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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022063371
(43)【公開日】2022-04-22
(54)【発明の名称】皮膚光老化改善剤のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20220415BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220415BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20220415BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20220415BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220415BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
G01N33/50 Q
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
G01N33/68
G01N33/50 P
C12Q1/686 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020171605
(22)【出願日】2020-10-12
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）掲載年月日 令和２年９月１０日 （２）掲載アドレス ｈｔｔｐ：／／ｉｆｓｃｃ２０２０．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＿ｐｒｏｇｒａｍ．ｈｔｍｌ
(71)【出願人】
【識別番号】591230619
【氏名又は名称】株式会社ナリス化粧品
(72)【発明者】
【氏名】齊藤 奈緒美
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045CB01
2G045CB09
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA36
2G045FB02
2G045FB03
4B063QA01
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS32
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
4B065AA90X
4B065AC14
4B065BB19
4B065CA46
(57)【要約】 （修正有）
【課題】光老化皮膚の線維芽細胞の挙動を模倣した光老化細胞モデル、および光老化に伴う線維芽細胞機能の変化を抑制することにより、光老化皮膚の諸症状を予防および改善することができる素材のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を有する光老化細胞モデル、及び、ニトロ化培養支持基質上に線維芽細胞を播種し培養する工程、または、ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を混合し培養する工程とを含有する光老化細胞モデルの製造方法を提供する。
【効果】本光老化細胞モデルを用いることにより、ヒトや動物実験を必要とせずに光老化皮膚の中の細胞機能を評価し光老化メカニズムの解明研究を行うことができ、さらには皮膚の硬度の増加、皮膚弾力性の低下の抑制、およびそれらに伴うシワ、たるみの形成、ハリの低下等の光老化の諸症状を予防改善する素材の開発が可能となる。
【選択図】図１
【解決手段】ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を有する光老化細胞モデル、及び、ニトロ化培養支持基質上に線維芽細胞を播種し培養する工程、または、ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を混合し培養する工程とを含有する光老化細胞モデルの製造方法を提供する。
【効果】本光老化細胞モデルを用いることにより、ヒトや動物実験を必要とせずに光老化皮膚の中の細胞機能を評価し光老化メカニズムの解明研究を行うことができ、さらには皮膚の硬度の増加、皮膚弾力性の低下の抑制、およびそれらに伴うシワ、たるみの形成、ハリの低下等の光老化の諸症状を予防改善する素材の開発が可能となる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ニトロ化培養支持基質と、線維芽細胞を有する光老化細胞モデル。
【請求項2】
Ａ）次のいずれかの工程
Ａ）－１ ： ニトロ化培養支持基質上に線維芽細胞を播種する工程
Ａ）－２ ： ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を混合する工程
Ｂ）Ａ）を培養する工程
を含有する光老化細胞モデルの製造方法。
Ａ）－１ ： ニトロ化培養支持基質上に線維芽細胞を播種する工程
Ａ）－２ ： ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を混合する工程
Ｂ）Ａ）を培養する工程
を含有する光老化細胞モデルの製造方法。
【請求項3】
光老化の予防および／又は改善剤をスクリーニングする方法であって、
Ａ）ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を培養する工程、
Ｂ）被験物質又は対照物質を添加し培養する工程
Ｃ）線維芽細胞の細胞活性及び／又は線維芽細胞の遺伝子発現量或いはタンパク質発現量を測定する工程、
Ｄ）被験物質添加群の細胞活性及び／又は遺伝子発現量或いはタンパク質発現量が、被験物質無添加群或いは対照物質添加群と比較して変化した被験物質を選択する工程、
を含んでなる方法。
Ａ）ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を培養する工程、
Ｂ）被験物質又は対照物質を添加し培養する工程
Ｃ）線維芽細胞の細胞活性及び／又は線維芽細胞の遺伝子発現量或いはタンパク質発現量を測定する工程、
Ｄ）被験物質添加群の細胞活性及び／又は遺伝子発現量或いはタンパク質発現量が、被験物質無添加群或いは対照物質添加群と比較して変化した被験物質を選択する工程、
を含んでなる方法。
【請求項4】
前記光老化の症状が、シワ、たるみの形成、ハリ低下、皮膚の硬化、弾力性の低下の少なくとも一つである請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項5】
前記培養支持基質が、細胞外基質タンパク質である請求項３又は請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項6】
前記培養支持基質が、エラスチンを含むものである請求項３乃至請求項５いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項7】
前記細胞活性が、細胞増殖である請求項３乃至請求項６いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項8】
前記遺伝子発現量或いはタンパク質発現量が、細胞外基質の遺伝子発現量或いはタンパク質発現量である請求項３乃至請求項７いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項9】
前記培養支持基質が、コラーゲンを含むものであり、かつ細胞活性がコラーゲン収縮作用である請求項３乃至請求項８いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、光老化皮膚を模倣した光老化細胞モデル、およびこれを用いた光老化改善予防剤等のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
皮膚は、加齢に伴い老化して硬度が増加、弾力性を喪失し、ハリの低下やシワ、たるみ等の変化を生じる。特に顔面など慢性的な紫外線の影響を受けやすい部位では、顕著にシワやたるみが形成する。これら紫外線暴露部で起こる皮膚老化は特に光老化と呼ばれ、この防止および改善は皮膚外用剤研究者にとって、最も大きな課題の一つである。
【0003】
皮膚の支持組織である真皮は、膠原線維（コラーゲン線維）、弾性線維（エラスチン線維やミクロフィブリル）、糖タンパク質（ラミニン、フィブロネクチンなど）、プロテオグリカン（バーシカンなど）、グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸）等の細胞外基質が主となり構成される。膠原線維は皮膚の強度、弾性線維は皮膚の弾力性、糖タンパク質は細胞や細胞外基質の結合、プロテオグリカンやグリコサミノグリカンは皮膚の水分保持や柔軟性に寄与する。また、真皮には細胞外基質の他に細胞成分として線維芽細胞が存在し、細胞外基質やその分解酵素（コラゲナーゼ、エラスターゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ等）を産生する。線維芽細胞は細胞膜に存在するインテグリン等の接着分子を介して足場となる細胞外基質に接着し生存するが、一方でこのとき細胞外基質からは細胞の増殖や分化、形質発現を制御するシグナルが伝えられている。このように細胞外基質は、物理的な支持体として皮膚組織や細胞を支えるだけでなく、細胞機能を直接制御する制御因子としての役割も担っている。
【0004】
光老化皮膚の真皮では、コラーゲン線維の減少や、エラスチン線維の異常沈着（線維肥厚や無定形塊蓄積など）、プロテオグリカンの蓄積等、細胞外基質の構成に異常が生じていることが知られている。加えて、線維芽細胞の活性も変化していることが知られており、例えば、細胞増殖の低下、コラーゲン線維の収縮能の低下、細胞外基質成分の産生機能が変化している。細胞外基質の産生機能の変化としては、特にエラスチン線維の前駆体のトロポエラスチンの産生および細胞外基質の分解酵素の産生が増加する（非特許文献１）。このような線維芽細胞機能の変化は、真皮の主たる細胞外基質の構成に異常をもたらし、さらに組織の修復力を低下させる。その結果、皮膚の硬度の増加や弾力性の低下が引き起こされ、結果的にハリの低下やシワ、たるみ等に繋がる（非特許文献２、３）。
