特開 2022-65545 免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤及び感染症を予防又は改善するための剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022065545

(43)【公開日】2022-04-27

(54)【発明の名称】免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤及び感染症を予防又は改善するための剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/702 20060101AFI20220420BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20220420BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20220420BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220420BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220420BHJP

   C12N 15/01 20060101ALI20220420BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20220420BHJP

【ＦＩ】

A61K31/702

A61P37/08

A61P31/00

A61P37/02

A61P43/00 111

C12N15/01 Z ZNA

C07K16/00

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020174193

(22)【出願日】2020-10-15

(71)【出願人】

【識別番号】000226415

【氏名又は名称】物産フードサイエンス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100110766

【弁理士】

【氏名又は名称】佐川 慎悟

(74)【代理人】

【識別番号】100165515

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 清子

(74)【代理人】

【識別番号】100169340

【弁理士】

【氏名又は名称】川野 陽輔

(74)【代理人】

【識別番号】100195682

【弁理士】

【氏名又は名称】江部 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100206623

【弁理士】

【氏名又は名称】大窪 智行

(72)【発明者】

【氏名】門田 吉弘

(72)【発明者】

【氏名】栃尾 巧

(72)【発明者】

【氏名】松田 幹

【テーマコード（参考）】

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA01

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB13

4C086ZB31

4C086ZC41

4H045AA11

4H045AA30

4H045AA50

4H045BA10

4H045DA75

4H045EA29

4H045EA60

4H045FA71

(57)【要約】

【課題】免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤、並びに幅広い病原体による感染症を予防又は改善することのできる剤を提供する。
【解決手段】分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤は、１－ケストースを有効成分とする。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１－ケストースを有効成分とする、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤。

【請求項2】

前記可変領域は、重鎖可変領域である、
ことを特徴とする請求項１に記載の剤。

【請求項3】

前記重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３である、
ことを特徴とする請求項２に記載の剤。

【請求項4】

前記ＩｇＡは、腸管分泌型ＩｇＡである、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の剤。

【請求項5】

アレルギーを予防又は改善するために用いられる、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の剤。

【請求項6】

１－ケストースを有効成分とする、感染症を予防又は改善するための剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤及び感染症を予防又は改善するための剤に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫グロブリンＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ：ＩｇＡ）は、抗体の一種で、ヒトの体内ではＩｇＧに次いで２番目に多い抗体である。特に、眼、鼻、喉、消化管などの外界と接する粘膜組織において、粘膜表面に分泌されるＩｇＡは、分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）と呼ばれる。

【0003】

ｓＩｇＡは、未消化のタンパク質、病原菌、毒素などと結合し、それらの吸収を抑制することが報告されており、アレルギーや感染症の発症との関連性が注目されている。

【0004】

ＩｇＡの機能を介してアレルギーや感染症を予防する物質について報告がなされてきた。

【0005】

特許文献１には、１－ケストースによってＩｇＡの産生を増強することでアレルギーの発症を予防する剤が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００６－３２１７８６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、特許文献１の剤は、アレルギー予防に効果を有するものの、感染症への予防又は改善効果を有しない点で課題を残していた。また、ＩｇＡの産生を増強することでアレルギーの発症を予防するものの、多種多様な抗原によるアレルギーに対して一律に効果を有するか否かについては不明であった。

【0008】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤、並びに幅広い病原体による感染症を予防又は改善することのできる剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤は、
１－ケストースを有効成分とする。

【0010】

例えば、前記可変領域は、重鎖可変領域である。

【0011】

例えば、前記重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３である。

【0012】

例えば、前記ＩｇＡは、腸管分泌型ＩｇＡである。

【0013】

例えば、アレルギーを予防又は改善するために用いられる。

【0014】

本発明の第２の観点に係る感染症を予防又は改善するための剤は、
１－ケストースを有効成分とする。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤、並びに幅広い病原体による感染症を予防又は改善することのできる剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】ＩｇＡの構造を模式的に表す図である。

