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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022061114
(43)【公開日】2022-04-18
(54)【発明の名称】組織再生用材料及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20220411BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20220411BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
C12N5/071
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020168891
(22)【出願日】2020-10-06
(71)【出願人】
【識別番号】504147243
【氏名又は名称】国立大学法人 岡山大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002206
【氏名又は名称】特許業務法人せとうち国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】河合 穂高
(72)【発明者】
【氏名】寳田 剛志
(72)【発明者】
【氏名】長塚 仁
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BA30
4B065BD44
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】骨髄組織から短時間で簡便な処理によりレプチン受容体陽性細胞数が一定以上の骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができる組織再生用材料を提供する。
【解決手段】骨髄組織から骨髄由来間葉系幹細胞が分離されてなる組織再生用材料であって、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料である。
【選択図】なし
【解決手段】骨髄組織から骨髄由来間葉系幹細胞が分離されてなる組織再生用材料であって、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
骨髄組織から骨髄由来間葉系幹細胞が分離されてなる組織再生用材料であって、
レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むことを特徴とする組織再生用材料。
レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むことを特徴とする組織再生用材料。
【請求項2】
骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数が９６×１０４／ｇ以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む請求項１に記載の組織再生用材料。
【請求項3】
前記骨髄由来間葉系幹細胞が、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼと０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液で骨髄組織を酵素処理して得られたものである請求項１又は２に記載の組織再生用材料。
【請求項4】
骨髄組織から骨髄由来間葉系幹細胞が分離されてなる組織再生用材料の製造方法であって、
骨髄組織に対し、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼと０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液を用いて３６℃以上３８℃以下で５分以上３０分未満酵素処理する請求項１～３のいずれかに記載の組織再生用材料の製造方法。
骨髄組織に対し、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼと０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液を用いて３６℃以上３８℃以下で５分以上３０分未満酵素処理する請求項１～３のいずれかに記載の組織再生用材料の製造方法。
【請求項5】
粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであって、
コラゲナーゼ及びディスパーゼを含む粉材（Ｘ）と、緩衝液を含む液剤（Ｙ）とを、コラゲナーゼ及びディスパーゼの濃度がそれぞれ０．５～１．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合して骨髄組織に対して酵素処理することにより、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を得ることを特徴とする粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キット。
コラゲナーゼ及びディスパーゼを含む粉材（Ｘ）と、緩衝液を含む液剤（Ｙ）とを、コラゲナーゼ及びディスパーゼの濃度がそれぞれ０．５～１．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合して骨髄組織に対して酵素処理することにより、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を得ることを特徴とする粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
間葉系幹細胞は、骨髄組織、脂肪組織等に存在し、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞等の間葉系に属する細胞への分化能を有しているため、再生医療等の分野での利用が期待されている。しかしながら、骨髄液に含まれる間葉系幹細胞は、その量が十分ではないため、臨床治療に用いる際には、間葉系幹細胞を培養して増殖する場合があった。
【0003】
例えば、特許文献１には、骨髄液に含まれる細胞を、少なくとも培養面にリン酸カルシウム類を含有する不織布上で培養する、骨髄由来間葉系幹細胞の分離方法が記載されている。これによれば、単純な培養操作で、容易に特定の幹細胞を選択的に分離培養することができるとされている。しかしながら、不織布上で少なくとも数日から１週間程度は培養する必要があるため、その間の感染リスクがあることや培養の維持に費用を要し、更なる改善が望まれていた。
【0004】