【0005】
従来、光老化皮膚に存在する細胞の機能を研究する場合や、また光老化の諸症状を予防および改善する素材を探索する場合、例えば培養細胞に紫外線を照射する又は酸化障害を惹起する試薬を添加するなど、細胞に直接外部刺激を加えてその挙動変化を検討する方法が広く用いられてきた。或いは、該当する症状を有する動物・臨床検体から細胞を単離し、直接それらの挙動を検討する方法が用いられてきた。しかしながら、前者の試験は簡便だが、外部から与える刺激や試薬の種類、濃度、頻度の設定が非常に難しく、結果しばしば細胞の挙動が培養細胞と実際の生体反応とでは異なることがあるという課題があった。また、後者の試験では該当する症状を有するヒトや動物の生体組織が必要となるため、容易には実施できないという課題があった。そのため、光老化皮膚の細胞機能の評価や光老化の予防改善剤の探索のため、容易かつ簡便に光老化皮膚の細胞の挙動を模倣することができる方法が求められていた。
【0006】
一方でタンパク質のニトロ化は、生体内で発生した活性窒素種によって生じるタンパク質翻訳後修飾のひとつであり、タンパク質を構成する芳香族アミノ酸のチロシン、トリプトファンの残基中のベンゼン環にニトロ基が付与されたものである。ニトロ化反応はアミノ酸中のベンゼン環が、活性窒素種により形成されるニトロニウムイオン（ＮＯ２＋）や二酸化窒素ラジカルなどと求電子置換反応をおこすことで生じる（非特許文献４）。生体内に存在する多くのタンパク質中のトリプトファンの含有率はチロシンのそれよりもはるかに小さく、タンパク質のニトロ化反応は主にチロシン残基に生じると考えられている（非特許文献５）。タンパク質にニトロ化が生じると、酵素やチロシンキナーゼ型受容体の機能低下を引き起こすことで、細胞機能に影響を及ぼすことが知られる（非特許文献６）。また、ニトロ化タンパク質は加齢に伴う数々の疾患（動脈硬化や脳虚血疾患など）で蓄積することが知られており、これらの疾患に関与することが報告されている（非特許文献７）。またニトロ化タンパク質は皮膚中に存在することが知られており、特に角層中に存在するニトロ化タンパク質量は皮膚色と関連する（特許文献１）。しかしながら、真皮中のニトロ化タンパク質が真皮の細胞に及ぼす影響、および光老化皮膚症状への関与については明らかではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開２０１７－１８１４２３号
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｌｕｓ、Ｊｕｎｅ ２０２０
【非特許文献2】Ｅｘｐ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２０１９、２８（８）：９１４－９２１
【非特許文献3】Ｅｘｐ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２０１９、２８（８）：９８１－９８４
【非特許文献4】Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．、２００９、２２（５）：８９４－８９８
【非特許文献5】Ｆｒｏｎｔ． Ｃｈｅｍ．、２０１６、３：７０
【非特許文献6】Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００８、５７（４）：８８９－９８
【非特許文献7】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００、２９０（５４９３）：９８５－９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、光老化皮膚の線維芽細胞の挙動を模倣した、真皮の光老化細胞モデルおよびその製造方法を提供することを課題とする。更には、光老化に伴う線維芽細胞機能の変化を抑制することにより、光老化皮膚の諸症状を予防および／又は改善することができる素材のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者は、容易かつ簡便に光老化皮膚の線維芽細胞の挙動を模倣する方法について鋭意検討の結果、紫外線等の外的刺激が線維芽細胞に直接与える影響に着目するのではなく、細胞周囲に存在し細胞生存の足場となる細胞外基質から線維芽細胞に伝わるシグナルに着目するという発想に至った。つまり光老化により生じた真皮の細胞外基質の異常は、線維芽細胞にも異常なシグナルを伝達している可能性があるという考えから着想した。
【0011】
そこで本発明者は光老化部皮膚での細胞外基質に生じる異常を探索したところ、光老化部皮膚の細胞外基質タンパク質にはニトロ化修飾が生じていることを見出した。さらに検討した結果、特にエラスチン線維にニトロ化修飾が生じていることを見出した。
【0012】
更に発明者は、細胞外基質タンパク質をニトロ化処理すると、それを足場とする線維芽細胞の細胞機能が変化し、例えば細胞増殖の低下、コラーゲン収縮力の低下、細胞外基質の産生が変化し特にエラスチンの前駆体であるトロポエラスチンの産生が亢進することを見出した。これらの細胞機能の変化は光老化皮膚中の線維芽細胞の特徴と同様であるため、本知見から細胞の支持基質がニトロ化修飾を受けると、ニトロ化した支持基質からこれを足場とする真皮線維芽細胞にシグナルが伝達され、光老化皮膚同様に細胞機能が変化することを突き止めた。この細胞機能の変化が、光老化皮膚のエラスチンの異常沈着や真皮の物性変化を引き起こすことで、光老化の進行に繋がると考えられた。
【0013】
以上の新知見から、ニトロ化した細胞外基質タンパク質を培養支持基質に用いることで、光老化皮膚中の線維芽細胞の挙動を模倣した光老化細胞モデルを構築することが可能と判断した。またこの光老化細胞モデルを用いることで、皮膚の硬化および皮膚弾力性の低下、それに伴うシワ、たるみの形成、ハリの低下等を予防又は改善することができる素材を評価及び／又は選択することができると確信し、本発明に至った。
【0014】
本発明では、培養細胞の足場となる培養支持基質にニトロ化処理を行い、これとともに線維芽細胞を培養する光老化細胞モデルを作製することで上記課題を解決した。更には、この光老化細胞モデルを用いることで、ニトロ化培養支持基質より伝達されたシグナルを受けて変化した線維芽細胞の細胞増殖、コラーゲンゲル収縮、遺伝子或いはタンパク質発現量を指標とすることで、上記課題を解決した。
【0015】
本発明は、以下の光老化細胞モデルおよびその製造方法およびスクリーニング方法を提供するものである。すなわち、
〔１〕ニトロ化培養支持基質と、線維芽細胞を有する光老化細胞モデル。
〔２〕
Ａ）次のいずれかの工程
Ａ）－１ ： ニトロ化培養支持基質上に線維芽細胞を播種する工程
Ａ）－２ ： ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を混合する工程
Ｂ）Ａ）を培養する工程
を含有する光老化細胞モデルの製造方法。
〔３〕
光老化の予防および／又は改善剤をスクリーニングする方法であって、
Ａ）ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を培養する工程、
Ｂ）被験物質又は対照物質を添加し培養する工程
Ｃ）線維芽細胞の細胞活性及び／又は線維芽細胞の遺伝子発現量或いはタンパク質発現量を測定する工程、
Ｄ）被験物質添加群の細胞活性及び／又は遺伝子発現量或いはタンパク質発現量が、被験物質無添加群或いは対照物質添加群と比較して変化した被験物質を選択する工程、
を含んでなる方法。
〔４〕前記光老化の症状が、シワ、たるみの形成、ハリ低下、皮膚の硬化、弾力性の低下の少なくとも一つである〔３〕に記載のスクリーニング方法。
〔５〕前記培養支持基質が、細胞外基質タンパク質である〔３〕又は〔４〕に記載のスクリーニング方法。
〔６〕前記培養支持基質が、エラスチンを含むものである〔３〕乃至〔５〕いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
〔７〕前記細胞活性が、細胞増殖である〔３〕乃至〔６〕いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
〔８〕前記遺伝子発現量或いはタンパク質発現量が、細胞外基質の遺伝子発現量或いはタンパク質発現量である〔３〕乃至〔７〕いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
〔９〕前記培養支持基質が、コラーゲンを含むものであり、かつ細胞活性がコラーゲン収縮作用である〔３〕乃至〔８〕いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
〔１〕ニトロ化培養支持基質と、線維芽細胞を有する光老化細胞モデル。
〔２〕
Ａ）次のいずれかの工程
Ａ）－１ ： ニトロ化培養支持基質上に線維芽細胞を播種する工程
Ａ）－２ ： ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を混合する工程
Ｂ）Ａ）を培養する工程
を含有する光老化細胞モデルの製造方法。
〔３〕
光老化の予防および／又は改善剤をスクリーニングする方法であって、
Ａ）ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を培養する工程、
Ｂ）被験物質又は対照物質を添加し培養する工程
Ｃ）線維芽細胞の細胞活性及び／又は線維芽細胞の遺伝子発現量或いはタンパク質発現量を測定する工程、
Ｄ）被験物質添加群の細胞活性及び／又は遺伝子発現量或いはタンパク質発現量が、被験物質無添加群或いは対照物質添加群と比較して変化した被験物質を選択する工程、
を含んでなる方法。
〔４〕前記光老化の症状が、シワ、たるみの形成、ハリ低下、皮膚の硬化、弾力性の低下の少なくとも一つである〔３〕に記載のスクリーニング方法。
〔５〕前記培養支持基質が、細胞外基質タンパク質である〔３〕又は〔４〕に記載のスクリーニング方法。