【図2】１－ケストース摂取によってマウスの盲腸、パイエル板、小腸及び脾臓におけるＩｇＡのＣＤＲ３の多様化が促進されたことを表すグラフ図であり、横軸の「Ｃｏｎ」は対照群、「Ｋｅｓ」はケストース群を表す。

【図3】１－ケストース摂取によってマウスの盲腸におけるＩｇＡのＣＤＲ３の多様化が促進されたことを表すグラフ図であり、（ａ）は対照群、（ｂ）はケストース群のグラフ図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

まず、本発明による免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤について詳細に説明する。

【0018】

本発明のＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤は、１－ケストースを有効成分として含有する。ＩｇＡは、未消化のタンパク質、病原菌、毒素等と結合し、それらの吸収を抑制する作用を有する。したがって、本発明による剤は、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進することで、後述するように幅広い抗原や病原体による疾患、症状等を予防又は改善することができる。

【0019】

免疫グロブリンＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ：ＩｇＡ）は、抗体の一種で、ヒトの体内ではＩｇＧに次いで２番目に多い抗体である。図１に示すように、ＩｇＡは、同じ構造をした２本の重鎖（Ｈ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ鎖）とによって形成されている。Ｈ鎖及びＬ鎖のＮ末端側に存在する、ＶＨ及びＶＬ領域は、ＩｇＡの「可変領域」と呼ばれており、構成するアミノ酸の種類、配列ともに多様性が見られる。この可変領域において超可変領域（相補性決定領域：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ（ＣＤＲ））と呼ばれる３つの小さな領域が存在している。ＣＤＲは５～１０個のアミノ酸によって構成される短い配列であり、特にアミノ酸配列の多様性に富むことが知られている。ＣＤＲを構成するアミノ酸の種類及び配列の違いによって、認識する抗原が変化することから、ＣＤＲは抗原の特異性を決定づけているといえる。

【0020】

本発明による剤は、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進する。本明細書において「ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進する」とは、１－ケストースを摂取した個体由来のＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列と、１－ケストース非摂取又は摂取前の個体由来のＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列と、を比較した場合、後者より前者のほうで同一の配列の割合が減少し、異なる配列（特に、互いに類似度の低い配列）の割合が増大することを意味する。異なる配列の割合の増大の程度は、例えば、可変領域のアミノ酸配列の種類の数、可変領域のアミノ酸配列の同一性又は相同性、ＩｇＡの抗原特異性、抗原結合性の変化等を指標とすることができる。

【0021】

「ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進する」ことの確認方法は、例えば、後述の実施例に記載される方法が挙げられる。具体的には、１－ケストースを摂取した個体の組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを調製する。調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＩｇＡ重鎖可変領域に特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより、ＩｇＡの可変領域であるＶＤＪ遺伝子領域を網羅的に増幅し、次世代シーケンサー（ＮＧＳ：Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて、その塩基配列を決定する。続いて、免疫グロブリン配列解析パイプラインを用いて得られた塩基配列データを解析し、アミノ酸配列及び各配列のリードカウントを計算し、種数を測定する。１－ケストース非摂取又は摂取前の個体由来の当該種数と比較し、１－ケストースを摂取した個体由来の当該種数が多い場合（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）に、またリードカウントが特定の配列に偏っていない場合（ｅｖｅｎｎｅｓｓ）に、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化が促進されたことを確認することができる。

【0022】

本発明において、「ＩｇＡの可変領域」は、重鎖（Ｈ鎖）可変領域又は軽鎖（Ｌ鎖）可変領域のいずれであってもよいが、好ましくは重鎖（Ｈ鎖）可変領域である。また、「ＩｇＡの可変領域」は、重鎖（Ｈ鎖）相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３又は軽鎖（Ｌ鎖）相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３のいずれであってもよいが、好ましくは、抗原結合に最も寄与する重鎖（Ｈ鎖）相補性決定領域（ＣＤＲ）３である。

【0023】

本発明において、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は、眼、鼻、喉、消化管等の外界と接する粘膜組織、脾臓などいずれの組織由来のＩｇＡであってもよいが、好ましくは腸管分泌型ＩｇＡである。腸管を含む消化管等の外界と接する粘膜組織において、粘膜表面に分泌されるＩｇＡは、分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）と呼ばれ、ｓＩｇＡは、未消化のタンパク質、病原菌、毒素などと結合し、それらの吸収を抑制することが報告されている。