一方、特許文献２には、骨基質を主成分とする骨組織部分であって骨髄とは区別される組織である骨質を材料とし、間葉系幹細胞を分離する方法が記載されている。これによれば、間葉系幹細胞を効率的に分離することができるため、容易に大量の間葉系幹細胞を調製することができるとされている。しかしながら、特許文献２で得られる骨質由来の間葉系幹細胞と、骨髄由来の間葉系幹細胞の細胞群は異なるため、骨質からレプチン受容体陽性細胞を必ずしも効率的に得られる訳ではなかった。また、骨質を材料とする場合、骨組織部分を乳鉢等で粉砕する手間がかかるため、簡便かつ効率的な間葉系幹細胞の分離方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】ＷＯ２０１８／０９７１９８号
【特許文献2】特開２０１５－３９３０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、骨髄組織から短時間で簡便な処理によりレプチン受容体陽性細胞数が一定以上の骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができる組織再生用材料を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記課題は、骨髄組織から骨髄由来間葉系幹細胞が分離されてなる組織再生用材料であって、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むことを特徴とする組織再生用材料を提供することによって解決される。
【0008】
このとき、骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数が９６×１０４／ｇ以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むことが好適な実施態様であり、前記骨髄由来間葉系幹細胞が、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼと０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液で骨髄組織を酵素処理して得られたものであることが好適な実施態様である。
【0009】
また、上記課題は、骨髄組織から骨髄由来間葉系幹細胞が分離されてなる組織再生用材料の製造方法であって、骨髄組織に対し、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼと０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液を用いて３６℃以上３８℃以下で５分以上３０分未満酵素処理する組織再生用材料の製造方法を提供することによって解決される。
【0010】
さらに、上記課題は、粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであって、コラゲナーゼ及びディスパーゼを含む粉材（Ｘ）と、緩衝液を含む液剤（Ｙ）とを、コラゲナーゼ及びディスパーゼの濃度がそれぞれ０．５～１．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合して骨髄組織に対して酵素処理することにより、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を得ることを特徴とする粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットを提供することによっても解決される。
【発明の効果】
【0011】
本発明により、骨髄組織から短時間で簡便な処理によりレプチン受容体陽性細胞数が一定以上の骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができる。こうして得られた骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料は、移植後の細胞の生着が良好であり、骨髄由来の骨・軟骨形成を誘導させることが可能となるため、再生医療の分野に特に適している。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】コラゲナーゼ濃度とディスパーゼ濃度を変化させてレプチン受容体陽性細胞数を計測した結果を示した図である。
【図2】本発明の組織再生用材料をマウスに静脈投与するように用いることを示した図である。
【図3】比較例１の組織再生用材料をマウスに移植し、背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、ＨＥ染色した結果（左側）と免疫組織化学的染色した結果（右側）を示した図である。
【図4】実施例１の組織再生用材料をマウスに移植し、背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、ＨＥ染色した結果（左側）と免疫組織化学的染色した結果（右側）を示した図である。
【図5】比較例１と実施例１の組織再生用材料をそれぞれマウスに移植し、背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、免疫組織化学的染色した結果を比較した図である（比較例１：左側、実施例１：右側）。
【図6】実施例１の組織再生用材料をマウスに移植し、背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、ＧＦＰとＲＵＮＸ２のモノクローナル抗体を用いて蛍光免疫二重染色した結果を示した図である。
【図7】実施例１の組織再生用材料をマウスに移植し、背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、ＧＦＰとＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｅのモノクローナル抗体を用いて蛍光免疫二重染色した結果を示した図である。
【図8】比較例１と実施例１の組織再生用材料をそれぞれマウスに移植し、背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、免疫組織化学的染色して異所性骨周囲の間質を観察した結果を比較した図である（比較例１：左側、実施例１：右側）。
【図9】実施例１の組織再生用材料をマウスに移植し、背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、免疫組織化学的染色して異所性骨周囲の間質を観察した結果（左側）と蛍光免疫二重染色して異所性骨周囲の間質を観察した結果（右側）を示した図である。
【図10】実施例１の組織再生用材料をマウスに移植し、背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、ＧＦＰとＲＵＮＸ２のモノクローナル抗体を用いて蛍光免疫二重染色して異所性骨周囲の間質を観察した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の組織再生用材料は、骨髄組織から骨髄由来間葉系幹細胞が分離されてなる組織再生用材料であって、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むことを特徴とするものである。
