特開 2022-54772 ウイルス濃縮材、濃縮装置及びウイルス濃縮材の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022054772

(43)【公開日】2022-04-07

(54)【発明の名称】ウイルス濃縮材、濃縮装置及びウイルス濃縮材の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/02 20060101AFI20220331BHJP

   C12N 1/02 20060101ALI20220331BHJP

   C12M 1/26 20060101ALI20220331BHJP

【ＦＩ】

C12N7/02

C12N1/02

C12M1/26

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020161970

(22)【出願日】2020-09-28

(71)【出願人】

【識別番号】000004547

【氏名又は名称】日本特殊陶業株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】500433225

【氏名又は名称】学校法人中部大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001036

【氏名又は名称】特許業務法人暁合同特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】喜田 真史

(72)【発明者】

【氏名】上村 和秀

(72)【発明者】

【氏名】中村 江里

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA09

4B029BB13

4B029CC01

4B029DG08

4B029GB09

4B029HA05

4B065AA95X

4B065BC41

4B065BD14

4B065BD38

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】ヘマグルチニンの高マンノース型糖鎖が欠損したウイルスに適用可能なウイルス濃縮材等の提供。
【解決手段】本発明のウイルス濃縮材１は、カルシウムイオン依存性の糖鎖結合活性を有するＣ型レクチン２と、シアロ糖鎖３ａを含む糖化合物３とを有するキメラ分子４が、担体５に担持されてなる。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

カルシウムイオン依存性の糖鎖結合活性を有するＣ型レクチンと、シアロ糖鎖を含む糖化合物とを有するキメラ分子が、担体に担持されてなるウイルス濃縮材。

【請求項2】

前記キメラ分子は、スクシニルイミド基を分子内に２つ有するリンカーに由来する構造を有し、
一方の前記スクシニルイミド基が前記Ｃ型レクチンと反応し、かつ他方の前記スクシニルイミド基が前記糖化合物と反応することで、前記Ｃ型レクチンが、前記リンカーを介して前記糖化合物に結合される請求項１に記載のウイルス濃縮材。

【請求項3】

前記担体の表面に形成され、前記Ｃ型レクチンの結合部位と特異的に結合する糖リガンドを含む糖リガンド層を有し、
前記キメラ分子は、前記Ｃ型レクチンの前記結合部位が前記糖リガンドに対して結合することで、前記担体に担持される請求項１又は請求項２に記載のウイルス濃縮材。

【請求項4】

前記シアロ糖鎖を受容体として特異的に結合するウイルスに対して適用可能であり、かつ前記ウイルスの濃度が、１０，０００ｐｆｕ／ｍＬ以下である被検査液を濃縮する請求項１から請求項３の何れか一項に記載のウイルス濃縮材。

【請求項5】

請求項１から請求項４の何れか一項に記載のウイルス濃縮材と、
一方の開口端からなる注入口と、他方の開口端からなる排出口と、前記注入口と前記排出口との間に配され、かつ前記注入口側から注入された被検査液を前記排出口側へ透過可能な状態で、前記ウイルス濃縮材を収容する収容部とを有する筒状容器とを備える濃縮装置。

【請求項6】

カルシウムイオン依存性の糖鎖結合活性を有するＣ型レクチンと、シアロ糖鎖を含む糖化合物とを有するキメラ分子が、担体に担持されてなるウイルス濃縮材の製造方法であって、
前記担体の表面に、前記Ｃ型レクチンの結合部位と特異的に結合する糖リガンドを含む糖リガンド層を形成する糖リガンド層形成工程と、
カルシウムイオンを含む緩衝液に前記Ｃ型レクチンを溶解させてなるＣ型レクチン含有緩衝液を、前記糖リガンド層が形成された前記担体に接触させて、前記Ｃ型レクチンを前記糖リガンドに結合させることで、前記糖リガンド層上に前記Ｃ型レクチンを含むＣ型レクチン層を形成するＣ型レクチン層形成工程と、
カルシウムイオンを含む緩衝液にスクシニルイミド基を分子内に２つ有するリンカーを溶解させてなるリンカー含有緩衝液を、前記Ｃ型レクチン層が形成された前記担体に接触させて、前記Ｃ型レクチンに前記リンカーを結合させることで、前記Ｃ型レクチン層上に、前記リンカーを含むリンカー層を形成するリンカー層形成工程と、
カルシウムイオンを含む緩衝液に前記シアロ糖鎖を含む前記糖化合物を溶解させてなる糖化合物含有緩衝液を、前記リンカー層が形成された前記担体に接触させて、前記リンカーに前記糖化合物を結合させることで、前記リンカー層上に、前記糖化合物を含む糖化合物層を形成する糖化合物層形成工程とを備えるウイルス濃縮材の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ウイルス濃縮材、濃縮装置及びウイルス濃縮材の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

