特開 2022-57400 フラビウイルスに対する多重抗原ペプチドおよびこれを含む免疫原性組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022057400

(43)【公開日】2022-04-11

(54)【発明の名称】フラビウイルスに対する多重抗原ペプチドおよびこれを含む免疫原性組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/18 20060101AFI20220404BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20220404BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20220404BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220404BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20220404BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20220404BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20220404BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20220404BHJP

【ＦＩ】

C07K14/18

A61P31/14 ZNA

A61P37/04

A61P43/00 121

A61K39/12

A61K39/39

C07K7/06

C07K7/08

【審査請求】未請求

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020165635

(22)【出願日】2020-09-30

(71)【出願人】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(71)【出願人】

【識別番号】508141391

【氏名又は名称】動物アレルギー検査株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(72)【発明者】

【氏名】増田 健一

(72)【発明者】

【氏名】齊藤 隆

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA51

4C085BA62

4C085CC08

4C085EE01

4C085EE06

4C085FF14

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA18

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA33

4H045GA21

(57)【要約】      （修正有）

【課題】フラビウイルス属ウイルスに対するワクチンの提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を含むペプチド、又は、前記特定のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むフラビウイルス属ウイルスのポリプロテインの部分ペプチド、並びに、これらのペプチドのいずれかを複数含む、多重抗原ペプチド。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

フラビウイルス属ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の一部である１１～３０アミノ酸長を有するペプチドであって、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むペプチド、または、当該アミノ酸配列に対応するポリプロテインのアミノ酸配列からなるポリプロテインの部分ペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載のペプチドであって、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、または、配列番号０のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなるポリプロテインの部分ペプチド。

【請求項3】

配列番号９に対応するアミノ酸配列が、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して、１塩基の付加、挿入、置換、および欠失のいずれかを有する、請求項２に記載のペプチド。

【請求項4】

配列番号９に対応するアミノ酸配列が、配列番号１～７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項２または３に記載のペプチド。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチドを含む、多重抗原ペプチド。

【請求項6】

請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチドを８以上含む、請求項５に記載の多重抗原ペプチド。

【請求項7】

請求項８に記載の多重抗原ペプチドを含む、フラビウイルス属ウイルスに対するワクチン。

【請求項8】

アジュバントを含有しない、請求項７に記載のワクチン。

【請求項9】

α－ガラクトシルセラミドと併用し、他のアジュバントと併用しない、請求項６または７に記載のワクチン。

【請求項10】

フラビウイルス属ウイルスが、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、およびダニ媒介性脳炎ウイルス並びにその変異体ウイルスからなる群から選択されるウイルスである、請求項７～９のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項11】

その必要のある対象においてフラビウイルス属ウイルスに対する免疫を活性化する方法であって、請求項５または６に記載の多重抗原ペプチドの有効量を当該対象に投与することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フラビウイルスに対する多重抗原ペプチドおよびこれを含む免疫原性組成物、特にフラビウイルスに対する免疫原性組成物またはワクチンに関する。

【背景技術】

【0002】

多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）によってＴ細胞を介さずに生体内で抗体上昇を誘導できることは以前から知られていた（非特許文献１）。生体内で抗体誘導が困難な自己抗体（抗ＩｇＥ抗体）の誘導がＭＡＰで可能であることが明らかにされている（特許文献１）。そして、この方法を用いることで、エボラ出血熱ウイルスのペプチド部位を作製して汎ウイルスＭＡＰを作製し、マウスへ免疫することによって血清中に目的の抗体が誘導されることが開示されている（特許文献２）。同様に、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンの部分ペプチドを用いて汎ウイルスＭＡＰを作製し、マウスへ免疫することによって血清中に目的の抗体が誘導されることが開示されている（特許文献３）。フラビウイルス属ウイルスに対する中和抗体が開発されている（非特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】ＵＳ２０１７－０１５８７３８Ａ

【特許文献2】ＵＳ２０１９－０２７６４９５Ａ

【特許文献3】ＵＳ２０１９－０３３７９８９Ａ

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｓａｒａｖａｎａｎ， Ｐ．， ｅｔ． ａｌ．， Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．， （４８） ３９－４５， ２００４

【非特許文献2】Ｙｉ－Ｃｈｉｎ Ｆａｎ， ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ．Ｔｒｏｐ． Ｄｉｓ．， ９（１０）：ｅ０００４１６７， ２０１５

【発明の概要】

【0005】

本発明は、本発明は、フラビウイルスに対する多重抗原ペプチドおよびこれを含む免疫原性組成物、特にフラビウイルスに対する免疫原性組成物またはワクチンを提供する。

【0006】

本発明者らは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、または、配列番号１のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなるフラビウイルス属ウイルスのポリプロテインの部分ペプチドを有する多重抗原ペプチドが、ＩｇＭ抗体の産生を促進することを見出した。本発明者らはまた、本発明の多重抗原ペプチドが、直接的に、辺縁帯B細胞およびＢ１Ｂ細胞からの抗体産生を刺激し、Ｔ細胞非依存性の抗体産生を誘導することを見出した。

【0007】

本発明は以下の発明を提供する。
［１］フラビウイルス属ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の一部である１１～３０アミノ酸長を有するペプチドであって、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むペプチド、または、当該アミノ酸配列に対応するポリプロテインのアミノ酸配列からなるポリプロテインの部分ペプチド。
［２］上記［１］に記載のペプチドであって、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、または、配列番号９のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなる、ペプチド。
［３］配列番号９に対応するアミノ酸配列が、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して、１塩基の付加、挿入、置換、および欠失のいずれかを有する、上記［２］に記載のペプチド。
［４］配列番号９に対応するアミノ酸配列が、配列番号１～７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、上記［２］または［３］に記載のペプチド。
［５］上記［１］～［４］のいずれかに記載のペプチドを含む、多重抗原ペプチド。
［６］上記［１］～［４］のいずれかに記載のペプチドを８以上含む、上記［５］に記載の多重抗原ペプチド。
［７］上記［８］に記載の多重抗原ペプチドを含む、フラビウイルス属ウイルスに対するワクチン。
［８］アジュバントを含有しない、上記［７］に記載のワクチン。
［９］α－ガラクトシルセラミドと併用し、他のアジュバントと併用しない、上記［６］または［７］に記載のワクチン。
［１０］フラビウイルス属ウイルスが、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、およびダニ媒介性脳炎ウイルス並びにその変異体ウイルスからなる群から選択されるウイルスである、上記［７］～［９］のいずれかに記載のワクチン。
［１１］その必要のある対象においてフラビウイルス属ウイルスに対する免疫を活性化する方法であって、上記［５］または［６］に記載の多重抗原ペプチドの有効量を当該対象に投与することを含む、方法。