〔６〕前記培養支持基質が、エラスチンを含むものである〔３〕乃至〔５〕いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
〔７〕前記細胞活性が、細胞増殖である〔３〕乃至〔６〕いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
〔８〕前記遺伝子発現量或いはタンパク質発現量が、細胞外基質の遺伝子発現量或いはタンパク質発現量である〔３〕乃至〔７〕いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
〔９〕前記培養支持基質が、コラーゲンを含むものであり、かつ細胞活性がコラーゲン収縮作用である〔３〕乃至〔８〕いずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【0016】
本発明によって、光老化皮膚中の線維芽細胞の挙動を模倣した光老化細胞モデルおよびその製造方法が提供される。さらに本発明によって、皮膚の硬度の増加、皮膚弾力性の低下の抑制、およびそれらに伴うシワ形成、たるみ形成、ハリ低下等の光老化症状を予防および／又は改善する新たな素材のスクリーニング方法が提供される。本発明を用いることで、ヒトや動物実験を必要とせず簡便に光老化皮膚の中の細胞機能を評価し光老化メカニズムの解明研究を行うことができ、さらには光老化の諸症状を予防改善する素材の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明で用いる培養支持基質は、特に限定されない。培養支持基質として一般に用いられるものを使用できるが、真皮の細胞外基質タンパク質を用いることが好ましい。例えば膠原線維成分としてはコラーゲン、弾性線維成分としてはエラスチンのほか、ミクロフィブリル構成成分であるフィブリリンやファイブリン等、糖タンパク質としてはラミニン、フィブロネクチン等、プロテオグリカンとしてはバーシカンやアグリカン等を用いることができる。これらは天然物でも人工的に作製したものでも良く、天然物としてはヒトやサル、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、サメ、サケ等の脊椎動物から抽出されたものの他、クラゲやタコ、アワビ等の無脊椎動物から抽出されたものを用いることができる。人工的に作製したものとしては、上記生物の細胞を単離し培養したものから抽出した細胞外基質タンパク質、或いは上記生物の細胞外基質タンパク質の遺伝子を大腸菌や酵母等の微生物細胞にトランスフェクションし産生させたリコンビナントタンパク質、或いは大腸菌やコムギ胚芽、培養細胞など抽出液中の酵素を用いた無細胞系にて産生されたタンパク質を用いることもできる。細胞外基質タンパク質の抽出方法は特に限定されなく、公知の方法を用いることができる。抽出した細胞外基質タンパク質をそのまま用いても良く、加水分解や変性処理、架橋処理を行ったもの、又は人為的に固形状或いは線維状組成物、ゲル状組成物に造形したものを用いることも出来る。培養支持基質には上記細胞外基質タンパク質が１種類以上含まれていれば良く、単一タンパク質として用いても良いし、複数混合して用いても良い。なお市販品としては、Ｃｅｌｌｍａｔｒｘ ＴｙｐｅI－Ａ（新田ゼラチン）、エラスチンファイバーシート（細胞外基質研究所）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を好適に用いることができるが、この限りではない。
【0019】
本発明で用いるエラスチンは、特に限定されないが、例えばトロポエラスチンタンパク質或いはエラスチンタンパク質が挙げられる。これらは天然物でも人工的に作製したものでも良く、天然物としては、ヒト、ラット、ウシ、ウサギ、サケ等を含む脊椎動物から抽出されたものを用いることができ、人工的に作製したものとしては、上記生物由来のトロポエラスチン遺伝子を大腸菌や酵母等の微生物細胞にトランスフェクションし産生させた、或いは大腸菌やコムギ胚芽、加えて培養細胞などの抽出液中の酵素を用いた無細胞系にて産生させたものを用いることができる。エラスチンはタンパク質として存在する状態でも良いし、複数のエラスチンが架橋して構成された線維状又はゲル状の構造物であっても良く、例えば上記生物から回収される弾性線維やエラウニン線維等の弾性系線維のほか、人工的に架橋操作を行い線維状構造物に成形した状態或いはゲル状構造物に成形した状態であってもよい。更に、これらのタンパク質或いは線維状或いはゲル状のエラスチンはそのまま用いることも出来るし、加水分解や酵素分解等の操作を加えて断片化した状態のものを用いても良く、変性処理を行った状態のものを用いても良い。
【0020】
本発明で用いるコラーゲンは、特に限定されないが、例えばI型コラーゲン或いはIII型コラーゲンが挙げられる。これらは天然物でも人工的に作製したものでも良く、天然物としては、ヒト、ラット、ウシ、ウサギ、サケ等を含む脊椎動物から抽出されたものを用いることができ、人工的に作製したものとしては、上記生物由来のコラーゲン合成遺伝子、例えばＣＯＬ１Ａ１遺伝子やＣＯＬ３Ａ１遺伝子などを大腸菌や酵母等の微生物細胞にトランスフェクションし産生させた、或いは大腸菌やコムギ胚芽、加えて培養細胞などの抽出液中の酵素を用いた無細胞系にて産生させたものを用いることができる。コラーゲンはタンパク質として存在する状態でも良いし、複数のコラーゲンが架橋して構成された線維状又はゲル状の構造物であっても良く、例えば上記生物から回収される膠原線維のほか、人工的に架橋操作を行い線維状構造物に成形した状態或いはゲル状構造物に成形した状態であってもよい。更に、これらのタンパク質或いは線維状のコラーゲンはそのまま用いることも出来るし、加水分解や酵素分解等の操作を加えて断片化した状態のものを用いても良く、変性処理を行った状態のものを用いても良い。
【0021】
本発明のニトロ化培養支持基質は、培養支持基質とニトロ化試薬を混合して反応させて作製したものを用いるほか、既にニトロ化された培養支持基質を用いることができる。例えばニトロチロシンやジニトロチロシン、ニトロトリプトファン、ニトロフェニルアラニン、ジニトロフェニルアラニン、ニトロシステイン等を含む培養支持基質は、既にニトロ化された培養支持基質として用いることができる。なお前述の新知見より、光老化部皮膚中に存在する細胞外基質、特にエラスチンは、ニトロ化修飾を受けている可能性が高い。そのため、長期間紫外線を浴びたヒトや動物の光老化皮膚から抽出した培養支持基質、或いはヒトや動物の細胞に紫外線を照射し培養したうえで抽出した培養支持基質を、既にニトロ化された培養支持基質として用いても良い。
【0022】
培養支持基質をニトロ化するために用いるニトロ化試薬としては、公知のものを用いることができ、例えばペルオキシナイトライト等の活性窒素種を直接用いるほか、試験系中に活性窒素種を発生させることができる化合物群を混合して用いても良い。例えば、一酸化窒素とスーパーオキシドアニオンを混合する、又はミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）とＮａＮＯ２、過酸化水素等と混合することによる。加えて、ニトロニウムイオンを発生させるテトラニトロメタン（ＴＮＭ）や硝酸などの試薬等を用いることもできる。このほか、塩化ニトロイルやニトロソペルオキシカルボキシレート、またアジ化ナトリウムおよびカタラーゼ等の試薬を用いることもできる。ニトロ化反応自体は公知の手法を用いることができる。上記試薬の利用により、培養支持基質である細胞外基質タンパク質中に含まれるチロシンやトリプトファン、フェニルアラニン、システイン残基にニトロ基が導入され、ニトロチロシンやジニトロチロシン、ニトロトリプトファン、ニトロフェニルアラニン、ジニトロフェニルアラニン、ニトロシステイン等を含む培養支持基質が形成される。また本発明では、培養支持基質とニトロ化試薬を混合する順番やタイミングは問わず、両者が試験系中で共存するタイミングがあればよい。
【0023】
本発明で用いる線維芽細胞は、ヒト又は動物由来であれば特に制限されず、例えばヒトやサル、マウス等の哺乳類由来の線維芽細胞を好適に用いることができる。線維芽細胞はヒト又は動物組織から単離しても良く、又はすでに単離された市販品を用いても良い。細胞培養培地には、用いる線維芽細胞に適切な培地を選択するのが良く、例えば１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えたダルベッコＭＥＭ（Ｄ－ＭＥＭ）が挙げられる。
【0024】
本発明の光老化細胞モデルは、ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞をその構造内に含むものであれば良く、例えばニトロ化培養支持基質の基質層表面上に線維芽細胞を備えた構造、或いはニトロ化培養支持基質の基質層中に線維芽細胞が内包された構造を形成するもの等が挙げられる。
【0025】
本発明の光老化細胞モデルは、以下の方法により作製することが出来る。例えば、培養容器内に予めニトロ化培養支持基質の基質層を作製したのち、ニトロ化培養支持基質の基質層上に線維芽細胞を播種し培養する。或いは、ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を予め混合したのちに培養容器に添加し、線維芽細胞を内包するニトロ化培養支持基質を作製しこれを培養する。培養容器には特に制限はないが、細胞培養用プレートやシャーレの他、チャンバースライドやトランスウェル等の支持膜体のあるものを用いることができる。
【0026】
本発明の光老化細胞モデルの製造方法の一態様では、
Ａ）次のいずれかの工程
Ａ）－１ ： ニトロ化培養支持基質上に線維芽細胞を播種する工程
Ａ）－２ ： ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を混合する工程
Ｂ）Ａ）を培養する工程
を含む。
Ａ）次のいずれかの工程
Ａ）－１ ： ニトロ化培養支持基質上に線維芽細胞を播種する工程
Ａ）－２ ： ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を混合する工程
Ｂ）Ａ）を培養する工程
を含む。
【0027】