インフルエンザウイルスは、毎年季節的流行を引き起こし、社会経済的に大きな損失をもたらしている。また、近い将来、変異したインフルエンザウイルスの出現により、世界的大流行（パンデミック）が引き起こされることも危惧されている。

【0003】

現在、インフルエンザウイルス感染症（所謂、インフルエンザ）の診断には、鼻腔ぬぐい液を検体とした免疫クロマトグラフィー法が用いられている。インフルエンザに罹患した被験者から採取された鼻腔ぬぐい液には、インフルエンザウイルスが高濃度（例えば、１０^４～１０^５ｐｆｕ／ｍＬ程度）で存在しており、ウイルス検出が容易であるため、インフルエンザの診断に、鼻腔ぬぐい液が使用されている。

【0004】

しかしながら、この鼻腔ぬぐい液を採取するためには、被験者の鼻腔の奥側までスワブ（綿棒）を挿入し、その奥側の部分をスワブで数回擦った後に、スワブを鼻腔から引き抜く必要があるため、被験者に対して不快感や強い痛みを与えてしまうことがしばしば問題となっていた。

【0005】

そこで、採取時に被験者に苦痛等を与えない、鼻腔ぬぐい液に代わる検体として、うがい液の使用が注目されている。ただし、うがい液中に含まれるインフルエンザウイルスの濃度は、最大で１０^２～１０^３ｐｆｕ／ｍＬ程度であり、鼻腔ぬぐい液と比べて、非常に希薄である。具体的には、うがい液中のインフルエンザウイルスの濃度は、鼻腔ぬぐい液の濃度と比べて、１／１００程度である。そのため、うがい液をそのまま検体として使用せず、ウイルス濃縮材を利用して、うがい液中のウイルス濃度を高めることが試みられている（例えば、特許文献１参照）。

【0006】

従来のウイルス濃縮材は、例えば、血清マンナン結合タンパク質（ＭＢＰ）をガラスビーズ製の担体に担持させたものからなる。インフルエンザウイルスの表面上に存在するヘマグルチニンには、高マンノース型糖鎖が修飾されていることが知られている。従来のウイルス濃縮材は、その高マンノース型糖鎖に、血清マンナン結合タンパク質を特異的に結合させることで、インフルエンザウイルスを捕捉するものである。なお、血清マンナン結合タンパク質の結合部位は、カルシウムイオン依存性であり、カルシウムイオンの濃度を、適宜、調節することで、ウイルス濃縮材の血清マンナン結合タンパク質と、インフルエンザウイルス（高マンノース型糖鎖）との結合を切断して、ウイルス濃縮材から、インフルエンザを遊離させることができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２０１９／０６４４６３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

将来、ヘマグルチニンの高マンノース型糖鎖が欠損したウイルス（例えば、変異した新型のインフルエンザウイルス）が発生した場合、従来のウイルス濃縮材は、その新型インフルエンザウイルスに対して使用することができない。

【0009】

本発明の目的は、ヘマグルチニンの高マンノース型糖鎖が欠損したウイルスに適用可能なウイルス濃縮材等を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

＜１＞ カルシウムイオン依存性の糖鎖結合活性を有するＣ型レクチンと、シアロ糖鎖を含む糖化合物とを有するキメラ分子が、担体に担持されてなるウイルス濃縮材。

【0011】

＜２＞ 前記キメラ分子は、スクシニルイミド基を分子内に２つ有するリンカーに由来する構造を有し、
一方の前記スクシニルイミド基が前記Ｃ型レクチンと反応し、かつ他方の前記スクシニルイミド基が前記糖化合物と反応することで、前記Ｃ型レクチンが、前記リンカーを介して前記糖化合物に結合される前記＜１＞に記載のウイルス濃縮材。

【0012】

＜３＞ 前記担体の表面に形成され、前記Ｃ型レクチンの結合部位と特異的に結合する糖リガンドを含む糖リガンド層を有し、前記キメラ分子は、前記Ｃ型レクチンの前記結合部位が前記糖リガンドに対して結合することで、前記担体に担持される前記＜１＞又は＜２＞に記載のウイルス濃縮材。

【0013】

＜４＞ 前記シアロ糖鎖を受容体として特異的に結合するウイルスに対して適用可能であり、かつ前記ウイルスの濃度が、１０，０００ｐｆｕ／ｍＬ以下である被検査液を濃縮する前記＜１＞から＜３＞の何れか１つに記載のウイルス濃縮材。

【0014】

＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞の何れか１つに記載のウイルス濃縮材と、一方の開口端からなる注入口と、他方の開口端からなる排出口と、前記注入口と前記排出口との間に配され、かつ前記注入口側から注入された被検査液を前記排出口側へ透過可能な状態で、前記ウイルス濃縮材を収容する収容部とを有する筒状容器とを備える濃縮装置。