【0008】

本発明の多重抗原ペプチドは、フラビウイルス属ウイルスに対する抗体産生を誘導する点で有利である。本発明の多重抗原ペプチドは、投与後に記憶免疫が成立しており、ウイルス感染によってさらに中和抗体産生を増強する点で有利であり得る。その上、本発明の多重抗原ペプチドはまた、感染中和能を有するＩｇＭ抗体の産生に適している。ＩｇＭ抗体は、感染中和能を奏しつつも、抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を生じさせる抗体サブクラスではない。また、ＩｇＧ抗体に関しては、産生されたとしても、ヘルパーT細胞や濾胞Ｂ細胞ではなく、Ｔ細胞非依存的に辺縁帯B細胞およびＢ１Ｂ細胞を刺激して抗体を産生させるものであり、産生された抗体は、生体内で抗原特異性免疫を誘導しつつも、抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を回避できるワクチン開発に繋がると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、マウスに対する本発明の多重抗原ペプチドの投与実験および採血のスキームを示す。

【図2】図２は、本発明の各種多重抗原ペプチドを投与されたマウスの血清中の抗体価を示す。

【図3】図３は、本発明の各種多重抗原ペプチドを投与されたマウスの血清中のＩｇＭの抗体価を示す。

【図4】図４は、本発明の各種多重抗原ペプチドを投与されたマウスの血清中のＩｇＧサブクラスの抗体価を示す。

【図5】図５は、ウイルス中和能の測定実験に用いられた血清（本発明の多重抗原ペプチドを投与されたマウスの血清）のＩｇＧ抗体の抗体価の時間的推移を示す。

【図6】図６は、マウスに対する本発明の多重抗原ペプチドの投与実験のスキームを示す。

【図7】図７は、ウイルス中和能の測定実験の結果を示す。プラークはウイルスによる細胞死によりもたらされ、プラーク出現数の低減は、被検血清のウイルスに対する中和能の存在を示す。

【発明の詳細な説明】

【0010】

本明細書では、「対象」とは、免疫系を有する動物であり、例えば、脊椎動物であり、例えば、フラビウイルス属ウイルスが感染する動物であり、例えば、哺乳動物、魚類、鳥類、両生類、は虫類、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセットおよびボノボなどの霊長類、ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコおよびイヌなどの四足動物（例えば、食肉類、偶蹄類、奇蹄類およびげっ歯類）、コウモリなどのコウモリ目の動物であり得る。

【0011】

本明細書では、「フラビウイルス」とは、フラビウイルス科に属するウイルスである。フラビウイルス科には、フラビウイルス属が属する。フラビウイルス科フラビウイルス属は、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、およびダニ媒介性脳炎ウイルスなどの病原性ウイルスを多く含む。これらのウイルスは、ヒト以外の哺乳動物や鳥類が保有宿主となり、ウイルスを増幅させると共に、蚊やダニなどによって媒介され、ヒトに感染する。このため、フラビウイルスを完全に自然界から撲滅することは不可能であると考えられている。これらに対してワクチンの作製が試みられている。しかし、フラビウイルス属ウイルスにおいては、ワクチンが抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を引き起こし、むしろワクチンによってフラビウイルス属ウイルスの感染が悪化することが懸念されている。これは、フラビウイルス属ウイルスはマクロファージに感染してその症状を重症化させうるが、マクロファージが有するＩｇＧ受容体が、フラビウイルス属ウイルスのマクロファージへの取込みを促進し、結果として抗体がフラビウイルス属ウイルスのマクロファージへの感染を促進してしまうためであると考えられる。マクロファージへのウイルス取込みへの影響を最小化するためには、ＩｇＧを産生させないことであり、とくにＩｇＧサブクラスの中ではＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂを産生させないことが望まれる。そのためにはＴ細胞非依存的な抗体誘導、より具体的には、辺縁帯Ｂ細胞およびＢ１Ｂ細胞を刺激して抗体を産生させることが有益である。

【0012】

本明細書では、「アジュバント」とは、免疫を賦活化する物質である。アジュバントとしては、水酸化アルミニウム、およびリン酸アルミニウムが多用されている。

【0013】

本明細書では、「α－ガラクトシルセラミド」とは、海綿の一種であるＡｇｅｌａｓ ｍａｕｒｉｔｉａｎｕｓから単離することができるスフィンゴ糖脂質である。α－ガラクトシルセラミドは、以下構造を有する。

【0014】

【化1】

【0015】

α－ガラクトシルセラミドは、ＣＤ１ｄに結合するリガンドであり、ＮＫＴ細胞を活性化する。α－ガラクトシルセラミドは、単離された、精製された、または合成されたα－ガラクトシルセラミドであり得る。Ｋａｉｎ Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６８（２ Ｐｔ Ａ）：９４－９７，２０１５によれば、α－グリコシルセラミド（α－ＧｌｙＣｅｒ）がＣＤ１ｄリガンドとして生体内でα－ＧａｌＣｅｒと同等の作用を有することが示されている。したがって、α－ＧａｌＣｅｒの代わりにα－ＧｌｙＣｅｒを用い得る。それ以外にも公知の様々なＣＤ１ｄリガンドは同様に用いられ得る。

【0016】

本明細書では、「多重抗原ペプチド」（ＭＡＰ）とは、特定のアミノ酸配列を有するペプチドの多重提示を可能とする分子である。多重抗原ペプチドは、繰り返し構造を有する骨格の側鎖にペプチドが連結された構造を有し得る。骨格とペプチドとは、リンカーを介して連結されていてもよい。多重抗原ペプチドとしては、例えば、樹状高分子の骨格を有するものが挙げられる。樹状高分子骨格を有する多重抗原ペプチドとしては、例えば、リジン（Ｌｙｓ）をコア（核）として含み、ペプチド結合でさらなるリジンがコアに連結することによって、分岐数を増加させた分子であり、分岐数ｎに対して、アミノ基およびそれに連結したペプチドを２ⁿ個｛ここでｎは２以上の自然数である｝まで有するものが挙げられる（Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｊ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９１： ７３； ２４９， Ｓｃｈｏｔｔ， Ｍ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏ． １９９６： １７４： １９９－２０９， Ｔａｍ， Ｊ．Ｐ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９８８： ８５； ５４０９－５４１３）。

