▶ ザ クリーブランド クリニック ファウンデーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022058700
(43)【公開日】2022-04-12
(54)【発明の名称】卵巣癌ワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20220405BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20220405BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220405BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20220405BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220405BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220405BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220405BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20220405BHJP
C12N 15/117 20100101ALI20220405BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20220405BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 H ZNA
A61K39/39
A61P35/00
A61P35/04
A61P37/04
A61K48/00
C12N15/12
C12N15/85 Z
C12N15/117 Z
C07K14/705
【審査請求】有
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022007374
(22)【出願日】2022-01-20
(62)【分割の表示】P 2018511702の分割
【原出願日】2016-09-02
(31)【優先権主張番号】62/213,286
(32)【優先日】2015-09-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】500064708
【氏名又は名称】ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ビンセント・ケイ・トゥーイ
(72)【発明者】
【氏名】スパルナ・マズムダー
(72)【発明者】
【氏名】ジャスティン・エム・ジョンソン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】卵巣癌の治療および予防のための新しい組成物および方法を提供する。
【解決手段】ヒト女性対象における卵巣癌腫瘍の治療または予防において用いるための、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）ポリペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物が対象に投与するためのものであり、該ＡＭＨＲ２ポリペプチドがヒトＡＭＨＲ２の細胞外ドメインを含む、免疫原性組成物である。
【選択図】なし
【解決手段】ヒト女性対象における卵巣癌腫瘍の治療または予防において用いるための、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）ポリペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物が対象に投与するためのものであり、該ＡＭＨＲ２ポリペプチドがヒトＡＭＨＲ２の細胞外ドメインを含む、免疫原性組成物である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト女性対象における卵巣癌腫瘍を治療する方法であって、該方法は抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）ポリペプチドを含む免疫原性組成物を該対象に投与することを含み、該ＡＭＨＲ２ポリペプチドは配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、方法。
【請求項2】
該少なくとも８個の連続するアミノ酸がＡＭＨＲ２の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と同一である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞質ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞外ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の膜貫通ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない、請求項２～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
該少なくとも８個の連続するアミノ酸がＡＭＨＲ２の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
該ポリペプチドはＡＭＨＲ２の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
該ポリペプチドはＡＭＨＲ２の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と同一である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
該ポリペプチドはＡＭＨＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の膜貫通ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞質ドメインと同一であるアミノ酸配列を含まない、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
該免疫原性組成物がアジュバントを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
該アジュバントがアジュバント６５、α－ＧａｌＣｅｒ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β－グルカンペプチド、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＰＩ－０１００、ＩＦＡ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、リピドＡ、リポ多糖、リポバント（Ｌｉｐｏｖａｎｔ）、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ポリ－ＩＣ、クイルＡ（ｑｕｉｌ Ａ）、トレハロースジミコレートおよびザイモサンからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
該アジュバントが１型／１７型混合型免疫応答を誘導するものである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
該卵巣癌腫瘍が原発性卵巣癌腫瘍である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
該卵巣癌腫瘍が転移性腫瘍である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
該卵巣癌腫瘍が卵巣上皮癌（ＥＯＣ）腫瘍である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
該卵巣癌腫瘍がＡＭＨＲ２を発現する請求項１～１９に記載の方法、。
【請求項21】
該免疫原性組成物の投与が該対象において卵巣癌腫瘍に対する免疫応答を誘導する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
該卵巣癌腫瘍がＡＭＨＲ２を発現するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
該免疫原性組成物の投与が該対象において卵巣癌腫瘍に対する免疫応答を誘導するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
該対象が該免疫原性組成物を複数用量投与される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
該免疫原性組成物の投与が該対象においてＡＭＨＲ２に対するＴ細胞免疫応答を誘導する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
該免疫原性組成物の投与が該対象においてＡＭＨＲ２に対するＢ細胞免疫応答を誘導する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
該免疫原性組成物の投与が該対象による抗ＡＭＨＲ２ＩｇＧ抗体の発現を誘導する、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
該対象に更なる抗癌剤を投与する工程をさらに含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
該更なる抗癌剤がパクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾール、ベバシズマブ、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
該対象が卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を除去するための外科手術を受けたことがある、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
ヒト女性対象における卵巣癌を予防する方法であって、該方法は該対象に抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）ポリペプチドを含む免疫原性組成物を投与することを含み、該ＡＭＨＲ２ポリペプチドは配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、該方法。
【請求項32】
該少なくとも８個の連続するアミノ酸がＡＭＨＲ２の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と同一である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と同一である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞質ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞外ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の膜貫通ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
該少なくとも８個の連続するアミノ酸がＡＭＨＲ２の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と同一である、請求項３１に記載の方法。
【請求項39】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と同一である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
該ポリペプチドはＡＭＨＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の膜貫通ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
該ポリペプチドはＡＭＨＲ２の細胞質ドメインと同一であるアミノ酸配列を含まない、 請求項３８～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
該免疫原性組成物がアジュバントを含む、請求項３１～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
該アジュバントがアジュバント６５、α－ＧａｌＣｅｒ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β－グルカンペプチド、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＰＩ－０１００、ＩＦＡ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、リピドＡ、リポ多糖、リポバント（Ｌｉｐｏｖａｎｔ）、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ポリ－ＩＣ、クイルＡ（ｑｕｉｌ Ａ）、トレハロースジミコレートおよびザイモサンからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。．
【請求項46】
該アジュバントが１型／１７型混合型免疫応答を誘導するものである、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項47】
該対象が卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を除去するための外科手術を受けたことがある、請求項３１～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
該対象に更なる抗癌剤を投与する工程をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
該更なる抗癌剤がパクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾール、ベバシズマブ、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
該卵巣癌腫瘍が原発性卵巣癌腫瘍である、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
該卵巣癌腫瘍が転移性腫瘍である、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
該卵巣癌腫瘍が卵巣上皮癌（ＥＯＣ）腫瘍である、請求項４７～５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
該卵巣癌腫瘍がＡＭＨＲ２を発現する、請求項４７～５２に記載の方法。
【請求項54】
該卵巣癌腫瘍がＡＭＨＲ２を発現するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項４７～５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項55】
該免疫原性組成物の投与が該対象においてＡＭＨＲ２に対する免疫応答を誘導する、請求項３１～５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
該免疫応答がＡＭＨＲ２に対するＴ細胞免疫応答を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
該免疫応答が該対象におけるＡＭＨＲ２に対するＢ細胞免疫応答を含む、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項58】
該免疫原性組成物の投与がＡＭＨＲ２に対する免疫応答を誘導するかどうかを決定する工程を更に含む、請求項３１～５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項59】
該対象が該免疫原性組成物を複数用量投与される、請求項３１～５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
該対象が卵巣癌になりやすい素因を持っている、請求項１～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
該対象のゲノムが対象を卵巣癌になりやすくするＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２変異を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
該対象が卵巣癌の家族歴を有する、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項63】
該対象が閉経後のヒト女性である、請求項１～６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項64】
ヒト女性対象における卵巣癌を予防または治療するためのキットであって、該キットは
抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）ポリペプチドを含み、該ＡＭＨＲ２ポリペプチドは配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、キット。
抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）ポリペプチドを含み、該ＡＭＨＲ２ポリペプチドは配列番号１の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、キット。
【請求項65】
該少なくとも８個の連続するアミノ酸がＡＭＨＲ２の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と同一である、請求項６４に記載のキット。
【請求項66】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項６５に記載のキット。
【請求項67】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と同一である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項６６に記載のキット。
【請求項68】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞質ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６７に記載のキット。
【請求項69】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞外ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない、請求項６５～６８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項70】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の膜貫通ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない、請求項６５～６９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項71】
該少なくとも８個の連続するアミノ酸がＡＭＨＲ２の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と同一である、請求項６４に記載のキット。
【請求項72】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項７１に記載のキット。
【請求項73】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と同一である１００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、請求項７２に記載のキット。
【請求項74】
該ポリペプチドはＡＭＨＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項75】
該ポリペプチドがＡＭＨＲ２の膜貫通ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない、請求項７１～７４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項76】
該ポリペプチドはＡＭＨＲ２の細胞質ドメインと同一であるアミノ酸配列を含まない、請求項７１～７５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項77】
さらにアジュバントを含む、請求項６４～７６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項78】
該アジュバントがアジュバント６５、α－ＧａｌＣｅｒ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β－グルカンペプチド、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＰＩ－０１００、ＩＦＡ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、リピドＡ、リポ多糖、リポバント（Ｌｉｐｏｖａｎｔ）、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ポリ－ＩＣ、クイルＡ（ｑｕｉｌ Ａ）、トレハロースジミコレートおよびザイモサンからなる群から選択される、請求項７７に記載のキット。
【請求項79】
該アジュバントが１型／１７型混合型免疫応答を誘導するものである、請求項７７または７８に記載のキット。
【請求項80】
さらなる抗癌剤をさらに含む、請求項６４～７９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項81】
該更なる抗癌剤がパクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾール、ベバシズマブ、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される、請求項８０に記載のキット。
【請求項82】
該キットが複数用量の該ポリペプチドを含む、請求項６４～８１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項83】
使用説明をさらに含む、請求項６４～８２のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年９月２日に出願された米国仮特許出願第６２／２１３，２８６号に対する優先権の利益を主張する。
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年９月２日に出願された米国仮特許出願第６２／２１３，２８６号に対する優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【0002】
卵巣上皮癌（ＥＯＣ）は、米国における婦人科悪性腫瘍の主要死因である。卵巣癌の約６０％が後期に診断され、現在の標準治療に対する初期反応は高いものの、ほとんどの患者は疾患再発を起こして５年全生存率（ＯＳ）は４５％をわずかに超える。
【0003】
ワクチン接種による卵巣腫瘍免疫の導入は有望なアプローチであり、その潜在的な有効性は、卵巣腫瘍がＴ細胞に浸潤されている患者で認められるＯＳの増加によって裏付けられる。全腫瘍ホモジネートまたはヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、癌精巣抗原１（ＣＴＡＧ１ＢまたはＮＹ－ＥＳＯ－１）および癌抗原２５（ＣＡ－１２５）のような特定の腫瘍関連抗原を用いた治療的卵巣癌ワクチンの戦略が試みられているが、僅かな治療結果しか提供していない（Zhang et al., Journal of Medicine 348:203－213 (2003)；Kandalaft et al., Journal of Clinical Oncology 29:925－933 (2011)；Bookman et al., Journal of Clinical Oncology 21:283－290 (2003)；Odunsi et al., Cancer Research 63:6076－6083 (2004)；and Rosen et al., Gynecologic Oncology 99:267－277 (2005)、各々その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【0004】
したがって、高い卵巣癌の再発率および低い５年生存率を考慮すると、卵巣癌の治療および予防のための新しい組成物および方法が非常に必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
ある態様において、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）に対する免疫応答の誘導を介した卵巣癌の治療および／または予防のための方法および組成物が提供される。
【0006】
特定の態様において、対象（例えば、ヒト女性対象）における卵巣癌腫瘍（例えば、原発性または転移性卵巣癌、例えば卵巣上皮癌腫瘍）の治療方法であって、該対象にＡＭＨＲ２タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部（例えば、配列番号１の少なくとも一部）を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド（すなわち「ＡＭＨＲ２ポリペプチド」）、ＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸、ＡＭＨＲ２エピトープを提示している抗原提示細胞、および／またはＡＭＨＲ２刺激リンパ球（例えば、Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球）を含む免疫原性組成物を投与することを含む、該治療方法を提供する。いくつかの実施形態において、卵巣癌腫瘍はＡＭＨＲ２を発現する。いくつかの実施形態において、該免疫原性組成物の投与により、対象における卵巣癌腫瘍に対する免疫応答（例えば、Ｔ細胞免疫応答（例えば１型および／または１７型免疫応答）および／またはＢ細胞免疫応答（例えばＩｇＧ応答））が誘導される。いくつかの実施形態において、対象は該免疫原性組成物を複数回投与される（例えば、少なくとも２、３、４、５または６回投与）。いくつかの実施形態において、対象は、卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を除去するための外科手術を受けたことがある。いくつかの実施形態において、当該方法は、卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を外科的に除去するステップをさらに含む。
【0007】
特定の態様において、対象（例えば、ヒト女性対象）における卵巣癌および／または卵巣癌の再発を予防する方法であって、ＡＭＨＲ２タンパク質（例えば、配列番号１）のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド（すなわち、「ＡＭＨＲ２ポリペプチド」）、ＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸、ＡＭＨＲ２エピトープを提示している抗原提示細胞、および／またはＡＭＨＲ２刺激リンパ球（例えば、Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球）を含む免疫原性組成物を該対象に投与することを含む、該方法が提供される。いくつかの実施形態において、該免疫原性組成物の投与は、対象においてＡＭＨＲ２に対する免疫応答（例えば、Ｔ細胞免疫応答（例えば１型および／または１７型免疫応答）および／またはＢ細胞免疫応答（例えばＩｇＧ応答））を誘導する。いくつかの実施形態において、対象は該免疫原性組成物を複数回投与される（例えば、少なくとも２、３、４、５または６回投与）。いくつかの実施形態において、対象は卵巣癌腫瘍（例えば、ＡＭＨＲ２を発現する卵巣癌腫瘍（例えば原発性または転移性卵巣癌腫瘍））の少なくとも一部を除去するための外科手術を受けたことがある。いくつかの実施形態において、該腫瘍は卵巣上皮癌腫瘍である。いくつかの実施形態において、当該方法は、卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を外科的に除去するステップをさらに含む。
