特開 2022-64286 マクロファージの挙動調節用ナノらせん－基板複合体、その製造方法、及びそれを利用したマクロファージの付着及び分極化調節方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022064286

(43)【公開日】2022-04-25

(54)【発明の名称】マクロファージの挙動調節用ナノらせん－基板複合体、その製造方法、及びそれを利用したマクロファージの付着及び分極化調節方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/02 20060101AFI20220418BHJP

   A61K 41/00 20200101ALI20220418BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20220418BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20220418BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20220418BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220418BHJP

【ＦＩ】

A61K47/02

A61K41/00

A61K35/15 Z

A61K9/14

A61K47/62

A61P29/00

【審査請求】有

【請求項の数】19

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021138666

(22)【出願日】2021-08-27

(31)【優先権主張番号】10-2020-0131888

(32)【優先日】2020-10-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(71)【出願人】

【識別番号】518107501

【氏名又は名称】コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】１４５，Ａｎａｍ－ｒｏ，Ｓｅｏｎｇｂｕｋ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100135079

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 修

(72)【発明者】

【氏名】キム ヨン－グン

(72)【発明者】

【氏名】カン，ヒ－ミン

(72)【発明者】

【氏名】コ，ミン－ジュン

(72)【発明者】

【氏名】ペ グンヒュ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC14

4C076DD22

4C076EE41

4C076FF31

4C084AA11

4C084AA24

4C084MA43

4C084MA66

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB11

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087MA43

4C087MA66

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB11

(57)【要約】      （修正有）

【課題】マクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体、この製造方法及び前記複合体を利用したマクロファージの付着及び分極化調節方法の提供。
【解決手段】マクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体は、基板、基板と化学結合されたナノらせん、及び前記ナノらせんと化学結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、前記ナノらせんは螺旋形のナノワイヤで構成され、一つ以上の金属元素を含み、前記ナノらせんは１００ｎｍ～２０μｍの長さを有し、磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含むことを特徴とする。
［式１］｜Ｌ１－Ｌ０｜＞１０ｎｍ
式１中、Ｌ１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、Ｌ０は磁場が印加されないナノらせんの長さである。
マクロファージの付着及び分極化調節方法は、前記複合体への磁場の印加有無を制御することにより調節するものである。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

基板、基板と化学結合されたナノらせん、及び前記ナノらせんと化学結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、
前記ナノらせんは螺旋形のナノワイヤで構成され、一つ以上の金属元素を含み、
前記ナノらせんは１００ｎｍ～２０μｍの長さを有し、
前記ナノらせんは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含むことを特徴とするマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体：
［式１］
｜Ｌ_１－Ｌ_０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ_１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ_０は磁場が印加されないナノらせんの長さである。

【請求項2】

前記金属元素はコバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）及びニッケル（Ｎｉ）の中の一つ以上の元素を含むことを特徴とする請求項１に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体。

【請求項3】

前記ナノワイヤは断面が円形のワイヤ形態で備えられ、直径は５ｎｍ～１００ｎｍであり、
前記ナノらせんの螺旋形外径の平均長さは５０ｎｍ～２００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体。

【請求項4】

前記印加される磁場は１００ｍＴ～７Ｔの大きさであることを特徴とする請求項１に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体。

【請求項5】

前記インテグリンリガンドペプチドは複数個が前記ナノらせんに互いに離隔されて結合され、互いに隣合うインテグリンリガンドの間の平均間隔は１～１０ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体。

【請求項6】

磁場の印加時に、前記ナノらせんの互いに隣合う螺旋は離隔され、互いに隣合う螺旋の間のピッチ（ｐｉｔｃｈ）は１ｎｍ～１００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体。

【請求項7】

前記インテグリンリガンドペプチドはチオール化されたインテグリンリガンドペプチドを含み、
前記インテグリンリガンドペプチドのチオール基と螺旋形のナノらせんのポリエチレングリコールリンカーによって結合された構造であることを特徴とする請求項１に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体。

【請求項8】

前記ナノらせんはカルボン酸塩が置換されて基板と結合された構造であることを特徴とする請求項１に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体。

【請求項9】

前記基板はナノらせんが結合されない基板の表面が非活性化されたことを特徴とする請求項１に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体。

【請求項10】

一つ以上の金属元素を含む溶液を電着してナノらせんを用意するステップと、
前記ナノらせんと第１懸濁液とを混合してナノらせんにカルボン酸塩置換基を置換するステップと、
カルボン酸塩が置換されたナノらせんを含む溶液に表面が活性化された基板を担持してナノらせんが結合された基板を製造するステップと、
ナノらせんが結合された基板をポリエチレングリコールリンカーを含む溶液に担持してナノらせんの末端にリンカーを結合するステップと、
インテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２懸濁液と活性化されたナノらせんが結合された基板を混合してナノらせんにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップと、を含むことを特徴とするマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体の製造方法。

【請求項11】

ナノらせんを用意するステップで金属元素を含む溶液はコバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）及びニッケル（Ｎｉ）の中の一つ以上の金属元素を含むことを特徴とする請求項１０に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体の製造方法。

【請求項12】

カルボン酸塩置換基を置換するステップで、前記第１懸濁液はカルボン酸塩置換基を含むアミノ酸誘導体を含み、
前記アミノ酸誘導体がナノらせんの表面に結合することを特徴とする請求項１０に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体の製造方法。

【請求項13】

インテグリンリガンドペプチドを結合するステップで、前記第２懸濁液はチオール化されたインテグリンリガンドペプチドを含むことを特徴とする請求項１１に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体の製造方法。

【請求項14】

ナノらせんが結合された基板を製造するステップは、基板を酸性溶液の中に浸漬させて基板の表面を活性化させた後表面が活性化された基板をアミノシラン溶液の中に担持して表面をアミン化させた基板を用いることを特徴とする請求項１１に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体の製造方法。

【請求項15】

ナノらせんにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップ以後にポリエチレングリコール誘導体を含む溶液にナノらせんが結合された基板を担持してナノらせんが結合されない基板の表面を非活性化させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載のマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体の製造方法。

【請求項16】

請求項１～９の中の何れか一項によるマクロファージの細胞付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体に培養液を処理した後２０ｍＴ～７Ｔの磁場を印加してマクロファージの細胞付着及び分極化を調節するステップを含み、
前記ナノらせんは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含むことを特徴とするマクロファージの付着及び分極化調節方法：
［式１］
｜Ｌ_１－Ｌ_０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ_１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ_０は磁場が印加されないナノらせんの長さである。

【請求項17】

マクロファージの付着及び分極化を調節するステップはナノらせん－基板複合体に磁場の印加有無によって可逆的にナノらせんの長さを変化させて生体内または生体外のマクロファージの付着及び分極化を調節する請求項１６に記載のマクロファージの付着及び分極化調節方法。

【請求項18】

マクロファージの付着及び分極化を調節するステップは、ナノらせん－基板複合体に磁場を印加しない場合、炎症性（Ｍ１）表現型を促進することを特徴とする請求項１６に記載のマクロファージの付着及び分極化調節方法。

