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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022061931
(43)【公開日】2022-04-19
(54)【発明の名称】足場ペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220412BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220412BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20220412BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220412BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220412BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220412BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220412BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20220412BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20220412BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/63 Z
C07K14/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12M1/00 A
C12M3/00 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020206671
(22)【出願日】2020-12-14
(31)【優先権主張番号】P 2020169730
(32)【優先日】2020-10-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「先端的バイオ創薬等基盤技術開発事業」、「高性能中分子医薬のスマートデザイン基盤技術開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100090251
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】門之園 哲哉
(72)【発明者】
【氏名】近藤 科江
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA08
4B029AA21
4B029BB11
4B029CC02
4B029GA08
4B029GB10
4B065AA19X
4B065AA26X
4B065AA50X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA46
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA18
4H045CA40
4H045EA20
4H045EA34
4H045EA50
4H045EA65
4H045FA20
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】短鎖ペプチドを安定化できるスキャホルドを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列における第１～第３の特定の提示領域に、それぞれ４個、３個および７個のアミノ酸からなるペプチドが提示されている足場ペプチドによる。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列における第１～第３の特定の提示領域に、それぞれ４個、３個および７個のアミノ酸からなるペプチドが提示されている足場ペプチドによる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で表されるアミノ酸配列における４～７番の第１提示領域への４個のアミノ酸からなるペプチドの提示、９～１１番の第２提示領域への３個のアミノ酸からなるペプチドの提示、及び１３～１９番の第３提示領域への７個のアミノ酸からなるペプチドの提示からなる群から選択される１つ以上の提示を有する足場ペプチド。
【請求項2】
請求項１に記載の足場ペプチドを含む足場ペプチドであって、
前記第１提示領域、第２提示領域、及び第３提示領域からなる群から選択される１つ以上の提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である、足場ペプチド。
前記第１提示領域、第２提示領域、及び第３提示領域からなる群から選択される１つ以上の提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である、足場ペプチド。
【請求項3】
配列番号１で表されるアミノ酸配列における、１番のチロシン、２番のアラニン、１２番のフェニルアラニン、２０番のアルギニン、２２番のイソロイシン、２３番のアルギニン、及び２４番のイソロイシンの１つ以上が他のアミノ酸に置換されており、且つ前記第１提示領域、第２提示領域、及び第３提示領域からなる群から選択される１つ以上の提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である、請求項１又は２に記載の足場ペプチド。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の足場ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項5】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項6】
請求項５に記載のベクターを含む宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、足場ペプチドに関する。本発明によれば、標的結合ペプチドの構造を安定化することができる。
【背景技術】
【0002】
最近、ペプチドを用いたペプチド医薬が開発され、それらの活性物質と、標的分子の結合が、種々の分析を駆使して解析されている。しかし、ペプチドは体内ではプロテアーゼによる分解を受けやすく、容易に結合力を失ってしまう。そのため、プロテアーゼ分解への耐性を高めるために、種々の化学修飾法や安定化技術の開発が進められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開２０１４／１７５３０５号明細書
【特許文献2】国際公開２０１７／１１５８２８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかしながら、ペプチドは全体の構造が簡単に変わる針金のような構造をしており、構造が変化してプロテアーゼの基質ポケットに入った場合にペプチド結合が加水分解される。従って、プロテアーゼ分解を防ぐためには、基質ポケットに入らないように、構造を一定に保持する土台（scaffold）が有用である。本発明者らは、このようなscaffoldの開発を行ってきた（特許文献１及び２）。しかしながら、さらに効率的なscaffoldの開発が期待されている。