【0015】

＜６＞ カルシウムイオン依存性の糖鎖結合活性を有するＣ型レクチンと、シアロ糖鎖を含む糖化合物とを有するキメラ分子が、担体に担持されてなるウイルス濃縮材の製造方法であって、前記担体の表面に、前記Ｃ型レクチンの結合部位と特異的に結合する糖リガンドを含む糖リガンド層を形成する糖リガンド層形成工程と、カルシウムイオンを含む緩衝液に前記Ｃ型レクチンを溶解させてなるＣ型レクチン含有緩衝液を、前記糖リガンド層が形成された前記担体に接触させて、前記Ｃ型レクチンを前記糖リガンドに結合させることで、前記糖リガンド層上に前記Ｃ型レクチンを含むＣ型レクチン層を形成するＣ型レクチン層形成工程と、カルシウムイオンを含む緩衝液にスクシニルイミド基を分子内に２つ有するリンカーを溶解させてなるリンカー含有緩衝液を、前記Ｃ型レクチン層が形成された前記担体に接触させて、前記Ｃ型レクチンに前記リンカーを結合させることで、前記Ｃ型レクチン層上に、前記リンカーを含むリンカー層を形成するリンカー層形成工程と、カルシウムイオンを含む緩衝液に前記シアロ糖鎖を含む前記糖化合物を溶解させてなる糖化合物含有緩衝液を、前記リンカー層が形成された前記担体に接触させて、前記リンカーに前記糖化合物を結合させることで、前記リンカー層上に、前記糖化合物を含む糖化合物層を形成する糖化合物層形成工程とを備えるウイルス濃縮材の製造方法。

【発明の効果】

【0016】

本発明によれば、ヘマグルチニンの高マンノース型糖鎖が欠損したウイルスに適用可能なウイルス濃縮材等を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ウイルス濃縮材の構成を模式的に表した断面図

【図2】ウイルス濃縮材の一部を模式的に表した拡大図

【図3】リンカーの具体例を示す説明図

【図4】ウイルス濃縮材の製造方法の一例を示すフロー図

【図5】濃縮装置の断面構成を模式的に表した説明図

【図6】ウイルス濃縮材により濃縮されたインフルエンザウイルスを模式的に表した説明図

【図7】比較例で使用したリンカーを示す説明図

【発明を実施するための形態】

【0018】

〔ウイルス濃縮材〕
図１は、ウイルス濃縮材１の構成を模式的に表した断面図であり、図２は、ウイルス濃縮材１の一部を模式的に表した拡大図である。

【0019】

ウイルス濃縮材１は、カルシウムイオン依存性の糖鎖結合活性を有するＣ型レクチン２と、シアロ糖鎖３ａを含む糖化合物３とを有するキメラ分子４が、担体５に担持されたものからなる。インフルエンザウイルスは、細胞表面に発現するシアロ糖鎖を受容体とし、ウイルス表面のヘマグルチニンとシアロ糖鎖の結合を介して細胞表面に吸着することが知られている。

【0020】

なお、本明細書において、「濃縮」とは、標的のウイルスの濃度を高めることであり、濃縮された試料中には、標的のウイルスが、濃縮前と比べて高濃度で存在することになる。

【0021】

担体５は、不溶性材料からなる支持体であり、後述する糖リガンド層を形成し易い等の観点より、表面に水酸基を有する無機物質又は有機物質によって構成することが好ましい。担体５を構成する具体的な材料としては、本発明の目的を損なわない限り特に制限はないが、例えば、ガラス、シリカ、各種樹脂（スチレン系樹脂、アクリル系樹脂等）、水酸基含有無機材料（紫外線処理した酸化チタン、アルミナ、その他のセラミックス等）等が挙げられる。また、担体５の形状は、本発明の目的を損なわない限り特に制限はないが、粒子状（ビーズ状）が好ましい。粒子状の担体の粒径は、インフルエンザウイルスが結合する表面の総和、及び透水性を規定する。すなわち、粒子径が小さいほど、総表面積が増大し、インフルエンザウイルスの結合には有利であるが、粒子径が小さいほど、透水性が低下して排圧の上昇により濃縮操作が困難になる。望ましい粒子径は、十分な透水性を有しつつ、できるだけ小さいもので、例えば、３０μｍ以上１１０μｍ以下が好ましく、３０μｍ以上６０μｍ以下が更に好ましい。なお、前記平均粒径の測定には、レーザー回折・散乱法（マイクロトラック）を用い、体積平均によって平均粒径が求められる。この担体５の平均粒径が前述の粒径範囲内となるように極力均一径のビーズ（担体）を用いてもよいし、意図的に粒子径分布が二峰性分布を描くように大小異なる粒子径のビーズ（担体）を混合して用いてもよい。