ニトロ化培養支持基質の基質層は、培養容器内にニトロ化培養支持基質を添加することで作製できる。例えば、培養支持基質およびニトロ化試薬を混合したものを培養容器に添加して作製するほか、培養容器内で培養支持基質およびニトロ化試薬を混合し反応させて作製しても良い。或いは、培養容器内に既にニトロ化された培養支持基質を添加することで作製することもできる。
【0028】
ニトロ化培養支持基質の基質層上に線維芽細胞を播種する工程では、任意の密度に希釈された線維芽細胞をニトロ化培養支持基質の基質層上に滴下すればよい。線維芽細胞の密度は特に制限がなく、例えば一般的な培養を行う際の播種密度を用いることができる。
【0029】
ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を混合する工程では、任意の密度に希釈された線維芽細胞とニトロ化培養支持基質を混合すればよい。線維芽細胞の密度は特に制限がなく、例えば一般的な培養を行う際の播種密度を用いることができる。
【0030】
培養は、一般的に線維芽細胞を培養する場合と同様に行えば良く、ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を含む構造物をインキュベートし、線維芽細胞をニトロ化培養支持基質に定着させればよい。培養条件も一般的に線維芽細胞を培養する場合と同様で良く、例えば３７℃、５％ＣＯ２の加湿条件下で数時間から数日間、長い場合には３０日間程度である。なお必要に応じて線維芽細胞を継代することもでき、一般的に線維芽細胞を培養する場合と同様に行えば良い。
【0031】
光老化細胞モデルの保存および輸送には、特に制限がない。線維芽細胞が生存できる条件で保存および輸送すればよく、一般的な細胞の保存および輸送条件又は本モデルに用いる線維芽細胞の生存に適した条件であればよい。
【0032】
本発明のスクリーニング方法は、一態様として、
ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を培養する工程、
被験物質又は対照物質を添加し培養する工程
線維芽細胞の細胞活性及び／又は線維芽細胞の遺伝子或いはタンパク質発現量を測定する工程、
被験物質添加群の細胞活性及び／又は遺伝子或いはタンパク質発現量が、対照物質添加群と比較して変化した被験物質を選択する工程、
を含む。
ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を培養する工程、
被験物質又は対照物質を添加し培養する工程
線維芽細胞の細胞活性及び／又は線維芽細胞の遺伝子或いはタンパク質発現量を測定する工程、
被験物質添加群の細胞活性及び／又は遺伝子或いはタンパク質発現量が、対照物質添加群と比較して変化した被験物質を選択する工程、
を含む。
【0033】
ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を培養する工程では、ニトロ化培養支持基質の基質層上に線維芽細胞を播種し培養する、或いはニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を混合したものを培養する。培養容器には特に制限はないが、細胞培養用プレートやシャーレの他、チャンバースライドやトランスウェル等の支持膜体のあるものを用いることができる。
【0034】
本発明のスクリーニング方法で用いる被験物質は、特に制限はない。動植物由来エキス、菌類の培養物、又はこれらの酵素等処理物、化合物又はその誘導体等であっても被検物質として用いることができ、液状の他、気体状、粉末状、ジェル状等であっても差し支えない。
【0035】
被験物質は、ニトロ化培養支持基質と線維芽細胞を含む構造物に任意の濃度および分量を添加することができる。また被験物質添加後の培養条件は一般的に線維芽細胞を培養する場合と同様で良く、例えば３７℃、５％ＣＯ２の加湿条件下で数時間から数日間、長い場合には３０日間程度である。
【0036】
本発明のスクリーニング方法では、線維芽細胞の細胞活性及び／又は遺伝子発現量或いはタンパク質発現量を指標とする。
【0037】
線維芽細胞の細胞活性を指標とする際、特に限定されないが、例えば線維芽細胞の細胞増殖および／又はコラ－ゲンゲルの収縮力を細胞活性の指標として用いることができる。線維芽細胞の細胞増殖を細胞活性の指標とする場合は、例えば、被験物質の存在により、ニトロ化した培養支持基質と培養した線維芽細胞の細胞増殖を、無添加群よりも増加させることができる場合、効果ありと判定することができる。被験物質の無添加に対して好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、線維芽細胞の細胞増殖を増加させる物質を選択すればよい。
【0038】
線維芽細胞のコラ－ゲンゲルの収縮力を細胞活性の指標とする場合は、例えば培養支持基質にはコラーゲンゲルを用い、被験物質の存在により、ニトロ化したコラーゲンゲルと培養した線維芽細胞によるコラーゲンゲル収縮が無添加群よりも増加し、コラーゲンゲルがより収縮した形状にすることができる場合、効果ありと判定することができる。被験物質の無添加に対して、好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上コラーゲンゲルの収縮を増加させる物質を選択すればよい。
【0039】
線維芽細胞の遺伝子発現量或いはタンパク質発現量を指標とする際、特に限定されないが、例えば線維芽細胞が産生する細胞外基質タンパク質、或いは細胞外基質タンパク質架橋酵素、或いは細胞外基質分解酵素、或いは細胞外基質分解酵素の阻害因子、等の遺伝子発現量或いはタンパク質発現量を用いることができる。細胞外基質タンパク質としては、例えば、コラーゲン、トロポエラスチン、フィブリリン、ファイブリン、ＥＭＩＬＩＮ、バーシカン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｐｏｄｏｃａｎ、Ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ等が挙げられる。細胞外基質タンパク質架橋酵素としては、リシルオキシダーゼやトランスグルタミナーゼ等が挙げられる。細胞外基質分解酵素としては、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、エラスターゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ等が挙げられる。細胞外基質分解酵素の阻害因子としては、例えばＴｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ）やエラフィン等が挙げられる。
被験物質の存在により、ニトロ化した培養支持基質と培養した線維芽細胞の遺伝子発現量或いはタンパク質発現量を、無添加群よりも増加或いは減少させることができる場合、効果ありと判定することができる。被験物質の無添加に対して好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、線維芽細胞の細胞増殖を増加或いは減少させる物質を選択すればよい。光老化皮膚において発現量の増加が報告されている遺伝子或いはタンパク質は、被験物質の無添加に対して減少させる物質を選択し、光老化皮膚において発現量の減少が報告されている遺伝子或いはタンパク質は、被験物質の無添加に対して増加させる物質を選択すればよい。光老化皮膚において発現量の増加が報告されているものとしては、例えばトロポエラスチン、フィブリリン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、エラスターゼ、エラフィン等が挙げられ、光老化皮膚において発現量の減少が報告されているものとしては、例えばコラーゲン、Ｐｏｄｏｃａｎ、Ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ、リシルオキシダーゼ等が挙げられる。
被験物質の存在により、ニトロ化した培養支持基質と培養した線維芽細胞の遺伝子発現量或いはタンパク質発現量を、無添加群よりも増加或いは減少させることができる場合、効果ありと判定することができる。被験物質の無添加に対して好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上、線維芽細胞の細胞増殖を増加或いは減少させる物質を選択すればよい。光老化皮膚において発現量の増加が報告されている遺伝子或いはタンパク質は、被験物質の無添加に対して減少させる物質を選択し、光老化皮膚において発現量の減少が報告されている遺伝子或いはタンパク質は、被験物質の無添加に対して増加させる物質を選択すればよい。光老化皮膚において発現量の増加が報告されているものとしては、例えばトロポエラスチン、フィブリリン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、エラスターゼ、エラフィン等が挙げられ、光老化皮膚において発現量の減少が報告されているものとしては、例えばコラーゲン、Ｐｏｄｏｃａｎ、Ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ、リシルオキシダーゼ等が挙げられる。
【0040】
線維芽細胞の細胞増殖は、任意の方法で測定することができる。例えば、細胞数を直接カウントする方法、又は細胞核を染色して細胞数をカウントする方法、ＢｒｄＵ等を用いて細胞のＤＮＡ合成を測定する方法、ＷＳＴやＭＴＴ等の代謝還元色素を用いて細胞の代謝活性を測定する方法、ルミノアッセイにて細胞内ＡＴＰを測定する方法等、公知の方法を用いて細胞増殖を測定することができる。
【0041】
線維芽細胞によるコラーゲンの収縮は、公知の方法で測定することができる。例えば、線維芽細胞とゲル状コラーゲンの共存によりゲル状コラーゲンが収縮するため、収縮前後のゲル状コラーゲンの体積や表面積を直接或いは画像撮影により計測する、或いは目視によるスコア付けを行うことで、コラーゲンの収縮を評価することが可能である。
【0042】