従って、本発明の目的は、短鎖ペプチドを安定化できるスキャホルドを提供することである。
従って、本発明の目的は、短鎖ペプチドを安定化できるスキャホルドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、短鎖ペプチドを安定化できるスキャホルドについて、鋭意研究した結果、驚くべきことに、２５アミノ酸からなるペプチドに短鎖ペプチドを安定化できる３カ所の特定の領域が存在することを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列における４～７番の第１提示領域への４個のアミノ酸からなるペプチドの提示、９～１１番の第２提示領域への３個のアミノ酸からなるペプチドの提示、及び１３～１９番の第３提示領域への７個のアミノ酸からなるペプチドの提示からなる群から選択される１つ以上の提示を有する足場ペプチド、
［２］［１］に記載の足場ペプチドを含む足場ペプチドであって、前記第１提示領域、第２提示領域、及び第３提示領域からなる群から選択される１つ以上の提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である、足場ペプチド、
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列における、１番のチロシン、２番のアラニン、１２番のフェニルアラニン、２０番のアルギニン、２２番のイソロイシン、２３番のアルギニン、及び２４番のイソロイシンの１つ以上が他のアミノ酸に置換されており、且つ前記第１提示領域、第２提示領域、及び第３提示領域からなる群から選択される１つ以上の提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である、［１］又は［２］に記載の足場ペプチド、
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の足場ペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、及び
［６］［５］に記載のベクターを含む宿主、
に関する。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列における４～７番の第１提示領域への４個のアミノ酸からなるペプチドの提示、９～１１番の第２提示領域への３個のアミノ酸からなるペプチドの提示、及び１３～１９番の第３提示領域への７個のアミノ酸からなるペプチドの提示からなる群から選択される１つ以上の提示を有する足場ペプチド、
［２］［１］に記載の足場ペプチドを含む足場ペプチドであって、前記第１提示領域、第２提示領域、及び第３提示領域からなる群から選択される１つ以上の提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である、足場ペプチド、
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列における、１番のチロシン、２番のアラニン、１２番のフェニルアラニン、２０番のアルギニン、２２番のイソロイシン、２３番のアルギニン、及び２４番のイソロイシンの１つ以上が他のアミノ酸に置換されており、且つ前記第１提示領域、第２提示領域、及び第３提示領域からなる群から選択される１つ以上の提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である、［１］又は［２］に記載の足場ペプチド、
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の足場ペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、及び
［６］［５］に記載のベクターを含む宿主、
に関する。
【発明の効果】
【0006】
本発明の足場ペプチドによれば、短鎖ペプチドの構造を安定化することができる。本発明の足場ペプチドは、分子サイズが小さいため、容易に化学合成できる。また、短鎖ペプチドの挿入部位を３カ所有し、複数のペプチドを導入することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】本発明の足場ペプチドの亜鉛の結合を示した図である。
【図2】ＺｎＦペプチドの安定な構造を示すアミノ酸鎖長を検討したグラフである。
【図3】本発明の足場ペプチドにおける短鎖ペプチドと置換可能な領域を検討したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明の足場ペプチドの１つの実施態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における４～７番の第１提示領域への４個のアミノ酸からなるペプチドの提示、９～１１番の第２提示領域への３個のアミノ酸からなるペプチドの提示、及び１３～１９番の第３提示領域への７個のアミノ酸からなるペプチドの提示からなる群から選択される１つ以上のペプチドの提示を有する（第１実施態様と称することがある）。具体的には、
ＹＡＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＲＨＩＲＩＨ
で表されるアミノ酸配列からなる足場ペプチドであり、「Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４」が第１提示領域であり、「Ｘ５Ｘ６Ｘ７」が第２提示領域であり、「Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４」が第３提示領域である。
すなわち、本発明の足場ペプチドの１つの実施態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における、１～３番のＹＡＣ、８番のＣ、１２番のＦ、及び２０～２５番のＲＨＩＲＩＨを含み、４～７番の提示領域への４個のアミノ酸からなるペプチドの提示、９～１１番の提示領域への３個のアミノ酸からなるペプチドの提示、及び１３～１９番の提示領域の７個のアミノ酸からなるペプチドの提示の１つ、又は２つ以上を含む。
前記ペプチドの提示は、好ましくは２つの提示領域へのペプチド提示であり、最も好ましくは３つの提示領域へのペプチド提示である。前記Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４に提示されるペプチドはオリジナルのＰＶＥＳでもよく、前記Ｘ５Ｘ６Ｘ７のペプチドはオリジナルのＤＲＲでもよく、前記にＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４のペプチドはオリジナルのＳＲＳＤＥＬＴでもよい。オリジナルのペプチドがいずれか２つの提示領域に提示されている場合、１つの提示領域に提示ペプチドが提示されていることを意味し、オリジナルのペプチドがいずれか１つの提示領域に提示されている場合、２つの提示領域に提示ペプチドが提示されていることを意味する。
ＹＡＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＲＨＩＲＩＨ
で表されるアミノ酸配列からなる足場ペプチドであり、「Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４」が第１提示領域であり、「Ｘ５Ｘ６Ｘ７」が第２提示領域であり、「Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４」が第３提示領域である。
すなわち、本発明の足場ペプチドの１つの実施態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における、１～３番のＹＡＣ、８番のＣ、１２番のＦ、及び２０～２５番のＲＨＩＲＩＨを含み、４～７番の提示領域への４個のアミノ酸からなるペプチドの提示、９～１１番の提示領域への３個のアミノ酸からなるペプチドの提示、及び１３～１９番の提示領域の７個のアミノ酸からなるペプチドの提示の１つ、又は２つ以上を含む。
前記ペプチドの提示は、好ましくは２つの提示領域へのペプチド提示であり、最も好ましくは３つの提示領域へのペプチド提示である。前記Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４に提示されるペプチドはオリジナルのＰＶＥＳでもよく、前記Ｘ５Ｘ６Ｘ７のペプチドはオリジナルのＤＲＲでもよく、前記にＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４のペプチドはオリジナルのＳＲＳＤＥＬＴでもよい。オリジナルのペプチドがいずれか２つの提示領域に提示されている場合、１つの提示領域に提示ペプチドが提示されていることを意味し、オリジナルのペプチドがいずれか１つの提示領域に提示されている場合、２つの提示領域に提示ペプチドが提示されていることを意味する。
【0009】
前記提示されるペプチドを構成するアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、又はヒスチジンの生体内のタンパク質を構成する２０種のα－アミノ酸が挙げられる。生体内のタンパク質を構成するα－アミノ酸は基本的にＬ型であるが、本発明のＸ１～Ｘ１４のアミノ酸は、Ｄ型アミノ酸を含んでもよい。
【0010】
また、限定されるものではないが、前記提示されるペプチドを構成するアミノ酸としては、２，３－ジアミノプロピオン酸、α－アミノイソ酪酸、ε－アミノヘキサン酸、δ－アミノ吉草酸、Ｎ－メチルグリシンまたはサルコシン、オルニチン、シトルリン、ｔ－ブチルアラニン、ｔ－ブチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、２－クロロフェニルアラニン、３－クロロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、２－フルオロフェニルアラニン、３－フルオロフェニルアラニン、４－フルオロフェニルアラニン、２－ブロモフェニルアラニン、３－ブロモフェニルアラニン、４－ブロモフェニルアラニン、２－メチルフェニルアラニン、３－メチルフェニルアラニン、４－メチルフェニルアラニン、２－ニトロフェニルアラニン、３－ニトロフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、２－シアノフェニルアラニン、３－シアノフェニルアラニン、４－シアノフェニルアラニン、２－トリフルオロメチルフェニルアラニン、３－トリフルオロメチルフェニルアラニン、４－トリフルオロメチルフェニルアラニン、４－アミノフェニルアラニン、４－ヨードフェニルアラニン、４－アミノメチルフェニルアラニン、２，４－ジクロロフェニルアラニン、３，４－ジクロロフェニルアラニン、２，４－ジフルオロフェニルアラニン、３，４－ジフルオロフェニルアラニン、ピリド－２－イルアラニン、ピリド－３－イルアラニン、ピリド－４－イルアラニン、ナフト－１－イルアラニン、ナフト－２－イルアラニン、チアゾリルアラニン、ベンゾチエニルアラニン、チエニルアラニン、フリルアラニン、ホモフェニルアラニン、ホモチロシン、ホモトリプトファン、ペンタフルオロフェニルアラニン、スチリルアラニン、アウトリルアラニン、３，３－ジフェニルアラニン、３－アミノ－５－フェニルペンタン酸、ペニシラミン、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、β－２－チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、Ｎ（ｗ）－ニトロアルギニン、ホモリジン、ホスホノメチルフェニルアラニン、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホモアスパラギン酸、ホモグルタミン酸、１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４カルボン酸；ピペコリン酸、アゼチジン－３－カルボン酸、１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸；アリルグリシン、プロパルギルグリシン、ホモアラニン、ノルバリン、ホモロイシン、ホモバリン、ホモイソロイシン、ホモアルギニン、Ｎ－アセチルリジン、２，４－ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノ酪酸、Ｎ－メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ヒドロキシプロリン、およびホモプロリンが挙げられる。前記アミノ酸は、好ましくはαアミノ酸である。αアミノ酸が、その構造から、本発明の足場ペプチドの構造を安定させることができるからである。しかしながら、βアミノ酸が数個（例えば４個以下、３個以下、２個以下、又は１個）含まれていても、本発明の足場ペプチドの構造は安定である。
【0011】
本発明の足場ペプチドの骨格となるペプチドは、下記アミノ酸配列：
ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号２）
で表されるＥＧＲ１／ＺＩＦ２６８タンパク質の３３５～３６７番のジンクフィンガー（ＺｎＦ）ペプチド（以下、ＺｎＦペプチドと称することがある）から、Ｎ末端の３アミノ酸及びＣ末端の５アミノ酸を除いた下記アミノ酸配列：
ＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号３）
で表される３３８～３６２番目の２５アミノ酸からなるペプチド（以下、骨格ペプチドと称することがある）である。
ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号２）
で表されるＥＧＲ１／ＺＩＦ２６８タンパク質の３３５～３６７番のジンクフィンガー（ＺｎＦ）ペプチド（以下、ＺｎＦペプチドと称することがある）から、Ｎ末端の３アミノ酸及びＣ末端の５アミノ酸を除いた下記アミノ酸配列：
ＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号３）
で表される３３８～３６２番目の２５アミノ酸からなるペプチド（以下、骨格ペプチドと称することがある）である。
【0012】
図１Ａに示すように、前記ＺｎＦペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端以外のアミノ酸残基は、全て根平均二乗揺らぎ値（ＲＭＳＦ値）が１．５Å以下であり、安定な構造を示す。