【0014】
レプチン受容体陽性細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞等の間葉系に属する細胞への分化において最も有用な細胞と考えられているが、骨髄液に含まれる間葉系幹細胞の量が十分ではないため、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を得ることは困難であった。後述する実施例と比較例との対比から分かるように、コラゲナーゼとディスパーゼの少なくとも一方が特定の濃度範囲を満たさない場合、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上とならず、これに対し、コラゲナーゼとディスパーゼが特定の濃度範囲にあることで、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞が得られることが本発明者らの検討により明らかとなった。このように、骨髄組織を酵素処理する条件によりレプチン受容体陽性細胞数が大きく異なることは本発明者らにより初めて確認されたものである。
【0015】
本発明の組織再生用材料は、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むものであり、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞等の間葉系に属する細胞へ分化させるために好適に用いることができる。特に、骨髄組織から短時間で簡便な処理により骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができるため、本発明の組織再生用材料を移植材料として好適に用いることができる。後述する実施例から明らかなように、本発明の組織再生用材料を移植することにより、移植後の細胞の生着が良好であり、骨髄由来の骨・軟骨形成を誘導させることが可能となるため、再生医療の分野に特に適しており、本発明の組織再生用材料を骨・軟骨形成剤として好適に用いることができる。
【0016】
本発明におけるレプチン受容体陽性細胞数は、フローサイトメトリーにより計測された細胞数であり、骨髄細胞の全細胞数を予め計測し、緩衝液０．２ｍＬ中の全細胞数が一定数となるように調製された組織再生用材料における細胞数を表すものである。フローサイトメトリーは、蛍光標識された細胞を含む懸濁液を細管に通し、一定波長のレーザー光を照射して光学的に検出する方法であり、レプチン受容体陽性細胞数を定量的に測定することが可能である。フローサイトメトリーに用いられる装置はフローサイトメーターである。各社から販売されているフローサイトメーターを用い、取扱説明書に従って測定することができる。また、骨髄細胞の全細胞数は、各社から販売されているセルカウンターを用いて定量的に測定することが可能である。セルカウンターとしては、前述のフローサイトメトリーに用いられるフローサイトメーターであってもよいし、細胞が開口部を通る際の電気抵抗の変化を測定することにより細胞数を計測するセルカウンターであってもよいし、オートフォーカスによる顕微鏡画像を画像処理して細胞数を計測するセルカウンターであってもよい。これらセルカウンターは、取扱説明書に従って測定することができる。
【0017】
本発明において、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４未満を示す骨髄由来間葉系幹細胞の場合、生体に生着するには不十分な量となり、組織再生用材料としての使用には適さない。かかる観点から、本発明の組織再生用材料におけるレプチン受容体陽性細胞数としては、５．２×１０４以上が好ましく、５．５×１０４以上がより好ましく、５．８×１０４以上がさらに好ましい。なお、本発明において、レプチン受容体陽性細胞数は、通常、９．９×１０４以下である。
【0018】
また、本発明の組織再生用材料は、骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数が９６×１０４／ｇ以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含むことが好ましい。骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数が９６×１０４／ｇ未満を示す骨髄由来間葉系幹細胞の場合、生体に生着するには不十分な量となるおそれがある。かかる観点から、骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１００×１０４／ｇ以上がより好ましく、１０５×１０４／ｇ以上がさらに好ましく、１１０×１０４／ｇ以上が特に好ましい。なお、本発明において、骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、通常、１９０×１０４以下である。
【0019】
本発明の組織再生用材料は、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼと０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液で骨髄組織を酵素処理することにより好適に得られるものである。本発明者らの検討により、コラゲナーゼとディスパーゼが特定の濃度範囲にあることで、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞が得られることが明らかとなった。後述する実施例と比較例との対比から分かるように、コラゲナーゼ濃度とディスパーゼ濃度の両方が上記濃度範囲を満たさない比較例１、３、４及び５、コラゲナーゼ濃度は上記濃度範囲を満たすがディスパーゼ濃度が上記濃度範囲を満たさない比較例２及び６、ディスパーゼ濃度は上記濃度範囲を満たすがコラゲナーゼ濃度が上記濃度範囲を満たさない比較例７では、いずれもレプチン受容体陽性細胞数が一定以上とならないため、生体に生着するには不十分な量となる。これに対し、コラゲナーゼとディスパーゼが上記濃度範囲にある実施例１では、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができるため、移植材料として好適に用いることができる。コラゲナーゼ濃度の下限値としては、０．６ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．８ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．９ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。一方、コラゲナーゼ濃度の上限値としては、１．４ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、１．３ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、１．２ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。また、ディスパーゼ濃度の下限値としては、０．６ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．８ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．９ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。一方、ディスパーゼ濃度の上限値としては、１．４ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、１．３ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、１．２ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。