線維芽細胞の当該遺伝子、或いはそれにより変換されるタンパク質の発現量は任意の方法を用いて測定した結果を用いることができる。例えば、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用い、アガロース電気泳動やリアルタイムＰＣＲ法にて定量的な検出を行うことができる。なお、前述した種々の因子をコードする遺伝子配列はそれぞれ公開されており、当業者は適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。そのほか、遺伝子チップ、アレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法等の公知の方法を用いて測定することもできる。また、線維芽細胞で産生される当該タンパク質の発現量は、ウエスタンブロッティング法やＥＬＩＳＡ法、放射免疫測定（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ）法、免疫染色法、質量分析法等の常法で定量的に測定した結果を用いてもよい。また、当該タンパク質の代謝産物を測定することで、間接的に当該タンパク質量を測定することもできる。
【0043】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例0044】
＜実験１＞光老化部および自然老化部皮膚切片中のエラスチンおよびニトロチロシンの局在
以下の手順で、皮膚切片中のエラスチン、ニトロチロシンを検出した。
インフォームドコンセントを得た９０代女性から得た光老化部皮膚（露光部、頬部）、自然老化部皮膚（非露光部、臀部）のホルマリン固定パラフィン包埋切片を作製し、一次抗体に抗ニトロチロシン抗体（Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ社）、エラスチン抗体（Ａｂｃａｍ社）、二次抗体にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（R）４８８標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ社）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（R）５９４標識抗ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡（キーエンス社）にて蛍光像を観察した（倍率１０倍）。
以下の手順で、皮膚切片中のエラスチン、ニトロチロシンを検出した。
インフォームドコンセントを得た９０代女性から得た光老化部皮膚（露光部、頬部）、自然老化部皮膚（非露光部、臀部）のホルマリン固定パラフィン包埋切片を作製し、一次抗体に抗ニトロチロシン抗体（Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ社）、エラスチン抗体（Ａｂｃａｍ社）、二次抗体にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（R）４８８標識抗マウス抗体（Ａｂｃａｍ社）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（R）５９４標識抗ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡（キーエンス社）にて蛍光像を観察した（倍率１０倍）。
【0045】
図１に示すように、露光部皮膚の真皮では非露光部の真皮よりもニトロチロシンが多く検出され、光老化部皮膚では真皮の細胞外基質にニトロチロシンが存在することが示された。また、露光部皮膚のニトロチロシンはエラスチンとほぼ同じ局在を示しており、光老化部皮膚にはニトロ化エラスチンが存在することが示唆された。
【0046】
＜実験２＞ニトロ化エラスチン線維上で培養した線維芽細胞の細胞増殖の変化
以下の手順でニトロ化処理したエラスチン線維上で培養した線維芽細胞の細胞増殖得率を測定した。
３０φガラスシャーレ（アズワン社）にシリコン支持シート（細胞外基質研究所社）を敷き、その上にエラスチンファイバーシート（細胞外基質研究所社）を重ねた。さらにその上に、中心部を１．２ｍｍの円形状にくり抜いたシリコン支持シートをエラスチンファイバーシートの周囲を押さえるように重ねた。ガラスシャーレに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、ＥｔＯＨに溶解した１０％テトラニトロメタン（ＴＮＭ）溶液を０．１％の濃度になるよう添加した。室温にて２０分間インキュベートした後、尿素水溶液を終濃度２Ｍになるよう添加し、反応を停止した。溶液を捨て、ガラスシャーレを攪拌しながらシートをＰＢＳ（－）にて数回洗浄した。ヒト成人由来真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに懸濁してガラスシャーレに２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で５日間培養した。培養終了後に培地を捨て、１０％ＷＳＴ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を含む１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭをガラスチャーレに２ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で培地色が変化するまでインキュベートした。培地を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に２００μＬずつ分注し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、数式１に従って細胞増殖を算出した。
以下の手順でニトロ化処理したエラスチン線維上で培養した線維芽細胞の細胞増殖得率を測定した。
３０φガラスシャーレ（アズワン社）にシリコン支持シート（細胞外基質研究所社）を敷き、その上にエラスチンファイバーシート（細胞外基質研究所社）を重ねた。さらにその上に、中心部を１．２ｍｍの円形状にくり抜いたシリコン支持シートをエラスチンファイバーシートの周囲を押さえるように重ねた。ガラスシャーレに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、ＥｔＯＨに溶解した１０％テトラニトロメタン（ＴＮＭ）溶液を０．１％の濃度になるよう添加した。室温にて２０分間インキュベートした後、尿素水溶液を終濃度２Ｍになるよう添加し、反応を停止した。溶液を捨て、ガラスシャーレを攪拌しながらシートをＰＢＳ（－）にて数回洗浄した。ヒト成人由来真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに懸濁してガラスシャーレに２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で５日間培養した。培養終了後に培地を捨て、１０％ＷＳＴ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を含む１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭをガラスチャーレに２ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で培地色が変化するまでインキュベートした。培地を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に２００μＬずつ分注し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、数式１に従って細胞増殖を算出した。
【0047】
【数1】
【0048】
表１に示すように、ニトロ化処理したエラスチンファイバー上で培養した線維芽細胞では、無処理のエラスチンファイバー上で培養したものに対して細胞増殖が大きく減少しており、ニトロ化処理したエラスチンを培養支持基質とする線維芽細胞は、細胞増殖が減少することが確認された。
【0049】
【表1】
【0050】
＜実験３＞ニトロ化コラーゲンゲル上で培養した線維芽細胞のコラーゲン収縮作用
以下の手順で、ニトロ化処理したコラーゲンゲル上で培養した線維芽細胞によるコラーゲンの収縮作用を評価した。
ＣｅｌｌＭａｔｒｉｘI－Ａ（新田ゼラチン社）、１０倍濃度のＰＢＳ（－）、０．０５Ｎ ＮａＯＨを氷冷し、８：１：１の割合で混合した。これを６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１．５ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で３０分間静置してコラーゲンゲルを作製した。ＥｔＯＨに溶解した１０％テトラニトロメタン（ＴＮＭ）溶液をＰＢＳ（－）に０．１％の濃度になるよう添加し、６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２ｍＬずつ分注した。室温にて１５分間インキュベートした後、４Ｍ尿素水溶液を２ｍＬずつ添加して混合し、反応を停止した。溶液を捨ててＰＢＳ（－）を添加したのち、プレートを数時間攪拌した。このＰＢＳ（－）による洗浄操作を数回繰り返した。ヒト成人由来真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに懸濁して６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに３．５ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。培地を交換したのち、６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ中のコラーゲンゲルの外周を注射針でなぞり、コラーゲンゲルと容器の接着を解除した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件でさらに５日間培養しコラーゲンゲルを収縮させたのち、カメラでコラーゲンゲルの画像を撮影した。Ｉｍａｇｅ Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ）を用いて画像からコラーゲンゲルの面積を算出し、数式２に従って線維芽細胞によるコラ－ゲン収縮を算出した。