【0024】

本発明のＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤は、１－ケストースを有効成分として含有する。１－ケストースは、１分子のグルコースと２分子のフルクトースからなる三糖類のオリゴ糖である。１－ケストースは、スクロースを基質として、特開昭５８－２０１９８０号公報に開示されているような酵素による酵素反応を行うことにより作ることができる。具体的には、まず、β－フルクトフラノシダーゼをスクロース溶液に添加し、３７℃～５０℃で２０時間程度静置することにより酵素反応を行って、酵素反応液を得る。この酵素反応液は１－ケストースを相当量含む糖液であるため、これをそのまま、本発明に係る剤として用いることができる。

【0025】

一方、１－ケストースを精製する場合は、酵素反応液を、特開２０００－２３２８７８号公報で開示されているようなクロマト分離法に供することよって、１－ケストースと他の糖（ブドウ糖、果糖、ショ糖、４糖以上のオリゴ糖）とを分離して精製し、高純度１－ケストース溶液を得る。続いて、この高純度１－ケストース溶液を濃縮した後、特公平６－７００７５号公報に開示されているような結晶化法で結晶化することにより、１－ケストースを結晶として得ることができる。

【0026】

また、１－ケストースは市販のフラクトオリゴ糖に含まれているため、これをそのまま、あるいは、フラクトオリゴ糖から上述の方法により１－ケストースを分離精製して用いてもよい。なお、本発明において、特定のオリゴ糖の「純度」とは、糖の総量を１００％とした場合の、当該オリゴ糖の質量％をいう。

【0027】

本発明の剤の投与剤型は任意であり、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤（サプリメントを含む）、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、注射剤などの非経口用液体製剤等に適宜調製することができる。また、適切なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を用いてもよい。また、医薬品又はサプリメント中に通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、増粘剤、保存剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等を添加することができる。また、本剤の投与方法についても任意であり、ヒト又は非ヒト哺乳動物に対し、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、舌下投与、局所投与等、適宜選択され得る。

【0028】

本発明の剤の投与量及び投与間隔は、投与対象の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができ、例えば、１日に１～３回投与であってもよいが、これに制限されるものではなく、また、食事中投与、食後投与、食前投与、食間投与、就寝前投与等のいずれも可能である。

【0029】

本発明の剤を飲食品又は飼料に用いてもよい。この場合、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、液体状等の状態で用いることができる。また、飲食品中又は飼料中に含有させることが認められている賦形剤、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、ｐＨ調製剤等を適宜含有させることができる。

【0030】

本発明の剤を飲食品に用いる場合、摂取量及び摂取間隔は、摂取対象の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができ、例えば、１日に１～３回摂取であってもよいが、これに制限されるものではない。また、アレルギー予防又は改善、感染症予防又は改善等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品等に応用することができる。

【0031】

本発明の剤を飼料に用いる場合、例えば、哺乳類等の飼料、ペットフード、ペット用サプリメント等に使用することができる。

【0032】

本発明の剤は、アレルギーを予防又は改善するために用いられてもよい。

【0033】

本明細書において、アレルギーの「予防」には、アレルギーの発症を抑制する又は遅延させ、またその再発を抑制することが含まれる。また、アレルギーの「改善」には、アレルギーを完全に治療することの他、症状を緩和し、またその進行を抑制することも含まれる。

【0034】

本発明の剤は、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するため、幅広い抗原（アレルゲン）によるアレルギーを予防又は改善することができる。本明細書において「アレルギー」の疾患としては、特に限定されるものではないが、例えば、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アレルギー性結膜炎、 アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、薬物アレルギー、蕁麻疹等を挙げることができる。

【0035】

次に、本発明による感染症を予防又は改善するための剤について説明する。

【0036】

本発明による感染症を予防又は改善するための剤は、１－ケストースを有効成分として含有する。１－ケストースの詳細については、前述のとおりである。また、「ＩｇＡ」、「ＩｇＡの可変領域」、「ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進する」等についても、前述のとおりである。