【請求項19】

マクロファージの付着及び分極化を調節するステップは、ナノらせん－基板複合体に磁場を印加する場合、再生性及び抗炎症性（Ｍ２）表現型を促進することを特徴とする請求項１６に記載のマクロファージの付着及び分極化調節方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はマクロファージの付着及び分極化調節のためのナノらせん－基板複合体、その製造方法及び前記ナノらせん－基板複合体を利用したマクロファージの付着及び分極化調節方法に関し、具体的には、前記ナノらせん－基板複合体に磁場印加有無によってマクロファージの細胞付着及び分極化を調節する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

マクロファージは先天免疫を担当する主な細胞である。体全体に定着性で存在するのが大部分であるが、一部は血液内で単球の形態で存在する。この単球は樹状細胞やマクロファージに分化することができる。大部分のマクロファージは定着性で、代表的に塵埃細胞、ミクログリア細胞、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞などがあり、これらは全身に分布されて、抗原が侵入すれば摂食するか毒素を分泌して破壊、抗原を取り除き、リンパ球に抗原を伝達、免疫反応を引き起こす。血中の単球は敵が傷に侵入すれば好中球とともに血管の外に出てマクロファージに分化されて、バクテリアを除去する。また、マクロファージは体内のあちこちを移動して食作用をする自由型（Ｆｒｅｅ ｆｏｒｍ）と指定された臓器に固定されて食作用をする固着型（Ｆｉｘｅｄ ｆｏｒｍ）に分けられる。固着型マクロファージは肝のクッパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌ）、肺胞のマクロファージ、結合組織の構造（Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ）、脳のミクログリア細胞（Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）などがある。

【0003】

このように、マクロファージの再生及び抗炎症効果を効率的に制御するための方法として生体内でリガンドの提示を通じた技術が利用されている。しかしながら、従来のマイクロ規模のインテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）着脱（ｕｎｃａｇｉｎｇ）が宿主マクロファージの付着を調節するが、マクロファージの機能的表現型分極の調整はしないという問題がある。

【0004】

そこで、本出願人はナノバーコードリガンドの周期性及び配列順を制御してマクロファージの付着及び分極化を制御する技術を開発及び出願したことがある。

【0005】

以下、本願出願人は既に出願したマクロファージ付着及び分極化技術に比べてさらに向上され、生体親和的技術を提供することができる技術を提案する。特にリガンドを予め設計して挿入する方式ではなく、注入後外部刺激を利用して細胞の特性をリアルタイムに変化させることができる技術を提案する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】大韓民国登録特許１０－１９１６５８８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明が解決しようとする課題は、リガンドがコーティングされたナノらせんを含む基板を提供し、リガンドがコーティングされたナノらせんに磁場を印加することを制御してマクロファージの付着及び分極化を調節する方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、基板、基板と化学結合されたナノらせん、及び前記ナノらせんと化学結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、前記ナノらせんは螺旋形のナノワイヤで構成され、一つ以上の金属元素を含み、前記ナノらせんは１００ｎｍ～２０μｍの長さを有し、前記ナノらせんは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含むマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体を提供する。

【0009】

［式１］
｜Ｌ_１－Ｌ_０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ_１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ_０は磁場が印加されないナノらせんの長さである。

【0010】

また、本発明は二つ以上の金属元素を含む溶液を電着してナノらせんを用意するステップと、前記ナノらせんと第１懸濁液とを混合してナノらせんにカルボン酸塩置換基を置換するステップと、カルボン酸塩が置換されたナノらせんを含む溶液に表面が活性化された基板を担持してナノらせんが結合された基板を製造するステップと、ナノらせんが結合された基板をポリエチレングリコールリンカーを含む溶液に担持してナノらせんの末端にリンカーを結合するステップと、インテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２懸濁液と活性化されたナノらせんが結合された基板を混合してナノらせんにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップと、を含むマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体の製造方法を提供する。

【0011】

また、本発明は前述したマクロファージの細胞付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体に培養液を処理した後、２０ｍＴ～７Ｔの磁場を印加してマクロファージの細胞付着及び分極化を調節するステップを含み、前記ナノらせんは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含むマクロファージの付着及び分極化調節方法を提供する：
［式１］
｜Ｌ_１－Ｌ_０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ_１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ_０は磁場が印加されないナノらせんの長さである。

【発明の効果】

【0012】

本発明によるマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体は、インテグリンリガンドペプチドがコーティングされたナノらせんに磁場の印加有無を制御することにより可逆的な制御が可能であり、生体内及び生体外でのマクロファージの付着及び表現型分極化を効率的に調節することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】本発明の一実施例によるマクロファージの細胞付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体及びこれを利用したマクロファージの付着及び分極化調節方法を示した模式図である。

【図2】本発明によるナノらせんの走査電子顕微鏡イメージである。

【図3】本発明によるナノらせんの高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）イメージ、エネルギー分散型Ｘ線分光法マッピング（ＥＤＳ Ｍａｐｐｉｎｇ）、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージ及び高分解能走査透過電子顕微鏡（ＨＲ－ＳＴＥＭ）イメージを示し、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭとＥＤＳのスケールバーは２５０nｍ、ＳＥＭのスケールバーは１μｍであり、ＨＲ－ＳＴＥＭのスケールバーは４Åを表す。

【図4】本発明によるナノらせんの（ａ）エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＳ）及び（ｂ）電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）で分析した結果グラフである。

【図5】本発明によるナノらせんの振動試料型磁力計測定結果グラフである。

【図6】本発明によるナノらせんのＸ線回折分析グラフである。

【図7】本発明によるナノらせんの高分解能透過電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）イメージであり、左側スケールバーは３００ｎｍ、右側スケールバーは２ｎｍである。

【図8】本発明によるナノらせん－基板複合体を製造するステップを図式化したイメージである。

【図9】本発明によるナノらせん－基板複合体のフーリエ変換赤外線分光（ＦＴ－ＩＲ）分析結果である。

【図10】本発明によるナノらせんを対象として原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で撮影したイメージであり、スケールバーは５００ｎｍを表す。

【図11】本発明によるナノらせんを対象として原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で撮影したイメージである。

【図12】本発明によるナノらせん－基板複合体を利用して培養されたマクロファージ（２４時間後）のＦ－アクチン、核及びビンキュリンに対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した細胞密度、細胞面積、細胞伸長因子を示したグラフ（ｂ）であり、スケールバーは２０μｍを表す。

【図13】本発明によるナノらせん－基板複合体を利用して培養されたマクロファージ（２４時間後）の生きている細胞と死んだ細胞に対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した細胞生存能力を示したグラフ（ｂ）であり、スケールバーは５０μｍを表す。

【図14】本発明の比較例によるナノらせんのない基板（Ｎｏ ｎａｎｏｈｅｌｉｘ）またはインテグリンリガンド（ＲＧＤ）が結合されないナノらせん－基板複合体で二重モードスイッチング（ｂｉｍｏｄａｌ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）に対するマクロファージの付着性実験結果である。

【図15】本発明によるナノらせん－基板複合体を利用して１２時間の間隔で磁場印加を調節して３６時間の間培養されたマクロファージのＦ－アクチン、核及びビンキュリンに対する共焦点免疫蛍光イメージで、この時、スケールバーは２０μｍを表す。