また、図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、骨格ペプチドであるＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨの２５アミノ酸を含むペプチドは、骨格ペプチドの領域で安定な構造を示す。しかし、図１Ｄに示すように、例えばＮ末端のチロシン（Ｙ）を除去すると、残りの２４アミノ酸の構造が不安定になり、ＲＭＳＦ値が１．５Åを超えるアミノ酸が増加する。従って、前記２５アミノ酸の骨格ペプチドが、安定な足場ペプチドのための必要最小限の鎖長であると考えられる。
また、図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、骨格ペプチドであるＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨの２５アミノ酸を含むペプチドは、骨格ペプチドの領域で安定な構造を示す。しかし、図１Ｄに示すように、例えばＮ末端のチロシン（Ｙ）を除去すると、残りの２４アミノ酸の構造が不安定になり、ＲＭＳＦ値が１．５Åを超えるアミノ酸が増加する。従って、前記２５アミノ酸の骨格ペプチドが、安定な足場ペプチドのための必要最小限の鎖長であると考えられる。
【0013】
なお、根平均二乗揺らぎ値（ＲＭＳＦ値）は、分子動力学計算によって求めることができる。具体的には、足場ペプチドを、Ａｍｂｅｒ１４プログラムパッケージでそれぞれのペプチドのＲＭＳＦ値を計算する。Amber ff14SB force field、GB/SA implicit solvent modelを使い、スーパーコンピューターTSUBAME3.0において10 nsの計算を行うことによって、ＲＭＳＦ値を得ることができる。
【0014】
本発明の足場ペプチドは、前記骨格ペプチドの３～７番目（ペプチド１領域）の「ＰＶＥＳ」、９～１１番目（ペプチド２領域）の「ＤＲＲ」、及び／又は１３～１９番目（ペプチド３領域）の「ＳＲＳＤＥＬＴ」のアミノ酸を任意のアミノ酸に置換しても、安定な構造を示すことができる。
図３では、前記ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域のペプチドをアラニン（Ａ）に置換しているが、いずれの置換ペプチドも、ＲＭＳＦ値がほぼ１．５Å以下であり、安定な構造を示す。しかしながら、ペプチド３領域のＣ末側のアルギニン（Ｒ）をアラニン（Ａ）に置換すると、多くのアミノ酸のＲＭＳＦ値が１．５Åを超え、不安定な構造となる。また、骨格ペプチドの２２～２４番の「ＩＲＩ」を「ＡＡＡ」に置換したペプチドも、多くのアミノ酸のＲＭＳＦ値が１．５Åを超え、不安定な構造となる。
図３では、前記ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域のペプチドをアラニン（Ａ）に置換しているが、いずれの置換ペプチドも、ＲＭＳＦ値がほぼ１．５Å以下であり、安定な構造を示す。しかしながら、ペプチド３領域のＣ末側のアルギニン（Ｒ）をアラニン（Ａ）に置換すると、多くのアミノ酸のＲＭＳＦ値が１．５Åを超え、不安定な構造となる。また、骨格ペプチドの２２～２４番の「ＩＲＩ」を「ＡＡＡ」に置換したペプチドも、多くのアミノ酸のＲＭＳＦ値が１．５Åを超え、不安定な構造となる。
【0015】
更に、表１には、ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域の少なくとも２領域以上のアミノ酸を、骨格ペプチドのオリジナルのアミノ酸、又はアラニン以外のアミノ酸に置換した足場ペプチドの平均ＲＭＳＦ値を示している。いずれの平均ＲＭＳＦ値も１．５Å以下であり、安定な構造を示している。
【0016】
本発明の足場ペプチドにおいては、前記Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４のアミノ酸（ペプチド１領域）、Ｘ５Ｘ６Ｘ７のアミノ酸（ペプチド２領域）、及び／又はＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４のアミノ酸（ペプチド３領域）の根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である。
ペプチド１領域、ペプチド２領域、及び／又はペプチド３領域のアミノ酸が、骨格ペプチドと異なる短鎖ペプチドの場合の、根平均二乗揺らぎ値（ＲＭＳＦ値）も、分子動力学計算によって求めることができる。具体的には、足場ペプチドの置換領域を、連続アラニンペプチド又は他の置換ペプチドに置換した分子モデルを構築し、同様にAmber14プログラムパッケージでそれぞれのペプチドのRMSF値を計算する。Amber ff14SB force field、GB/SA implicit solvent modelを使い、スーパーコンピューターTSUBAME3.0において10 nsの計算を行う。
ペプチド１領域、ペプチド２領域、及び／又はペプチド３領域のアミノ酸が、骨格ペプチドと異なる短鎖ペプチドの場合の、根平均二乗揺らぎ値（ＲＭＳＦ値）も、分子動力学計算によって求めることができる。具体的には、足場ペプチドの置換領域を、連続アラニンペプチド又は他の置換ペプチドに置換した分子モデルを構築し、同様にAmber14プログラムパッケージでそれぞれのペプチドのRMSF値を計算する。Amber ff14SB force field、GB/SA implicit solvent modelを使い、スーパーコンピューターTSUBAME3.0において10 nsの計算を行う。
【0017】
本発明の足場ペプチドの第２の実施態様は、前記第１実施態様の足場ペプチドを含む足場ペプチド（以下、付加足場ペプチドと称することがある）である。すなわち、前記ＹＡＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＲＨＩＲＩＨのペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に任意のペプチド（タンパク質）が付加されたペプチド（タンパク質）である。実際に、図２Ａの付加足場ペプチドは、前記２５アミノ酸のＮ末に「ＥＲＰ」のアミノ酸が結合し、Ｃ末に「ＴＧＱＫＰ」の５つのアミノ酸が結合しているが、２５アミノ酸の足場ペプチドのアミノ酸は、ＲＭＳＦ値が１．５Å以下であり、安定な構造を示す。また、図２Ｂの付加足場ペプチドは、前記２５アミノ酸のＮ末に「ＥＲＰ」のアミノ酸が結合しているが、同様に２５アミノ酸の足場ペプチドのアミノ酸は、ＲＭＳＦ値が１．５Å以下であり、安定な構造を示す。
すなわち、前記２５アミノ酸の足場ペプチドのＮ末端側、又はＣ末端側にペプチドやタンパク質が付加された場合でも、２５アミノ酸の足場ペプチドの安定化作用は維持される。
すなわち、前記２５アミノ酸の足場ペプチドのＮ末端側、又はＣ末端側にペプチドやタンパク質が付加された場合でも、２５アミノ酸の足場ペプチドの安定化作用は維持される。
【0018】
本発明の付加足場ペプチドにおいては、前記Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４のアミノ酸（ペプチド１領域）、Ｘ５Ｘ６Ｘ７のアミノ酸（ペプチド２領域）、及び／又はＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４のアミノ酸（ペプチド３領域）の根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である。