【0022】

なお、担体５としては、多数の粒子同士が圧着することにより形成された一体型多孔質材料が用いられてもよい。この種の一体型多孔質材料は、貫通孔と細孔の両方又は貫通孔のみを有する多孔質材料であり、「モノリス」等と称されることもある。

【0023】

キメラ分子４は、カルシウムイオン依存性の糖鎖結合活性を有するＣ型レクチン（以下、単に「Ｃ型レクチン」と称する）２と、シアロ糖鎖３ａを含む糖化合物３とを有する化合物であり、担体５の表面に担持される。キメラ分子４は、Ｃ型レクチン２及び糖化合物３の他に、スクシニルイミド基を分子内に２つ有するリンカー（２価官能基性のリンカー）６に由来する構造を備えている。なお、本実施形態のキメラ分子４は、担体５に結合する糖リガンド７を介して、解離（分離）可能な状態で担体５に担持されている。

【0024】

Ｃ型レクチン２は、カルシウムイオン依存性の糖鎖結合活性を有するタンパク質であり、１つ又は２つ以上の結合部位（糖認識ドメイン）２ａを備えている。Ｃ型レクチン２の結合部位２ａは、カルシウムイオン依存性の糖鎖結合活性を備えており、後述する糖リガンド７に対して特異的に結合する。このようなＣ型レクチン２としては、例えば、マンナン結合タンパク質（ＭＢＰ）を用いることができる。

【0025】

ＭＢＰは、動物レクチンの一種であり、マンノース、フコース、Ｎ－アセチルグルコサミンを末端に有する糖鎖と特異的に結合する。なお、生体において、ＭＢＰは、主に血清及び肝臓に存在する。また、Ｃ型レクチン２としては、組換え型ＭＢＰも用いることができる（例えば、Vorup-Jensen T et al., International Immunopharmacology 1, 677-687. (2001)を参照）。

【0026】

ＭＢＰは、ウサギ、ヒト等の動物の血清から常法に従って調製することができる。また、ヒト由来のＭＢＰは、常法に従って、遺伝子組換え型として調製することができる。なお、図２には、説明の便宜上、Ｃ型レクチン２の結合部位が１つのみ模式的に示されている。

【0027】

糖化合物３は、シアロ糖鎖３ａを含む化合物である。シアロ糖鎖３ａは、シアル酸３ａ１を含む糖鎖であり、インフルエンザウイルスの表面に存在するヘマグルチニンが、受容体として特異的に結合する物質として知られている。糖化合物３としては、化学的に合成された合成シアロ糖鎖であってもよいし、天然物由来の物質（例えば、シアロ糖鎖を含む糖タンパク質であるフェツイン）であってもよい。

【0028】

合成シアロ糖鎖としては、例えば、Neu5Acα(2-6)Galβ(1-4)GlcNAc-β-ethylamine（東京化成工業製）を用いることができる。

【0029】

なお、シアロ糖鎖３ａの構造は、標的ウイルス（インフルエンザウイルス）の種類に応じて、適宜、設定されてもよい。例えば、標的が鳥インフルエンザウイルスの場合、シアロ糖鎖として、シアル酸とガラクトースとがα２－３結合したものが利用されてもよい。

【0030】

また、糖化合物３は、後述するリンカー６と結合可能な官能基３ｂを備えている。例えば、合成シアロ糖鎖の場合、そのアグリコン部分に、リンカー６の官能基（スクシニルイミド基）と反応可能な官能基（アミノ基等）を備えている。

【0031】

リンカー６は、キメラ分子４を作製する際に、Ｃ型レクチン２と、シアロ糖鎖３ａを含む糖化合物３とを結合するために利用される。リンカー６は、スクシニルイミド基を分子内に２つ有する化合物からなる。リンカー６の一方のスクシニルイミド基が、Ｃ型レクチン２が有するアミノ基等の官能基と反応し、他方のスクシニルイミド基が、糖化合物３が有するアミノ基等の官能基と反応することで、Ｃ型レクチン２が、リンカー６を介して糖化合物３に結合される。そのため、キメラ分子４中には、リンカー６に由来する構造が存在している。

【0032】

リンカー６としては、例えば、図３に示されるＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート）、Ｓｕｌｆｏ－ＥＧＳ（３，３’－［エチレンビス（オキシカルボニル）］ビス［プロピオン酸２，５－ジオキソ－３－（ソジオスルホ）ピロリジン－１－イル］）が挙げられる。

【0033】

キメラ分子４は、Ｃ型レクチン２の結合部位が、担体５の表面上に形成された糖リガンド７に結合することで、担体５に担持されている。糖リガンド７は、Ｃ型レクチン２の結合部位が特異的に結合する糖類（マンノース等）を含む物質であり、例えば、マンナン（マンノースを主な構成単位とする多糖類）等が利用される。

