特開 2022-60514 ガバペンチノイドからの干渉が減少し、ＨＧＦ異型体を発現するＤＮＡコンストラクトを用いる神経病症の治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022060514

(43)【公開日】2022-04-14

(54)【発明の名称】ガバペンチノイドからの干渉が減少し、ＨＧＦ異型体を発現するＤＮＡコンストラクトを用いる神経病症の治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20220407BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220407BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20220407BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220407BHJP

   A61K 38/22 20060101ALN20220407BHJP

   A61K 31/195 20060101ALN20220407BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220407BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61P25/00

A61P25/02

A61P43/00 105

A61K38/22

A61K31/195

C12N15/12 ZNA

【審査請求】有

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022027322

(22)【出願日】2022-02-24

(62)【分割の表示】P 2020522034の分割

【原出願日】2018-10-16

(31)【優先権主張番号】62/574,100

(32)【優先日】2017-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】518069438

【氏名又は名称】ヘリックスミス カンパニー， リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079049

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(72)【発明者】

【氏名】キム、ソン ヨン

(72)【発明者】

【氏名】イ、ジュン フン

(57)【要約】

【課題】本発明は、ガバペンチノイドを投与された神経病症患者の治療方法に関する。
【解決手段】特に、前記方法は、ガバペンチノイドを中断した後、ヒトＨＧＦタンパク質をコードする核酸コンストラクトを投与する段階を含む。本発明は、ガバペンチノイドによる治療効果の干渉を避けることによって特定患者集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）がより優れた治療結果を達成する新規の方法を提供する。
【選択図】図９Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経病症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の治療方法における使用のためのＶＭ２０２であって、前記方法は次の段階を含む、ＶＭ２０２：
ガバペンチノイドを投与された神経病症患者を選択する段階、
前記患者へのガバペンチノイド投与を中断する段階、及び
前記患者にＶＭ２０２を投与する段階。

【請求項2】

前記方法は、ＶＭ２０２投与段階後に少なくとも１週間の間にガバペンチノイド投与を保留する段階をさらに含む、請求項１に記載のＶＭ２０２。

【請求項3】

前記方法は、ＶＭ２０２投与段階後に少なくとも１０日間の間にガバペンチノイド投与を保留する段階をさらに含む、請求項１に記載のＶＭ２０２．

【請求項4】

前記ガバペンチノイド投与を中断する段階は、ガバペンチノイド投与を次第に減少させることを含む、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。

【請求項5】

ＶＭ２０２を投与する段階は、ガバペンチノイド投与が完全に中断された後に行われる、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。

【請求項6】

前記ＶＭ２０２を投与する段階は、ガバペンチノイド投与が完全に中断されて少なくとも１日、２日、３日、５日、７日、１４日、２１日、３０日、６０日又は９０日後に行われる、請求項５に記載のＶＭ２０２。

【請求項7】

前記神経病症は、糖尿病性末梢神経病症である、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。

【請求項8】

前記神経病症は、帯状疱疹後神経病症（ｐｏｓｔ－ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）である、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。

【請求項9】

前記ガバペンチノイドは、ガバペンチン又はプレガバリンである、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。

【請求項10】

前記ＶＭ２０２を投与する段階は、患者の患肢（ａｆｆｅｃｔｅｄ ｌｉｍｂ）当たり８ｍｇのＶＭ２０２を、複数回の筋肉内注射及び複数回の訪問に同等に分けて投与することを含み、所定の１回の訪問において複数回の筋肉内注射のそれぞれは、離隔した注射部位で行われる、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。

【請求項11】

前記ＶＭ２０２を投与する段階は、１６ｍｇの容量のＶＭ２０２を６４回の筋肉内注射で均等に分けて投与する段階を含み、
１６回の筋肉内注射は、一番目の訪問において一番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、
１６回の筋肉内注射は、一番目の訪問において二番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、
１６回の筋肉内注射は、二番目の訪問において一番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、
１６回の筋肉内注射は、二番目の訪問において二番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、及び
６４回の筋肉内注射のそれぞれは０．５ｍｌ体積中の０．２５ｍｇのＶＭ２０２を用いて行われる、請求項１０に記載のＶＭ２０２。

【請求項12】

患者において神経病症を治療する方法に使用するためのＶＭ２０２であって、前記方法は次の段階を含む、ＶＭ２０２：
神経病症の患者にここ一週（ｗｅｅｋ）内にガバペンチノイドが投与されたか否か決定する段階；
患者にここ一週内にガバペンチノイドが投与された場合、患者へのガバペンチノイド投与を中断した後、患者にＶＭ２０２を投与する段階；及び
患者にここ一週内にガバペンチノイドが投与されなかった場合、患者にＶＭ２０２を投与する段階。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ガバペンチノイドを投与された神経病症患者の治療方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ガバペンチノイド（Ｇａｂａｐｅｎｔｉｎｏｉｄｓ）は、抑制性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）神経伝達物質ＧＡＢＡ（γ－アミノ酪酸）の誘導体である薬物部類（ｃｌａｓｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ）である。ガバペンチンプロドラッグ、ガバペンチンエナカルビル（ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ ｅｎａｃａｒｂｉｌ；Ｈｏｒｉｚａｎｔ）だけでなく、ガバペンチン（ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ；Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ）とプレガバリン（ｐｒｅｇａｂａｌｉｎ；Ｌｙｒｉｃａ）を含むいくつかのガバペンチノイドが開発され、臨床的に承認された。

【0003】

ガバペンチノイドは、シナプス前（ｐｒｅ－ｓｙｎａｐｔｉｃ）カルシウムチャネルのα２δサブユニットに主に作用し、ニューロンカルシウム流入（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｆｌｕｘ）を抑制するものと見なされる。これは、神経線維からグルタメート、サブスタンスＰ及びカルシトニン遺伝子関連ペプチドのような興奮性（ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ）神経伝達物質の放出を減少させて、神経又は組織損傷後神経興奮性（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ）を抑制する。この薬物は、神経病症疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ）のような神経損傷と関連した様々な状態の治療だけでなく、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、線維筋痛症（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、全般性不安障害（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ａｎｘｉｅｔｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）及びレストレスレッグス症候群（ｒｅｓｔｌｅｓｓ ｌｅｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を含む様々な他の神経系障害の治療に使用されてきた。それらはまた、片頭痛（ｍｉｇｒａｉｎｅ）、社交不安障害（ｓｏｃｉａｌ ｐｈｏｂｉａ）、パニック障害（ｐａｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、燥病（ｍａｎｉａ）、双極性障害（ｂｉｐｏｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）及びアルコール禁断（ａｌｃｏｈｏｌ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）の治療に効果的なものとして提案された。

【0004】

近年、神経病症性疼痛は、ヒトＨＧＦタンパク質の２つの異型体（ｉｓｏｆｏｒｍ）を発現するＤＮＡコンストラクト（すなわち、“ＶＭ２０２”とも呼ばれるｐＣＫ－ＨＧＦ－Ｘ７）で治療可能であることが立証された。第ＩＩ相臨床試験において、糖尿病性末梢神経病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）患者のふくらはぎの筋肉にＶＭ２０２を注射すると、疼痛が有意に減少することが見出された－２週間隔で２日間治療することにより、３ケ月間、生活の質が改善された症状緩和を十分に提供した（Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２（５）：４６５－４７８（２０１５））。

【0005】

ＶＭ２０２が糖尿病性末梢神経病症を持つ患者を治療するのに効果的であることが立証されたが、第ＩＩ相臨床試験データの追加分析は、ＶＭ２０２が、ガバペンチノイドを服用した患者におけるよりも、プレガバリン又はガバペンチンを服用していない患者において疼痛を緩和させる効果がより高いことを立証した（Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２（５）：４６５－４７８（２０１５））。しかし、事後解析（ｐｏｓｔ ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、この観察の基礎となる生理学的メカニズムを説明できなかった。特に、このデータは、ガバペンチノイドの事前投与がＶＭ２０２の事後効能（ｌａｔｅｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ）を妨げるかどうか予測できず、また事前にガバペンチノイドを服用した患者にＶＭ２０２を効率よく投与する方法も予測できなかった。

【0006】

したがって、ガバペンチノイドを以前に投与された患者に効率よくＶＭ２０２を投与する方法が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、ガバペンチノイドによる神経病症に対するＨＧＦ（例えば、ＶＭ２０２）を暗号化する核酸コンストラクトの治療効果の干渉と関連した新規の発見に基づく。具体的に、本発明者らは、ガバペンチノイドがＶＭ２０２の投与時点及び直後に投与されるとき、神経病症性疼痛の動物モデルにおいてガバペンチノイドがＶＭ２０２に有害な影響を及ぼすということを発見した。ＶＭ２０２と共に投与されたか、或いはＶＭ２０２投与直後に投与されたガバペンチノイドの前記抑制効果はガバペンチノイドの中断後にも持続した。しかし、ＶＭ２０２を投与して１週以上経過した後に投与されたガバペンチノイドは、ＶＭ２０２の治療効果に影響を与えなかった。これらの結果は、ＶＭ２０２の治療効能（ｅｆｆｉｃａｃｙ）及び効果（ｐｏｔｅｎｃｙ）を最大化するためには、ＶＭ２０２投与前、投与中及び投与後の何日の間はガバペンチノイド治療を中断することが重要であることを示唆する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

したがって、第１態様において、ガバペンチノイドを投与した患者において、ＨＧＦ（例えば、ＶＭ２０２）の異型体をコードする核酸コンストラクトで神経病症を治療する方法が提示される。

【0009】

具体的に、前記方法は、核酸コンストラクトの投与前、投与中及び投与後の特定期間の間にガバペンチノイドの投与を中断することを含む。したがって、本発明は、ガバペンチノイドによる干渉を避けることによって、特定患者集団にとってより良好な治療結果を達成できる新規な方法を提供する。

【0010】

具体的に、本発明の一部の具現例は、次の段階を含む神経病症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）治療方法に関する：（１）ガバペンチノイドを投与された神経病症患者を選択する段階、（２）前記患者へのガバペンチノイド投与を中断する段階、及び（３）前記患者にＶＭ２０２を投与する段階。一部の具現例において、前記方法は、ＶＭ２０２投与段階後に少なくとも１週間の間にガバペンチノイド投与を保留する段階をさらに含む。一部の具現例において、前記方法は、ＶＭ２０２投与段階後に少なくとも１０日間の間にガバペンチノイド投与を保留する段階をさらに含む。

【0011】

一部の具現例において、前記ガバペンチノイド投与を中断する段階は、ガバペンチノイド投与を次第に減少させること（ｔａｐｅｒｉｎｇ）を含む。一部の具現例において、ＶＭ２０２を投与する段階は、ガバペンチノイド投与が完全に中断された後に行われる。一部の具現例において、前記ＶＭ２０２を投与する段階は、ガバペンチノイド投与が完全に中断されて少なくとも１日、２日、３日、５日、７日、１４日、２１日、３０日、６０日又は９０日後に行われる。

【0012】

一部の具現例において、前記神経病症は、糖尿病性末梢神経病症である。一部の具現例において、前記神経病症は、帯状疱疹後神経病症（ｐｏｓｔ－ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）である。

【0013】

一部の具現例において、前記ガバペンチノイドは、ガバペンチン又はプレガバリンである。

【0014】

一部の具現例において、前記ＶＭ２０２を投与する段階は、患者の患肢（ａｆｆｅｃｔｅｄ ｌｉｍｂ）当たり８ｍｇのＶＭ２０２を複数回の筋肉内注射及び複数回の訪問で同等に分けて投与することを含み、所定の１回の訪問における複数回の筋肉内注射のそれぞれは、離隔した注射部位で行われる。

【0015】

一部の具現例において、ＶＭ２０２は、１６ｍｇの容量が６４回の筋肉内注射で均等に分けて投与され、ここで、１６回筋肉内注射は、一番目の訪問において一番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、他の１６回筋肉内注射は、一番目の訪問において二番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、他の１６回筋肉内注射は、二番目の訪問において一番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、他の１６回筋肉内注射は、二番目の訪問において二番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、このとき、６４回の筋肉内注射のそれぞれは、０．５ｍｌ体積中の０．２５ｍｇのＶＭ２０２を用いて行われる。

【0016】

他の態様において、本発明は、次の段階を含む、ＶＭ２０２を投与して神経病症を治療する方法を提供する：ガバペンチノイドを投与された神経病症患者を選択する段階；前記患者へのガバペンチノイド投与を中断する段階；及び、その後、前記患者にＶＭ２０２を投与する段階。

【0017】

さらに他の態様において、本発明は、次の段階を含む神経病症を治療する方法を提供する：神経病症の患者にここ１週間（ｗｅｅｋ）内にガバペンチノイドが投与されたか否かを決定する段階；患者にここ１週間内にガバペンチノイドが投与された場合、患者へのガバペンチノイド投与を中断した後、患者にＶＭ２０２を投与する段階；及び患者にここ１週間内にガバペンチノイドが投与されなかった場合、患者にＶＭ２０２を投与する段階。