前記付加足場ペプチドにおいても、根平均二乗揺らぎ値（ＲＭＳＦ値）は、分子動力学計算によって求めることができる。具体的には、足場ペプチドの置換領域を、他の置換ペプチドに置換し、Ｎ末又はＣ末に付加されたペプチド（タンパク質）の分子モデルを構築し、同様にAmber14プログラムパッケージでそれぞれのペプチドのRMSF値を計算する。Amber ff14SB force field、GB/SA implicit solvent modelを使い、スーパーコンピューターTSUBAME3.0において10 nsの計算を行う。仮に、前記第１実施態様の足場ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に任意のペプチドが付加された場合に、足場ペプチドの構造が不安定になることがあっても、前記第１提示領域、第２提示領域、及び／又は第３提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値は本明細書の記載から容易に計算できる。従って、前記第１提示領域、第２提示領域、及び／又は第３提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値が１．５Åを超える足場ペプチドを特定することができる。
前記付加足場ペプチドにおいても、根平均二乗揺らぎ値（ＲＭＳＦ値）は、分子動力学計算によって求めることができる。具体的には、足場ペプチドの置換領域を、他の置換ペプチドに置換し、Ｎ末又はＣ末に付加されたペプチド（タンパク質）の分子モデルを構築し、同様にAmber14プログラムパッケージでそれぞれのペプチドのRMSF値を計算する。Amber ff14SB force field、GB/SA implicit solvent modelを使い、スーパーコンピューターTSUBAME3.0において10 nsの計算を行う。仮に、前記第１実施態様の足場ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に任意のペプチドが付加された場合に、足場ペプチドの構造が不安定になることがあっても、前記第１提示領域、第２提示領域、及び／又は第３提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値は本明細書の記載から容易に計算できる。従って、前記第１提示領域、第２提示領域、及び／又は第３提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値が１．５Åを超える足場ペプチドを特定することができる。
【0019】
本発明の足場ペプチド（付加足場ペプチド）において、ペプチド１領域、ペプチド２領域、及び／又はペプチド３領域が任意のアミノ酸であっても、安定な構造を示すメカニズムは完全に解析されたわけではないが、以下のように推定することができる。しかしながら、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
本発明の足場ペプチドの骨格ペプチドは、図１に示すように亜鉛イオンに結合する亜鉛結合ペプチドである。亜鉛の結合には、３番目のシステイン、８番目のシステイン、２１番目のヒスチジン、及び２５番目のヒスチジンが重要な働きをしていると推定される。更に２５アミノ酸の構造を維持するために、１番目のチロシン、１２番目のフェニルアラニンも構造安定性に寄与していると考えられる。（しかしながら、１番目のチロシン、１２番目のフェニルアラニンは別の特定のアミノ酸に置換されても、一定の構造安定性は維持される。）すなわち、亜鉛イオンに結合するための４つのアミノ酸、及び１番目のチロシン、１２番目のフェニルアラニンを有することにより、本発明の足場ペプチドは、ペプチド１領域、ペプチド２領域、及び／又はペプチド３領域が任意のアミノ酸残基に置換されても、構造の変化が起こらないものと考えられる。
更に、付加足場ペプチドは、２５アミノ酸の足場ペプチドのＮ末側及びＣ末側に任意のペプチド（タンパク質）が付加されているが、前記２５アミノ酸の足場ペプチドが、前記のとおり、強固な構造を有しているため、Ｎ末側及びＣ末側に任意のペプチドが結合していても、２５アミノ酸の足場ペプチドの部分の構造は、それらの影響を受けにくいと考えられる。
本発明の足場ペプチドの骨格ペプチドは、図１に示すように亜鉛イオンに結合する亜鉛結合ペプチドである。亜鉛の結合には、３番目のシステイン、８番目のシステイン、２１番目のヒスチジン、及び２５番目のヒスチジンが重要な働きをしていると推定される。更に２５アミノ酸の構造を維持するために、１番目のチロシン、１２番目のフェニルアラニンも構造安定性に寄与していると考えられる。（しかしながら、１番目のチロシン、１２番目のフェニルアラニンは別の特定のアミノ酸に置換されても、一定の構造安定性は維持される。）すなわち、亜鉛イオンに結合するための４つのアミノ酸、及び１番目のチロシン、１２番目のフェニルアラニンを有することにより、本発明の足場ペプチドは、ペプチド１領域、ペプチド２領域、及び／又はペプチド３領域が任意のアミノ酸残基に置換されても、構造の変化が起こらないものと考えられる。
更に、付加足場ペプチドは、２５アミノ酸の足場ペプチドのＮ末側及びＣ末側に任意のペプチド（タンパク質）が付加されているが、前記２５アミノ酸の足場ペプチドが、前記のとおり、強固な構造を有しているため、Ｎ末側及びＣ末側に任意のペプチドが結合していても、２５アミノ酸の足場ペプチドの部分の構造は、それらの影響を受けにくいと考えられる。
【0020】
本発明の足場ペプチドの第３の実施態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列における、１番のチロシン、２番のアラニン、１２番のフェニルアラニン、２０番のアルギニン、２２番のイソロイシン、２３番のアルギニン、及び２４番のイソロイシンの１つ以上が他のアミノ酸に置換されており、且つ前記第１提示領域、第２提示領域、及び／又は第３提示領域のアミノ酸の平均根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である。
前記のとおり、３番目のシステイン、８番目のシステイン、２１番目のヒスチジン、及び２５番目のヒスチジンが亜鉛と結合しており、本発明の足場ペプチドの構造の安定性に重要である。これ４つのアミノ酸以外の１番のチロシン、２番のアラニン、１２番のフェニルアラニン、２０番のアルギニン、２２番のイソロイシン、２３番のアルギニン、及び２４番のイソロイシンも構造の安定に重要であるが、他のアミノ酸に置き換えても本発明の効果を得ることができる。本発明のアミノ酸の置換数は、最大７つであり、好ましくは６つであり、更に好ましくは５つであり、更に好ましくは４つであり、更に好ましくは３つであり、更に好ましくは２つであり、更に好ましくは１つである。このようにアミノ酸が置換されても、ペプチドの効果が得られる置換を保存的置換と称する。
