特開 2022-63860 ホウ素化合物およびその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022063860

(43)【公開日】2022-04-22

(54)【発明の名称】ホウ素化合物およびその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 5/08 20060101AFI20220415BHJP

   C07K 5/06 20060101ALI20220415BHJP

   C07K 5/10 20060101ALI20220415BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20220415BHJP

   C07F 5/05 20060101ALI20220415BHJP

【ＦＩ】

C07K5/08

C07K5/06

C07K5/10

C07K7/06

C07F5/05 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021166060

(22)【出願日】2021-10-08

(31)【優先権主張番号】P 2020171996

(32)【優先日】2020-10-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000125347

【氏名又は名称】学校法人近畿大学

(74)【代理人】

【識別番号】100118924

【弁理士】

【氏名又は名称】廣幸 正樹

(72)【発明者】

【氏名】北松 瑞生

(72)【発明者】

【氏名】井上 健

(72)【発明者】

【氏名】山形 尚紀

(72)【発明者】

【氏名】道上 宏之

【テーマコード（参考）】

4H045

4H048

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA11

4H045BA12

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA50

4H045BA52

4H045EA20

4H045FA10

4H045FA20

4H048AA01

4H048AA02

4H048AC63

4H048BA92

4H048BB31

4H048VA20

4H048VA30

4H048VA40

4H048VA77

4H048VB10

(57)【要約】

【課題】従来ＢＳＨと細胞内運搬ペプチドとの結合をマレイミド基で細胞内運搬ペプチドを修飾することで１回の合成でできていた。しかし、マレイミド基を使うと結合点にキラル炭素が発生し、ラセミ体が形成されるおそれがあった。
【解決手段】ＢＳＨと細胞内運搬ペプチドの間をメチレンカルボニルリンカー（－Ｃ－Ｃ（Ｏ）－）で連結することで、ラセミ体の発生を抑止することができ、人体に安全に投与できるホウ素化合物を得ることができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）のＳＨ基と細胞内運搬ペプチドのＮ末端のＮＨ_２基がメチレンカルボニルリンカーで連結されたことを特徴とするホウ素化合物。

【請求項2】

前記細胞内運搬ペプチドのＮ末端が結合するα－炭素には、塩基性基が結合していることを特徴とする請求項１に記載されたホウ素化合物。

【請求項3】

前記細胞内運搬ペプチドがアルギニン、リジン、ヒスチジンのうちの少なくとも１種の１乃至１０個の連結体を含むことを特徴とする請求項１または２に記載されたホウ素化合物。

【請求項4】

前記細胞内運搬ペプチドと前記メチレンカルボニルリンカーとの間に炭素数が７以下の炭素鎖が配置された請求項２または３に記載されたホウ素化合物。

【請求項5】

細胞内運搬ペプチドのＮ末端をクロロアセチル化する工程と、
メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）に、前記Ｎ末端がクロロアセチル化された細胞内運搬ペプチドを結合させる工程と有することを特徴とするホウ素化合物の製造方法。

【請求項6】

前記細胞内運搬ペプチドのＮ末端が結合するα－炭素には、塩基性基が結合していることを特徴とする請求項５に記載されたホウ素化合物の製造方法。

【請求項7】

前記細胞内運搬ペプチドがアルギニンの３乃至１１個の連結体を含むことを特徴とする請求項５または６に記載されたホウ素化合物の製造方法。

【請求項8】

前記細胞内運搬ペプチドのＮ末端には、炭素数が７以下の直鎖炭化水素鎖が結合されていることを特徴とする請求項６または７に記載されたホウ素化合物の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ホウ素中性子捕捉療法に用いるホウ素化合物およびその製造方法に関するものであり、またホウ素含有化合物を含む薬剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ホウ素の安定同位体（以後「^１０Ｂ」とも記載する。）は、中性子線を照射することで、核分裂反応が進行して、α線を放出する。ホウ素中性子捕捉療法（Ｂｏｒｏｎ Ｎｅｕｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：以下「ＢＮＣＴ」）は、その放出したα線によって細胞内のＤＮＡに損傷を与え、がん細胞を死滅させる技術であり、放射線療法と化学療法を掛け合わせた新しいがん治療法である。