【0020】
前記コラゲナーゼと前記ディスパーゼを含む緩衝液としては、細胞内液等と同等の浸透圧を有するものであれば特に限定されないが、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、リンゲル液、細胞培養液等を好適に用いることができる。中でも、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、細胞培養液がより好適に用いられる。
【0021】
骨髄組織に対し、前記コラゲナーゼと前記ディスパーゼを含む緩衝液を用いて３６℃以上３８℃以下で５分以上３０分未満酵素処理することが本発明の好適な実施態様である。このように短時間で簡便な処理によりレプチン受容体陽性細胞数が一定以上の骨髄由来間葉系幹細胞を骨髄組織から分離して得ることができる。特に、酵素処理する時間が短時間であることにより、医療現場において酵素処理して組織再生用材料を得て、その場で当該組織再生用材料を移植材料として用いることができる利点を有する。かかる観点から、酵素処理する時間は２５分以下であることがより好ましく、２０分以下であることがさらに好ましい。
【0022】
骨髄組織は、骨の内部から好適に採取することができる。例えば、骨を切断して、骨の内部を緩衝液等で洗い流すことにより骨髄組織を採取する方法が挙げられる。より簡便に行う観点から、前記コラゲナーゼと前記ディスパーゼを含む緩衝液で骨の内部を洗い流すことにより骨髄組織を採取する方法が好適に採用される。骨の種類としては、骨髄組織が含まれる骨であれば特に限定されず、大腿骨、脛骨、腓骨、顎骨、上腕骨等が挙げられ、中でも大腿骨又は脛骨が好適に用いられ、大腿骨がより好適に用いられる。
【0023】
上記説明したように、本発明では短時間で簡便な処理により骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができるため、医療現場において酵素処理して組織再生用材料を得て、その場で当該組織再生用材料を移植材料として用いることも可能である。かかる観点から、粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであって、コラゲナーゼ及びディスパーゼを含む粉材（Ｘ）と、緩衝液を含む液剤（Ｙ）とを、コラゲナーゼ及びディスパーゼの濃度がそれぞれ０．５～１．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合して骨髄組織に対して酵素処理することにより、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を得ることを特徴とする粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであることが本発明の実施態様の一つである。また、粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであって、コラゲナーゼを含む粉材（Ｘ）と、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼを含む緩衝液を含む液剤（Ｙ）とを、コラゲナーゼの濃度が０．５～１．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合して骨髄組織に対して酵素処理することにより、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を得ることを特徴とする粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであることも本発明の実施態様の一つである。さらに、粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであって、ディスパーゼを含む粉材（Ｘ）と、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼを含む緩衝液を含む液剤（Ｙ）とを、ディスパーゼの濃度が０．５～１．５ｍｇ／ｍＬとなるように混合して骨髄組織に対して酵素処理することにより、レプチン受容体陽性細胞数が５．０×１０４以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を得ることを特徴とする粉材（Ｘ）と液剤（Ｙ）とからなる組織再生用材料キットであることも本発明の実施態様の一つである。
【0024】
本発明の組織再生用材料は、ヒトだけでなく、ヒト以外の哺乳動物に対しても好適に用いることができる。本発明の組織再生用材料を骨、軟骨、血管、脂肪細胞等の組織の再生を目的とする部位に対して直接投与するように用いてもよいし、静脈注射により投与するように用いてもよい。特に、短時間で簡便な処理により骨髄由来間葉系幹細胞を得ることができるため、医療現場において酵素処理して組織再生用材料を得て、その場で当該組織再生用材料を投与するように用いてもよく、滅菌処理や再手術等を行わずに当該組織再生用材料を投与できる利点を有する。投与する際に、他の医薬を併用しても構わない。例えば、骨欠損部位に対してＢＭＰ－２を投与しつつ、本発明の組織再生用材料を投与するように用いることも好適な実施態様である。また、本発明の組織再生用材料を培養して投与するように用いることも好適な実施態様であり、さらに本発明の組織再生用材料を分化させてから投与するように用いることも好適な実施態様である。本発明では、短時間で簡便な処理によりレプチン受容体陽性細胞数が一定以上を示す骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料が得られるため、再生医療や実験等において幅広い応用が可能となる。
【実施例0025】
以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。
【0026】
［試薬］
（１）１０×ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）