【0034】

担体５上に糖リガンド７を固相化（固定化）する方法としては、本発明の目的を損なわない限り特に制限されないが、例えば、シランカップリング法とアミンカップリング法を利用した固相化方法や、初めにアミノプロピルトリエトキシシランを用いたアミノ基の付与を行い、次いで炭酸Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルを用いたスクシニルイミド基の付与を行う方法（例えば、Bioconjugate Technique 542頁等、参照）等が挙げられる。

【0035】

Ｃ型レクチン２と糖リガンド７との結合は、カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）の濃度に依存している。ウイルス濃縮材におけるＣ型レクチン２と糖リガンド７との結合は、例えば、２ｍＭ～１０ｍＭのカルシウムイオンが存在する環境下で、維持される。そして、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート剤により、カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）を捕捉することで、Ｃ型レクチン２と糖リガンド７との結合を解離させることができる。

【0036】

ウイルス濃縮材１は、図１に示されるように、巨視的に見ると、担体５の表面上に形成される糖リガンド７からなる糖リガンド層７０と、糖リガンド層７０上に形成されるＣ型レクチン２からなるＣ型レクチン層２０と、Ｃ型レクチン層２０上に形成されるリンカー６からなるリンカー層６０と、リンカー層６０上に形成される糖化合物３からなる糖化合物層３０とを備えている。

【0037】

また、図２には、ウイルス濃縮材１の一部を、微視的に見た状態が示され、シアロ糖鎖３ａ（シアル酸３ａ１）に、インフルエンザウイルスＶのヘマグルチニンＨＡが結合する様子が模式的に示されている。

【0038】

〔ウイルス濃縮材の製造方法〕
次いで、ウイルス濃縮材の製造方法の一例を説明する。図４は、ウイルス濃縮材の製造方法の一例を示すフロー図である。ウイルス濃縮材の製造方法は、図４に示されるように、糖リガンド層形成工程Ｓ１、Ｃ型レクチン層形成工程Ｓ２、リンカー層形成工程Ｓ３、及び糖化合物層形成工程Ｓ４を備えている。

【0039】

糖リガンド層形成工程Ｓ１は、担体５の表面に、Ｃ型レクチン２の結合部位２ａと特異的に結合する糖リガンド７を含む糖リガンド層７０を形成する工程である。糖リガンド層形成工程Ｓ１では、例えば、シランカップリング法とアミンカップリング法を利用した固相化方法により、担体５の表面を覆うように、糖リガンド７であるマンナンからなる糖リガンド層７０が形成される。

【0040】

Ｃ型レクチン層形成工程Ｓ２は、カルシウムイオンを含む緩衝液にＣ型レクチン２を溶解させてなるＣ型レクチン含有緩衝液を、糖リガンド層７０が形成された担体５に接触させて、Ｃ型レクチン２を糖リガンド７に結合させることで、糖リガンド層７０上にＣ型レクチン２を含むＣ型レクチン層２０を形成する工程である。Ｃ型レクチン層形成工程Ｓ２では、担体５の表面上に形成された糖リガンド７に、Ｃ型レクチン２の結合部位を結合させることで、糖リガンド層７０上にＣ型レクチン層２０が形成される。

【0041】

リンカー層形成工程Ｓ３は、カルシウムイオンを含む緩衝液にスクシニルイミド基を分子内に２つ有するリンカー６を溶解させてなるリンカー含有緩衝液を、Ｃ型レクチン層２０が形成された前記担体５に接触させて、Ｃ型レクチン２にリンカー６を結合させることで、Ｃ型レクチン層２０上に、リンカー６を含むリンカー層６０を形成する工程である。

【0042】

糖化合物層形成工程Ｓ４は、カルシウムイオンを含む緩衝液にシアロ糖鎖３ａを含む糖化合物３を溶解させてなる糖化合物含有緩衝液を、リンカー層６０が形成された前記担体５に接触させて、リンカー６に糖化合物３を結合させることで、リンカー層６０上に、糖化合物３を含む糖化合物層３０を形成する工程である。

【0043】

以上のような各工程を経ることで、ウイルス濃縮材１を製造することができる。

【0044】

なお、Ｃ型レクチン層形成工程Ｓ２以降の各工程は、所定の容器（例えば、）内に、前記担体５を封入した状態で、逐次行ってもよい。容器としては、注入口と、排出口と、注入口と排出口との間にあり、Ｃ型レクチン含有緩衝液等の緩衝液を透過（流通）可能な状態で収容する収容部とを有する筒状容器が用いられてもよい。このような筒状容器内で、Ｃ型レクチン層形成工程Ｓ２以降の各工程を行うことで、各工程における固相化反応を逐次、行うことができる。筒状容器としては、例えば、後述する濃縮装置１００で利用されるものを、適用してもよい。