【0037】

本明細書において、感染症の「予防」には、感染症の発症を抑制する又は遅延させ、またその再発を抑制することが含まれる。また、感染症の「改善」には、感染症を完全に治療することの他、症状を緩和し、またその進行を抑制することも含まれる。さらに、感染症の「改善又は予防」には、ＩｇＡの抗原結合能が低下することも含まれる。

【0038】

特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明による感染症を予防又は改善するための剤は、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進することで、感染症の予防又は改善効果を奏し得る。本発明の剤は、幅広い病原体による感染症を予防又は改善することができる。ウイルス由来の感染症としては、例えば、インフルエンザ、ウイルス性肺炎、ウイルス性肝炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性結膜炎、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、成人Ｔ細胞白血病、エボラ出血熱、黄熱、風邪症候群、狂犬病、サイトメガロウイルス感染症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）、新型ブニヤウイルス、重症熱性血小板減少症候群、進行性多巣性白質脳症、水痘・帯状疱疹、単純疱疹、手足口病、デング熱、ジカ熱、日本脳炎、伝染性紅斑、伝染性単核球症、天然痘、風疹、急性灰白髄炎（ポリオ）、麻疹、咽頭結膜熱（プール熱）、マールブルグ出血熱、腎症候性出血熱、ラッサ熱、流行性耳下腺炎、ウエストナイル熱、ヘルパンギーナ、チクングニア熱などが挙げられる。細菌由来の感染症としては、例えば、インフルエンザ菌、肺炎球菌、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、結核菌、大腸菌、コレラ菌、サルモネラ菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌などによる感染症が挙げられる。

【0039】

本発明の剤の投与剤型、投与量及び投与間隔の詳細については、前述同様である。また、本発明の剤を飲食品又は飼料に用いてもよく、その詳細についても、前述同様である。

【0040】

以上説明したように、本発明のＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進するための剤は、１－ケストースを有効成分として含有する。ＩｇＡは、未消化のタンパク質、病原菌、毒素等と結合し、それらの吸収を抑制する作用を有するため、本発明による剤は、ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様化を促進することで、幅広い抗原（アレルゲン）によるアレルギーを予防又は改善することができる。

【0041】

また、本発明による感染症を予防又は改善するための剤は、１－ケストースを有効成分として含有する。本発明の剤は、ウイルスや細菌など、幅広い病原体による感染症を予防又は改善することができる。

【実施例0042】

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0043】

以下の実施例では、特段の記載のない限り、百分率（％）は質量％を示す。また、固形分濃度は、試料に含まれる可溶性固形分の含有量を表す。

【0044】

４週齢のＤＢＡ／２雌性マウスを対照群及びケストース群の２群に分け、対照群には、一般的な精製飼料であるＡＩＮ－９３Ｇのタンパク質を大豆タンパク質に置き換えた飼料（コントロール飼料）を与えた。一方で、ケストース群には、コントロール飼料中のコーンスターチを、１－ケストース含量が５％（ｗ／ｗ）となるように１－ケストースへ置き換えた飼料を与えた。飼育開始から１０週間後に解剖を実施し、小腸、盲腸、脾臓及びパイエル板を採取した。

【0045】

採取した組織からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを調製した。調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＩｇＡの可変領域であるＶＤＪ遺伝子領域を網羅的に増幅し、次世代シーケンサー（ＮＧＳ：Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて、その塩基配列を決定した。続いて、免疫グロブリン配列解析パイプラインを用いて得られた塩基配列データを解析し、ＶＤＪ遺伝子の連結部であるＣＤＲ３のアミノ酸配列及び各配列のリードカウントを計算した。