以下の手順で、ニトロ化処理したコラーゲンゲル上で培養した線維芽細胞によるコラーゲンの収縮作用を評価した。
ＣｅｌｌＭａｔｒｉｘI－Ａ（新田ゼラチン社）、１０倍濃度のＰＢＳ（－）、０．０５Ｎ ＮａＯＨを氷冷し、８：１：１の割合で混合した。これを６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１．５ｍＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で３０分間静置してコラーゲンゲルを作製した。ＥｔＯＨに溶解した１０％テトラニトロメタン（ＴＮＭ）溶液をＰＢＳ（－）に０．１％の濃度になるよう添加し、６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２ｍＬずつ分注した。室温にて１５分間インキュベートした後、４Ｍ尿素水溶液を２ｍＬずつ添加して混合し、反応を停止した。溶液を捨ててＰＢＳ（－）を添加したのち、プレートを数時間攪拌した。このＰＢＳ（－）による洗浄操作を数回繰り返した。ヒト成人由来真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに懸濁して６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに３．５ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。培地を交換したのち、６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ中のコラーゲンゲルの外周を注射針でなぞり、コラーゲンゲルと容器の接着を解除した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件でさらに５日間培養しコラーゲンゲルを収縮させたのち、カメラでコラーゲンゲルの画像を撮影した。Ｉｍａｇｅ Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ）を用いて画像からコラーゲンゲルの面積を算出し、数式２に従って線維芽細胞によるコラ－ゲン収縮を算出した。
【0051】
【数2】
【0052】
表２に示すように、ニトロ化処理したコラーゲンゲル上で培養した線維芽細胞では、無処理のコラーゲンゲル上で培養したものに対して、コラーゲンゲルの収縮が減少しており、ニトロ化処理したコラーゲンゲルを培養支持基質とする線維芽細胞は、コラーゲンの収縮を減少させることが確認された。
【0053】
【表2】
【0054】
＜実験４＞ニトロ化エラスチン線維上で培養した線維芽細胞の遺伝子発現量の変化
以下の手順で、ニトロ化処理したエラスチン線維上で培養した線維芽細胞の遺伝子発現量を測定した。
３０φガラスシャーレにシリコン支持シートを敷き、その上にエラスチンファイバーシートを重ねた。さらにその上に、中心部を１．２ｍｍの円形状にくり抜いたシリコン支持シートをエラスチンファイバーシートの周囲を押さえるように重ねた。０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を３００μＭになるよう滴下した。３７℃で２日間インキュベートした後、ＰＢＳ（－）にてエラスチンファイバーシートを数回洗浄した。ヒト成人由来真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに懸濁し、ガラスシャーレに播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で５日間培養した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、細胞外基質を構成するタンパク質であるI型コラーゲン、トロポエラスチン、フィブリリン－１、ファイブリン２、ファイブリン４、ファイブリン５、ＥＭＩＬＩＮ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、ニトロ化エラスチンファイバーシート上で培養した線維芽細胞の遺伝子発現量の変化は、無処理のエラスチンファイバーシート上で培養した線維芽細胞のトロポエラスチンのＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
以下の手順で、ニトロ化処理したエラスチン線維上で培養した線維芽細胞の遺伝子発現量を測定した。
３０φガラスシャーレにシリコン支持シートを敷き、その上にエラスチンファイバーシートを重ねた。さらにその上に、中心部を１．２ｍｍの円形状にくり抜いたシリコン支持シートをエラスチンファイバーシートの周囲を押さえるように重ねた。０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を３００μＭになるよう滴下した。３７℃で２日間インキュベートした後、ＰＢＳ（－）にてエラスチンファイバーシートを数回洗浄した。ヒト成人由来真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに懸濁し、ガラスシャーレに播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で５日間培養した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、細胞外基質を構成するタンパク質であるI型コラーゲン、トロポエラスチン、フィブリリン－１、ファイブリン２、ファイブリン４、ファイブリン５、ＥＭＩＬＩＮ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、ニトロ化エラスチンファイバーシート上で培養した線維芽細胞の遺伝子発現量の変化は、無処理のエラスチンファイバーシート上で培養した線維芽細胞のトロポエラスチンのＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
【0055】
表３に示すように、ニトロ化処理したエラスチンファイバー上で培養した線維芽細胞では、コントロールに対してＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）、フィブリリン－１（Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ－１）、ファイブリン２（Ｆｉｂｕｌｉｎ－２）、ファイブリン４（Ｆｉｂｕｌｉｎ－４）、ファイブリン５（Ｆｉｂｕｌｉｎ－５）の遺伝子発現量にはほぼ変化がなかったが、トロポエラスチン（Ｔｒｏｐｏｅｌａｓｔｉｎ）の遺伝子発現量は増加し、ＥＭＩＬＩＮ、Ｖｅｒｓｉｃａｎの遺伝子発現量は減少した。
【0056】
【表3】
【0057】
上記の結果より、光老化部皮膚の真皮にはニトロ化タンパク質が多く含まれており、細胞外基質タンパク質、特にエラスチン線維にニトロ化修飾が生じていることを見出した。加えて、細胞の足場となる細胞外基質タンパク質がニトロ化された際、真皮の線維芽細胞には細胞増殖の低下およびコラーゲンゲル収縮の低下、また細胞外基質タンパク質の遺伝子発現量に変化が生じることを見出した。このような細胞機能の変化は光老化皮膚中の線維芽細胞の特徴と同様であるため、ニトロ化した培養支持基質を用いて線維芽細胞を培養することで光老化皮膚中の線維芽細胞の挙動を模倣できると考えられた。本発明の光老化細胞モデル、および皮膚の硬化および弾力性の低下、それに伴うシワの形成、たるみの形成、ハリの低下といった光老化の兆候を予防又は改善することができる物質を評価及び／又は選択する方法は、上記知見に基づくものである。
【0058】
＜実施例１＞ニトロ化フィブロネクチン上で線維芽細胞を培養する光老化細胞モデルの作製
ヒト血漿由来フィブロネクチン溶液（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）をＰＢＳ（－）に溶解して１０μｇ／ｍＬの濃度に調製した。６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに１ｍＬずつ分注し、室温で３時間インキュベートした。溶液を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅにＰＢＳ（－）を２ｍＬ分注し、ＥｔＯＨに溶解した１０％テトラニトロメタン（ＴＮＭ）溶液をＰＢＳ（－）に０．１％の濃度になるよう添加した。室温にて１０分間インキュベートした後、４Ｍ尿素水溶液を２ｍＬずつ添加して混合し、反応を停止した。溶液を捨ててＰＢＳ（－）を添加し、プレートを攪拌しながらＰＢＳ（－）で数回洗浄した。新生児包皮より単離したヒト真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭで２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度になるよう懸濁した。線維芽細胞を６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で一晩培養した。培地を捨て、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭを１ｍＬ分注し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で７日間培養した。