【0045】

〔濃縮装置〕
ウイルス濃縮材１は、例えば、所定の筒状容器２００内に充填して使用される。本明細書では、筒状容器２００内にウイルス濃縮材１を充填したものを、濃縮装置１００と称する。図５は、濃縮装置１００の断面構成を模式的に表した断面図である。濃縮装置１００は、図５に示されるように、ウイルス濃縮材１と、筒状容器２００とを備えている。

【0046】

筒状容器２００は、２つの筒型の部品が上下方向で接続したような形をなしている。筒状容器２００は、上方に配置される第１筒状体（メス型ルアーコックコネクタ）２１０と、下方に配置される第２筒状体（オス型ルアーコックコネクタ）２２０とを備えており、全長が約２７．５ｍｍである。

【0047】

筒状容器２００の注入口２００ａは、第１筒状体２１０の開口端からなり、筒状容器２００の排出口２００ｂは、第２筒状体２２０の開口端からなる。筒状容器２００は、注入口２００ａと排出口２００ｂとの間に配され、かつ注入口２００ａ側から注入された被検査液を排出口２００ｂ側へ透過可能な状態で、ウイルス濃縮材１を収容する収容部２００ｃを備えている。この収容部２００ｃは、第２筒状体２２０の内部に形成されている。収容部２００ｃの底側（排出口２００ｂ側）には、円盤状のフリット（例えば、ポリエチレン製フィルタ）２２１が配置されており、そのフリット２２１と、第２筒状体２２０の内周面とで囲まれた部分が収容部２００ｃとなっている。なお、収容部２００ｃ内に充填されたウイルス濃縮材１は、第１筒状体２１０の筒状の下端部によって押さえられている。ウイルス濃縮材１はビーズ状であり、その集合物が、収容部２００ｃ内に充填される。

【0048】

収容部２００ｃの内径は、例えば、約４ｍｍ～８ｍｍに設定され、排出口２００ｂの内径は、約１ｍｍ～３ｍｍに設定される。この筒状容器の場合、収容部２００ｃ内に、約０．１ｍＬ～０．５ｍＬのウイルス濃縮材１が封入される。

【0049】

〔ウイルス濃縮材を用いた被検査液の濃縮方法〕
次いで、ウイルス濃縮材１を用いた被検査液の濃縮方法を説明する。ここでは、図５に示される濃縮装置１００を利用して、非検査液中のウイルスを濃縮する方法を説明する。ウイルス濃縮材１は、シアロ糖鎖３ａを受容体として特異的に結合するインフルエンザウイルス等に対して適用可能である。ウイルス濃縮材１は、例えば、ウイルス濃度が、１０，０００ｐｆｕ／ｍＬ以下である被検査液を濃縮することができる。

【0050】

例えば、被験者から採取されたうがい液を被検査液とし、その被検査液をシリンジ等を利用して、注入口２００ａか筒状容器２００内へ注入して、ウイルス濃縮材１によるウイルスの捕捉が行われる。注入口２００ａから注入された被検査液は、収容部２００ｃ内に充填されたウイルス濃縮材１を透過し、更にフリット２２１を透過して、排出口２００ｂから外部へ排出される。被検査液がウイルス濃縮材１を透過する際に、被検査液中のウイルスがシアロ糖鎖３ａを有する糖化合物３に捕捉される。被検査液の注入が終わった後、ＥＤＴＡ等を含む緩衝液を、注入口２００ａから筒状容器２００内に供給し、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンと糖化合物３におけるシアロ糖鎖３ａとの結合を解離させ、濃縮装置１００の排出口２００ｂから、インフルエンザウイルスを溶出させる。

【0051】

図６は、ウイルス濃縮材１により濃縮されたインフルエンザウイルスＶを模式的に表した説明図である。ウイルス濃縮材１に捕捉され、かつ担体５側から解離されたインフルエンザウイルスＶには、ウイルス濃縮材１の一部が結合した状態となっている。具体的には、ウイルス濃縮材１のＣ型レクチン２と糖リガンド７との結合が解離された後も、インフルエンザウイルスＶには、キメラ分子４が結合した状態となっている。

【0052】

ウイルス濃縮材１は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンが、シアロ糖鎖３ａを受容体として結合する機構を利用したものであり、仮に、ヘマグルチニンの高マンノース型糖鎖が欠損した新型インフルエンザウイルスが発生した場合でも、その新型インフルエンザに対して、問題なく適用することができる。

【0053】

また、インフルエンザウイルスＶに、キメラ分子４が結合していると、カルシウムイオンの濃度を適宜、調節することで、キメラ分子４のＣ型レクチン２の結合部位２ａに、インフルエンザウイルスＶのヘマグルチニンＨＡに存在するマンノース９を結合させて、インフルエンザウイルスＶ同士を、クラスター状に集められる可能性がある。