【0008】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバントを含む。いくつかの実施形態において、アジュバントはアジュバント６５、α－ＧａｌＣｅｒ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β－グルカンペプチド、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＰＩ－０１００、ＩＦＡ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、リピドＡ、リポ多糖、リポバント（Ｌｉｐｏｖａｎｔ）、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ポリ－ＩＣ、クイルＡ（ｑｕｉｌ Ａ）、トレハロースジミコレート、またはザイモサンである。いくつかの実施形態において、アジュバントは１型／１７型混合型免疫応答の混合を誘導するものである。
【0009】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、該方法は対象中のおよび／または対象由来の卵巣癌腫瘍がＡＭＨＲ２を発現するかどうかを決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、該方法はＡＭＨＲ２の発現に関し対象から得られた腫瘍サンプルを試験する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２の発現は腫瘍サンプルにおけるＡＭＨＲ２タンパク質の存在を（例えばＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡法、ウエスタンブロットなどによって）検出することによって決定される。いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２タンパク質は、該サンプルを、検出可能に標識された抗体（例えば、蛍光部分で直接または間接的に標識された抗体）と接触させることによって検出される。いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２の発現は、ＡＭＨＲ２ｍＲＮＡの存在を（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロットなどによって）検出することによって決定される。いくつかの実施形態では、ＡＭＨＲ２ｍＲＮＡは、該サンプルを検出可能に標識された核酸プローブ（例えば、蛍光部分で直接または間接的に標識されたプローブ）と接触させることによって検出される。いくつかの実施形態において、該方法は、対象から（例えば、腫瘍バイオプシーにより）試料を得ることを含む。
【0010】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、該方法は、該免疫原性組成物の投与が対象における卵巣癌腫瘍および／またはＡＭＨＲ２対する免疫応答を誘導するか否かを決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、該免疫応答はＴ細胞免疫応答（例えば、１型／１７型混合型免疫応答）である。いくつかの実施形態において、該免疫応答は、患者試料（例えば、患者血清試料）中のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γおよび／またはＩＬ－１７）の存在を検出することによって決定される。いくつかの実施形態において、サイトカインは、検出されるサイトカインに特異的な検出可能に標識された抗体と、直接的または間接的に試料を接触させることによって検出される。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＥＬＩＳＡアッセイを実施することによって検出される。いくつかの実施形態では、免疫応答はＢ細胞免疫応答である。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞免疫応答は、患者試料（例えば、血清試料）中の抗ＡＭＨＲ２抗体（例えば、抗ＡＭＨＲ２ＩｇＧ抗体）の存在を検出することによって検出される。
【0011】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、対象にさらなる薬剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、該さらなる薬剤は抗癌剤である。いくつかの実施形態において、抗癌剤はパクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾール、またはベバシズマブである。いくつかの実施形態において、抗癌剤は免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ４の阻害剤、例えば抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ（ＢＭＳ）、トレメリムマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、および／またはＫＡＨＲ－１０２（Ｋａｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ））である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１の阻害剤、例えば抗ＰＤ－１抗体（例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ）、ペンブロリズマブ／ランブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（Ｃｕｒｅｔｅｃｈ）、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ）、ＡＭＰ－５１４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＳＴＩ－Ａ１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）および／またはＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ）である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２の阻害剤、例えば抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＰＤ－Ｌ２抗体（例えば、ＲＧ－７４４６（Ｒｏｃｈｅ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＢＭＳ）、ＭＥＤＩ－４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＳＢ－００２０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ）、ＡＵＲ－０１２（Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ Ｍｅｄ）、ＳＴＩ－Ａ１０１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ））である。
【0012】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態において、該ヒト女性対象は卵巣癌になりやすい素因を持っている。いくつかの実施形態では、対象のゲノムは、対象を卵巣癌にかかりやすくするＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２変異を含む。いくつかの実施形態において、対象は、卵巣癌の家族歴を有する。いくつかの実施形態において、対象は閉経後のヒト女性である。
【0013】
特定の態様において、対象（例えば、ヒト女性対象）における卵巣癌を予防および／または治療するためのキットおよび／または組成物（例えば、免疫原性組成物）であって、ＡＭＨＲ２タンパク質（例えば、配列番号１）のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド（すなわち、「ＡＭＨＲ２ポリペプチド」）、ＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸、ＡＭＨＲ２エピトープを提示している抗原提示細胞、および／またはＡＭＨＲ２刺激リンパ球（例えば、Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球）を含む、該キットまたは組成物が提供される。いくつかの実施形態において、該キットは該ポリペプチド、核酸、抗原提示細胞および／またはリンパ球の複数回用量を含む。いくつかの実施形態において、該キットは使用説明をさらに含む。
【0014】
本明細書で提供されるキットおよび組成物の特定の実施形態において、該キットまたは組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態において、該アジュバントは、アジュバント６５、α－ＧａｌＣｅｒ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β－グルカンペプチド、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＰＩ－０１００、ＩＦＡ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、リピドＡ、リポ多糖、リポバント（Ｌｉｐｏｖａｎｔ）、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、クイルＡ（ｑｕｉｌ Ａ）、トレハロースジミコレートまたはザイモサンである。いくつかの実施形態において、アジュバントは１型／１７型混合型免疫応答を誘導するものである。
【0015】
本明細書で提供される該キットまたは組成物のいくつかの実施形態において、該キットまたは組成物はさらなる薬剤（例えば、抗癌剤）を更に含む。いくつかの実施形態において、該さらなる薬剤はパクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾールおよびベバシズマブからなる群から選択される抗癌剤である。
【0016】
いくつかの実施形態において、該抗癌剤は免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態において、該免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ４の阻害剤、例えば抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ（ＢＭＳ）、トレメリムマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）および／または ＫＡＨＲ－１０２（Ｋａｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ））である。いくつかの実施形態において、該免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１の阻害剤、例えば抗ＰＤ－１抗体（例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ）、ペンブロリズマブ／ランブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（Ｃｕｒｅｔｅｃｈ）、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ）、ＡＭＰ－５１４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＳＴＩ－Ａ１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）、および／またはＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ））である。いくつかの実施形態において、該免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２の阻害剤、例えば抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＰＤ－Ｌ２抗体（例えば、ＲＧ－７４４６（Ｒｏｃｈｅ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＢＭＳ）、ＭＥＤＩ－４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＳＢ－００２０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ）、ＡＵＲ－０１２（Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ Ｍｅｄ）、ＳＴＩ－Ａ１０１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ））である。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】図１には３つのパネルがある。パネル（Ａ）は細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを示す全長ＡＭＨＲ２、およびＣ－末端６ｘＨｉｓタグのついたＡＭＨＲ２－ＣＤ変異体を示す模式図である。パネル（Ｂ）は、非誘導、ＩＰＴＧ誘導におけるＡＭＨＲ２－ＣＤの発現、およびＮｉ－ＮＴＡアフィニティー精製ＡＭＨＲ２－ＣＤを示す、クーマシーブルーで染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。パネル（Ｃ）は、非誘導、ＩＰＴＧ誘導におけるＡＭＨＲ２－ＣＤの発現、およびＮｉ－ＮＴＡアフィニティー精製（２つの用量）のＡＭＨＲ２－ＣＤを示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの抗Ｈｉｓウエスタンブロットを示す。
【図2】図２は６つのパネルを有し、ＡＭＨＲ２－ＣＤ／ＣＦＡによるメスＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫化がもたらしたデータ、およびＬＮＣまたは脾細胞が増殖およびサイトカイン生成の評価のためにインビトロで培養されたことを示す。パネル（Ａ）は、１０日刺激ＬＮＣが抗原濃度のいくつかのログにわたってＡＭＨＲ２－ＣＤに対する顕著な抗原特異的リコール増殖応答を示したことを実証する。パネル（Ｂ）は、ＡＭＨＲ２－ＣＤに対する応答が磁気ビーズ分離によって精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞によって誘発されるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞によっては誘発されなかったことを示す。パネル（Ｃ）は、ＡＭＨＲ２－ＣＤに対する増殖応答がＣＤ４抗体の存在下で著しく阻害されるが、ＣＤ８またはアイソタイプ対照抗体の存在下では阻害されないことを示す。パネル（Ｄ）は免疫４週間後に脾細胞は免疫原で再活性化されたこと、および７２時間の培養上清のＥＬＩＳＡ分析により、ＡＭＨＲ２－ＣＤに対するリコール応答がＩＦＮγ生成の上昇およびＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－５の極小の生成を伴う炎症性の表現型を伴ったことを示されたことを示す。パネル（Ｅ）は、ＩＦＮγの脾細胞生成が精製ＣＤ４＋Ｔ細胞から誘発され、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞では誘発されなかったことを示す。パネル（Ｆ）は、免疫化の２ヶ月後、ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的ＩｇＧの血清レベルが１：５０，０００希釈を超えての力価でも検出可能であったことを示す。ＰＢＳコントロールには希釈血清の代わりにＰＢＳを使用した。エラーバーは±ＳＤを示す。
【図3】図３は３つのパネルを有し、ＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化後の良性一過性卵巣炎症に関連するデータを示す。パネル（Ａ）は、相対的卵巣ＩＦＮγ遺伝子発現が、ＡＭＨＲ２－ＣＤで免疫した４週間後に上昇したが、ＣＦＡ単独で免疫した後では上昇しなかったことを示す。免疫後８週間で、相対的卵巣ＩＦＮγ遺伝子発現は、免疫した両方のマウス群において同様であった。パネル（Ｂ）はＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化マウスの卵巣におけるＩＦＮγの低レベル一過性発現は、ＡＭＨＲ２－ＣＤで免疫化したメスＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＣＦＡ単独で免疫化したコントロールマウスにおける４連続の交配サイクルにわたる仔産生により定義される妊孕性を評価することにより決定されたとおり、卵巣機能に対する検出可能な影響と関連していないことを示す。パネル（Ｃ）は、ＡＭＨＲ２遺伝子発現が卵巣およびＩＤ８卵巣腫瘍細胞に限定され、正常子宮、胃、脾臓、心臓、肺、腎臓および肝臓において検出されなかったことを示す。エラーバーは±ＳＤを示す。
【図4】図４は７つのパネルを有し、ＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化マウスにおける腫瘍増殖の阻害に関連するデータを示す。図（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）にそれぞれ示されるように、ＩＤ８腫瘍増殖は、腫瘍細胞の接種の５日前、７日前、または１日前に予防的にワクチン接種されたマウスにおいて阻害された。パネル（Ｄ）は、ＩＤ８接種の７日前および１日前にワクチン接種されたマウスにおける実験終了時の最終腫瘍重量によって測定されたとおり、ＡＭＨＲ２－ＣＤワクチン接種が全体的な腫瘍量の有意な減少をもたらしたことを示す。パネル（Ｅ）は、ＩＤ８腫瘍の接種の６０日後のＡＭＨＲ２－ＣＤによる治療的ワクチン接種が、確立された触知できる増殖ＩＤ８腫瘍の増殖を有意に阻害することを示す。パネル（Ｆ）は、ＡＭＨＲ２－ＣＤによる６－７週齢のメスＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇトランスジェニックマウスの予防的ワクチン接種が、自然発症ＥＯＣの増殖において高度に有意な阻害をもたらしたことを示す。パネル（Ｇ）は、６－７週齢の雌ＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇトランスジェニックマウスの予防的ＡＭＨＲ２－ＣＤワクチン接種が、ＣＦＡ単独でワクチン接種したコントロールマウスと比較して、高度に有意な４１．７％の平均ＯＳ増加をもたらしたことを示す。アスタリスクは統計的有意性を示す。エラーバーは±ＳＤを示す。
【図5】図５は、３つのパネルを有し、腫瘍分析に関連するデータを示す。パネル（Ａ）において、矢印は低解像度（上）および高解像度（下）画像中のＡＭＨＲ２－ＣＤワクチン接種マウスからのＩＤ８腫瘍におけるＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤を示す。ＣＦＡ単独でワクチン接種したコントロールマウスでは、ＣＤ３＋Ｔ細胞の炎症性浸潤は観察されなかった。パネル（Ｂ）は、ＣＤ３＋Ｔ細胞集団にゲートされたＴＩＬのフローサイトメトリー分析は、ＣＦＡ単独で免疫化されたコントロールマウスと比較して、ＡＭＨＲ２－ＣＤでワクチン接種されたマウスからの腫瘍浸潤におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の割合の明らかな増加を示したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞では示されなかったことを示す。示されたデータは、同様の結果をもたらす３つの実験の代表例である。パネル（Ｃ）は、ＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化マウス由来の腫瘍が、ＣＤ４、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２について相対的な遺伝子発現の増加を一貫して示したが、ＣＤ８については示さなかったことを示している。アスタリスクは統計的有意性を示す。エラーバーは±ＳＤを示す。
【図6】図６は、５つのパネルを有し、ＣＤ４＋Ｔ細胞による腫瘍増殖に対する免疫防御の受動移入に関連するデータを示す。細胞移入の翌日に、レシピエントマウスに、ＩＤ８腫瘍細胞を接種した。ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的ＬＮＣ（パネル（Ａ））および脾細胞（パネル（Ｂ））を移入したマウスでは、ＩＤ８腫瘍の増殖が阻害された。パネル（Ｃ）は、脾細胞移入および接種の１９０日後に、ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的脾細胞のレシピエントでは、ＯＶＡ特異的脾細胞のレシピエントと比較して、平均腫瘍重量が低かったことを示す。パネル（Ｄ）および（Ｅ）はそれぞれ、精製ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の移植がＩＤ８腫瘍増殖を阻害したことを示す（Ｂ２２０＋Ｂ細胞では示されなかった）。アスタリスクは統計的有意性を示す。エラーバーは±ＳＤを示す。
【図8】図８は、５つのパネルを有し、ヒト組織におけるＡＭＨＲ２遺伝子発現を示す。パネル（Ａ）は、ＡＭＨＲ２の細胞外ドメインが卵巣で発現するが、他のＡＭＨＲ２発現組織では発現しないことを示す。パネル（Ｂ）は、ＡＭＨＲ２－ＣＤおよびＡＭＨＲ２－ＥＤに特異的なプライマー対を使用するヒト組織のｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＡＭＨＲ２－ＥＤが専らヒト卵巣で発現され、ヒトの副腎または膵臓では発現されないことを示すことによって、ヒトタンパク質アトラスからの治験を確認する。パネル（Ｃ）は、ヒトＡＭＨＲ２の卵巣発現が年齢と共に低下すること、およびこの低下は、閉経前卵巣（平均年齢、３１歳）と比較して、閉経後卵巣（平均年齢、６４歳）では有意に低いレベルで発現するＡＭＨＲ２－ＥＤに関して特に明白であることを示す。より年老いたマウス卵巣（９ヶ月齢）では、ＡＭＨＲ２－ＥＤ遺伝子発現の同様の有意な低下が起こる。パネル（Ｄ）は、ＡＭＨＲ２の卵巣発現の年齢に伴う減少は、ヒトＥＯＣにおけるＡＭＨＲ２－ＣＤおよびＡＭＨＲ２－ＥＤドメインの両方の高レベルの遺伝子発現とは対照的であることを示す。パネル（Ｅ）は、ヒトＥＯＣにおけるこの高いＡＭＨＲ２遺伝子発現が、１６の全てのヒトＥＯＣ腫瘍において、ウエスタンブロット分析によって検出された対応する高レベルの検出可能なＡＭＨＲ２タンパク質を伴うことを示す（これはＡＭＨＲ２－ＥＤに特異的なポリクローナル抗体を用い、内在性コントロールとしてβ－アクチン免疫染色を用いて試験された）。すべての場合において、エラーバーは±ＳＤを示し、アスタリスクは有意性を示す。
【図9】図９は２つのパネルを有し、ヒトＥＯＣにおけるＡＭＨＲ２細胞外ドメインの発現を示す。パネル（Ａ）は、ＡＭＨＲ２－ＥＤに特異的なプライマー対を使用する定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析が正常ヒト卵巣（ｎ＝７）におけるＡＭＨＲ２－ＥＤの発現を示し、正常なヒト副腎（ｎ＝３）では示さないことを示す。パネル（Ｂ）は、ＡＭＨＲ２の細胞外ドメインに特異的なポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析は、試験した５個のヒトＥＯＣすべてにおいてＡＭＨＲ２－ＥＤタンパク質の検出を示すことを示す。該全長タンパク質は当該５つの試験腫瘍のうちの１つのみで検出され、細胞質キナーゼドメインの領域の可能な欠失のために、多くのＥＯＣにおいてＡＭＨＲ２シグナル伝達が変化し得ることを示唆された。β－アクチンに特異的な抗体をコントロールとして使用した。
【図10】図１０には８つのパネルがある。パネル（Ａ）は、完全長マウスＡＭＨＲ２（上段）ならびに組み換え免疫原としての産生のために選択された１４０アミノ酸ＡＭＨＲ２－ＥＤ ＨＩＳタグ切断変異体の略図である。パネル（Ｂ）は、２つの充填量でのＮｉ－ＮＴＡアフィニティー精製ＡＭＨＲ２－ＥＤの発現を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの抗Ｈｉｓウエスタンブロット（左）およびＣｏｏｍａｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色（右）を示す。パネル（Ｃ）は、８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種の１ヶ月後を示す；ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、ＩＦＮγおよびＩＬ－１７を産生するが、ＩＬ－５は産生しない、抗原特異的Ｔ細胞の脾細胞頻度の上昇を示した。パネル（Ｄ）（ＩＦＮγ）およびパネル（Ｅ）（ＩＬ－１７）は、ＡＭＨＲ２－ＥＤに対する炎症誘発性応答が、応答するＣＤ４＋Ｔ細胞に主によるものであったが、ＣＤ８＋Ｔ細胞からの顕著な応答も組み込まれたことを示す。パネル（Ｆ）は、ＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種がＡＭＨＲ２－ＥＤに対する実質的な血清ＩｇＧ抗体応答を誘導し、１／５０，０００までの希釈で検出可能であったことを示し、パネル（Ｇ）は、主に関与するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂアイソタイプを示す。パネル（Ｈ）は、３つの他の異なるＨ－２ハプロタイプを表す雌マウスがＩＦＮγ産生Ｔ細胞の高い抗原特異的頻度を示したことから、ＡＭＨＲ２－ＥＤの免疫原性はＣ５７ＢＬ／６マウスに限定されないことを示す。すべての場合において、エラーバーは±ＳＤを示す。
【図11】図１１は５つのパネルを有し、ＡＭＨＲ２－ＥＤが高度に免疫原性であることを示す。パネル（Ａ）は、ＡＭＨＲ２－ＥＤ免疫化マウス由来の脾細胞が、ＡＭＨＲ２－ＥＤに対する抗原特異的リコール増殖応答を示したが、ＡＭＨＲ２－ＥＤと同様の方法で生成および精製された無関係なコントロール抗原である組換えマウスβ－カゼインに対してでは応答はないことを示す。パネル（Ｂ）は、ＣＦＡ免疫化マウスからの脾細胞がＡＭＨＲ２－ＥＤおよびβ－カゼインの両方に応答しないことを示す。パネル（Ｃ）は培養上清のＥＬＩＳＡ分析を示し、これは高レベルの炎症誘発性サイトカイン、ＩＦＮγおよびＩＬ－１７の産生をＡＭＨＲ２－ＥＤが活性化したことおよび２型制御性サイトカインＩＬ－５の極小産生であったことを示す。パネル（Ｄ）は、ＡＭＨＲ２－ＥＤ免疫化マウス由来の脾細胞は１型（～１／４，０００リンパ球；ｐ＜０．０００１）および１７型（～１／２０，０００リンパ球；ｐ＜０．０２）の炎症誘発性Ｔ細胞の有意に高い頻度と、ＩＬ－５を発現する２型制御性Ｔ細胞の最小頻度を実証することを示す。パネル（Ｅ）は、ＡＭＨＲ２－ＥＣによる免疫化の４ヶ月後、ＡＭＨＲ２－ＥＤ特異的ＩｇＧの血清力価が、１／５０，０００希釈を超える力価で有意に検出可能であったことを示す（ｐ＜０．００１）。
