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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022057665
(43)【公開日】2022-04-11
(54)【発明の名称】ヘミセルロース糖化用酵素組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 9/24 20060101AFI20220404BHJP
C12P 19/02 20060101ALI20220404BHJP
【ＦＩ】
C12N9/24 ZNA
C12P19/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020166043
(22)【出願日】2020-09-30
(71)【出願人】
【識別番号】000006884
【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】齊藤 祐樹
(72)【発明者】
【氏名】重久 晃
(72)【発明者】
【氏名】渡邊 洋平
(72)【発明者】
【氏名】佃 直紀
(72)【発明者】
【氏名】小原 薫
(72)【発明者】
【氏名】原 妙子
(72)【発明者】
【氏名】松本 敏
(72)【発明者】
【氏名】辻 浩和
(72)【発明者】
【氏名】松木 隆広
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B050CC01
4B050CC03
4B050DD02
4B050KK07
4B050LL02
4B050LL05
4B064AF02
4B064BJ10
4B064CA19
4B064CA21
4B064CB07
4B064CC24
4B064CD24
4B064DA16
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ヘミセルロースの糖化に有用な酵素製剤及びそれを用いたヘミセルロースの糖化方法の提供。
【解決手段】特定のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質と、別の特定のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質と、を含有するヘミセルロース糖化用酵素組成物。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質と、別の特定のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質と、を含有するヘミセルロース糖化用酵素組成物。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記のＡで示されるアラビノフラノシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質と、Ｂで示されるキシロシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質とを含有する、ヘミセルロース糖化用酵素組成物。
Ａ：アラビノフラノシダーゼ
（Ａ１）配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ａ２）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
Ｂ：キシロシダーゼ
（Ｂ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ２）配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ３）配列番号１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
Ａ：アラビノフラノシダーゼ
（Ａ１）配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ａ２）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
Ｂ：キシロシダーゼ
（Ｂ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ２）配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ３）配列番号１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項2】
請求項１に記載の酵素組成物を用いる、ヘミセルロースの糖化方法。
【請求項3】
配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項4】
配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヘミセルロースの糖化に有用な酵素組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、作物や木材の収穫後の残渣等、農業生産の副産物として生じる植物バイオマスは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。植物バイオマスの主要構成要素は、セルロース、ヘミセルロース等の多糖類とリグニンである。
【0003】
バイオマス中のセルロースやヘミセルロースを効率よく分解するにはセルラーゼ及びヘミセルラーゼが共に必要であり、酵素の種類や組成が大きく影響する。このため、近年、最適な糖化酵素を求めて開発が進められ、特にヘミセルラーゼの最適化は重要とされている。ヘミセルロースはグルコース以外の糖を含むヘテロ多糖であり，植物の種類によって異なるが、多くはアラビノキシランである。キシランの加水分解には、キシラナーゼ（エンド－１，４－β－キシラナーゼ）及びβ－キシロシダーゼが必要とされる。β－キシロシダーゼは、キシラナーゼによるヘミセルロースの加水分解により生じたオリゴ糖（キシロオリゴ糖）を加水分解し、単糖を生成するプロセスに関わる加水分解酵素の一つである。また、アラビノキシランは，α－Ｌ－アラビノフラノシダーゼによって、α－１，２及び／又はα－１，３結合したアラビノース側鎖が非還元末端側から加水分解され、Ｌ－アラビノフラノースが遊離される。