【0017】

本明細書では、「樹状高分子」（デンドリマー）とは、中心（コア）から規則的に分岐した構造を有する分子をいう。樹状高分子は、コアと呼ばれる中心分子とデンドロンとよばれる側鎖部分から構成される。樹状高分子は、複数の腕を有し、分岐を形成する核（コア）となる分子のそれぞれの腕に、さらに複数の腕を有し、分岐を形成する分子が連結する。このような複数の腕を有する分岐を形成する分子が連なることによってデンドリマーが形成される。樹状高分子は、デンドロン部分におけるコアからの分岐の連続回数を世代であらわす。中心分子は、第０世代の分岐（Ｇ０）を提供し、デンドロンの根本の分岐は、第１世代の分岐（Ｇ１）を提供し、当該分岐からのさらなる分岐は第２世代の分岐（Ｇ２）を提供し、これが繰り返されて、第ｎ世代の分岐（Ｇｎ）が提供される。

【0018】

本明細書では、「配列番号ｎのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなるフラビウイルス属ウイルスのポリプロテインの部分ペプチド」｛ここでｎは自然数である｝とは、フラビウイルス属ウイルスのポリプロテインの部分ペプチドであって、アラインメントにより配列番号ｎのアミノ酸配列と対応する配列からなるペプチドを意味する。例えば、配列番号1は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＡ８１５５４．１のアミノ酸番号３９２～４１３に対応するアミノ酸配列を有し、フラビウイルス属ウイルスのポリプロテイン（特にエンベロープタンパク質）に共通するアミノ酸配列である（表１参照）。表１では、アミノ酸番号は、ポリプロテインのアミノ酸配列中のアミノ酸番号を示し、太字で示されたアミノ酸配列は、Ｙｉ－Ｃｈｉｎ Ｆａｎ， ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ．Ｔｒｏｐ． Ｄｉｓ．， ２０１５において変異させると中和抗体が中和能を喪失することが示唆された部位である。

【0019】

本発明によれば、
（Ａ）フラビウイルス属ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の一部である１１～３０アミノ酸長を有するペプチドであって、配列番号１０に記載のアミノ酸配列または、配列番号１０のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなるフラビウイルス属ウイルスのポリプロテインの部分ペプチド
が提供される。本明細書では、これらのペプチドを以下では本発明のペプチドということがある。

【0020】

本発明によれば、本発明のペプチドは、
（Ｂ）フラビウイルス属ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の一部である１１～３０アミノ酸長を有するペプチドであって、配列番号１１～１３のいずれかに記載のアミノ酸配列または、当該アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなるポリプロテインの部分ペプチド
であり得る。

【0021】

本発明によれば、（Ｂ１）本発明のペプチドにおいて、配列番号１１～１３のいずれかに記載のアミノ酸配列は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列であり得る。本発明によれば、（Ｂ２）本発明のペプチドにおいて、配列番号１１～１３のいずれかに記載のアミノ酸配列は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列であり得る。本発明によれば、（Ｂ３）本発明のペプチドにおいて、配列番号１１～１３のいずれかに記載のアミノ酸配列は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列であり得る。

【0022】

本発明によれば、上記（Ａ）、（Ｂ）および（Ｂ１）～（Ｂ３）に記載の本発明のペプチドは、１１アミノ酸長、１２アミノ酸長、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、１７アミノ酸長、１８アミノ酸長、１９アミノ酸長、２０アミノ酸長、２１アミノ酸長、２２アミノ酸長、２３アミノ酸長、２４アミノ酸長、２５アミノ酸長、２６アミノ酸長、２７アミノ酸長、２８アミノ酸長、２９アミノ酸長、もしくは３０アミノ酸長、またはそれ以上であり得る。多重抗原ペプチドは、抗原ペプチドの長さは、１１アミノ酸以上である場合に効果的に抗体産生誘導能を示す。多重抗原ペプチドは、抗原の数は４以上である場合に効果的に抗体産生誘導能を示す。

【0023】

本発明によれば、（Ｃ）本発明のペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含み得る。すなわち、本発明によれば、
配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、または、配列番号９のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなるフラビウイルス属ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の部分ペプチド
が提供される。

【0024】

本発明によれば、（Ｄ）本発明のペプチドは、配列番号１～７のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み得る。本発明によれば、（Ｄ’）本発明のペプチドは、配列番号１～７のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり得る。

【0025】

本発明のペプチドは、単離されているか、または精製されている。本発明のペプチドは、人工的に合成されたものであり得る。

【0026】

配列番号９～１３に記載のアミノ酸配列は、フラビウイルスに特異的な抗体を誘導し得る。配列番号９～１３に記載のアミノ酸配列は、フラビウイルスすべてに広く保存されている。これに対して、当該アミノ酸配列とそれに連続するアミノ酸配列を含むより長いペプチドは、特定のフラビウイルスへの高い指向性を有し得る。

【0027】

配列番号１～７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドはそれぞれ、２２アミノ酸長である。配列番号１～７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、多重抗原ペプチドに組込むことで、フラビウイルスに特異的な抗体を誘導することができる。配列番号１～７に記載のアミノ酸配列は、フラビウイルスすべてに広く保存されている。これに対して、当該アミノ酸配列とそれに連続するアミノ酸配列を含むより長いペプチドは、特定のフラビウイルスへの高い指向性を有し得る。