【0046】

上記の各手法について以下詳細に説明する。

【0047】

（１．１－ケストースの製造）
特公昭５９－５３８３４号公報（第２～３頁）及び特開２０１０－２７３５８０号公報（段落［００９６］）に記載の方法に準じて、スクロースを基質としてフラクトシルトランスフェラーゼの酵素反応を行い、１－ケストースを製造した。具体的には、まず、アスペルギルス・ニガーＡＣＥ－２－１株（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ－５８８６）を酵素生産培地（５％スクロース、０．７％麦芽エキス、１％ポリペプトン、０．５％カルボキシメチルセルロース、０．３％ＮａＣｌ）に植菌し、２８℃で３日間培養した後、菌体を超音波で破砕して粗酵素液を調製した。４５％スクロース水溶液（ｐＨ７．５）に、粗酵素液をスクロース１ｇあたり２．５単位の割合で添加して、４０℃にて２４時間反応させて酵素反応液を得た。酵素反応液を１００℃で１０分間加熱して酵素反応を停止させた後、ろ過してろ液を回収した。ろ液を定法により活性炭で脱色し、さらにイオン交換樹脂で脱塩して、これを１－ケストースを含有する糖液（供試試料）とした。

【0048】

（２．次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を使用したアンプリコンディープシーケンスによるＩｇＡ重鎖可変領域のシーケンス分析）
（組織ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出）
小腸及び盲腸は内容物を除去し、脾臓はそのままの状態で、５ｍｍ以下の横断組織片を切り取り、１．５ｍＬチューブに移し、ＲＮＡ抽出試薬であるＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１ｍＬ添加した後、速やかにバイオマッシャーを用いて組織を破砕した。また、小腸組織から、１つのパイエル板を含む５ｍｍ以下の横断組織片を切り取り、「パイエル板を含む小腸組織」として前述同様にＲＮＡを抽出した。ＴＲＩｚｏｌに溶解されたＲＮＡを、公知のクロロホルム処理・タンパク質除去、イソプロパノール沈殿により分離精製し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡとして用いた。

【0049】

抽出した各組織由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡについて、超微量分光光度計であるＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液中のＲＮＡ濃度及び純度（Ａ２６０／Ａ２８０）を測定した（図示せず）。また、１％アガロースゲル電気泳動を行い、１８Ｓ ｒＲＮＡ及び２８Ｓ ｒＲＮＡの存在を確認した（図示せず）。

【0050】

（ＤＮａｓｅ処理による混入しているゲノムＤＮＡの分解・除去）
前述のとおり抽出した各組織由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡ １～４μｇに、１０×ＤＮａｓｅ Ｉ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １．７５μＬ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮａｓｅＩ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｇｒａｄｅ、１Ｕ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １．７５μＬ及びＤＥＰＣ処理水を加えた。ＤＥＰＣ処理水は、溶液の液量が１７．５μＬになるように加えた。この溶液を室温で１５分間静置した後、２５ｍＭ ＥＤＴＡ １．７５μＬを加え、６５℃で１０分間加温した。

【0051】

（逆転写反応：ｏｌｉｇｏ ｄＴ、ｃＤＮＡプールの調製）
前述のとおりＤＮａｓｅ処理した各組織由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡ １１μＬ（ＲＮＡ量が全個体で等しくなるようにＤＥＰＣ処理水で希釈）に、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８ Ｐｒｉｍｅｒ（０．５μｇ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１μＬ添加し、７０℃で１０分間静置した後、氷上で３分間静置した。５×Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ４μＬ、０．１Ｍ ＤＴＴ ２μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ） １μＬを加え混合した。逆転写酵素（ＲＴ）を加えるＲＴ（＋）と加えないＲＴ（－）に分け、ＲＴ（＋）には、逆転写酵素（ＲＴ）Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １μＬ、ＲＴ（－）にはＤＥＰＣ処理水を１μＬ添加した後、４２℃で５０分間静置した。その後、７０℃で１５分間静置し、得られた溶液をｃＤＮＡプールとした。

【0052】

（アンプリコンＰＣＲ：ＩｇＡ可変領域のｃＤＮＡの増幅（アンプリコンの調製））
前述で得られた各組織由来のｃＤＮＡプールを用いて、ＩｇＡ可変領域（ＶＨ領域から定常領域（Ｃα）領域）をＰＣＲにより増幅した。ＩｇＡのＨ鎖の定常領域（Ｃα）とＶ遺伝子領域（ＶＨ）とに相補的なプライマーを用いた（Ｌｉｎｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。プライマーの５’末端側に、次世代シークエンサーＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ用のオーバーハング配列を付加した。
・Ｆｏｒｗａｒｄ（定常領域（Ｃα））
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＧＡＧＴＧＴＣＡＧＴＧ－３’（配列番号１）
（オーバーハング配列：（５’側から）「ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ」）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ（マウスに固有のすべてのＶＨ遺伝子、ＶＨ遺伝子の５’保存領域）
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧ－３’（配列番号２）
（オーバーハング配列：（５’側から）「ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ」）