【図12】図１２は５つのパネルを有し、ＡＭＨＲ２－ＥＤが主にＣＤ４＋Ｔ細胞応答を活性化することを示す。ＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇトランスジェニック雌マウスのＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫化から１ヶ月後に単離した脾細胞および精製ＣＤ４＋（ＣＤ８＋ではない）Ｔ細胞は、１型（パネル（Ａ））および１７型（パネル（Ｂ）））炎症誘発性Ｔ細胞の顕著な抗原特異的誘導を示した。６週齢でＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化した７ヶ月齢のメスのＴｇＭＩＳＩＩＲ－Ｔａｇマウスから採取した自然発症ＥＯＣの免疫組織化学分析は、ＣＤ３＋Ｔ細胞（パネル（Ｃ））およびＣＤ４＋Ｔ細胞（パネル（Ｄ））の主な浸潤を示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞では示さなかった（パネル（Ｅ））。
【図13】図１３は３つのパネルを有し、ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫後の一過性卵巣炎症を示す。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫４週間後（パネル（Ａ））に摂取した卵巣では炎症性サイトカインＩＬ－１βの発現を示したが、８週間後（パネル（Ｂ））では示さなかった。ＩＦＮγ発現は、免疫後の時点で上昇しなかった。９ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスのＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種後４週間での（パネル（Ｃ））ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＩＬ－１βについてもＩＦＮγについても卵巣遺伝子発現の上昇を示さなかった。
【図14】図１４は２つのパネルを有し、ＡＭＨＲ２－ＥＤ免疫化によってマウス妊孕性が影響を受けないことを示している。ＣＦＡ中のＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化したマウスまたはＣＦＡ単独で免疫化した対照マウス間に、１腹あたり平均仔数（パネル（Ａ））および平均仔出生体重（パネル（Ｂ））に有意差は認められなかった。
【図15】図１５は８つのパネルを有しており、ＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種は、自発性および移植可能な卵巣腫瘍の増殖を阻害することを示している。パネル（Ａ）は、６－７週齢の雌ＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇトランスジェニックマウスの予防的ＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種が、自然発症ＥＯＣの増殖における高度に有意な阻害をもたらしたことを示す（ｐ＜０．０００１）。パネル（Ｂ）は、６－７週齢の雌ＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇトランスジェニックマウスの予防的ＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種が、ＣＦＡ単独でワクチン接種したコントロールマウスと比較して全生存の４２％の増大をもたらした（平均１９３．７±３４．５日対平均１３５±１３．８９日）ことを示す。移植可能なＴｇＭＩＳＩＩＲ ＥＯＣ腫瘍の増殖における同様の有意な阻害が、３ｘ１０６マウス卵巣癌（ＭＯＶＣＡＲ）細胞を接種する７日間前パネル（Ｃ）または１５日間前パネル（Ｄ）のいずれかにワクチン接種したマウスに見られた（ｐ＜０．００１）。パネル（Ｅ）は、６～７週齢のＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（ＤＲ２６）トランスジェニックマウスの予防的ＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種が自然発症ＥＯＣ腫瘍の出現および増殖を有意に遅延させたことを示す。パネル（Ｆ）は、自発性腫の増殖の阻害が、高度に有意な全生存の４２％の増大をもたらしたことを示す。パネル（Ｇ）は、ＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種が、確立された自発性腫瘍を有するＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（ＤＲ２６）トランスジェニックマウスにおいてＥＯＣに対する有意な免疫療法を提供するのにも有効であることを示す。パネル（Ｈ）は、ＡＭＨＲ２－ＥＤでワクチン接種したＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（ＤＲ２６）マウスの自然発症ＥＯＣ腫瘍の免疫組織化学的分析が、矢印で示されるとおり、一貫して、ＣＤ３＋Ｔ細胞（左上パネル）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（中央上パネル）の顕著な浸潤（時折ＣＤ８＋Ｔ細胞（右上パネル）も）を示した。ＣＦＡ単独でワクチン接種したコントロールマウス由来の対応する免疫染色されたＥＯＣ腫瘍は、一貫して検出可能なＴ細胞浸潤を示さなかった（下パネル）。すべての場合において、エラーバーは±ＳＤを示し、アスタリスクは有意性を示す。
【図16】図１６は２つのパネルを有し、ＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ２２０＋Ｂ細胞の移入後のＥＯＣ腫瘍増殖の阻害を示す。ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫したマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞（パネル（Ａ））またはＢ２２０＋Ｂ細胞（パネル（Ｂ））の移入後に、ＭＯＶＣＡＲ ＥＯＣの増殖の阻害が生じた。アスタリスクは有意性を示す。
【図17】図１７は、２つのパネルを有し、ＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ２２０＋Ｂ細胞の移入後の全生存の増大を示す。ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化したマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞パネル（Ａ）またはＢ２２０＋Ｂ細胞パネル（Ｂ）を受けたＭＯＶＣＡＲ腫瘍保有マウスにおける全生存の増大。
【図18】図１８は、ＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激ドＣＤ４＋Ｔ細胞および血清の移入後の腫瘍増殖の阻害および全生存の増大を示す。ＩＤ８－ＶＥＧＦ ＥＯＣ腫瘍の成長阻害が、ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化したマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞（左上パネル）または血清（左下パネル）を受けたマウスで生じた。全生存の増大が、ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化されたマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞（右上のパネル）または血清（右下のパネル）を受けたマウスで生じた。
【図19】図１９は、ヒトＡＭＨＲ２－ＣＤタンパク質バリアントの最も長いアミノ酸配列（配列番号１）である。細胞外ドメイン（ＡＭＨＲ２－ＥＤ）は太字で示し、細胞質ドメイン（ＡＭＨＲ２－ＣＤ）はイタリック体で示す。
【図20】図２０は６つのパネルを有し、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ２２０＋Ｂ細胞、および精製ＩｇＧによる腫瘍免疫の受動移入を示す。パネル（Ａ）は、ＭＯＶＣＡＲ接種の１日前のＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（低）雌マウスへのＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞の移入が、腫瘍増殖の有意な阻害をもたらしたことを示し、パネル（Ｂ）は、オボアルブミン刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞を受けたマウスと比較して全生存が向上したことを示す。パネル（Ｃ）は、ＭＯＶＣＡＲ接種の１日前のＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（低）雌マウスへのＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激Ｂ２２０＋Ｂ細胞の移入が腫瘍増殖の有意な阻害をもたらしたことを示し、パネル（Ｄ）は、オボアルブミン免疫化マウスからのＢ２２０＋Ｂ細胞を受けたマウスと比較して、全生存が向上したことを示す。パネル（Ｅ）はＭＯＶＣＡＲ接種の１日前の、ＡＭＨＲ２－ＥＤ免疫化マウス由来アフィニティー精製ＩｇＧの、ＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（低）雌マウスへの移入が、腫瘍増殖の有意な阻害をもたらしたことを示し、パネル（Ｆ）はオボアルブミン免疫マウス由来のアフィニティー精製ＩｇＧを受けたマウスと比較して、全生存が向上したことを示す。すべてのケースにおいて、エラーバーは±ＳＤを示し、アスタリスクは有意性を示す。
【0018】
詳細な説明
一般
本願では、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）に対する免疫応答の誘導を介した卵巣癌の治療および／または予防のための方法、キットおよび組成物が提供される。
一般
本願では、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）に対する免疫応答の誘導を介した卵巣癌の治療および／または予防のための方法、キットおよび組成物が提供される。
【0019】
ＡＭＨＲ２はトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）ファミリーのＩＩ型受容体に相同な（homologous to）セリン／スレオニンキナーゼ容体である。ヒトＡＭＨＲ２遺伝子は１１個のエクソンを含有し、３つの既知のコードタンパク質を産生する７つの既知の選択的スプライスによるバリアント、タンパク質コード特性を持つ１つの更なるバリアント、およびオープンリーディングフレームの無い３つの非コード転写物がある（The human AMHR2 gene contains 11 exons with seven known alternatively spliced variants producing three known coded proteins, one additional variant with protein coding features, and three non－coding transcripts with no open reading frames.）。成人女性において、５７３アミノ酸長のタンパク質（配列番号１；図１９）の最も長いヒトタンパク質コード転写物は、通常、卵巣のみで発現され、１２７アミノ酸細胞外ドメイン（ＡＭＨＲ２－ＥＤ）、２６アミノ酸膜貫通ドメイン、および４０３アミノ酸細胞質ドメイン（ＡＭＨＲ２－ＣＤ）を含む。ＡＭＨＲ２シグナル伝達は、雄性発生の間にミュラー管の退行を引き起こし、および成人女性において卵母細胞発生および卵胞生成を調整し、それにより、卵巣予備能力および受精能の実質的な制御を提供する。ＡＭＨＲ２はヒトＥＯＣの大部分で発現し、原発性ＥＯＣでは９０％、境界悪性腫瘍では７８％、非ＥＯＣ卵巣腫瘍では７７～８６％、およびグレードＩＩＩ－ＩＶの卵巣癌の悪性腹水では５６％である。正常組織では、ＡＭＨＲ２－ＣＤ発現は主に卵巣に限定される。ＡＭＨＲ２－ＣＤ発現が少数の他のヒト組織でも起こることもあるが、ＡＭＨＲ２－ＥＤは専ら卵巣で発現する。さらに、ＡＭＨＲ２－ＣＤおよびＡＭＨＲ２－ＥＤの両方の卵巣発現は、閉経後の卵巣で減少する。
【0020】
本明細書に記載されるように、ＡＭＨＲ２ポリペプチドによるワクチン接種および／またはＡＭＨＲ２で刺激されたリンパ球の養子移入は、広範な自己免疫合併症を生じることなく、卵巣癌に対する有効な免疫療法を提供する。３９９アミノ酸配列の該細胞質ドメイン（ＡＭＨＲ２－ＣＤ）または１４０アミノ酸配列の該細胞外ドメイン（ＡＭＨＲ２－ＥＤ）のいずれかを含有する組換えマウスＡＭＨＲ２ポリペプチドのいずれかによる卵巣癌のマウスモデルの免疫化は、顕著な炎症誘発性Ｔ細胞応答をもたらし、非常に高いＩｇＧ抗体価を伴った。ＡＭＨＲ２－ＣＤおよびＡＭＨＲ２－ＥＤポリペプチドによるワクチン接種は、卵巣癌に対する有意なＴ細胞介在性の予防および治療を提供し、マウス卵巣癌モデルにおける自然発症卵巣癌腫瘍の発症に対する有意な予防を媒介した。さらに、当該腫瘍増殖に対する保護は、自己免疫症状が最小限であり、その後の交配サイクルにわたって受精能に検出できるほどの影響はなかった。これらのデータは、ＡＭＨＲ２－ＣＤおよび／またはＡＭＨＲ２－ＥＤに対する標的化ワクチン接種が、卵巣癌に対する安全かつ有効な治療法を提供することを示している。
【0021】
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。
【0022】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、その冠詞の文法的目的の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を意味するために使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つのｅｌｅｍｅｎｔまたは２つ以上のｅｌｅｍｅｎｔを意味する。
【0023】
本明細書で使用される場合、用語「投与する」は、対象に医薬品または組成物を提供することを意味し、これに限定されないが、例えば、医療従事者による投与および自己投与を含む。
【0024】
本明細書において、「免疫応答」という用語は、免疫系による抗原または抗原決定基に対する任意の応答を意味する。例示的な免疫応答として、体液性免疫応答（例えば抗原特異的抗体（中和またはその他）の生成）および細胞性免疫応答（例えばリンパ球増殖）が挙げられる。１型炎症性免疫応答は１型サイトカイン（例えばＩＦＮγ）の産生を特徴とする。２型炎症性免疫応答は２型サイトカイン（例えばＩＬ－４またはＩＬ－５）の発現を特徴とする。１７型炎症性免疫応答は１７型サイトカイン、特にＩＬ－１７の発現を特徴とする。いくつかの例では、混合型免疫応答が生成され得る。例えば、ある場合には、ＩＦＮγおよびＩＬ－１７の両方の発現を特徴とする１型／１７型混合型炎症性免疫応答が産生される。
【0025】
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列間の「％同一性」は「％相同性」と同義であり、これはＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264－2268, 1990）およびＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873－5877, 1993）で修正されたアルゴリズムを用いて決定することができる。上記のアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌら（J. Mol. Biol. 215, 403－410, 1990）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本明細書に記載のポリヌクレオチドに相同なヌクレオチド配列をえるためにＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２で行う。基準ポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝３で行う。比較目的のためのギャップのあるアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら（(Nucleic Acids Res. 25, 3389－3402, 1997）に記載のとおりに使用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用される。
【0026】
本明細書で使用される「医薬的に許容される担体」という用語は医薬的に許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または物質を封入する溶媒であって、対象化合物をある臓器または体の部分から、別の臓器または体の部分へ運搬または輸送することに関与するものを意味する
【0027】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、治療または療法のために選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【0028】
本明細書で使用する「治療上有効な量」および「有効量」という語句は、医薬療法に適用可能な合理的な利益／リスク比で対象の少なくとも一部の細胞集団において所望の治療効果を生じるのに有効な薬剤の量を意味する
【0029】
対象における疾患を「治療する」または疾患を有する対象を「治療する」とは、疾患の少なくとも１つの症状が減少するように、または悪化しないように、対象に医薬的処置、例えば薬物の投与を施すことをいう。
【0030】
抗ミュラー管ホルモン受容体ＩＩ（ＡＭＨＲ２）
特定の態様において、ＡＭＨＲ２ポリペプチド（例えば、ＡＭＨＲ２－ＥＤまたはその免疫原性フラグメント、またはＡＭＨＲ２－ＣＤまたはその免疫原性フラグメントを含有するポリペプチド）またはＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸の投与による、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）に対する免疫応答の誘導を介した卵巣癌の治療および／または予防のための方法、キットおよび組成物が提供される。
特定の態様において、ＡＭＨＲ２ポリペプチド（例えば、ＡＭＨＲ２－ＥＤまたはその免疫原性フラグメント、またはＡＭＨＲ２－ＣＤまたはその免疫原性フラグメントを含有するポリペプチド）またはＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸の投与による、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）に対する免疫応答の誘導を介した卵巣癌の治療および／または予防のための方法、キットおよび組成物が提供される。
【0031】
ヒトＡＭＨＲ２遺伝子は１１個のエクソンを含有し、３つの既知のコードタンパク質を産生する７つの既知の選択的スプライスによるバリアント、タンパク質コード特性を持つ１つの更なるバリアント、およびオープンリーディングフレームの無い３つの非コード転写物がある（The human AMHR2 gene contains 11 exons with seven known alternatively spliced variants producing three known coded proteins, one additional variant with protein coding features, and three non－coding transcripts with no open reading frames.）。成人女性において、５７３アミノ酸長のタンパク質の最も長いヒトタンパク質コード転写物は、通常、卵巣のみで発現され、１２７アミノ酸細胞外ドメイン、２６アミノ酸膜貫通ドメイン、および４０３アミノ酸細胞質ドメインを含む（図１９）。ＡＭＨＲ２シグナル伝達は、雄性発生の間にミュラー管の退行を引き起こし、および成人女性において卵母細胞発生および卵胞生成を調整し、それにより、卵巣予備能力および受精能の実質的な制御を提供する。ＡＭＨＲ２の３つのタンパク質コードアイソフォームのｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０２０５４７．２、ＮＭ＿００１１６４６９０．１およびＮＭ＿００１１６４６９０．１で提供され、これらはそれぞれ、ＮＣＢＩ参照番号、ＮＰ＿０６５４３４．１、ＮＰ＿００１１５８１６２．１およびＮＰ＿００１１５８１６３．１で提供されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。上記ｍＲＮＡおよびタンパク質配列の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0032】
いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドおよび／またはＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸が本明細書において提供される。ＡＭＨＲ２ポリペプチドはＡＭＨＲ２タンパク質、ＡＭＨＲ２－ＥＤ、ＡＭＨＲ２－ＣＤ、および／またはＡＭＨＲ２特異的免疫応答を誘発するのに充分な長さの該ＡＭＨＲ２アミノ酸配列の一部のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。特定の実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドはまた、当該アミノ酸配列に相当しないアミノ酸を含む（例えば、ＡＭＨＲ２アミノ酸配列と非ＡＭＨＲ２タンパク質またはポリペプチドに相当するアミノ酸配列を含む融合タンパク質）。いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドは、ＡＭＨＲ２タンパク質またはそのフラグメントに相当するアミノ酸配列のみを含む。
【0033】
本明細書で提供される方法、組成物およびキットの特定の実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドは、ＡＭＨＲ２タンパク質アミノ酸配列の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該連続するアミノ酸は、ＡＭＨＲ２の細胞質ドメインのアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態において、該連続するアミノ酸は、ＡＭＨＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列と同一である。
【0034】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドはＡＭＨＲ２タンパク質アミノ酸配列の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００個の連続するアミノ酸から本質的になるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、該連続するアミノ酸は、ＡＭＨＲ２の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態において、該連続するアミノ酸はＡＭＨＲ２の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と同一である。
【0035】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、ＡＭＨＲ２ポリペプチドはＡＭＨＲ２タンパク質アミノ酸配列の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、該連続するアミノ酸はＡＭＨＲ２の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態において、該連続するアミノ酸はＡＭＨＲ２の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と同一である。
【0036】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドはＡＭＨＲ２タンパク質中のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、７７％、９８％または９９％の同一性である、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、該アミノ酸配列は、ＡＭＨＲ２タンパク質の細胞質ドメイン中にある。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列は、ＡＭＨＲ２タンパク質の細胞外ドメイン中にある。
【0037】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドはＡＭＨＲ２タンパク質中のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、７７％、９８％または９９％同一性の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００個の連続するアミノ酸から本質的になるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、該アミノ酸配列はＡＭＨＲ２タンパク質の細胞質ドメイン中にある。いくつかの実施形態において、該アミノ酸配列はＡＭＨＲ２タンパク質の細胞外ドメイン中にある。
【0038】
本明細書で提供される方法、組成物およびキットのいくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドはＡＭＨＲ２タンパク質中のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、７７％、９８％または９９％同一性である８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列は、ＡＭＨＲ２タンパク質の細胞質ドメイン中にある。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列は、ＡＭＨＲ２タンパク質の細胞外ドメイン中にある。
【0039】
本明細書で提供される方法、組成物およびキットのいくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドは、ＡＭＨＲ２の細胞外ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない。いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドは、ＡＭＨＲ２の膜貫通ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない。いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドは、ＡＭＨＲ２の細胞質ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない。
【0040】
当業者に周知のように、実質的な配列類似性を有するポリペプチドは、宿主動物において同一または非常に類似の免疫反応を引き起こすことができる。従って、いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２タンパク質の誘導体、同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）、バリアント、フラグメント、または突然変異体またはそれらのフラグメントもまた本明細書で提供される該方法、組成物およびキットに適し得る。
【0041】