【0028】

配列番号１～７に記載のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列からなるフラビウイルス属ウイルスのポリプロテインの部分ペプチドは、上記に定義される通りである。ある態様では、この部分ペプチドは、配列番号１～７のいずれかに対応するアミノ酸配列がそれぞれ、配列番号１～７のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１塩基の付加、挿入、置換、および欠失のいずれかを有し得る。置換は、保存的置換であり得る｛例えば、塩基性アミノ酸間の置換、酸性アミノ酸間の置換、疎水性アミノ酸間の置換、および非荷電性親水性側鎖を有するアミノ酸間の置換｝。置換としては、例えば、保存的置換（例えば、酸性アミノ酸間の置換、塩基性アミノ酸間の置換、および疎水性アミノ酸間の置換等）が挙げられる。また、ある態様では、この部分ペプチドは、配列番号９に記載されるアミノ酸配列：ＤＲＧＷＧＮＸ₁ＣＧＸ₂ＦＧＫＧＸ₃ＩＸ₄Ｘ₅ＣＸ₆ＫＸ₇｛ここで、Ｘ₁は、ＧまたはＨであり、Ｘ₂は、ＦまたはＬであり、Ｘ₃は、ＧまたはＳであり、Ｘ₄は、Ｄ、ＶまたはＬであり、Ｘ₅はＴまたはＡであり、Ｘ₆はＡまたはＶであり、Ｘ₇は、ＦまたはＡである｝を有し得る。また、ある好ましい対象では、（Ｄ１）この部分ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる配列を有し得る。ある好ましい対象では、（Ｄ２）この部分ペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる配列を有し得る。ある好ましい対象では、（Ｄ３）この部分ペプチドは、配列番号３ある好ましい対象では、（Ｄ４）この部分ペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる配列を有し得る。に記載のアミノ酸配列からなる配列を有し得る。ある好ましい対象では、（Ｄ５）この部分ペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる配列を有し得る。ある好ましい対象では、（Ｄ６）この部分ペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる配列を有し得る。ある好ましい対象では、（Ｄ７）この部分ペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる配列を有し得る。

【0029】

本発明によれば、本発明のペプチドを含む多重抗原ペプチド（以下、「本発明の多重抗原ペプチド」ということがある）が提供される。多重抗原ペプチドにおいては、樹状高分子骨格の最末端部に本発明のペプチドが連結している。当該最末端部と本発明のペプチドとは、リンカーを介して連結されていてもよい。連結は共有結合であり得る。リンカーは、ペプチドの提示を著しく妨げない限り特に限定されないが、ポリエチレングリコールやフレキシブルリンカーなどのリンカー（例えば、非ペプチド性のリンカー）を用いることができる。リンカーとしては、ペプチド性のリンカーを用いてもよい。ペプチド性のリンカーを用いる場合には、ＧＳリンカーなどのフレキシブルリンカー、および、αヘリックス構造またはβシート構造などの二次構造を有するリンカーが用いられ得る。本発明の多重抗原ペプチドにおいては、本発明のペプチドは、１以上含まれ得る。ある好ましい態様では、本発明の多重抗原ペプチドにおいては、本発明のペプチドは、４以上含まれ得る。ある好ましい態様では、本発明の多重抗原ペプチドにおいては、本発明のペプチドは、８以上含まれ得る。本発明の多重抗原ペプチドは、好ましくは単離または精製されている。

【0030】

本発明のある態様では、本発明の多重抗原ペプチドは、
樹状高分子の骨格および本発明の多重抗原ペプチドを含み、樹状高分子のコアがリジンであり、当該リジンを第０世代として、以下（要件１）が、ｋが１～ｎのいずれの自然数においても満たされ、第ｎ世代のリジンのアミノ基それぞれに本発明のペプチドが連結している、多重抗原ペプチド：
（要件１）第ｋ－１世代のリジンのアミノ基のアミノ基それぞれに第ｋ世代のリジンがペプチド結合している。

【0031】

上記の態様において、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、好ましくは、２、３、または４であり、より好ましくは２または３であり得る。すなわち、本発明のこの態様では、４価～２ⁿ⁺¹価の多重抗原ペプチドが提供され得る。

【0032】

本発明のある態様では、本発明の多重抗原ペプチドは、
樹状高分子の骨格および本発明の多重抗原ペプチドを含み、樹状高分子のコアがリジンであり、当該リジンの２つのアミノ基それぞれに第１世代の分岐を形成するリジンがペプチド結合しており、前記第１世代の分岐を形成するリジンのアミノ基それぞれに本発明のペプチドが連結しており、４つの前記ペプチドを含む、多重抗原ペプチド（すなわち、４価の多重抗原ペプチド）であり得る。

【0033】

本発明のある態様では、本発明の多重抗原ペプチドは、
樹状高分子の骨格および本発明の多重抗原ペプチドを含み、樹状高分子のコアがリジンであり、当該リジンの２つのアミノ基それぞれに第１世代の分岐を形成するリジンがペプチド結合しており、前記第１世代の分岐を形成するリジンのアミノ基それぞれに第２世代の分岐を形成するリジンがペプチド結合しており、前記第２世代を形成するリジンのアミノ基それぞれに本発明のペプチドが連結しており、４つ～８つの前記ペプチドを含む、多重抗原ペプチド（すなわち、４価～８価の多重抗原ペプチド）。

【0034】

ある好ましい態様では、本発明の多重抗原ペプチドは、下記式（Ｉ）示される構造を有する４価の多重抗原ペプチド（ＭＡＰ－４）または下記式（ＩＩ）に示される構造を有する８価の多重抗原ペプチド（ＭＡＰ－８）であり得る。分岐の世代数ｎに対応して、４価～２ⁿ⁺¹価の多重抗原ペプチド（ＭＡＰ－２ⁿ⁺¹）が提供される。

【0035】

【化2】

【0036】

【化3】

【0037】

これらの多重抗原ペプチドは、樹脂に固相化した樹状の骨格に対して、ペプチドを導入することによって合成することができる。より具体的には、ＭＡＰ－４に関しては、以下式（ＩＩＩ）の構造を有する樹状の骨格を有する樹脂に対してペプチドを導入することができる。

【0038】

【化4】

【0039】

また、ＭＡＰ－８は、以下式（ＩＶ）の構造を有する樹脂に対してペプチドを導入した。

【0040】

【化5】

【0041】

ある好ましい態様では、本発明の多重抗原ペプチドは、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の構造を有し得る｛ここでペプチドは、本発明のペプチドである｝。

【0042】

ある好ましい態様では、本発明の多重抗原ペプチドは、以下式（ＶＩ）の構造を有し得る。

【化6】

【0043】

｛ここで、Ｒは、－リンカー－ペプチド、または－ペプチドであり、ペプチドは本発明のペプチドのアミノ酸配列を含み得る。｝。この構造は、リジンが２つのアミノ基を有し、分岐点として構造的に適していることから選択された構造である。なお、ＭＡＰ－８は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物２つが、式（ＶＩ）中の第０世代のリジンのカルボキシル基を介して、さらなるリジンのアミノ基それぞれに連結した構造を有し得る。同様にして、第ｎ世代の分岐を有するＭＡＰ－２ⁿ⁺¹それぞれの構造を規定できる。