【0003】

ＢＮＣＴは、^１０ＢがＤＮＡのより近い位置に存在することでその効果が向上するので、^１０Ｂを細胞内へ運搬することが重要となる。このことから、細胞内に侵入できるホウ素含有化合物およびそれを用いた薬剤（以下「ホウ素製剤」とも呼ぶ。）の発明は重要となる。

【0004】

一方、ＢＮＣＴのホウ素製剤は、これまでにＢＰＡ（ボロノフェニルアラニン：４－Ｂｏｒｏｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）が使用されてきている。しかし、ＢＰＡは、１分子中に１個の^１０Ｂしか含んでおらず、細胞内に^１０Ｂを運搬する上で効率が悪い。

【0005】

その点、１分子中に１２個の^１０Ｂが含まれているホウ素クラスタ（以下ＢＳＨ：メルカプトウンデカハイドロドデカボレート）は、一度に大量の^１０Ｂを細胞内に運搬できるので、新しいＢＮＣＴのためのホウ素製剤として期待できる。しかし、^１０Ｂは単独で細胞内に侵入することができないので、細胞内に運搬するための手段を必要とする。

【0006】

特許文献１には、細胞内運搬ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、以下ＣＰＰ）のＮ末端をマレイミド基にし、ＢＳＨを共有結合により連結させることで、細胞内にうまくＢＳＨを運搬することができる点が開示されている。

【0007】

また、特許文献２には、ＢＳＨのＳＨ基をシアノエチル化したものとα―アミノ酸誘導体との結合物が開示されている。また、特許文献３には、ＢＳＨのＳＨ基をシアノエチル化したものとカルボニル基をエステル結合した結合物が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２０１６－０２０３１６号公報

【特許文献2】国際公開第２０１０／０１０９１２号

【特許文献3】特開２００８－０９４７３０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかし、特許文献１での共有結合では、ＢＳＨのチオール基とＣＰＰに修飾したマレイミド基の反応により生じるため、ラセミ化が生じる。ラセミ化は、サリドマイドのように人体に甚大な悪影響を及ぼす可能性があるため、ラセミ化を生じないような連結方法が必要となる。

【0010】

特許文献２および３では、ＢＳＨとの結合においてラセミ体は生じない形状をしているが、ＢＳＨのＳＨ基をシアノエチル化した後、ハロゲン化アルキルと反応させ、その後さらにシアノエチル基を除去するという複雑な工程を用いている。また、特許文献２では、ホウ素化合物としてラセミ体が生じることを前提にしている。これは、ＢＳＨに結合させるペプチドのＮ末端若しくはＣ末端でＢＳＨと結合していないからである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、ＢＳＨとＣＰＰとの結合において、ラセミ化が生じない結合を有するホウ素化合物を提供するものである。

【0012】

より具体的に本発明に係るホウ素化合物は、
メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）のＳＨ基と細胞内運搬ペプチドのＮ末端のＮＨ_２基がメチレンカルボニルリンカーで連結されたことを特徴とする。

【0013】

また、本発明に係るホウ素化合物の製造方法は、
細胞内運搬ペプチドのＮ末端をクロロアセチル化する工程と、
メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）に、前記Ｎ末端がクロロアセチル化された細胞内運搬ペプチドを結合させる工程と有することを特徴とする。

【発明の効果】

【0014】

本発明に係るホウ素化合物は、ＢＳＨと細胞内運搬ペプチドがメチレンカルボニルリンカーで連結されているので、ラセミ化が生じることがなく、人体への甚大な悪影響を及ぼす可能性を排除することができる。

【0015】

また、本発明に係るホウ素化合物の製造方法では、Ｎ末端をクロロアセチル化した細胞内運搬ペプチドをＢＳＨと反応させるだけで、ＢＳＨと細胞内運搬ペプチドをラセミ化が生じない方法で結合させることができ、製造方法を単純化させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明に係るホウ素化合物の構造を示す図である。

【図2】従来技術と本発明の相違点を示す図である。

【図3】本発明に係るホウ素化合物の合成手順を示す図である。

【図4】ＣＰＰをトリアルギニンで構成した場合のホウ素化合物の合成手順を示す図である。

【図5】Ｃｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ－ＮＨ_２のＲＰ－ＨＰＬＣ測定結果を示す図である。