いくつかの実施形態において、該ＡＭＨＲ２ポリペプチドのバリエーションまたは誘導体が本明細書で提供される。改変されたポリペプチドは改変された（例えば保存的置換によって）アミノ酸配列を有し得るが、未改変のタンパク質抗原と反応する免疫応答を依然誘発し、機能的同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）と考えられる。本明細書で使用される場合、用語「保存的置換」はを別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を示す。同じ保存的グループ内のアミノ酸は、典型的には、タンパク質の機能に実質的に影響を及ぼすことなく互いに代用することができることは、当技術分野において周知である。特定の実施形態によれば、ＡＭＨＲ２ポリペプチドのリガンド結合ドメインの誘導体、同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）、バリアント、または突然変異体は、該ＡＭＨＲ２タンパク質またはそのフラグメントの少なくとも８５％相同性の配列のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、相同性は少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％である。
【0042】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸（例えばＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子）が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２核酸は、オープンリーディングフレームの発現に必要な調節エレメントを含む。そのような要素は、例えば、プロモーター、開始コドン、停止コドン、およびポリアデニル化シグナルを含むことができる。さらに、エンハンサーを含めることができる。これらのエレメントは、ＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結することができる。
【0043】
プロモーターの例には、これらに限定されないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒトヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えばＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター）、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶ最初期プロモーター）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびにヒト遺伝子（例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネイン）のプロモーターが挙げられる。適切なポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
発現に必要とされる調節エレメントに加えて、他のエレメントもまた核酸分子に含まれ得る。そのような追加要素にはエンハンサーが含まれる。エンハンサーには、上記のプロモーターが含まれる。好ましいエンハンサー／プロモーターには、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびウイルスエンハンサー（例えばＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶ由来のもの）が含まれる。
【0045】
いくつかの実施形態では、核酸は、キャリアまたは送達ベクターに作動可能に組み込まれることができる。有用な送達ベクターには、これらに限定されないが例えば、生分解性マイクロカプセル、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）またはリポソーム、および遺伝子改変された弱毒化生キャリア（例えばウイルスまたは細菌）が挙げられる。
【0046】
いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、鶏痘、ＡＶポックス、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）および他の組換えウイルス）である。例えば、ワクシニアウイルスベクターを、樹状細胞を感染させるために使用することできる。
【0047】
医薬組成物
特定の態様において、本明細書に記載のＡＭＨＲ２ポリペプチドおよび／または本明細書に記載のＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）が提供される。いくつかの実施形態において、該組成物は医薬的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の複数（例えば２つ以上の）のＡＭＨＲ２ポリペプチドまたは核酸の組み合わせを含む。
特定の態様において、本明細書に記載のＡＭＨＲ２ポリペプチドおよび／または本明細書に記載のＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）が提供される。いくつかの実施形態において、該組成物は医薬的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の複数（例えば２つ以上の）のＡＭＨＲ２ポリペプチドまたは核酸の組み合わせを含む。
【0048】
本明細書中に記載される医薬組成物は、以下の投与に適するものを含む、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化され得る：（１）経口投与、例えばドレンチ（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤（例えば、頬側、舌下、および全身性吸収の標的とされるもの）、ボーラス投与、粉末、顆粒、舌への投与のためのペースト；または（２）非経口投与（例えば皮下、筋肉内、静脈内、硬膜外注射による。例えば滅菌溶液もしくは懸濁液、または徐放性製剤として）。
【0049】
これらの製剤または組成物を調製する方法には、本明細書に記載のＡＭＨＲ２ポリペプチドおよび／または核酸を、担体、および適宜１つまたは複数の補助成分と会合させる工程が含まれる。一般に、製剤は、本明細書に記載の薬剤を液体担体または細かく分割した固体担体、またはその両方と均一かつ密接に接触させ、次いで必要に応じて製品を成形することによって調製される。
【0050】
非経口投与に適した医薬組成物は、本明細書に記載のＡＭＨＲ２ポリペプチドおよび／または核酸を、１つまたは複数の医薬的に許容される滅菌等張水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルションと組み合わせて含むか、または糖、アルコール、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質、懸濁化剤、または増粘剤を含有していてもよい、使用直前に滅菌注射用溶液または分散液に再構成され得る滅菌粉末剤と組み合わせて含む。
【0051】
医薬組成物に使用することができうる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【0052】
選択された投与経路にかかわらず、本明細書に提供される薬剤（これは適切な水和形態で使用され得る）および／または本明細書に開示される医薬組成物は、医薬的に許容される剤形に、当該技術分野で知られる従来の方法によって製剤化される。
【0053】
いくつかの実施形態において、記載される医薬組成物は、対象に投与される場合、ＡＭＨＲ２を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することができる。そのような医薬組成物は、卵巣癌の予防的および／または治療的処置のためのワクチン組成物として有用である。
【0054】
いくつかの実施形態において、該医薬組成物は生理学的に許容されるアジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態において、使用されるアジュバントは、医薬組成物の免疫原性の増加をもたらす。アジュバントは、抗原の徐放を提供するものであり得るか（例えば、アジュバントはリポソームであり得る）、またはそれ自体が免疫原性であり、それによって抗原（すなわち、ＡＭＨＲ２ポリペプチド中に存在する抗原）と相乗的に機能するアジュバントであり得る。例えば、アジュバントは、既知のアジュバント、または抗原摂取を促進する、免疫系細胞を投与部位に動員する、または応答するリンパ細胞の免疫活性化を促進する、他の物質であり得る。アジュバントには、これらに限定されないが例えば、免疫調節分子（例えば、サイトカイン）、油および水エマルション、水酸化アルミニウム、グルカン、硫酸デキストラン、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、Ｂａｃｔｏ－アジュバント、合成ポリマー（例えばポリアミノ酸およびアミノ酸の共重合体）、サポニン、パラフィン油、およびムラミルジペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態において、該アジュバントはアジュバント６５、α－ＧａｌＣｅｒ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β－グルカンペプチド、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＰＩ－０１００、ＩＦＡ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、リピドＡ、リポ多糖、リポバント（Ｌｉｐｏｖａｎｔ）、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、クイルＡ（ｑｕｉｌ Ａ）、トレハロースジミコレートまたはザイモサンである。いくつかの実施形態において、アジュバントは１型／１７型混合型免疫応答を誘導するものである。
【0055】
いくつかの実施形態において、アジュバントは免疫調節分子である。例えば、免疫調節分子は、組換えタンパク質サイトカイン、ケモカイン、または免疫刺激剤、またはサイトカイン、ケモカイン、または免疫応答を増強するように設計された免疫刺激剤をコードする核酸であり得る。
【0056】
免疫調節性サイトカインの例として、インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβおよびＩＦＮγ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７およびＩＬ－２０）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＬＴ－３リガンド、ｇＩｐ１０、ＴＣＡ－３、ＭＣＰ－１、ＭＩＦ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ランテス、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ならびに上記いずれかの機能性フラグメントが挙げられる。
【0057】
いくつかの実施形態において、ケモカイン受容体、すなわち、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ、またはＣＸ３Ｃケモカイン受容体に結合する免疫調節性ケモカインもまた、本明細書で提供される組成物に含めることができる。ケモカインの例には、これらに限定されないが例えば、Ｍｉｐ１α、Ｍｉｐ－１β、Ｍｉｐ－３α（Ｌａｒｃ）、Ｍｉｐ－３β、ランテス、Ｈｃｃ－１、Ｍｐｉｆ－１、Ｍｐｉｆ－２、Ｍｃｐ－１、Ｍｃｐ－２、Ｍｃｐ－３、Ｍｃｐ－４、Ｍｃｐ－５、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｔａｒｃ、Ｅｌｃ、Ｉ３０９、ＩＬ－８、Ｇｃｐ－２ Ｇｒｏ－α、Ｇｒｏ－β、Ｇｒｏ－γ、Ｎａｐ－２、Ｅｎａ－７８、Ｇｃｐ－２、Ｉｐ－１０、Ｍｉｇ、Ｉ－Ｔａｃ、Ｓｄｆ－１、およびＢｃａ－１（Ｂｌｃ）、ならびに上記いずれかの機能性フラグメントが挙げられる。
【0058】
特定の実施形態において、本明細書で提供される組成物はまた、または１つ以上の他の薬剤（例えばこれらに限定されないが化学療法剤、免疫療法剤、免疫調節性および／または抗血管新生薬）を含む。
【0059】
いくつかの実施形態において、該１つ以上の薬剤は化学療法剤であることができ、例えば”Cancer Chemotherapeutic Agents”, American Chemical Society, 1995, W. O. Foye Edに記載のような、天然または合成のものであることができる。
【0060】
１つの実施形態において、該化学療法剤は小分子受容体アンタゴニスト（例えばバタラニブ、ＳＵ １１２４８またはＡＺＤ－６４７４）、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２アンタゴニスト（例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＩ－１０３３またはハーセプチン）、抗体（例えばベバシズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ）、ＤＮＡアルキル化剤（例えばシスプラチン、オキサリプラチンまたはカルボプラチン）、アントラサイクリン（例えばドキソルビシンまたはエピルビシン）、代謝拮抗剤（例えば５－ＦＵ、ペメトレキセド、ゲムシタビンまたはカペシタビン）、カンプトテシン（例えばイリノテカンまたはトポテカン、抗癌剤（例えばパクリタキセルまたはドセタキセル）、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシドまたはテニポシド）、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブまたは抗炎症薬（例えばセレコキシブまたはロフェコキシブ）からなる群から選択され、これらは適宜該医薬的に許容される塩の形態、該水和物および／または溶媒和物の形態であってもよく、適宜、その個々の光学異性体の形態であっても、個々のエナンチオマーまたはラセミ体の混合物であっても良い。
【0061】
別の実施形態において、該化学療法剤は、小分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（例えばバタラニブ（ＰＴＫ－７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＳＵ－５４１６、ＳＵ－６６６８、ＳＵ－１１２４８、ＳＵ－１４８１３、ＡＺＤ－６４７４、ＡＺＤ－２１７１、ＣＰ－５４７６３２、ＣＥＰ－７０５５、ＡＧ－０１３７３６、ＩＭ－８４２またはＧＷ－７８６０３４）、二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２アンタゴニスト（例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＩ－１０３３またはＧＷ－２０１６）、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えばイレッサ（ＺＤ－１８３９）、タルセバ（ＯＳＩ－７７４）、ＰＫＩ－１６６、ＥＫＢ－５６９、ＨＫＩ－２７２またはハーセプチン）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト（例えばＢＡＹ－４３－９００６またはＢＡＹ－５７－９００６）、キナゾリン誘導体（例えば４－［（３－クロロ－４－フルオロフェニルアミノ］－６－｛［４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）－１－オキソ－２－ブテン－１－イル］アミノ｝－７－（（Ｓ）－テトラヒドロフラン－３－イルオキシ）キナゾリン（4－[(3－chloro－4－fluorophenypamino]－6－{[4－(N,N－dimethylamino)－1－oxo－2－bute－－ n－1－yl]amino}－7－((S)－tetrahydrofuran－3－yloxy)quinazoline）または４－［（３－クロロ－４－フルオロ－フェニル）アミノ］－６－｛［４－（ホモモルホリン－４－イル）－１－オキソ－２－ブテン－１－イル］アミノ｝－７－［（Ｓ）－（テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ］－キナゾリン（4－[(3－chloro－4－fluoro－phenyl)amino]－6－{[4－(homomorpholin－4－yl)－1－oxo－2－bu－ －ten－1－yl]amino}－7－[(S)－(tetrahydrofuran－3－yl)oxy]－quinazoline）、または医薬的に許容されるそれらの塩）、合成的小分子下に分類されないタンパク質キナーゼ受容体アンタゴニスト（例えばアトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、アバスチン．ＴＭ．（ベバシズマブ）、ＩＭＣ－１Ｃ１１、アービタックス（Ｃ－２２５）、ＤＣ－１０１、ＥＭＤ－７２０００、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、イマチニブ）、融合タンパク質であるタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えばＶＥＧＦｔｒａｐ）、アルキル化剤または白金化合物 例えばメルファラン、シクロホスファミド、オキサザホスホリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、テトラプラチン、イプロプラチン、マイトマイシン、ストレプトゾシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、イホスファミド、ストレプトゾシン、チオテパ、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード（例えばメクロレタミン）、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネート、ダウノルビシン、ドキソルビシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、リポソームのドキソルビシン（ｄｏｘｉｌ）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ダクチノマイシン、ディスタマイシンまたはその誘導体、ネトロプシン、ピベンジモル、マイトマイシン、ＣＣ－１０６５、デュオカルマイシン、ミスラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシン、フタラニリド（ｐｈｔａｌａｎｉｌｉｄｅ）（例えばプロパミジンまたはスチルバミジン）、アントラマイシン、アジリジン、ニトロソウレアまたはその誘導体、ピリミジンまたはプリンアナログまたはヌクレオシドジホスフェートレダクターゼのアンタゴニストまたは阻害剤（例えばシタラビン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ペメトレキセド、テガフール／ウラシル、ウラシルマスタード、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、クラドリビン、チオグアニン、メトトレキサート、ペントスタチン、ヒドロキシ尿素、または葉酸）、フレオマイシン、ブレオマイシンまたはその誘導体または塩、ＣＨＰＰ、ＢＺＰＰ、ＭＴＰＰ、ＢＡＰＰ、リブロマイシン（ｌｉｂｌｏｍｙｃｉｎ）、アクリジンまたはその誘導体、リファマイシン、アクチノマイシン、アドラマイシン（ａｄｒａｍｙｃｉｎ）、カンプトテシン（例えばイリノテカン（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）またはトポテカン）、アムサクリンまたはそのアナログ、三環系カルボキサミド、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばＳＡＨＡ、ＭＤ－２７５、トリコスタチンＡ、ＣＢＨＡ、ＬＡＱ８２４、またはバルプロ酸）、植物由来の抗癌剤（例えばパクリタキセル（ｔａｘｏｌ）、ドセタキセルまたはタキソテール）、ビンカアルカロイド（例えばナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビン）、トロポロンアルカロイド（例えばコルヒチンまたはその誘導体）、マクロライド（例えばマイタンシン、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）またはリゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ））、抗有糸分裂性ペプチド（例えばフォモプシン（ｐｈｏｍｏｐｓｉｎ）またはドラスタチン）、エピポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシンの誘導体（例えばエトポシドまたはテニポシド）、ステガナシン（ｓｔｅｇａｎａｃｉｎ）、抗有糸分裂性カルバメート誘導体（例えばコンブレタスタチンまたはアンフェチニル（ａｍｐｈｅｔｉｎｉｌｅ））、プロカルバジン、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ）、酵素（例えばアスパラギナーゼ、ペグ化アスパラギナーゼ（ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ））またはチミジン－ホスホリラーゼ阻害剤、ゲスターゲンまたはエストロゲン（例えばエストラムスチン（Ｔ－６６）またはメゲストロール）、抗アンドロゲン（例えばフルタミド、カソデックス、アナンドロン（ａｎａｎｄｒｏｎ）またはシプロテロン酢酸エステル）、アロマターゼ阻害剤（例えばアミノグルテチミド（ｇｌｕｔｈｅｔｉｍｉｄｅ）、アナストロゾール、ホルメスタンまたはレトロゾール）、ＧＮｒＨアナログ（例えばリュープロレリン、ブセレリン、ゴセレリンまたはトリプトレリン）、抗エストロゲン（例えばタモキシフェンまたはそのクエン酸塩、ドロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ラロキシフェンまたはジンドロキシフェン（ｚｉｎｄｏｘｉｆｅｎｅ））、１７β－エストラジオールの誘導体（例えばＩＣＩ １６４，３８４またはＩＣＩ １８２，７８０）、アミノグルテチミド、ホルメスタン、ファドロゾール、フィナステリド、ケトコナゾール、ＬＨ－ＲＨアンタゴニスト（例えばリュープロリド）、ステロイド（例えばプレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ブデノシド（ｂｕｄｅｎｏｓｉｄｅ）、フルオコルトロンまたはトリアムシノロン）、インターフェロン（例えばインターフェロンβ）、インターロイキン（例えばＩＬ－１０またはＩＬ－１２）、抗ＴＮＦα抗体（例えばエタネルセプト）、免疫調節薬（例えばサリドマイド、そのＲ－およびＳ－エナンチオマーおよびその誘導体、またはレビニド（ｒｅｖｉｍｉｄ）（ＣＣ－５０１３））、ロイコトリエンアンタゴニスト、マイトマイシンＣ、アジリドキノン（ａｚｉｒｉｄｏｑｕｉｎｏｎｅ）（例えばＢＭＹ－４２３５５、ＡＺＱまたはＥＯ－９）、２－ニトロイミダゾール（例えばミソニダゾール、ＮＬＰ－１またはＮＬＡ－１）、ニトロアクリジン、ニトロキノリン、ニトロピラゾロアクリジン、「二重機能」ニトロ芳香族化合物（例えばＲＳＵ－１０６９またはＲＢ－６１４５）、ＣＢ－１９５４、ナイトロジェンマスタードのＮ－オキシド（例えばナイトロミン）、ナイトロジェンマスタードの金属錯体、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２５抗体、耐性誘導剤、ビホスホネートまたはその誘導体（例えばミノドロン酸またはその誘導体（ＹＭ－５２９、Ｏｎｏ－５９２０、ＹＨ－５２９）、ゾレドロン酸一水和物、イバンドロン酸ナトリウム水和物 またはクロドロン酸二ナトリウム）、ニトロイミダゾール（例えばメトロニダゾール、ミソニダゾール、ベンズニダゾールまたはニモラゾール）、ニトロアリール化合物（例えばＲＳＵ－１０６９）、ニトロキシルまたはＮ－オキシド（例えばＳＲ－４２３３）、ハロゲン化ピリミジンアナログ（例えばブロモデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン）、チオホスフェート（例えばＷＲ－２７２ １）、光化学的活性化薬剤（例えばポルフィマー、フォトフリン、ベンゾポルフィリン誘導体、フェオホルビド（ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ）誘導体、メロシアニン５４０（ＭＣ－５４０）またはスズエチオポルプリン（ｔｉｎ ｅｔｉｏｐｏｒｐｕｒｉｎ））、ａｎｔ－テンプレートまたはアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ（例えばオブリメルセン）、非ステロイド性炎症性薬（例えばアセチルサリチル酸（ａｃｅｔｙｌｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ ａｃｉｄ）、メサラジン、イブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、チアプロフェン酸、フルプロフェン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、ゾメピラック、ナブメトン、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、アルクロフェナク、ブロムフェナク、イブフェナク、アセクロフェナク、アセメタシン、フェンチアザク、クリダナク、エトドラク、オキシピナク（ｏｘｐｉｎａｃ）、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルミニク酸（ｎｉｆｌｕｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、トルフェナム酸、ジフルニサル、フルフェニサール、ピロキシカム、テノキシカム、ロモキシカム（ｌｏｍｏｘｉｃａｍ）、ニメスリド、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、または非ステロイド性炎症性薬の医薬的に許容される塩）、細胞障害性抗菌薬、ガン細胞の表面分子を標的にする抗体（例えばアポリズマブまたは１Ｄ０９Ｃ３）、メタロプロテイナーゼの阻害剤（例えばＴＩＭＰ－１またはＴＩＭＰ－２）、亜鉛、癌遺伝子の阻害剤（例えばＰ５３およびＲｂ）、希土類元素の複合物（例えばランタニドの複素環複合物）、光化学療法剤（例えばＰＵＶＡ）、転写因子複合体ＥＳＸ／ＤＲＩＰ１３０／Ｓｕｒ－２の阻害剤、ＨＥＲ－２発現の阻害剤、（例えば該ヒートショックタンパク質ＨＳＰ９０修飾薬ゲルダナマイシンおよびその誘導体１７－アリルアミノゲルダナマイシンまたは１７－ＡＡＧ）、またはＩＭ－８４２、テトラチオモリブデート、スクアラミン、コンブレスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）Ａ４、ＴＮＰ－４７０、マリマスタット、ネオバスタット（ｎｅｏｖａｓｔａｔ）、ビカルタミド、アバレリックス、オレゴボマブ、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、ＴＬＫ－２８６、アレムツズマブ、イブリツモマブ、テモゾロミド、デニロイキンジフチトクス、アルデスロイキン、ダカルバジン、フロクスウリジン、プリカマイシン、ミトタン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェンおよびテストラクトンから選択される治療薬からなる群から選択される。好ましい化合物として、小分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（例えばバタラニブ（ＰＴＫ－７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＳＵ－５４１６、ＳＵ－６６６８、ＳＵ－１１２４８、ＳＵ－１４８１３、ＡＺＤ－６４７４）、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２アンタゴニスト（例えばＣＩ－１０３３またはＧＷ－２０１６）、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えばイレッサ（ゲフィチニブ、ＺＤ－１８３９）、タルセバ（エルロチニブ、ＯＳＩ－７７４）、ＰＫＩ－１６６、ＥＫＢ－５６９、ＨＫＩ－２７２またはハーセプチン）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト（例えばＢＡＹ－４３－９００６またはＢＡＹ－５７－９００６）、アトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、Ａｖａｓｔｉｎ．ＴＭ．（ベバシズマブ）、ＩＭＣ－１Ｃ１１、アービタックス（Ｃ－２２５）、ＤＣ－１０１、ＥＭＤ－７２０００、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、イマチニブ、アルキル化剤または白金化合物 例えばメルファラン、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、リポソームのドキソルビシン（ｄｏｘｉｌ）、エピルビシン、イダルビシン、ピリミジンまたはプリン