【0054】

また、カルシウムイオンの濃度を適宜、調節することで、キメラ分子４のＣ型レクチン２を、基材上に固定されたリガンド（マンナン）等に結合させて、インフルエンザウイルスＶを精製すること等も可能である。

【0055】

なお、濃縮装置１００から、インフルエンザウイルスＶを回収した状態では、カルシウムイオン濃度が低く設定されているため、インフルエンザウイルスＶは、回収液（濃縮液中）で互いに凝集せず、個々に浮遊した状態になっていると推測される。

【0056】

以上のように、ウイルス濃縮材１は、ウイルス濃縮性能が高く、インフルエンザウイルス等を高濃度に濃縮することができる。

【0057】

また、ウイルス濃縮材１は、ヘマグルチニンの高マンノース型糖鎖が欠損した新型インフルエンザウイルスに対しても、問題なく適用することができる。

【0058】

以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

【0059】

〔ウサギＭＢＰの精製〕
ウサギ血清５００ｍＬに対して、等量の緩衝液（イミダゾール：４０ｍＭ、塩化カルシウム：４０ｍＭ、塩化ナトリウム：２．５Ｍ、ｐＨ＝７．８）を加えて混合し、その混合液を、予め結合用緩衝液（イミダゾール：２０ｍＭ、塩化カルシウム：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：１．２５Ｍ、ｐＨ＝７．８）で平衡化したマンナン－セファロースカラムにかけた。カラムを結合用緩衝液で洗浄した後、結合物（ＭＢＰ）を解離用緩衝液Ｉ（イミダゾール：２０ｍＭ、ＥＤＴＡ：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：１．２５Ｍ、ｐＨ＝７．８）で溶出した。溶出画分のうち、タンパク質濃度の高い画分を集めて、それに塩化カルシウムを加えたものを、再びマンナン－セファロースカラムにかけ、同様に洗浄と溶出を行い、その溶出物に再び塩化カルシウムを加えて、更にもう一度マンナン－セファロースカラムにかけ、解離用緩衝液ＩＩ（イミダゾール：２０ｍＭ、マンノース：１０ｍＭ、塩化カルシウム：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：１．２５Ｍ、ｐＨ＝７．８）で溶出することにより、最終精製物であるＭＢＰを得た。

【0060】

〔マンナン－ガラスビーズの作製〕
洗浄済みのガラスビーズを用意し、そのガラスビーズに３－アミノプロピルエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を反応させ、更にそれをアセトンで洗浄した。アセトンで洗浄した後、ＤＳＣ（炭酸ジスクシニル）を反応させ、更にそれをアセトンで洗浄し、その後、乾燥させた。乾燥後、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、塩化カルシウム：２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）に、１００μｇ／ｍＬの濃度で溶解した酵母マンナンを加えて、それらを反応させた。反応後、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、塩化カルシウム：２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）でガラスビーズを洗浄したのち、未反応のスクシニルイミド基を封鎖するために、前記ガラスビーズに、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、Ｔｒｉｓ：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、塩化カルシウム：２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を作用させた。その後、再びＨｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、塩化カルシウム：２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で前記ガラスビーズを洗浄し、更に、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、塩化カルシウム：２０ｍＭ）に溶解したＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ａｃｅｔａｔｅ（酢酸スルホスクシンイミジル）を、前記ガラスビーズに作用させて、酵母マンナンに含まれるアミノ基を封鎖した。このようにして、酵母マンナンが結合されたガラスビーズ（マンナン－ガラスビーズ）を得た。

【0061】

なお、酵母マンナンのアミノ基を封鎖した理由は、後で使用される２価官能基性のリンカーが反応して、酵母マンナンに、シアロ糖鎖がＭＢＰを介さずに、直接結合することを避けるためである。酵母マンナンにシアロ糖鎖が直接結合すると、シアロ糖鎖を介してガラスビーズに結合したインフルエンザウイルスを、ＥＤＴＡで溶出できなくなり、濃縮性能の著しい低下を引き起こすからである。