【図6】Ｃｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ－ＮＨ_２のＭＡＬＤＩ－ＴｏｆＭａｓｓ測定結果を示す図である。

【図7】ＢＳＨ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ－ＮＨ_２のＲＰ－ＨＰＬＣ測定結果を示す図である。

【図8】ＢＳＨ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ－ＮＨ_２のＭＡＬＤＩ－ＴｏｆＭａｓｓ測定結果を示す図である。

【図9】ＢＳＨ－ＣＰＰ（トリアルギニン）連結体を細胞に導入した際の染色写真である。

【図10】ＢＳＨ－ＣＰＰ（ウンデカアルギニン）連結体を細胞に導入した際の染色写真である。

【図11】反応時間毎のＲＰ－ＨＰＬＣの測定結果を示すグラフである。（ａ）は時間と共に反応が進む場合の結果を表す。（ｂ）は反応が進まない場合の結果を表す。

【図12】ペプチドの種類を変えた場合の反応率を測定した結果である。

【図13】ペプチドの長さを変えた場合の反応率を測定した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下に本発明に係るホウ素化合物とその製造方法について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。

【0018】

本発明に係るホウ素化合物の構造を図１に示す本発明に係るホウ素化合物（符号は１）は、１分子中に１２個のホウ素安定同位体（^１０Ｂ）が含まれているホウ素クラスタにチオール基（ＳＨ基）が付加されているメルカプトウンデカハイドロドデカボレート（以下「ＢＳＨ」と呼ぶ。符号は１０）と、メチレンカルボニルリンカー（符号は１２）と、細胞内運搬ペプチド（ＣＰＰ）（符号は１４）で構成される。なお、ＣＰＰのＮ末端とＣ末端以外の部分を「ＣＰＰ本体」とした。また、後述する実施例４で示すように、ＣＰＰのＮ末端とメチレンカルボニルリンカー１２の間に分子が含まれていてもよい。

【0019】

メチレンカルボニルリンカーは、ＢＳＨのチオール基（ＳＨ基）と、ＣＰＰのＮ末端との間をつなぐもので、図１のメチレンカルボニルリンカー１２に示す構造をしている。示性式では、（－Ｃ－Ｃ（Ｏ）－）である（（Ｏ）は炭素に二重結合で結合している状態を示す。）。これは、後に詳説するが、ＣＰＰのＮ末端にクロロアセチル基を導入し、クロロアセチル基の塩素が抜けてチオール基の硫黄と結合してできた結果の構造である。

【0020】

ＣＰＰは、ＢＳＨを細胞内へ導入するためのもので、細胞膜透過能を有するペプチドである。具体的には、Ｔａｔタンパク質、オリゴアルギニン、ＨＩＶ－１Ｒｅｖ（３４－５０）、ＦＨＶ Ｃｏａｔといった塩基性ペプチドである。本発明に係るホウ素化合物では、Ｎ末端が結合したα－炭素（ＣＰＰ本体のＮ末端のアミノ酸のα－炭素）にカチオン性基が結合したものが望ましい。例えば、Ｔａｔやアルギニンは細胞内への運搬能および構造の点からも望ましい。なお、ＣＰＰのＣ末端は、第一アミド（－ＣＯＮＨ_２）で示したが、カルボキシル基であってもよい。

【0021】

図２（ａ）は、特許文献１に示したＢＳＨにＣＰＰを結合させる方法の概念図を示す。この方法では、ＢＳＨにＣＰＰを結合させる際に、ＣＰＰのＮ末端にマレイミド基を結合ししておく。マレイミド基の二重結合が切れ、ＢＳＨのチオール基と結合し、ＢＳＨとマレイミド基を導入したＣＰＰを結合させることができる。この方法は１回の合成でＣＰＰとＢＳＨを結合させることができる。

【0022】

しかし、結合点にキラル炭素（符号２０）が出現し、結合の外れた水素が上側に来る場合（符号２２）と下側に来る場合（符号２４）で鏡像対象が発生してしまう。

【0023】

一方、図２（ｂ）は本発明に係るホウ素化合物の場合である。ＣＰＰのＮ末端にはクロロアセチル基（符号２６）が導入されている。ハロゲンである塩素とＢＳＨのチオール基の水素が脱離することで、ＢＳＨとＣＰＰは結合される。この時、ＢＳＨとＣＰＰを連結するメチレンカルボニルリンカー（符号１２）では、キラル炭素は出現せず、この部分でラセミ体は形成されない。したがって、安全に人体に投与することができる。また、この方法も１回の合成でＣＰＰとＢＳＨを結合することができる。