アナログまたはヌクレオシドジホスフェートレダクターゼのアンタゴニストまたは阻害剤（例えばシタラビン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ペメトレキセド、テガフール／ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、メトトレキサート）、抗癌剤（例えばパクリタキセル（ｔａｘｏｌ）またはドセタキセル）、ビンカアルカロイド（例えばナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビン）、抗有糸分裂性ペプチド（例えばドラスタチン）、エピポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシンの誘導体（例えばエトポシドまたはテニポシド）、非ステロイド性炎症性薬（例えばメロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ）、ガン細胞の表面分子を標的にする抗体（例えばアポリズマブまたはＩＤ０９Ｃ３）、またはヒートショックタンパク質ＨＳＰ９０修飾薬ゲルダナマイシンおよびその誘導体１７－アリルアミノゲルダナマイシンまたは１７－ＡＡＧが挙げられる。
アナログまたはヌクレオシドジホスフェートレダクターゼのアンタゴニストまたは阻害剤（例えばシタラビン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ペメトレキセド、テガフール／ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、メトトレキサート）、抗癌剤（例えばパクリタキセル（ｔａｘｏｌ）またはドセタキセル）、ビンカアルカロイド（例えばナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビン）、抗有糸分裂性ペプチド（例えばドラスタチン）、エピポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシンの誘導体（例えばエトポシドまたはテニポシド）、非ステロイド性炎症性薬（例えばメロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ）、ガン細胞の表面分子を標的にする抗体（例えばアポリズマブまたはＩＤ０９Ｃ３）、またはヒートショックタンパク質ＨＳＰ９０修飾薬ゲルダナマイシンおよびその誘導体１７－アリルアミノゲルダナマイシンまたは１７－ＡＡＧが挙げられる。
【0062】
別の実施形態において、化学療法剤はチューブリンと相互作用または結合する化合物、合成的小分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、小分子増殖因子受容体アンタゴニスト、ＥＧＦ受容体および／またはＶＥＧＦ受容体および／またはインテグリン受容体または他のタンパク質チロシンキナーゼ受容体の合成的小分子の下に分類されない阻害剤、ＥＧＦ受容体および／またはＶＥＧＦ受容体および／またはインテグリン受容体または他のタンパク質チロシンキナーゼ受容体を対象とする阻害剤である融合タンパク質、核酸と相互作用し、アルキル化剤または白金化合物として分類される化合物、核酸と相互作用し、アントラサイクリン、ＤＮＡ干渉物質、またはＤＮＡ架橋剤（ＤＮＡ副溝結合化合物を含む）として分類される化合物、代謝拮抗薬、天然、半合成的または合成的ブレオマイシン型抗生物質、ＤＮＡ転写酵素の阻害剤、および特にトポイソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、クロマチン変性剤、有糸分裂阻害剤、有糸分裂阻害薬、細胞周期阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ホルモン阻害剤、ステロイド生合性の阻害剤、ステロイド、サイトカイン、低酸素－選択的細胞毒、サイトカインの阻害剤、リンホカイン、サイトカインに対する抗体、経口および非経口耐性誘導剤、支持的薬物（ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、化学的放射線増感剤およびプロテクター、光化学的活性化薬剤、合成的ポリ－またはオリゴヌクレオチド（適宜改変またはコンジュゲートしている）、非ステロイド性抗炎症、細胞障害性抗菌薬、ガン細胞の表面分子を標的にする抗体、増殖因子またはそれらの受容体を標的にする抗体、メタロプロテイナーゼの阻害剤、金属、癌遺伝子の阻害剤、遺伝子転写またはＲＮＡ翻訳またはタンパク質発現の阻害剤、希土類元素の複合物、および光化学療法剤からなる群から選択される。
【0063】
他の実施形態において、化学療法剤は、パクリタキセル（ｔａｘｏｌ）、ドセタキセル、ビンカアルカロイド（例えばナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビン）、アルキル化剤または白金化合物 例えばメルファラン、シクロホスファミド、オキサザホスホリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、テトラプラチン、イプロプラチン、マイトマイシン、ストレプトゾシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ブスルファン、イホスファミド、ストレプトゾシン、チオテパ、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード（例えばメクロレタミン）、免疫調節薬（例えばサリドマイド、そのＲ－およびＳ－エナンチオマーおよびその誘導体）、またはレビニド（ｒｅｖｉｍｉｄ）（ＣＣ－５０１３））、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネート、ダウノルビシン、ドキソルビシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、リポソームのドキソルビシン（ｄｏｘｉｌ）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ダクチノマイシン、ディスタマイシンまたはその誘導体、ネトロプシン、ピベンジモル、マイトマイシン、ＣＣ－１０６５、デュオカルマイシン、ミスラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシン、フタラニリド（ｐｈｔａｌａｎｉｌｉｄｅ）（例えば プロパミジンまたはスチルバミジン）、アントラマイシン、アジリジン、ニトロソウレアまたはその誘導体、ピリミジンまたはプリンアナログまたはヌクレオシドジホスフェートレダクターゼのアンタゴニストまたは阻害剤（例えばシタラビン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ウラシルマスタード、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、クラドリビン、チオグアニン、メトトレキサート、ペントスタチン、ヒドロキシ尿素、または葉酸）、アクリジンまたはその誘導体、リファマイシン、アクチノマイシン、アドラマイシン（ａｄｒａｍｙｃｉｎ）、カンプトテシン（例えばイリノテカン（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）またはトポテカン）、アムサクリンまたはそのアナログ、三環系カルボキサミド、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えばＳＡＨＡ、ＭＤ－２７５、トリコスタチンＡ、ＣＢＨＡ、ＬＡＱ８２４、またはバルプロ酸）、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ）、小分子ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト（例えばバタラニブ（ＰＴＫ－７８７／ＺＫ２２２５８４）、ＳＵ－５４１６、ＳＵ－６６６８、ＳＵ－１１２４８、ＳＵ－１４８１３、ＡＺＤ－６４７４、ＡＺＤ－２１７１、ＣＰ－５４７６３２、ＣＥＰ－７０５５、ＡＧ－０１３７３６、ＩＭ－８４２またはＧＷ－７８６０３４）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト（例えばＢＡＹ－４３－９００６またはＢＡＹ－５７－９００６）、二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２アンタゴニスト（例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＩ－１０３３またはＧＷ－２０１６）、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えばイレッサ（ＺＤ－１８３９）、タルセバ（ＯＳＩ－７７４）、ＰＫＩ－１６６、ＥＫＢ－５６９、ＨＫＩ－２７２またはハーセプチン）、キナゾリン誘導体（例えば４－［（３－クロロ－４－フルオロフェニル）アミノ］－６－｛［－４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）－１－オキソ－２－ブテン－１－イル］アミノ｝－７－（（Ｓ）－テトラヒドロフラン－３－イルオキシ）－キナゾリン（4－[(3－chloro－4－fluorophenyl)amino]－6－{[－4－(N,N－dimethylamino)－1－oxo－2－but－ －en－1－yl]amino}－7－((S)－tetrahydrofuran－3－yloxy)－quinazoline）または４－［（３－クロロ－４－フルオロ－フェニル）アミノ］－６－｛［４－（ホモモルホリン－４－イル）－１－オキソ－２－ブテン－１－イル］アミノ｝－７－［（Ｓ）－（テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ］－キナゾリン（4－[(3－chloro－4－fluoro－phenyl)amino]－6－{[4－(homomorpholin－4－yl)－1－oxo－2－bu－ －ten－1－yl]amino}－7－[(S)－(tetrahydrofuran－3－yl)oxy]－quinazoline）、またはそれらの医薬的に許容される塩、転写因子複合体ＥＳＸ／ＤＲＩＰ１３０／Ｓｕｒ－２の阻害剤、ＨＥＲ－２発現の阻害剤、例えばヒートショックタンパク質ＨＳＰ９０修飾薬ゲルダナマイシンおよびその誘導体１７－アリルアミノゲルダナマイシンまたは１７－ＡＡＧ、合成的小分子の下に分類されないタンパク質キナーゼ受容体アンタゴニスト 例えばアトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、Ａｖａｓｔｉｎ．ＴＭ．（ベバシズマブ）、ＩＭＣ－１Ｃ１１、アービタックス（Ｃ－２２５）、ＤＣ－１０１、ＥＭＤ－７２０００、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、イマチニブ、およびガン細胞の表面分子を標的にする抗体（例えばアポリズマブまたは１Ｄ０９Ｃ３）からなる群から選択される。
【0064】
いくつかの実施形態において、抗癌剤は免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ４の阻害剤（例えば抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ（ＢＭＳ）、トレメリムマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）および／またはＫＡＨＲ－１０２（Ｋａｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ））））である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１の阻害剤（例えば抗ＰＤ－１抗体（例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ）、ペンブロリズマブ／ランブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）、ピディリズマブ（Ｃｕｒｅｔｅｃｈ）、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ）、ＡＭＰ－５１４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＳＴＩ－Ａ１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）および／またはＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ））である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２の阻害剤（例えば抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＰＤ－Ｌ２抗体（例えば、ＲＧ－７４４６（Ｒｏｃｈｅ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＢＭＳ）、ＭＥＤＩ－４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＭＳＢ－００２０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ）、ＡＵＲ－０１２（Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ Ｍｅｄ）、ＳＴＩ－Ａ１０１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）））である。
【0065】
いくつかの実施形態において、該組成物は本明細書に記載のＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸（例えばＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子）を含む。いくつかの実施形態において該組成物は、ＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む発現ベクターを含む。
【0066】
細胞（例えば、筋肉細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状細胞、マクロファージ、ｅｔｃ．））によってって取り込まれると、ＤＮＡ分子は染色体外分子として細胞内に存在することができ、かつ／または、染色体に組み込むことができる。ＤＮＡは、別の遺伝物質として残ることができるプラスミドの形態で細胞に導入することができる。あるいは、染色体に組み込むことができる直鎖状ＤＮＡを細胞に導入することができる。ＤＮＡを細胞に導入する場合、適宜、ＤＮＡと染色体との統合を促進する試薬を添加することができる。
【0067】
治療法
特定の態様において、卵巣癌を治療または予防する方法、および／または卵巣癌腫瘍またはＡＭＨＲ２に対する免疫応答を誘導する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、卵巣癌腫瘍は原発性腫瘍である。いくつかの実施形態では、該卵巣癌腫瘍は転移性腫瘍である。いくつかの実施形態では、該卵巣癌腫瘍は、卵巣上皮癌（ＥＯＣ）腫瘍である。いくつかの実施形態では、該卵巣癌腫瘍はＡＭＨＲ２を発現する。
特定の態様において、卵巣癌を治療または予防する方法、および／または卵巣癌腫瘍またはＡＭＨＲ２に対する免疫応答を誘導する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、卵巣癌腫瘍は原発性腫瘍である。いくつかの実施形態では、該卵巣癌腫瘍は転移性腫瘍である。いくつかの実施形態では、該卵巣癌腫瘍は、卵巣上皮癌（ＥＯＣ）腫瘍である。いくつかの実施形態では、該卵巣癌腫瘍はＡＭＨＲ２を発現する。
【0068】
本明細書に記載の方法を使用して、その必要がある対象を治療することができる。本明細書中で使用される場合、「その必要がある対象」は、卵巣癌を有している、卵巣癌を有していた、および/または卵巣癌の素因を有する対象を含む。例えば、いくつかの実施形態において、対象は、卵巣癌腫瘍（例えば、ＡＭＨＲ２を発現する卵巣癌腫瘍）を有する。いくつかの実施形態では、対象は、卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を除去するための手術を受けたことがある。いくつかの実施形態において、対象は、ゲノム中に対象を卵巣癌になりやすくするＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２変異を有しているため、卵巣癌になりやすい素因を持っている。いくつかの実施形態において、対象は、卵巣癌の家族歴を有する。
【0069】
本明細書に開示される医薬組成物は、経口および非経口を含む、任意の適切な投与経路によって送達され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、一般的な方法で（例えば、経口または非経口投与によって）送達される。
【0070】
対象薬剤の用量は、薬剤の血漿濃度を参照して決定され得る。例えば、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）および時間０から無限大までの血漿濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ（０－４））を用いることができる。用量には、ＣｍａｘおよびＡＵＣ（０－４）の上記の値を生じるもの、およびこれらのパラメーターのより大きいまたはより小さい値をもたらす他の用量が含まれる。
【0071】
該医薬組成物における有効成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性無く、特定の患者、組成および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な量の有効成分を与えるように変化させうる。
【0072】
選択された投与量レベルは、使用される特定の薬剤の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄または代謝速度、治療期間、使用される特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態および以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の要因のような、さまざまな要因に依存する。
【0073】
当該技術分野の通常のスキルを有する医師または獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルより低いレベルで医薬組成物に用いられる薬剤の用量を処方および／または投与し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることができるであろう。
【0074】
一般に、本明細書に記載の薬剤の適切な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である薬剤の量であろう。そのような有効用量は、一般に上記の因子に依存する。
【0075】
一態様では、ＡＭＨＲ２を発現する細胞（例えば、卵巣癌腫瘍細胞）に対する免疫応答を対象において誘発する方法が本明細書で提供される。本方法は、本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、該医薬的に許容される組成物は、対象に投与されるとき、ＡＭＨＲ２を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する。
【0076】
一般に、該免疫応答は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはその両方を含み得る。
【0077】
体液性応答は、該医薬組成物を投与された対象由来の血清試料中の抗体レベルについての標準的なイムノアッセイによって測定することができる。細胞性免疫応答は、Ｔ細胞を伴う応答であり、インビトロまたはインビボで測定することができる。例えば、一般的な細胞性免疫応答は、医薬的に許容される組成物の投与後適切な時間に対象から採取された細胞（例えば、末梢血白血球（ＰＢＬ））におけるＴ細胞増殖活性として測定されることができる。例えばＰＢＭＣを適切な期間、刺激因子と共にインキュベートした後、［３Ｈ］チミジン取り込みを測定することができる。増殖しているＴ細胞のサブセットは、フローサイトメトリーを用いて測定することができる。
【0078】
特定の態様では、本明細書で提供される方法は、ヒトおよび非ヒト哺乳類の両方に投与することを含む。獣医学的用途も考えられる。いくつかの実施形態では、対象は、免疫応答が誘発され得る任意の生きたメス生物であり得る。対象の例としては、ヒト、家畜、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられるが、これらに限定されない。
【0079】
特定の実施形態において、対象は、卵巣癌の病歴を有し、別の治療様式を投与されたことがある。該別の治療は、例えば、外科的切除、放射線療法、化学療法、および免疫療法の他の様式であって、当該他の療法の結果として対象が臨床的に測定可能な腫瘍を示さないものを含み得る。しかしながら、対象は、元の腫瘍部位の近くに、または転移によって、癌の再発または進行のリスクがあると決定されたものであることができる。そのような対象は、高リスクおよび低リスクの対象としてさらに分類することができる。細分化は、最初の治療の前後に観察される特徴に基づいて行うことができる。これらの特徴は、臨床分野において知られており、異なる癌ごとに適宜定義される。高リスクサブグループの典型的な特徴は、腫瘍が隣接組織に浸潤したか、またはリンパ節の関与を示すものである。従って、例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、主に再発に対する予防措置として抗癌応答を誘発するために対象に投与することができる。
【0080】
いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、適切な任意の時間に投与することができる。例えば、投与は、卵巣癌腫瘍を有する対象の従来の治療の前またはその間に実施することができ、腫瘍が臨床的に検出不能になった後も継続されることができる。投与はまた、再発の徴候を示す対象においても継続することができる。
【0081】
いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、治療上または予防上有効な量で投与されることができる。対象への該医薬組成物の投与は、既知の手順を用いて、所望の効果を達成するのに十分な用量および期間で行うことができる。
【0082】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、任意の適切な部位、例えば、原発性腫瘍に対して遠位または近位である部位で、対象に投与されることができる。投与経路は、治療されている腫瘍性疾患およびを患者の状態を考慮して、非経口、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、静脈内（留置カテーテルを含む）、求心性リンパ管を介して、または適切な他の経路によるものであることができる。好ましくは、用量は、所望の応答（腫瘍性疾患および／またはそれに関連する症状の免疫応答または予防的もしくは治療的処置を誘発する）をもたらすのに有効な量および時間で投与される。
【0083】
医薬的に許容される組成物は、対象において免疫応答を誘発する療法を含む他の療法に続いて、前に、または同時に投与することができる。例えば、対象は、化学療法、放射線療法、および他の免疫療法の製剤、好ましくは、本明細書に記載の組成物の免疫原性を妨げないような方法で提供される他の療法によって、その前にまたは同時に治療されてもよい。
【0084】
投与は、ケア提供者（例えば、医師、獣医師）によって適切にタイミングをとられることができ、対象の臨床状態、投与の目的、および／または考慮または投与されている他の療法に依存しうる。いくつかの実施形態では、初期量を投与し、対象は免疫学的および／または臨床的応答についてモニタリングされることができる。免疫学的モニタリングの適切な手段には、応答者としての患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）および刺激因子としての腫瘍性細胞を用いることが含まれる。免疫学的反応はまた、投与部位での炎症応答の遅延によっても測定され得る。所望の効果が達成されるまで、典型的には、月に１回、２回、または好ましくは１週間に１回、初期投与量に続く１回または複数回の投与量を適宜与えることができる。その後、必要に応じて、特に免疫学的または臨床的利益が低下しているように見える場合に、さらなるブースターまたは維持用量を与えることができる。
【0085】
細胞療法
特定の態様では、本明細書に記載のＡＭＨＲ２ポリペプチドまたは当該ＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸は、ＡＭＨＲ２で刺激された抗原提示細胞および／またはこれらの抗原提示細胞で産生されたＡＭＨＲ２特異的リンパ球を提供するための組成物および方法において使用されることができる。いくつかの実施形態において、このような抗原提示細胞および／またはリンパ球は、卵巣癌の治療または予防に使用される。
特定の態様では、本明細書に記載のＡＭＨＲ２ポリペプチドまたは当該ＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸は、ＡＭＨＲ２で刺激された抗原提示細胞および／またはこれらの抗原提示細胞で産生されたＡＭＨＲ２特異的リンパ球を提供するための組成物および方法において使用されることができる。いくつかの実施形態において、このような抗原提示細胞および／またはリンパ球は、卵巣癌の治療または予防に使用される。
【0086】
いくつかの態様では、抗原提示細胞を本明細書に記載のＡＭＨＲ２ポリペプチドまたは少なくとも１つのＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸と、少なくとも１つのＡＭＨＲ２ポリペプチドが抗原提示細胞によって提示されるのに十分な条件下、インビトロで接触させることによる、ＡＭＨＲ２で刺激された抗原提示細胞を作製するための方法が提供される。
【0087】
いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチド、またはＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸は、抗原提示細胞を含む同種な、実質的に同種な、または異種の組成物と接触させることができる。例えば、該組成物には、これらに限定されないが、全血、新鮮血、またはその画分、例えばこれらに限定されないが、末梢血単核細胞、全血のバフィーコート画分、濃厚赤血球、放射線照射血液、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、およびナチュラルキラーＴ細胞が含まれる。任意に抗原提示細胞の前駆体が使用される場合、該前駆体を抗原提示細胞に分化させるのに十分な適切な培養条件下で前駆体を培養されることができる。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞（またはその前駆体）は、単球、マクロファージ、骨髄系細胞系の細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、またはランゲルハンス細胞から選択される。