ＮａＣｌ（１３７０ｍＭ）８０ｇ、ＫＣｌ（２７ｍＭ）２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４（８１ｍＭ）１１．５ｇ、及びＫＨ２ＰＯ４（１４．７ｍＭ）２ｇを滅菌水で１Ｌにメスアップして調製した。
（２）１×ＰＢＳ
上記（１）１０×ＰＢＳを滅菌水で１０倍希釈した。
（１）１０×ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）
ＮａＣｌ（１３７０ｍＭ）８０ｇ、ＫＣｌ（２７ｍＭ）２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４（８１ｍＭ）１１．５ｇ、及びＫＨ２ＰＯ４（１４．７ｍＭ）２ｇを滅菌水で１Ｌにメスアップして調製した。
（２）１×ＰＢＳ
上記（１）１０×ＰＢＳを滅菌水で１０倍希釈した。
【0027】
［実験動物］
７週齢雌性ＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ/６－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ））と７週齢雌性同系野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ/６Ｊ）を使用した。
７週齢雌性ＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ/６－Ｔｇ（ＣＡＧ－ＥＧＦＰ））と７週齢雌性同系野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ/６Ｊ）を使用した。
【0028】
［骨髄細胞の全細胞数］
採取された骨髄細胞の細胞数を、セルカウンター（ＴＣ２０ＴＭ 全自動セルカウンター、ＢＩＯ ＲＡＤ）でカウントした。計測方法は下記のとおりである。シャーレ状に流し出した骨髄細胞が含まれたＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒから１０μＬを採取し、同量のトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ ＃１４５００２１、ＢＩＯ ＲＡＤ）で染色を行い、直ちに前記セルカウンターを用いて１０μＬ中の細胞数の計測を行った。ここから得られた情報を元に、骨髄細胞の全細胞数を算出した。
採取された骨髄細胞の細胞数を、セルカウンター（ＴＣ２０ＴＭ 全自動セルカウンター、ＢＩＯ ＲＡＤ）でカウントした。計測方法は下記のとおりである。シャーレ状に流し出した骨髄細胞が含まれたＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒから１０μＬを採取し、同量のトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ ＃１４５００２１、ＢＩＯ ＲＡＤ）で染色を行い、直ちに前記セルカウンターを用いて１０μＬ中の細胞数の計測を行った。ここから得られた情報を元に、骨髄細胞の全細胞数を算出した。
【0029】
［レプチン受容体陽性細胞数］
実施例及び比較例において、酵素処理後の骨髄細胞をフローサイトメーター（和研薬株式会社製「ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０」）を用いてレプチン受容体陽性細胞数を計測した。
実施例及び比較例において、酵素処理後の骨髄細胞をフローサイトメーター（和研薬株式会社製「ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０」）を用いてレプチン受容体陽性細胞数を計測した。
【0030】
［組織再生用材料の移植］
野生型マウス（Ｃ５７ＢＪ／６）にＸ線照射装置（株式会社日立メディコ製「ＭＢＲ－１５２０Ｒ」）を用いて総量１０ＧｙのＸ線照射を行い、２７Ｇ注射器により０．５ｍＬ／匹で組織再生用材料を経尾静脈投与した。
野生型マウス（Ｃ５７ＢＪ／６）にＸ線照射装置（株式会社日立メディコ製「ＭＢＲ－１５２０Ｒ」）を用いて総量１０ＧｙのＸ線照射を行い、２７Ｇ注射器により０．５ｍＬ／匹で組織再生用材料を経尾静脈投与した。
【0031】
［ＩＢＭ（不溶性骨基質）の移植］
後述する実施例１と比較例１の組織再生用材料をそれぞれ上記「組織再生用材料の移植」に記載の方法にしたがってマウスに移植し、骨髄生着期間として２８日間設けた。その後、マウスの背部皮下にＩＢＭ（Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ Ｂｏｎｅ Ｍａｔｒｉｘ）を１５０ｍｇとＢＭＰ－２（ＰＥＰＲＯ ＴＥＣＨ社製）を１０μｇ移植し、強制的に背部皮下に異所性の骨組織を誘導させた。なお、ＩＢＭは、脱水したラットの大腿骨と脛骨を粉砕機により粉砕して０．５ＭのＨＣｌで脱灰したものを使用した。背部皮下への移植から２８日後、マウスを屠殺し、背部皮下の異所性骨組織を摘出してホルマリン固定、ＥＤＴＡ脱灰後、通法にしたがって組織切片を作成した。
後述する実施例１と比較例１の組織再生用材料をそれぞれ上記「組織再生用材料の移植」に記載の方法にしたがってマウスに移植し、骨髄生着期間として２８日間設けた。その後、マウスの背部皮下にＩＢＭ（Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ Ｂｏｎｅ Ｍａｔｒｉｘ）を１５０ｍｇとＢＭＰ－２（ＰＥＰＲＯ ＴＥＣＨ社製）を１０μｇ移植し、強制的に背部皮下に異所性の骨組織を誘導させた。なお、ＩＢＭは、脱水したラットの大腿骨と脛骨を粉砕機により粉砕して０．５ＭのＨＣｌで脱灰したものを使用した。背部皮下への移植から２８日後、マウスを屠殺し、背部皮下の異所性骨組織を摘出してホルマリン固定、ＥＤＴＡ脱灰後、通法にしたがって組織切片を作成した。
【0032】
［ヘマトキシリン（ＨＥ）染色］
得られた上記組織切片をキシレンにて脱パラフィンし、１００％から７０％エタノール（１００％、９０％、８０％、７０％の順）、及び精製水を用いて再水和後、ＨＥ染色を行った。７０％から１００％エタノール（７０％、８０％、９０％、１００％の順）、及びキシレンを用いて脱水・透徹を行った後、Ｅｎｔｅｌｌａｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）にて封入し、システム生物顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製「ＢＸ５３」）により組織学的観察を行った。
得られた上記組織切片をキシレンにて脱パラフィンし、１００％から７０％エタノール（１００％、９０％、８０％、７０％の順）、及び精製水を用いて再水和後、ＨＥ染色を行った。７０％から１００％エタノール（７０％、８０％、９０％、１００％の順）、及びキシレンを用いて脱水・透徹を行った後、Ｅｎｔｅｌｌａｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）にて封入し、システム生物顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製「ＢＸ５３」）により組織学的観察を行った。