【0024】

次に本発明に係るホウ素化合物の製造方法について図３を参照して説明する。ＣＰＰのＮ末端をクロロアセチル化するために、まずＮ－ヒドロキシスクシンイミド（以下「ＮＨＳ」）とクロロ酢酸をエステル結合させたクロロエチルカルボニルオキシサクシンイミドを用意する。これを以下「クロロ酢酸ＮＨＳエステル（符号３０）」と呼ぶ。

【0025】

このクロロ酢酸ＮＨＳエステルをＣＰＰのＮ末端と反応させ、ＣＰＰのＮ末端にクロロアセチル基を導入する（図３（ａ））。これを「クロロアセチル化されたＣＰＰ（符号３２）」と呼ぶ。そして、クロロアセチル化されたＣＰＰとＢＳＨを結合させる（図３（ｂ））。ＣＰＰのクロロアセチル基の塩素と、ＢＳＨのチオール基の水素が脱離し、ＢＳＨとＣＰＰは結合され、本発明に係るホウ素化合物を得る。このとき、ＢＳＨとＣＰＰの間を結合させるのは、メチレンカルボニルリンカー（符号１２）である。

【0026】

したがって、メチレンカルボニルリンカーはＢＳＨのＳＨ基とＣＰＰのＮ末端のＮＨ_２基を連結すると言ってよい。

【0027】

本発明に係るホウ素化合物は、薬学的に許容できる塩の形で得られてもよい。薬学的に許容できる塩には、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。

【0028】

無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。

【0029】

有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。

【0030】

無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。

【0031】

有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。

【0032】

塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。

【実施例0033】

以下に本発明に係るホウ素化合物について実施例を示す。

【0034】

（実施例１）
ＢＳＨは１分子中に１２個の^１０Ｂと１個の－ＳＨ基を含んだホウ素クラスタである。ＢＳＨは、Ｋａｔｃｈｅｍ（プラハ、チェコ）より購入した。

【0035】

ＣＰＰであるオリゴアルギニン鎖からなるペプチドは、アルギニン（Ｒ）を３つ連結した後にグリシン（Ｇ）が結合したものとした。これをＣＰＰ（トリアルギニン）と呼ぶ。これは以下の手順でペプチド固相法により合成した。なお、合成の流れを図４に示す。また、ここでは簡単のためにＣＰＰ（トリアルギニン）を用いたが、グリシンの位置に細胞導入に好適なアミノ酸を連結できることは言うまでもない。

【0036】

＜クロロアセチル化されたＣＰＰの合成＞
図４（ａ）を参照して、Ｆｍｏｃペプチド固相合成法によりＲ３‐Ｇ（アルギニンの３連接続＋グリシン）をＦｍｏｃ－ＮＨ－ＳＡＬ－ＰＥＧ樹脂（渡辺化学工業、広島）上で作製した。樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で１晩膨潤させた後、ＤＭＦで洗浄し、樹脂上のアミノ基を保護しているＦｍｏｃ基を２０％ピぺリジン（和光純薬工業（株）、大阪）／ＤＭＦ溶液５００μＬで脱保護（７ｍｉｎ）した。

【0037】

脱保護された樹脂上のアミノ基に対して４等量のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（渡辺化学工業）ＤＭＦ溶液１４４μＬを加え、縮合剤（ＨＢＴＵ／ＤＭＦ溶液１３０μＬ、Ｎ‐メチルモルホリン（ＮＭＭ）１８μＬ）を加えカップリング（４０ｍｉｎ）させた。なお、ＨＢＴＵは、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＣＡＳ番号９４７９０－３７－１）である。

【0038】

その後、同様にＮ末端のアミノ基を保護しているＦｍｏｃ基を脱保護‐カップリングの工程を繰り返すことにより、３つのアルギニンをＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ（渡辺化学工業）を用いることにより縮合させた（図４の符号４０）。したがって、図４においてｎ＝３である。