【0088】
抗原提示細胞と接触して配置されるＡＭＨＲ２ポリペプチドまたはＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸の量は、通常の実験によって当業者によって決定されることができる。一般に、抗原提示細胞は、細胞がＴ細胞の調節のための抗原のプロセシングされた形態を提示するのに十分な時間、ＡＭＨＲ２ポリペプチドまたはＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸と接触される。一実施形態では、抗原提示細胞を、ＡＭＨＲ２ポリペプチドまたはＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸の存在下、約１週間未満、例示的には１分～約４８時間、約２分～約３６時間、約３分～約２４時間、約４分～約１２時間、約６分～約８時間、約８分～約６時間、約１０分～約５時間、約１５分～約４時間、約２０分～約３時間、約３０分～約２時間、および約４０分～約１時間インキュベートする。抗原提示細胞が抗原を処理して提示するのに必要な時間およびＡＭＨＲ２ポリペプチドまたはＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸の量は、例えば、パルスチェイス法を用いて決定することができる。ここでは接触後にウォッシュアウト時間と読み取りシステム、例えば、抗原反応性Ｔ細胞への曝露が続く。
【0089】
特定の実施形態では、抗原提示細胞の内在性プロセシング経路に抗原を送達するための任意の適切な方法を使用することができる。そのような方法には、これらに限定されないが、ｐＨ感受性リポソーム、アジュバントへの抗原のカップリング、アポトーシス性細胞送達、樹状細胞上への細胞のパルスシング、抗原を含む組換えキメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）の樹状細胞株のＭＨＣクラスＩプロセッシングの経路への送達を伴う方法が挙げられる。
【0090】
一実施形態では、可溶化ＡＭＨＲ２ポリペプチドが、抗原提示細胞とインキュベートされる。いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ経路への送達のための抗原提示細胞のサイトゾルへの抗原の移動を増強するために細胞溶解素に結合され得る。細胞溶解素の例には、サポニン化合物（例えばサポニン含有免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ５））、孔形成毒素（例えばα－毒素）、およびグラム陽性菌の天然細胞溶解素（例えばリステリオリジンＯ（ＬＬＯ）、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）、およびパーフリンゴリジンＯ（ＰＦＯ）が挙げられる。
【0091】
いくつかの実施形態において、ＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸を抗原提示細胞に導入するために、抗原提示細胞（例えば樹状細胞およびマクロファージ）は当技術分野で公知の方法に従って単離されて、当技術分野で公知の方法によってポリヌクレオチドによりトランスフェクトされることができる。トランスフェクション試薬および方法は、当該分野で公知であり、市販されている。例えば、ＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードするＲＮＡを、適切な培地中に提供し、抗原提示細胞と接触させる前に脂質（例えば、カチオン性脂質）と組み合わせられることができる。そのような脂質の非限定的な例としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭが挙げられる。次いで、得られたポリヌクレオチド－脂質複合体を抗原提示細胞と接触させることができる。あるいは、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウムトランスフェクションのような技術を用いて、ポリヌクレオチドを抗原提示細胞に導入することができる。次いで、ポリヌクレオチド積載抗原提示細胞を使用して、インビボまたはエクスビボでのＴリンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）増殖を刺激することができる。１つの実施形態において、エクスビボで増大されたＴリンパ球は、養子免疫療法の方法で対象に投与される。
【0092】
特定の態様において、ＡＭＨＲ２エピトープが抗原提示細胞によって提示されるのに十分な条件下で、インビトロでＡＭＨＲ２ポリペプチドまたはＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸と接触された抗原提示細胞を含む組成物が本明細書に提供される。
【0093】
いくつかの態様では、ＡＭＨＲ２に特異的なリンパ球を調製するための方法が提供される。この方法は、ＡＭＨＲ２を発現する細胞に対して免疫応答を誘発することができるＡＭＨＲ２特異的リンパ球を産生するのに十分な条件下で、リンパ球を上述の抗原提示細胞と接触させることを含む。したがって、抗原提示細胞はまた、ＡＭＨＲ２を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するためのリンパ球（Ｔリンパ球およびＢリンパ球を含む）を提供するために使用され得る。
【0094】
いくつかの実施形態では、抗原提示細胞によって提示されるＡＭＨＲ２エピトープにＴリンパ球をプライミングするために、Ｔリンパ球の調製物を上記の抗原提示細胞と一定時間（例えば、少なくとも約２４時間）接触させる。
【0095】
いくつかの実施形態では、抗原提示細胞の集団を、ＡＭＨＲ２ポリペプチドまたはＡＭＨＲ２ポリペプチドをコードする核酸とともに末梢血Ｔリンパ球の異種集団と共培養することができる。該細胞はＡＭＨＲ２ポリペプチドに含まれるＡＭＨＲ２エピトープが抗原提示細胞によって提示されかつ抗原提示細胞がＡＭＨＲ２を発現する細胞に応答するためのＴリンパ球の集団を刺激するのに十分な時間および条件下で共培養されることができる。特定の実施形態では、ＡＭＨＲ２を発現する細胞に応答するために刺激されたＴリンパ球およびＢリンパ球が提供される。
【0096】
Ｔリンパ球は、任意の適切な供給源（例えば末梢血、脾臓、およびリンパ節）から得ることができる。Ｔリンパ球は、粗製調製物として、または部分的に精製されたまたは実質的に精製された調製物として使用することができ、標準的な方法、これらに限定されないが例えば、抗体を用いる免疫磁気またはフローサイトメトリー法を伴う方法によって得ることができる。
【0097】
特定の態様において、上記の抗原提示細胞またはリンパ球ならびに医薬的に許容される担体および／または希釈剤を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。いくつかの実施形態では、該組成物は、上記のようなアジュバントをさらに含む。
【0098】
特定の態様において、ＡＭＨＲ２を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するための方法であって、免疫応答を誘発するのに十分な有効量で上記の抗原提示細胞またはリンパ球を対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、有効量の上記抗原提示細胞またはリンパ球を対象に投与することを含む、卵巣癌の治療または予防のための方法が提供される。一実施形態において、該抗原提示細胞またはリンパ球は、全身的に、好ましくは注射によって投与される。あるいは、例えば、組織（例えば、卵巣癌腫瘍の近位の組織、例えば卵巣組織）に、好ましくはデポー製剤または徐放性製剤中で、直接注射することにより、全身というよりむしろ局所的に投与されることができる。
【0099】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原刺激抗原提示細胞およびこれらの抗原提示細胞により作製された抗原特異的Ｔリンパ球は、卵巣癌の予防的または治療的処置のための免疫調節組成物中の活性化合物として使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＭＨＲ２刺激抗原提示細胞は、対象への養子移入のためのＣＤ８＋Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、および／またはＢリンパ球を生成するために使用され得る。したがって、例えば、ＡＭＨＲ２特異的リンパ球は、卵巣癌に罹患した対象において治療目的のために養子移入されることができる。
【0100】
特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗原提示細胞および／またはリンパ球は、免疫応答を誘発するために、特に、ＡＭＨＲ２を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するために、単独でまたは組み合わせて対象に投与されることができる。いくつかの実施形態では、該抗原提示細胞および／またはリンパ球は、対象由来（すなわち、自己細胞）または対象とＭＨＣ適合または不適合である（例えば、アロジェネイック）異なる対象由来であり得る。
【0101】
該抗原提示細胞およびリンパ球の単回または複数回の投与は、ケア提供者（例えば、医師）によって選択される細胞数および処置で実施されることができる。いくつかの実施形態において、該抗原提示細胞および／またはリンパ球は医薬的に許容される担体中で投与される。適切な担体は、細胞を増殖させた増殖培地、またはリン酸緩衝食塩水のような任意の適切な緩衝化培地であり得る。該細胞は、単独で、または他の治療剤と併用して補助治療として投与されることができる。
【実施例0102】
実験操作
【0103】
組換えマウスＡＭＨＲ２ポリペプチドの生成
８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの卵巣からトータルｍＲＮＡを抽出した。ＡＭＨＲ２配列１－１４０または１７０－５６８を増幅するように設計されたプライマー対を使用して、ＲＴ－ＰＣＲによってマウスＡＭＨＲ２の１４０アミノ酸細胞外ドメイン全体または３９９アミノ酸細胞質ドメイン全体のいずれかをコードするｃＤＮＡを生成した。タンパク質フォールディングを最適化し、全収率を高めるために、天然のコドン配列の置換（Ｄａｐｃｅｌ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を行い、当該最適化したｃＤＮＡをｐＥＴ－３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部位に挿入し、Ｃ末端６×Ｈｉｓ標識組換えタンパク質を得た（図１Ａおよび１０Ａ）。大腸菌を、これらの挿入断片を含むプラスミドで形質転換した。高レベルの発現コロニーを、イソプロピルチオガラクトピロニダーゼ（ＩＰＴＧ；Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ ＯＨ）による誘導後に選択し、適切な配向および整列を確認するために配列決定した。６ｘＨｉｓ標識ＡＭＨＲ２ポリペプチドを、ニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）アフィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて変性条件下で精製した。精製したＡＭＨＲ２ポリペプチドを変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で電気泳動し、免疫ブロットＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上にブロットした。ＡＭＨＲ２ポリペプチドの免疫検出は、ＨＲＰ結合Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた増強化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて行った。使用前に、６ｘＨｉｓ標識ＡＭＨＲ２ポリペプチドを逆相ＨＰＬＣによって精製し、エンドトキシンフリータンパク質を得た。エンドトキシンのレベルは、組換えタンパク質１ｍｇあたり＜０．０５エンドトキシン単位（＜５ｐｇ）であった。
８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの卵巣からトータルｍＲＮＡを抽出した。ＡＭＨＲ２配列１－１４０または１７０－５６８を増幅するように設計されたプライマー対を使用して、ＲＴ－ＰＣＲによってマウスＡＭＨＲ２の１４０アミノ酸細胞外ドメイン全体または３９９アミノ酸細胞質ドメイン全体のいずれかをコードするｃＤＮＡを生成した。タンパク質フォールディングを最適化し、全収率を高めるために、天然のコドン配列の置換（Ｄａｐｃｅｌ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を行い、当該最適化したｃＤＮＡをｐＥＴ－３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ部位に挿入し、Ｃ末端６×Ｈｉｓ標識組換えタンパク質を得た（図１Ａおよび１０Ａ）。大腸菌を、これらの挿入断片を含むプラスミドで形質転換した。高レベルの発現コロニーを、イソプロピルチオガラクトピロニダーゼ（ＩＰＴＧ；Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ ＯＨ）による誘導後に選択し、適切な配向および整列を確認するために配列決定した。６ｘＨｉｓ標識ＡＭＨＲ２ポリペプチドを、ニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）アフィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて変性条件下で精製した。精製したＡＭＨＲ２ポリペプチドを変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で電気泳動し、免疫ブロットＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上にブロットした。ＡＭＨＲ２ポリペプチドの免疫検出は、ＨＲＰ結合Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた増強化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて行った。使用前に、６ｘＨｉｓ標識ＡＭＨＲ２ポリペプチドを逆相ＨＰＬＣによって精製し、エンドトキシンフリータンパク質を得た。エンドトキシンのレベルは、組換えタンパク質１ｍｇあたり＜０．０５エンドトキシン単位（＜５ｐｇ）であった。
【0104】
マウスと免疫
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＩＤ８腫瘍のレシピエントとして使用した。マウスを６週齢で商業的に入手し（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）、７－１０週齢で、等量の水と４００μｇのマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）のエマルション２００μＬ中に含まれる組換えマウスＡＭＨＲ２－ＣＤまたはＡＭＨＲ２－ＥＤ１００μｇを、側腹部に皮下注射することにより免疫した。ＴｇＭｌＳＩＩＲ－ＴＡｇ（ＤＲ２６ ｌｉｎｅ）トランスジェニックマウスは雄のＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（Ｈ－２ｂ）マウスを雌の野生型同系Ｃ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と交配させることによって維持された。ＴｇＭｌＳＩＩＲ－ＴＡｇマウスを、６～７週齢で、上記のようにＣＦＡ中の組換えマウスＡＭＨＲ２－ＣＤまたはＡＭＨＲ２－ＥＤ１００μｇで免疫化した。妊孕性表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を決定するために、年齢適合試験および対照ワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを同じＣ５７ＢＬ／６雄と交配させた。
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＩＤ８腫瘍のレシピエントとして使用した。マウスを６週齢で商業的に入手し（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）、７－１０週齢で、等量の水と４００μｇのマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）のエマルション２００μＬ中に含まれる組換えマウスＡＭＨＲ２－ＣＤまたはＡＭＨＲ２－ＥＤ１００μｇを、側腹部に皮下注射することにより免疫した。ＴｇＭｌＳＩＩＲ－ＴＡｇ（ＤＲ２６ ｌｉｎｅ）トランスジェニックマウスは雄のＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（Ｈ－２ｂ）マウスを雌の野生型同系Ｃ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と交配させることによって維持された。ＴｇＭｌＳＩＩＲ－ＴＡｇマウスを、６～７週齢で、上記のようにＣＦＡ中の組換えマウスＡＭＨＲ２－ＣＤまたはＡＭＨＲ２－ＥＤ１００μｇで免疫化した。妊孕性表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を決定するために、年齢適合試験および対照ワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを同じＣ５７ＢＬ／６雄と交配させた。
【0105】
腫瘍接種および測定
ＩＤ８細胞を７５または２２５ｃｍ２組織培養フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中、４％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、およびインスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム培地補充物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＤＭＥＭ（Mediatech Cellgro, Manassas, VA）中で、該細胞が７０－８０％コンフルエントになるまで培養した。トリプシン処理により細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。メスＣ５７ＢＬ／６マウスに、５ｘ１０６個のＩＤ８細胞を左背側腹部に皮下接種した。ＩＤ８腫瘍の増殖は、長さｘ幅を測定するためにバーニアキャリパーを用いて定期的に評価した。腫瘍増殖のエンドポイントは、１７ｍｍの任意の方向の測定によって決定した。
ＩＤ８細胞を７５または２２５ｃｍ２組織培養フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中、４％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、およびインスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム培地補充物（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＤＭＥＭ（Mediatech Cellgro, Manassas, VA）中で、該細胞が７０－８０％コンフルエントになるまで培養した。トリプシン処理により細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。メスＣ５７ＢＬ／６マウスに、５ｘ１０６個のＩＤ８細胞を左背側腹部に皮下接種した。ＩＤ８腫瘍の増殖は、長さｘ幅を測定するためにバーニアキャリパーを用いて定期的に評価した。腫瘍増殖のエンドポイントは、１７ｍｍの任意の方向の測定によって決定した。
【0106】
自然発症卵巣腫瘍のインビボイメージングおよび測定。
雌トランスジェニックマウスにおける両側卵巣腫瘍増殖を、小動物用のＶｅｖｏ７７０高分解能ｉｎ ｖｉｖｏマイクロイメージングシステム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて超音波により毎月測定した。腹部から毛を除去した後、ＲＭＶ７０４低周波プローブ／スキャンヘッドおよび水性導電性ゲルを用いて、腹部のリアルタイムイメージングを行った。３０分間未満の画像取得時間中、１～２％ｖｏｌ／ｖｏｌイソフルランの連続流を有するノーズコーンを用いて固定のための麻酔を施し、酸素供給を連続的に維持した。プローブ／スキャンヘッドを、水性導電性ゲルを塗布した後、腹部を非常に穏やかに移動させた。腫瘍領域の測定および計算を、関心設定の多角形領域（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）を用いて、インビボでの卵巣腫瘍サイズの２－Ｄ評価を可能にするＶｅｖｏソフトウェアＢモード測定ツールを用いて行った。Ｂモード超音波検査による固形腫瘍の測定は組織病理学的測定と良好に相関することが示されている。
雌トランスジェニックマウスにおける両側卵巣腫瘍増殖を、小動物用のＶｅｖｏ７７０高分解能ｉｎ ｖｉｖｏマイクロイメージングシステム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）を用いて超音波により毎月測定した。腹部から毛を除去した後、ＲＭＶ７０４低周波プローブ／スキャンヘッドおよび水性導電性ゲルを用いて、腹部のリアルタイムイメージングを行った。３０分間未満の画像取得時間中、１～２％ｖｏｌ／ｖｏｌイソフルランの連続流を有するノーズコーンを用いて固定のための麻酔を施し、酸素供給を連続的に維持した。プローブ／スキャンヘッドを、水性導電性ゲルを塗布した後、腹部を非常に穏やかに移動させた。腫瘍領域の測定および計算を、関心設定の多角形領域（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）を用いて、インビボでの卵巣腫瘍サイズの２－Ｄ評価を可能にするＶｅｖｏソフトウェアＢモード測定ツールを用いて行った。Ｂモード超音波検査による固形腫瘍の測定は組織病理学的測定と良好に相関することが示されている。
【0107】
ＲＴ－ＰＣＲ
組織を切除し、ＲＮＡ－Ｌａｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）で凍結保存した。ＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でのホモジナイゼーションによって各組織から抽出するか、または市販品を購入した（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ；ＩＬＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｃｈｅｓｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＤ）。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてバルクＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。遺伝子特異的プライマー（テーブル１）を用いてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてｑＲＴ－ＰＣＲにより遺伝子発現を定量した。相対的遺伝子発現は、個々の組織におけるβ－アクチン発現レベルに対する各試験遺伝子発現レベルの標準化によって評価した。遺伝子発現は、ＡＭＨＲ２特異的プライマーおよびβアクチン特異的プライマー（テーブル１）を用いたＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＲＴ－ＰＣＲによって決定した。３０サイクルの増幅後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル（１ＴＢＥ緩衝液中２％）で分離し、臭化エチジウムで染色した後に紫外線下で可視化した。ＴｇＭｌＳＩＩＲ－ＴＡｇマウスの子孫における導入遺伝子発現は、先に記載したようなプライマー対（テーブル１）を用いたＳＶ４０－ＴＡｇの７７３ｂｐフラグメントのＰＣＲ増幅によって決定した。マウスＡＭＨＲ２の細胞外ドメインの全１４０アミノ酸配列のＤＮＡを、ＡＭＨＲ２特異的プライマー対（テーブル１）を用いてマウス卵巣組織からＲＴ－ＰＣＲにより増幅した。
組織を切除し、ＲＮＡ－Ｌａｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）で凍結保存した。ＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でのホモジナイゼーションによって各組織から抽出するか、または市販品を購入した（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ；ＩＬＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｃｈｅｓｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＤ）。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてバルクＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。遺伝子特異的プライマー（テーブル１）を用いてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてｑＲＴ－ＰＣＲにより遺伝子発現を定量した。相対的遺伝子発現は、個々の組織におけるβ－アクチン発現レベルに対する各試験遺伝子発現レベルの標準化によって評価した。遺伝子発現は、ＡＭＨＲ２特異的プライマーおよびβアクチン特異的プライマー（テーブル１）を用いたＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＲＴ－ＰＣＲによって決定した。３０サイクルの増幅後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル（１ＴＢＥ緩衝液中２％）で分離し、臭化エチジウムで染色した後に紫外線下で可視化した。ＴｇＭｌＳＩＩＲ－ＴＡｇマウスの子孫における導入遺伝子発現は、先に記載したようなプライマー対（テーブル１）を用いたＳＶ４０－ＴＡｇの７７３ｂｐフラグメントのＰＣＲ増幅によって決定した。マウスＡＭＨＲ２の細胞外ドメインの全１４０アミノ酸配列のＤＮＡを、ＡＭＨＲ２特異的プライマー対（テーブル１）を用いてマウス卵巣組織からＲＴ－ＰＣＲにより増幅した。
【0108】
テーブル１． クローニング、ｑＲＴ－ＰＣＲ、トランスジーンの検出、およびＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＲＴ－ＰＣＲに使用されるプライマー対
【表1】
【0109】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のフローサイトメトリー分析
５０ＫＵのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＨＢＳＳ中３７℃で３０分間、刻んだ腫瘍を消化し、続いて不連続勾配遠心分離によってＴＩＬをＩＤ８腫瘍から単離した。当該部分的に精製されたＴＩＬを、０．５％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中、ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ受容体抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理し、ＦＩＴＣ結合抗マウスＣＤ３とＰＥ結合抗マウスＣＤ４またはＰＥ結合抗マウスＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の一方でニ重染色した。ＣＤ３＋Ｔ細胞集団をゲーティングし、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージについて分析した。３０，０００の総イベントで収集されたデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