前記のとおり、３番目のシステイン、８番目のシステイン、２１番目のヒスチジン、及び２５番目のヒスチジンが亜鉛と結合しており、本発明の足場ペプチドの構造の安定性に重要である。これ４つのアミノ酸以外の１番のチロシン、２番のアラニン、１２番のフェニルアラニン、２０番のアルギニン、２２番のイソロイシン、２３番のアルギニン、及び２４番のイソロイシンも構造の安定に重要であるが、他のアミノ酸に置き換えても本発明の効果を得ることができる。本発明のアミノ酸の置換数は、最大７つであり、好ましくは６つであり、更に好ましくは５つであり、更に好ましくは４つであり、更に好ましくは３つであり、更に好ましくは２つであり、更に好ましくは１つである。このようにアミノ酸が置換されても、ペプチドの効果が得られる置換を保存的置換と称する。
【0021】
例えば、１番のチロシンは、限定されるものではないが、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）、又はバリン（Ｖ）に置換しても安定な構造を示す。２番目のアラニン（Ａ）は、限定されるものではないが、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、又はバリン（Ｖ）へ置換しても安定な構造を示す。１２番のフェニルアラニン（Ｆ）は、限定されるものではないが、メチオニン（Ｍ）、又はチロシン（Ｙ）に置換しても安定な構造を示す。２０番のアルギニン（Ｒ）は、限定されるものではないが、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスタミン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、又はトレオニン（Ｔに置換しても安定な構造を示す。２２番のイソロイシン（Ｉ）は、限定されるものではないが、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、又はトロプトファン（Ｗ）に置換しても安定な構造を示す。２３番のアルギニン（Ｒ）は、限定されるものではないが、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、又はトリプトファン（Ｗ）に置換しても安定な構造を示す。２４番のイソロイシン（Ｉ）は、限定されるものではないが、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トロプトファン（Ｗ）、又はチロシン（Ｙ）に置換しても安定な構造を示す。
【0022】
本明細書において「保存的置換」とは、アミノ酸を置換しても、そのペプチドの作用が維持される置換を意味する。例えば、限定されるものではないが、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。また、化学的に類似していない場合でも、アミノ酸の構造が類似したアミノ酸残基で置き換えてもよい。例えばアスパラギン酸（Ｄ）からアラニン（Ａ）への置換、アスパラギン（Ｅ）からアラニン（Ａ）への置換、チロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換などを挙げることができる。
【0023】
（ポリヌクレオチド）
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の足場ペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、足場ポリヌクレオチドと称することがある）。足場ポリヌクレオチドは、リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチドを含んでもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の足場ペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、足場ポリヌクレオチドと称することがある）。足場ポリヌクレオチドは、リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチドを含んでもよい。
【0024】
（ベクター）
本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、ベクターに組み込むことによって、容易に増幅させることができる。また、足場ペプチドとして、容易に発現させることができる。
前記ポリヌクレオチドを組込むベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限り、プラスミド、ファージ、又はウイルス等のいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ－１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、ベクターに組み込むことによって、容易に増幅させることができる。また、足場ペプチドとして、容易に発現させることができる。
前記ポリヌクレオチドを組込むベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限り、プラスミド、ファージ、又はウイルス等のいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ－１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【0025】
（宿主）
本明細書において「宿主」とは、前記ベクターが組込まれ、足場ペプチドを発現できる限りにおいて、限定されるものでない。例えば、ファージベクターの宿主としては、Ｍ１３ファージ、ｆｄファージ、又はＴ７ファージを挙げることができる。
また、細菌のベクターの宿主としては、大腸菌、ストレプトミセス、又は枯草菌を挙げることができる。更に、酵母ベクターの宿主としては、パン酵母、又はメタノール資化性酵母を挙げることができる。昆虫細胞ベクターの宿主としては、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９を挙げることができる。更に、動物細胞ベクターの宿主としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７を挙げることができる。
本明細書において「宿主」とは、前記ベクターが組込まれ、足場ペプチドを発現できる限りにおいて、限定されるものでない。例えば、ファージベクターの宿主としては、Ｍ１３ファージ、ｆｄファージ、又はＴ７ファージを挙げることができる。
また、細菌のベクターの宿主としては、大腸菌、ストレプトミセス、又は枯草菌を挙げることができる。更に、酵母ベクターの宿主としては、パン酵母、又はメタノール資化性酵母を挙げることができる。昆虫細胞ベクターの宿主としては、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９を挙げることができる。更に、動物細胞ベクターの宿主としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７を挙げることができる。
【実施例0026】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0027】
《実施例１》
本実施例では、本発明に用いる骨格ペプチドの領域を検討した。
ＥＧＲ１／ＺＩＦ２６８タンパク質の構造を、ＰＤＢより取得し（ＰＤＢ ＩＤ： ４Ｒ２Ｄ）、下記のアミノ酸番号３３５～３６７のジンクフィンガー（ＺｎＦ）ペプチドの分子モデルを作成した。
ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号２）
ジンクフィンガー（ＺｎＦ）ペプチドの根平均二乗揺らぎ（ＲＭＳＦ）値は、Ａｍｂｅｒ１６プログラムパッケージを用いた分子動力学計算によって求めた。Amber ff14SB force field、GB/SA implicit solvent modelを使い、スーパーコンピューターTSUBAME3.0において10 nsの計算を行った。
Ｎ末端およびＣ末端以外の残基は全てＲＭＳＦ値が１．５Å以下であり、安定な構造を示した（図１Ａ）。
本実施例では、本発明に用いる骨格ペプチドの領域を検討した。
ＥＧＲ１／ＺＩＦ２６８タンパク質の構造を、ＰＤＢより取得し（ＰＤＢ ＩＤ： ４Ｒ２Ｄ）、下記のアミノ酸番号３３５～３６７のジンクフィンガー（ＺｎＦ）ペプチドの分子モデルを作成した。
ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号２）
ジンクフィンガー（ＺｎＦ）ペプチドの根平均二乗揺らぎ（ＲＭＳＦ）値は、Ａｍｂｅｒ１６プログラムパッケージを用いた分子動力学計算によって求めた。Amber ff14SB force field、GB/SA implicit solvent modelを使い、スーパーコンピューターTSUBAME3.0において10 nsの計算を行った。
Ｎ末端およびＣ末端以外の残基は全てＲＭＳＦ値が１．５Å以下であり、安定な構造を示した（図１Ａ）。
【0028】
次に、前記ＺｎＦペプチドのＣ末の「ＴＧＱＫＰ」の５アミノ酸を欠如したペプチド：
（１）ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号４）
ＺｎＦペプチドのＮ末のＮ末の「ＥＲＰ」及びＣ末の「ＴＧＱＫＰ」の５アミノ酸を欠如したペプチド：
（２）ＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号３）、及び
ＺｎＦペプチドのＮ末のＮ末の「ＥＲＰＹ」及びＣ末の「ＴＧＱＫＰ」の５アミノ酸を欠如したペプチド：
（３）ＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号５）
について、ＲＭＳＦ値を計算した。
図１に示すように、前記（１）のペプチドは、Ｎ末端のＥを除き、ＲＭＳＦ値が１．５Å以下であり、安定な構造を示した（図１Ｂ）。また、（２）のペプチドは、すべてのアミノ酸残基のＲＭＳＦ値が１．５Å以下であり、安定な構造を示した（図１Ｃ）。これに対して、前記（３）のペプチドは、８つのアミノ酸残基のＲＭＳＦ値が１．５Åを超え、不安定な構造となった。
従って、ＺｎＦのペプチドの安定的な構造を示すためにアミノ酸は、（２）ＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号３）であると考えられた。
（１）ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号４）
ＺｎＦペプチドのＮ末のＮ末の「ＥＲＰ」及びＣ末の「ＴＧＱＫＰ」の５アミノ酸を欠如したペプチド：
（２）ＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号３）、及び
ＺｎＦペプチドのＮ末のＮ末の「ＥＲＰＹ」及びＣ末の「ＴＧＱＫＰ」の５アミノ酸を欠如したペプチド：
（３）ＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号５）
について、ＲＭＳＦ値を計算した。
図１に示すように、前記（１）のペプチドは、Ｎ末端のＥを除き、ＲＭＳＦ値が１．５Å以下であり、安定な構造を示した（図１Ｂ）。また、（２）のペプチドは、すべてのアミノ酸残基のＲＭＳＦ値が１．５Å以下であり、安定な構造を示した（図１Ｃ）。これに対して、前記（３）のペプチドは、８つのアミノ酸残基のＲＭＳＦ値が１．５Åを超え、不安定な構造となった。
従って、ＺｎＦのペプチドの安定的な構造を示すためにアミノ酸は、（２）ＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号３）であると考えられた。
【0029】
《実施例２》
本実施例では、前記骨格ペプチドにおいて、任意の短鎖ペプチドに置換できる領域を検討した。
実施例１の（１）のペプチドに対して、下記のＳＺｎＦ変異体１～９を作成し、実施例１と同じように、ＲＭＳＦ値を計算した。
ＳＺｎＦ変異体１：ＹＡＣＡＡＡＡＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号６）
ＳＺｎＦ変異体２：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号７）
ＳＺｎＦ変異体３：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号８）
ＳＺｎＦ変異体４：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号９）
ＳＺｎＦ変異体５：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＡＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号１０）
ＳＺｎＦ変異体６：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＡＡＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号１１）
ＳＺｎＦ変異体７：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＡＡＡＲＨＩＲＩＨ（配列番号１２）
ＳＺｎＦ変異体８：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＡＡＡＡＨＩＲＩＨ（配列番号１３）
ＳＺｎＦ変異体９：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＡＡＡＲＨＡＡＡＨ（配列番号１４）
図３に示すように、骨格ペプチドの４～７のアミノ酸、９～１１のアミノ酸、及び１３～１９のアミノ酸の一部又は全部をアラニンに置換したＳＺｎＦ変異体１～７のペプチドは、ＲＭＳＦ値がほぼ１．５Å以下であり、安定な構造を示した。一方、２０番目のアルギニン（Ｒ）をアラニン（Ａ）に置換したＳＺｎＦ変異体８及び２２～２４のアミノ酸を「ＡＡＡ」に置換したＳＺｎＦ変異体９は、ＲＭＳＦ値が１．５Åを超えるアミノ酸があった。
従って、任意のアミノ酸に置換できる領域は、骨格ペプチドの３～７番目（ペプチド１領域）、９～１１番目（ペプチド２領域）、及び１３～１９番目（ペプチド３領域）であることが分かった。
本実施例では、前記骨格ペプチドにおいて、任意の短鎖ペプチドに置換できる領域を検討した。
実施例１の（１）のペプチドに対して、下記のＳＺｎＦ変異体１～９を作成し、実施例１と同じように、ＲＭＳＦ値を計算した。
ＳＺｎＦ変異体１：ＹＡＣＡＡＡＡＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号６）