【0039】

次に、Ｎ末端のアルギニンのアミノ基を脱保護し、そこに１０等量の０．５Ｍｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ／Ｎ‐メチルピロリドン（ＮＭＰ）溶液（これはクロロ酢酸ＮＨＳエステル／ＮＭＰ溶液（符号４２）といってよい。）を加えて反応させた（４０ｍｉｎ）。そうして生成物（Ｃｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ）を合成した。

【0040】

ジクロロメタンを用いて樹脂を乾燥させた後、切り出し溶液（トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）９５％、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）２．５％、蒸留水２．５％）５００μＬを加えて樹脂から切り出し（９０ｍｉｎ）、目的とするペプチド（クロロアセチル化したＣＰＰ（トリアルギニン）：Ｃｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ－ＮＨ_２）を得た（符号４４）。この反応による生成物は、クロロアセチル化したＣＰＰ（トリアルギニン）と不純物を含む混合物である。

【0041】

生成物中の不純物はジエチルエーテル沈殿法により除去し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＲＰ－ＨＰＬＣ）により単離・精製し、凍結乾燥して純度の高いクロロアセチル化したＣＰＰ（トリアルギニン）を得た。結果を図５に示す。図５を参照して、横軸は時間（分）であり、縦軸は検知電圧（ｍＶ）である。測定条件は、０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、ＭｅＣＮ＝０‐５０％、測定時間は２０分、測定波長は２３０ｎｍであった。測定結果としては、８．８４分の時点で３８０ｍＶであった。

【0042】

また、得られたクロロアセチル化したＣＰＰ（トリアルギニン）の確認は、質量分析（ＭＡＬＤＩ‐Ｔｏｆ Ｍａｓｓ）により行った。結果を図６に示す。図６において、横軸はｍ／ｚであり、縦軸は強度である。（理論値：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝６１９．３２、実測値：６２０．６９）収率は５４％であった。

【0043】

＜ＢＳＨ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ－ＮＨ_２の合成＞
図４（ｂ）を参照して、上記の操作で合成したＣｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ－ＮＨ_２をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｃｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ－ＮＨ_２１ｍｇに対してＤＭＳＯ２２０μＬ程度）に溶解させた。また、これとは別に、Ｃｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ－ＮＨ_２の１．５等量のＢＳＨ（符号１０）を蒸留水（上記のＤＭＳＯと同体積）に溶解させた。

【0044】

上記のように調製した２種の溶液を混合し、ｐＨが１０程度になるようにトリエチルアミン（ＴＥＡ）を１０μＬずつ加えた。ｐＨが１０付近になったことを確認したのち、３０ｍｉｎ攪拌させ反応させた。その後、０．５％トリフルオロ酢酸水溶液を１００μＬずつ加えていき、ｐＨ６付近まで加えることで反応を終了させた。この反応によってＢＳＨとクロロアセチル化したＣＰＰ（トリアルギニン）が結合したホウ素化合物（ＢＳＨ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ－ＮＨ_２）を含む生成物を得た。このホウ素化合物をＢＳＨ－Ｌ－ＣＰＰ（トリアルギニン）連結体（符号４６）とも呼ぶ。なお、ここで「Ｌ」はメチレンカルボニルリンカーである。

【0045】

この生成物は高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により単離・精製し、凍結乾燥し、高純度のＢＳＨ－Ｌ－ＣＰＰ（トリアルギニン）連結体を得た。結果を図７に示す。図７を参照して、横軸は時間（分）であり、縦軸は検知電圧（ｍＶ）である。測定条件は、０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ、ＭｅＣＮ＝０‐５０％、測定時間は２０分、測定波長は２３０ｎｍであった。測定結果としては、１１．７７分の時点で２０９ｍＶであった。

【0046】

また、得られたＢＳＨ－Ｌ－ＣＰＰ（トリアルギニン）連結体（符号４６：図４参照）の確認は、質量分析（ＭＡＬＤＩ－Ｔｏｆ Ｍａｓｓ）により行った。結果を図８に示す。図８において、横軸はｍ／ｚであり、縦軸は強度である。（理論値：［Ｍ＋Ｈ］^＋＝７４８．４４、実測値：７４９．５３）収率は３３％であった。結果、ペプチド合成からＢＳＨと反応させるまでの操作の収率は、樹脂に対して１７％であった。