【図16】本発明によるナノらせん－基板複合体を利用して磁場印加によってマクロファージの付着－依存的表現型分極が調節されるかに対する実験結果を示したのであり、スケールバーは２０μｍを表す。

【図17】本発明のナノらせん－基板複合体を利用して分極表現型とマッチングされた刺激培地がない時（即ち、Ｍ２－刺激培地でＭ１発現またはＭ１－刺激培地でＭ２発現）の磁場印加に対する実験結果である。

【図18】３６時間の間磁場を印加した伸長（「ＯＮ」）及び磁場を印加しない収縮（「ＯＦＦ」）の二重モードスイッチング下でＭ１またはＭ２培地でマクロファージを培養した後ＲＯＣＫ２及び核の共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）及び共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算したＲＯＣＫ２免疫蛍光強度を表したグラフであり、スケールバーは２０μｍを表す。

【図19】本発明の一実施例によるナノらせん－基板複合体を利用して実験したもので、（ａ）はＲＯＣＫ（Ｙ２７６３２）、ミオシンII（ブレビスタチン）またはアクチン重合（サイトカラシンＤ）に対する抑制剤の存在及び不在のＭ１分極培地で３６時間の間培養した後ＣＤ６８、Ｆ－アクチン及び核に対する共焦点免疫蛍光イメージと共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した細胞面積、細胞伸長因子及びＣＤ６８蛍光強度を表したグラフであり、（ｂ）はＲＯＣＫ（Ｙ２７６３２）、ミオシンII（ブレビスタチン）またはアクチン重合（サイトカラシンＤ）に対する抑制剤の存在及び不在のＭ２分極培地で培養した後Ａｒｇ－１及びＦ－アクチン及び核に対する共焦点免疫蛍光イメージであり、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した細胞面積、細胞伸長因子及びＡｒｇ－１蛍光強度を表したグラフである。

【図20】本発明によるナノらせん－基板複合体を利用した生体内宿主マクロファージ付着及び表現型調節に対する実験結果である。

【図21】本発明によるナノらせん－基板複合体を利用した生体内宿主マクロファージ付着及び表現型調節に対する実験結果である。

【図22】本発明によるナノらせん－基板複合体を利用して基板に対する宿主好中球の生体内付着実験結果である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明をより具体的に説明するために、本発明による好ましい実施例を添付図面を参照してより詳しく説明する。しかしながら、本発明はここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。

【0015】

本発明は、基板、基板と化学結合されたナノらせん、及び前記ナノらせんと化学結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、前記ナノらせんは螺旋形のナノワイヤで備えられ、一つ以上の金属元素を含み、前記ナノらせんは１００ｎｍ～２０μｍの長さを有し、前記ナノらせんは磁場の印加有無によって可逆的に長さが下記式１の範囲内で変化することを含むマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体を提供する：
［式１］
｜Ｌ_１－Ｌ_０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ_１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ_０は磁場が印加されないナノらせんの長さである。

【0016】

図１は本発明によるマクロファージの細胞付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体及びこれを利用したマクロファージの細胞付着及び分極化調節方法を示した模式図である。

【0017】

図１によれば、本発明のナノらせん－基板複合体は、基板、基板と化学結合されたナノらせん、及び前記ナノらせんと化学結合されたインテグリンリガンドペプチドを含み、前記ナノらせんは螺旋形のナノワイヤで備えられ、前記ナノワイヤはコバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）及びニッケル（Ｎｉ）の中の一つ以上の金属元素を含むことが分かる。

【0018】

具体的には、前記ナノらせんは式１を充足する螺旋形ナノワイヤで備えられることができる：
［式１］
｜Ｌ_１－Ｌ_０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ_１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ_０は磁場が印加されないナノらせんの長さである。

【0019】

前記式１で、磁場が印加されないナノらせんの長さは１００ｎｍ～２０μｍ、５００ｎｍ～４μｍまたは１μｍ～３μｍであってもよい。

【0020】

前記のように、磁場を印加する時、ナノらせんが伸長（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）されて長さが長くなると、生体内でマクロファージの付着及びＭ２分極を促進させることができる。ただ、磁場が除去される場合ナノらせんが収縮して既存のナノらせんの長さに戻る。

【0021】

具体的には、前記式１で磁場の印加有無によるナノらせんの長さ変化は１０ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、１０ｎｍ～５００ｎｍまたは１０ｎｍ～１００ｎｍであってもよい。

【0022】

本発明のナノらせん－基板複合体でナノらせんの長さ変化が前記式１を充足しない場合、前記ナノらせんの長さ変化が小さくて細胞付着能の差を見せなくて問題になる。

【0023】

前記ナノらせんの螺旋形外径の平均長さは５０ｎｍ～２００ｎｍまたは１００ｎｍ～２００ｎｍであってもよい。ナノらせんの螺旋形外径が１００ｎｍ未満の場合、ナノらせんが小さすぎてインテグリンリガンドペプチドが所定の間隔を隔てて結合しにくくなり、外径が２００ｎｍを超える場合、基板上にナノらせんが占める領域が広くなって基板で適切な密度で分布しにくいという問題がある。

【0024】

前記ナノらせんはナノワイヤからなり、前記ナノワイヤはコバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）及びニッケル（Ｎｉ）の中の一つまたは二つ以上の金属元素を含むことができ、前記ナノワイヤは断面が円形のワイヤ形態で備えられ、直径は５ｎｍ～１００ｎｍ、２０ｎｍ～９０ｎｍまたは６０ｎｍ～９０ｎｍであってもよい。前記のようなワイヤの直径を充足しない場合、ナノらせんの伸長及び収縮が円滑に現れないないことがある。

【0025】

前記ナノらせん内に結合されたインテグリンリガンドペプチドはチオール化されたインテグリンリガンドペプチドであってもよく、前記インテグリンリガンドペプチドは複数個が前記ナノらせんに互いに離隔されて結合され、互いに隣合うインテグリンリガンドの間の平均間隔は１ｎｍ～１０ｎｍであってもよい。互いに隣合うインテグリンリガンドペプチドの間の平均間隔が１ｎｍ未満の場合、磁場を印加した場合にもマクロファージの付着及び分極化を活性化しにくく、１０ｎｍを超える場合、磁場を印加しない場合にもマクロファージの付着及び分極化を活性化して磁場を利用した可逆的制御をしにくいという問題が発生する。

【0026】

前記ナノらせんで磁場を印加する時、前記ナノらせんの互いに隣合う螺旋は離隔され、互いに隣合うらせんの間のピッチ（ｐｉｔｃｈ）は１ｎｍ～１００ｎｍ、１ｎｍ～５０ｎｍまたは５ｎｍ～３０ｎｍであってもよい。これは磁場の印加時にナノらせんが伸長（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）しながらピッチ間隔が増加したのである。それによってインテグリンリガンドペプチドの間隔も増加する。

【0027】

前記インテグリンリガンドペプチドはチオール化されたインテグリンリガンドペプチドで、インテグリンリガンドペプチドのチオール基と螺旋形のナノらせんのポリエチレングリコールリンカーによって結合されることができる。前記ポリエチレングリコールリンカーはマレイミド－ポリエチレングリコール－ＮＨＳエステル（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）であってもよい。前記のようなリンカーを含んでナノらせんとインテグリンリガンドペプチドとの間の結合力を高めて耐久性を向上させることができる。