５０ＫＵのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＨＢＳＳ中３７℃で３０分間、刻んだ腫瘍を消化し、続いて不連続勾配遠心分離によってＴＩＬをＩＤ８腫瘍から単離した。当該部分的に精製されたＴＩＬを、０．５％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中、ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ受容体抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理し、ＦＩＴＣ結合抗マウスＣＤ３とＰＥ結合抗マウスＣＤ４またはＰＥ結合抗マウスＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の一方でニ重染色した。ＣＤ３＋Ｔ細胞集団をゲーティングし、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージについて分析した。３０，０００の総イベントで収集されたデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【0110】
腫瘍免疫の受動移入
ＡＭＨＲ２ポリペプチドまたはコントロール免疫原（オボアルブミン；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたメスＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫の１０日後、５ｘ１０６細胞／ｍｌのＬＮＣを、ＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１８（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）の存在下、２４ウェル平底Ｆａｌｃｏｎプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、上記のように補充したＤＭＥＭ中、総量２．０ ｍｌ／ウェルで、２０μｇ／ｍｌの免疫原でｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化した。再刺激の３日後、２×１０７個の活性化全ＬＮＣを、亜致死的にγ照射された（５Ｇｙ）ナイーブメスレシピエントに腹腔内注射した。あるいは、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスをＡＭＨＲ２ポリペプチドまたはＯＶＡのいずれかで免疫化し、４週間後、上記のように免疫原、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１８で再活性化された７．５ｘ１０７全脾細胞、磁気ビーズ分離で全脾細胞から精製され同様に再活性化された２ｘ１０７のＣＤ４＋Ｔ細胞、および
磁気ビーズ分離で全脾細胞から精製された２ｘ１０７の非再活性化Ｂ２２０＋Ｂ細胞を含む、３グループの細胞を亜致死的にγ照射された（５Ｇｙ）ナイーブメスレシピエントに腹腔内注射した。すべての場合において、細胞移入の翌日に５ｘ１０６個のＩＤ８細胞を宿主に皮下接種し、腫瘍増殖を上記のように定期的に評価した。濃縮された細胞の純度は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリー分析によって決定され、一貫して＞９０％であった。
ＡＭＨＲ２ポリペプチドまたはコントロール免疫原（オボアルブミン；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたメスＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫の１０日後、５ｘ１０６細胞／ｍｌのＬＮＣを、ＩＬ－１２（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－１８（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）の存在下、２４ウェル平底Ｆａｌｃｏｎプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、上記のように補充したＤＭＥＭ中、総量２．０ ｍｌ／ウェルで、２０μｇ／ｍｌの免疫原でｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化した。再刺激の３日後、２×１０７個の活性化全ＬＮＣを、亜致死的にγ照射された（５Ｇｙ）ナイーブメスレシピエントに腹腔内注射した。あるいは、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスをＡＭＨＲ２ポリペプチドまたはＯＶＡのいずれかで免疫化し、４週間後、上記のように免疫原、ＩＬ－１２、およびＩＬ－１８で再活性化された７．５ｘ１０７全脾細胞、磁気ビーズ分離で全脾細胞から精製され同様に再活性化された２ｘ１０７のＣＤ４＋Ｔ細胞、および
磁気ビーズ分離で全脾細胞から精製された２ｘ１０７の非再活性化Ｂ２２０＋Ｂ細胞を含む、３グループの細胞を亜致死的にγ照射された（５Ｇｙ）ナイーブメスレシピエントに腹腔内注射した。すべての場合において、細胞移入の翌日に５ｘ１０６個のＩＤ８細胞を宿主に皮下接種し、腫瘍増殖を上記のように定期的に評価した。濃縮された細胞の純度は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリー分析によって決定され、一貫して＞９０％であった。
【0111】
生物統計分析
スチューデントのｔ検定を用いて、ｍＲＮＡ発現レベルと平均腫瘍重量の差違を比較した。腫瘍増殖曲線間の差異を、ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって比較し、ｌｏｇｒａｎｋ検定を用いてマウス生存曲線の差を比較した。
スチューデントのｔ検定を用いて、ｍＲＮＡ発現レベルと平均腫瘍重量の差違を比較した。腫瘍増殖曲線間の差異を、ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって比較し、ｌｏｇｒａｎｋ検定を用いてマウス生存曲線の差を比較した。
【0112】
実施例１：組換えマウスＡＭＨＲ２－ＣＤの作製
全細胞質ドメインの３９９個のアミノ酸を含む１７０－５６８配列からなるマウスＡＭＨＲ２の最も長い親水性ドメインが発現された（図１Ａ）。Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティー精製Ｃ末端６ｘＨｉｓタグタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色（図１Ｂ）およびＨＲＰコンジュゲートＨｉｓ特異的抗体を用いたウエスタンブロットブロット免疫染色によって決定される（図１Ｃ）～４４ｋＤタンパク質として移動した。
全細胞質ドメインの３９９個のアミノ酸を含む１７０－５６８配列からなるマウスＡＭＨＲ２の最も長い親水性ドメインが発現された（図１Ａ）。Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティー精製Ｃ末端６ｘＨｉｓタグタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色（図１Ｂ）およびＨＲＰコンジュゲートＨｉｓ特異的抗体を用いたウエスタンブロットブロット免疫染色によって決定される（図１Ｃ）～４４ｋＤタンパク質として移動した。
【0113】
実施例２：ＡＭＨＲ２－ＣＤの免疫原性
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化の１０日後、ＬＮＣは、ＡＭＨＲ２－ＣＤに用量反応的に増殖したが、ＡＭＨＲ２－ＣＤと同様の方法で生成および精製された組換えヒトコクリン（ｃｏｃｈｌｉｎ）、コントロールタンパク質では増殖しなかった（図２Ａ）。ＬＮＣによるこの抗原特異的増殖は、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞から誘導されたが、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞からは誘導されず（図２Ｂ）、ＣＤ４特異的抗体（ＣＤ８特異的抗体でない）との培養の処理によって阻害された（図２Ｃ）。免疫化から４週間後、免疫原刺激された脾細胞からの上清のＥＬＩＳＡ分析は、ＩＦＮγの高産生およびＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－５の産生が比較的低いといった、ＡＭＨＲ２－ＣＤに対する主要な炎症促進性応答を示した（図２Ｄ）。全脾細胞集団からのＴ細胞サブセットの精製は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞でなく）がＡＭＨＲ２－ＣＤに応答してＩＦＮγを産生することを示した（図２Ｅ）。免疫化の２ヶ月後、ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的ＩｇＧの血清レベルは、１：５０，０００希釈を超える力価でも検出可能であった（図２Ｆ）。
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化の１０日後、ＬＮＣは、ＡＭＨＲ２－ＣＤに用量反応的に増殖したが、ＡＭＨＲ２－ＣＤと同様の方法で生成および精製された組換えヒトコクリン（ｃｏｃｈｌｉｎ）、コントロールタンパク質では増殖しなかった（図２Ａ）。ＬＮＣによるこの抗原特異的増殖は、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞から誘導されたが、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞からは誘導されず（図２Ｂ）、ＣＤ４特異的抗体（ＣＤ８特異的抗体でない）との培養の処理によって阻害された（図２Ｃ）。免疫化から４週間後、免疫原刺激された脾細胞からの上清のＥＬＩＳＡ分析は、ＩＦＮγの高産生およびＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－５の産生が比較的低いといった、ＡＭＨＲ２－ＣＤに対する主要な炎症促進性応答を示した（図２Ｄ）。全脾細胞集団からのＴ細胞サブセットの精製は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞でなく）がＡＭＨＲ２－ＣＤに応答してＩＦＮγを産生することを示した（図２Ｅ）。免疫化の２ヶ月後、ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的ＩｇＧの血清レベルは、１：５０，０００希釈を超える力価でも検出可能であった（図２Ｆ）。
【0114】
実施例３：ＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫後の良性一過性卵巣炎症
次に、卵巣の自己免疫を誘導するＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫の可能性を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスのＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化の４週間後および８週間後、卵巣ＩＦＮγ遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。相対的な卵巣ＩＦＮγ遺伝子発現は、ＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化の４週間後には中程度に上昇したが、ＣＦＡ単独の免疫化後ではそうではなかった（図３Ａ）。免疫化の８週間後、相対的な卵巣ＩＦＮγ遺伝子発現は、免疫した両マウス群において同様であった。中でも注目すべきは、４週間でＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化マウスで観察されたＩＦＮγ遺伝子発現の一時的な上昇は、ＣＦＡコントロールマウスより３倍高いだけであった。ＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化の４、８および１２週間後の免疫組織化学分析により、卵巣でＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤は観察されなかった。４連続交配サイクル（この間、ＡＭＨＲ２－ＣＤおよびＣＦＡ免疫化マウス間に同腹仔あたりの子の数に有意差は生じなかった（Ｐ＞０．６０）（図３Ｃ））にわたるマウス妊孕性により示されるとおり、ＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫マウスの卵巣におけるＩＦＮγの低い一過性発現は、卵巣機能への検出可能な影響と関連していなかった。ＡＭＨＲ２遺伝子の発現は、卵巣およびＩＤ８卵巣腫瘍細胞で直ちに検出され、正常なマウス子宮、胃、脾臓、心臓、肺、腎臓および肝臓ではいずれも感知可能なレベルで検出されなかった（図３Ｃ）。
次に、卵巣の自己免疫を誘導するＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫の可能性を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスのＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化の４週間後および８週間後、卵巣ＩＦＮγ遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。相対的な卵巣ＩＦＮγ遺伝子発現は、ＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化の４週間後には中程度に上昇したが、ＣＦＡ単独の免疫化後ではそうではなかった（図３Ａ）。免疫化の８週間後、相対的な卵巣ＩＦＮγ遺伝子発現は、免疫した両マウス群において同様であった。中でも注目すべきは、４週間でＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化マウスで観察されたＩＦＮγ遺伝子発現の一時的な上昇は、ＣＦＡコントロールマウスより３倍高いだけであった。ＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化の４、８および１２週間後の免疫組織化学分析により、卵巣でＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤は観察されなかった。４連続交配サイクル（この間、ＡＭＨＲ２－ＣＤおよびＣＦＡ免疫化マウス間に同腹仔あたりの子の数に有意差は生じなかった（Ｐ＞０．６０）（図３Ｃ））にわたるマウス妊孕性により示されるとおり、ＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫マウスの卵巣におけるＩＦＮγの低い一過性発現は、卵巣機能への検出可能な影響と関連していなかった。ＡＭＨＲ２遺伝子の発現は、卵巣およびＩＤ８卵巣腫瘍細胞で直ちに検出され、正常なマウス子宮、胃、脾臓、心臓、肺、腎臓および肝臓ではいずれも感知可能なレベルで検出されなかった（図３Ｃ）。
【0115】
実施例４：ＡＭＨＲ２－ＣＤで免疫化したマウスにおける腫瘍増殖の阻害
ＡＭＨＲ２－ＣＤによるワクチン接種が、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスにおける移植可能なＩＤ８腫瘍の増殖を阻害するかどうかを次に試験した。ＩＤ８卵巣腫瘍細胞の接種の１５日前（図４Ａ；Ｐ＜０．００１）、７日前（図４Ｖ；Ｐ＜０．００１）または１日後（図４Ｃ；Ｐ＜０．０５）に予防ワクチン接種したマウスにおいて、ＩＤ８腫瘍増殖は阻害された。さらに、ＩＤ８接種の７日前（Ｐ＜０．０１）および１日前（Ｐ＜０．０５）にワクチン接種されたマウスにおける実験の終了時の最終ＩＤ８腫瘍重量によって測定されたとおり、ＡＭＨＲ２－ＣＤワクチン接種は、全腫瘍量の有意な減少をもたらした（図４Ｄ）。ＡＭＨＲ２－ＣＤワクチン接種は、ＥＯＣに対する治療としても有効であった。ＩＤ８腫瘍の接種６０日後のＡＭＨＲ２－ＣＤによるワクチン接種は、確立された触診可能なＩＤ８腫瘍の増殖を有意に阻害した（Ｐ＜０．０５；図４Ｅ）。ＡＭＨＲ２－ＣＤを用いたワクチン接種は、ＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇトランスジェニックマウスにおいて自然発症的に発生する自然発症ＥＯＣの増殖を有意に阻害した（Ｐ＜０．０００１；図４Ｆ）。さらに、ＣＦＡワクチン接種コントロールマウスと比較した場合、腫瘍増殖におけるこの阻害は、極めて有意に全生存期間（ＯＳ）の増加を伴った（Ｐ＜０．０００５；図４Ｇ）。ＣＦＡワクチン接種対照マウス（平均１３５日±１３．８９）と比較したＡＭＨＲ２－ＣＤワクチン接種マウスのこの拡大された寿命（平均１９１．２５日±２２．９５）は、ＯＳにおける４１．７％の増大を表す。
ＡＭＨＲ２－ＣＤによるワクチン接種が、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスにおける移植可能なＩＤ８腫瘍の増殖を阻害するかどうかを次に試験した。ＩＤ８卵巣腫瘍細胞の接種の１５日前（図４Ａ；Ｐ＜０．００１）、７日前（図４Ｖ；Ｐ＜０．００１）または１日後（図４Ｃ；Ｐ＜０．０５）に予防ワクチン接種したマウスにおいて、ＩＤ８腫瘍増殖は阻害された。さらに、ＩＤ８接種の７日前（Ｐ＜０．０１）および１日前（Ｐ＜０．０５）にワクチン接種されたマウスにおける実験の終了時の最終ＩＤ８腫瘍重量によって測定されたとおり、ＡＭＨＲ２－ＣＤワクチン接種は、全腫瘍量の有意な減少をもたらした（図４Ｄ）。ＡＭＨＲ２－ＣＤワクチン接種は、ＥＯＣに対する治療としても有効であった。ＩＤ８腫瘍の接種６０日後のＡＭＨＲ２－ＣＤによるワクチン接種は、確立された触診可能なＩＤ８腫瘍の増殖を有意に阻害した（Ｐ＜０．０５；図４Ｅ）。ＡＭＨＲ２－ＣＤを用いたワクチン接種は、ＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇトランスジェニックマウスにおいて自然発症的に発生する自然発症ＥＯＣの増殖を有意に阻害した（Ｐ＜０．０００１；図４Ｆ）。さらに、ＣＦＡワクチン接種コントロールマウスと比較した場合、腫瘍増殖におけるこの阻害は、極めて有意に全生存期間（ＯＳ）の増加を伴った（Ｐ＜０．０００５；図４Ｇ）。ＣＦＡワクチン接種対照マウス（平均１３５日±１３．８９）と比較したＡＭＨＲ２－ＣＤワクチン接種マウスのこの拡大された寿命（平均１９１．２５日±２２．９５）は、ＯＳにおける４１．７％の増大を表す。
【0116】
実験の終了時に、腫瘍を炎症性浸潤について分析した。免疫組織化学分析は、一貫して、ＡＭＨＲ２－ＣＤワクチン接種マウスからの腫瘍におけるＣＤ３＋Ｔ細胞の広範な浸潤を示した（図５Ａ）。ＣＦＡ単独で免疫化したマウスの腫瘍では浸潤は観察されなかった。ＴＩＬのフローサイトメトリー分析は、ＣＦＡ単独で免疫化したコントロールマウスと比較して、ＡＭＨＲ２－ＣＤでワクチン接種したマウスからの腫瘍におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の顕著な増加を示した（４０．７％対１１．７％；図５ｂ）。腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の実質的な増加は、ＣＦＡ免疫化コントロールマウスと比較してＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化マウスでは生じなかった（それぞれ１０．５％対７．４％）。次に、ｑＲＴ－ＰＣＲによって腫瘍ＲＮＡを炎症誘発因子の遺伝子発現について分析した。ＣＦＡ免疫化コントロールマウスの腫瘍と比較して、ＡＭＨＲ２－ＣＤ免疫化マウスの腫瘍はＣＤ４、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－２の相対的遺伝子発現では一貫して有意な増加を示した（全てのケースでＰ＜０．０５）が、ＣＤ８ではなかった（図５Ｃ）。これらのデータは、ＡＭＨＲ２－ＣＤによる免疫化後のＩＤ８腫瘍内の炎症誘発性免疫環境の誘導を示す。
【0117】
実施例５：ＣＤ４＋細胞による腫瘍免疫の受動移入
全てのレシピエントマウスに、細胞移入の翌日にＩＤ８腫瘍細胞を接種した。ＯＶＡ特異的ＬＮＣを投与されたマウスと比較した場合、ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的ＬＮＣ（Ｐ＝０．０４；図６Ａ）および脾細胞（Ｐ＜０．０１；図６Ｂ）を移入したマウスにおいて腫瘍増殖は有意に阻害された。初回刺激された脾細胞の移入および腫瘍接種の１９０日後、平均腫瘍重量は、ＯＶＡ特異的脾細胞のレシピエントと比較して、ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的脾細胞のレシピエントにおいて有意に低かった（Ｐ＜０．０５；図６Ｃ）。４週間の初回刺激脾細胞から精製したＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の移入は、精製ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の移入と比較してＩＤ８腫瘍増殖の有意な阻害をもたらした（Ｐ＜０．０００４；図６Ｄ）、一方、４週間初回刺激された脾臓細胞から精製されたＡＭＨＲ２－ＣＤ－刺激Ｂ２２０＋Ｂ細胞の移入は、ＯＶＡ刺激Ｂ２２０＋Ｂ細胞の移入と比較して、ＩＤ８腫瘍増殖を有意に阻害しなかった（Ｐ＝０．０７；図６Ｄ）。したがって、ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的炎症誘発性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥＯＣの増殖に対する免疫防御を伝達するのに十分である。
全てのレシピエントマウスに、細胞移入の翌日にＩＤ８腫瘍細胞を接種した。ＯＶＡ特異的ＬＮＣを投与されたマウスと比較した場合、ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的ＬＮＣ（Ｐ＝０．０４；図６Ａ）および脾細胞（Ｐ＜０．０１；図６Ｂ）を移入したマウスにおいて腫瘍増殖は有意に阻害された。初回刺激された脾細胞の移入および腫瘍接種の１９０日後、平均腫瘍重量は、ＯＶＡ特異的脾細胞のレシピエントと比較して、ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的脾細胞のレシピエントにおいて有意に低かった（Ｐ＜０．０５；図６Ｃ）。４週間の初回刺激脾細胞から精製したＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の移入は、精製ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の移入と比較してＩＤ８腫瘍増殖の有意な阻害をもたらした（Ｐ＜０．０００４；図６Ｄ）、一方、４週間初回刺激された脾臓細胞から精製されたＡＭＨＲ２－ＣＤ－刺激Ｂ２２０＋Ｂ細胞の移入は、ＯＶＡ刺激Ｂ２２０＋Ｂ細胞の移入と比較して、ＩＤ８腫瘍増殖を有意に阻害しなかった（Ｐ＝０．０７；図６Ｄ）。したがって、ＡＭＨＲ２－ＣＤ特異的炎症誘発性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥＯＣの増殖に対する免疫防御を伝達するのに十分である。
【0118】
実施例６：ヒトＡＭＨＲ２組織発現
ヒトタンパク質アトラスデータベースを調べて、３０のヒト組織における相対的なＡＭＨＲ２遺伝子発現を決定した。図７に見られるように、ＡＭＨＲ２遺伝子発現は、３０個の組織のうちのわずか５個でバックグラウンドを上回ることが観察され、最高発現は卵巣で観察された。
ヒトタンパク質アトラスデータベースを調べて、３０のヒト組織における相対的なＡＭＨＲ２遺伝子発現を決定した。図７に見られるように、ＡＭＨＲ２遺伝子発現は、３０個の組織のうちのわずか５個でバックグラウンドを上回ることが観察され、最高発現は卵巣で観察された。
【0119】
ＡＭＨＲ２のいくつかの公知のスプライスバリアントがあり、ＡＭＨＲ２の異なる部分をコードする様々なスプライスバリアントがある。次いで、ヒトタンパク質アトラスを調べて、ＡＭＨＲ２遺伝子発現が観察された５つの組織における異なるＡＭＨＲ２エキソンの発現レベルを決定した。図８に示すように、ＡＭＨＲ２の細胞外ドメインをコードするエキソンの発現は、専ら卵巣に限定されていた。
【0120】
定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、ＡＭＨＲ２－ＥＤの発現が正常なヒト卵巣に限定され、該ヒトの副腎または膵臓で発現されないことを示した（図８Ｂ）。さらに、図８Ｄに示されるように、ヒト閉経後卵巣（平均６４歳、５２～９５歳）および老いたマウス卵巣（９ヶ月齢）は、ヒト閉経前卵巣と（平均３１歳、範囲２７～４５歳）および若いマウス卵巣（６週齢）とそれぞれ比較して、低レベルのＡＭＨＲ２－ＥＤ発現を有する。さらに、試験された全てのヒトＥＯＣ腫瘍は、ＡＭＲＲ２－ＥＤ転写物（ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価；図８Ｅ）およびタンパク質（ウエスタンブロット分析によって評価；図８Ｆ）の両方の高レベル発現を示した。したがって、正常な卵巣では、両方のドメインの発現レベルが年齢とともに低下し、ＡＭＨＲ２ポリペプチドを有する閉経後の女性にワクチン接種する際の一過性の卵巣炎の可能性も低下する。
【0121】
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを用いて、ＡＭＨＲ２細胞外ドメインが正常なヒト卵巣で発現されるが、細胞外ドメインでは発現しないことを確認した（図９Ａ）。
【0122】
ＡＭＨＲ２細胞外ドメインがＥＯＣで発現されるかどうかを次に試験した。５つのＥＯＣをＡＭＨＲ２細胞外ドメインに特異的な抗体を用いたウエスタンブロットで試験したところ、すべてのサンプルで細胞外ドメインの発現が観察された（図９Ｂ）。
【0123】
実施例７：組換えマウスＡＭＨＲ２－ＥＤの作製
ＡＭＨＲ２タンパク質のＮ末端１４０アミノ酸で構成されるマウスＡＭＨＲ２細胞外ドメインを発現させた（図１０Ａ）。Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティー精製Ｃ末端６ｘＨｉｓタグタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色およびＨＲＰ結合Ｈｉｓ特異的抗体を用いたウエスタンブロット免疫染色によって決定される～１７ｋＤタンパク質として移動した（図１０Ｂ）。６週齢の若いＣ５７ＢＬ／６雌マウスのＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種の１ヶ月後、ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、ＩＦＮγ産生抗原特異的Ｔ細胞の脾細胞頻度（平均で３，８３１脾臓細胞あたり１）、ＩＬ－１７の脾細胞頻度（平均で２１，７３９脾細胞あたり１個）の上昇を示したがＩＬ－５ではなかった（図１０Ｃ）。
ＡＭＨＲ２タンパク質のＮ末端１４０アミノ酸で構成されるマウスＡＭＨＲ２細胞外ドメインを発現させた（図１０Ａ）。Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティー精製Ｃ末端６ｘＨｉｓタグタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色およびＨＲＰ結合Ｈｉｓ特異的抗体を用いたウエスタンブロット免疫染色によって決定される～１７ｋＤタンパク質として移動した（図１０Ｂ）。６週齢の若いＣ５７ＢＬ／６雌マウスのＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種の１ヶ月後、ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、ＩＦＮγ産生抗原特異的Ｔ細胞の脾細胞頻度（平均で３，８３１脾臓細胞あたり１）、ＩＬ－１７の脾細胞頻度（平均で２１，７３９脾細胞あたり１個）の上昇を示したがＩＬ－５ではなかった（図１０Ｃ）。