【0018】

また、ガバペンチノイドを投与された患者における神経病症治療方法に使用するための、ＨＧＦ異型体をコードする核酸コンストラクト（例えば、ＶＭ２０２）が提供され、前記方法は、患者へのガバペンチノイドの投与を中断する段階、及び患者に核酸コンストラクトを投与する段階を含む。一部の具現例は、神経病症を治療する方法に使用するための、ＨＧＦ異型体をコードする核酸コンストラクト（例えば、ＶＭ２０２）を提供し、前記方法は、ガバペンチノイドを投与された神経病症患者を選択する段階、前記患者へのガバペンチノイドを中断する段階、及び前記患者に核酸コンストラクトを投与する段階。一部の具現例は、神経病症を治療する方法に使用するための、ＨＧＦ異型体をコードする核酸コンストラクト（例えば、ＶＭ２０２）を提供し、前記方法は、ガバペンチノイドを投与された神経病症患者を選択する段階、ガバペンチノイドの中断後にのみ核酸コンストラクトを投与する段階、及び少なくとも１週間の間に追加容量のガバペンチノイドを投与しない段階を含む。

【0019】

また、ガバペンチノイドを投与された患者において神経病症の治療のための医薬（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）を調製するための、ＨＧＦの異型体をコードする核酸コンストラクト（例えば、ＶＭ２０２）の用途（ｕｓｅ）が提供される。

【0020】

一部の具現例は、ガバペンチノイドを投与された患者において神経病症を治療するための医薬（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）の調製のための核酸コンストラクトの用途（ｕｓｅ）に関するが；ガバペンチノイド投与が中断されたか、中断中であるか、中断されるだろう。一部の具現例は、ガバペンチノイドを投与された患者において神経病症を治療するための医薬（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）の調製のための核酸コンストラクトの用途に関するが、前記核酸コンストラクトの投与前及び投与後に少なくとも１週間の間にガバペンチノイド投与が中断されるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1A】図１Ａは、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２（５）：４６５－４７８（２０１５）から再現されたものであり、高用量ＶＭ２０２（０日目における脚当たり８ｍｇ、１４日目における脚当たり８ｍｇ；両訪問及び両脚にわたる総容量、３２ｍｇ）、低容量ＶＭ２０２（０日目における脚当たり４ｍｇ、１４日目における脚当たり４ｍｇ；両訪問及び両脚にわたる総容量、１６ｍｇ）、又は食塩水（プラシーボ）を投与して３月、６月、及び９月後の第２相臨床試験における全患者から測定した疼痛レベルにおける経時的変化（ｔｉｍｅ－ｃｏｕｒｓｅ ｃｈａｎｇｅ）を示す。

【図1B】図１Ｂは、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２（５）：４６５－４７８（２０１５）から再現されたものであり、高用量ＶＭ２０２、低容量ＶＭ２０２、又は食塩水（プラシーボ）を投与して３月、６月、及び９月後のリリカ（Ｌｙｒｉｃａ；ｐｒｅｇａｂａｌｉｎ）及び／又はニューロンチン（Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ；ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ）を服用しなかった患者のグループから測定した疼痛レベルにおける経時的変化（ｔｉｍｅ－ｃｏｕｒｓｅ ｃｈａｎｇｅ）を示す。リリカ及び／又はニューロンチンを服用しなかった患者（図１Ｂ）は、低容量ＶＭ２０２の投与後、一般に総患者グループ（ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｇｒｏｕｐ）（図１Ａ）に比べて基準線（ｂａｓｅｌｉｎｅ）から疼痛の大きな減少を経験した。

【図2】図２は、慢性収縮損傷（ＣＣＩ）マウスを用いてＶＭ２０２媒介疼痛減少に対するガバペンチンの効果を試験するための実験手順を示す。坐骨神経（ＣＣＩ又はｓｈａｍ）に対する手術手順を行い、０日目に５週齢雄マウスにプラスミド（ｐＣＫ又はＶＭ２０２）を投与し、１日目から１５日目までマウスにガバペンチン又はＰＢＳを毎日注射し、それらの疼痛レベルはフォンフレイフィラメントテスト（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｔｅｓｔ）によって１４日目から始まって１６日目まで測定された。

【図3】図３は、４個の異なる動物グループで測定された疼痛レベル（ｙ－軸における足逃避反応頻度（ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）％）を示す。（ａ）慢性収縮のないシャム（Ｓｈａｍ）動物は全経過時間において低いレベルの疼痛を示した（“Ｓｈａｍ”、ダイアモンドを有する線）；（ｂ）ガバペンチンを毎日注射せず、ｐＣＫを注射したＣＣＩ－動物は、持続的に高いレベルの疼痛を示した（“ｐＣＫ－ＰＢＳ”、三角形を有する線）；（ｃ）ガバペンチンを毎日注射し、ｐＣＫを注射したＣＣＩ－動物は、ガバペンチン投与の直後に疼痛レベルが一時的に減少した（“ｐＣＫ＋ガバペンチン”、丸を有する線）；及び（ｄ）毎日ガバペンチンを注射せず、ＶＭ２０２を注射したＣＣＩ－動物は、低いレベルの疼痛を示した（“ＶＭ２０２”、ｘを有する線）。

【図4】図４は、４個の異なる動物グループで測定された疼痛レベル（ｙ－軸における足逃避反応頻度（ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）％）を示す。（ａ）慢性収縮のないシャム動物は、全経過時間において低いレベルの疼痛を示した（“Ｓｈａｍ”、ダイアモンドを有する線）；（ｂ）ガバペンチンを毎日注射せず、ｐＣＫを注射したＣＣＩ－動物は、高いレベルの疼痛を示した（“ｐＣＫ－ＰＢＳ”、三角形を有する線）；（ｃ）ガバペンチンを毎日注射せず、ＶＭ２０２を注射したＣＣＩ－動物は、低いレベルの疼痛を示した（“ＶＭ２０２”、ｘを有する線）、（ｄ）毎日ガバペンチンを投与し、ＶＭ２０２を注射したＣＣＩ－動物は、ガバペンチンを投与した直後に疼痛が一時的に減少し、その後、疼痛レベルが急激に増加してから漸次減少した。

【図5】図５は、神経損傷マウス（ｎｅｒｖｅ ｃｒｕｓｈ ｍｏｕｓｅ）モデルにおいてＶＭ２０２媒介神経再生に対するガバペンチン効果をテストするための実験手順を示す。神経損傷を誘導し、１日目にＶＭ２０２を９週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、ガバペンチンを２日目から６日目まで毎日注射し、７日目に神経ピンチテスト（ｎｅｒｖｅ ｐｉｎｃｈ ｔｅｓｔ）を行った。

【図6】図６は、神経損傷マウスモデルで測定された神経再生（例えば、再生された神経の長さ（ｍｍ））を示す。棒は、左側から右側まで（ｉ）ＶＭ２０２に対する陰性対照区（ｐＣＫベクター）及びガバペンチンに対する陰性対照区（ＰＢＳを毎日注射）；（ｉｉ）ＶＭ２０２及び毎日注射されたＰＢＳ；（ｉｉｉ）ｐＣＫ及び毎日注射されたガバペンチン；及び（ｉｖ）ＶＭ２０２及び毎日注射されたガバペンチンが投与されたマウスにおける神経再生の程度を示す。ＶＭ２０２で処理したマウスは、ＰＢＳ又はガバペンチンで処理したか否かに関係なく、より有意な神経再生を示した。しかし、ＶＭ２０２媒介の神経再生は、ガバペンチンで処理したマウスに比べてＰＢＳで処理した対照区マウスにおいてより有意に改善された。

【図7A】図７Ａは、ＰＢＳ又はガバペンチンを毎日注射したシャムマウス（レーン１及び４）；ｐＣＫを注射し、さらにＰＢＳ又はガバペンチンを毎日注射した神経損傷マウス（レーン２及び５）；及びＶＭ２０２を処理し、さらにＰＢＳ又はガバペンチンを毎日注射した神経損傷マウス（レーン３及び６）から得られたタンパク質サンプルのウェスタンブロット分析の結果を示す。ｃ－Ｊｕｎ（上段）及びＧＡＰＤＨ（下段）の発現は、それぞれのタンパク質に特異的な抗体によって検出された。

【図7B】図７Ｂは、それぞれのサンプルにおけるｃ－Ｊｕｎ発現の相対的なレベルを示し、ｃ－Ｊｕｎのバンド強度を測定することによって計算され、該強度とＧＡＰＤＨのバンド強度とを比較した。

【図8A】図８Ａは、ＶＭ２０２投与後、一番目の２週間又は二番目の２週間（３～４週間）の間にガバペンチンでさらに処理したとき、ＣＣＩマウスでＶＭ２０２媒介の疼痛減少をテストするための実験手順を示す。

【図8B】図８Ｂは、４個の異なる動物グループにおける疼痛レベル（足逃避反応頻度（ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、反応の＃）を示す。（ａ）慢性収縮のないシャム動物は、全経過時間にわたって低いレベルの疼痛を示し（“Ｓｈａｍ”）、（ｂ）ガバペンチンを毎日注射せず、ｐＣＫを注射したＣＣＩ－動物は、高いレベルの疼痛を示し（“ＣＣＩ－ｐＣＫ”）、（ｃ）毎日ガバペンチンを注射せず、ＶＭ２０２を注射したＣＣＩ－動物は、低いレベルの疼痛を示し（“ＶＭ２０２”）、（ｄ）最初の２週間の間に毎日ガバペンチンを投与し、ＶＭ２０２を注射したＣＣＩ－動物は、高いレベルの疼痛を示し（“ＣＣＩ－ＶＭ２０２－Ｇａｂａ１”）、及び（ｅ）二番目の２週間の間に毎日ガバペンチンを投与し、ＶＭ２０２を注射したＣＣＩ－動物は、低いレベルの疼痛を示した（“ＣＣＩ－ＶＭ２０２－Ｇａｂａ２”）。

【図9A】図９Ａは、ＶＭ２０２投与後、０日目（“ＧＰ１”）、３日目（“ＧＰ２”）、７日目（“ＧＰ３”）、又は１０日目（“ＧＰ４”）から始まったガバペンチンの毎日注射でさらに処理されたＣＣＩマウスにおけるＶＭ２０２媒介の疼痛減少を試験するための実験手順を示す。

【図9B】図９Ｂは、６個の異なる動物グループから測定した疼痛レベル（ｙ－軸における足逃避反応頻度％）を示す。（ａ）ＶＭ２０２を注射せず、ガバペンチンを毎日注射したＣＣＩ－動物は、高いレベルの疼痛を示し、（ｂ）ＶＭ２０２を注射し、ガバペンチンを毎日注射しなかったＣＣＩ－動物は、低いレベルの疼痛を示し、（ｃ）ＶＭ２０２を注射し、０日目からガバペンチンを毎日注射したＣＣＩ－動物は、高いレベルの疼痛を示し（“ＧＰ１”）、（ｄ）ＶＭ２０２を注射し、３日目からガバペンチンを毎日注射したＣＣＩ－動物は、高いレベルの疼痛を示し（“ＧＰ２”）、（ｅ）ＶＭ２０２を注射し、７日目からガバペンチンを毎日注射したＣＣＩ－動物は、高いレベルの疼痛を示し（“ＧＰ３”）、（ｆ）ＶＭ２０２を注射し、１０日目からガバペンチンを毎日注射したＣＣＩ－動物は、低いレベルの疼痛を示した（“ＧＰ４”）。 全ての値は、３個の独立した実験から平均（ｍｅａｎ）＋標準誤差平均（ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｍｅａｎ；ＳＥＭ）を示す。値間の差は、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡに続くＴｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ－ｈｏｃテストによって決定された。

【0022】

各図面は単に例示の目的で本発明の様々な具現例を示す。当業者にとっては、後述する議論から、本明細書に示された構造及び方法の代案的な具現例が、本明細書に説明された本発明の原理を逸脱することなく採用され得るということが容易に認識できよう。

【発明を実施するための形態】

【0023】

１．定義
特に定義されない限り、本願に使われた全ての技術及び科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者に一般的に理解される意味を有する。本明細書で使われている通り、次の用語は、次に説明される意味を有する。

【0024】

本願に使われた用語“ガバペンチノイド”は、抑制性神経伝達物質γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の誘導体である薬物部類を指し、α２δサブユニット含有電圧依存性カルシウムチャネルを遮断する。ガバペンチノイドは、ガバペンチン（Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ）及びプレガバリン（Ｌｙｒｉｃａ）のような臨床的に承認されたガバペンチノイドだけでなく、ガバペンチンプロドラッグ、ガバペンチンエナカルビル（Ｈｏｒｉｚａｎｔ）も含むが、これに制限されない。

【0025】

本明細書で使われた用語“中断（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｅ）”は、薬物投与の持続を断絶（ｂｒｅａｋｉｎｇ）させる過程を意味する。これは、突然な投与終了及び特定期間にわたって投与量及び／又は頻度を減少させることによる投与終了を含むが、これに制限されるものではない。しばしば、前記過程は、投与の量及び／又は頻度の一時的増加、減少又は維持を含むことができる。また、前記過程は、一つのガバペンチノイドから他のガバペンチノイドへの転換を含むことができる。