【0028】

前記ナノらせんはカルボン酸塩が置換された構造であってもよい。前記カルボン酸塩置換基はアミノ酸誘導体、具体的にはアミノカプロン酸であってもよい。前記のように、ナノらせんがカルボン酸塩が置換された構造を有することにより、基板及びインテグリンリガンドペプチドとの結合力を高めることができる。

【0029】

前記基板は表面がアミン化された基板で、アミノシラン溶液に担持されて表面が活性化された基板であってもよく、前記基板の表面にあるアミノ基とナノらせんのカルボキシル基がＥＤＣ／ＮＨＳ反応を通じて結合された構造であってもよい。

【0030】

また、前記基板はナノらせんが結合されない基板の表面が非活性化されたものであってもよい。

【0031】

また、本発明は一つ以上の金属元素を含む溶液を電着してナノらせんを用意するステップと、前記ナノらせんと第１懸濁液とを混合してナノらせんにカルボン酸塩置換基を置換するステップと、カルボン酸塩基が置換されたナノらせんを含む溶液に表面が活性化された基板を担持してナノらせんが結合された基板を製造するステップと、ナノらせんが結合された基板をポリエチレングリコールリンカーを含む溶液に担持してナノらせんの末端にリンカーを結合するステップと、インテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２懸濁液と活性化されたナノらせんが結合された基板を混合してナノらせんにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップと、を含むマクロファージの付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体の製造方法を提供する。

【0032】

前記ナノらせんを用意するステップで金属元素を含む溶液はコバルト（Ｃｏ）、鉄（Ｆｅ）及びニッケル（Ｎｉ）の中の一つまたは二つ以上の金属元素を含むことができる。

【0033】

前記ナノらせんを用意するステップは、ナノ気孔を有し、一面に作用電極を有するナノテンプレート（ｎａｎｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を用意するステップと、アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ；Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_６）、オキシ硫酸バナジウム（ＩＶ）（ＶＯＳＯ_４・ｘＨ_２Ｏ）及び蒸着しようとする金属を含む金属前駆体溶液を含む第１金属前駆体混合液を用意するステップと、前記第１金属前駆体混合液に硝酸（Ｎｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ；ＨＮＯ_３）を混合して第２金属前駆体混合液を用意するステップと、前記第２金属前駆体混合液に前記ナノテンプレートを浸漬し、前記第２金属前駆体混合液に挿入された対電極（ｃｏｕｎｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）と前記作用電極との間に電流を印加して電気メッキ方式で前記ナノ気孔に金属ナノらせんを蒸着させるステップと、前記金属ナノらせんが蒸着されたナノテンプレートで前記作用電極及び前記ナノテンプレートを選択的に除去するステップと、を含む。

【0034】

前記ナノテンプレートとしては陽極酸化アルミニウム（Ａｎｏｄｉｃ Ａｌｕｍｉｎｕｍ Ｏｘｉｄｅ、ＡＡＯ）ナノテンプレート、無機材料（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ）ナノテンプレートまたは高分子ナノテンプレートを用いる。ここでは、陽極酸化アルミニウムナノテンプレートを用いる場合を図示する。陽極酸化アルミニウムをナノテンプレートポア（Ｐｏｒｅ）の直径によってナノワイヤーの大きさが決まり、ナノワイヤーの形成時間及び速度によってナノワイヤーの長さが決まる。

【0035】

前記ナノ気孔の平均直径は５ｎｍ ～５００ｎｍ、５０ｎｍ～２００ｎｍまたは１００ｎｍ～２００ｎｍであってもよい。

【0036】

前記金属前駆体溶液は硫酸コバルト（ＩＩ）七水和物（ＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）及び硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）の中で少なくとも一つを含むことができる。

【0037】

硫酸コバルト（ＩＩ）七水和物（ＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）の濃度は３０ｍＭ～１００ｍＭで、オキシ硫酸バナジウム（ＩＶ）（ＶＯＳＯ_４・ｘＨ_２Ｏ）の濃度は３０ｍＭ～１００ｍＭで、鉄硫酸鉄（ＩＩ）七水和物（ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）の濃度は３０ｍＭ～１００ｍＭで、アスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ；Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_６）の濃度は２０ｍＭ～５０ｍＭであってもよい。

【0038】

前記第２金属前駆体混合液のｐＨは１．５～２．５であってもよい。

【0039】

前記ナノテンプレートを前記第２金属前駆体混合液に浸漬し、前記第２金属前駆体混合液を収納するメッキ槽（ｐｌａｔｉｎｇ ｂａｔｈ）を減圧するステップをさらに含むことができる。前記メッキ槽の圧力は１００Ｔｏｒｒ～７００Ｔｏｒｒであってもよい。

【0040】

電気メッキ時に前記作用電極に流れる電流密度は０．１～３００ｍＡ／ｃｍ^２で、電気メッキ時間は１分～４８時間であってもよい。

【0041】

電子ビーム蒸着法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｂｅａｍ Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）で陽極酸化アルミニウムナノテンプレートの底面に厚さ２５０ｎｍの銀（Ａｇ）電極層を形成する。この電極層は電着時に陰極の役割を果たす。ここで、電極層として他の金属または他の伝導性物質層を用いることができる。

【0042】

前記カルボン酸塩置換基を置換するステップは、前記ナノらせんと第１懸濁液を混合して８～２０時間または１０～１５時間反応させて実施することができる。前記第１懸濁液はカルボン酸塩置換基を含むアミノ酸誘導体を含むことができ、具体的には、前記アミノ酸誘導体はアミノカプロン酸であってもよい。前記のような第１懸濁液と反応させて前記アミノ酸誘導体がナノらせんの表面に結合することができる。

【0043】

前記ナノらせんが結合された基板を製造するステップは、カルボン酸塩が置換されたナノらせんを含む溶液に表面が活性化された基板を担持して実施することができる。

【0044】

前記表面が活性化された基板は塩酸及び硫酸の中の何れか一つ以上を含む酸性溶液に３０分～２時間または３０分～１時間浸漬させて製造することができる。これを通じて、前記基板の表面に水酸化基を結合させてアミノ基との結合を容易にして基板の表面活性化を効果的に行うことができる。

【0045】

前記ナノらせんが結合された基板を製造するステップは、前記表面が活性化された基板を暗条件下でアミノ－シラン溶液に基板を担持して基板の表面をアミン化させることができる。前記アミノ－シラン溶液は（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を含むことができる。この時、基板の表面をアミン化させるとは基板の上にアミン基を結合させたという意味である。前記のように、アミノ－シラン溶液に浸漬して基板の表面をアミン化させることにより前記ナノらせんとＥＤＣ／ＮＨＳ反応を通じて結合することができる。

【0046】

前記ナノらせんの末端にリンカーを結合するステップは、ナノらせんが結合された基板をポリエチレングリコールリンカーを含む溶液に担持して実施することができる。前記ポリエチレングリコールリンカーはマレイミド－ポリエチレングリコール－ＮＨＳエステル（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）であってもよい。前記のようなリンカーを含んでナノらせんとインテグリンリガンドペプチドとの間の結合力を高めて耐久性を向上させることができる。