【0124】
ＡＭＨＲ２－ＥＤに応答する炎症誘発性Ｔ細胞は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞であったが、ＩＦＮγ（図１０Ｄ）およびＩＬ－１７（図１０Ｅ）を産生するＣＤ８＋Ｔ細胞も含んでいた。ＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種の４ヶ月後、ＡＭＨＲ２－ＥＤに対する血清ＩｇＧ抗体応答は、１／５０，０００までの希釈で検出可能であり（図１０Ｆ）、主にＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂアイソタイプからなっていた（図１０Ｇ）。ＡＭＨＲ２－ＥＤは、完全に異なる主要組織適合複合体ハプロタイプ（Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２ｂ）、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２ｄ）、Ａ／Ｊ（Ｈ－２ａ）、およびＦＶＢＮ／Ｊ（Ｈ－２ｑ）を含む）を示すいくつかのマウス株において高度に免疫原性であり、ＩＦＮγ分泌脾細胞がワクチン接種の１ヶ月後の頻度が平均でそれぞれ１／４，３１０、１／４，４２５、１／８，７７２、および１／１０，０００であった（図１０Ｈ）。
【0125】
実施例８：ＡＭＨＲ２－ＥＤの免疫原性
ＡＭＨＲ２－ＥＤの免疫原性は、ＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇ（ＤＲ２６系）トランスジェニック雌マウスのＣＦＡ中ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫化によって決定した。免疫化の４週間後、ＡＭＨＲ２－ＥＤ由来の脾細胞は、ＡＭＨＲ２－ＥＤに対する抗原特異的リコール増殖応答を示したが、組換えマウスβ－カゼイン（ＡＭＨＲ２－ＥＤと同様の様式で生成および精製された無関係なコントロール抗原）では見られなかった（図１１Ａ）。対照的に、ＣＦＡ免疫化マウス由来の脾細胞は、ＡＭＨＲ２－ＥＤおよびβ－カゼインの両方に対して応答しなかった（図１１Ｂ）。培養上清のＥＬＩＳＡ分析により、高レベルの炎症誘発性サイトカインサイトカイン、ＩＦＮγおよびＩＬ－１７のＡＭＨＲ２－ＥＤ活性化産生が示され、および第２型制御性サイトカインＩＬ－５の産生は最小であることが示された（図１１Ｃ）。ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫したマウスの脾細胞は、１型（～１／４，０００リンパ球；ｐ＜０．０００１）および１７型（～１／２０，０００リンパ球；ｐ＜０．０２）炎症誘発性Ｔ細胞の有意に高い頻度を示したが、ＩＬ－５を発現する２型制御性Ｔ細胞は最小の頻度であった（図１１Ｄ）。ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫化の４ヶ月後、ＡＭＨＲ２－ＥＤ特異的ＩｇＧの血清力価は、１／５０，０００希釈を超える力価で依然として検出可能であった（ｐ＜０．００１、図１１Ｅ）。これらの結果は、ＡＭＨＲ２－ＥＤが高度に免疫原性であることを示している。
ＡＭＨＲ２－ＥＤの免疫原性は、ＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇ（ＤＲ２６系）トランスジェニック雌マウスのＣＦＡ中ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫化によって決定した。免疫化の４週間後、ＡＭＨＲ２－ＥＤ由来の脾細胞は、ＡＭＨＲ２－ＥＤに対する抗原特異的リコール増殖応答を示したが、組換えマウスβ－カゼイン（ＡＭＨＲ２－ＥＤと同様の様式で生成および精製された無関係なコントロール抗原）では見られなかった（図１１Ａ）。対照的に、ＣＦＡ免疫化マウス由来の脾細胞は、ＡＭＨＲ２－ＥＤおよびβ－カゼインの両方に対して応答しなかった（図１１Ｂ）。培養上清のＥＬＩＳＡ分析により、高レベルの炎症誘発性サイトカインサイトカイン、ＩＦＮγおよびＩＬ－１７のＡＭＨＲ２－ＥＤ活性化産生が示され、および第２型制御性サイトカインＩＬ－５の産生は最小であることが示された（図１１Ｃ）。ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫したマウスの脾細胞は、１型（～１／４，０００リンパ球；ｐ＜０．０００１）および１７型（～１／２０，０００リンパ球；ｐ＜０．０２）炎症誘発性Ｔ細胞の有意に高い頻度を示したが、ＩＬ－５を発現する２型制御性Ｔ細胞は最小の頻度であった（図１１Ｄ）。ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫化の４ヶ月後、ＡＭＨＲ２－ＥＤ特異的ＩｇＧの血清力価は、１／５０，０００希釈を超える力価で依然として検出可能であった（ｐ＜０．００１、図１１Ｅ）。これらの結果は、ＡＭＨＲ２－ＥＤが高度に免疫原性であることを示している。
【0126】
ＡＭＨＲ２－ＥＤによるワクチン接種によって生成された免疫応答の性質をさらに評価するために、ＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇトランスジェニック雌マウスをＡＭＨＲ２－ＥＤ２５μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌのいずれかで免疫化した。免疫化の１ヶ月後、脾臓を採取し、ＩＦＮγおよびＩＬ－１７の発現を検出した。図１２Ａ－Ｂに見られるように、ＡＭＨＲ２－ＥＤの免疫化の１ヶ月後に単離された脾細胞および精製ＣＤ４＋（ＣＤ８＋ではない）Ｔ細胞は、１型および１７型炎症誘発性Ｔ細胞の顕著な抗原特異的誘導を示した。ＡＭＨＲ２－ＥＤで６週齢で免疫化された７ヶ月齢のメスＴｇＭＩＳＩＩＲ－Ｔａｇマウスから採取した自然発症ＥＯＣの免疫組織化学分析は、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の優勢な浸潤を示したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞ではなかった（図１２Ｃ～Ｄ）。
【0127】
実施例９：ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫は妊孕性に影響しない
ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫後の卵巣炎症のレベルを調べた。マウスの卵巣を、ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫化の４週間後および８週間後に採取し、ＲＴ－ＰＣＲによって分析した。図１３に見られるように、採取された卵巣は、免疫後４週間で炎症性サイトカインＩＬ－１βの発現を示したが、８週間では示さなかった。ＩＦＮγ発現は、免疫後のいずれの時点でも上昇しなかった。対照的に、ＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種の４週間後、９ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの卵巣中のＩＬ－１βについてもＩＦＮγについては遺伝子発現の上昇は起こらなかった（図１３Ｃ）。
ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫後の卵巣炎症のレベルを調べた。マウスの卵巣を、ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫化の４週間後および８週間後に採取し、ＲＴ－ＰＣＲによって分析した。図１３に見られるように、採取された卵巣は、免疫後４週間で炎症性サイトカインＩＬ－１βの発現を示したが、８週間では示さなかった。ＩＦＮγ発現は、免疫後のいずれの時点でも上昇しなかった。対照的に、ＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種の４週間後、９ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの卵巣中のＩＬ－１βについてもＩＦＮγについては遺伝子発現の上昇は起こらなかった（図１３Ｃ）。
【0128】
次に、ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫したマウスの妊孕性を調べた。図１４に見られるように、４回の交配サイクルにわたる妊孕性によって測定された卵巣機能は、ＡＭＨＲ２－ＥＤ免疫化による影響を受けなかった。具体的には、ＣＦＡ中のＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化したマウス間またはＣＦＡ単独で免疫化したコントロールマウスの間で、同腹仔あたりの平均仔数または平均出生時重量の有意差は検出されなかった。
【0129】
実施例１０：ＡＭＨＲ２－ＥＤによる免疫化は、卵巣癌腫瘍の増殖を阻害する
自発性かつ移植可能な卵巣腫瘍の増殖を阻害するＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種の能力を試験した。図１５Ａ～Ｂに見られるように、６～７週齢の雌ＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇトランスジェニックマウスの予防的ＡＭＨＲ２－ＥＣワクチン接種は、自然発症ＥＯＣの増殖において高度に有意な阻害をもたらし（ｐ＜０．０００１）、ＣＦＡ単独でワクチン接種したコントロールマウスと比較して、全生存が４２％増加した（平均１９３．７±３４．５日対平均１３５±１３．８９日）。移植可能なＴｇＭＩＳＩＩＲ ＥＯＣ腫瘍の増殖における同様の有意な阻害は、３ｘ１０６マウス卵巣癌（ＭＯＶＣＡＲ）細胞を接種する７日前または１５日前のいずれかにワクチン接種されたマウスで生じた（ｐ＜０．００１；図１５Ｃ～Ｄ）。
自発性かつ移植可能な卵巣腫瘍の増殖を阻害するＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種の能力を試験した。図１５Ａ～Ｂに見られるように、６～７週齢の雌ＴｇＭ１ＳＩＩＲ－ＴＡｇトランスジェニックマウスの予防的ＡＭＨＲ２－ＥＣワクチン接種は、自然発症ＥＯＣの増殖において高度に有意な阻害をもたらし（ｐ＜０．０００１）、ＣＦＡ単独でワクチン接種したコントロールマウスと比較して、全生存が４２％増加した（平均１９３．７±３４．５日対平均１３５±１３．８９日）。移植可能なＴｇＭＩＳＩＩＲ ＥＯＣ腫瘍の増殖における同様の有意な阻害は、３ｘ１０６マウス卵巣癌（ＭＯＶＣＡＲ）細胞を接種する７日前または１５日前のいずれかにワクチン接種されたマウスで生じた（ｐ＜０．００１；図１５Ｃ～Ｄ）。
【0130】
同様に、６－７週齢のＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（ＤＲ２６）トランスジェニックマウスの予防的ＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種は、ＣＦＡ単独でワクチン接種したコントロールマウスと比較して、自然発症ＥＯＣの出現および増殖を有意に遅延させた（Ｐ＜０．００１；図１５Ｅ）。この自然発症ＥＯＣの出現および増殖の阻害は、ＣＦＡ単独でワクチン接種したコントロールマウスと比較して、有意な４２％全生存の増加をもたらした（Ｐ＜０．０００１）、（平均１９４±３５日対平均１３５±１４日それぞれ；図１５Ｆ）。ＡＭＨＲ２－ＥＤワクチン接種はまた、確立された増殖性自然発症ＥＯＣを有するＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（ＤＲ２６）トランスジェニックマウスにおいて、ＥＯＣに対する高度に有意な免疫療法を提供するのに有効であった（Ｐ＜０．０００１；図１５Ｇ）。ＡＭＨＲ２をワクチン接種したＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（ＤＲ２６）マウスからの自然発症ＥＯＣの免疫組織化学的分析は、ＣＤ３＋Ｔ細胞（図１５Ｈ、左上パネル）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（図１５Ｈ、上段中央パネル）では一貫して、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１５Ｈ、右上パネル）では時折、顕著な浸潤を示した。ＣＦＡ単独でワクチン接種したコントロールマウス由来の対応する免疫染色ＥＯＣは、一貫して検出可能なＴ細胞浸潤を示さなかった（図３ｆ、下のパネル）。
【0131】
実施例１１：ＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激Ｔ細胞およびＢ細胞の移入は、卵巣癌腫瘍の増殖を阻害する
ＥＯＣ腫瘍増殖に対するＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ２２０＋Ｂ細胞の移入の効果を試験した。図１６に見られるように、ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化したマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞またはＢ２２０＋Ｂ細胞の移入後に、ＭＯＶＣＡＲ ＥＯＣの増殖の阻害が生じた。さらに、図１７に見られるように、ＡＭＨＲ２－ＥＤ免疫化マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞またはＢ２２０＋Ｂ細胞の移入もまた、細胞を受けたＭＯＶＣＡＲ腫瘍を有するマウスにおいて全生存を増加させた。ナイーブレシピエントへの細胞の移入およびＭＯＶＣＡＲ ＥＯＣの接種は、互いに１日以内に行われた。さらに、図１８に見られるように、ＩＤ８－ＶＥＧＦ ＥＯＣ腫瘍の増殖阻害は、ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化したマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞（左上パネル）または血清（左下パネル）を受けたマウスで生じた。全生存の増大は、ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化したマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞（右上のパネル）または血清（右下のパネル）を受けたマウスで生じた。ナイーブレシピエントへの細胞の移入およびＩＤ８－ＶＥＧＦ ＥＯＣの接種は、互いに１日以内に行われた。アスタリスクは有意性を示す。
ＥＯＣ腫瘍増殖に対するＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ２２０＋Ｂ細胞の移入の効果を試験した。図１６に見られるように、ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化したマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞またはＢ２２０＋Ｂ細胞の移入後に、ＭＯＶＣＡＲ ＥＯＣの増殖の阻害が生じた。さらに、図１７に見られるように、ＡＭＨＲ２－ＥＤ免疫化マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞またはＢ２２０＋Ｂ細胞の移入もまた、細胞を受けたＭＯＶＣＡＲ腫瘍を有するマウスにおいて全生存を増加させた。ナイーブレシピエントへの細胞の移入およびＭＯＶＣＡＲ ＥＯＣの接種は、互いに１日以内に行われた。さらに、図１８に見られるように、ＩＤ８－ＶＥＧＦ ＥＯＣ腫瘍の増殖阻害は、ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化したマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞（左上パネル）または血清（左下パネル）を受けたマウスで生じた。全生存の増大は、ＡＭＨＲ２－ＥＤで免疫化したマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞（右上のパネル）または血清（右下のパネル）を受けたマウスで生じた。ナイーブレシピエントへの細胞の移入およびＩＤ８－ＶＥＧＦ ＥＯＣの接種は、互いに１日以内に行われた。アスタリスクは有意性を示す。
【0132】
実施例１２：ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ２２０＋Ｂ細胞、およびＩｇＧによる腫瘍免疫の受動移入
ＥＯＣ腫瘍増殖の阻害を説明する免疫集団の同一性を試験した。ＭＯＶＣＡＲ接種の１日前にＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（低）雌マウスに移入すると、オボアルブミン刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞を受けたマウスと比較して、腫瘍増殖の極めて有意な阻害がもたらされ（Ｐ＜０．０００１；図２０Ａ）、全生存が増大することが見出された（Ｐ＜０．００６；図２０Ｂ）。さらに、ＭＯＶＣＡＲ接種の１日前にＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（低）雌マウスにＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激Ｂ２２０＋Ｂ細胞を移入することにより、オボアルブミン免疫化マウスからのＢ２２０＋Ｂ細胞を受けたマウスと比較して、有意な腫瘍増殖の阻害（Ｐ＜０．０００１；図２０Ｃ）および全生存の増大（Ｐ＜０．００９；図２０Ｄ）が媒介された。ＭＯＶＣＡＲ接種の１日前にＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（低）雌マウスへのＡＭＨＲ２－ＥＤ免疫化マウス由来のアフィニティー精製ＩｇＧの移入は、オボアルブミン免疫化マウス由来のアフィニティー精製ＩｇＧを受けたマウスと比較して、腫瘍増殖の有意な阻害をもたらし（Ｐ＜０．０００１；図２０Ｅ）、全生存を増大した（Ｐ＜０．００２；図２０Ｆ）。
ＥＯＣ腫瘍増殖の阻害を説明する免疫集団の同一性を試験した。ＭＯＶＣＡＲ接種の１日前にＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（低）雌マウスに移入すると、オボアルブミン刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞を受けたマウスと比較して、腫瘍増殖の極めて有意な阻害がもたらされ（Ｐ＜０．０００１；図２０Ａ）、全生存が増大することが見出された（Ｐ＜０．００６；図２０Ｂ）。さらに、ＭＯＶＣＡＲ接種の１日前にＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（低）雌マウスにＡＭＨＲ２－ＥＤ刺激Ｂ２２０＋Ｂ細胞を移入することにより、オボアルブミン免疫化マウスからのＢ２２０＋Ｂ細胞を受けたマウスと比較して、有意な腫瘍増殖の阻害（Ｐ＜０．０００１；図２０Ｃ）および全生存の増大（Ｐ＜０．００９；図２０Ｄ）が媒介された。ＭＯＶＣＡＲ接種の１日前にＴｇＭＩＳＩＩＲ－ＴＡｇ（低）雌マウスへのＡＭＨＲ２－ＥＤ免疫化マウス由来のアフィニティー精製ＩｇＧの移入は、オボアルブミン免疫化マウス由来のアフィニティー精製ＩｇＧを受けたマウスと比較して、腫瘍増殖の有意な阻害をもたらし（Ｐ＜０．０００１；図２０Ｅ）、全生存を増大した（Ｐ＜０．００２；図２０Ｆ）。
【0133】
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各々の刊行物、特許または特許出願が具体的に参照され、個々に示されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。コンフリクトの場合には、本明細書中の定義を含む本出願は、コントロールする。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各々の刊行物、特許または特許出願が具体的に参照され、個々に示されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。コンフリクトの場合には、本明細書中の定義を含む本出願は、コントロールする。
【0134】
同等物（均等物）
当業者であれば、本明細書に記載された特定の実施形態に対する多くの同等物（均等物）を認識するであろうし、あるいは通常の実験を用いて確認することができるであろう。
そのような同等物（均等物）は、下記の請求の範囲に記載されたものに包含されることが意図される。
当業者であれば、本明細書に記載された特定の実施形態に対する多くの同等物（均等物）を認識するであろうし、あるいは通常の実験を用いて確認することができるであろう。
そのような同等物（均等物）は、下記の請求の範囲に記載されたものに包含されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-01-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト女性対象における卵巣癌腫瘍の治療または予防において用いるための、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）ポリペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物が対象に投与するためのものであり、該ＡＭＨＲ２ポリペプチドがヒトＡＭＨＲ２の細胞外ドメインを含む、免疫原性組成物。
【請求項2】
該免疫原性組成物がアジュバントを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項3】
該アジュバントが、アジュバント６５、ａ－ＧａｌＣｅｒ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β－グルカンペプチド、ＣｐＧ ＤＮＡ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＰＩ－０１００、ＩＦＡ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１７、リピドＡ、リポ多糖、リポバント（Ｌｉｐｏｖａｎｔ）、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ポリ－ＩＣ、クイルＡ、トレハロースジミコレート、およびザイモサンから成る群から選択される、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項4】
該アジュバントがＩ型／１７型混合型免疫応答を誘導するものである、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項5】
該腫瘍が原発性卵巣癌腫瘍である、請求項１～４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項6】
該腫瘍が転移性卵巣癌腫瘍である、請求項１～４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項7】
該卵巣癌腫瘍が卵巣上皮癌（ＥＯＣ）腫瘍である、請求項１～６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項8】
該免疫原性組成物の投与が該対象においてＡＭＨＲ２を発現する細胞に対するＴ細胞免疫応答を誘導する、請求項１～７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項9】
該免疫原性組成物の投与が該対象においてＡＭＨＲ２を発現する細胞に対するＢ細胞免疫応答を誘導する、請求項１～８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項10】
該免疫原性組成物が該対象に複数用量で投与される、請求項１～９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項11】
該対象が卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を除去するための外科手術を受けたことがある、請求項１～１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項12】
該アジュバントがリポ多糖である、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項13】
該卵巣癌腫瘍がＡＭＨＲ２を発現する、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項14】
該免疫原性組成物がヒト女性対象において原発性卵巣癌腫瘍の予防に用いられる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項15】
該ヒト女性対象がゲノム中にＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２変異を含む、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項16】
該ヒト女性対象が卵巣癌の家族歴を有する、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項17】
該ヒト女性対象が閉経後のヒト女性である、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【手続補正書】
【提出日】2022-02-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト女性対象における卵巣癌腫瘍の治療または予防において用いるための、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲ２）ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物であって、該組成物が対象に投与するためのものであり、該ＡＭＨＲ２ポリペプチドがヒトＡＭＨＲ２の細胞外ドメインを含む、組成物。
【請求項2】
該腫瘍が原発性卵巣癌腫瘍である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
該腫瘍が転移性卵巣癌腫瘍である、請求項１～２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項4】
該卵巣癌腫瘍が卵巣上皮癌（ＥＯＣ）腫瘍である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
該組成物の投与が該対象においてＡＭＨＲ２を発現する細胞に対するＴ細胞免疫応答を誘導する、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
該組成物の投与が該対象においてＡＭＨＲ２を発現する細胞に対するＢ細胞免疫応答を誘導する、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
該組成物が該対象に複数用量で投与される、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
該対象が卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を除去するための外科手術を受けたことがある、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
該卵巣癌腫瘍がＡＭＨＲ２を発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
該組成物がヒト女性対象において原発性卵巣癌腫瘍の予防に用いられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
該ヒト女性対象がゲノム中にＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２変異を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
該ヒト女性対象が卵巣癌の家族歴を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項13】
該ヒト女性対象が閉経後のヒト女性である、請求項１０に記載の組成物。
【外国語明細書】