【0033】
［免疫組織化学的染色］
得られた上記組織切片の脱パラフィン後、室温（２５℃）で３０分間０．３％過酸化水素メタノール溶液にて内因性ペルオキシダーゼをブロックし、精製水で洗浄した。抗体として、ＧＦＰ（ａｂｃａｍ）、ＲＵＮＸ２（ａｂｃａｍ）、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｅ（ａｂｃａｍ）のモノクローナル抗体を用い、システム生物顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製「ＢＸ５３」）により観察を行った。陰性対照は二次抗体のみで行い、すべて陰性であった。
得られた上記組織切片の脱パラフィン後、室温（２５℃）で３０分間０．３％過酸化水素メタノール溶液にて内因性ペルオキシダーゼをブロックし、精製水で洗浄した。抗体として、ＧＦＰ（ａｂｃａｍ）、ＲＵＮＸ２（ａｂｃａｍ）、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｅ（ａｂｃａｍ）のモノクローナル抗体を用い、システム生物顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製「ＢＸ５３」）により観察を行った。陰性対照は二次抗体のみで行い、すべて陰性であった。
【0034】
［蛍光免疫二重染色］
ＧＦＰ（ａｂｃａｍ）、ＲＵＮＸ２（ａｂｃａｍ）、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｅ（ａｂｃａｍ）のモノクローナル抗体を用いて、蛍光免疫二重染色を行った。各抗体の希釈はＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で行った。二次抗体反応終了後、対比染色としてＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）１μｇ／ｍｌを３分間反応させた。洗浄後にＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｄａｋｏ社製）で封入し、オールインワン蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製「ＢＺ７００」）で観察した。
ＧＦＰ（ａｂｃａｍ）、ＲＵＮＸ２（ａｂｃａｍ）、Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｅ（ａｂｃａｍ）のモノクローナル抗体を用いて、蛍光免疫二重染色を行った。各抗体の希釈はＴＢＳ（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で行った。二次抗体反応終了後、対比染色としてＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）１μｇ／ｍｌを３分間反応させた。洗浄後にＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｄａｋｏ社製）で封入し、オールインワン蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製「ＢＺ７００」）で観察した。
【0035】
実施例１
［Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ］
Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１０ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）１０ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させて調製した。
［Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ］
Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１０ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）１０ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させて調製した。
【0036】
［組織再生用材料］
ＧＦＰトランスジェニックマウス（約１８．９ｇ）を安楽死させ、大腿骨と脛骨を採取した。大腿骨１本の重量は約０．０５２ｇであった。大腿骨の両端をブレードで切断し、シャーレに入れた。１ｍＬシリンジ（２１Ｇ針）を用いてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ４ｍＬを骨の両側から流すことにより、骨髄組織をシャーレ上に流し出した。上述のとおりに骨髄細胞の全細胞数を算出したところ、１．０×１０７ｃｅｌｌｓであった。シャーレ上のＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを１５ｍＬのチューブ（Ａ）に回収した。シャーレ上に残った骨髄組織を新たなＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ２ｍＬで洗い、チューブ（Ａ）に回収した。３７℃のウォータバスに１０分間チューブ（Ａ）を静置して酵素処理を行った。チューブ（Ａ）を転倒混和し、氷上に２分間静置した。溶け残った骨髄組織を沈殿させて、上清を新たな１５ｍＬチューブ（Ｂ）に入れて氷上で保管した。新たなＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ４ｍＬをチューブ（Ａ）に入れて、３７℃のウォータバスに１０分間チューブ（Ａ）を静置して酵素処理を行った。チューブ（Ａ）を転倒混和し、チューブ（Ａ）とチューブ（Ｂ）を１５００ｒｐｍで５分間遠心した。アスピレーターで上清を取り除き、Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＨ４Ｃｌ（１５０ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３（１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ２Ｎａ（１ｍＭ））を１ｍＬずつチューブ（Ａ）とチューブ（Ｂ）を加え、ピペッティングにて懸濁後、チューブ（Ａ）とチューブ（Ｂ）の中身をチューブ（Ａ）の方にまとめた。１分後、２％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）／ＰＢＳを５ｍＬ加えて懸濁後、１５００ｒｐｍで５分間遠心した。アスピレーターで上清を取り除き、０．１Ｍ ＰＢＳ／ＨＢＳＳで希釈し、約１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬに調製して組織再生用材料を得た。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、６．０×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１１５．４×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。また、マウスの背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、組織学的解析を行った結果を図４、５（右側）、６、７、８（右側）、９及び１０にそれぞれ示す。