【0047】

前記ナノらせんにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップは、インテグリンリガンドペプチド（ＲＧＤ）を含む第２懸濁液と活性化されたナノらせんが結合された基板を混合して実施することができる。前記第２懸濁液はチオール化されたインテグリンリガンドペプチドを含むことができる。

【0048】

前記ナノらせんにインテグリンリガンドペプチドを結合するステップ以後にポリエチレングリコール誘導体を含む溶液にナノらせんが結合された基板を担持してナノらせんが結合されない基板の表面を非活性化させるステップをさらに含むことができる。前記ポリエチレングリコール誘導体はメトキシ－ポリ（エチレングリコール）－スクシンイミジルカルボキシメチルエステルであってもよい。

【0049】

また、本発明は前述したマクロファージの細胞付着及び分極化調節用ナノらせん－基板複合体に処理した後、２０ｍＴ～７Ｔの磁場を印加してマクロファージの細胞付着及び分極化を調節するステップを含み、前記ナノらせんは磁場の印加有無によって可逆的に長さが変化し、下記式１を充足することを特徴とするマクロファージの付着及び分極化調節方法を提供する：
［式１］
｜Ｌ_１－Ｌ_０｜＞１０ｎｍ
式１で、Ｌ_１は磁場を印加する時のナノコイルの長さであり、
Ｌ_０は磁場が印加されないナノらせんの長さである。

【0050】

前記マクロファージの細胞付着及び分極化を調節するステップは、ナノらせん－基板複合体に磁場の印加有無によって可逆的にナノらせんの長さを変化させて生体内及び生体外のマクロファージの付着及び分極化を調節することができる。

【0051】

具体的には、マクロファージの付着及び分極化を調節するステップは、ナノらせん－基板複合体に磁場を印加しない場合ナノらせんが収縮し、ナノらせんのピッチの間隔が減小して炎症性（Ｍ１）表現型を促進することができる。

【0052】

また、マクロファージの付着及び分極化を調節するステップは、ナノらせん－基板複合体に磁場を印加する場合ナノらせんが伸長し、ナノらせんのピッチの間隔が増加して再生性及び抗炎症性（Ｍ２）表現型を促進することができる。

【0053】

例えば、ナノらせん－基板複合体に磁場を印加してから磁場を除去する場合、ナノらせんの長さが伸長及び収縮が可逆的に発生する。

【0054】

これを通じて、本発明によるナノらせん－基板複合体を利用したマクロファージの細胞付着及び分極化調節は時間的及び可逆的に調節することができる。

【0055】

具体的には、前記式１で磁場の印加有無によるナノらせんの長さ変化は１０ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、１０ｎｍ～５００ｎｍまたは１０ｎｍ～１００ｎｍであってもよい。

【0056】

本発明のナノらせん－基板複合体でナノらせんの長さ変化が前記式１を充足しない場合、前記ナノらせんの長さ変化が少なくて細胞付着能の差を見せなくて問題になる。

【0057】

以下、本発明の実施例を記載する。しかし、以下の実施例は本発明の好ましい一実施例に過ぎず、本発明の権利範囲が以下の実施例によって限定されるのではない。

【0058】

［製造例］
製造例
ナノらせんの製造
気孔直径が２００ｎｍの陽極酸化アルミニウム（ＡＡＯ）の多孔性テンプレートを用いて電着して製造した。まず、陽極酸化アルミニウム多孔性テンプレートの片面に電子ビーム蒸発器を用いて銀（Ａｇ）を蒸着した。金属イオン前駆体溶液で硫酸コバルト七水和物（ＣｏＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０８Ｍ）と硫酸鉄七水和物（ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０８Ｍ）を脱イオン水に混合して用意した。ＣｏＦｅナノらせんを生産するためにオキシ硫酸バナジウム（ＩＶ）（ＶＯＳＯ_４・ｘＨ_２Ｏ）とＬ－アスコルビン酸（０．０６Ｍ）を前記金属イオン前駆体溶液に添加した。その後、硝酸を前駆体溶液に添加してｐＨ２．５に調整した後、陽極酸化アルミニウムテンプレートの気孔に注入し、２０ｍＡ／ｃｍ^２の所定の電流密度を１分間印加してＣｏＦｅナノらせんを蒸着した。ＣｏＦｅナノらせんが蒸着されたナノテンプレートを１ＭのＮａＯＨで４５℃で３０分間反応させてナノテンプレートを除去した後脱イオン水で洗浄してＣｏＦｅナノらせんを製造した。洗浄されたＣｏＦｅナノらせんは基板に結合する前に１ｍＬの脱イオン水に懸濁した。

【0059】

比較制造例
陰性荷電されたチオール化されたＲＧＤペプチド（ＣＤＤＲＧＤ、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ）を添加しないことを除いて製造例１と同じ方法でナノらせんを製造した。

【0060】

［実施例］
実施例
ナノらせん－基板複合体製造
アミノカプロン酸（ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）は製造例で製造したナノらせんの天然酸化物層と反応するものと知られたアミングループに基づいて磁気ＣｏＦｅナノらせんの表面にカップリングするのに使われた。１ｍＬのナノらせんと１ｍＬの６ｍＭアミノカプロン酸溶液の混合溶液を室温で１２時間撹拌した後、遠心分離して脱イオン水で洗浄した。２２ｍｍ×２２ｍｍの平面の細胞培養グレード硝子基板をアミン化させてナノらせんの表面にカルボキシレート基が基板上のアミン基に結合されるようにする。まず、基板を塩酸及びメタノールを１：１で混合した混合物で３０分間洗浄し、脱イオン水で洗浄した。洗浄された基板を硫酸で１時間活性化させて脱イオン水で洗浄した。基板を暗室で３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）及びエタノール（１：１）で１時間アミン化してエタノールで洗浄した後、１００℃で１時間乾燥した。１ｍＬの脱イオン水でアミノカプロン酸が結合されたナノらせんを０．５ｍＬの２０ｍＭのＮ－エチル－Ｎ`－（３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（ＥＤＣ）及び０．５ｍＬの２０ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）を含む脱イオン水１ｍＬで３時間ＥＤＣ／ＮＨＳ反応を通じて活性化させ、その後、脱イオン水で洗浄した。

【0061】

アミン化された基板を活性化されたナノらせんに１時間漬けた後脱イオン水で洗浄した。インテグリンリガンドはまず０．０４ｍＭのマレイミド－ポリ（エチレングリコール）－ＮＨＳエステルリンカーと２μlのＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２μＬ）を含む１ｍＬの脱イオン水で暗条件下で１６時間振りながら培養してアミド結合を形成して基板の表面にグラフトされた後脱イオン水で洗浄した。チオール－エン反応を媒介するために前記基板をチオール化されたＲＧＤペプチドリガンド（ＧＣＧＹＣＦＣＤＳＰＧ、ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ、０．０４Ｍ）、２μＬのＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）及び１０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）を含む脱イオン水１ｍＬで暗条件下で２時間培養した後脱イオン水で洗浄した。細胞の培養前に非－ＲＧＤリガンド特異的マクロファージ付着を最小化するために、ナノらせんが結合されない領域を暗所で２μＬのＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）及び１００μΜメトキシ－ポリ（エチレングリコール）－スクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ｍｅｔｈｏｘｙ－ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）を含む脱イオン水１ｍＬで２時間反応させた後洗浄して基板の非－ナノらせんーコーティングされた領域を遮断した。