【0026】

本明細書で使われた用語“漸減（ｔａｐｅｒ）”は、終了（ｅｎｄ）まで薬物投与の量又は頻度を次第に減少させて薬物投与を中断する方法を意味する。

【0027】

本明細書で使われた用語“ＨＧＦの異型体（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）”は、動物から自然的に発生するＨＧＦポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。前記用語は、所定の全長野生型ＨＧＦ（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＨＧＦ）ポリペプチドと少なくとも８０％同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、自然発生ＨＧＦ対立遺伝子変異体（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ＨＧＦ ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）、スプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ）、又は欠失変異体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｔ）と少なくとも８０％同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明における使用に好適なＨＧＦの異型体は、全長ＨＧＦ（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＨＧＦ；ｆｌＨＧＦ）（同意語として、ｆＨＧＦ）、欠失変異体ＨＧＦ（ｄｅｌｅｔｅｄ ｖａｒｉａｎｔ ＨＧＦ；ｄＨＧＦ）、ＮＫ１、ＮＫ２、及びＮＫ４からなる群から選ばれる２つ以上の異型体を含む。本発明のより好ましい具現例によれば、本明細書に記載された方法で用いられるＨＧＦの異型体は、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦを含む。

【0028】

ヒトＨＧＦタンパク質の１－７２８アミノ酸で構成されたタンパク質を称するために、用語“ヒトｆｌＨＧＦ”、“ｆｌＨＧＦ”及び“ｆＨＧＦ”が同じ意味で使われる。ｆｌＨＧＦの配列は、配列番号１に提供されている。

【0029】

用語“ヒトｄＨＧＦ”及び“ｄＨＧＦ”は、ヒトＨＧＦ遺伝子の選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって生産されたＨＧＦタンパク質の欠失変異体を意味するもので、同じ意味で使用される。具体的に“ヒトｄＨＧＦ”又は“ｄＨＧＦ”は、全長ＨＧＦ配列からアルファ鎖の最初クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメインで５個のアミノ酸（Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｓ及びＳ）が欠失されたヒトＨＧＦタンパク質を指す。ヒトｄＨＧＦは、長さ７２３のアミノ酸である。ヒトｄＨＧＦのアミノ酸配列は、配列番号２に提供される。

【0030】

本明細書で使われた用語“ＶＭ２０２”とは、ｐＣＫベクターにクローニングされたＨＧＦ－Ｘ７であるｐＣＫ－ＨＧＦ－Ｘ７（配列番号１１）とも呼ばれるプラスミドＤＮＡを指す。ＶＭ２０２は、ブダペスト条約によって２００２年３月１２日付に受託番号ＫＣＣＭ－１０３６１として韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託された。

【0031】

本明細書で使われた用語“ベクター”とは、核酸のクローニング及び／又は宿主細胞内への核酸の伝達のための任意のビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）を指す。ベクターは特にプラスミド、ウイルスベクター、リポプレックス（カチオン性リポソーム－ＤＮＡ複合体）、ポリプレックス（カチオン性ポリマー－ＤＮＡ複合体）、及びタンパク質－ＤＮＡ複合体を含む。

【0032】

本明細書で使われた用語“発現ベクター”とは、宿主への形質転換後に挿入された核酸配列の発現が可能となるようにデザインされたベクターを指す。

【0033】

用語“再構成された（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）”又は“再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）”は、例えば、保存及び貯蔵のために以前に変更された物質の再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）による原形（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｆｏｒｍ）への復元、例えば、以前に乾燥し貯蔵されたＤＮＡプラスミド剤形の液状（ｌｉｑｕｉｄ ｓｔａｔｅ）への復元を指す。本発明の凍結乾燥した組成物は、投与に適した、安定であるとともに単一分散された溶液を製造する任意の水溶液で再構成され得る。このような水溶液は次を含むが、これに制限されない：滅菌水（ｓｔｅｒｉｌｅ ｗａｔｅｒ）、ＴＥ、ＰＢＳ、トリスバッファ又は生理食塩水。

【0034】

本発明の方法で再構成された凍結乾燥ＤＮＡの濃度は、伝達される剤形の量、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の年齢及び体重、伝達方法とルート、及び伝達される抗原の免疫原性を含む諸要因によって調整される。

【0035】

本明細書で使われた用語“治療”とは、（ａ）神経病症性疼痛抑制；（ｂ）神経病症性疼痛の緩和；及び（ｃ）神経病症性疼痛の除去を意味する。一部の具現例において、本発明の組成物は、神経細胞の成長又は神経細胞死滅の抑制によって神経病症性疼痛を治療することができる。

【0036】

本明細書で使われた用語“治療学的有効服量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）”又は“有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）”は、所望の効果を生成する投与される服量（ｄｏｓｅ）又は量（ａｍｏｕｎｔ）を指す。この方法に照らして、治療学的有効量は、神経病症の症状を治療するために効果的な量である。正確な服量（ｄｏｓｅ）又は量（ａｍｏｕｎｔ）は治療の目的に依存し、公知の技術（参照：例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９） Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ）を用いて当業者によって確認され得る。

【0037】

本明細書で使われた用語“十分量（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｍｏｕｎｔ）”は、所望の効果を生成するに十分な量を指す。

【0038】

本明細書で使われた用語“縮退配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”は、レファレンス核酸配列から翻訳されたのと同じ核酸配列を提供するために翻訳され得る核酸配列を指す。

【0039】

２．他の解釈規則
本明細書で引用された範囲は、短縮したものと理解される。
例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０から構成された群からの任意の数、数の組合せ、又は下位範囲を含むものと理解される。

【0040】

特に表示されない限り、一つ以上の立体中心（ｓｔｅｒｅｏｃｅｎｔｅｒ）を有する化合物に対する言及は、それぞれの立体異性質体及びそれらの立体異性質体の全ての組合せを意味する。

【0041】

３．ガバペンチノイドを投与された患者において神経病症を治療する方法
一態様において、ガバペンチノイドを投与された患者において神経病症を治療するための方法が提示される。これらの方法は、ガバペンチノイドを投与された神経病症を有する患者を選択する段階、ガバペンチノイド投与を中断する段階、及びヒトＨＧＦタンパク質の２つの異型体を発現する核酸コンストラクトの治療学的有効量を投与する段階を含む。好ましい具現例において、核酸コンストラクトは、ＶＭ２０２である。

【0042】

３．１．神経病症を持つ患者
本願に記載された方法において、治療のために選択された患者は神経病症を持つ。前記患者は、末梢神経病症（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、脳神経病症（ｃｒａｎｉａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、自律神経病症（ａｕｔｏｎｏｍｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）又は局所神経病症（ｆｏｃａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）を有し得る。神経病症は、疾病、負傷、感染又はビタミン欠乏状態によって発生し得る。例えば、神経病症は、糖尿病、ビタミン欠乏、自己免疫疾患、遺伝の（ｇｅｎｅｔｉｃ）又は遺伝的（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ）障害、アミロイド症（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）、毒素（ｔｏｘｉｎｓ）又は毒（ｐｏｉｓｏｎｓ）、外傷（ｔｒａｕｍａ）又は傷害（ｉｎｊｕｒｙ）、腫瘍（ｔｕｍｏｒｓ）によって誘発されるか、特発性（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ）であり得る。

【0043】

本好ましい具現例において、患者は糖尿病性末梢神経病症を持つ。

【0044】

３．２．ガバペンチノイドを投与された患者
ガバペンチノイドを投与された患者は、従来知られた様々な方法によって選択され得る。例えば、標準化したアンケートに対する応答の一部として又はインタビュー時に患者又は患者の保護者から得られた情報に基づいて選択することができる。前記選択はまた、患者に関する医療、臨床、処方、又は保険記録、又は他の記録、又は患者のための医療専門家から得た情報に基づいてもよい。選択に関連している情報は、投与された薬物の名、及びその服量、頻度、投与経路、最初投与日、最終投与日などを含むが、これに制限されない。選択的に、前記選択は、血液検査のような診断によって得られた情報に基づいてもよい。

【0045】

一部の具現例において、患者のガバペンチノイドへの最後の露出は、選択時点３ケ月未満前の日であろう。一部の具現例において、患者のガバペンチノイドへの最後の露出は、選択時点前の１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、又は８週未満である。一部の具現例において、前記患者のガバペンチノイドへの最後の露出は、選択時点前の１日、５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、又は５０日未満である。

【0046】

一部の具現例において、患者のガバペンチノイドへの最後の露出は、ＶＭ２０２の最初投与時点の３ケ月未満前である。一部の具現例において、患者のガバペンチノイドへの最後の露出は、ＶＭ２０２の最初投与時点の１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、又は８週未満前である。一部の具現例において、患者のガバペンチノイドへの最後の露出は、ＶＭ２０２の最初投与時点の１日、５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、又は５０日未満前である。

【0047】

一部の具現例において、処方服量（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｄｏｓｅ）の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多いガバペンチノイドへの患者の最後の露出は、選択時点の３ケ月未満前である。一部の具現例において、処方服量（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｄｏｓｅ）の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多いガバペンチノイドへの患者の最後の露出は、選択時点の１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、又は８週未満前である。一部の具現例において、処方服量（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｄｏｓｅ）の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多いガバペンチノイドへの患者の最後の露出は、選択時点の１日、５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、又は５０日未満前である。

【0048】

一部の具現例において、処方服量（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｄｏｓｅ）の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多いガバペンチノイドへの患者の最後の露出は、ＶＭ２０２最初投与時点の３ケ月未満前である。一部の具現例において、処方服量（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｄｏｓｅ）の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多いガバペンチノイドへの患者の最後の露出は、ＶＭ２０２最初投与時点の１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、又は８週未満前である。一部の具現例において、処方服量（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｄｏｓｅ）の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多いガバペンチノイドへの患者の最後の露出は、ＶＭ２０２最初投与時点の１日、５日、１０日、１５日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、又は５０日未満前である。

【0049】

一部の具現例において、ガバペンチノイドに３日、５日、７日、１４日、２１日、２８日又は３５日間以上事前露出された患者が、ガバペンチノイドを投与されてきた患者として選択される。一部の具現例において、ガバペンチノイドに２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、又は１８ヶ月間以上事前露出された患者が、ガバペンチノイドを投与されてきた患者として選択される。

【0050】

一部の具現例において、処方服量（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｄｏｓｅ）の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多いガバペンチノイドに３日、５日、７日、１４日、２１日、２８日又は３５日間以上事前露出された患者が、ガバペンチノイドを投与されてきた患者として選択される。一部の具現例において、処方服量（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｄｏｓｅ）の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％より多いガバペンチノイドに対して２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、又は１８ヶ月間以上事前露出された患者が、ガバペンチノイドを投与されてきた患者として選択される。

【0051】

３．３．ガバペンチノイドの中断（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕａｔｉｏｎ）
患者が選択されると、ガバペンチノイド投与は中断される。一部の具現例において、ガバペンチノイド投与は中断される。一部の具現例において、ガバペンチノイド投与は、ガバペンチノイド投与を完全に中止させることによって中断される。

【0052】

一部の具現例において、ガバペンチノイド投与は、ガバペンチノイド投与を漸減（ｔａｐｅｒｉｎｇ）させることによって中断される。一部の具現例において、ガバペンチノイドの服量は、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、又は８週間にわたって減少する。一部の具現例において、ガバペンチノイドの服量は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、又は５ヶ月間にわたって減少する。一部の具現例において、ガバペンチノイド投与の頻度は、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、又は８週間にわたって減少する。一部の具現例において、ガバペンチノイド投与の頻度は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、又は５ヶ月間にわたって減少する。

【0053】

様々な具現例において、ガバペンチノイド投与は、週当たり１０～１００ｍｇ、週当たり２０～１００ｍｇ、週当たり２０～９０ｍｇ、週当たり３０～８０ｍｇ、週当たり４０～８０ｍｇ、週当たり５０～７５ｍｇ、週当たり５５～７０ｍｇ、週当たり５５～６５ｍｇ、又は週当たり約６０ｍｇ減少する。

【0054】

一部の具現例において、ガバペンチノイド投与は、４日ごとに５００ｍｇ、４日ごとに４５０ｍｇ、４日ごとに４００ｍｇ、４日ごとに３５０ｍｇ、４日ごとに３００ｍｇ、４日ごとに２５０ｍｇ、４日ごとに２００ｍｇ、４日ごとに１５０ｍｇ、４日ごとに１００ｍｇ、又は４日ごとに５０ｍｇ未満の比率で減少する。

【0055】

一部の具現例において、ガバペンチノイド投与は、３日ごとに５００ｍｇ、３日ごとに４５０ｍｇ、３日ごとに４００ｍｇ、３日ごとに３５０ｍｇ、３日ごとに３００ｍｇ、３日ごとに２５０ｍｇ、３日ごとに２００ｍｇ、３日ごとに１５０ｍｇ、３日ごとに１００ｍｇ、又は３日ごとに５０ｍｇ未満の比率で減少する。

【0056】

一部の具現例において、２日ごとに５００ｍｇ、２日ごとに４５０ｍｇ、２日ごとに４００ｍｇ、２日ごとに３５０ｍｇ、２日ごとに３００ｍｇ、２日ごとに２５０ｍｇ、２日ごとに２００ｍｇ、２日ごとに１５０ｍｇ、２日ごとに１００ｍｇ、２日ごとに５０ｍｇ、２日ごとに２５ｍｇ、２日ごとに１０ｍｇ、又は２日ごとに５ｍｇ未満の比率で減少する。