ヒト血漿由来フィブロネクチン溶液（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）をＰＢＳ（－）に溶解して１０μｇ／ｍＬの濃度に調製した。６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに１ｍＬずつ分注し、室温で３時間インキュベートした。溶液を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅにＰＢＳ（－）を２ｍＬ分注し、ＥｔＯＨに溶解した１０％テトラニトロメタン（ＴＮＭ）溶液をＰＢＳ（－）に０．１％の濃度になるよう添加した。室温にて１０分間インキュベートした後、４Ｍ尿素水溶液を２ｍＬずつ添加して混合し、反応を停止した。溶液を捨ててＰＢＳ（－）を添加し、プレートを攪拌しながらＰＢＳ（－）で数回洗浄した。新生児包皮より単離したヒト真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭで２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度になるよう懸濁した。線維芽細胞を６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で一晩培養した。培地を捨て、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭを１ｍＬ分注し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で７日間培養した。
【0059】
＜実施例２＞ニトロ化コラーゲンに線維芽細胞を内包した光老化細胞モデルの作製
ＣｅｌｌＭａｔｒｉｘI－Ａ（新田ゼラチン社）、１０倍濃度のＰＢＳ（－）、０．０５Ｎ ＮａＯＨを氷冷し、８：１：１の割合で混合した。これにＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅを１ｍＭになるよう滴下し、氷冷下でよく混合した。マウス胎児線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度になるよう懸濁し、コラーゲン溶液に線維芽細胞懸濁液を１／５量添加し、よく転倒混和した。この細胞懸濁コラーゲンを１２ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で一晩培養し、ゲル状構造物を作製した。
ＣｅｌｌＭａｔｒｉｘI－Ａ（新田ゼラチン社）、１０倍濃度のＰＢＳ（－）、０．０５Ｎ ＮａＯＨを氷冷し、８：１：１の割合で混合した。これにＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅを１ｍＭになるよう滴下し、氷冷下でよく混合した。マウス胎児線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度になるよう懸濁し、コラーゲン溶液に線維芽細胞懸濁液を１／５量添加し、よく転倒混和した。この細胞懸濁コラーゲンを１２ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で一晩培養し、ゲル状構造物を作製した。
【0060】
＜実施例３＞細胞増殖促進剤のスクリーニング方法
以下の手順で、ニトロ化エラスチンシート上で培養した線維芽細胞の細胞増殖促進剤のスクリーニングを行った。
＜被験物質の調製＞
複数の乾燥植物原体にそれぞれ１０倍の重量の５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液を加えて室温で１週間抽出した。抽出物の乾燥残分に対して、エタノール、水を重量比で１：５０：４９となるように加えて希釈したものを被験物質とした。対照物質としては溶媒である５０％エタノール溶液を用いた。
＜細胞増殖試験＞
ブタ由来水溶性エラスチンｔｙｐｅ－Ａ溶液（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）をＰＢＳ（－）に溶解して１００μｇ／ｍＬの濃度に調製した。９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに５０μＬずつ分注し、室温で３時間インキュベートした。溶液を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ水溶液を１００μＬ分注し、１Ｍ ＮａＮＯ２、１ｍＭ ＦｅＣｌ３、３％過酸化水素を含む反応液を１０μＬ添加して３７℃で１日間インキュベートしたのち、溶液を捨ててＰＢＳ（－）で数回洗浄した。ヒト成人真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭで５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度になるよう懸濁した。線維芽細胞を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。培地を新しいものに置換し、各被験物質又は対照物質を終濃度１００ｐｐｍになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で３日間培養した。培養終了後に培地を捨て、１０％ＷＳＴ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を含む１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭを９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２００μＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で培地色が変化するまでインキュベートした。培地を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２００μＬずつ分注し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、数式３に従って対照物質添加を１００％としたときの各被験物質の細胞増殖（％）を算出し、細胞増殖が１０５％以上の被験物質を効果成分と判定した。
以下の手順で、ニトロ化エラスチンシート上で培養した線維芽細胞の細胞増殖促進剤のスクリーニングを行った。
＜被験物質の調製＞
複数の乾燥植物原体にそれぞれ１０倍の重量の５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液を加えて室温で１週間抽出した。抽出物の乾燥残分に対して、エタノール、水を重量比で１：５０：４９となるように加えて希釈したものを被験物質とした。対照物質としては溶媒である５０％エタノール溶液を用いた。
＜細胞増殖試験＞
ブタ由来水溶性エラスチンｔｙｐｅ－Ａ溶液（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）をＰＢＳ（－）に溶解して１００μｇ／ｍＬの濃度に調製した。９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに５０μＬずつ分注し、室温で３時間インキュベートした。溶液を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ（ＴｒｕｅＬｉｎｅ社）に２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ水溶液を１００μＬ分注し、１Ｍ ＮａＮＯ２、１ｍＭ ＦｅＣｌ３、３％過酸化水素を含む反応液を１０μＬ添加して３７℃で１日間インキュベートしたのち、溶液を捨ててＰＢＳ（－）で数回洗浄した。ヒト成人真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭで５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度になるよう懸濁した。線維芽細胞を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。培地を新しいものに置換し、各被験物質又は対照物質を終濃度１００ｐｐｍになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で３日間培養した。培養終了後に培地を捨て、１０％ＷＳＴ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を含む１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭを９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２００μＬずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で培地色が変化するまでインキュベートした。培地を９６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２００μＬずつ分注し、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社）にて４５０ｎｍの吸光度を測定し、数式３に従って対照物質添加を１００％としたときの各被験物質の細胞増殖（％）を算出し、細胞増殖が１０５％以上の被験物質を効果成分と判定した。
【0061】
【数3】
【0062】
被験物質を添加したときの線維芽細胞の細胞増殖が、対照物質を添加したときに対して１０５％以上であれば、被験物質にはニトロ化エラスチン上で培養した線維芽細胞の増殖促進作用が十分あると判断できる。この方法を用いて線維芽細胞の細胞増殖促進剤を選択することができ、本スクリーニング方法を用いることで、皮膚の硬化抑制剤、皮膚弾力性の低下抑制剤、シワ形成、たるみ形成、ハリ低下の予防改善剤等、光老化を予防又は改善する物質を選択することが可能である。
【0063】
＜実施例４＞トロポエラスチン遺伝子発現抑制剤のスクリーニング方法
以下の手順で、ニトロ化エラスチンシート上で培養した線維芽細胞のトロポエラスチン遺伝子発現抑制剤のスクリーニングを行った。
＜被験物質の調製＞
複数の乾燥植物原体にそれぞれ１０倍の重量の水を加えて６０℃、５時間加熱抽出した。抽出物の乾燥残分に対して水を重量比で１：９９となるように加えて希釈したものを被験物質とした。対照物質としては溶媒である水を用いた。
＜遺伝子発現量の測定＞