【0062】

比較例１
前記比較制造例１で製造したナノらせんを用いたことを除いて同じ方法でナノらせん－基板複合体を製造した。

【0063】

［実験例］
実験例１
本発明によるナノらせんの形態と化学的特性を確認するために、製造されたナノらせんを対象に走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＥＭ）、高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）、高分解能透過型電子顕微鏡（ＨＲ－ＴＥＭ）及び高分解能走査透過電子顕微鏡（ＨＲ－ＳＴＥＭ）で撮影し、エネルギー分散型Ｘ線分光法（Ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｘ－ｒａｙ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＥＤＳ）、電子エネルギー損失分光法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｅｎｅｒｇｙ ｌｏｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＥＥＬＳ）、振動試料型磁力計測定（Ｖｉｂｒａｔｉｎｇ－ｓａｍｐｌｅ ｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｒｙ、ＶＳＭ）及びＸ線回折分析（Ｘ－ｒａｙ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ、ＸＲＤ）を利用して分析し、その結果は図２及び図７に示した。

【0064】

図２は本発明によるナノらせんの走査電子顕微鏡イメージである。具体的には、（ａ）は電着テンプレートの気孔直径を調節して製造したＣｏＦｅナノらせんの走査電子顕微鏡イメージであり、（ｂ）はコバルトナノらせんとＣｏＦｅナノらせんの走査電子顕微鏡イメージであり、（ｃ）は電着時間によるＣｏＦｅナノらせんの長さを測定した走査電子顕微鏡イメージであり、この時、スケールバーは（ａ）５００ｎｍ、（ｂ）２００ｎｍ、及び（ｃ）１μｍである。

【0065】

図２によれば、本発明によるナノらせんは電着テンプレートの気孔直径によってＣｏＦｅナノらせんの直径を調節することができ、金属イオン前駆体を調節することによってナノらせんの構成元素を調節することができ、電着時間によってＣｏＦｅナノらせんの長さを調節することができることが分かる。

【0066】

図３は本発明によるナノらせんの高角度環状暗視野走査透過型電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）イメージエネルギー分散型Ｘ線分光法マッピング（ＥＤＳ ｍａｐｐｉｎｇ）及び高分解能走査透過電子顕微鏡（ＨＲ－ＳＴＥＭ）イメージを示した。

【0067】

図４は本発明によるナノらせんの（ａ）エネルギー分散型X線分光法（ＥＤＳ）及び（ｂ）電子エネルギー損失分光法（ＥＥＬＳ）で分析した結果グラフである。

【0068】

図３及び図４によれば、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭイメージでナノらせんはコバルト（Ｃｏ）及び鉄（Ｆｅ）からなり、それぞれ約５０原子％の分布で均一に分布されたことを確認することができる。

【0069】

図５は本発明によるナノらせんの振動試料型磁力計測定結果グラフである。具体的には、コバルト及び鉄によるナノらせんの磁気特性を確認し、これを通じてナノらせんのナノ伸長（「ＯＮ」）及びナノ収縮（「ＯＦＦ」）の可逆的な二重モード（ｂｉｍｏｄａｌ）転換が可能であることが分かる。

【0070】

図６は本発明によるナノらせんのＸ線回折分析グラフであり、図７は本発明によるナノらせんの高分解能透過電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）イメージである。

【0071】

図６及び図７によれば、ナノらせんは体心立方構造の（１１０）結晶面を有することが分かり、平均格子間隔は約２．０２±０．０２Åであることが分かる。また、等方性インテグリンリガンドと結合を促進するためにナノらせんを成すナノワイヤの直径はインテグリン分子大きさの約１０ｎｍとほぼ類似することが分かる。

【0072】

実験例２
本発明によるナノらせん－基板複合体の特性を確認するために、ナノらせん－基板複合体を対象に電界放出走査電子顕微鏡で撮影し、フーリエ変換赤外線分光分析（Ｆｏｕｒｉｅｒ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＦＴ－ＩＲ）を実施し、原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＡＦＭ）で撮影し、その結果は図８～図１１に示した。

【0073】

フーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ）はナノらせんの化学的結合特性を確認するために、ＦＴＩＲはＧＸ１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＵＳＡ）を用いて行った。化学的結合特性の変化に対する分析を経たサンプルを分析する前に凍結乾燥させてＫＢｒペレットに稠密にパッキングした。

【0074】

図８は本発明によるナノらせん－基板複合体を製造するステップを図式化したイメージである。図８によれば、ナノらせんにアミノカプロン酸を結合させた。その後、ＥＤＣ／ＮＨＳ反応を利用してＥＤＣ及びＮＨＳが含まれた水にアミノカプロン酸が結合されたナノらせんを入れて活性化させた後、表面がアミン化された基板と結合させた。基板が結合されないナノらせんに結合されたアミノカプリン酸にポリエチレングリコールを結合させた後チオール化されたインテグリンリガンド（ＲＧＤ）と反応させてインテグリンリガンドをナノらせんに結合させた。

【0075】

図９は本発明によるナノらせん－基板複合体のフーリエ変換赤外線分光（ＦＴ－ＩＲ）分析した結果である。図９によれば、アミノカプロン酸がコーティングされたナノらせんの化学的結合特性を分かることができる。具体的には、１５６０ー１５６５Ｃｍ^－１及び１３８７ー１３８９Ｃｍ^－１でＣＯＯ^－結合を確認した。これを通じて、ナノらせんにアミノカプロン酸が成功的に結合されたことが分かる。

【0076】

また、非リガンド特異的（ ｎｏｎ－ｌｉｇａｎｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）マクロファージの接着を最小化するために、ナノリガンドが結合されない基板はメトキシ－ＰＥＧ－ＮＨＳエステルグループと結合して非活性化させ、図３によれば、ナノらせんの均一な分布は走査電子顕微鏡を通じて確認することができ、密度は約６２８０２±２３８５ナノらせん／ｍｍ^２であることが分かる。

【0077】

図１０は本発明によるナノらせんの伸長（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ、「ＯＮ」）及び収縮（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ、「ＯＦＦ」）による弾性運動の磁気二重モードスイッチング（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｉｍｏｄａｌ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を確認するために原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で撮影した結果である。図１１は本発明によるナノらせんに磁場を印加しない場合を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で撮影した結果である。

【0078】

図１０及び図１１によれば、本発明によるナノらせん－基板複合体は、磁場を印加すればナノらせんの伸長が発生してナノらせんの長さが長くなり、また磁場を印加しない場合、ナノらせんの収縮が発生してナノらせんの長さが元の状態に戻ることが分かる。しかし、ナノらせんの長さだけ長くなってから再び短くなるだけでナノらせんの外径やナノらせんを成すナノワイヤの直径は大きい差がないことを確認することができる。