【0057】

一部の具現例において、毎日５００ｍｇ、毎日４５０ｍｇ、毎日４００ｍｇ、毎日３５０ｍｇ、毎日３００ｍｇ、毎日２５０ｍｇ、毎日２００ｍｇ、毎日１５０ｍｇ、毎日１００ｍｇ、毎日５０ｍｇ、毎日２５ｍｇ、毎日１０ｍｇ、毎日５ｍｇ、又は毎日２ｍｇ未満の比率で減少する。

【0058】

一部の具現例において、ガバペンチノイド投与減少の比率は、前記減少に対する患者の反応に基づいて調整される。例えば、特定の比率は、反跳不安（ｒｅｂｏｕｎｄ ａｎｘｉｅｔｙ）、不眠症（ｉｎｓｏｍｎｉａ）、頭痛、神経質（ｎｅｒｖｏｕｓｎｅｓｓ）、憂うつ（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、疼痛（ｐａｉｎ）、発汗増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｗｅａｔｉｎｇ）、目眩（ｄｉｚｚｉｎｅｓｓ）などのような患者の症状除去（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）に基づいて決定され得る。一部の具現例において、特定比率は疼痛（ｐａｉｎ）のような神経病症と関連した症状に基づいて決定され得る。

【0059】

一部の場合に、ガバペンチノイド投与の量は、患者の反応に基づく中断の間に一時的に増加したり或いは同一レベルに維持され得る。例えば、ガバペンチノイド投与の量は、患者の反跳不安（ｒｅｂｏｕｎｄ ａｎｘｉｅｔｙ）、不眠症（ｉｎｓｏｍｎｉａ）、頭痛、神経質（ｎｅｒｖｏｕｓｎｅｓｓ）、憂うつ（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、疼痛（ｐａｉｎ）、発汗増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｗｅａｔｉｎｇ）、目眩（ｄｉｚｚｉｎｅｓｓ）などのような患者の症状除去（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）に基づいて一時的に増加するか又は同一レベルに維持され得る。一部の場合に、ガバペンチノイド投与の量は疼痛のような神経病症に関連した患者の症状に基づいて一時的に増加又は同一レベルに維持され得る。

【0060】

一部の具現例において、ガバペンチノイド投与の減少比率は、ガバペンチノイドへの患者の過去露出に基づいて決定され得る。例えば、特定比率は、ガバペンチノイド投与の容量又は頻度、又はガバペンチノイドへの以前露出の量又は時間に基づいて決定され得る。

【0061】

３．４．２つの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）異型体をコードする核酸コンストラクトの投与
選択された患者に、ヒトＨＧＦタンパク質の２つの異型体を発現する核酸コンストラクトの治療学的有効量が投与される。

【0062】

患者へのガバペンチノイド投与を中断した後、核酸コンストラクトが投与され得る。

【0063】

様々な具現例において、核酸コンストラクトはガバペンチノイド投与の完全な中断後に投与される。一部の具現例において、核酸コンストラクトは、ガバペンチノイド投与を完全に中断して少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、７日、１４日、２１日、３０日、６０日、又は９０日後に投与される。一部の具現例において、核酸コンストラクトは、ガバペンチノイド投与を完全に中断して少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、又は６ヶ月後に投与される。

【0064】

特定具現例において、核酸コンストラクトは、ガバペンチノイド投与の完全な中断後に初めて投与される。一部の具現例において、核酸コンストラクトの初投与は、ガバペンチノイド投与を完全に中断して少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、７日、１４日、２１日、３０日、６０日、又は９０日後である。一部の具現例において、核酸コンストラクトの初投与は、ガバペンチノイド投与を完全に中断して少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、又は８週後である。一部の具現例において、核酸コンストラクトの初投与は、ガバペンチノイド投与を完全に中断して少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、又は６ヶ月後である。

【0065】

一部の具現例において、核酸コンストラクトは、ガバペンチノイド投与を次第に減少させる間に初めて投与される。一部の具現例において、核酸コンストラクトの初回の服量は、漸減療法（ｔａｐｅｒｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎ）の０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、２１日、２８日、又は３５日目に投与される。特定の具現例において、核酸コンストラクトの初回の服量は漸減プロセスの１週、２週、３週、４週、５週、又は６週に投与される。一部の具現例において、核酸コンストラクトの初回の服量は、ガバペンチノイド投与を完全に中断して０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１４日、２１日、２８日、又は３５日後に投与される。

【0066】

一部の具現例において、２つの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）異型体を発現する核酸コンストラクトの投与後、ガバペンチノイドは少なくとも４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日間再び投与されない。一部の具現例において、２つの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）異型体を発現する核酸コンストラクトの投与後、ガバペンチノイドは少なくとも１週、２週、３週、４週、又は５週間再び投与されない。一部の具現例において、２つの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）異型体を発現する核酸コンストラクトの投与後、ガバペンチノイドは５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日間再び投与されない。一部の具現例において、２つの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）異型体を発現する核酸コンストラクトの投与後、ガバペンチノイドは少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２４ヶ月又は３６ヶ月間再び投与されない。

【0067】

一部の具現例において、２つの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）異型体を発現する核酸コンストラクトは、複数の訪問で投与される。この場合に、ガバペンチノイドの投与は各訪問前に中断される。一部の具現例において、ガバペンチノイドは各訪問前の少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、又は６週間投与されない。一部の具現例において、ガバペンチノイドは各訪問前の少なくとも５日、６日、７日、８日、９日、１０日又は１５日間投与されない。一部の具現例において、ガバペンチノイドは、各訪問後に少なくとも１週、２週、３週、４週、５週、又は６週間投与されない。一部の具現例において、ガバペンチノイドは、各訪問後に少なくとも５日、６日、７日、８日、９日、１０日又は１５日間投与されない。一部の場合に、複数の訪問中ずっと、核酸コンストラクト投与の完了までガバペンチノイドは投与されない。

【0068】

３．５．２つの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）異型体を発現する核酸コンストラクト
本明細書に記載された方法において、核酸コンストラクトは、ヒトＨＧＦタンパク質の少なくとも２つの異型体を発現する。一部の具現例において、前記核酸コンストラクトは２つの異型体を発現する。典型的な具現例において、前記核酸コンストラクトは少なくとも一つのｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦを発現する。特定の具現例において、前記核酸コンストラクトはｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦの両方を発現する。

【0069】

３．５．１．発現された配列（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）
一部の具現例において、前記コンストラクトは、各異型体コーディング配列（ＣＤＳ）に対する発現調節配列を含むことによって２つ又はそれ以上のＨＧＦ異型体を発現する。一部の具現例において、前記コンストラクトは、例えば、（１）発現調節配列－（２）一番目の異型体のコーディング配列－（３）ＩＲＥＳ－（４）二番目の異型体のコーディング配列－（５）転写終結配列の順に、２つのコーディング配列間のＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を含む。ＩＲＥＳはＩＲＥＳ配列において翻訳が始まるようにし、単一コンストラクトから関心の２つの遺伝子の発現を可能にする。さらに他の具体例において、それぞれＨＧＦの単一異型体をコードする複数のコンストラクトは、投与された対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）においてＨＧＦの１つ以上の異型体の発現を誘導するために共に使用される。

【0070】

本方法の好ましい具現例は、選択的なスプライシング部位を含むことによって、ＨＧＦの２つ又はそれ以上の他の類型の異型体－例えば、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ－を同時に発現するコンストラクトを使用する。選択的スプライシングを通じたＨＧＦの２つの異型体（ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）をコードするコンストラクトが１つのＨＧＦ異型体をコードするコンストラクトに比べてより多い（略２５０倍高い）発現効率（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を有するということが、本明細書に参照として統合された米国特許第７，８１２，１４６号で既に知られたことがある。典型的な具現例において、前記コンストラクトは、（１）ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン１～４を含む一番目の配列又は該一番目の配列の縮退配列；（２）ヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４を含む二番目の配列又は該二番目の配列の断片；及び（３）ヒトＨＧＦ遺伝子のエクソン５～１８を含む三番目の配列又は該三番目の配列の縮退配列を含む。前記コンストラクトから、エクソン４とエクソン５との間の選択的なスプライシングによってＨＧＦの２つの異型体（ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）が生成され得る。

【0071】

一部の具現例において、前記コンストラクトはイントロン４の全体配列を含む。一部の具現例において、前記コンストラクトはイントロン４の断片を含む。好ましい具現例において、前記コンストラクトは、配列番号３～１０からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む。前記配列番号３のヌクレオチド配列は、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦをコードする７１１３ｂｐポリヌクレオチドに相応し、イントロン４の全体配列を含む。配列番号４～１０のヌクレオチド配列は、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦをコードするポリヌクレオチドに相応し、イントロン４の様々な断片を含む。

【0072】

ヒトＨＧＦのエクソン１～１８に相応するｃＤＮＡ及びヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４又はその断片を含む様々な核酸コンストラクトは“ＨＧＦ－Ｘ”と命名され、米国特許第７，８１２，１４６号で記述された通り、固有番号が続く。出願人によってテストされたＨＧＦ－Ｘは、配列番号３～１０のヌクレオチド配列を有するＨＧＦ－Ｘ１、ＨＧＦ－Ｘ２、ＨＧＦ－Ｘ３、ＨＧＦ－Ｘ４、ＨＧＦ－Ｘ５、ＨＧＦ－Ｘ６、ＨＧＦ－Ｘ７、及びＨＧＦ－Ｘ８を含むが、これに制限されない。

【0073】

ＨＧＦの２つの異型体（例えば、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）はそれぞれのコンストラクトからエクソン４及びエクソン５間の選択的なスプライシングによって生成され得るということが既に立証された。しかも、様々なＨＧＦコンストラクトのうち、ＨＧＦ－Ｘ７は、その全体内容が参照として本明細書に統合された米国特許第７，８１２，１４６号に開示された通り、ＨＧＦの２つの異型体（例えば、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）の最高の発現レベルを示す。したがって、ＨＧＦ－Ｘ７を含む核酸コンストラクトを、本発明の方法の好ましい具現例において用いることができる。

【0074】

特に好ましい具現例において、ｐＣＫ－ＨＧＦ－Ｘ７（“ＶＭ２０２”とも表記される）（配列番号１１）が、本明細書に記載された方法で用いられる。ｐＣＫ－ＨＧＦ－Ｘ７はブダペスト条約によって２００２年３月１２日付に受託番号ＫＣＣＭ－１０３６１として韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託された。

【0075】

本明細書に記載された方法で用いられるＨＧＦ異型体のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、さらに、野生型ヒトＨＧＦ異型体の配列と実質的に同じアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を含むことができる。実質的な同一性は少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％同一性、及び最も好ましくは少なくとも９５％同一性を有する配列を含み、前記野生型ヒトＨＧＦ異型体のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列は、他の配列に対して最大限にアラインされる。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野でよく知られている。具体的には、米国国立生物学情報センター（NCBl、Bethesda、Md）ウェブサイトのNCBI基本ローカルアラインメント検索ツール（BLAST）に開示されており、且つシーケンス分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、ｔｂｌａｓｔｘに関連して使用され得る配列アルゴリズムを、相同性を決定するために用いることができる。

【0076】

３．５．２．ベクター
本発明の方法で用いられるコンストラクトは、発現された配列に作動的に連結された１つ又はそれ以上の調節配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）を有するベクターを典型的に含む。

【0077】

ＨＧＦタンパク質の１つ又はそれ以上の異型体をコードするポリヌクレオチドは、発現コンストラクト内のプロモーターに作動的に連結されることが好ましい。用語“作動的に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”とは、核酸発現調節配列（プロモーター、信号配列、又は転写因子結合部位のアレイのような）と二番目の核酸配列間の機能的連結を意味し、前記発現調節配列は、前記二番目の配列に相応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を与える。

【0078】

典型的な具現例において、ポリヌクレオチドに連結されたプロモーターは、好ましくは動物内で、より好ましくは哺乳動物細胞内で、ポリヌクレオチドの転写を制御するために作動でき、哺乳動物細胞のゲノムから又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーターを含み、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、ヒトＩＬ－２遺伝子プロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモーター、ヒトＩＬ－４遺伝子プロモーター、ヒトリンフォトキシン遺伝子プロモーター及びヒトＧＭ－ＣＳＦ遺伝子プロモーターを含むが、これに制限されない。より好ましくは、本発明に有用なプロモーターは、ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）又はＥＦｌアルファプロモーターのＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ｅａｒｌｙ）遺伝子から由来したプロモーターであり、最も好ましくは、ＡＴＧ開始コドン直前の配列にわたるエクソン１及びエクソン２の全体配列を含むｈＣＭＶ ＩＥ遺伝子由来プロモーター／エンハンサー及び５’－ＵＴＲ（非翻訳領域）である。