２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅにシリコン支持シートを敷き、その上にエラスチンファイバーシートを密着させた。０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、ＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅドナーのＳＩＮ－１（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を２０ｍＭ ＨＣｌで希釈して２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに１００μＭになるよう滴下した。３７℃で３日間インキュベートした後、ＰＢＳ（－）にてエラスチンファイバーシートを数回洗浄した。ヒト真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに懸濁して２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で５日間培養した。培地を新しいものに置換し、各被験物質又は対照物質を終濃度１００ｐｐｍになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、エラスチンの前駆体タンパク質であるトロポエラスチン、およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、被験物質添加によるトロポエラスチン遺伝子発現量の変化は、対照物質添加群のＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。各被験物質添加群のトロポエラスチン遺伝子発現量が対照物質添加群に対して１０％以上減少する被験物質を効果成分と判定した。
以下の手順で、ニトロ化エラスチンシート上で培養した線維芽細胞のトロポエラスチン遺伝子発現抑制剤のスクリーニングを行った。
＜被験物質の調製＞
複数の乾燥植物原体にそれぞれ１０倍の重量の水を加えて６０℃、５時間加熱抽出した。抽出物の乾燥残分に対して水を重量比で１：９９となるように加えて希釈したものを被験物質とした。対照物質としては溶媒である水を用いた。
＜遺伝子発現量の測定＞
２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅにシリコン支持シートを敷き、その上にエラスチンファイバーシートを密着させた。０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、ＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅドナーのＳＩＮ－１（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を２０ｍＭ ＨＣｌで希釈して２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに１００μＭになるよう滴下した。３７℃で３日間インキュベートした後、ＰＢＳ（－）にてエラスチンファイバーシートを数回洗浄した。ヒト真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに懸濁して２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で５日間培養した。培地を新しいものに置換し、各被験物質又は対照物質を終濃度１００ｐｐｍになるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、エラスチンの前駆体タンパク質であるトロポエラスチン、およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を遺伝子特異的プライマー及びＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ社）にて測定し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、被験物質添加によるトロポエラスチン遺伝子発現量の変化は、対照物質添加群のＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。各被験物質添加群のトロポエラスチン遺伝子発現量が対照物質添加群に対して１０％以上減少する被験物質を効果成分と判定した。
【0064】
光老化皮膚ではトロポエラスチンの発現量が増加することが知られており、また発明者らが得た知見により、ニトロ化エラスチン上で培養した線維芽細胞ではトロポエラスチンの遺伝子発現量が増加することが確認されているため、被験物質添加によりトロポエラスチンの遺伝子発現量を減少させるものを効果成分として選定した。被験物質を添加したときの線維芽細胞のトロポエラスチン遺伝子発現量が、対照物質を添加したときに対して１０％以上減少していれば、被験物質にはニトロ化エラスチン上で培養した線維芽細胞のトロポエラスチン発現量の抑制作用が十分あると判断できる。この方法を用いてトロポエラスチン遺伝子の発現抑制剤を選択することができ、本スクリーニング方法を用いることで、皮膚の硬化抑制剤、皮膚弾力性の低下抑制剤、シワ形成、たるみ形成、ハリ低下の予防改善剤等、光老化を予防又は改善する物質を選択することが可能である。
【0065】
＜実施例５＞コラーゲン収縮促進剤のスクリーニング方法
以下の手順で、ニトロ化処理したコラーゲン内で培養した線維芽細胞のコラーゲン収縮促進剤のスクリーニングを行った。
＜被験物質の調製＞
複数の乾燥植物原体にそれぞれ１０倍の重量の５０％１，３－ブチレングリコールを加えて４０℃、３日間抽出した。ろ液を被験物質とし、対照物質としては溶媒である５０％１，３－ブチレングリコールを用いた。
＜コラーゲン収縮の測定＞
ＣｅｌｌＭａｔｒｉｘI－Ａ（新田ゼラチン社）、１０倍濃度のＰＢＳ（－）、０．０５Ｎ ＮａＯＨを氷冷し、８：１：１の割合で混合した。これにＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅを１ｍＭになるよう滴下し、氷冷下でよく混合した。ヒト成人由来線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度になるよう懸濁し、コラーゲン溶液に線維芽細胞懸濁液を１／５量添加し、よく転倒混和した。さらに各被験物質又は対照物質を１％の終濃度になるよう添加し、さらに各被験物質又は対照物質を１％の終濃度になるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養し、ゲル状構造物を作製した。この細胞懸濁コラーゲンを１２ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で一晩培養し、ゲル状構造物を作製した。１２ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ中のコラーゲンゲルの外周を注射針でなぞり、コラーゲンゲルと容器の接着を解除した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件でさらに３日間培養しコラーゲンゲルを収縮させたのち、カメラでコラーゲンゲルの画像を撮影した。Ｉｍａｇｅ Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ）を用いて画像からコラーゲンゲルの面積を算出し、数式４に従って対照物質添加を１００％としたときの各被験物質のコラーゲン収縮（％）を算出し、コラーゲン収縮が１０５％以上の被験物質を効果成分と判定した。
以下の手順で、ニトロ化処理したコラーゲン内で培養した線維芽細胞のコラーゲン収縮促進剤のスクリーニングを行った。
＜被験物質の調製＞
複数の乾燥植物原体にそれぞれ１０倍の重量の５０％１，３－ブチレングリコールを加えて４０℃、３日間抽出した。ろ液を被験物質とし、対照物質としては溶媒である５０％１，３－ブチレングリコールを用いた。
＜コラーゲン収縮の測定＞
ＣｅｌｌＭａｔｒｉｘI－Ａ（新田ゼラチン社）、１０倍濃度のＰＢＳ（－）、０．０５Ｎ ＮａＯＨを氷冷し、８：１：１の割合で混合した。これにＰｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅを１ｍＭになるよう滴下し、氷冷下でよく混合した。ヒト成人由来線維芽細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤ－ＭＥＭに２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度になるよう懸濁し、コラーゲン溶液に線維芽細胞懸濁液を１／５量添加し、よく転倒混和した。さらに各被験物質又は対照物質を１％の終濃度になるよう添加し、さらに各被験物質又は対照物質を１％の終濃度になるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で１日間培養し、ゲル状構造物を作製した。この細胞懸濁コラーゲンを１２ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で一晩培養し、ゲル状構造物を作製した。１２ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ中のコラーゲンゲルの外周を注射針でなぞり、コラーゲンゲルと容器の接着を解除した。３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件でさらに３日間培養しコラーゲンゲルを収縮させたのち、カメラでコラーゲンゲルの画像を撮影した。Ｉｍａｇｅ Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ）を用いて画像からコラーゲンゲルの面積を算出し、数式４に従って対照物質添加を１００％としたときの各被験物質のコラーゲン収縮（％）を算出し、コラーゲン収縮が１０５％以上の被験物質を効果成分と判定した。
【0066】
【数4】
【0067】
被験物質を添加したときのコラーゲンの収縮が、対照物質を添加したときに対して１０５％以上であれば、被験物質には線維芽細胞によるニトロ化コラーゲンの収縮促進作用が十分あると判断できる。この方法を用いてコラーゲン収縮促進剤を選択することができ、本スクリーニング方法を用いることで、皮膚の硬化抑制剤、皮膚弾力性の低下抑制剤、シワ形成、たるみ形成、ハリ低下の予防改善剤等、光老化を予防又は改善する物質を選択することが可能である。
【図1】