【0044】

上記においてリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。ある好ましい太陽では、ＰＥＧは、例えば、重合度２～３０のＰＥＧであり得、重合度５～２０のＰＥＧであり得、重合度１０～１５のＰＥＧであり得る。

【0045】

上記式（ＶＩ）の構造を有する化合物は、以下式（ＶＩＩ）の構造を有する化合物のアセチレン基（－Ｃ≡ＣＨ）に対して、クリックケミストリーによってペプチドまたはペプチド－リンカー化合物を反応させることによって得られ得る。より具体的には、以下式（ＶＩＩ）の構造を有する化合物に対して、末端にアジド基を有するペプチド－アジド基またはペプチド－リンカー－アジド基と１価銅イオン存在下で反応させることにより得られ得る。

【化7】

【0046】

式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物の合成中間体であり、第１世代の分岐を提供するリジンのアミノ基に対して、反応の便宜上、側鎖にアセチレン基を有する人工アミノ酸をペプチド結合によって連結させて、末端に反応性のアセチレン基を設けたものである（例えば、ＷＯ２０１５／１９０５５５Ａ参照）。なお、ＭＡＰ－８の合成中間体は、式（ＶＩＩ）の構造を有する化合物２つが、式（ＶＩＩ）中の第０世代のリジンのカルボキシル基を介して、さらなるリジンのアミノ基それぞれに連結した構造を有し得る。同様にして、第ｎ世代の分岐を有するＭＡＰ－２ⁿ⁺¹の合成中間体それぞれの構造を規定できる。

【0047】

本発明の多重抗原ペプチドは、例えば、ＷＯ２０１８／０８４２４７Ａに記載の方法に従って作製することができる。

【0048】

ある好ましい態様では、本発明の多重抗原ペプチドは、多重同種抗原ペプチドであり得る。多重同種抗原ペプチドにおいては、すべての抗原ペプチドが同一のアミノ酸配列を有する。

【0049】

別の好ましい態様では、本発明の多重抗原ペプチドは、２種以上の異なるアミノ酸配列を有するペプチドを抗原ペプチドとして含み得る。

【0050】

本発明では、本発明の多重抗原ペプチドは、対象に投与して、当該対象に免疫（特に、抗原特異的免疫）を誘導することに用いることができる。本発明では、本発明の多重抗原ペプチドは、対象に投与して、抗原特異的な抗体産生を誘導することに用いることができる。また、本発明では、本発明の多重抗原ペプチドは、対象に投与して、コロナウイルスに対する抗体を誘導することに用いることができる。抗原特異的な抗体は、中和抗体（例えば、感染を中和することができる抗体）であり得る。抗原特異的な抗体は、ＩｇＭであり得る。抗原特異的な抗体は、辺縁帯B細胞およびＢ１Ｂ細胞から産生されるマクロファージが有するＩｇＧ受容体には結合しない抗体サブクラスであり得る。

【0051】

本発明では、本発明の多重抗原ペプチドを含む免疫原性組成物（「本発明の免疫原性組成物」ということがある）が提供される。本発明の免疫原性組成物は、ワクチンとして用いることができる。

【0052】

本発明のワクチンは、フラビウイルスに広く有効であり得る。本発明のワクチンは、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、およびダニ媒介性脳炎ウイルス並びにその変異体ウイルスからなる群から選択されるフラビウイルス属ウイルスに対して有効であり得る。

【0053】

本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、ヘルパーT細胞（またはＴ細胞依存性免疫）を刺激するアジュバント（例えば、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、例えば、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、流動パラフィン、ラノリン、沈降性アジュバント）と併用しなくてもよく、好ましくは併用しない。本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、アジュバント（例えば、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、例えば、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、流動パラフィン、ラノリン、沈降性アジュバント）を含まなくてもよく、好ましくは含まない。ただし、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、α－ガラクトシルセラミドなどのヘルパーT細胞（Ｔ細胞依存性免疫）を刺激しない作用剤と好ましく併用することができる。本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、α－ガラクトシルセラミドなどのヘルパーT細胞（Ｔ細胞依存性免疫）を刺激しない作用剤をさらに含んでいてもよい。

【0054】

本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、本発明の多重抗原ペプチドと薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでいてもよい。本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経鼻投与、経粘膜投与、吸入投与）されるものであり得る。したがって、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経鼻投与、経粘膜投与、吸入投与）に適した担体および／または賦形剤を用いることができる。薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤としては、例えば、塩、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、保存剤、および水が挙げられる。

【0055】

本発明によれば、免疫原性組成物またはワクチンは、対象においてフラビウイルスに対する抗体を産生させること、またはフラビウイルスに対する免疫を確立することに用いるための組成物であり得る。

【0056】

本発明によれば、対象においてフラビウイルスに対する抗体を産生させることに用いるための本発明の多重抗原ペプチドが提供される。本発明によれば、対象においてフラビウイルスに対する抗体を産生させることに用いるための本発明の多重抗原ペプチドが提供される。

【0057】

本発明によれば、免疫原性組成物またはワクチンの製造における本発明のペプチドの使用が提供される。本発明によれば、免疫原性組成物またはワクチンの製造における本発明の多重抗原ペプチドの使用が提供される。免疫原性組成物またはワクチンは、対象においてフラビウイルスに対する抗体を産生させること、またはフラビウイルスに対する免疫を確立することに用いるための免疫原性組成物またはワクチンであり得る。

【0058】

本発明によれば、対象に抗原ペプチドを導入する方法であって、当該対象に本発明の多重抗原ペプチドを投与することを含む方法が提供される。本発明によれば、対象において抗原特異的な免疫を賦活化する方法であって、当該対象に有効量の本発明の多重抗原ペプチドを投与することを含む方法が提供される。本発明によれば、対象においてフラビウイルスに対する免疫を賦活化する方法であって、当該対象に有効量の本発明の多重抗原ペプチドを投与することを含む方法が提供される。