ＧＦＰトランスジェニックマウス（約１８．９ｇ）を安楽死させ、大腿骨と脛骨を採取した。大腿骨１本の重量は約０．０５２ｇであった。大腿骨の両端をブレードで切断し、シャーレに入れた。１ｍＬシリンジ（２１Ｇ針）を用いてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ４ｍＬを骨の両側から流すことにより、骨髄組織をシャーレ上に流し出した。上述のとおりに骨髄細胞の全細胞数を算出したところ、１．０×１０７ｃｅｌｌｓであった。シャーレ上のＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを１５ｍＬのチューブ（Ａ）に回収した。シャーレ上に残った骨髄組織を新たなＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ２ｍＬで洗い、チューブ（Ａ）に回収した。３７℃のウォータバスに１０分間チューブ（Ａ）を静置して酵素処理を行った。チューブ（Ａ）を転倒混和し、氷上に２分間静置した。溶け残った骨髄組織を沈殿させて、上清を新たな１５ｍＬチューブ（Ｂ）に入れて氷上で保管した。新たなＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ４ｍＬをチューブ（Ａ）に入れて、３７℃のウォータバスに１０分間チューブ（Ａ）を静置して酵素処理を行った。チューブ（Ａ）を転倒混和し、チューブ（Ａ）とチューブ（Ｂ）を１５００ｒｐｍで５分間遠心した。アスピレーターで上清を取り除き、Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＨ４Ｃｌ（１５０ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３（１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ２Ｎａ（１ｍＭ））を１ｍＬずつチューブ（Ａ）とチューブ（Ｂ）を加え、ピペッティングにて懸濁後、チューブ（Ａ）とチューブ（Ｂ）の中身をチューブ（Ａ）の方にまとめた。１分後、２％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）／ＰＢＳを５ｍＬ加えて懸濁後、１５００ｒｐｍで５分間遠心した。アスピレーターで上清を取り除き、０．１Ｍ ＰＢＳ／ＨＢＳＳで希釈し、約１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬに調製して組織再生用材料を得た。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、６．０×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１１５．４×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。また、マウスの背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、組織学的解析を行った結果を図４、５（右側）、６、７、８（右側）、９及び１０にそれぞれ示す。
【0037】
比較例１
実施例１において、Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒの代わりにＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬを使用した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、０．３×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、５．８×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。また、マウスの背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、組織学的解析を行った結果を図３、５（左側）及び８（左側）にそれぞれ示す。
実施例１において、Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒの代わりにＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬを使用した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、０．３×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、５．８×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。また、マウスの背部皮下に異所性骨組織を誘導させて得られた組織切片について、組織学的解析を行った結果を図３、５（左側）及び８（左側）にそれぞれ示す。
【0038】
比較例２
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１０ｍｇのみをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１．０×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１９．２×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１０ｍｇのみをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１．０×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１９．２×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
【0039】
比較例３
実施例１において、Ｄｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）２０ｍｇのみをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、２．４×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、４６．２×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