【0079】

本発明に用いられた発現カセットは、例えば、ウシの成長ホルモン終結剤（ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）（Ｇｉｍｍｉ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：６９８３－６９９８（１９８９））、ＳＶ４０－誘導されたポリアデニル化配列（Ｓｃｈｅｋ，Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：５３８６－５３９３（１９９２））、ＨＩＶ－１ポリＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ，Ｂ．Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１８７０－１８７６（１９９８））、β－グロビンポリＡ（Ｇｉｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ４９：３９９－４０６（１９８７））、ＨＳＶ ＴＫポリＡ（Ｃｏｌｅ，Ｃ．Ｎ．ａｎｄ Ｔ．Ｐ．Ｓｔａｃｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．５Ｂｉｏｌ．５：２１０４－２１１３（１９８５））又はポリオマウイルスポリＡ（Ｂａｔｔ，Ｄ．Ｂａｎｄ Ｇ．Ｇ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４７８３－４７９０（１９９５））を含むポリアデニル化配列を含むことができるが、これに制限されるものではない。

【0080】

３．５．２．１．非ウイルス性ベクター
具体的な具現例において、核酸コンストラクトは、２つ又はそれ以上のＨＧＦ異型体を発現可能な非ウイルス性ベクターである。

【0081】

典型的な具現例において、非ウイルス性ベクターはプラスミドである。現在、好ましい具現例において、プラスミドは、ｐＣＫ、ｐＣＰ、ｐＶＡＸ１又はｐＣＹである。特に好ましい具現例において、プラスミドはｐＣＫであり、詳細な内容はＷＯ２０００／０４０７３７号及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７２：２３０－２３５（２０００）から検索でき、両文献はいずれもその全体が本明細書に参照として挿入される。ｐＣＫで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ（Ｔｏｐ１０－ｐＣＫ）は、ブダペスト条約によって２００３年３月２１日に韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託された（受託番号ＫＣＣＭ－１０４７６）。ｐＣＫ－ＶＥＧＦ１６５で形質転換された大腸菌（すなわち、ＶＥＧＦコーディング配列を有するｐＣＫベクター－Ｔｏｐ１０－ｐＣＫ／ＶＥＧＦ１６５’）は、１９９９年１２月２７日付にブダペスト条約の条件によって韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託された（受託番号：ＫＣＣＭ－１０１７９）。

【0082】

ｐＣＫベクターは、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７２：２３０（２０００）；ＷＯ２０００／０４０７３７号（両文献はその全体が参照として統合される）に詳細に開示されているように、遺伝子、例えばＨＧＦ遺伝子の発現がヒトサイトメガロウイルスのエンハンサー／プロモーター下で調節されるように構成される。ｐＣＫベクターは、人体に対する臨床試験のために使用され、安全性及び効能が確認された（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７８８（２０１１））。

【0083】

特に好ましい具現例において、ＨＧＦ－Ｘ７発現配列を含有するｐＣＫプラスミドは、本発明の方法における核酸コンストラクトとして用いられる。好ましい一具現例であるｐＣＫ－ＨＧＦ－Ｘ７（“ＶＭ２０２”とも表記される）は、ブダペスト条約の条項によって韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に受託番号ＫＣＣＭ－１０３６１で寄託した（前記プラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ菌株の形態で寄託）。

【0084】

３．５．２．２．ウイルス性ベクター
他の具現例において、従来公知された様々なウイルス性ベクターが本発明の１つ又は２つ以上のＨＧＦ異型体タンパク質を運搬し発現することに用いられ得る。例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスを用いて開発したベクターが本発明の一部の具現例で用いられ得る。

【0085】

（ａ）レトロウイルス
比較的大きい外因性遺伝子を運搬できるレトロウイルスは、それらがそれらのゲノムを宿主ゲノムに統合させ、広い宿主スペクトルを有するということから、ウイルス遺伝子伝達ベクターとして用いられてきた。

【0086】

レトロウイルスベクターを構築するために、本発明のポリヌクレオチドは特定ウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて複製欠陥ウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｖｉｒｕｓ）を生成する。ビリオンを生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）及びＷ成分は含まないパッケージング細胞株が構築された（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３－１５９（１９８３））。本発明のポリヌクレオチド、ＬＴＲ及びＷを含有する組換えプラスミドがこの細胞株に導入される時、Ｗ配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写体がウイルス粒子内にパッケージングされるようにし、次いで、培養培地に分泌された（Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ “Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ，” Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ（ｅｄｓ．）、Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４９４－５１３（１９８８））。その後、組換えレトロウイルスを含む培地が収集され、選択的に濃縮され、遺伝子伝達のために利用された。

【0087】

第２世代レトロウイルスベクターを使用した成功的な遺伝子伝達が報告された。Ｋａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１３７３－１３７６（１９９４））は、エンベロープ領域の代わりにＥＰＯ（Ｅｔｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）配列が挿入されて新しい結合特性を有するキメラタンパク質を生産するモロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）の変異体を製造した。同様に、この遺伝子伝達システムは２世代レトロウイルスベクターの構築戦略によって構築され得る。

【0088】

（ｂ）レンチウイルス
レンチウイルスも本発明の一部の具現例で用いられ得る。レンチウイルスはレトロウイルスの下位クラスである。しかし、レンチウイルスは非分裂細胞のゲノムに統合され得るのに対し、レトロウイルスは分裂細胞（ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）だけを感染させることができる。

【0089】

レンチウイルスベクターは通常、いくつかのプラスミドで形質転換されたパッケージング細胞株、一般にＨＥＫ２９３から生産される。プラスミドは、（１）カプシド及び逆転写酵素のようなビリオンタンパク質をコードするプラスミドパッケージング、（２）ターゲットに伝達される外因性遺伝子を含むプラスミドを含む。

【0090】

ウイルスが細胞に入る時、ＲＮＡ形態のウイルスゲノムは逆転写されてＤＮＡを生成し、次いでウイルスインテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）酵素によってゲノムに挿入される。したがって、レンチウイルスベクターと共に伝達された外因性質（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）はゲノムに残留でき、細胞が分裂される時に細胞の子孫に伝達される。

【0091】

（ｃ）アデノウイルス
アデノウイルスは一般に、その中間サイズのゲノム（ｍｉｄ－ｓｉｚｅｄ ｇｅｎｏｍｅ）、操作容易性、高い力価（ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ）、広いターゲット－細胞範囲及び高い感染性の点で遺伝子伝達システムとして採用されてきた。ウイルスゲノムの両端は１００～２００ｂｐ ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）を含み、これはウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングに必要なシース要素（ｃｉｓ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）である。Ｅｌ領域（ＥｌＡ及びＥｌＢ）は、ウイルスゲノム及びいくつかの細胞遺伝子の転写調節を担当するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成を招く。

【0092】

いままで開発されたアデノウイルスベクターのうち、削除されたＥ１領域を有する複製不能アデノウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）が一般的に使用される。アデノウイルスベクターにおいて欠失されたＥ３領域は、トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）に対する挿入部位を提供することができる（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３１：５４３－５５１（１９８２）；及びＲｉｏｒｄａｎ，ＪＲ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１０６６－１０７３（１９８９））。したがって、デコリン－コーディングヌクレオチド配列が、欠失されたＥｌ領域（ＥｌＡ領域及び／又はＥｌＢ５領域、好ましくはＥｌＢ領域）又は欠失されたＥ３領域に挿入されることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、欠失されたＥ４領域に挿入され得る。ウイルスゲノム配列と関連して用語“削除”は、全体欠失及び部分欠失も含む。事実上、アデノウイルスは約１０５％の野生型ゲノムをパッケージ化して約２ｅｘｔｒａ ｋｂのＤＮＡを受容することができる（Ｇｈｏｓｈ－Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．’６：１７３３－１７３９（１９８７））。これと関連して、アデノウイルスに挿入された前記記載された外来配列は、アデノウイルス野生型ゲノムにさらに挿入され得る。

【0093】

アデノウイルスは公知の血清型又はサブグループＡ～Ｆのいずれかであり得る。サブグループＣのアデノウイルスタイプ５は、本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムを構築するための最も好ましい出発物質である。アデノウイルスタイプ５に対する多くの生化学的及び遺伝的情報が知られている。アデノウイルス遺伝子伝達システムによって伝達される外来遺伝子はエピソーマル（ｅｐｉｓｏｍａｌ）であり、宿主細胞に対して遺伝毒性を示す。したがって、アデノウイルス遺伝子伝達システムを使用する遺伝子治療は、非常に安全であり得る。

【0094】

（ｄ）アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ関連ウイルスは非分裂細胞及び様々なタイプの細胞を感染させることができ、それらを本発明の遺伝子伝達システムの構築において有用にさせる。ＡＡＶベクターの使用及び製造に関する詳細な説明は、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に記載されている。

【0095】

遺伝子伝達システムとしてのＡＡＶに対する研究結果は、ＬａＦａｃｅ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｏｌｏｇｙ，１６２：４８３－４８６（１９８８）、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（ＮＹ）、２１：９２８－９３３（１９９３）、Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４：１４４０－１４４８（１９９４）及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２：２９－３７（１９９５）に開示されている。典型的に、組換えＡＡＶウイルスは２個のＡＡＶ末端反復（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）が側面に結合された（ｆｌａｎｋｅｄ）関心遺伝子（すなわち、伝達されるヌクレオチド配列）を含有するプラスミド（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９）及び末端反復を持たない野生型ＡＡＶコーディング配列を含有する発現プラスミド（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．，６５：２９３６－２９４５（１９９１））を共形質感染（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させることによって製造される。

【0096】

（ｅ）他のウイルスベクター
他のウイルスベクターが本発明における遺伝子伝達システムとして用いられ得る。ワクシニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：６４９－６５７（１９９９）；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，“Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ，” Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４６７－４９２（１９８８）；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，“Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｇｅｎｅｓ，” Ｉｎ：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｒ，ｅｄ．Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１１７－１４８（１９８６） ａｎｄ Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６８：１－１０（１９８８））、レンチウイルス（Ｗａｎｇ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：ＲＳ ５－６２（１９９９））、及びヘルペスシンプルレックスウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．１０ １５ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１４１１－１４１５（１９９５））のようなウイルスから由来したベクターは、細胞内で本発明の両ポリヌクレオチドを全て転移させるための本発明の伝達システムにおいて用いられ得る。

【0097】

３．６．２つの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）異型体を発現する核酸コンストラクトの投与
３．６．１．伝達方法
本明細書に記載された方法においてＨＧＦの１つ以上の異型体を発現するポリヌクレオチドコンストラクトを投与するために様々な伝達方法が用いられ得る。

【0098】

３．６．１．１．注射
典型的な具現例において、核酸コンストラクトは液状薬剤学的組成物の注射によって投与される。

【0099】

現在、好ましい具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは、筋肉内注射（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって投与される。典型的に、ポリヌクレオチドコンストラクトは、疼痛部位又は患者認識疼痛部位に近接する筋肉内注射によって投与される。一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の手、足、脚又は腕の筋肉に投与される。

【0100】

一部の具現例において、コンストラクトは皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）又は皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌｌｙ）注射される。

【0101】

一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは、血管内伝達（ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）によって投与される。特定の具現例において、コンストラクトは、逆行性静脈注射（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって注射される。

【0102】

３．６．１．２．電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）
プラスミドＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ細胞への形質転換効率は、一部の場合に、注射に続く電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を行うことによって改善され得る。したがって、一部の具現例において、ポリヌクレオチドは注射に続く電気穿孔によって投与される。特定の具現例において、電気穿孔は、ＴｒｉＧｒｉｄ^ＴＭＤｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて投与される。

【0103】

３．６．１．３．超音波穿孔法（Ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）
一部の具現例において、超音波穿孔法（Ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）は、本発明のコンストラクトの形質転換効率を向上させるために用いられる。超音波穿孔法は、超音波を用いて細胞膜を一時的に透過性にさせてＤＮＡの細胞内吸収を許容する。ポリヌクレオチドコンストラクトはマイクロバブル内に統合され、全身循環で投与された後、超音波の外部適用が続き得る。超音波はターゲット組織内のマイクロバブルの空洞化（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）を誘導してコンストラクトの放出及び形質感染の結果を誘導する。

【0104】

３．６．１．４．磁気注入法（Ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）
一部の具現例において、磁気注入法は、本発明のコンストラクトの形質転換効率を向上させるために用いられる。前記コンストラクトは磁性ナノ粒子に結合された後に投与される。高い勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）外部磁石の適用は、ターゲットに複合体が捕獲され、維持されるようにする。ポリヌクレオチドコンストラクトは、架橋された分子の酵素分解、電荷相互作用又はメトリックス分解によって放出され得る。

【0105】

３．６．１．５．リポソーム
一部の具現例において、本発明のポリヌクレオチドはリポソームによって伝達され得る。リン脂質が過量の水性媒質に懸濁される時にリポソームが自動的に形成される。リポソーム媒介核酸伝達は、Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５－１９０（１９８２）及びＮｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７－１７６（１９８７）に記述された通り、非常に成功的だった。リポソームを用いて動物細胞を形質感染させるための市販試薬の例は、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含む。本発明のポリヌクレオチドを捕獲するリポソームは、エンドサイトーシス、吸着（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）及び融合（ｆｕｓｉｏｎ）のようなメカニズムによって細胞と相互作用した後、細胞内に配列を運搬する。

【0106】

３．６．１．６．形質感染（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ウイルスベクターがＨＧＦをコードするポリヌクレオチドを運搬するために用いられるとき、ポリヌクレオチド配列は従来知られた様々なウイルス感染方法によって細胞内に伝達され得る。ウイルスベクターを用いた宿主細胞の感染は、上に言及された引用文献に記載されている。