ＳＺｎＦ変異体２：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号７）
ＳＺｎＦ変異体３：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号８）
ＳＺｎＦ変異体４：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＥＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号９）
ＳＺｎＦ変異体５：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＡＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号１０）
ＳＺｎＦ変異体６：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＡＡＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号１１）
ＳＺｎＦ変異体７：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＡＡＡＲＨＩＲＩＨ（配列番号１２）
ＳＺｎＦ変異体８：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＡＡＡＡＨＩＲＩＨ（配列番号１３）
ＳＺｎＦ変異体９：ＹＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＦＡＡＡＡＡＡＡＲＨＡＡＡＨ（配列番号１４）
図３に示すように、骨格ペプチドの４～７のアミノ酸、９～１１のアミノ酸、及び１３～１９のアミノ酸の一部又は全部をアラニンに置換したＳＺｎＦ変異体１～７のペプチドは、ＲＭＳＦ値がほぼ１．５Å以下であり、安定な構造を示した。一方、２０番目のアルギニン（Ｒ）をアラニン（Ａ）に置換したＳＺｎＦ変異体８及び２２～２４のアミノ酸を「ＡＡＡ」に置換したＳＺｎＦ変異体９は、ＲＭＳＦ値が１．５Åを超えるアミノ酸があった。
従って、任意のアミノ酸に置換できる領域は、骨格ペプチドの３～７番目（ペプチド１領域）、９～１１番目（ペプチド２領域）、及び１３～１９番目（ペプチド３領域）であることが分かった。
【0030】
《実施例３》
本実施例では、前記ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域のアミノ酸を任意のアミノ酸に置換して、ＲＭＳＦ値を計算した。
置換したアミノ酸配列は、表１に示す。９つのペプチドで、ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域の平均ＲＭＳＦ値は、１．５Å以下であり、安定な構造を示した。
本実施例では、前記ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域のアミノ酸を任意のアミノ酸に置換して、ＲＭＳＦ値を計算した。
置換したアミノ酸配列は、表１に示す。９つのペプチドで、ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域の平均ＲＭＳＦ値は、１．５Å以下であり、安定な構造を示した。
【0031】
【表1】
【0032】
《実施例４》
本実施例では、前記足場ペプチドの１番目のチロシン（Ｙ）、２番目のアラニン（Ａ）、１２番のフェニルアラニン（Ｆ）、２０番のアルギニン（Ｒ）、２２番のイソロイシン（Ｉ）、２３番のアルギニン（Ｒ）、及び２４番のイソロイシン（Ｉ）をそれぞれ、別のアミノ酸に置換して、前記ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域の平均ＲＭＳＦ値を計算した。
表２に１番目のチロシン（Ｙ）を他の１９種のアミノ酸に置換した場合の、ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域の平均ＲＭＳＦ値を示す。チロシンを、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）に置換した場合、ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域の平均ＲＭＳＦ値は、１．５Å以下であり、安定な構造を示した。
本実施例では、前記足場ペプチドの１番目のチロシン（Ｙ）、２番目のアラニン（Ａ）、１２番のフェニルアラニン（Ｆ）、２０番のアルギニン（Ｒ）、２２番のイソロイシン（Ｉ）、２３番のアルギニン（Ｒ）、及び２４番のイソロイシン（Ｉ）をそれぞれ、別のアミノ酸に置換して、前記ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域の平均ＲＭＳＦ値を計算した。
表２に１番目のチロシン（Ｙ）を他の１９種のアミノ酸に置換した場合の、ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域の平均ＲＭＳＦ値を示す。チロシンを、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）に置換した場合、ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域の平均ＲＭＳＦ値は、１．５Å以下であり、安定な構造を示した。
【0033】
【表2】
【0034】
２番目のアラニン（Ａ）、１２番のフェニルアラニン（Ｆ）、２０番のアルギニン（Ｒ）、２２番のイソロイシン（Ｉ）、２３番のアルギニン（Ｒ）、及び２４番のイソロイシン（Ｉ）についても同様の計算を行い、ペプチド１領域、ペプチド２領域、及びペプチド３領域の平均ＲＭＳＦ値が１．５Å以下であり、安定な構造を示すアミノ酸の置換を表３にまとめた。２番目のアラニン（Ａ）は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、又はバリン（Ｖ）への置換は安定な構造を示した。１２番のフェニルアラニン（Ｆ）は、メチオニン（Ｍ）、又はチロシン（Ｙ）への置換は安定な構造を示した。２０番のアルギニン（Ｒ）は、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスタミン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、又はトレオニン（Ｔ）への置換は安定な構造を示した。２２番のイソロイシン（Ｉ）は、アラニン（Ａ）、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、又はトロプトファン（Ｗ）への置換は安定な構造を示した。２３番のアルギニン（Ｒ）は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、又はトリプトファン（Ｗ）への置換は安定な構造を示した。２４番のイソロイシン（Ｉ）は、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トロプトファン（Ｗ）、又はチロシン（Ｙ）への置換は安定な構造を示した。
【0035】
【表3】
【産業上の利用可能性】
【0036】
本発明の足場ペプチドは、ペプチド医薬品として用いることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】