【0047】

＜細胞導入＞
得られたＢＳＨ－Ｌ－ＣＰＰ（トリアルギニン）連結体が、細胞内に侵入できるかを確認するための試験として、培養したＵ８７ΔＥＧＦＲ細胞に、１００μＭのＢＳＨ－Ｌ－ＣＰＰ（トリアルギニン）連結体を加えて２４時間インキュベーションを行った。

【0048】

その後、細胞の培養液を取り除き、洗浄した後、共焦点レーザー顕微鏡を測定した。その結果を図９に示す。写真中のスケールバーはそれぞれ２０μｍを示す。

【0049】

図９（ａ）はＨｏｅｃｈｓｔによる核の染色画像である。染色された部分を白になるように白黒写真にしている。以下の写真も（図１０の写真も含め）同様である。図９（ｂ）はＢＳＨ抗体による染色した画像である。白く見える部分にＢＳＨが存在していることを示している。図９（ｃ）はＦ－ａｃｔｉｎによる細胞質の染色の画像であり、図９（ｄ）は、それらの重ね合わせ画像である。図９（ｂ）の写真で白く見えるＢＳＨが存在している部分は、図９（ｃ）の細胞質と図９（ａ）の細胞核を含めた領域に拡散している。これによりＢＳＨ－Ｌ－ＣＰＰ連結体（トリアルギニン）により「ＢＳＨがうまく細胞内に運搬できることが分かった。

【0050】

図１０はＢＳＨ－Ｌ－ＣＰＰ（トリアルギニン）連結体のＣＰＰに、トリアルギニンに変えてウンデカアルギニンを用いたときの結果である。つまり、ＢＳＨ－Ｌ－ＣＰＰ（ウンデカアルギニン）連結体を用いた場合の染色画像である。写真中のスケールバーは２０μｍを示す。

【0051】

図９と同じようにＢＳＨが存在している部分（図１０（ｂ））は、細胞質（図１０（ｃ））と細胞核（図１０（ａ））の領域に拡散している。したがって、ＢＳＨ－Ｌ－ＣＰＰ（ウンデカアルギニン）連結体を用いた場合でも、うまくＢＳＨが細胞内に運搬できることがわかった。したがって、ＣＰＰを構成するアルギニンは、少なくとも３個以上１１個以下（３乃至１１個ともいう）の連結体が利用できると考えられる。

【0052】

（実施例２）
実施例１と同様に、ＣＰＰを構成しているトリアルギニン（Ｒ３）の代わりにトリリジン（Ｋ３）、トリヒスチジン（Ｈ３）、トリチロシン（Ｙ３）、トリアスパラギン酸（Ｄ３）、トリグルタミン酸（Ｅ３）、トリセリン（Ｓ３）、トリトレオニン（Ｔ３）、トリアスパラギン（Ｎ３）、トリグルタミン（Ｑ３）、トリグリシン（Ｇ３）、トリアラニン（Ａ３）、トリバリン（Ｖ３）、トリロイシン（Ｌ）、トリイソロイシン（Ｉ）、トリフェニルアラニン（Ｆ）、トリトリプトファン（Ｗ）に置換したものを作成した。

【0053】

それぞれＣＰＰ（トリアルギニン）、ＣＰＰ（トリリジン）、ＣＰＰ（ヒスチジン）、ＣＰＰ（トリチロシン）、ＣＰＰ（トリアスパラギン酸）、ＣＰＰ（トリグルタミン酸）、ＣＰＰ（トリセリン）、ＣＰＰ（トリトレオニン）、ＣＰＰ（トリアスパラギン）、ＣＰＰ（トリグルタミン）、ＣＰＰ（トリグリシン）、ＣＰＰ（トリアラニン）、ＣＰＰ（トリバリン）、ＣＰＰ（トリロイシン）、ＣＰＰ（トリイソロイシン）、ＣＰＰ（トリフェニルアラニン）、ＣＰＰ（トリトリプトファン）と呼ぶ。そしてこれらをクロロアセチル化したＣＰＰとＢＳＨとの合成を試みた。