【0107】

好ましくは、本発明の薬剤学的組成物は非経口投与され得る。非経口投与のために、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射又は局所注射が採用され得る。例えば、薬剤学的組成物は逆行性静脈注射（ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって注射され得る。

【0108】

好ましくは、本発明の薬剤学的組成物は、筋肉内に投与され得る。一部の具現例において、前記投与は、神経病症疼痛に影響を受ける筋肉をターゲットとする。

【0109】

３．６．２．服量（Ｄｏｓｅ）
ポリヌクレオチドコンストラクトは、治療学的有効服量で投与される。本願に記載された方法において、治療学的有効服量は、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）において神経病症を治療するのに効果的な服量である。

【0110】

本明細書に記載された方法の一部の具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは総容量１μｇ～２００ｍｇ、１ｍｇ～２００ｍｇ、１ｍｇ～１００ｍｇ、１ｍｇ～５０ｍｇ、１ｍｇ～２０ｍｇ、５ｍｇ～１０ｍｇ、１６ｍｇ、８ｍｇ又は４ｍｇで投与される。

【0111】

典型的な具現例において、総容量は複数の個別的注射容量に分割される。一部の具現例において、総容量は複数の同一の注射容量に分割される。一部の実施態様において、総容量は不均等な注射容量に分けられる。

【0112】

様々に分割された容量具現例において、総容量は４カ所、８カ所、１６カ所、２４カ所又は３２カ所の異なる注射部位に投与される。

【0113】

一部の具現例において、注射容量は０．１～５ｍｇである。特定の具現例において、注射容量は、０．１ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．３ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．４５ｍｇ又は０．５ｍｇである。

【0114】

総容量は、１回訪問の間に又は２回以上の訪問の間に投与され得る。

【0115】

典型的な分割された容量具現例において、複数の注射容量はいずれも互いに１時間以内に投与される。一部の具現例において、複数の注射容量はいずれも互いに１．５時間、２時間、２．５時間又は３時間以内に投与される。

【0116】

本方法の様々な具現例において、単一容量で投与されようが複数の注射容量で分けられようが、総容量のポリヌクレオチドコンストラクトは対象に１回だけ投与される。

【0117】

一部の具現例において、１回、２回、３回又は４回の訪問にわたる複数の注射部位への総容量のポリヌクレオチドコンストラクトの投与は、単一サイクルを含むことができる。特に、２回訪問にわたって３２ｍｇ、１６ｍｇ、８ｍｇ又は４ｍｇのポリヌクレオチドコンストラクトを複数の注射部位に投与することは、単一サイクルを含むことができる。２回の訪問は３日、５日、７日、１４日、２１日又は２８日の間隔であり得る。

【0118】

一部の具現例において、前記サイクルは反復され得る。前記サイクルは２回、３回、４回、５回、６回又はそれ以上反復され得る。

【0119】

一部の具現例において、サイクルは、以前サイクル後、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月又はそれ以上反復され得る。

【0120】

一部の具現例において、後続サイクルに投与される総容量は、以前サイクルに投与された総容量と同一である。一部の具現例において、後続サイクルで投与される総容量は以前サイクルで投与された総容量と異なり得る。

【0121】

現在の好ましい具現例において、核酸コンストラクトは患肢当たり８ｍｇの容量で投与され、複数の筋肉内注射及び複数の訪問で同一に分けられ、任意の単一訪問における複数の注射のそれぞれが、分離された注射部位で行われる。特定の具現例において、核酸コンストラクトは、患肢（ａｆｆｅｃｔｅｄ ｌｉｍｂ）当たり８ｍｇの容量で投与され、０日目に肢当たり４ｍｇの第１容量及び１４日目に肢当たり４ｍｇの第２容量で同一に分けられ、ここで、第１及び第２容量は、複数の注射容量に均等に分割される。

【0122】

実際の投与量、投与速度及び経時変化は、治療される神経病症の本質及び重症度に左右されるだろう。典型的な具現例において、ポリヌクレオチドコンストラクトは神経病症、例えば神経病症疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ）の症状を減少させるのに効果的な量で投与される。一部の実施具現例において、前記量は、投与１週以内に神経病症疼痛を減少させるのに効果的である。一部の具現例において、前記量は、投与２週、３週又は４週内に神経病症疼痛を減少させるのに効果的である。

【0123】

一部の具現例において、２つの互いに異なるタイプのコンストラクト（すなわちｆｌＨＧＦをコードする第１コンストラクト及びｄＨＧＦをコードする第２コンストラクト）が共に投与されてＨＧＦの２つの異型体の発現を誘導する。一部の具現例において、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦを両方ともコードする単一コンストラクトが伝達され、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ両方の発現を誘導する。

【0124】

当業者に公知された通常の技術によれば、薬剤学的組成物は、前記記載されたように、薬剤学的に許容される担体及び／又はビークルで剤形化可能であり、最終的に、単位投与量形態（ｕｎｉｔ ｄｏｓｅ ｆｏｒｍ）及び多重投与量形態（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ ｆｏｒｍ）のようないくつかの形態を提供する。剤形（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の非制限的な例は、溶液（ｓｏｌｉｔｉｏｎ）、オイル又は水性媒質の懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）又は乳剤（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、抽出物、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、粉末（ｐｏｗｄｅｒ）、顆粒（ｇｒａｎｕｌｅ）、錠剤（ｔａｂｌｅｔ）及びカプセル（ｃａｐｓｕｌｅ）を含むが、これに制限されず、分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ａｇｅｎｔ）又は安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）をさらに含むことができる。

【0125】

３．６．３．変異型（Ｖａｔｉａｔｉｏｎｓ）
Ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はＩｎ ｖｉｔｒｏ分析は、最適の投与量範囲を確認することに役立つように任意に用いられ得る。また、製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に使用される正確な投与量は投与経路及び状態の深刻性によって可変可能であり、医師の判断及び各対象ｓｕｂｊｅｃｔ）の状況（ｃｉｒｃｕｍｓｔａｎｃｅｓ）によって決定される必要がある。効果的な投与量は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は動物モデルテストシステムから誘導された容量－反応カーブから推定され得る。

【0126】

ポリヌクレオチドコンストラクトは単独で又は他の治療と併用して投与され得る。

【0127】

４．薬剤学的組成物
典型的な具現例において、核酸コンストラクトは液状薬剤学的組成物として投与され得る。

【0128】

４．１．薬理学的組成物（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）及び単位投与量形態
静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）又は皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射の場合、核酸コンストラクトは非経口的に許容される水溶液の形態で存在でき、発熱源がなく（ｐｙｒｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ）、適度のｐＨ、等張性及び安定性を有する。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射剤（Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リンゲル注射剤（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、乳酸加リンゲル液（Ｌａｃｔａｔｅｄ Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）のような等張性ビークルを用いて適切な溶液を製造することができる。必要によって、保存剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ）、安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ）、緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒｓ）、酸化防止剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）及び／又は他の添加剤（ｏｔｈｅｒ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）が含まれ得る。

【0129】

様々な具現例において、核酸コンストラクトは、液体組成物に０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ又は１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。一部の具現例において、単位投与量形態は２ｍｌの薬剤学的組成物を０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ又は１ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するバイアルである。

【0130】

一部の具現例において、単位投与量形態は、バイアル、アンプル、瓶又は予め満たされた注射器である。一部の具現例において、単位投与形態は、０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、１６ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ又は２００ｍｇの本発明のポリヌクレオチドを含有する。

【0131】

典型的な具現例において、単位投与量形態における薬剤学的組成物は、液状形態である。様々な具現例において、単位投与量形態は、０．１ｍｌと５０ｍｌとの間の薬剤学的組成物を含有する。一部の具現例において、単位投与量形態は、０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２．５ｍｌ、５ｍｌ、７．５ｍｌ、１０ｍｌ、２５ｍｌ又は５０ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。

【0132】

特定の具現例において、単位投与量形態は、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）又は筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）投与に適した単位投与量形態具現例において、１ｍｌの薬剤学的組成物を含有するバイアルであり、それぞれ前記記載された薬剤学的組成物の予め決められた量を含有する予め充填された注射器（ｐｒｅｌｏａｄｅｄ ｓｙｒｉｎｇｅ）、自動注射器（ａｕｔｏ－ｉｎｊｅｃｔｏｒ）及び自動注射ペン（ａｕｔｏ－ｉｎｊｅｃｔ ｐｅｎ）を含む。

【0133】

様々な具現例において、単位投与形態は、注射器及び予め決定された量の薬剤学的組成物を含む予め充填された注射器である。特定の予め充填された注射器具現例において、前記注射器は皮下投与に適用される。特定の具現例において、前記注射器は自己投与に適する。特定の具現例において、予め充填された注射器は使い捨て注射器である。

【0134】

様々な具現例において、予め充填された注射器は、約０．１ｍｌ～約０．５ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。特定の具現例において、前記注射器は約０．５ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。特定の具現例において、前記注射器は約１．０ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。特定の具現例において、前記注射器は約２．０ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。

【0135】

特定の具現例において、前記単位投与量形態は自動注射ペンである。前記自動注射ペンは、本明細書に記載された薬剤学的組成物を含有する自動注射ペンを含む。一部の具現例において、自動注射ペンは、予め決められた体積の薬剤学的組成物を伝達する。他の具現例において、前記自動注射ペンは、使用者によって設定された体積の薬剤学的組成物を伝達するように構成される。

【0136】

様々な具現例において、自動注射ペンは約０．１ｍｌ～約５．０ｍＬの薬剤学的組成物を含有する。特定の具現例において、自動注射ペンは約０．５ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。特定の具現例において、自動注射ペンは約１．０ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。他の具現例において、自動注射ペンは約５．０ｍｌの薬剤学的組成物を含有する。

【0137】

４．２．凍結乾燥したＤＮＡ剤形
一部の具現例において、本発明の核酸コンストラクトは、凍結乾燥剤形から再構成された液状組成物として投与される。具体的な具現例において、本明細書にその全体が参照として統合された米国特許第８，３８９，４９２号に開示された凍結乾燥したＤＮＡ剤形は、再構成された後に用いられる。

【0138】

一部の具現例において、本発明の核酸コンストラクトは、凍結乾燥に先立ち、炭水化物及び塩を含む特定賦形剤と共に剤形化される。診断剤又は治療剤として用いられる凍結乾燥したＤＮＡ剤形の安定性は、安定化量（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ）の炭水化物を含む水溶液で凍結乾燥する前にＤＮＡを製剤化することによって増加し得る。

【0139】

本発明のＤＮＡ製剤の炭水化物は、単糖類、オリゴ糖又は多糖類、例えばスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、ペントース（ｐｅｎｔｏｓｅ）、リボース（ｒｉｂｏｓｅ）、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、ヘキソース（ｈｅｘｏｓｅ）、イドース（ｉｄｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）、タロース（ｔａｌｏｓｅ）、ヘプトース（ｈｅｐｔｏｓｅ）、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、グルコン酸（ｇｌｕｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、メチルａ－グルコピラノシド（ｍｅｔｈｙｌ ａ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）、イソアスコルビン酸（ｉｓｏａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、ラクトン（ｌａｃｔｏｎｅ）、ソルボース（ｓｏｒｂｏｓｅ）、グルカル酸（ｇｌｕｃａｒｉｃ ａｃｉｄ）、エリトロース（ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ）、トレオース（ｔｈｒｅｏｓｅ）、アロース（ａｌｌｏｓｅ）、アルトロース（ａｌｔｒｏｓｅ）、グロース（ｇｕｌｏｓｅ）、エリトルロース（ｅｒｙｔｈｒｕｌｏｓｅ）、リブロース（ｒｉｂｕｌｏｓｅ）、キシルロース（ｘｙｌｕｌｏｓｅ）、プシコース（ｐｓｉｃｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、マンヌロン酸（ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、グルコサミン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトサミン（ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ノイラミン酸（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アラビナン（ａｒａｂｉｎａｎ）、フルクタン（ｆｒｕｃｔａｎ）、フカン（ｆｕｃａｎ）、ガラクタン（ｇａｌａｃｔａｎ）、ガラクツロナン（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｎ）、グルカン（ｇｌｕｃａｎ）、マンナン（ｍａｎｎａｎ）、キシラン（ｘｙｌａｎ）、レバン（ｌｅｖａｎ）、フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）、カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、ガラクトカロロース（ｇａｌａｃｔｏｃａｒｏｌｏｓｅ）、ペクチン、ペクチン酸（ｐｅｃｔｉｃ ａｃｉｄｓ）、アミロース（ａｍｙｌｏｓｅ）、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）、グリコーゲン（ｇｌｙｃｏｇｅｎ）、アミロベクチン（ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）、シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、プスツラン（ｐｕｓｔｕｌａｎ）、キチン（ｃｈｉｔｉｎ）、アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）、ケラチン（ｋｅｒａｔｉｎ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、デルマタン（ｄｅｒｍａｔａｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、キサンタンガム（ｘａｎｔｈａｎ ｇｕｍ）又は澱粉（ｓｔａｒｃｈ）である。