【実施例0059】

実施例１：抗原ペプチドの合成
日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスの表面タンパク質のアミノ酸配列のうち、相同性の高い部位で、かつ論文上（Ｙｉ－Ｃｈｉｎ Ｆａｎ， ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ．Ｔｒｏｐ． Ｄｉｓ．． ２０１５）報告された中和抗体の結合部位（下記表太字部分）のアミノ酸を含有する、2１残基のアミノ酸からなる部分ペプチドとした。ＭＡＰのペプチド部分の配列としては、日本脳炎ウイルスの部分配列を用いた。これを黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスの配列と比較した場合、下線を付したアミノ酸が異なる。

【0060】

【表1】

※アミノ酸配列に記載された数字は、タンパク質中の末端のアミノ酸それぞれのアミノ酸番号を表す。
※アミノ酸配列中の太字は、中和抗体が結合すると予想される配列を示す。
※アミノ酸配列中の下線を付されたアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸配列と相違するアミノ酸である。

【0061】

表１に示されるように、選択した日本脳炎ウイルスの表面タンパク質の部分ペプチドに相当する２２の連続したアミノ酸配列部分は、フラビウイルスにおいて高い相同性を示した。

【0062】

配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを常法に基づいて人工合成し、下記式（Ｉ）示される構造を有する４価の多重抗原ペプチド（ＭＡＰ－４）および下記式（ＩＩ）に示される構造を有する８価の多重抗原ペプチド（ＭＡＰ－８）を作製した。

【0063】

【化8】

【0064】

【化9】

【0065】

これらの多重抗原ペプチドは、樹脂上での効率的な合成の目的で、樹脂に固相化した樹状の骨格に対して、ペプチドを導入することによって合成した。より具体的には、ＭＡＰ－４に関しては、以下式（ＩＩＩ）の構造を有する樹状の骨格を有する樹脂に対してペプチドを導入した。

【0066】

【化10】

【0067】

また、ＭＡＰ－８は、以下式（ＩＶ）の構造を有する樹脂に対してペプチドを導入した。

【0068】

【化11】

【0069】

上記式において、リジン（Ｌｙｓ）は、２つのアミノ基を有するアミノ酸である。それぞれのアミノ基に対して、２つリジンのカルボキシル基をペプチド結合により連結すると、末端の２つリジンは合計４つのアミノ基を有する樹状の骨格となる。当該リジンのアミノ基に対して、リンカーを介してペプチドを導入することによって、４価の多重抗原ペプチド（ＭＡＰ－４）を作製することができる。

【0070】

また、ＭＡＰ－８は、末端のリジン（Ｌｙｓ）をさらにそれぞれ２つに分岐させて、８つのＦｍｏｃ保護基を有するＬｙｓ残基を有する樹脂に対してペプチドを導入した。上記の合計４つのアミノ基を有する樹状の骨格のリジン残基の４つのアミノ基それぞれに対して４つのリジンのカルボキシル基をペプチド結合により連結すると、末端の４つのリジンは合計で８つのアミノ基を有する樹状の骨格となる。当該リジンのアミノ基に対して、リンカーを介してペプチドを導入することによって、４価または８価の多重抗原ペプチドを作製することができる。

【0071】

上記ペプチドを導入する際には、ペプチドのＣ末端にリンカーを導入した。本実施例では、リンカーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた。ポリエチレングリコールは、重合度１２のＰＥＧ（「ＰＥＧ（１２）」とも表記する）であった。

【0072】

ＭＡＰ－４のより具体的な構造は以下に示されるとおりであった。

【0073】

【化12】

【0074】

｛ここで、Ｒは、－ＰＥＧ（１２）－ペプチドである。｝

【0075】

上記ＭＡＰ－４およびＭＡＰ－８は、例えば、ＷＯ２０１８／０６２２１７Ａを参照して作製することができる。

【0076】

そして、得られたペプチドを０．１％ ２，２，２－トリフルオロ酢酸とアセトンを用いて樹脂から離脱させ、その後、遊離したＭＡＰ－４およびＭＡＰ－８を高速液体クロマトグラフィーにより精製して、ＭＡＰ－４およびＭＡＰ－８を得た（それぞれ、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰ－４およびＦｌａｖ－ｍＭＡＰ－８と呼ぶ）。

【0077】

実施例２：投与実験
投与実験は、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌、８週齢）に対して図１に示されるスキームにしたがって行った。具体的には、マウスに対して、図１に示されるように、０週目、１週目、および５週目において、実施例で得たＦｌａｖ－ｍＭＡＰ－４またはＦｌａｖ－ｍＭＡＰ－８を投与した。また、図１に示されるように、０週目、３週目、５週目、６週目、および７週目でマウスからそれぞれ採血し、抗体産生の有無、および経時的変化を確認した。

【0078】

Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰ４の投与量は１００μｇ／投与とし、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰ８の投与量は、１００μｇ／投与または２００μｇ／投与とした。また、投与２回目の際には、α－ガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００， フナコシ社）を０．１μｇ／マウスを併用した。詳細は、表２に示される通りである。

【0079】

【表2】

【0080】

採血した血清中の抗体価測定は、以下のように行った。選択した日本脳炎ウイルスの表面タンパク質の部分ペプチドに相当する２２の連続したアミノ酸配列部分にＦＬＡＧタグ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号８）を連結させた。得られたペプチド（ＪＥＶペプチド）をさらにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させて、ＪＥＶペプチドとＢＳＡとのコンジュゲートタンパク質を作製した。得られたコンジュゲートタンパク質をプレート表面に固相化し、ＥＬＩＳＡを行った。具体的には、コンジュゲートタンパク質をＥＬＩＳＡプレートに５μｇ／ｍｌの濃度で３７℃で１時間インキュベートして固相化した後、室温３０分でブロッキング（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ， Ｔｈｅｒｎｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を行い、プレート洗浄後に、被検試料としてＰＢＳで５０００倍希釈したマウス血清を添加して反応させた。その後、プレートを洗浄し、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ、そしてＩｇＧサブクラスを検出するためそれぞれ、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＭヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｒｃｈ社）およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｒｃｈ社）、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ１ヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｒｃｈ社）、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ２ａヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｒｃｈ社）、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ２ｂヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｒｃｈ社）、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ３ヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｒｃｈ社）を５０００倍希釈で用い、発色基質として３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加え、最終的に吸光プレートリーダにて吸光度を測定した。