【0079】

具体的には、磁場を印加する前のナノらせんの長さは１０６０±９ｎｍであり、磁場を印加する時のナノらせんの長さは１２４３±２５ｎｍであり、また、磁場を印加しない場合、ナノらせんの長さは１０５２±９ｎｍに減小することを確認することができる。この時、ナノらせんの外径は１７４ｎｍ～１８１ｎｍに保持され、、ナノらせんを成すナノワイヤの直径は８３～８６ｎｍに保持されて循環スイッチング
（ＯＦＦ→ＯＮ→ＯＦＦ）される間に大きな差がないことを確認することができる。

【0080】

これを通じて、本発明のナノらせん－基板複合体は二重モードスイッチングする間に巨視的なリガンド密度が一定に保持されることを分かることができる。

【0081】

実験例３
本発明によるナノらせん－基板複合体に磁場を印加することによってマクロファージの付着に及ぶ影響を確認するために以下のような実験を行い、その結果は図１２～図１５に示した。

【0082】

ナノらせんの二重モードスイッチング下でマクロファージの付着性及び表現型分極化を調節する効果を評価した。培養前に基板を紫外線下で２時間滅菌させた。ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ）の継代５（ｐａｓｓａｇｅ ５）からマクロファージを約９×１０^４Ｃｅｌｌ／ｃｍ^２の密度に滅菌された基板に播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、マクロファージを高いグルコースＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭ）、１０％熱－不活性化されたウシ胎児血清及び５０ＩＵ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを含む基礎培地で５％ＣＯ_２下３７℃で培養した。マクロファージの二重モードスイッチングで制御された付着力は「ＯＮ」状態（基板辺縁付近に２７０ｍＴ永久磁石配置、リガンド含有ナノらせんが基板辺縁側へ伸長）または「ＯＦＦ」状態（磁石を取り除いて元のナノらせん構造に収縮する）の間の周期的転換を通じて評価した。マクロファージ付着を評価するための対照実験は二重モードスイッチング下で行ったが、ナノらせんまたはインテグリンリガンドのない状態で行った。

【0083】

マクロファージの表現型分極の評価に用いられるＭ１培地はそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）及び組換インターフェロン-γ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、ＩＦＮ－γ）を有する基礎培地を用いて製造した。インターロイキン－４（ＩＬ－４）及びインターロイキン－１３（ＩＬ－１３）それぞれ２０ｎｇ／ｍＬを有する基礎培地を用いてＭ２培地を製造した。マクロファージの付着－補助Ｍ２表現型分極はＲＯＣＫ（５０μＭ Ｙ２７６３）、ミオシンII（１０μＭ ブレビスタチン）またはアクチン重合（２μｇ／ｍＬのサイトカラシンＤ）抑制剤で評価した。

【0084】

図１２は本発明によるナノらせん－基板複合体を利用して培養されたマクロファージ（２４時間後）のＦ－アクチン、核及びビンキュリンに対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）で、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した細胞密度、細胞面積、細胞伸長因子を示したグラフ（ｂ）で、スケールバーは２０μｍを表す。

【0085】

図１２によれば、共焦点免疫蛍光イメージはマクロファージが二重モードスイッチングで磁場を印加する「ＯＮ」モードで磁場を印加しない「ＯＦＦ」と比べてかなり高い細胞付着密度とビンキュリン及びＦ－アクチン拡散領域を有するので、磁場の印加時にマクロファージの付着を促進したことを示した。

【0086】

これを通じて、巨視的なストレッチング媒介マクロファージ付着はマクロファージの接着を促進するためにナノ規模ストレッチングを発揮することができることを確認した。

【0087】

図１３は本発明によるナノらせん－基板複合体を利用して培養されたマクロファージ（２４時間後）の生きている細胞と死んだ細胞に対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）で、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した細胞生存能力を示したグラフ（ｂ）で、スケールバーは５０μｍを表す。

【0088】

図１３によれば、磁場を印加する二重モードスイッチングにも細胞の生存能力が９５％と優れており、マクロファージに対して細胞適合性が優れていることが分かる。

【0089】

図１４は本発明の比較例によるナノらせんのない基板（Ｎｏ ｎａｎｏｈｅｌｉｘ）またはインテグリンリガンド（ＲＧＤ）が結合しないナノらせん－基板複合体で二重モードスイッチング（ｂｉｍｏｄａｌ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）に対するマクロファージの付着性実験で、培養されたマクロファージ（２４時間後）のＦ－アクチン、核及びビンキュリンに対する共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）であり、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した細胞密度、細胞面積、細胞伸長因子を示したグラフ（ｂ）であり、この時、スケールバーは２０μｍを表す。

【0090】

図１４によれば、比較例はナノらせんがないかインテグリンリガンド（ＲＧＤ）が結合されない基板を用いた状態で二重モードスイッチング「ＯＮ」及び「ＯＦＦ」で有意味な差がないので、マクロファージの付着を促進しないことを確認することができる。

【0091】

これを通じて、本発明のナノらせん－基板複合体の場合、インテグリンリガンドがナノらせんに結合されてこそ二重モードスイッチングが効果を表すことが分かる。

【0092】

図１５は本発明によるナノらせん－基板複合体を利用して１２時間の間隔で磁場印加を調節して３６時間培養されたマクロファージのＦ－アクチン、核及びビンキュリンに対する共焦点免疫蛍光イメージであり、この時、スケールバーは２０μｍを表す。

【0093】

図１５によれば、磁場を印加しない場合には細胞付着に変化がなく、磁場を印加する場合には細胞付着が促進され、再び磁場を印加しない場合には可逆的に細胞付着が減少することが分かる。

【0094】

これを通じて、本発明のナノらせん－基板複合体はナノらせんの伸長及び収縮を時間的及び可逆的方式でマクロファージの付着を促進して抑制することが分かる。

【0095】

実験例４
本発明によるナノらせん－基板複合体を利用してマクロファージの表現型分極媒介付着を制御するかに対する実験を以下のように行い、その結果は図１６～２２に示した。

【0096】

マクロファージの付着構造はＭ１またはＭ２分極刺激剤の存在下でこれらの表現型分極を調節することと知られている。特に、長い形態の一般的なＦ－アクチン及びビンキュリンのアセンブリーを含んで強力な付着構造を表すマクロファージはこれらの表現型分極を再生性／抗炎症性Ｍ２状態に活性化させる傾向がある。反対に、低いＦ－アクチン及び丸い形態を表すマクロファージはＭ１状態を活性化させる傾向がある。

【0097】

図１６は本発明によるナノらせん－基板複合体を利用して磁場印加によってマクロファージの付着－依存的表現型分極が調節されるかに対する実験結果を示した。

【0098】

図１６によれば、共焦点免疫蛍光イメージはマクロファージが漸進的にＭ１－誘導培地で磁場を印加するほど弱いＣＤ６８蛍光信号を表したが、Ｍ２－誘導培地では磁場を印加するほどより強いＡｒｇ－１蛍光信号を表した。また、遺伝子発現プロファイルは免疫蛍光で観察された傾向を確認することができる。マクロファージはＭ１－誘導培地で磁場を印加するほどよほど低いｉＮＯＳ及びＴＮＦ－α発現を見せたが、Ｍ２－誘導培地で磁場を印加するほど高いＡｒｇ－１及びＹｍ１発現を見せた。