【0062】

〔キメラ分子の作製〕
精製したウサギ血清ＭＢＰを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、塩化カルシウム：２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で透析して、イミダゾールを除去した。なお、イミダゾールは、２級アミンであり、次のスクシニルイミド基とアミノ基のカップリング反応を阻害するため、除去が必要である。透析後のウサギ血清ＭＢＰを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、塩化カルシウム：２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で希釈し、濃度を１００μｇ／ｍＬに調整して、緩衝液（Ｃ型レクチン含有緩衝液）を得た。その緩衝液を、マンナン－ガラスビーズに接触させて、緩衝液中のＭＢＰ（Ｃ型レクチン）を、マンナン－ガラスビーズのマンナンに結合させた。その後、前記ガラスビーズを、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、塩化カルシウム：２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で洗浄し、未反応のＭＢＰを除去した。次に、ＭＢＰが結合したガラスビーズに、各種の２価官能基性のリンカー（ＢＳ３（図３参照）、Ｓｕｌｆｏ－ＥＧＳ（図３参照）、Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（図７参照））を反応させた。なお、各リンカーは、緩衝液（Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、塩化カルシウム：２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４））に溶解させた状態（リンカー含有緩衝液）で反応させた。更に、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、塩化カルシウム：２０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）に溶解したシアロ糖鎖を含む糖化合物（つまり、糖化合物含有緩衝液）を反応させた。なお、糖化合物としては、糖化合物Ｉ（Neu5Acα(2-6)Galβ(1-4)GlcNAc-β-ethylamie）及び糖化合物ＩＩ（牛血清フェツイン）を用意し、各種の２価官能基性のリンカーに対して、糖化合物Ｉ、及び糖化合物ＩＩをそれぞれ反応させた。以上のようにして、キメラ分子が酵母マンナン（糖リガンド）を介してガラスビーズに結合した６種類のウイルス濃縮材を得た。

【0063】

〔評価１：ウイルス濃縮性能の評価〕
得られた６種類のウイルス濃縮材について、以下に示される濃縮実験により、ウイルス濃縮性能を評価した。インフルエンザウイルスＡ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７を、ＭＤＣＫ細胞で増殖させたもの（増殖液）を、１ｍＬに小分け分注し、その後、プラークアッセイによりそれのウイルス濃度を求めたところ、５．０×１０^６ｐｆｕ／ｍＬであった。濃縮実験では、これをＨｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、塩化カルシウム：５ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で５００倍に希釈したウイルス液２０ｍＬを使用した。次いで、ウイルス濃縮材を、所定のカートリッジに、０．１ｍＬの容量で充填して、ウイルス濃縮デバイス（濃縮装置）を作製した。このウイルス濃縮デバイスの注入口から、ウイルス液２０ｍＬを注入して、ウイルス濃縮材にウイルスを結合させた。その後、Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸：２０ｍＭ、塩化ナトリウム：０．１５Ｍ、ＥＤＴＡ：１００ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を注入して、ウイルス濃縮材におけるＭＢＰと酵母マンナンとの結合部分を切断して、ウイルス濃縮材に捕捉されたウイルスを溶出させた。濃縮倍率は、適切な溶出画分（２００μＬ）のウイルス濃度と、濃縮前のウイルス濃度から算出した。なお、濃縮前後の各ウイルス濃度は、シアロ糖鎖を有する糖タンパク質であるフェツインがコートされたマイクロタイタープレートと、インフルエンザウイルスに特異的な抗体を用いた、公知のウイルス結合アッセイにより測定した。結果は、表１に示した。

【0064】

【表1】

【0065】

表１に示されるように、実施例１～４のウイルス濃縮材は、リンカーとして、ホモバイファンクショナルリンカーであるＢＳ３、Ｓｕｌｆｏ－ＥＧＳが使用されたものである。このような実施例１～４のウイルス濃縮材は、高いウイルス濃縮性能を発揮することが示された。

【0066】

これに対して、比較例１，２のウイルス濃縮材は、リンカーとして、ヘテロバイファンクショナルリンカーであるＳｕｌｆｏ－ＳＭＣＣが使用されたものである。このような比較例１，２では、キメラ分子が上手く作製されず（つまり、シアロ糖鎖を含む糖化合物とＭＢＰとの結合が上手く行かず）、得られたウイルス濃縮材のウイルス濃縮性能は、低い結果となった。

【0067】

〔評価２：ウイルス濃縮材の容量の評価〕
ウイルス濃縮材の容量の違いを評価するために、上述した実施例３と同様のウイルス濃縮材を作製した。得られたウイルス濃縮材を、表２に示される容量（ｍＬ）で、所定のカートリッジに充填して、実施例５～７のウイルス濃縮デバイス（濃縮装置）を作製した。そして、実施例５～７について、上述した実施例１等と同様、ウイルス濃縮性能を評価した。結果は、表２に示した。

【0068】

【表2】

【0069】

表２に示されるように、ウイルス濃縮材の容量が、０．５ｍＬの場合に、最も高いウイルス濃縮性能が発揮された。

【符号の説明】

【0070】

１…ウイルス濃縮材、２…Ｃ型レクチン、２ａ…結合部位、３…糖化合物、３ａ１…シアル酸、３ａ…シアロ糖鎖、３ｂ…官能基、４…キメラ分子、５…担体、６…リンカー、７…糖リガンド、２０…Ｃ型レクチン層、３０…糖化合物層、６０…リンカー層、７０…糖リガンド層、Ｖ…インフルエンザウイルス、ＨＡ…ヘマグルチニン

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】