【0081】

その結果、図２に示されるように、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰ－４を投与した第１群では、弱い抗体産生が認められた。これに対して、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰ－８を投与した第２群および第３群の方がＦｌａｖ－ｍＭＡＰ－４を投与した第１群より抗体価が高かった。さらに２００μｇ投与の第３群の方が個体間の抗体産生強度の差が小さく、安定した抗体産生を誘導できることがわかった。

【0082】

上記第３群における血清中のＩｇＭの誘導については、図３に示される通りであった。図３に示されるように、ＩｇＭは、２回目のＦｌａｖ－ｍＭＡＰ－８投与後に上昇し、抗体産生記憶Ｂ細胞の確立が示唆された。また、３回目のＦｌａｖ－ｍＭＡＰ－８投与後にも抗体価が上昇したことから、誘導されたＩｇＭ産生細胞は、メモリー細胞となって記憶免疫を成立させていることが明らかになった。このように、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰは、ＩｇＭを誘導し、その記憶を免疫細胞に維持させることができることが明らかになった。したがって、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰは、ワクチンとして利用できると考えられる。

【0083】

次に、上記第３群から採血した血清中のＩｇＧ抗体のサブクラスについてＥＬＩＳＡを用いて検証した。結果は、図４に示される通りであった。図４に示されるように、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰにより産生誘導されるサブクラスは、マウスではＩｇＧ１が主であり、その他は、産生されたとしても微量であるか一時的なものであることが明らかになった。また、マウスにおけるＩｇＧ１は、マクロファージなどのエフェクター細胞表面上のＦｃ受容体には結合が弱いため、フラビウイルス属ウイルスのワクチンにおける最大の副作用と考えられる抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）は、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰにより誘発される可能性を低減できると考えられた。このように、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰテクノロジーは、フラビウイルス属ウイルスのワクチンとして有益であると考えられた。

【0084】

実施例３：ウイルス中和能の測定実験
実施例２では、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰの投与により、動物体内でＩｇＭを中心とした抗体産生が誘導されること、および記憶免疫を誘導し、抗体産生能が長期にわたって維持されることを見出した。本実施例では、産生された抗体のウイルス中和能を評価した。

【0085】

Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰ－８で免疫したマウスから採血し、血清を得た。得られた血清を用いて、Ｖｅｒｏ細胞に対する日本脳炎ウイルスの感染系における抗体の中和活性を測定した。なお、この測定にはＦｌａｖ－ｍＭＡＰ投与後９週目の血清を用いた。その際の血中ＩｇＧ濃度を前出と同様のＥＬＩＳＡ系にて測定した。ここで、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰ－８に用いたペプチド抗原に対する抗体を得ることは困難であったので、本ＥＬＡＳＡ系では、当該ペプチド抗原をＦｌａｇタグ付きのＢＳＡと連結させ、検出抗体として抗ＦＬＡＧタグ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を用いることで検量線を描き、血中抗体濃度を推定した。結果は図５に示される通りであった。

【0086】

次に、ウイルスの中和活性は、８０％プラーク減数中和試験により行った。ウイルス株ＪＥＶ／ｓｗ／Ｃｈｉｂａ／８８／２００２を用い、希釈した被検血清と１００ＰＦＵウイルスを混合後、１．５時間３７℃でインキュベートした。その後、６穴プレートにＶｅｒｏ９０１３細胞を播種し、播種２４時間後にウイルスと血清の混合液を細胞に接種し、３７℃で１．５時間インキュベートした。０．８％アガロースゲル含有培養液を重層した後、さらに３７℃で４日培養後、ホルマリンで固定してクリスタルバイオレットで染色し、プラーク数を計測した。ウイルスにより細胞が剥離するとプラークが形成される。抗体がウイルス中和活性を有している場合、形成されるプラーク数は減少する。そこで、本実施例では、示された濃度の抗体の存在下におけるこのプラークの減少率を求め、抗体の中和能を評価した。実験は２回繰り返した。結果は、表３に示される通りであった。

【0087】

【表3】

【0088】

表３に示されるように、２回の実験の平均値において、投与前のプールド血清を用いた実験よりも、免疫後のマウスにおいては高い中和結果が得られた。マウス５においては、高い抗体産生を誘発し、高い中和能が誘導された。特に抗ペプチド抗体濃度が２０μｇ／ｍｌを越えるケースにおいて、顕著に高い中和能が認められた。

【0089】

次に動物モデルを用いてＦｌａｖ－ｍＭＡＰのウイルス中和能を検討した。実験系としては、図６に示されるスキームを採用した。すなわち、雌マウスにＦｌａｖ－ｍＭＡＰ－８を投与し、免疫を形成させた上で、妊娠させ、仔マウスを出産させる。仔マウスに対してウイルス接種し、母マウスと仔マウスとを一緒に飼育した。母マウスから授乳した仔マウスおよび母マウスの感染防御を確認した。Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰ－８は、２００μｇ／マウス／回とし、２回目の投与時には、０．１μｇのα－ＧａｌＣｅｒを併用投与した。対象群には、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰ－８の代わりにＰＢＳを投与した。なお、本実験系は、日本脳炎ウイルスの毒性が強く、直接ウイルスを感染させるとマウスが死亡してしまうため、仔マウスにウイルスを感染させ、親マウスは仔マウスから感染させることによる緩やかな自然感染系とし、感染後早期に中和抗体が産生誘導されるかどうかを検証するための系として構築されたものである。

【0090】

結果、仔マウスは、感染５日目（産後１４日目）で感染により死亡した。仔マウスにおけるウイルス感染防御は十分でなかった可能性が示唆される。他方で、産後１４日目の母マウスの血清を採取し、血清による日本脳炎ウイルス中和活性を上記のプラークアッセイを用いて測定した。すると、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰ－８投与群においては、その上、図７に示されるように、感染前と感染5日後との比較によれば、母マウスにおいて、仔マウスからのウイルス感染をトリガーとして、ウイルス感染防御能が向上することが明らかになった。すなわち、事前のＦｌａｖ－ｍＭＡＰ－８投与により、ウイルス感染に対する応答性が高まったことが示唆され、Ｆｌａｖ－ｍＭＡＰ－８が母マウスに記憶免疫をもたらし、ウイルス感染に伴って免疫が誘導されたことが明らかとなった。