【0004】
例えば、特許文献１には、ヘミセルラーゼとして、トリコデルマ・レセイ由来のβ-キシロシダーゼ（ＢＸＬ１）とトリコデルマ・レセイ由来のアラビノフラノシダーゼ（ＡＢＦ１、ＡＢＦ２、及びＡＢＦ３から選択された２以上）を含有する酵素組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特許第５６９０７１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ヘミセルロースの糖化に有用な酵素組成物及びそれを用いたヘミセルロースの糖化方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、ヒトの腸内より見出されたキシラン類を資化できるビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）から基質特異性の異なる２種のアラビノフラノシダーゼと、３種のキシロシダーゼを新たに単離し、これらがヘミセルロースの糖化に使用可能であることを見出した。
【0008】
すなわち、本発明は以下の（１）～（４）に係るものである。
（１）下記のＡで示されるアラビノフラノシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質と、Ｂで示されるキシロシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質とを含有する、ヘミセルロース糖化用酵素組成物。
Ａ：アラビノフラノシダーゼ
（Ａ１）配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ａ２）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
Ｂ：キシロシダーゼ
（Ｂ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ２）配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ３）配列番号１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（２）（１）に記載の酵素組成物を用いる、ヘミセルロースの糖化方法。
（３）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質。
（４）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質。
（１）下記のＡで示されるアラビノフラノシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質と、Ｂで示されるキシロシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質とを含有する、ヘミセルロース糖化用酵素組成物。
Ａ：アラビノフラノシダーゼ
（Ａ１）配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ａ２）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
Ｂ：キシロシダーゼ
（Ｂ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ２）配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ３）配列番号１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（２）（１）に記載の酵素組成物を用いる、ヘミセルロースの糖化方法。
（３）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質。
（４）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、ヘミセルロース、特にアラビノキシランを多く含むヘミセルロースを効率よく糖化することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本発明のアラビノフラノシダーゼ及びキシロシダーゼのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果。
【図2】（Ａ）アラビノキシラン分解物を各酵素と反応させたときに生じるキシロースおよびアラビノースの量。（Ｂ）本発明のアラビノフラノシダーゼの基質特異性。（Ｃ）本発明のキシロシダーゼの代謝活性。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の配列同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Science, 1985, 227:1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【0012】
本明細書において、アミノ酸配列又は塩基配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性をいう。また、「少なくとも９５％の同一性」とは、９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【0013】
本発明のアラビノフラノシダーゼは、以下のＡ１及びＡ２で示されるタンパク質である。
（Ａ１）配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ａ２）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ａ１）配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ａ２）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質
【0014】
Ａ１の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）ＹＩＴ ４０７２株由来のアラビノフラノシダーゼＲＳ０１６１０（以下、「ＲＳ０１６１０」とも称する）、Ａ２の配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、同微生物株由来のアラビノフラノシダーゼＲＳ０２３７５（以下、「ＲＳ０２３７５」とも称する）である。
ＲＳ０１６１０は、アミノ酸配列の相同性解析の結果、文献１（Lagaert S, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2010;402(4):644‐650.）に記載のビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）由来のＡＸＨ－ｄ３と９９％の配列同一性を示す。また、ＲＳ０２３７５は、同文献に記載のＡｂｆＡと９１％の配列同一性を示す。
ＲＳ０１６１０は、アミノ酸配列の相同性解析の結果、文献１（Lagaert S, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2010;402(4):644‐650.）に記載のビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）由来のＡＸＨ－ｄ３と９９％の配列同一性を示す。また、ＲＳ０２３７５は、同文献に記載のＡｂｆＡと９１％の配列同一性を示す。
【0015】
「アラビノフラノシダーゼ活性」とは、アラビノース含有多糖中のα－１，２若しくはα－１，３結合したアラビノース側鎖、α－１，２及びα－１，３結合したアラビノース側鎖を切断し、α－Ｌ－アラビノース残基を加水分解する活性をいう。
後述する実施例に示すとおり、ＲＳ０１６１０は、非還元末端に２分子のアラビノースがα－１，２及びα－１，３結合したアラビノース側鎖を加水分解するが、非還元末端にα－１，２又はα－１，３結合したアラビノース側鎖は加水分解しないという基質特異性を有する。一方、ＲＳ０２３７５は、非還元末端にα－１，２又はα－１，３結合したアラビノース側鎖を加水分解するという基質特異性を有する。
したがって、Ａ１で示されるアラビノフラノシダーゼは、α－１，２及びα－１，３結合したアラビノース側鎖のα－Ｌ－アラビノース残基を加水分解する活性を有するものが好ましく、Ａ２で示されるアラビノフラノシダーゼは、α－１，２又はα－１，３結合したアラビノース側鎖のα－Ｌ－アラビノース残基を加水分解する活性を有するものが好ましい。
後述する実施例に示すとおり、ＲＳ０１６１０は、非還元末端に２分子のアラビノースがα－１，２及びα－１，３結合したアラビノース側鎖を加水分解するが、非還元末端にα－１，２又はα－１，３結合したアラビノース側鎖は加水分解しないという基質特異性を有する。一方、ＲＳ０２３７５は、非還元末端にα－１，２又はα－１，３結合したアラビノース側鎖を加水分解するという基質特異性を有する。
したがって、Ａ１で示されるアラビノフラノシダーゼは、α－１，２及びα－１，３結合したアラビノース側鎖のα－Ｌ－アラビノース残基を加水分解する活性を有するものが好ましく、Ａ２で示されるアラビノフラノシダーゼは、α－１，２又はα－１，３結合したアラビノース側鎖のα－Ｌ－アラビノース残基を加水分解する活性を有するものが好ましい。
【0016】
本発明のキシロシダーゼは、以下のＢ１～Ｂ３で示されるタンパク質である。
（Ｂ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ２）配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ３）配列番号１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ１）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ２）配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ３）配列番号１０で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシロシダーゼ活性を有するタンパク質
【0017】
Ｂ１の配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータムＹＩＴ ４０７２株由来のキシロシダーゼＲＳ０１５９５（以下、「ＲＳ０１５９５」とも称する）、Ｂ２の配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、同微生物株由来のキシロシダーゼＲＳ０２３００（以下、「ＲＳ０２３００」とも称する）、Ｂ３の配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、同微生物株由来のキシロシダーゼＲＳ０２４００（以下、「ＲＳ０２４００」とも称する）である。
ＲＳ０１５９５は、アミノ酸配列の相同性解析の結果、文献（Lagaert S, et al. Appl Microbiol Biotechnol. 2011;92(6):1179‐1185.)に記載のビフィドバクテリウム・アドレセンティス由来のＸｙｌＣと８１％、文献（Viborg AH, et al. AMB Express. 2013;3(1):56.）に記載のビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ） ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ ＢＢ－１２由来のＢＸＡ４３と８４％の配列同一性を示す。
また、ＲＳ０２３００は、同ＸｙｌＣと７７％、ＢＸＡ４３と７９％の配列同一性を示す。
また、ＲＳ０２４００は、同ＸｙｌＣと９８％、ＢＸＡ４３と７８％の配列同一性を示す。
ＲＳ０１５９５は、アミノ酸配列の相同性解析の結果、文献（Lagaert S, et al. Appl Microbiol Biotechnol. 2011;92(6):1179‐1185.)に記載のビフィドバクテリウム・アドレセンティス由来のＸｙｌＣと８１％、文献（Viborg AH, et al. AMB Express. 2013;3(1):56.）に記載のビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ） ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ ＢＢ－１２由来のＢＸＡ４３と８４％の配列同一性を示す。
また、ＲＳ０２３００は、同ＸｙｌＣと７７％、ＢＸＡ４３と７９％の配列同一性を示す。
また、ＲＳ０２４００は、同ＸｙｌＣと９８％、ＢＸＡ４３と７８％の配列同一性を示す。
【0018】
ここで、「β－キシロシダーゼ活性」とは、キシロオリゴ糖を加水分解してキシロースとする反応を触媒する活性を意味する。
【0019】
本発明の酵素組成物は、アラビノフラノシダーゼとキシロシダーゼを含有するが、Ａ１及びＡ２の２種のアラビノフラノシダーゼと、Ｂ１～Ｂ３のキシロシダーゼから選ばれる１種以上の酵素を含有するのが好ましい。
【0020】
本発明のアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼは、例えば、本発明のアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。すなわち、本発明のアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、該形質転換体を適切な培地で培養すれば、本発明のアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼが生産される。生産されたアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼを該培養物から単離又は精製することにより、本発明のアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼを取得することができる。
【0021】
本発明のアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼをコードするポリヌクレオチドとしては、前記のＡ１～Ａ２で示されるタンパク質、又はＢ１～Ｂ３で示されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、好ましくは、下記（ａ１）～（ａ２）、及び（ｂ１）～（ｂ３）から選ばれる塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ１）配列番号１で示される塩基配列又は当該塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列
（ａ２）配列番号３で示される塩基配列又は当該塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列
（ｂ１）配列番号５で示される塩基配列又は当該塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列
（ｂ２）配列番号７で示される塩基配列又は当該塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列
（ｂ３）配列番号９で示される塩基配列又は当該塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列
（ａ１）配列番号１で示される塩基配列又は当該塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列
（ａ２）配列番号３で示される塩基配列又は当該塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列
（ｂ１）配列番号５で示される塩基配列又は当該塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列
（ｂ２）配列番号７で示される塩基配列又は当該塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列
（ｂ３）配列番号９で示される塩基配列又は当該塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列
【0022】
本発明のアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータムＹＩＴ ４０７２等から、当該分野で用いられる任意の方法を用いて単離することができる。例えば、当該ポリヌクレオチドは、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータムＹＩＴ ４０７２の全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号１、３、５、７又は９の塩基配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的遺伝子を選択的に増幅し、増幅した遺伝子を精製することで得ることができる。
【0023】
本発明のアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの種類としては、特に限定されず、遺伝子のクローニングに通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ等が挙げられる。このうち、プラスミドベクターが好ましく、例えば、市販のタンパク質発現用プラスミドベクター、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２（いずれもタカラバイオ株式会社製）等を好適に用いることができる。
【0024】
上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含むことができ、本発明のアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼをコードするポリヌクレオチドの上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域等の制御配列が作動可能に連結されていてもよい。また、ベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子がさらに組み込まれていてもよい。
【0025】
上記ベクターを導入する形質転換体の宿主の例としては、細菌、糸状菌、酵母などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、バチルス属に属する細菌などが挙げられ、このうち大腸菌が好ましい。
【0026】
宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
【0027】
斯くして得られた、本発明のアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、本発明のアラビノフラノシダーゼ又はキシロシダーゼが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
【0028】
上記培養物にて生成された本発明のアラビノフラノシダーゼ及びキシロシダーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。培養物から回収されたアラビノフラノシダーゼは、公知の手段でさらに精製されてもよい。
【0029】
上記本発明のアラビノフラノシダーゼ及びキシロシダーゼを組み合わせた酵素組成物は、ヘミセルロース糖化のために使用することができる。
また、当該酵素組成物は、さらにセルラーゼや本発明の酵素以外のヘミセルラーゼ等、他の糖化酵素を組み合わせることによりバイオマス糖化のために使用することができる。
また、当該酵素組成物は、さらにセルラーゼや本発明の酵素以外のヘミセルラーゼ等、他の糖化酵素を組み合わせることによりバイオマス糖化のために使用することができる。
【0030】
ここで、「ヘミセルロース」は、グルコース以外の糖のモノマーを含む植物性物質のポリマー性成分である。ヘミセルロースは、グルコースの他にキシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース及びアラビノースを含むことができ、キシロースが最も一般的な糖モノマーである。ヘミセルロースとしては、ガラクタン、マンナン、キシラン、アラバナン、アラビノキシラン、グルコマンナン、ガラクトマンナン等が挙げられるが、本発明においては、キシラン、アラビノキシランを含むものが好ましい。
【0031】
本発明の酵素組成物における、アラビノフラノシダーゼとキシロシダーゼとのタンパク質量比（アラビノフラノシダーゼ／キシロシダーゼ）は、特に限定されないが、好ましくは１：１～１：４であり、より好ましくは１：１～１：２である。
【0032】
本発明の酵素組成物は、ヘミセルロースから糖化するために用いられる。すなわち、本発明の糖化方法は、ヘミセルロースを、上記本発明の酵素製剤で糖化処理する工程が含まれる。
ヘミセルロースを糖化処理する際には、粉砕効率向上、糖化効率向上及び生産効率向上の観点から、糖化処理する工程の前に当該ヘミセルロースをアルカリ処理、粉砕処理又は水熱処理等の前処理工程をさらに含むことができる。
ヘミセルロースを糖化処理する際には、粉砕効率向上、糖化効率向上及び生産効率向上の観点から、糖化処理する工程の前に当該ヘミセルロースをアルカリ処理、粉砕処理又は水熱処理等の前処理工程をさらに含むことができる。
【0033】
糖化処理の条件は、本発明のアラビノフラノシダーゼ及びキシロシダーゼが失活しない条件であれば特に限定されない。例えば、ヘミセルロースを含む懸濁液に、本発明の酵素組成物を添加し、所定のｐＨ、温度で、一定時間反応することが挙げられる。懸濁液中のヘミセルロースの含有量は、糖化効率又は糖生産効率向上の観点から適宜調整すればよい。また、酵素組成物の使用量も、適宜決定される。
【実施例0034】
実施例１ 酵素の調製
（１）リコンビナントタンパク質の調製
Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ ＹＩＴ ４０７２Ｔのゲノムを鋳型として、配列番号２，４，６，８及び１０で示されるアミノ酸配列からなる各酵素タンパク質をコードする遺伝子（配列番号１，３，５，７及び９）のＯＲＦをＦｗプライマーおよびＲｖプライマーと、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）もしくはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）により増幅した。増幅産物を精製後に、制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩを用いて、もしくはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｐＣｏｌｄ Ｉベクター（Ｔａｋａｒａ）に導入した。クローニングのホストにはＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０９株を用いた。用いたプライマーおよび各プラスミドの構築方法を表１に示した。
（１）リコンビナントタンパク質の調製
Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ ＹＩＴ ４０７２Ｔのゲノムを鋳型として、配列番号２，４，６，８及び１０で示されるアミノ酸配列からなる各酵素タンパク質をコードする遺伝子（配列番号１，３，５，７及び９）のＯＲＦをＦｗプライマーおよびＲｖプライマーと、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）もしくはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）により増幅した。増幅産物を精製後に、制限酵素ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩを用いて、もしくはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｐＣｏｌｄ Ｉベクター（Ｔａｋａｒａ）に導入した。クローニングのホストにはＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ １０９株を用いた。用いたプライマーおよび各プラスミドの構築方法を表１に示した。
【0035】
【表1】
【0036】
（２）His-tag付加タンパク質の精製
各発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株にヒートショック法にて導入し、形質転換体を得た。得られた菌株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１０ｍｌにて培養した。ＯＤ６００＝０．５となった時点で培養液を１５℃にて３０分間インキュベーションした。その後１００ｍＭ ＩＰＴＧを１００μｌ添加した上でさらに１５℃にて２４時間インキュベーションした。得られた培養液を８０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体に対してＢ－ＰＥＲＴＭ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、要したＢ－ＰＥＲＴＭ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ １ｍｌに付き２μｌ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮａｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ）（Ｔａｋａｒａ）、２μｌ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｃｈｉｋｅｎ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ（５０ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してタンパク質を抽出した。菌体から得られたタンパク質抽出物からＮｉ－ＮＴＡ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて目的のＨｉｓタグ付きレコンビナントタンパク質を精製した。なお、必要に応じてＶｉｖａｓｐｉｎ ５００－５０Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製タンパク質を濃縮した。
精製された組換え酵素のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を図１に示す。
各発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株にヒートショック法にて導入し、形質転換体を得た。得られた菌株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１０ｍｌにて培養した。ＯＤ６００＝０．５となった時点で培養液を１５℃にて３０分間インキュベーションした。その後１００ｍＭ ＩＰＴＧを１００μｌ添加した上でさらに１５℃にて２４時間インキュベーションした。得られた培養液を８０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体に対してＢ－ＰＥＲＴＭ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、要したＢ－ＰＥＲＴＭ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ １ｍｌに付き２μｌ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮａｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ）（Ｔａｋａｒａ）、２μｌ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｃｈｉｋｅｎ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ（５０ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してタンパク質を抽出した。菌体から得られたタンパク質抽出物からＮｉ－ＮＴＡ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて目的のＨｉｓタグ付きレコンビナントタンパク質を精製した。なお、必要に応じてＶｉｖａｓｐｉｎ ５００－５０Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製タンパク質を濃縮した。
精製された組換え酵素のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を図１に示す。
【0037】
実施例２ 酵素活性の測定
（１）アラビノキシラン分解物を代謝した際のキシロースおよびアラビノースの測定
各酵素がキシロシダーゼであるかアラビノフラノシダーゼであるかを確認するために、アラビノキシラン分解物を代謝した際のキシロースおよびアラビノースの量を測定した。アラビノキシラン分解物を得るために、２％の小麦由来アラビノキシラン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｐ－ＷＡＸＹＬ）５０ｍｌに対してＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｍｉｘｔｕｓ由来のキシラナーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｅ－ＸＹＮＢＣＭ）を４０℃にて１６時間反応させた。反応液を容器ごと沸騰水中にて１０分インキュベーションし、室温まで放冷した。２００ｍｌのエタノールを加え、遠心して得られた上清をエバポレーターにて乾固させることにより、アラビノキシラン分解物を得た。得られた粉末を終濃度１０％となるように水に溶解し、そのうち１２．５μｌを、３７．５μｌのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ６．３）、２μｌの実施例１で取得した各酵素と混合し、３７℃にて１６時間インキュベーションした。反応後９４℃にて５分間インキュベーションし、終濃度１ｍＭとなるようにグルコース溶液を添加したうえで、ＨＰＬＣにて糖組成を分析した。ＨＰＬＣは株式会社島津製作所のシステムを用いてＫＳ－８０２ ｃｏｌｕｍｎ（Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．）により糖を分離し、昭和電工株式会社のＲＩ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＲＩ－１０１にて検出した。
（１）アラビノキシラン分解物を代謝した際のキシロースおよびアラビノースの測定
各酵素がキシロシダーゼであるかアラビノフラノシダーゼであるかを確認するために、アラビノキシラン分解物を代謝した際のキシロースおよびアラビノースの量を測定した。アラビノキシラン分解物を得るために、２％の小麦由来アラビノキシラン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｐ－ＷＡＸＹＬ）５０ｍｌに対してＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｍｉｘｔｕｓ由来のキシラナーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｅ－ＸＹＮＢＣＭ）を４０℃にて１６時間反応させた。反応液を容器ごと沸騰水中にて１０分インキュベーションし、室温まで放冷した。２００ｍｌのエタノールを加え、遠心して得られた上清をエバポレーターにて乾固させることにより、アラビノキシラン分解物を得た。得られた粉末を終濃度１０％となるように水に溶解し、そのうち１２．５μｌを、３７．５μｌのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ６．３）、２μｌの実施例１で取得した各酵素と混合し、３７℃にて１６時間インキュベーションした。反応後９４℃にて５分間インキュベーションし、終濃度１ｍＭとなるようにグルコース溶液を添加したうえで、ＨＰＬＣにて糖組成を分析した。ＨＰＬＣは株式会社島津製作所のシステムを用いてＫＳ－８０２ ｃｏｌｕｍｎ（Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ Ｋ．Ｋ．）により糖を分離し、昭和電工株式会社のＲＩ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＲＩ－１０１にて検出した。
【0038】
（２）キシロシダーゼ活性の測定
ＭａｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ＝６．３）４６５μｌと１００ｍＭキシロテトラオース１０μｌを混合し、３７℃にて約１０分間プレインキュベーションを行った。反応液に、１．６μＭに希釈した実施例１で取得した各酵素を２５μｌ添加し、３７℃にてインキュベーションを行った。ＴＬＣによる分析のために、同様に反応させた溶液から０分、５分、１５分、３０分、９０分後に５０μｌサンプリングし、９４℃にて５分インキュベーションして酵素を失活させ、そのうちの６μｌをＴＬＣシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ，１．０５７２１．０００１）にスポットした。文献（Nong G, Rice JD, Chow V, Preston JF. 2009. Appl Environ Microbiol 75:4410-4418）を参考にＣＨ３ＣＯＯＨ：Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：Ｈ２Ｏ＝７：６：１にて２回展開し、２％Ｏｒｃｉｎｏｌ（ｉｎ Ｈ２ＳＯ４：ＭｅＯＨ＝１：９）にて加熱呈色し、検出した。
ＭａｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ＝６．３）４６５μｌと１００ｍＭキシロテトラオース１０μｌを混合し、３７℃にて約１０分間プレインキュベーションを行った。反応液に、１．６μＭに希釈した実施例１で取得した各酵素を２５μｌ添加し、３７℃にてインキュベーションを行った。ＴＬＣによる分析のために、同様に反応させた溶液から０分、５分、１５分、３０分、９０分後に５０μｌサンプリングし、９４℃にて５分インキュベーションして酵素を失活させ、そのうちの６μｌをＴＬＣシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ，１．０５７２１．０００１）にスポットした。文献（Nong G, Rice JD, Chow V, Preston JF. 2009. Appl Environ Microbiol 75:4410-4418）を参考にＣＨ３ＣＯＯＨ：Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：Ｈ２Ｏ＝７：６：１にて２回展開し、２％Ｏｒｃｉｎｏｌ（ｉｎ Ｈ２ＳＯ４：ＭｅＯＨ＝１：９）にて加熱呈色し、検出した。
【0039】
（３）アラビノフラノシダーゼ活性の測定