【0054】

＜隣接するアミノ酸によるクロロアセチル基とＢＳＨとの反応性＞
クロロアセチル基とＢＳＨとのＳ_Ｎ２反応において、クロロアセチル基と隣接するアミノ酸（ＣＰＰ本体のＮ末端のアミノ酸）の種類によって反応性の違いを評価するため、ＨＰＬＣによる反応追跡とＭＡＬＤＩ－Ｔｏｆ－Ｍａｓｓによる同定を行った。その代表例を図１１（ａ）（ｂ）に示した。

【0055】

図１１を参照して、図１１（ａ）、（ｂ）共に横軸は時間（分）であり、縦軸は出力電圧（ｍＶ）である。横軸は反応開始からの時間とみてよい。同一質量のものは、同一時間にピークを観測することができる。図１１（ａ）では、０分の場合（破線）には、８分５０秒付近にピークが観測された。３０分経過時（実践）には、１０分２０秒付近にピークが移動し、１日経過後（一点鎖線）も１０分２０秒付近のピークは維持されていた。この結果より、アミノ酸との反応が進行したと判断できる。

【0056】

一方、図１１（ｂ）の場合は、０分（破線）、３０分（実線）および１日（一点鎖線）のピーク位置は、ほとんど変化なく、反応は進行しなかったと判断できる。

【0057】

それらの結果から反応が進行したアミノ酸と反応が進行しなかったアミノ酸にグループ分けした。その結果を表１に示す。

【0058】

【表1】

【0059】

表１を参照して、クロロアセチル基に隣接するアミノ酸の側鎖に塩基性基を有するＣＰＰ（トリアルギニン）とＣＰＰ（トリリジン）、ＣＰＰ（ヒスチジン）の三つはＢＳＨとの反応が進行した。しかし、ＣＰＰ（トリリジン）、ＣＰＰ（ヒスチジン）の二つはアルギニンほど顕著な反応性は見られなかった。また、クロロアセチル基に隣接するアミノ酸の側鎖に塩基性基を有していないＣＰＰ（トリチロシン）、ＣＰＰ（トリアスパラギン酸）、ＣＰＰ（トリグルタミン酸）、ＣＰＰ（トリセリン）、ＣＰＰ（トリトレオニン）、ＣＰＰ（トリアスパラギン）、ＣＰＰ（トリグルタミン）、ＣＰＰ（トリグリシン）、ＣＰＰ（トリアラニン）、ＣＰＰ（トリバリン）、ＣＰＰ（トリロイシン）、ＣＰＰ（トリイソロイシン）、ＣＰＰ（トリフェニルアラニン）、ＣＰＰ（トリトリプトファン）はＢＳＨとの反応が進行しなかった。

【0060】

以上の結果より、反応が進行したアミノ酸の共通点は塩基性アミノ酸であるということが分かった。すなわちクロロアセチル基に隣接するアミノ酸（ＣＰＰ本体のＮ末端のアミノ酸）に塩基性アミノ酸を用いることでＢＳＨとＣＰＰの反応が進行する。

【0061】

（実施例３）
ＢＳＨとＣＰＰの反応が進行させるためには、クロロアセチル基に隣接するアミノ酸に塩基性アミノ酸を用いる必要がある。これはＢＳＨと塩基性アミノ酸を有するＣＰＰとの静電相互作用に依存していると示唆される。そこでアルギニンの数を減らし、電荷を変化させることでどのような影響があるか評価した。

【0062】

実施例１のトリアルギニン（「ＲＲＲ」と表記した。）に加えて、アルギニン－アルギニン－アラニン（「ＲＲＡ」と表記した。）、アルギニン－アラニン－アラニン（「ＲＡＡ」と表記した。）となるＣＰＰを合成し、クロロアセチル化の後ＢＳＨとの反応を試みた。そのＨＰＬＣの結果から各ペプチドの反応率を算出し図１２のグラフにプロットした。

【0063】

図１２を参照して、横軸は反応時間（分）であり、縦軸は反応率（％）である。また、ＲＲＲは、アルギニン－アルギニン－アルギニン（トリアルギニン）であり、ＲＲＡは、アルギニン－アルギニン－アラニンであり、ＲＡＡはアルギニン－アラニン－アラニンである。ＣＰＰをＲＲＲにした場合のＢＳＨとの反応は、３０分で１００％の反応率であった。一方、ＣＰＰをＲＡＡ、ＲＡＡにした場合は、アラニンの増加と共に、反応率は低下した。アラニンの増加は、ＣＰＰ内の電荷の減少と考えてよい。