【0140】

一連の一具現例において、炭水化物はマンニトール又はスクロースである。

【0141】

凍結乾燥に先立つ炭水化物溶液は、水単独中の炭水化物に相応するか、又は緩衝液が含まれ得る。このような緩衝液の例には、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ又はＴＲＩＳ／ＥＤＴＡが含まれる。典型的に炭水化物溶液は、約０．０５％～約３０％スクロース、典型的に０．１％～約１５％スクロース、例えば０．２％～約５％、１０％又は１５％スクロース、好ましくは約０．５％～１０％スクロース、１％～５％スクロース、１％～３％スクロース、及び最も好ましくは約１．１％スクロースの最終濃度でＤＮＡと結合される。

【0142】

本発明のＤＮＡ製剤の塩は、ＮａＣ１又はＫＣｌである。特定態様において、ＤＮＡ製剤の塩はＮａＣｌである。追加の態様において、ＤＮＡ製剤の塩は、約０．００１％～約１０％、約０．１％～５％、約０．１％～４％、約０．５％～２％、約０．８％～１．５％、約０．８％～１．２％ ｗ／ｖからなる群から選ばれる量で存在する。特定の具現例において、ＤＮＡ製剤の塩は約０．９％ ｗ／ｖの量で存在する。

【0143】

凍結乾燥した製剤から再構成された液状組成物中の最終濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍｌのプラスミドである。例えば、本発明の製剤は、約１ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約５．５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約９ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、又は約３０ｍｇ／ｍｌのプラスミドの最終濃度を有することができる。本発明の特定の具現例において、ＤＮＡの最終濃度は１００μｇ／ｍｌ～２．５ｍｇ／ｍｌである。本発明の特定の具現例において、ＤＮＡの最終濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌである。

【0144】

本発明のＤＮＡ製剤は、当業界に公知された標準条件下で凍結乾燥する。本発明のＤＮＡ剤形の凍結乾燥方法は、（ａ）ＤＮＡ剤形、例えばプラスミドＤＮＡ、塩及び炭水化物を含むＤＮＡ剤形を有するコンテナ、例えばバイアルを凍結乾燥器内にローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）する段階；前記でプラスミドＤＮＡはＨＧＦ遺伝子、又はそれらの変異体を含み、前記凍結乾燥器は約５℃～約－５０℃の開始温度を有する；（ｂ）ＤＮＡ剤形を零下の温度（例えば、－１０℃～－５０℃）に冷却させる段階；及び（ｃ）続いてＤＮＡ剤形を乾燥させる段階を含むことができる。本発明のＤＮＡ剤形の凍結乾燥条件、例えば、温度及び期間は、凍結乾燥パラメータに影響を与え得る因子、例えば、使用された凍結乾燥装置のタイプ、使用されたＤＮＡの量、及び使用されたコンテナのサイズを考慮して当業者が調整することができる。

【0145】

凍結乾燥したＤＮＡ剤形を保有する容器は、様々な温度（例えば、室温～約－１８０℃、好ましくは約２～８℃～約－８０℃、より好ましくは約－２０℃～約－８０℃、及び最も好ましくは約－２０℃）で延長された時間周期の間に密封されて保管され得る。特定の態様において、凍結乾燥したＤＮＡ剤形は、好ましくは約２～８℃～約－８０℃の範囲内で少なくとも６ケ月の期間の間に有意な活性の損失なく好適に安定である。

【0146】

プラスミドＤＮＡ剤形の安定した保管は、また、研究又はプラスミド基盤治療のような使用前に、長期間安定した形態でプラスミドＤＮＡを保管することに該当し得る。保管時間は、数ケ月、１年、５年、１０年、１５年又は２０年であり得る。好ましくは、製剤は、少なくとも約３年間安定である。

【0147】

５．実施例
下記の実施例は、当業者に本発明を作って使用する方法に関する完全な開示及び説明を提供するために提示されるもので、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を制限しようとする意図はなく、以下の実験が、行われた全部又は唯一の実験であることを示そうとする意図はない。使用された数字（例えば、量、温度など）と関連して正確性を保障するために努力したが、一部の実験の誤り及び偏差が考慮されるべきだろう。特に指示しない限り、部（ｐａｒｔｓ）は重量部（ｐａｒｔｓ ｂｙ ｗｅｉｇｈｔ）、分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）は重量平均分子量（ｗｅｉｇｈｔ ａｖｅｒａｇｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）であり、温度は摂氏温度、圧力は大気圧又は周辺大気圧（ｎｅａｒ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ）である。標準略語、例えば、ｂｐ、塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ（ｓ））；ｋｂ、キロベース（ｋｉｌｏｂａｓｅ（ｓ））；ｐｌ、ピコリットル（ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ（ｓ））；ｓ又はｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈ又はｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｎｔ、ヌクレオチド；など。

【0148】

特に指示されない限り、本発明の実施は、当業者に通常の方法である、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学的公知方法が用いられるだろう。

【0149】

５．１．実施例１：神経病症に対する慢性収縮損傷（ＣＣＩ）動物モデルにおけるＶＭ２０２媒介疼痛減少に対するガバペンチンの効果

【0150】

図１Ａは、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２（５）：４６５－４７８（２０１５）から再現されたものであり、糖尿病性末梢神経病症の治療に対するＶＭ２０２の臨床第２相で全患者から測定した疼痛レベルの経時的変化を示す。実験データは、高用量ＶＭ２０２（０日目における脚当たり８ｍｇ、１４日目における脚当たり８ｍｇ；両訪問及び両脚にわたる総容量、３２ｍｇ）、低容量ＶＭ２０２（０日目における脚当たり４ｍｇ、１４日目における脚当たり４ｍｇ；両訪問及び両脚にわたる総容量、１６ｍｇ）、又は食塩水（プラシーボ）の投与後３月、６月、９月後に測定した疼痛深刻度を示す。図１Ｂはまた、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２（５）：４６５－４７８（２０１５）から再現されたものであり、高用量ＶＭ２０２、低容量ＶＭ２０２、又は食塩水（プラシーボ）の投与後、３月、６月、及び９月後のリリカ（Ｌｙｒｉｃａ；ｐｒｅｇａｂａｌｉｎ）及び／又はニューロンチン（Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ；ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ）を服用しなかった患者グループから測定した疼痛レベルにおける経時的変化（ｔｉｍｅ－ｃｏｕｒｓｅ ｃｈａｎｇｅ）を示す。また、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．に報告された通り、リリカ及び／又はニューロンチンを服用しなかった患者（図１Ｂ）は、低容量ＶＭ２０２の投与後、一般に、総患者グループ（ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｇｒｏｕｐ）（図１Ａ）に比べて、基準線（ｂａｓｅｌｉｎｅ）から疼痛のより大きな減少を経験した。

【0151】

第ＩＩ相臨床試験データの事後分析（ｐｏｓｔ ｈｏｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、ガバペンチノイドとＶＭ２０２の明白な有害な（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ）相互作用の基礎となる生理学的メカニズムを明らかにすることができなかった。特に、前記データは、ガバペンチノイドの事前投与がＶＭ２０２の以降の効能を妨げるかどうか予想できず、事前にガバペンチノイドを服用した患者にＶＭ２０２をどのように効果的に投与すればよいか予想できなかった。

【0152】

ＶＭ２０２効能とのガバペンチノイド干渉の背後のメカニズムを探求するために、本発明者らは、図２に提示するように、慢性収縮損傷（ＣＣＩ）マウスでＶＭ２０２媒介疼痛減少に対するガバペンチンの効果を試験した。ＣＣＩは神経病症疼痛研究に広く使用される動物モデルである。具体的に、５週齢雄マウスの坐骨神経（ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ）に緩く収縮性リガチャー（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｖｅ ｌｉｇａｔｕｒｅ）を適用することによって、慢性収縮損傷（ＣＣＩ）を導入した。ＣＣＩマウスは３個のグループに分けられた。第１グループにおいて、２００μｇのｐＣＫベクターがＶＭ２０２投与のための陰性対照群として頭蓋大腿筋肉（ｃｒａｎｉａｌ ｔｈｉｇｈ ｍｕｓｃｌｅ）に投与され（ｐＣＫはＶＭ２０２に用いられたベクターであるが、ＨＧＦベクター搭載がない）、第２グループにおいて、２００μｇのＶＭ２０２を頭蓋大腿筋肉（ｃｒａｎｉａｌ ｔｈｉｇｈ ｍｕｓｃｌｅ）に投与し、第３グループにおいて、ＤＮＡコンストラクトを投与しなかった。第１及び第２グループの各動物を２個の下位群にさらに分け、第１下位グループは毎日１００ｍｇ／ｋｇのガバペンチンを注射し、第２下位グループはガバペンチン投与に対する陰性対照群としてＰＢＳを腹腔内空洞（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｖｉｔｙ）を通って２週間毎日注射した。ＣＣＩのないシャムグループも維持され、ＰＢＳを毎日注射した。１４日から１６日まで、フォンフレイフィラメント検査（Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｔｅｓｔ）を行って神経病症疼痛（機械的アロディニア（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｌｌｏｄｙｎｉａ））のレベルを評価した。

【0153】

５個の異なるグループでフォンフレイフィラメント試験（Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｔｅｓｔ）によって測定された足逃避反応頻度（ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ）を図３及び図４に示した。シャム手術群（ｓｈａｍ－ｏｐｅｒａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ）（“Ｓｈａｍ”、図３及び図４のダイアモンドを有する線）は、実験期間を通じて非常に低い基底頻度（ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｂａｓａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）の足逃避（ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）を示した。これに対し、ｐＣＫが投与され（ＶＭ２０２に対する陰性対照群）、ＰＢＳが毎日投与された（ガバペンチンに対する陰性対照群）ＣＣＩ手術群（ＣＣＩ－ｏｐｅｒａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ）（“ｐＣＫ－ＰＢＳ”、図３及び図４の三角形を有する線）は、実験期間を通じて持続的に高い疼痛レベルを示した。一方、ｐＣＫを投与し、毎日ガバペンチンを注射したＣＣＩ手術群は、足逃避頻度（ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ）の減少によって立証された通り、ガバペンチン投与直後に疼痛レベルの減少を示した（“ｐＣＫ－ガバペンチン”、図３の丸を有する線）。しかし、ガバペンチンの疼痛緩和効果は、約６時間しか持続しなかった。

【0154】

ＶＭ２０２を注射したＣＣＩ手術群は、全実験期間を通じて有意に低い疼痛レベルを示した（“ＶＭ２０２”、図３でｘを有する線）。ＶＭ２０２処理されたＣＣＩマウスにガバペンチンを毎日注射したとき（“ＶＭ２０２＋ガバペンチン”、図４のｘを有する線）、疼痛レベルは、ＶＭ２０２によって達成されたレベルから、非常に短い時間の間に格段に減少した後、疼痛レベルは約１０時間の間に増加してｐＣＫ－ＰＢＳレベルに近接し、その後、ガバペンチンの二番目の投与時まで漸次減少した。

【0155】

初期注射２４時間後に二番目の時間の間にガバペンチンを投与したとき、疼痛レベルは、非常に短い時間の間に再びＶＭ２０２レベル以下に減少した後、ｐＣＫ－ＰＢＳレベルとＶＭ２０２レベルとの間の安定したポイントまで上昇した。全般的に、ＶＭ２０２の疼痛減少効果は、３０．５６％の頻度から４６．１％頻度へと、５０％以上ガバペンチンによって損傷した。

【0156】

５．２．実施例２：神経病症に対する神経損傷動物モデル（ｎｅｒｖｅ ｃｒｕｓｈ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ）においてＶＭ２０２媒介神経再生に対するガバペンチンの効果
ＶＭ２０２媒介神経再生に対するガバペンチノイドの効果は神経損傷動物モデルで試験した。プロトコルは、図５に図式化している。具体的に、９週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスに短い圧力を加えることによってその坐骨神経（ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ）に神経損傷を導入した。その当日（１日）、マウスに神経損傷直後、頭蓋大腿筋肉（ｃｒａｎｉａｌ ｔｈｉｇｈ ｍｕｓｃｌｅ）に２００μｇのＶＭ２０２を注射した。翌日（２日）から、１００ｍｇ／ｋｇのガバペンチンを毎日投与した。

【0157】

７日に、損傷した神経の機能的回復を定量化するために神経ピンチテスト（ｎｅｒｖｅ ｐｉｎｃｈ ｔｅｓｔ）を行った。神経ピンチテストのために、軽い麻酔（ｌｉｇｈｔ ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ）を誘導し、坐骨神経（ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ）を露出させた。損傷した神経を反射反応（ｒｅｆｌｅｘ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が観察されるまで遠位（ｄｉｓｔａｌ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）から近位（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）の方向にピンチングした。その後、負傷部位と反応を起こした先頭部位との距離を測定した。この方法で測定した距離は、再生された神経の長さを表し、図６のｙ軸に示した。

【0158】

ＶＭ２０２処理されたマウスで測定された再生神経の長さは、陰性対照群プラスミドベクターであるｐＣＫ（１．５±０．５ｍｍ）で処理された対照群マウスで測定された長さよりも略２．７倍長い約４±０．２ｍｍであった。この結果から、ＶＭ２０２が、損傷したニューロンの再生を誘導するのに効果的であることを確認した（図６で“ＰＢＳ”と表示された左側の２本の棒）。神経再生のこのＶＭ２０２媒介向上は、ガバペンチンで処理されたマウスで大きく減少した。ＶＭ２０２処理されたマウスで測定された再生神経の長さは、毎日ガバペンチンを注射したとき、１．９５±０．３ｍｍであった。したがって、マウスで神経再生（１．９５±０．３ｍｍ）は、ＶＭ２０２を類似に投与したが、ガバペンチンを毎日注射しなかったマウス（４±０．２ｍｍ）に比べて有意に少なかった。この結果は、ガバペンチンがＶＭ２０２媒介神経再生を妨害することを示す。しかし、ガバペンチンが存在しても、ＶＭ２０２はｐＣＫ対照群に比して相変らず神経再生を２．３倍増加させることができた（図６で“ガバペンチン”と表示された右側の２本の棒）。