【0053】

各組織由来のｃＤＮＡの一定量（３μＬ）を鋳型に、ＤＮＡポリメラーゼであるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてマウスＩｇＡ重鎖の可変領域のｃＤＮＡを増幅した。

【0054】

（ＰＣＲ産物の精製（ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ＵＰ １））
前述のとおり増幅した各組織由来のｃＤＮＡについて、磁気ビーズＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いてプライマー及び塩類を除去し、ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ（アンプリコン）の精製を行なった。精製したＤＮＡ溶液を次のインデックスＰＣＲの鋳型として用いた。

【0055】

（インデックスＰＣＲプライマー）
上記オーバーハング配列の５’側に個体・組織識別用のインデックス配列を付加したインデックスＰＣＲプライマーを合成した。
・インデックスＰＣＲプライマー（インデックス１）
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ－３’（配列番号３）
（オーバーハング配列：（５’側から）「ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ」）
・インデックスＰＣＲプライマー（インデックス２）
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ－３’（配列番号４）
（オーバーハング配列：（５’側から）「ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ」）

【0056】

（インデックスＰＣＲ：インデックスタグを付加したアンプリコンの調製）
前述のとおり精製したアンプリコンＰＣＲ産物を鋳型に、ＤＮＡポリメラーゼであるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、以下の反応液組成及び反応条件でインデックスＰＣＲを行った。

【0057】

（ＰＣＲ産物の精製（ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ＵＰ ２））
前述のＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ＵＰ １と同様、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓを用いて、インデックスＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の精製を行った。

【0058】

精製操作は、ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ＵＰ １と同様に行ったが、ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ＵＰ ２では、インデックスＰＣＲ産物５０μＬに対し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｂｅａｄｓを５６μＬ加えた。また、ビーズからのＤＮＡ溶出の際には、ＴＥを２７．５μＬ加え、２５μＬのＤＮＡ溶液を回収した。

【0059】

（次世代シーケンサー（ＮＧＳ）解析用サンプルの調製）
マウス各個体（３群、ｎ＝８／群）の小腸組織由来及び盲腸組織由来のｃＤＮＡから調製したインデックスタグ付きアンプリコンＤＮＡサンプルを１つのチューブに、脾臓組織由来及びパイエル板由来のｃＤＮＡから調製したインデックスタグ付きアンプリコンＤＮＡサンプルを別の１つのチューブに混合し、２サンプルとした。１サンプル（１チューブ）に含まれるＤＮＡは、３群×８個体×２組織＝４８アンプリコンとなる。なお、アンプリコンＰＣＲ後にバンド強度から概算した各サンプル１μＬ中のＤＮＡ量をもとに、各サンプル中ＤＮＡ量が１０ｎｇとなるように混合した。

【0060】

（次世代シークエンサー（ＮＧＳ）による塩基配列解析）
次世代シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ３００ＰＥ）による塩基配列解析は、外部委託（北海道システム・サイエンス株式会社）により行った。Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍによってアンプリコンの濃度測定・品質の確認を行った後、次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ３００ＰＥ）を使用して、以下の条件でシークエンス解析を行った。
解析方法：Ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ
読み取り塩基長：３００塩基／リード
取得リード数：２０万リードペア／２サンプル
平均取得リード数：１０万リードペア（２０万リード）

【0061】

１サンプル（チューブ）には、インデックスタグを付した４８のアンプリコン（３群×８個体×２組織）が含まれており、１アンプリコンあたり２０００リードペア程度の塩基配列が得られることが想定された。

【0062】

（３．免疫グロブリン配列分析パイプラインを使用したＩｇＡ重鎖ＶＤＪ配列レパートリー分析）
（ＩