特開 2022-58635 大腸癌の検出及び処置方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022058635

(43)【公開日】2022-04-12

(54)【発明の名称】大腸癌の検出及び処置方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20220405BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20220405BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220405BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20220405BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20220405BHJP

   C07K 14/71 20060101ALN20220405BHJP

   C07K 14/745 20060101ALN20220405BHJP

【ＦＩ】

G01N33/574 A ZNA

G01N33/543 545A

G01N33/53 D

G01N27/62 V

C07K14/47

C07K14/71

C07K14/745

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022004846

(22)【出願日】2022-01-17

(62)【分割の表示】P 2017529836の分割

【原出願日】2015-12-10

(31)【優先権主張番号】62/090,800

(32)【優先日】2014-12-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】517189777

【氏名又は名称】ウイスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】110000741

【氏名又は名称】特許業務法人小田島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】イバンシク，メラニー・メイ

(72)【発明者】

【氏名】サスマン，マイケル・リチャード

(72)【発明者】

【氏名】ダブ，ウイリアム・フランクリン

(72)【発明者】

【氏名】アービング，エイミー・アン

(72)【発明者】

【氏名】プライマン，ジェニファー・キャスリーン

(72)【発明者】

【氏名】ハットリン，エドワード・レオ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，シャオディ

(72)【発明者】

【氏名】ヘゲマン，アドリアン・ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】レイチェルダーファー，マーク

(72)【発明者】

【氏名】ケネディー，グレゴリー・ディー

(72)【発明者】

【氏名】ピックハート，ペリー・ジェイ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】大腸癌の患者又は大腸癌を発症し易いかも知れない患者における低侵襲性の同定、診断及び治療的介入のために有用な方法、試薬ならびに診断及び予後マーカーを提供する。
【解決手段】癌性又は前－癌性結腸病変を有する患者の同定方法であって、（ａ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーに関して患者からの生体試料をアッセイし、ここでタンパク質バイオマーカーは表皮成長因子受容体、ロイシン－リッチアルフア－２グリコプロテイン、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖３、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖４、などであり；（ｂ）生体試料における１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを決定し；そして（ｃ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルが結腸病変のない患者において検出されるレベルと異なる場合、患者を結腸病変を有すると同定することを含んでなる方法。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌性又は前－癌性結腸病変を有する患者の同定方法であって：
（ａ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーに関して患者からの生体試料をアッセイし、ここでタンパク質バイオマーカーは表皮成長因子受容体、ロイシン－リッチアルフア－２グリコプロテイン、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖３、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖４、ジペプチジルペプチダーゼ４、ペプチダーゼインヒビター１６、凝固因子Ｖ、Ｃ－反応性タンパク質、Ｒｈｏ－ＧＤＰ解離インヒビター１イソ型Ａ、ヘモペキシン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ－Ｚｎ］、トロンボスポンジン－４、コラーゲンアルフア－１（ｌ）鎖、カドヘリン－２又はビトロネクチンであり；
（ｂ）生体試料における１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを決定し；そして
（ｃ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルが結腸病変のない患者において検出されるレベルと異なる場合、患者を結腸病変を有すると同定する
ことを含んでなる方法。

【請求項2】

病変が前－癌性状態を含む請求項１の方法。

【請求項3】

病変が異形成組織、異常陰窩又は良性ポリープを含む請求項２の方法。

【請求項4】

病変がポリープ形成を含む請求項１の方法。

【請求項5】

ポリープが腺腫である請求項４の方法。

【請求項6】

ポリープが癌腫である請求項４の方法。

【請求項7】

癌腫がステージ１、ステージ２、ステージ３又はステージ４と分類される請求項６の方法。

【請求項8】

生体試料中の１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを、ステージ１、ステージ２、ステージ３又はステージ４癌腫を有する患者における該１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーの参照レベルと比較することにより、癌腫をステージ１、ステージ２、ステージ３又はステージ４と同定することをさらに含んでなる請求項６の方法。

【請求項9】

生体試料が血液、血清、血漿、尿、便又は唾液である請求項１の方法。

【請求項10】

（ａ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーに相同性を有する１種もしくはそれより多い合成ペプチドを選択し；
（ｂ）合成ペプチドを生体試料と合わせ；そして
（ｃ）組み合わせを物理的分離法に供する
ことを含んでなる方法により生体試料をアッセイする請求項１の方法。

【請求項11】

配列番号１から配列番号９１までのいずれかに従う１種もしくはそれより多いペプチドから合成ペプチドを選択する請求項１０の方法。

【請求項12】

表２に挙げられている１種もしくはそれより多いペプチドから合成ペプチドを選択する請求項１０の方法。

【請求項13】

物理的分離法が液体クロマトグラフィーである請求項１０の方法。

【請求項14】

合成ペプチドを同位体標識する請求項１０の方法。

【請求項15】

１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルの決定が生体試料中のタンパク質バイオマーカーの濃度の絶対的定量を含む請求項１の方法。

【請求項16】

アッセイ段階が免疫学的アッセイを含む請求項１の方法。

【請求項17】

該免疫学的アッセイが酵素－結合イムノソルベントアッセイを含む請求項１６の方法。

【請求項18】

決定段階が質量分析を含む請求項１の方法。

【請求項19】

結腸中にポリープ形成を有すると同定される患者に処置を施す段階をさらに含んでなる請求項１の方法。

【請求項20】

結腸中にポリープ形成を有すると同定される患者に大腸内視鏡検査を行う段階をさらに含んでなる請求項１の方法。

【請求項21】

方法が非－侵襲性である請求項１の方法。

【請求項22】

１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーが少なくともＥＧＦＲ、ＬＲＧ１、ＩＴＩＨ４及びＦ５を含む請求項１の方法。

【請求項23】

１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーが少なくともＤＰＰ４、ＬＲＧ１、ＩＴＩＨ４、ＶＴＮ、ＨＰＸ、ＥＧＦＲ及びＦ５を含む請求項１の方法。

【請求項24】

１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーが少なくともＥＧＦＲ、ＬＲＧ１、ＩＴＩＨ３、ＩＴＩＨ４、ＤＰＰ４、ＰＩ１６、Ｆ５、ＣＲＰ及びＡＲＨＧＤＩＡを含む請求項１の方法。

【請求項25】

１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーが少なくともＬＲＧ１、Ｆ５、ＶＴＮ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１０、ＣＤ４４、ＩＴＩＨ３、ＩＴＩＨ４、ＨＰＸ、ＣＦＩ、ＳＯＤ３及びＣＯＬ １Ａ１を含む請求項１の方法。

【請求項26】

（ａ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーに関して患者からの生体試料をアッセイし、ここでタンパク質バイオマーカーは表皮成長因子受容体、ロイシン－リッチアルフア－２グリコプロテイン、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖３、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖４、ジペプチジルペプチダーゼ４、ペプチダーゼインヒビター１６、凝固因子Ｖ、Ｃ－反応性タンパク質、Ｒｈｏ－ＧＤＰ解離インヒビター１イソ型Ａ、ヘモペキシン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ－Ｚｎ］、トロンボスポンジン－４、コラーゲンアルフア－１（ｌ）鎖、カドヘリン－２及びビトロネクチンであり；
（ｂ）生体試料における１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを決定し；そして
（ｃ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルが結腸におけるポリープ形成のない患者において検出されるレベルと異なる場合、患者を大腸内視鏡検査を必要とすると同定する
ことを含んでなる大腸内視鏡検査に関する必要性を決定するための患者のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

電子的に提出されたテキストファイルの記載
本明細書に添えて電子的に提出されるテキストファイルの内容は、引用することによりそれらの全体が本明細書の内容となる：配列表（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ）のコンピュータ読み取り可能フォーマットコピー（ファイル名：１４－１８９５－ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、データの記録日：２０１５年１２月１０日、ファイルサイズ ２１ＫＢ）。

【0002】

発明の背景
発明の分野
本発明は、大腸癌の患者（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）又は大腸癌を発症し易いかも知れない患者における低侵襲性の同定、診断及び治療的介入のために有用な方法、試薬ならびに診断及び予後マーカーを提供する。本発明の特定の態様は、プロテオーム及びトランスクリプトームスクリーン中に存在する血清バイオマーカーを用い、それは大腸癌を発症しているかも知れない患者を同定し、特により侵襲性の診断方法（大腸内視鏡検査のような）に関する決定のための他の指標がない患者において、そのための根拠を提供する。さらなる特定の態様は、本明細書に提供される方法において用いるための血清バイオマーカーのパネルを提供する。

【背景技術】

【0003】

関連技術の記載
大腸癌は近代国家における癌関連罹患率及び死亡率の主要な原因であり、発展途上世界において頻度が増しつつある（非特許文献１）。現局性大腸癌の初期の検出は、多くの場合にポリープ切除又は外科手術による完治に導くが、初期検出の様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）は現在、感度及び特異性において限られており、スクリーニング推奨への患者アドヒアランスが低く、胃腸病専門臨床医の能力に負担を強いている（ｐｌａｃｅ ａ ｓｔｒａｉｎ）（非特許文献２；非特許文献３）。現在推奨されているスクリーニング法（大腸内視鏡検査、ＣＴスキャン又は便潜血反応検査）は非－特異的であり得るか、最も初期の手術可能な病変に関して非感受性であり得るか、又は高度に侵襲性であり得る（非特許文献４；非特許文献５）。対照的に、血液又は血清試料に基づく検出様式はもっとずっと広い患者のコンプライアンス及び臨床的適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を達成することができる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｊｅｍａｌ ｅｔ ａｌ．著，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ２０１１，６１，（２），６９－９０

【非特許文献2】Ｈｏｐｃｈｉｋ著，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｎｕｒｓ ２０１３，３６，（４），２８９－９０

【非特許文献3】Ｋｒｉｚａ ｅｔ ａｌ．著，Ｅｕｒ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ ２０１３，８２，（１１），ｅ６２９－３６

【非特許文献4】Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ Ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２００８，６３，（８），８７９－８４

【非特許文献5】Ｂｕｒｔ ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃｏｍｐｒ Ｃａｎｃ Ｎｅｔｗ ２０１３，１１，（１２），１５３８－７５

【発明の概要】

【0005】

発明の概略
本発明は、大腸癌の患者又は大腸癌を発症し易いかも知れない患者における低侵襲性の同定、診断及び治療的介入のために有用な方法、試薬ならびに診断及び予後マーカーを提供する。ある態様において、本発明は血清バイオマーカーならびに大腸癌のスクリーニング、検出、監視、処置及び予後評価の方法を含むこれらの血清バイオマーカーの使用方法を提供する。他の態様は、大腸癌の患者又は大腸癌を発症し易いかも知れない患者における低侵襲性の同定、診断及び治療的介入のために有用な合成ペプチドを提供する。

【0006】

１つの側面において、結腸における癌性又は前－癌性病変を有する患者の同定方法を本明細書に提供し、その方法は：（ａ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーに関して患者からの生体試料をアッセイし、ここでタンパク質バイオマーカーは表皮成長因子受容体、ロイシン－リッチアルフア－２グリコプロテイン（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ
ａｌｐｈａ－２ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖３（ｉｎｔｅｒ－ａｌｐｈａ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ３）、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖４、ジペプチジルペプチダーゼ４、ペプチダーゼインヒビター１６、凝固因子Ｖ、Ｃ－反応性タンパク質、Ｒｈｏ－ＧＤＰ解離インヒビター１イソ型Ａ、ヘモペキシン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ－Ｚｎ］、トロンボスポンジン－４、コラーゲンアルフア－１（ｌ）鎖、カドヘリン－２又はビトロネクチンであり；（ｂ）生体試料における１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを決定し；そして（ｃ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルが結腸におけるポリープ形成のない患者において検出されるレベルと異なる場合、患者を結腸の病変を有すると同定することを含んでなる。

【0007】

特定の態様において、本開示の方法により同定され且つ処置される病変は結腸における前－癌性状態を含む。例えば本開示の態様は、結腸における異形成、異常陰窩又は良性ポリープの同定方法を提供する。

【0008】

いくつかの態様において、本開示の方法により同定される病変はポリープ形成を含む。特定の態様において、ポリープは腺腫又は癌腫である。他の態様において、癌腫はステージ１、ステージ２、ステージ３又はステージ４として分類される。さらに別の態様において、本開示の方法は癌腫をステージ１、ステージ２、ステージ３又はステージ４癌腫として同定するために有用である。

【0009】

特定の態様において、方法は生体試料、例えば制限ではなく血液、血漿又は血清について行われる。

【0010】

他の態様において：（ａ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーに相同性を有する１種もしくはそれより多い合成ペプチドを選択し；（ｂ）合成ペプチドを生体試料と合わせ；そして（ｃ）組み合わせを物理的分離法に供することを含んでなる方法により生体試料をアッセイする。特定の態様において、物理的分離法は液体クロマトグラフィーである。他の特定の態様において、合成ペプチドを同位体標識する。さらに別の特定の態様において、アッセイ段階は酵素結合イムノソルベントアッセイのような免疫学的アッセイを含む。

【0011】

他の態様において、決定段階は質量分析を含む。

【0012】

他の態様において、方法はさらに、結腸におけるポリープ形成を有すると同定される患者に処置を施す段階を含む。さらに別の態様において、方法はさらに、結腸におけるポリープ形成を有すると同定される患者に大腸内視鏡検査を行う段階を含む。他の態様において、方法は非－侵襲性である。

【0013】

別の側面において、（ａ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーに関して患者からの生体試料をアッセイし、ここでタンパク質バイオマーカーは表皮成長因子受容体、ロイシン－リッチアルフア－２グリコプロテイン、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖３、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖４、ジペプチジルペプチダーゼ４、ペプチダーゼインヒビター１６、凝固因子Ｖ、Ｃ－反応性タンパク質、Ｒｈｏ－ＧＤＰ解離インヒビター１イソ型Ａ、ヘモペキシン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ－Ｚｎ］、トロンボスポンジン－４、コラーゲンアルフア－１（ｌ）鎖、カドヘリン－２及びビトロネクチンであり；（ｂ）生体試料における１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを決定し；そして（ｃ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルが結腸におけるポリープ形成のない患者において検出されるレベルと異なる場合、患者を大腸内視鏡検査を必要とすると同定することを含んでなる大腸内視鏡検査に関する必要性を決定するための患者のスクリーニング方法を本明細書において提供する。

【0014】

さらに別の態様において、大腸内視鏡検査又はポリープ切除法によるさらなる評価又は処置を含むがこれらに限られないさらなる臨床的評価又は処置から利益を得る患者の同定方法を提供する。他の態様において、外科手術－後又はポリープ切除－後の患者の監視を提供する。さらに別の態様において、開示される方法は、化学予防薬又は化学治療薬への患者の反応性を監視するために有用である。

【0015】

さらに、現存する大腸スクリーニング、診断、予後及び処置法の有用性を強化することができる方法を提供する。従って本明細書で開示されるある種の態様は、大腸内視鏡検査、Ｓ状結腸鏡検査、ＣＴスキャン又は便潜血反応検査、便免疫化学的検査及び他の便に基づくスクリーニング又は診断法を含むがこれらに限られない当該技術分野において既知の他の方法との組み合わせにおいて有用である。

【0016】

大腸癌及び前癌性状態のスクリーニング、診断、予後及び処置への用途を含むがこれらに限られない臨床的用途を有するタンパク質バイオマーカーも本明細書に提供する。ある種の態様において、タンパク質バイオマーカーは表皮成長因子受容体、ロイシン－リッチアルフア－２グリコプロテイン、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖３、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖４、ジペプチジルペプチダーゼ４、ペプチダーゼインヒビター１６、凝固因子Ｖ、Ｃ－反応性タンパク質、Ｒｈｏ－ＧＤＰ解離インヒビター１イソ型Ａ、ヘモペキシン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ－Ｚｎ］、トロンボスポンジン－４、コラーゲンアルフア－１（ｌ）鎖、カドヘリン－２又はビトロネクチンあるいは予後、診断又は処置に有用なそれらのいずれかの組み合わせを含む。

【0017】

ある種の態様において、本明細書に開示されるタンパク質バイオマーカーのサブセットから成るタンパク質バイオマーカーのパネルを提供する。特定の態様において、（ａ）タンパク質バイオマーカーのパネルのレベルに関して患者からの生体試料をアッセイし；（ｂ）生体試料におけるタンパク質バイオマーカーのパネルのレベルを決定し；そして（ｃ）パネル中の１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルが結腸におけるポリープ形成のない患者において検出されるレベルと異なる場合、患者を大腸内視鏡検査を必要とすると同定することを含んでなる方法を提供する。いくつかの態様において、少なくともバイオマーカー：ＬＲＧ１、Ｆ５、ＶＴＮ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１０、ＣＤ４４、ＩＴＩＨ３、ＩＴＩＨ４、ＨＰＸ、ＣＦＩ、ＳＯＤ３及びＣＯＬ１Ａ１を含んでなるタンパク質バイオマーカーのパネルを提供する。他の態様において、少なくともバイオマーカー：ＥＧＦＲ、ＬＲＧ１、ＩＴＩＨ４及びＦ５を含んでなるタンパク質バイオマーカーのパネルを提供する。さらに別の態様において、少なくともバイオマーカー：ＤＰＰ４、ＬＲ
Ｇ１、ＩＴＩＨ４、ＶＴＮ、ＨＰＸ、ＥＧＦＲ及びＦ５を含んでなるタンパク質バイオマーカーのパネルを提供する。さらにもっと別の態様において、少なくともバイオマーカー：ＥＧＦＲ、ＬＲＧ１、ＩＴＩＨ３、ＩＴＩＨ４、ＤＰＰ４、ＰＩ１６、Ｆ５、ＣＲＰ及びＡＲＨＧＤＩＡを含んでなるタンパク質バイオマーカーのパネルを提供する。

【0018】

本発明のこれらの及び他の特徴及び利点は、添付の請求項と一緒に理解される以下の本発明の詳細な記載からさらに十分に理解されるであろう。請求項の範囲はそこにおける詳述により定義され、本記述中に示される特徴及び利点の特定の議論により定義されないことが注目される。

【図面の簡単な説明】

【0019】

図面の簡単な記述

【図1】標的化定量的プロテオミクス実験のワークフローを示す図。適した同位体標識された参照標準を、酵素消化の前にタンパク質抽出物中に添加する（ｓｐｉｋｅｄ）。ペプチドを逆－相クロマトグラフィーによりクロマトグラフィー的に分離し、続いて三連四重極型質量分析計（ＱＱＱ－ＭＳ）を用いる直列する分析を行い、そこで標的化前駆体及びフラグメントイオン質量（トランジション体（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ））を選択する。内因性フラグメントイオン及び参照標準フラグメントイオンの抽出されたイオンのクロマトグラム面積を比較することにより定量を行う。そのような標的化定量的プロテオミクス法は選択反応モニタリング（ＳＲＭ）又は多重反応モニタリング（ＭＲＭ）法としても既知である。

【図2】標的化分析のためのペプチドの選択のための基準を示す図。ペプチドを標的化分析に用いるために、“Ｔｉｅｒ １”基準を満たさねばならない。“Ｔｉｅｒ ２”基準は、標的化質量分析アッセイにおいて内因性ペプチドが可視である機会を最大にする。“Ｔｉｅｒ ３”基準は複数の種における標的化分析のために考慮されるべきである。

【図3】Ａｐｃ^Pirc/+ラットモデル（“Ｐｉｒｃラット”）における正常な結腸組織及び腫瘍組織における遺伝子発現プロファイリングの選ばれた結果を示すグラフ。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙにより、正常な組織と比較して腫瘍において上方調節された遺伝子転写産物が同定された。これらの候補は：１）腫瘍中のｍＲＮＡ発現レベルにおける５－倍かもっと高い上方調節を示す、２）既知の又は予測される分泌タンパク質をコードする、及び３）ヒト結腸癌にいくつかの既知の生物学的有意性を有する遺伝子を表す。

【図4】選択反応モニタリング質量分析実験（ＳＲＭ－ＭＳ）確認スクリーニングのために選ばれた候補のまとめ。ＳＲＭ－ＭＳを用い、これらのタンパク質のそれぞれからのペプチドの内因性形態をＦ₁－Ｐｉｒｃラットの血清において定量可能なレベルで同定することに成功した。

【図5A】ある時間経過に及んで示される血清中のタンパク質バイオマーカー発現を示すグラフ。

【図5B】大腸腫瘍負荷の関数として示される血清中のタンパク質バイオマーカー発現を示すグラフ。

【図6A】バイオマーカーＥＧＦＲの受診者操作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）（ＲＯＣ）分析を示し、Ｆ₁－Ｐｉｒｃラット血清における腫瘍の検出のためのタンパク質バイオマーカーとしての診断的有用性を示しているグラフ。

【図6B】バイオマーカーＬＲＧ１の受診者操作特性（ＲＯＣ）分析を示し、Ｆ₁－Ｐｉｒｃラット血清における腫瘍検出のためのタンパク質バイオマーカーとしての診断的有用性を示しているグラフ。

【図6C】バイオマーカーＩＴＩＨ４の受診者操作特性（ＲＯＣ）分析を示し、Ｆ₁－Ｐｉｒｃラット血清における腫瘍検出のためのタンパク質バイオマーカーとしての診断的有用性を示しているグラフ。

【図6D】バイオマーカーＩＴＩＨ３の受診者操作特性（ＲＯＣ）分析を示し、Ｆ₁－Ｐｉｒｃラット血清における腫瘍検出のためのタンパク質バイオマーカーとしての診断的有用性を示しているグラフ。

【図7】Ｆ₁－Ｐｉｒｃラットからの血清における腫瘍検出のための表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ロイシン－リッチアルファ－２－グリコプロテイン（ＬＲＧ１）、インター－アルファトリプシンインヒビター、重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）及び凝固因子Ｖ（Ｆ５）から成るパネルのＲＯＣ分析を示すグラフ。

【図8】動物モデルにおいて同定されるバイオマーカーが大腸癌のヒト又は結腸癌の前癌段階のヒトに関して予測し、診断し、及び予後を決定する能力を決定するヒト臨床研究の設計を示す図。

【図9A-9J】健康な（「対照」）群及び前癌性（ステージ０）又は癌性（ステージ１－３）］結腸病変を有する患者から成るヒト集団において研究された、示されるバイオマーカーに関する結果を示すグラフ。上のパネルは、合成参照標準に対して評価される患者群において観察されるバイオマーカーレベルの棒プロットを示す。内因性ペプチド対合成ペプチド参照標準の比としてデータを表す。患者群は健康な患者（対照）あるいはステージ０、ステージ１、ステージ２又はステージ３病変を有する患者を含む。平均（“Ａｖｇ”）癌はステージ０－３を合わせて含む。“ｎ－”の値は各郡中の患者の数を示す。エラーバーは平均生物学的標準誤差を示す。下のパネルは、結腸病変（ステージ０－３及び合された平均）を有する患者において観察されるバイオマーカー発現レベル対健康な対照患者における同じバイオマーカー発現レベルの比の棒プロットを示す。各棒は、対照患者及び結腸病変を有する患者の間の示されるバイオマーカーの倍変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を示す。定量された比を各棒プロットに関して、各比に関する両側ｔ検定（２－ｔａｉｌｅｄ ｔ－ｔｅｓｔｓ）からのＰ－値と共に示す。

【図10】既知の腺腫を有する１２人の患者における相対的なＣｏｌ １ａ１バイオマーカー発現レベルを示すグラフ。上のパネルは、ポリープ除去の前（“ｐｒｅ－ｐｏｌｙ”）及びポリープ除去から３－４週間後の発現を示す。下のパネルは、ポリープ除去後のＣｏｌ １ａ１バイオマーカーデータにおける倍－変化として同じデータを示す。

【図11】ＬＲＧ１及びＩＴＩＨ３に関する正常な発現レベルに向かうポリープ切除－後の復帰を示すグラフ。これらのグラフにおける患者１及び２はそれぞれ３個の成長中の腺腫を有した。棒グラフは、内部参照標準と内因性血清ペプチドの間の面積比を示す。

【0020】

発明の詳細な記述
本発明において引用するすべての出版物、特許及び特許出願は、引用することによりそれらの内容がすべての目的のために明らかに本明細書の内容となる。

【0021】

結腸の癌性又は前癌性病変を有する患者の同定及び処置のための非－侵襲性方法を本明細書に提供する。本明細書で用いられる「病変」は、結腸の異常な領域を指し、異形成、異常陰窩ならびに良性又は癌性ポリープを含む。

【0022】

本明細書で用いられる「ポリープ」は、大腸癌の４つのステージのいずれかにおいて存在するポリープあるいは前癌性状態のポリープを指す。本明細書で用いられる場合、「大腸癌」は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）によりＴＮＭシステム（組織学的性質（Ｔ）、近くのリンパ節における腫瘍の存在（Ｎ）及び転移拡散（Ｍ）を評価する）に従って分類されるステージ１からステージ４の範囲の４つのステージのいずれかから成る悪性の状態を指す（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１０，２８，（２），２６４－７１；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｆ．Ｌ．著，Ｂｕｌｌ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｓｕｒｇ ２００２，８７，（７），１３－５）。（表１）。

【0023】

【表1】

【0024】

本明細書で用いられる場合、「前－癌性状態」は人に結腸癌の傾向を持たせる（ｄｉｓｐｏｓｅ）前－浸潤性、前－転移性病変を有する患者を指す。例には異形成、異常陰窩の存在及び腺腫の存在が含まれる。ＡＪＣＣは、腺腫を“Ｔｉｓ”のＴ－ステージにより前－癌性ポリープ（「ステージ０」）として正式に特性化しており、ここで“ｉｓ”は非浸潤性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）を示す。Ｔｉｓ腺腫は腸壁の浸潤なく大腸粘膜中に位置するポリープにより特徴付けられる。（表１）。

【0025】

いくつかの態様において、患者の結腸における病変の臨床的ステージの分析方法を提供する。本明細書で用いられる場合、「ステージ」又は「ステージング」は、結腸における癌性又は前－癌性病変の進行及び重度を記述するために用いられる１つもしくはそれより多い臨床的な分類システムを指す。大腸腫瘍のステージは、腸壁、所属リンパ節（ｒｅｇｉｏｎａｌ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）及び隣接組織中への腫瘍浸潤の位置及びレベルを記述する。

【0026】

本開示の態様と関連して用いられる腫瘍ステージングシステムの排他的ではない例はＴＮＭシステム（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１０，２８，（２），２６４－７１；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｆ．Ｌ．著，Ｂｕｌｌ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｓｕｒｇ ２００２，８７，（７），１３－５）（表１）である。ＴＮＭシステムにおいて、ステージ１及び２はリンパ節の浸潤又は転移がなく（Ｎ０ Ｍ０）、それぞれＴ１又はＴ２及びＴ３又はＴ４のＴ－ステージを有する。ステージ１病変は粘膜下及びおそらく筋肉層中に進んでいる（ｐａｓｓｅｄ ｉｎｔｏ）。ステージ２病変は漿膜に浸潤し、腸壁を介して成長しているかも知れないが近隣のリンパ節に浸潤していない。ステージ３病変は非常に複雑で３つの細分類を有するが、いずれかのＴ－ステージ及びいくつか又は多くの近隣リンパ節の浸潤を有することで広く特徴付けられ得る。悪性転移性結腸癌を構成するステージ４はいずれのＴ及びＮ分類も有し得るが、他の器官、最も普通には肝臓に転移している。（表１）。

【0027】

当該技術分野における熟練者は、本開示の方法と関連して有用な別のステージングシステムを認識するであろう。他のステージングシステムの例にはＤｕｋｅの分類システム（Ｄｕｋｅｓ，Ｃ．Ｅ．著，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １９３２，３５：３２３）及びＡｓｔｌｅｒ－Ｃｏｌｌｅｒ分類システム（Ａｓｔｌｅｒ Ｖ．Ｂ ａｎｄ Ｃｏｌｌｅｒ Ｆ．Ａ．著，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ １９５４，１３９：８４６）が含まれる。

【0028】

いくつかの態様において、患者の結腸における病変の臨床的悪性度を分析するための方法を提供する。本明細書で用いられる場合、「腫瘍悪性度」は、腫瘍細胞が正常な結腸組織細胞に分化した程度を記述する組織学的評価を指す。現在の腫瘍悪性度分類は結腸癌分類のＴＮＭ指針の一部であり、Ｇ１からＧ４の範囲がある。Ｇ１と評価される細胞は組織学的に最も健康な結腸組織細胞のように見える。Ｇ２と評価される細胞は中程度に分化しており、Ｇ３と評価される細胞はあまり分化しておらず、Ｇ４細胞は分化していない。より高い悪性度の細胞はより急速に成長する傾向があり、癌処置の方法に影響し得る。いくつかの態様において、本明細書に提供されるタンパク質バイオマーカー及び方法は細胞分化のレベル（腫瘍悪性度）を評価するために用いられ得、患者処置戦略に影響を与えることができる。

【0029】

１つの特定な側面において、結腸におけるポリープ形成を有する患者の同定方法を本明細書に提供し、その方法は（ａ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーに関して患者からの生体試料をアッセイし；（ｂ）生体試料における１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを決定し；そして（ｃ）１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルが結腸におけるポリープ形成のない患者において検出されるレベルと異なる場合、患者を結腸におけるポリープ形成を有すると同定することを含んでなる。適したタンパク質バイオマーカーには表皮成長因子受容体、ロイシン－リッチアルフア－２グリコプロテイン、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖３、インター－アルファトリプシンインヒビター重鎖４、ジペプチジルペプチダーゼ４、ペプチダーゼインヒビター１６、凝固因子Ｖ、Ｃ－反応性タンパク質、Ｒｈｏ－ＧＤＰ解離インヒビター１イソ型Ａ、ヘモペキシン、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ－Ｚｎ］、トロンボスポンジン－４、コラーゲンアルフア－１（ｌ）鎖、カドヘリン－２、ビトロネクチン、マルターゼグルコアミラーゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼ、ピルベートキナーゼｍ２、ビタミンＤ結合タンパク質、ＣＤ４４抗原、ＣＥＡＣＡＭ５、カテプシンＢ（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ Ｂ）、血清アミロイドＰ、フェチュインＢ、マトリリシン、補体因子１、ヘパリン補因子２、スルフヒドリルオキシダーゼ１、トロンボスポンジン４及び受容体－型チロシン－タンパク質ホスファターゼｍｕが含まれる。

【0030】

【表2】

【0031】

別の側面において、本方法の実施に有用なバイオマーカーとしてインター－アルファ－トリプシンインヒビター、重鎖Ｈ３（ＩＴＩＨ３）及び重鎖４、イソ型１（ＩＴＩＨ４）を提供する。インター－アルファトリプシンインヒビターは細胞外マトリックス上のヒアルロン酸の共有結合及び安定化に含まれる（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９４，２６９，（４５），２８２８２－７）。ヒアルロナンは、結腸ポリープ及び腫瘍の成長と共に寸法が増加することが知られている大きな上皮グリコサミノグリカン複合体である（Ｍｉｓｒａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．著，Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ２００８，４９，（３），２１９－２４）。さらに、ＩＴＩＨ３はヒト胃癌患者の血漿中で上方調節されることが以前に同定されており、結腸癌における転移及び腫瘍浸潤活性の予防において予測される役割を有する（Ｍｉｓｒａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．著，Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ２００８，４９，（３），２１９－２４；Ｃｈｏｎｇ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１０，９，（７），３６７１－９）。

【0032】

さらに、本方法の実施に有用なバイオマーカーとして表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を提供する。ＥＧＦＲは劣った腫瘍予後に関係があるとされる（Ｌｉｅｔｏ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．著，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ２００８，１５，（１），６９－７９）。

【0033】

本方法の実施に有用なバイオマーカーとして炎症反応に含まれるある種の酵素を提供する。アルファ－１－アンチトリプシン１－５はプロテアーゼインヒビターであり、それは炎症酵素の放出から組織を保護するのを助け、多くの場合に急性炎症反応の間に濃度が上昇する（Ｆｏｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｇｕｔ ２００９．５８，（６），８５９－６８）。このタンパク質は、ヒト結腸癌患者からの便試料中及び血清中で上昇したレベルで同定された（Ｆｏｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｇｕｔ ２００９．５８，（６），８５９－６８；Ｗａｒｄ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．著，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００６，９４，（１２），１８９８－９０５）。ロイシン－リッチアルファ－２－グリコプロテイン（ＬＲＧ１）及びフェチュイン－Ｂは急性期反応及び炎症において役割を果たすと思わ
れる（Ｈｓｕ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．著，Ｇｅｎｏｍｅ ２００４，４７，（５），９３１－４６；Ｓｈｉｒａｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．著，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００９，３８２，（４），７７６－９）。ＬＲＧ１は複数のマウスの研究において上方調節を示し、ヒト結腸癌患者の血漿において上方調節されることが示された（Ｈｕｎｇ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．著，Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ Ｒｅｓ（Ｐｈｉｌａ）２００９，２，（３），２２４－３３；Ｃｈｏｎｇ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１０，９，（７），３６７１－９；Ｓｈｉｒａｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．著，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００９，３８２，（４），７７６－９）；Ｌａｄｄ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．著，Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ Ｒｅｓ（Ｐｈｉｌａ）２０１２，５，（４），６５５－６４）。

【0034】

ＬＲＧ１は結腸癌のヒト及びネズミモデルの血液において上方調節される急性期反応タンパク質である（Ｉｖａｎｃｉｃ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１３，１２，（９），４１５２－６６；Ｃｈｏｎｇ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１０，９，（７），３６７１－９；Ｌａｄｄ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．著，Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ Ｒｅｓ（Ｐｈｉｌａ）２０１２，５，（４），６５５－６４；Ｉｖａｎｃｉｃ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．著，Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ Ｒｅｓ ２０１４，５５，７（１１）；１１６０－９）。研究はこのタンパク質が潰瘍性大腸炎の患者の血清においても上方調節されることを示し、ＬＲＧ１が腸疾患の全身的指標（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）でもあり得ることを示唆している（Ｓｅｒａｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．著，Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ ２０１２，１８，（１１），２１６９－７９）。１つの研究は、ＬＲＧ１がＡＬＫ１－ＳＭＡＤ １，５及び８との相互作用を介するＴＧＦ－β経路によるシグナリングを介して内皮細胞形成を促進し、かくして血管新生状態を誘導することを示した（Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３，４９９，（７４５８），３０６－１１）。腫瘍浸潤及び転移の基本的な属性の１つである血管新生は腫瘍形成中の非常に初期に引き起こされ得る（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｃｅｌｌ ２０１１，１４４，（５），６４６－７４）。他の研究は、血漿におけるＬＲＧ１の循環レベルが大腸癌を診断し、結腸、直腸Ｓ状結腸移行部及び直腸内の局所的腫瘍限局（ｒｅｇｉｏｎａｌ ｔｕｍｏｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を同定するために有用であり得ることを示した（Ｓｕｒｉｎｏｖａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．著，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０１５，７，１１５３－１１６５；Ｓｕｒｉｎｏｖａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．著，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０１５，７，１１６６－１１７８）。

【0035】

本方法の実施に有用なバイオマーカーの１つとしてマルターゼ－グルコアミラーゼ（ＭＧＡＭ）も提供する。ＭＧＡＭはデンプン異化における最終段階を触媒するために必要な腸タンパク質である（Ｒｅａｌ，Ｆ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．著，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９２，５１，（２），１７３－８１；Ｙｏｕｎｇ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １９９２，７，（４），３４７－５４）。ヒト結腸上皮上のＭＧＡＭ発現を正常な上皮上の発現と比較する免疫組織化学的研究は、この酵素の発現の低下を示した（Ｒｅａｌ，Ｆ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．著，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９２，５１，（２），１７３－８１；Ｙｏｕｎｇ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ １９９２，７，（４），３４７－５４）。ＭＧＡＭは腸に非常に特異的であるが、１個の貫膜パス（ｔｒａｎｓｍｅｎｂｒａｎｅ ｐａｓｓ）及び細胞内に非常に小さいドメインを有する非常に大きな（１８２７アミノ酸）タンパク質である（Ｓｉｍ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００８，３７５，（３），７８２－９２）。酵素の刷子縁活性は完全に細胞の外部に局在する。かくしてこのタンパク質は血液中に放出され得る。

【0036】

さらに本方法の実施に有用なバイオマーカーの１つとしてコラーゲン－１ １（Ｉ）型
アルファ１（ＣＯＬ １Ａ１）を提供する。癌研究において下方調節されたＣＯＬ １Ａ１が以前に報告され、それは発癌性形質転換の一部として役割を果たすと考えられる（Ｓｅｎｇｕｐｔａ ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５，２８０，（２２），２１００４－１４）。その多くの機能の中で、ＣＯＬ １Ａ１は結腸癌の初期ステージに構成的に活性な経路である古典的ＷＮＴシグナリング経路の正の調節物質である（Ｍｅｄｉｃｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ ２０１０，２９，（３），１６１－５）。ＣＯＬ １Ａ１及びＬＲＰ５発現は通常、骨基質形成において連結しており、骨疾患において誤調節される。ＬＲＰ５はＷＮＴシグナリング経路におけるｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体との共同受容体である。

【0037】

本方法の実施に有用なバイオマーカーの１つとして凝固因子Ｖ（Ｆ５）も提供する。Ｆ５は活性化凝固因子Ｘ（Ｘａ）のための補因子であり、それはプロトロンビンを切断して、血液凝固に肝要である活性トロンビンタンパク質を形成するのを助ける（Ｄａｖｉｅ，Ｅ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．著，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１，３０，（４３），１０３６３－７０）。止血における障害（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）は、結腸癌患者における実証されている（ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ）合併症としての静脈血栓塞栓症と共に、通常観察される癌の副作用である（Ｆａｌａｎｇａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ
Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１３，１１，（２），２２３－３３；Ａｌｃａｌａｙ，Ａ．ｅｔ
ａｌ．著，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００６，２４，（７），１１１２－８）。フィブリノゲン、Ｆ５及び他の凝固因子のような血液凝固物質（ｃｏａｇｕｌａｎｔｓ）は結腸癌患者においてレベルが上昇した（Ｐａｓｐａｔｉｓ，Ｇ．Ａ．ｅｔ ａｌ．著，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｈａｅｍｏｓｔ Ｔｈｒｏｍｂ ２００２，３２，（１），２－７；Ｖｏｓｓｅｎ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１１，２９，（１３），１７２２－７）。さらに、Ｆ５は第５因子ライデン凝固疾患（Ｆａｃｔｏｒ Ｖ Ｌｅｉｄｅｎ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）とのその関連に関して最も知られている。第５因子ライデンはＲ５０６Ｑ突然変異を含む一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＮＰ）により引き起こされる。この突然変異は活性化プロテインＣ抗凝固タンパク質がＦ５に結合する能力を低下させる。活性化プロテインＣとＦ５の間の正常な相互作用はＦ５の分解に導く。しかしながらこの相互作用の不在下で、Ｆ５レベルは上昇し、過剰な凝固を引き起こす。第５因子ライデン突然変異に関してホモ接合である患者は大腸癌に関してほとんど６－倍増加した危険を示す（Ｖｏｓｓｅｎ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１１，２９，（１３），１７２２－７）。最近のバイオマーカー研究は、Ｆ５が転移性大腸癌に対して限局性大腸癌を区別するための血漿マーカーであり得ることを示した（Ｓｕｒｉｎｏｖａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．著，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０１５，７，１１５３－１１６５）。

【0038】

別の側面において、本方法の実施に有用なバイオマーカーの１つとしてビトロネクチン（ＶＴＮ）を提供する。ビトロネクチンは細胞接着及び拡散を促進することが示されており、悪性腫瘍（ｔｕｍｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）において示されている（Ｆｅｌｄｉｎｇ－Ｈａｂｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．著，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９３，５，（５），８６４－８）。このタンパク質はまた、いくつかのセルピンセリンプロテアーゼインヒビターへの結合を介して、末端細胞溶解性補体経路（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ）中に含まれるいくつかのタンパク質の膜－傷害効果を阻害する（Ｍｉｌｉｓ，Ｌ．；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．著，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９３，９２，（１），１１４－９）。補体因子Ｂ、補体Ｃ５及び補体Ｃ４－Ｂを含むネズミモデルにおけるいくつかの補体因子の大きく且つ一貫した上方調節は、ビトロネクチンがこれらの上方調節されたタンパク質の傷害効果を部分的に軽減できたことを示唆している。ビトロネクチンは、結腸、直腸Ｓ状結腸移行部及び直腸内の局所的腫瘍限局に関するマーカーでもあり得
る（Ｓｕｒｉｎｏｖａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．著，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０１５，７，１１５３－１１６５）。

【0039】

さらに、本方法の実施に有用なバイオマーカーとしてカテプシンＢ及びＥを提供する。カテプシンＥは胃アスパルチルプロテアーゼであり、それは胃の粘膜生産性上皮細胞上に最も高いレベルで見出される（Ｃａｒｕｓｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．著，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ ２００９，４５４，（３），２９１－３０２）。それは通常胃癌において上方調節される。カテプシンＢは結腸腫瘍細胞の表面上で、血漿中で高められた量で同定され、以前に負の結腸癌予後に結び付けられた（Ｈｕｎｇ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．著，Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ Ｒｅｓ（Ｐｈｉｌａ）２００９，２，（３），２２４－３３；Ｃａｖａｌｌｏ－Ｍｅｄｖｅｄ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．著，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ２００３，５，（６），５０７－１９）。プロテアーゼインヒビター（及び本方法の実施に有用なバイオマーカー）であるアルファ－２－マクログロブリンは、これらの２つのカテプシンと相互作用することが示された（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．著，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００３，２７０，（６），１１８９－９８；Ｍａｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．著，Ａｒｃｈ
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９８９，２７３，（２），３６７－７４）。

【0040】

本発明のある側面は、タンパク質バイオマーカーに関して生体試料をアッセイすることを提供し、ここでアッセイ段階は生体試料から所望のペプチドを抽出し、抽出されたペプチド混合物を分離することを含む。特定の態様において、問題の生物学的材料からタンパク質を抽出し、単離されるタンパク質を、プロテアーゼを用いて酵素的に消化し、ペプチドフラグメントを生成させる。逆－相クロマトグラフィーを用い、複合ペプチド混合物をクロマトグラフィーにより分離する。特定の態様において、逆相クロマトグラフィーは高ｐＨ逆相クロマトグラフィーである。あるいはまた、オフラインイオン交換クロマトグラフィー又は高ｐＨ逆－相クロマトグラフィーを用いて、複合ペプチド混合物をクロマトグラフィーにより分離する。さらに、当該技術分野における熟練者は、本方法の態様の実施のために他の抽出及び分離法が適していることを認識するであろう。

【0041】

特定の態様において、酵素消化の前に安定な同位体標識された標準をタンパク質抽出物に添加する。参照標準は、相対的又は絶対的定量のために用いられ得る（Ｙｏｃｕｍ，Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ，Ａ．Ｍ．著，Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ２００９，８，（２），１４５－５７）。通常の絶対的定量法はＡＱＵＡ（絶対的定量（Ａｂｓｏｌｕｔｅ ＱＵＡｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を示す）として知られる。ＡＱＵＡペプチドは、既知の濃度で試料中に添加される重い安定な同位体アミノ酸以外は、配列において内因性ペプチドと同一である。かくしてＡＱＵＡペプチドと比較すると、内因性ペプチドの正確な濃度を決定することができる（Ｇｅｒｂｅｒ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．著，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００３，１００，（１２），６９４０－５）。安定な同位体－標識されたペプチドの正確な濃度が未知の場合、ペプチドを既知の比率で試料中に添加し、相対的な定量のために用いることができる。それぞれ安定な同位体標識されたタンパク質（ＰＳＡＱ）又はコンカテマー（ＱｃｏｎＣＡＴ）を用いて、全タンパク質として又は合成の連結されたトリプシンペプチドとして参照標準を生体内で作ることもできる（Ｋａｉｓｅｒ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１１，８，（８），６９１－６，１３０）。

【0042】

本明細書で開示される特定の態様は、低いレベルの内因性ペプチドを分解し（ｒｅｓｏｌｖｅ）、定量的ピーク積分のためにピークの形を最適化するように最適化された逆－相クロマトグラフィーを用いる。例えばある態様において、ＨＰＬＣ系はＮａｎｏｆｌｅｘ
ｃＨｉＰＬＣ系が備えられたＥｋｓｉｇｅｎｔ Ｎａｎｏ ２Ｄ ＬＣである。ペプチドを捕獲し、逆－相勾配でクロマトグラフィー的に溶離するために用いられるＣ１８マイクロ流体チップ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐｓ）を、場合によりＮａｎｏｆｌ
ｅｘ系に備えることができる。さらに、ピーク分解能への温度の効果を最適化するためにカラムヒーターを、場合によりＮａｎｏｆｌｅｘ系に備えることができる。

【0043】

特定の態様において、本明細書に提供される方法は、共－溶離される種の数を変え、局在する試料の複雑さを低下させることにより、低含量の内因性ペプチドを同定するために最適化されたクロマトグラフィーの勾配長を用いる。従って特定の態様において、本発明の方法はクロマトグラフィー分離のために９０－分の有効勾配長を提供する。

【0044】

高い特異性を達成するために、参照標準のペプチドアミノ酸配列はタンパク質バイオマーカーに独特である（Ｌａｎｇｅ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．著，Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ ２００８，４，２２２）。良いクロマトグラフィーピークの形、適切なイオン化及び最適のフラグメント化を達成するために、ペプチドの長さは約６－２０アミノ酸に保たれる（Ｐｉｃｏｔｔｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３，４９４，（７４３６），２６６－７０；Ｅｌｉａｓ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５，２，（９），６６７－７５；Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．著，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５，３５，（３），２６５－７３）。ある態様において、最も強いフラグメントイオンを与えるようにペプチド衝突エネルギーを最適化し、与えられるサイクル時間に及んで限られた数のトランジション体のみが分析されるようにスケジューリング法を実施する。当該技術分野における熟練者は、スケジューリングが、特定のイオンに関するシグナルを最大にするために滞留時間（トランジション体が分析される時間の長さ）を延長する能力が有することを認識するであろう。１つの態様において、５－７分のスケジューリング枠（ｗｉｎｄｏｗ）が選ばれ、本方法において用いられるペプチドのための１．５－秒のサイクル時間内に少なくとも２０ミリ秒かもしくはそれよれ長い滞留時間を生ずる。あるいはまた、種々の長さのスケジューリング枠も包含される。

【0045】

参照標準としての安定な同位体の使用は、同じ分析内で２種かもしくはそれより多い試料を直接比較し、かくして標識なしの方法において観察される実験から実験への変動（ｒｕｎ－ｔｏ－ｒｕｎ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）に関連する問題を取り除くことができるようにする。標的タンパク質バイオマーカーに独特のこれらの標準は、標的内因性ペプチドバイオマーカーからそれを区別するために重い安定な同位体標識されたアミノ酸を含有する。さらに、これらの参照標準は、複雑なタンパク質消化物中に複数の類似のペプチド配列が存在する場合に正しい問題のペプチド異性体を同定することを助ける能力も有し、かくしてアッセイの特異性に寄与する（Ｂａｎａｃｋ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．著，Ｔｏｘｉｃｏｎ ２０１０，５６，（６），８６８－７９）。

【0046】

ある態様において、質量分析を用いて生体試料中の１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを決定する。特定の態様において、選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ－ＭＳ）を用いてタンパク質バイオマーカーのレベルを決定する。他の態様において、スペクトラルカウンティング（ｓｐｅｃｔｒａｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）、アイソバリックマスタギング（ｉｓｏｂａｒｉｃ ｍａｓｓ ｔａｇｇｉｎｇ）又はイオンモビリティー質量分析を含むがこれらに限られない他の定量的質量分析法を用いて、生体試料中の１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを決定する。

【0047】

さらなる態様において、１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーの絶対濃度を決定する。いくつかの態様において、ＳＲＭ－ＭＳをＡＱＵＡ法と組み合わせて用い、１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーの絶対濃度を決定する。

【0048】

他の態様において、特許請求される方法の決定段階は質量分析法に代わる手段を用いる。例えばある態様において、当該技術分野に既知の日常的な免疫測定法を用いてタンパク質バイオマーカーのレベルを決定する。そのような免疫測定法には酵素－結合イムノソル
ベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質アレー（ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｒａｙｓ）、ウエスターンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、フローサイトメトリー細胞選別、免疫組織化学、免疫細胞化学又はイムノサイトメトリーが含まれるがこれらに限られない。本開示の方法のいくつかの態様において、決定段階はマイクロ流体チップに基づくＥＬＩＳＡｓ又はウエスターンを含むがこれらに限られない日常的な免疫測定法への変形を含む。

【0049】

さらに別の態様において、本開示の方法の決定段階は電気泳動による定量を用いる。例えばいくつかの態様において、決定段階は、制限ではなく一次元又は二次元電気泳動あるいはキャピラリー電気泳動を含む。当該技術分野における熟練者は本開示の実施に適したさらに別の定量的電気泳動法を認識するであろう。

【0050】

さらに別の態様において、通常のタンパク質定量法により生体試料中の１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルを決定する。例えばある態様において、制限ではなくＵＶ－ＶＩＳ分光分析法、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、ＢＣＡ又はローリーアッセイ（Ｌｏｗｒｙ ａｓｓａｙ）を用いて１種もしくは複数種のバイオマーカーのレベルを決定する。いくつかの態様において、１種もしくは複数種のバイオマーカーのレベルの決定は、生体試料からバイオマーカーを精製した後に行われる。

【0051】

他の態様において、本開示の決定段階は、生体試料を１つもしくはそれより多くのクロマトグラフィー定量法に供することを含む。液体クロマトグラフィー法の例にはカチオン交換、アニオン交換、逆－相及びサイズ排除クロマトグラフィーが含まれる。当該技術分野における熟練者は、クロマトグラフィーピークの下の面積が生体試料中に存在するバイオマーカーの相対的な量を表すものであることを認識するであろう。

【0052】

１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーの発現レベルが結腸におけるポリープ形成のない患者において検出される発現レベルと異なる場合に、患者は結腸におけるポリープ形成を有すると同定される。ある態様において、結腸におけるポリープ形成のない患者のレベルは、ポリープ形成又は結腸癌を有していなかった以前に検査された患者からのタンパク質マーカーのデータベースに由来する。あるいはまた、患者の生体試料中で異なって発現されるバイオマーカーのレベルを、癌又は前癌のない患者からの生体試料に相対的に測定する。

【0053】

本明細書で用いられる場合、「異なって発現される」は、２つもしくはそれより多くの生体試料において決定されるバイオマーカーの間の、あるいは生体試料において決定されるバイオマーカーとバイオマーカー参照標準の間の比較を指し、ここで測定されるバイオマーカーの発現レベルは比較される生体試料の間で、あるいは生体試料と参照標準の間で異なる。いくつかの態様において、異なる発現は、比較されるバイオマーカーレベルにおける上昇を含む。他の態様において、異なる発現は、比較されるバイオマーカーレベルにおける低下を含む。さらに別の態様において、異なる発現は、比較されるバイオマーカーにおける時間を経ての変化を含む。さらにもっと別の態様において、異なる発現は、比較されるバイオマーカーにおける患者の結腸中に存在するポリープ又は腫瘍の異なるステージの間の変化を含む。さらに別の態様において、異なる発現は、比較されるバイオマーカーにおける患者の結腸中に存在する病変の処置の間の変化を含む。

【0054】

態様において、患者の結腸における病変の存在又はステージを決定するために、本開示の１種もしくは複数種のバイオマーカーの異なる発現を用いる。特定の態様において、異なる発現は、生体試料中の１種もしくは複数種のバイオマーカーのレベルにおける参照生体試料からの、あるいはバイオマーカー参照標準からの変動を含む。いくつかの態様において、１種もしくは複数種のバイオマーカーにおける対応する参照量からの約１０％、約
２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％又は約９０％の変動は、患者の結腸における病変の存在又はステージの指標である。別の態様において、１種もしくは複数種のバイオマーカーにおける対応する参照量からの約２－倍、約４－倍、約８－倍、約１０－倍、約２０－倍、約４０－倍、約８０－倍又は約１００－倍の変動は、患者の結腸における病変の存在又はステージの指標である。

【0055】

ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ又はウシから集められた生体試料中の１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーのレベルの決定方法を提供する。本明細書で用いられる場合、「生体試料」は患者から単離される生物学的材料から成り、血液、血清、組織、血漿又は血球を含むがこれらに限られない。

【0056】

特に、本開示の方法に有用なバイオマーカーは、時には腫瘍又は腺腫又はポリープ細胞から離れて起こっている体の反応を含む。主な例には肝臓で生産される急性－期及び炎症反応タンパク質が含まれる。急性期、炎症及び免疫反応は、腫瘍の存在への通常の反応として同定されており（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ ２００８，４５４，（７２０３），４３６－４４；２１５）、細胞接着は癌転移に関連する重要な機能を表す。インター－アルファ－トリプシンインヒビターのようなヒアルロナン－結合タンパク質は、このグリコサミノグリカンの成長中の腫瘍への生体輸送を与える。これらは癌への全身的な反応に関連して本明細書に提示されるほんのいくつかの例である。従って当該技術分野における熟練者は、本発明の生体試料が腫瘍及び非－腫瘍細胞の両方に由来することを認識するであろう。さらに当該技術分野における熟練者は、本発明の生体試料が場合により血液、血清、血漿、組織、腹水液、尿及び糞便を含むがこれらに限られない広範囲の材料から単離され得ることを認識するであろう。

【0057】

本開示の態様は、一次診断機構として大腸内視鏡検査を用いる日常的なスクリーニングの代わりとなる感度及び特異性を有する大腸癌に関する生体試料に基づく検査を与える。スクリーニング方法の態様は、高－処理量の標的化質量分析法を用い、それは多くのタンパク質マーカーを１回の定量的スクリーニングアッセイに多重化する（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｓ）。

【0058】

特定の態様において、ＳＲＭ－ＭＳを用いる大腸癌に関する生体試料に基づく検査は、有利なことにバイオマーカー当たりのコストの減少、バイオマーカーパネル分析における処理量の増加の可能性及び向上した感度及び特異性を与える。

【0059】

ある態様は、前癌性又は癌性状態の存在に関する日常的な集団のスクリーニングのための方法を与える。これらの方法は、診断目的に有用な血液及び他の材料の日常的な収集を含む。さらに、ある態様において、大腸内視鏡検査又はポリープ切除法の間に、又はそれらと同時に本発明の生体試料を得る。さらに別の態様において、大腸内視鏡検査又はポリープ切除法の後に周期的に本発明の態様の生体試料を得る。さらに別の態様において、大腸内視鏡検査の前に生体試料を得、タンパク質バイオマーカーのレベルを決定し、大腸内視鏡検査の必要な患者を同定する。

【0060】

本方法の態様は、患者集団の日常的なスクリーニングに有用である。本方法は、主に現存するスクリーニング法が侵襲性であり、高価であり且つ農村部で利用不可能なために、適格な（ｅｌｉｇｉｂｌｅ）患者の現存するスクリーニング推奨とのコンプライアンスが低い場合に特に有利である。さらに本方法の態様は、大腸癌に関する高められた危険因子（例えば家族歴）を呈しないか、あるいは本方法でなければ現存するスクリーニング又は診断法の必要を示されないであろう患者集団のスクリーニングに有用である。

【0061】

さらに別の態様において、大腸内視鏡検査又はポリープ切除法によるさらなる評価又は
処置を含むがこれらに限られないさらなる臨床的評価又は処置から利益を得るであろう患者の同定のための方法を提供する。他の態様において、外科手術－後又はポリープ切除－後の患者の監視を提供する。さらに別の態様において、本方法は化学予防薬又は化学治療薬への患者の反応性の監視に有用である。

【0062】

さらに、現存する大腸スクリーニング、診断、予後及び処置法の診断的及び予後的有用性を強化することができる方法を提供する。従って本明細書に開示されているある態様は、大腸内視鏡検査、ＣＴスキャン又は便潜血反応検査を含む当該技術分野に既知の他の方法との組み合わせにおいて有用である。

【0063】

さらなる側面において、開示は患者における大腸病変の決定のためのキットを目的とする。キットは本開示の１種もしくは複数種のバイオマーカーを検出するための１種もしくはそれより多い検出試薬を含み、場合により癌性又は前－癌性大腸病変の存在又は不在と関連する１種もしくは複数種のタンパク質バイオマーカーに関する１組の標準値を含むことができる。

【0064】

さらに本開示は；ａ）本開示の生体試料中の１種もしくは複数種のバイオマーカーの量を決定するための手段、ｂ）患者の結腸中に存在する病変の存在又はステージを決定するべく段階ａ）で決定される量を参照量と比較するための手段を含んでなる、上記で言及した本開示の方法を実施するために適したキットに関する。いくつかの態様において、キットは本開示の方法を実施するための使用説明書を含む。

【0065】

本明細書で用いられる場合、「キット」という用語は、適切には個別に又は１つの容器内で与えられる上記の手段の集合を指す。容器は、やはり適切には本開示の方法を実施するための使用説明書を含む。

【0066】

本開示は、結腸中の癌性又は前癌性病変を有する患者を同定するため；あるいは大腸癌腫をステージ１、ステージ２、ステージ３又はステージ４癌腫と同定するため；あるいは結腸中にポリープ形成を有すると同定される患者に一定期間の（ａ ｃｏｒｕｓｅ ｏｆ）処置を決定し、施すため、あるいは大腸内視鏡検査に関する必要性を決定するために患者をスクリーニングするための、前に挙げたキットの使用にも関する。

【0067】

本発明を以下の実施例においてさらに記述し、実施例は請求項に記載される本発明の範囲を制限しない。

【0068】

以下の実施例は本発明及び種々のその使用の特定の態様の例である。それらは説明目的のためのみに示され、本発明を制限すると理解されるべきではない。

【発明を実施するための形態】

【0069】

実施例

【実施例0070】

Ａｐｃ ^Pirc/+ ラットマイクロアレー及び長期間分析（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）
動物交配及び管理（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）。雌のラットにおける発情周期による混同の可能性を取り除くために、雄のラットのみをマイクロアレー及びプロテオミクス研究に用いた。実験の間ずっと、１２：１２時間の明：暗サイクルを保持し、概日サイクルの故の変動を抑制するために４－時間の枠内にラットをすべて解剖した。雌のＡＣＩＡｐｃ^+/-ラット（Ｈａｒｌａｎ）を雄のＦ３４４Ｎ／ＴａｃコアイソジェニックＡｐｃ^Pirc/+
（Ｐｉｒｃ）ラット（ＷＦＤの実験室で開発され、現在はＴａｃｏｎｉｃを介して商業的
に入手可能である）に交配することにより、Ｆ₁世代（ＡＣＩｘＦ３４４）－Ａｐｃ^Pirc/+ラットを形成した（Ａｍｏｓ－Ｌａｎｄｇｒａｆ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．著，Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００７，１０４，（１０），４０３６－４１）。これらの“Ｆ₁－Ｐｉｒｃ”ラットは、標準的なコアイソジェニックＦ３４４Ｎ／Ｔ
ａｃ－Ｐｉｒｃラットと比較して向上した腫瘍多様性（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）及び腫瘍発生までの減少した時間を示す。９７－日令のＦ₁－Ｐｉｒｃラットの１つの群をマ
イクロアレー研究に用いた。追加の２つの群、Ｆ₁－Ｐｉｒｃ及び（ＡＣＩＸＦ３４４）
Ｆ₁ＡＰＣ^+/-“Ｆ₁－野生型”コホートをプロテオミクス研究のために６０日令から１３
５日令まで長期間追跡した。

【0071】

マイクロアレーラットコホート。マイクロアレー実験は、ＭＩＡＭＥ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（Ｂｒａｎｚｍａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．著，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２００１，２９，（４），３６５－７１）により推奨される命名法、記述及びデータ共有に従う。データはＮＣＢＩ’ｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．著，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００２，３０，（１），２０７－１０）に寄託されており、ＧＥＯ Ｓｅｒｉｅｓ受け入れ番号ＧＳＥ５４０３５を介して入手可能（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）である。腫瘍において異なって発現された転写産物のレベルを測定するために、４個のＦ₁－Ｐｉｒｃラットからの１０個の結腸腫瘍試料及
び４個の匹敵する（ｍａｔｃｈｅｄ）正常な組織試料からＲＮＡを単離した。腫瘍の四分の一を収穫することにより、腫瘍試料を得た。正常な腸組織の収集のために、円刃刀（ｓｃａｌｐｅｌ ｂｌａｄｅ）を用いて遠位結腸の管腔表面を穏やかに削り取った。正常な組織の収集のために、腫瘍の周りの最低で２ｍｍの障壁が必要であった。

【0072】

Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、製造者の指示に従って全ＲＮＡ（１００ｎｇ）をＣｙ３染料で標識した。ラットのコホートからの正常な組織から収集されたＲＮＡをＣｙ５染料で標識した。試料を均等に分配し、Ａｇｉｌｅｎｔ ４ｘ４４ｋ Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅマイクロアレーにハイブリッド形成させた。インキュベーションに続き、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ上で、２０ビットデータフォーマットを用いて３μｍの解像度でアレーを走査した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ １０．７を用いてファイルを抽出した。次いで分析のためにデータをＧｅｎｏｍｅ Ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｐａｒｔｅｋ）中にインポートした。５％に等しいかもしくはそれより小さい偽発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）（ＦＤＲ）を以て５－倍に等しいかもしくはそれより大きい異なる発現の基準を用い、正常な結腸組織と腫瘍組織の間で異なって発現された遺伝子のリストを作成した。

【0073】

長期間ラットコホート。１４のＦ₁－Ｐｉｒｃ及び１０のＦ₁－野生型ラットに６０及び９０日令に内視鏡検査を受けさせ、生体内で結腸腫瘍の多様性及び成長パターンを決定した。次いで１３５日にラットを犠牲にし、全腸腫瘍多様性を決定した。６０、９０及び１３５日令に各動物から血液を集めた。内視鏡検査のために、３％イソフルランを用いて動物に麻酔をかけ、腹側を下にして無菌の外科手術野に置いた。温食塩水で結腸を洗って（ｆｌｕｓｈｅｄ）便を除去し、且つ潤滑を与えた。２回の内視鏡検査実施（ｖｉｓｉｔｓ）の各回に腫瘍を調べ、両方の実施において見られる腫瘍に３つのスコア：成長中、静止（ｓｔａｔｉｃ）又は後退（ｒｅｇｒｅｓｓｉｎｇ）の１つを与えた。３人の目隠しされた観察者の少なくとも２人の間の一致に基づいて、各腫瘍に関して合意スコアを形成した。１３５日令に犠牲にした後、ホルマリン－固定された小腸及び結腸中の腫瘍を、Ｏｌｙｍｐｕｓ解剖顕微鏡上で１０倍の倍率で数えた。

【実施例0074】

液体クロマトグラフィー選択反応モニタリング質量分析
タンパク質候補選択。２つの戦略を用いて標的化質量分析のための血清タンパク質を選択した。第１に、マイクロアレー研究において結腸腫瘍中で上方－調節された転写産物に対応するタンパク質候補を選択した。３つの基準を用いてこれらの候補を称した：０．０５偽発見率まで選別（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）した後に正常な組織と比較して結腸新生物中で少なくとも５－倍上方調節されたＲＮＡレベルを有するもの；分泌されることが予測されるか又は既知のタンパク質（Ｅｄｇａｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．著，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００２，３０，（１），２０７－１０）；及び結腸癌に生物学的有意性を持つ可能性のあるタンパク質（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ． ｅｔ ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３，３３９，（６１２７），１５４６－５８）。候補選択の第２の戦略は、以前に記載されている通り（Ｉｖａｎｃｉｃ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１３，１２，（９），４１５２－６６）、野生型と比較されるＡｐｃ^Min/+マウスの血清からの定量的プロテオームデータを用いた。異なって発現さ
れる血液タンパク質の同定の機会を増すために、両方の検出戦略において浮かび上がった２つのタンパク質候補を選択した。

【0075】

標的化分析のための合成ペプチド。３層選択法（ｔｈｒｅｅ ｔｉｅｒｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）を用いてペプチドを設計し、合成した。（図２）。層１選択基準は配列の独特性（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９０，２１５，（３），４０３－１０）、長さ、相対的疎水性（Ｙａｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．著，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１２，９，（２），１２９－３４）ならびに既知の翻訳－後修飾の不在（分析のために修飾が標的化されていなければ）を含んだ。

【0076】

層２選択基準は、組織内ショットガンプロテオミクス研究から集められた非標的化データならびに酵母、マウス及びヒトからのプロテオームデータを保存しているＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓのようなオープンソース質量分析リポジトリ中に見出さされるデータを含むプロテオタイプ的（ｐｒｏｔｅｏｔｙｐｉｃ）ペプチド配列の適切性を示す実験的質量分析データを含んだ（Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ｅ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．著，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ２００８，９，（５），４２９－３４）。これらのデータベース中で日常的に同定されるペプチドは、より大きな標的化分析において同定される機会を有する。これらの質量分析データ資源は、酵素消化の間に切断され損ないがちなペプチドを有するタンパク質も同定することができる。層２基準は三連四重極型計測器上における標的化ＳＲＭ分析のために良いペプチドの同定のための予測的アルゴリズムも含んだ。例えばＳＲＭＡｔｌａｓは、ＳＲＭ分析のためのプロテオタイプ的ペプチドの選択を助けるために、予測的アルゴリズムＰＡＢＳＴを用いる。ＰＡＢＳＴは、ペプチドを酵母、マウス又はヒトに関するＳＲＭ－ＭＳ実験におけるそれらの有用性に関して採点するために理論的データ及び実験的データの両方を用いる。

【0077】

層３基準は異種間有意性を有するペプチドの設計に関連する。標的化されるペプチドは実験モデル種のプロテオーム内で独特でなければならないが、ヒトにおけるオルソロガスタンパク質に同一で、かくしてヒトにおいて有用な方法及び試薬への動物データの外挿を容易にもしなければならない。

【0078】

第１の反復で、ラットトランスクリプトーム候補から６１のペプチドを選択した（下記の実施例３）。調べられた６１中の９つのペプチドはさらなるスクリーニング基準を満たした。２回目のスクリーニングにおいて、３０のペプチドが選択され、調べられ、２７がさらなるスクリーニング基準を満たした。ペプチドの完全なリストを表２に与える。

【0079】

【表3-1】

【0080】

【表3-2】

【0081】

【表3-3】

【0082】

ペプチド選択の後、１つの重い標識された安定な同位体アミノ酸を含有する、問題の標的を定める（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）それぞれのペプチドの合成形態を合成した。このペプチドを絶対的定量分析に用いることができるか、あるいはそれを相対的定量分析に用いることができる。下記の実施例における態様は、未精製合成参照標準を既知の希釈係数（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ）で試料中に添加して、相対的定量を用いる。血清のよ
うな複雑な混合物においては、種々のタンパク質からの複数のアイソバリック（ｉｓｏｂａｒｉｃ）ペプチドが類似の溶離時間にピークを生ずるであろう。重い参照標準は、内因性ペプチドの正しい保持時間及びトランジション体順序（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｏｒｄｅｒ）を同定するのを助け、かくして正しくないペプチドの定量を防ぐことができる。それぞれの選択されたバイオマーカー候補に独特の同位体標識されたペプチド参照標準を、ＵＷ－Ｍａｄｉｓｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒのペプチド合成コア施設により合成し、各参照ペプチドにおいて少なくとも１個の¹³Ｃ及び¹⁵Ｎ標識されたアミノ酸を導入した。（表２）。

【0083】

試料収集。Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｔｕｃｋ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ２００９，８，（１），１１３－７）により公開された標準的な操作法に従って、血液試料を集め、処理し、保存した。約１．５ｍｌの血液を眼窩後洞からＰｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中に集めた。１日の中の血液収集のための時点を研究全体に及んで（ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ）制御し、すべての血液試料を２－時間の枠内に集めた。血液を室温で３０－６０分間放置して凝固させてから１，２００ｇにおいて２０分間室温で遠心分離した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５ｃ）。次いで無菌のＬｏＲｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｄｕａｌｆｉｌｔｅｒピペットチップ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて血清を新しいＰｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄ管に移し、使用まで－８０℃で凍結した。

【0084】

試料調製。１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐユニットを用い、１５００ｇにおいて４℃で１時間、血清を５ｍＬの２０％アセトニトリル／８０％Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ₂Ｏで５回洗浄し、続いて凍結乾燥した。ネズミの研究のために、４．
６ｍｍｘ１００ｍｍのマウスＭＡＲＳカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、製造者の案に従って、主な血液タンパク質（アルブミン、トランスフェリン及びＩｇＧ）を再可溶化された血清の２ｍｇのアリコートから除去した。（ヒト試料の調製は下記の実施例４に記載される。）カラムにより保持されないタンパク質を集め、濃縮し、以前に記載されている通りに三塩化酢酸を用いて沈殿させた（（Ｉｖａｎｃｉｃ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１３，１２，（９），４１５２－６６）。再可溶化された試料につき、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標） ＢＣＡタンパク質濃度アッセイを、製造者の指示に従って行った（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ）。

【0085】

各試料からの血清タンパク質の１００μｇのアリコートにシステイン残基の還元及びアルキル化を経させ、続いてシーケンシング等級（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｇｒａｄｅ）のブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１：５０のトリプシン－タンパク質比で用いて消化した。還元及びアルキル化の前に、各標的内因性ペプチドの安定な同位体標識されたペプチド参照標準を血清タンパク質試料に加えた。トリプシン消化は３７℃で終夜行われた。得られるペプチドを、ＳＰＥＣ Ｃ１８ Ｐｉｐｅｔｔｅ Ｔｉｐｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で製造者の指示に従って脱塩した。真空遠心を用いて溶離ペプチドを乾燥した。

【0086】

ＬＣ－ＳＲＭ－ＭＳ法。合成ペプチドを０．１％ギ酸、５％アセトニトリル及び水中で１μｇ／μｌの内因性ペプチドの濃度に再可溶化した。ナノフレックスｃＨｉＰＬＣが備えられたＮａｎｏＬＣ ｕｌｔｒａ ２Ｄ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ）を用いて液体クロマトグラフィー分離を行った。マイクロ流体チップは、１２０Åの細孔寸法におけるＣ１８ ３μｍ樹脂を有する７５μｍ直径１５ｃｍ長さのカラムであり、ｃＨｉＰＬＣ系の温度を３７℃に設定した。３００ｎｌ／分の流量における９０分の勾配を以下の通りに適用した：開始条件を水中の０．１％ギ酸（緩衝液Ａ）の９７％及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（緩衝液Ｂ）の３％に設定し、３０分までに直線的に１５％Ｂに上昇させた。６０分ま
でに緩衝液Ｂを３５％に直線的に上昇させ、次いで５０％Ｂへのもっと急な勾配を８５分まで適用した。９０分に勾配を開始条件に切り替えて戻した。５５００ＱＴｒａｐ（ＡｂＳｃｉｅｘ）中にペプチドを直接溶離させた。ペプチド前駆体をＱ１において選択し、続いてｑ２においてフラグメント化させ、続いてＱ３において各ペプチドに関して上位（ｔｏｐ）３－４つのトランジション体を監視した。すべてのＱ１及びＱ３の質量を単位分解能（ｕｎｉｔ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）において測定した。滞留時間を最大にするために、１．５秒のサイクル時間と共に５－分のスケジューリング枠を適用した。方法の展開及びピークの分析は、Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェアを用いて行われた。

【0087】

データ処理。質量分析結果をＳｋｙｌｉｎｅ中にインポートし、ピークを積分した。３回の技術的反復に及ぶ最も強いトランジション体の平均ピーク面積を用いて各ペプチドを評価した。各タンパク質に関し、Ｆ₁－Ｐｉｒｃ／Ｆ₁－野生型の平均比をペプチドのそれぞれに関して計算した。正規分布を仮定して両側スチューデントのｔ検定を用い、Ｐ－値を得た。

【0088】

個々のレベルにおける及びパネルとしての血清タンパク質マーカーの診断的能力を、ＪＲＯＣＦＩＴウェブに基づく計算機（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅウェブサイトに与えられたＥｎｇ Ｊ．，ＲＯＣ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ ｆｏｒ ＲＯＣ
ｃｕｒｖｅｓを参照されたい）を用いるＲｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）分析により、１４のＦ₁－Ｐｉｒｃ及び１０のＦ₁－野生型動物の同じテストセットを用いて決定した。データフォーマット２（信頼度格付けを用いる二値応答（ｂｉｎａｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ））を合計３つの格付けカテゴリーと共に用いた：１＝低い信頼度；２＝中度の信頼度；及び３＝高い信頼度。最初に各タンパク質を個々のタンパク質としてのその診断的能力に関して格付けた。次に個々のＲＯＣ分析に基づいて選ばれる４つの特定のタンパク質の群をパネルとしてのその診断的可能性に関して評価した。単独のタンパク質及びパネルのＲＯＣ分析のさらなる詳細を下記に記載する。

【0089】

プロテオミクスにおいて、相対的定量は多くの場合に１つの生物学的状態（例えば癌）の別の生物学的状態（例えば癌なし）への比較から誘導される倍変化の使用に頼っている。ほとんどの研究者は、分析されているデータに関して任意に定義される閾発現変化を指定する。最近、タンパク質上方調節に関する合理的な閾指定がＳｅｒａｎｇと共同研究者により定義された（Ｓｅｒａｎｇ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ
２０１３，１２，（１０），４５５６－６５）。彼らは１．２－倍変化が定量されているタンパク質が上方調節されていると考えるのに合理的なカット－オフであると決定した。ＲＯＣ分析は陽性又は陰性の試験を決定するために定量的なカットオフに頼っているので、ＲＯＣ分析において陽性又は陰性の結果を指定するための枠としてＳｅｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．により設定される指針が用いられた。

【0090】

タンパク質を、２つの探索（ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）研究（トランスクリプトーム／プロテオーム）に基づいて上方調節されていると予測されるもの又は下方調節されていると予測されるものに分けた。表３及び４は、各タンパク質発現比に関して指定される信頼度格付け（１－３）（ｗｗｗ．ｊｒｏｃｆｉｔ．ｏｒｇ上の分析フォーマット２、信頼度格付けを用いる二値応答により必要とされる）を示す。ＬＲＧ１、Ｆ５、ＶＴＮ、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１０、ＣＤ４４、ＩＴＩＨ３、ＩＴＩＨ４、ＨＰＸ及びＣＦＩは、探索データに基づいて上方調節されると予測された。従ってそれらのタンパク質格付けは１．２－倍閾値に基づいた（Ｓｅｒａｎｇ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．著，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ２０１３，１２，（１０），４５５６－６５）。１．２の発現閾値より低いが、低い信頼度を以て１．１６－１．１９カテゴリーにおいて上方調節されるタンパク質は、ＲＯＣ分析に
おいて偽の陰性の可能性を減じると思われる。

【0091】

【表4】

【0092】

Ｓｅｒａｎｇと共同研究者による研究は、下方調節に関して合理的に有意であると思われる倍－変化値を設定しなかった。従って、０．８６かもしくはもっと低い発現比を合理的な下方調節に関するカットオフとして設定した。０．８６の閾値より高いが、０．８７－０．８９の発現比を有するタンパク質は信頼度の低いレベルを以て下方調節されると考えられ、分析中への偽の陰性の導入を避ける。タンパク質に関して下記に示される下方調節カットオフを用いた。

【0093】

【表5】

【0094】

パネルとしての候補のＲＯＣ分析。ネズミモデルは、ＥＧＦＲ、ＬＲＧ１、ＩＴＩＨ４及びＦ５がそれらの個々のＲＯＣ分析及びそれらの野生型の濃度における低い変動により決定される最も高い診断的可能性を有することを示した（下記の実施例３を参照されたい）。従ってこれらの４つのタンパク質をパネルとしてＲＯＣ分析のために選択した。パネルとしてのＥＧＦＲ、ＬＲＧ１、ＩＴＩＨ４及びＦ５に関する３回の異なる分析を、上記の格付けシステムを用いるこれらのタンパク質に関する個々の陽性の数に基づいて行った。第１の分析は最も厳格でなく、パネル中の４つの中の１つのタンパク質のみが異なる発現を示すことを必要とした。第２及び第３の分析は、それぞれ少なくとも２つ及び３つの陽性の値を必要とした。単独のタンパク質を用いる分析と同様に、ＪＲＯＣＦＩＴ上でフォーマット２（信頼度格付けを用いる二値応答）を用いた。パネル中の陽性のマーカーの数に基づいて信頼度格付けを指定した。表５－７は調べられた３つの厳格度レベルのそれぞれに関して用いられる格付けである。

【0095】

【表6】

【0096】

【表7】

【0097】

【表8】