【0159】

５．３．実施例３：ｃ－ＪｕｎのＶＭ２０２媒介上向き調節に対するガバペンチンの効果
ｃ－Ｊｕｎは、神経再生に関与する主要因子としてよく確立されており、その過程に対するマーカーとして用いられてきた。シャムマウス（”Ｓｈａｍ”）又は神経損傷マウス（“Ｃｒｕｓｈ”）から得た後根神経節（Ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ；ＤＲＧ）細胞から製造されたｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現は、ｃ－Ｊｕｎに対する抗体を用いてウェスタンブロット分析で測定された。ｃ－Ｊｕｎの発現は、シャム動物に比べて神経損傷モデルで有意に増加した（図７Ａのレーン１及び２比較）。ＶＭ２０２処理はｃ－Ｊｕｎ発現レベルを１．３倍さらに増加させたが（図７Ａのレーン２及び３比較）、マウスがガバペンチンに露出されたとき、このような誘導は観察されなかった（図７Ａのレーン５及び６比較）。ウェスタンブロット分析結果をバンド強度に基づいて定量化し、それらの分析及び比較のために図７Ｂに提示した。データは、ＶＭ２０２から生産されたＨＧＦがカルシウム信号伝達経路を用いてｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルを増加させ、結局は、損傷した神経の再生につながり得ることを示唆した。

【0160】

５．４．実施例４：異なる時点に投与されたガバペンチンによるＶＭ２０２の治療効果の干渉
ＶＭ２０２投与と関連して、異なる時点でガバペンチノイド投与の効果を慢性収縮損傷（ＣＣＩ）マウスで試験した。ＣＣＩマウスを５個のグループに割り当て、図８Ａに例示するように処理し、下表１に要約した。

【0161】

【表1】

【0162】

ＣＣＩ手術後、１週間に１回フォンフレイフィラメントテスト（Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ‘ｓ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｔｅｓｔ）を用いて機械的アロディニア（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｌｌｏｄｙｎｉａ）の発達を評価し、機械的頻度評価に基づいて疼痛減少倍率レベルを計算した。要するに、動物は、適応のために金属メッシュ底の上部のシリンダーに個別的に配置された。機械的感度の頻度を調べるために、一定の厚さのフィラメント（０．１６ｇ）を使って後足を刺激することによってマウスを評価した。

【0163】

図８Ｂの結果は、ＶＭ２０２の注射が、ｐＣＫベクター（ＣＣＩ－ｐＣＫ）で注射された対照群マウスと比較して、疼痛レベル（ＣＣＩ－ＶＭ２０２）を有意に減少させることを立証した。しかし、ガバペンチンがＶＭ２０２と同時に２週間毎日投与されたとき（ＣＣＩ－ＶＭ２０２－Ｇａｂａ１）、ＶＭ２０２の注射は、ｐＣＫベクター欠損挿入で処理されたＣＣＩグループ（ＣＣＩ－ｐＣＫ）と比較できるような効果はなかった。これは、ＶＭ２０２注射と同時に及び／又は直後のガバペンチンの投与が、ＶＭ２０２の疼痛緩和効果を完全に妨害し除去し得ることを示唆する。さらに、追加のガバペンチン投与がない場合にも、このような干渉は続いた。具体的に、ＶＭ２０２で処理されたＣＣＩマウス（ＣＣＩ－ＶＭ２０２－Ｇａｂａ１）は、追加のガバペンチン投与がないとき、１４日から２８日まで、ｐＣＫベクター（ＣＣＩ－ｐＣＫ）で処理されたＣＣＩ対照群マウスと類似な高レベルの疼痛が持続した。

【0164】

しかし、ガバペンチンによるＶＭ２０２の治療効果の干渉は、ガバペンチン治療がＶＭ２０２注射１４日後に開始された時には観察されなかった（ＣＣＩ－ＶＭ２０２－Ｇａｂａ２）。ＣＣＩマウスを最初２週間にガバペンチン投与無しでＶＭ２０２で治療したとき、ガバペンチンを１５日から２８日まで毎日投与した場合にもＶＭ２０２の疼痛緩和効果が有意であるとともに維持された。これは、ＶＭ２０２投与とガバペンチン投与との間に十分の時間遅延がある場合、ガバペンチンがＶＭ２０２の治療効果を干渉しないことを示唆する。

【0165】

干渉を防止するために要求される時間遅延をさらに調べるために、追加の実験において、ＶＭ２０２で注射されたＣＣＩマウスは、０～１４日範囲の様々な期間で遅延後にガバペンチンで処理した。具体的に、ＣＣＩマウスは、図９Ａに示され、下表２に要約されたように、６個のグループに割り当てられた。ＣＣＩマウスには０日にＶＭ２０２又はｐＣＫが注射された。ＣＣＩマウスはガバペンチンで処理されていないか（ＣＯＮＴ１、ＣＯＮＴ２）、ＶＭ２０２注射後０日（その当日ＶＭ２０２注射、ＧＰ１）又は３日（ＧＰ２）、７日（ＧＰ３）又は１０日（ＧＰ４）に始めてガバペンチンをさらに処理した。

【0166】

【表2】

【0167】

ＣＣＩ手術及びＶＭ２０２又はｐＣＫ注射２週後に、フォンフレイフィラメント試験（Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ’ｓ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｔｅｓｔ）を用いて機械的アロディニア（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｌｌｏｄｙｎｉａ）の発達を評価し、疼痛減少倍率レベルを、それぞれの動物に対する機械的頻度評価に基づいて計算した。結果は図９Ｂに提供される。この結果は、ＶＭ２０２がＧＰ１、ＧＰ２及びＧＰ３で有意の疼痛減少効果を示さなかったが、ＶＭ２０２はＣＯＮＴ２又はＧＰ４で有意の疼痛緩和を提供することを示した。これは、ＶＭ２０２投与と共に及び／又は最初の週にガバペンチン治療をすると、ＶＭ２０２の治療効果を妨害し得るが、ＶＭ２０２投与して約１０日後に始めるガバペンチン治療は、ＶＭ２０２の治療効能に有意の影響を及ぼさないということを示唆する。

【0168】

本研究は、ＶＭ２０２の効能及び効果に対するガバペンチノイドの有害な効果が、ＶＭ２０２の第１投与に先立ってガバペンチノイド投与を中断することによって顕著に減少し、ＶＭ２０２の第１投与後に少なくとも約１週の間にガバペンチノイド投与を保留することによって弱化し得ることを示す。

【0169】

参照による統合
本明細書に引用された全ての刊行物、特許、特許出願及びその他文書は、それぞれの個別刊行物、特許、特許出願又はその他文書が個別的に全ての目的のために参照として含まれたものと表示されるのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照として本明細書に含まれる。

【0170】

等価物
様々な具体的な具現例が図示及び説明されてきたが、前記詳細な説明は制限的なものではない。本発明の思想及び範囲を逸脱することなく様々な変更が可能であることが理解できよう。本発明の詳細な説明を検討することで多くの変形が当業者にとって明らかであろう。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【配列表】

2022060514000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-03-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0170】

等価物
様々な具体的な具現例が図示及び説明されてきたが、前記詳細な説明は制限的なものではない。本発明の思想及び範囲を逸脱することなく様々な変更が可能であることが理解できよう。本発明の詳細な説明を検討することで多くの変形が当業者にとって明らかであろう。
本開示に係る態様は以下の態様も含む。
＜１＞
神経病症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の治療方法における使用のためのＶＭ２０２であって、前記方法は次の段階を含む、ＶＭ２０２：
ガバペンチノイドを投与された神経病症患者を選択する段階、
前記患者へのガバペンチノイド投与を中断する段階、及び
前記患者にＶＭ２０２を投与する段階。
＜２＞
前記方法は、ＶＭ２０２投与段階後に少なくとも１週間の間にガバペンチノイド投与を保留する段階をさらに含む、＜１＞に記載のＶＭ２０２。
＜３＞
前記方法は、ＶＭ２０２投与段階後に少なくとも１０日間の間にガバペンチノイド投与を保留する段階をさらに含む、＜１＞に記載のＶＭ２０２．
＜４＞
前記ガバペンチノイド投与を中断する段階は、ガバペンチノイド投与を次第に減少させることを含む、＜１＞～＜３＞のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。
＜５＞
ＶＭ２０２を投与する段階は、ガバペンチノイド投与が完全に中断された後に行われる、＜１＞～＜４＞のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。
＜６＞
前記ＶＭ２０２を投与する段階は、ガバペンチノイド投与が完全に中断されて少なくとも１日、２日、３日、５日、７日、１４日、２１日、３０日、６０日又は９０日後に行われる、＜５＞に記載のＶＭ２０２。
＜７＞
前記神経病症は、糖尿病性末梢神経病症である、＜１＞～＜６＞のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。
＜８＞
前記神経病症は、帯状疱疹後神経病症（ｐｏｓｔ－ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）である、＜１＞～＜６＞のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。
＜９＞
前記ガバペンチノイドは、ガバペンチン又はプレガバリンである、＜１＞～＜８＞のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。
＜１０＞
前記ＶＭ２０２を投与する段階は、患者の患肢（ａｆｆｅｃｔｅｄ ｌｉｍｂ）当たり８ｍｇのＶＭ２０２を、複数回の筋肉内注射及び複数回の訪問に同等に分けて投与することを含み、所定の１回の訪問において複数回の筋肉内注射のそれぞれは、離隔した注射部位で行われる、＜１＞～＜９＞のいずれか一項に記載のＶＭ２０２。
＜１１＞
前記ＶＭ２０２を投与する段階は、１６ｍｇの容量のＶＭ２０２を６４回の筋肉内注射で均等に分けて投与する段階を含み、
１６回の筋肉内注射は、一番目の訪問において一番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、
１６回の筋肉内注射は、一番目の訪問において二番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、
１６回の筋肉内注射は、二番目の訪問において一番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、
１６回の筋肉内注射は、二番目の訪問において二番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、及び
６４回の筋肉内注射のそれぞれは０．５ｍｌ体積中の０．２５ｍｇのＶＭ２０２を用いて行われる、＜１０＞に記載のＶＭ２０２。
＜１２＞
患者において神経病症を治療する方法に使用するためのＶＭ２０２であって、前記方法は次の段階を含む、ＶＭ２０２：
神経病症の患者にここ一週（ｗｅｅｋ）内にガバペンチノイドが投与されたか否か決定する段階；
患者にここ一週内にガバペンチノイドが投与された場合、患者へのガバペンチノイド投与を中断した後、患者にＶＭ２０２を投与する段階；及び
患者にここ一週内にガバペンチノイドが投与されなかった場合、患者にＶＭ２０２を投与する段階。

【手続補正2】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＶＭ２０２を含む神経病症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）の治療のため医薬組成物であって、
前記医薬組成物はガバペンチノイドを投与された神経病症患者に、ガバペンチノイド投与が中断された後に投与され、
前記医薬組成物の投与後少なくとも１０日間、前記患者に対するガバペンチノイド投与が保留される、
前記医薬組成物。

【請求項2】

前記ガバペンチノイド投与の中断は、ガバペンチノイド投与を次第に減少させることを含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記ガバペンチノイド投与の中断は、ガバペンチノイド投与の完全な中断を含む、請求項１又は請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記ガバペンチノイド投与の中断は、少なくとも１日間、２日間、３日間、５日間、７日間、１４日間、２１日間、３０日間、６０日間、又は９０日間の完全な中断を含む、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記保留の後にガバペンチノイドの投与が再開される、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記神経病症は、糖尿病性末梢神経病症である、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記神経病症は、帯状疱疹後神経病症（ｐｏｓｔ－ｈｅｒｐｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）である、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記ガバペンチノイドは、ガバペンチン又はプレガバリンである、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記医薬組成物は、患者の患肢（ａｆｆｅｃｔｅｄ ｌｉｍｂ）当たり８ｍｇのＶＭ２０２が、複数回の筋肉内注射及び複数回の診察に同等に分けられるように投与され、所定の１回の診察において前記複数回の筋肉内注射のそれぞれは、離隔した注射部位で行われる、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記医薬組成物は、１６ｍｇの用量のＶＭ２０２が６４回の筋肉内注射で均等に分けられるように投与され、
１６回の筋肉内注射は、一番目の診察において一番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、
１６回の筋肉内注射は、前記一番目の診察において二番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、
１６回の筋肉内注射は、二番目の診察において一番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、
１６回の筋肉内注射は、前記二番目の診察において二番目のふくらはぎの離隔した注射部位に投与され、
前記６４回の筋肉内注射のそれぞれは０．５ｍｌ体積中の０．２５ｍｇのＶＭ２０２を用いて行われる、請求項９に記載の医薬組成物。