【0099】

これを通じて、マクロファージ付着を調節するナノらせんの磁場印加による二重モードスイッチングがマクロファージの付着性に依存する分極を調節することができることが分かる。

【0100】

図１７は本発明のナノらせん－基板複合体を利用して分極表現型とマッチングされた刺激培地がない時（即ち、Ｍ２－刺激培地でＭ１発現またはＭ１－刺激培地でＭ２発現）の磁場印加の調節に対する実験結果である。

【0101】

図１７によれば、分極表現型とマッチングされた刺激培地の不在下で（即ち、Ｍ２－刺激培地でＭ１発現またはＭ１－刺激培地でＭ２発現）磁場の印加有無を調節することはｉＮＯＳ、ＴＮＦ－α、Ａｒｇ－１及びＹｍ１発現で有意味な差を表していないことを発見した。

【0102】

これを通じて、Ｍ１及びＭ２刺激がそれぞれ適切な刺激なしにＭ１またはＭ２発現の変化に影響を及ぼさないことを分かることができる。

【0103】

図１８は磁場を３６時間印加した伸長（「ＯＮ」）及び磁場を印加しない収縮（「ＯＦＦ」）の二重モードスイッチング下でＭ１またはＭ２培地でマクロファージを培養した後、ＲＯＣＫ２及び核の共焦点免疫蛍光イメージ（ａ）及び共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算したＲＯＣＫ２免疫蛍光強度を表したグラフであり、スケールバーは２０μｍを表す。

【0104】

図１８によれば、磁場を印加することがＭ２培地の培養下で磁場を印加しないことに比べてＲＯＣＫ２発現を増加させることを確認することができる。これを通じて、磁場を印加した伸長（「ＯＮ」）条件によってマクロファージの付着依存性Ｍ２分極化を媒介することが分かる。

【0105】

図１９の（ａ）はＲＯＣＫ（Ｙ２７６３２）、ミオシンII（ブレビスタチン）またはアクチン重合（サイトカラシンＤ）に対する抑制剤の存在及び不在のＭ１分極培地で３６時間培養した後ＣＤ６８、Ｆ－アクチン及び核に対する共焦点免疫蛍光イメージと共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した細胞面積、細胞伸長因子及びＣＤ６８蛍光強度を表したグラフであり、図１９の（ｂ）はＲＯＣＫ（Ｙ２７６３２）、ミオシンII（ブレビスタチン）またはアクチン重合（サイトカラシンＤ）に対する抑制剤の存在及び不在のＭ２分極培地で培養した後Ａｒｇ－１及びＦ－アクチン及び核に対する共焦点免疫蛍光イメージで、共焦点免疫蛍光実験結果に基づいて計算した細胞面積、細胞伸長因子及びＡｒｇ－１蛍光強度を表したグラフであり、スケールバーは２０μｍを表す。

【0106】

図１９によれば、ＲＯＣＫ、ミオシンIIまたはアクチン重合を抑制する薬理学的阻害剤（それぞれＹ２７６３２、ブレビスタチンまたはサイトカラシンＤ）を用いてＭ１培地の培養下で二重モードスイッチング「ＯＮ」下でマクロファージのＭ１分極化抑制が持続的に妨害されたことを確認することができる。また、Ｍ２培地の培養下では前記阻害剤を処理する時強力な付着（より高い細胞面積及び伸長因子）とＭ２分極の発現（Ａｒｇ－１発現）の刺激が妨害されたことを確認することができる。

【0107】

これを通じて、ＲＯＣＫ、ミオシンII及びＦ－アクチンがインテグリンリガンド含有ナノらせんの磁気二重モードスイッチング（磁場の印加有無）とともにＭ１対Ｍ２分極の調節で分子スィッチで作動することが分かる。

【0108】

実験例５
本発明によるナノらせん提示基板を利用して磁場印加によるナノらせんの伸長及び収縮に対して生体内宿主マクロファージの付着及び表現型を空間的に調節することを確認するために以下のような実験を行い、その結果は図２０～図２２に示した。

【0109】

図２０は本発明によるナノらせん－基板複合体を利用した生体内宿主マクロファージの付着及び表現型調節に対する実験結果である：（ａ）は生体内のナノらせん－基板複合体に磁場印加を示した概略的な模式図で、イントルキン－４及びイントルキンー１３（Ｍ２誘導剤）を全部生体内に皮下移植された基板上に注射した。（ｂ）はナノらせんの伸長（「ＯＮ」）及び収縮（「ＯＦＦ」）の二重モードスイッチング下で２４時間後に基板に付着されたｉＮＯＳ、Ｆ－アクチン及び宿主マクロファージの核に対する共焦点免疫蛍光イメージ及びこれを定量化したグラフであり、スケールバーは２０μｍを表す。（ｃ）はナノらせんの伸長（「ＯＮ」）及び収縮（「ＯＦＦ」）の二重モードスイッチング下で２４時間後に基板に付着されたＭ１表現型マーカー（ｉＮＯＳ及びＴＮＦ－α）の生体内付着性宿主細胞の定量分析結果グラフである。

【0110】

図２１の（ａ）はナノらせんの伸長（「ＯＮ」）及び収縮（「ＯＦＦ」）の二重モードスイッチング下で２４時間後に基板に付着されたＡｒｇ－１、Ｆ－アクチン及び宿主マクロファージの核に対する共焦点免疫蛍光イメージであり、スケールバーは２０μｍを表す。（ｂ）はナノらせんの伸長（「ＯＮ」）及び収縮（「ＯＦＦ」）の二重モードスイッチング下で２４時間後に基板に付着されたＭ２表現型マーカー（Ａｒｇ－１及びＹｍ１）の生体内付着性宿主細胞の定量分析結果グラフである。

【0111】

図２２は本発明によるナノらせん－基板複合体を利用して基板に対する宿主好中球の生体内付着実験結果である。（ａ）は２４時間後に基板に付着されたＮＩＭＰ－Ｒ１４、Ｆ－アクチン及び宿主細胞の核に対する共焦点免疫蛍光イメージであり、スケールバーは２０μｍである。（ｂ）は生体内付着性ＮＩＭＰ－Ｒ１４－陽性宿主好中球の定量データでイントルキン－４及びイントルキン－１３が全部ナノらせんが結合された皮下移植された基板上に注入された。

【0112】

図２０～図２２によれば、二重モードスイッチングで磁場を印加する伸長（「ＯＮ」）は磁場を印加しない収縮（「ＯＦＦ」）に比べてかなり高い付着性細胞密度、Ｆ－アクチン拡散領域、より明らかな伸長、低いｉＮＯＳ及びＴＮＦ－α発現で宿主マクロファージのＭ１分極を抑制する時間調節付着を促進することを確認することができる。また、二重モードスイッチングで磁場を印加する伸長（「ＯＮ」）は堅固な付着構造と磁場を印加しない収縮（「ＯＦＦ」）に比べて付着性ＮＩＭＰ－Ｒ１４陽性好中球に関連するよほど高いＡｒｇ－１及びＹｍ１発現を有する宿主マクロファージの付着媒介Ｍ２分極を一時的に刺激することを確認することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】