【0064】

すなわち、図１２の結果より、ＣＰＰ分子内の電荷の減少と伴にＢＳＨとの反応率が減少することが確認できた。一方、アルギニンが１つの場合であっても、反応率は５０％以上を達成することができ、実用的には使用できる。すなわち、ＢＳＨとＣＰＰの反応を迅速に進行させるためにはＣＰＰ分子内にアルギニンが最低でも１つ以上必要であることが必要である。なお、ここではアルギニンについての実施例を示したが、表１で示したように、アルギニンと同様にＢＳＨとの反応を進行させることができるリジン、ヒスチジンを使ってもＢＳＨとＣＰＰの反応を迅速に進行させることができると考えられる。

【0065】

（実施例４）
電荷保有部位と反応点との距離を遠ざけることで反応にどのような影響があるか評価するため、アルギニンとクロロアセチル基の間に任意の炭化水素鎖を組み込んだＣｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｃ１－Ｒ３－Ｓｐ６－ＮＨ_２、Ｃｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｃ２－Ｒ３－Ｓｐ６－ＮＨ_２、Ｃｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｃ４－Ｒ３－Ｓｐ６－ＮＨ_２、Ｃｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｃ７－Ｒ３－Ｓｐ６－ＮＨ_２、Ｃｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｃ１１－Ｒ３－Ｓｐ６－ＮＨ_２を実施例１と同様に合成しＢＳＨとの反応を試みた。なお、反応点とはＢＨＳのチオール基の水素と、クロロアセチ基の塩素の反応箇所をいう。

【0066】

Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ１１は、それぞれ炭素が１、２、３、４、１１の直鎖の炭化水素鎖である。すなわちこれらの直鎖炭化水素は、ＣＰＰとクロロアセチル基の間に挿入される。そのＨＰＬＣの結果から各ペプチドの反応率を算出し図のグラフにプロットした。

【0067】

図１３を参照して、横軸は反応時間（分）であり、縦軸は反応率（％）である。炭化水素鎖の長さが長くなるに従って、反応率は低下した。図１３の結果より、電荷保有部位であるＣＰＰとクロロアセチル基との距離の増加と伴にＢＳＨとの反応率が減少することが確認できた。

【0068】

また、直鎖炭素数が７でも反応率は２０％以上を示しており、実用的に利用できる範囲である。従って、ＢＳＨとクロロアセチル化したＣＰＰの反応を迅速に進行させるためにはＣＰＰと反応点であるクロロアセチル基の距離を炭素鎖七つ分以内に収める必要がある。言い換えると、ＣＰＰのＮ末端には炭素数７以下の炭素鎖があってもよい。また、ＣＰＰとメチレンカルボニルリンカーの間に炭素数が７以下の炭素鎖を配置できると言ってもよい。

【0069】

なお、この炭素数７以下の炭素鎖は、アルギニンの連結部の炭素七つとも見なすことができ、炭素鎖を全てアルギニンに置き換えれば、アルギニンは１０個を連続させた結合体までつけることができる。なお、ここではアルギニンについての実施例を示したが、表１で示したように、アルギニンと同様にＢＳＨとの反応を進行させることができるリジン、ヒスチジンを使ってもＢＳＨとＣＰＰの反応を迅速に進行させることができると考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0070】

本発明に係るホウ素化合物は、ホウ素中性子捕捉療法のための薬剤として好適に利用できる。

【符号の説明】

【0071】

１ ホウ素化合物
１０ ＢＳＨ
１２ メチレンカルボニルリンカー
１４ ＣＰＰ
２０ キラル炭素
２２ 結合でできた水素が上の場合
２４ 結合でできた水素が下の場合
２６ クロロアセチル基
３０ クロロ酢酸ＮＨＳエステル
３２ クロロアセチル化されたＣＰＰ
４０ ＣＰＰ（トリアルギニン）
４２ クロロ酢酸ＮＨＳエステル／ＮＭＰ溶液
４４ クロロアセチル化したＣＰＰ（トリアルギニン）（Ｃｌ－ＣＨ_２ＣＯ－Ｒ３－Ｇ－ＮＨ_２）
４６ ＢＳＨ－Ｌ－ＣＰＰ（トリアルギニン）連結体

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】