【0091】

［考察］
抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）は、マクロファージに感染するデング熱、ジカ熱、エボラ出血熱ウイルスなどでよく知られており、ウイルスタンパク質を使う従来の不活化ワクチンではこれを避けることができない。ウイルスタンパク質はＴ細胞を介した免疫反応を刺激して抗体を産生に至るため（Ｔ細胞依存性）ＩｇＧ受容体に高親和性ＩｇＧを誘導してしまいＡＤＥを誘発するためである。そこで、ＡＤＥを回避するためにＩｇＧ受容体に結合しない抗体誘導、つまりＴ細胞を介さずにＢ細胞を直接刺激すること（Ｔ細胞非依存性）によってそれが可能となり（Ｓａｒａｖａｎａｎ， Ｐ．， ｅｔ． ａｌ．， Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．， （４８） ３９－４５， ２００４）、技術的には多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）によるワクチンがその具体的方法に相当する。

【0092】

本実施例は、８つの抗原ペプチドを提示する（すなわち、８価の）多重抗原ペプチドは、ヘルパーT細胞を介さずに辺縁帯B細胞およびＢ１Ｂ細胞を直接刺激し、ＩｇＭ、および、ＩｇＧ受容体に結合しないＩｇＧのサブクラス（マウスの場合は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３）を産生することを示す。多重抗原ペプチドは、辺縁帯B細胞およびＢ１Ｂ細胞を直接刺激して、表面に発現したＢ細胞受容体にクラスターを形成させ、これによってB細胞を刺激して抗原特異的な抗体産生を刺激したものと考えられる。

【0093】

ＩｇＧのサブタイプ別に血清中抗体量を測定すると、ＩｇＧ受容体に結合しない、あるいは親和性が弱い（結合力が弱い）サブタイプである、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３が誘導され、ＩｇＧ受容体に結合するＩｇＧ２ａは誘導されなかった。このことは、ＭＡＰで免疫刺激した動物体内では、辺縁帯B細胞およびＢ１Ｂ細胞が直接刺激され、これにより、ＩｇＧ受容体に結合しないタイプの抗体しか誘導されないこと、および当該抗体産生誘導がＴ細胞非依存的であることを示唆するものである。

【0094】

この結果は、ＭＡＰが刺激するＢ細胞は、辺縁帯Ｂ細胞および粘膜や漿膜に存在するＢ１Ｂ細胞であり、上記のＴ細胞依存性に抗体を産生する濾胞Ｂ細胞とは異なる。辺縁帯Ｂ細胞およびＢ１Ｂ細胞よって産生される抗体は主にＩｇＧ受容体に結合しない抗体（ＩｇＭおよびマウスの場合ＩｇＧ３）、あるいは結合能の低いＩｇＧサブクラス（マウスの場合ＩｇＧ１）である（Ｂｅｎｎｅｔｔ， ＫＭ．， ｅｔ． ａｌ．， ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， （１５）７１， ２０１５）との知見と一貫するものである。

【0095】

また、Ｔ細胞依存性の刺激で産生されるＩｇＭは７～１０日間ほど血中から消失するものの、Ｔ細胞非依存性で産生されたＩｇＭは血中に長く存在し（マウスでは９０日程度）（Ｄｉｎｔｚｉｓ， ＨＭ， ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ， （７３） ３６７１－５， １９７４）、ある程度の長期間にわたってウイルス防御が期待できる。

【0096】

上記結果によれば、ＡＤＥの回避は、ＩｇＧ受容体に結合しない抗体誘導、つまりＴ細胞を介さずにＢ細胞を直接刺激すること（Ｔ細胞非依存性）によってそれが可能となり（Ｓａｒａｖａｎａｎ， Ｐ．， ｅｔ． ａｌ．， Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．， （４８） ３９－４５， ２００４）、技術的には多重抗原ペプチドによるワクチンによりＡＤＥの回避が可能になると期待される。

【0097】

本発明のペプチドは、フラビウイルス属全般に広く保存されたアミノ酸配列であった。従って、本発明のペプチドは、フラビウイルス属全般に対して有効な抗体を産生させるものとなり得る。また、フラビウイルス属全般において広く保存されているということは、度重なる天然の突然変異にもかかわらず、保存されてきた配列であることが示唆され、すなわち、本発明の多重抗原ペプチドは、突然変異に強い多重抗原ペプチド（ｍｕｔａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ＭＡＰ；ｍＭＡＰ）であり、今後生み出されうるフラビウイルス属に対しても有効であることが示唆される。

【0098】

さらには、化学合成によって作製できるＭＡＰは、培養工程が必要な組換タンパク質やベクターを用いるワクチンと異なり、迅速に大量生産が可能であり、フラビウイルス属ウイルスの対策のように喫緊の対策を要する感染症のワクチンとして最適な手法でもあると考えられる。

【0099】

また、本実施例により、多重抗原ペプチドは、記憶免疫を成立させ、フラビウイルスに対する長期的な免疫効果を付与する点も注目するべき点である。

【0100】

配列表の説明
配列番号１：
抗原ペプチド候補としての日本脳炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の一部；
配列番号２：
抗原ペプチド候補としての黄熱ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の一部；
配列番号３：
抗原ペプチド候補としてのウエストナイルウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の一部；
配列番号４：
抗原ペプチド候補としてのデングウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の一部；
配列番号５：
抗原ペプチド候補としてのジカウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の一部；
配列番号６：
抗原ペプチド候補としてのセントルイス脳炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の一部；
配列番号７：
抗原ペプチド候補としてのダニ媒介性脳炎ウイルスのポリプロテインのアミノ酸配列の一部；
配列番号８：
ＦＬＡＧタグのアミノ酸配列；
配列番号９：
抗原ペプチド候補のアミノ酸配列（２２アミノ酸長）；
配列番号１０：
中和抗体が結合する抗原ペプチド中の部分配列（７アミノ酸長）のアミノ酸配列；
配列番号１１：
中和抗体が結合する抗原ペプチド中の部分配列（１１アミノ酸長）の一例のアミノ酸配列；
配列番号１２：
中和抗体が結合する抗原ペプチド中の部分配列（１１アミノ酸長）の一例のアミノ酸配列；
配列番号１３：
中和抗体が結合する抗原ペプチド中の部分配列（１１アミノ酸長）の一例のアミノ酸配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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