実施例１において、Ｄｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）２０ｍｇのみをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、２．４×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、４６．２×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
【0040】
比較例４
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）２ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、４．６×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、８８．５×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）２ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、４．６×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、８８．５×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
【0041】
比較例５
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）２ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）１ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１．２×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、２３．１×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）２ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）１ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、１．２×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、２３．１×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
【0042】
比較例６
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１０ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）２０ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、３．８×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、７３．１×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）１０ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）２０ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、３．８×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、７３．１×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
【0043】
比較例７
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）２０ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）１０ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、３．６×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、６９．２×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
実施例１において、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０４－０１９）２０ｍｇ、及びＤｉｓｐａｓｅ（ライフテクノロジーズ社製、１７１０５－０４１）１０ｍｇをＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、１４１７５－０９５）１０ｍＬに溶解させてＤｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを調製した以外は実施例１と同様に組織再生用材料を調製した。大腿骨１本（約０．０５２ｇ）あたりのレプチン受容体陽性細胞数は、３．６×１０４であった。すなわち、大腿骨１ｇあたりのレプチン受容体陽性細胞数は、６９．２×１０４／ｇであった。得られた結果を表１にまとめて示す。
【0044】
【表1】
【0045】
比較例１と実施例１とを対比した図３～５の結果から、比較例１では骨芽細胞、軟骨細胞、骨細胞のいずれもＧＦＰ陰性であることが確認され、実施例１では異所性骨と異所性軟骨においてＧＦＰ陽性の骨髄由来骨芽細胞、軟骨細胞及び骨細胞が確認されており、移植後の細胞の生着が良好であった。なお、比較例１と実施例１のいずれもＧＦＰ陽性の炎症細胞が確認された。また、図６の結果から、ＧＦＰ陽性の骨髄由来細胞においてＲＵＮＸ２の発現が確認され、図７の結果から、ＧＦＰ陽性の骨髄由来細胞においてＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｅの発現が確認され、実施例１のＧＦＰ陽性細胞は骨髄由来骨細胞と軟骨細胞であることが確認された。また、異所性骨周囲の間質を観察した図８の結果から、比較例１では間質細胞はＧＦＰ陰性であったが、実施例１では異所性骨周囲の間質細胞にＧＦＰ陽性細胞が多数存在していることが確認された。そして、図９及び１０の結果から、間質に存在するＧＦＰ陽性の骨髄由来細胞においてＲＵＮＸ２の発現が確認されており、異所性骨周囲の間質におけるＧＦＰ陽性細胞は、ＲＵＮＸ２陽性の骨髄由来の骨前駆細胞であることが確認された。以上のことから、レプチン受容体陽性細胞数が一定以上の骨髄由来間葉系幹細胞を含む組織再生用材料を移植することにより、移植後の細胞の生着が良好であり、骨髄由来の骨・軟骨形成を誘導させることが可能となることが分かる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