反応基質としては、キシロオリゴ糖に対してアラビノースが異なる結合様式にて結合した４種類のＡＸＯＳ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社）、すなわち３２－α－Ｌ－Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ－ｘｙｌｏｂｉｏｓｅ（ＡＸＯＳ１）、２３，３３－ｄｉ－α－Ｌ－Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ－ｘｙｌｏｔｒｉｏｓｅ（ＡＸＯＳ２）、２３－α－Ｌ－Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ－ｘｙｌｏｔｒｉｏｓｅ（ＡＸＯＳ３）および３３－α－Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ－ｘｙｌｏｔｅｔｒａｏｓｅ（ＡＸＯＳ４）を用いた。４４μｌのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ６．３）に、１００ｍＭ ＡＸＯＳを１μｌ、２μＭに希釈した実施例１で取得した各酵素を５μｌ添加し、３７℃にて２時間反応させた後、９４℃５分間インキュベーションして酵素を失活させた。反応液のうち６μｌの糖組成をＴＬＣにて分析した。
（３）結果
結果を図２に示す。
図２Ａは、アラビノキシラン分解物を各酵素と反応させたときに生じるキシロースとアラビノースの量を示したものである。ＲＳ０１６１０及びＲＳ０２３７５はアラビノースが生成したことから、アラビノフラノシダーゼ活性を有する(＝アラビノフラノシダーゼである)ことがわかった。同様にＲＳ０１５９５、ＲＳ０２３００及びＲＳ０２４００はキシロースが生じたことからキシロシダーゼ活性を有する(＝キシロシダーゼである)ことがわかった。
図２Ｂは、ＲＳ０１６１０及びＲＳ０２３７５のアラビノフラノシダーゼ活性における基質特異性を示している。ここで、ＡＸＯＳ１～４は、アラビノース側鎖の結合様式の異なるアラビノキシロオリゴ糖を示しており、ＸＯＳ２～４は、それぞれ二糖、三糖および四糖のキシロオリゴ糖を示している。図２Ｂより、ＲＳ０１６１０は、非還元末端に２分子のアラビノースがα－１，２及びα－１，３結合したアラビノース側鎖を加水分解するが、非還元末端にα－１，２又はα－１，３結合したアラビノース側鎖は加水分解しないというという基質特異性を有することがわかる。一方、ＲＳ０２３７５は、非還元末端にα－１，２又はα－１，３結合したアラビノース側鎖を加水分解するが、非還元末端に２分子のアラビノースが結合したアラビノース側鎖を加水分解できないという基質特異性を有することがわかる。この２種類のアラビノフラノシダーゼを用いることで、多様な結合を有するアラビノース側鎖を分離することができる。
図２Ｃは、ＲＳ０１５９５、ＲＳ０２３００及びＲＳ０２４００のキシロシダーゼ活性を示している。図２Ｃより、各酵素がキシロシダーゼ活性を有していることがわかるが、特にＲＳ０１５９５のキシロオリゴ糖からキシロースまでの分解時間が短く代謝活性が強いことがわかる。
反応基質としては、キシロオリゴ糖に対してアラビノースが異なる結合様式にて結合した４種類のＡＸＯＳ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社）、すなわち３２－α－Ｌ－Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ－ｘｙｌｏｂｉｏｓｅ（ＡＸＯＳ１）、２３，３３－ｄｉ－α－Ｌ－Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ－ｘｙｌｏｔｒｉｏｓｅ（ＡＸＯＳ２）、２３－α－Ｌ－Ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ－ｘｙｌｏｔｒｉｏｓｅ（ＡＸＯＳ３）および３３－α－Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ－ｘｙｌｏｔｅｔｒａｏｓｅ（ＡＸＯＳ４）を用いた。４４μｌのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ６．３）に、１００ｍＭ ＡＸＯＳを１μｌ、２μＭに希釈した実施例１で取得した各酵素を５μｌ添加し、３７℃にて２時間反応させた後、９４℃５分間インキュベーションして酵素を失活させた。反応液のうち６μｌの糖組成をＴＬＣにて分析した。
（３）結果
結果を図２に示す。
図２Ａは、アラビノキシラン分解物を各酵素と反応させたときに生じるキシロースとアラビノースの量を示したものである。ＲＳ０１６１０及びＲＳ０２３７５はアラビノースが生成したことから、アラビノフラノシダーゼ活性を有する(＝アラビノフラノシダーゼである)ことがわかった。同様にＲＳ０１５９５、ＲＳ０２３００及びＲＳ０２４００はキシロースが生じたことからキシロシダーゼ活性を有する(＝キシロシダーゼである)ことがわかった。
図２Ｂは、ＲＳ０１６１０及びＲＳ０２３７５のアラビノフラノシダーゼ活性における基質特異性を示している。ここで、ＡＸＯＳ１～４は、アラビノース側鎖の結合様式の異なるアラビノキシロオリゴ糖を示しており、ＸＯＳ２～４は、それぞれ二糖、三糖および四糖のキシロオリゴ糖を示している。図２Ｂより、ＲＳ０１６１０は、非還元末端に２分子のアラビノースがα－１，２及びα－１，３結合したアラビノース側鎖を加水分解するが、非還元末端にα－１，２又はα－１，３結合したアラビノース側鎖は加水分解しないというという基質特異性を有することがわかる。一方、ＲＳ０２３７５は、非還元末端にα－１，２又はα－１，３結合したアラビノース側鎖を加水分解するが、非還元末端に２分子のアラビノースが結合したアラビノース側鎖を加水分解できないという基質特異性を有することがわかる。この２種類のアラビノフラノシダーゼを用いることで、多様な結合を有するアラビノース側鎖を分離することができる。
図２Ｃは、ＲＳ０１５９５、ＲＳ０２３００及びＲＳ０２４００のキシロシダーゼ活性を示している。図２Ｃより、各酵素がキシロシダーゼ活性を有していることがわかるが、特にＲＳ０１５９５のキシロオリゴ糖からキシロースまでの分解時間が短く代謝活性が強いことがわかる。
【図1】
【図2】
【配列表】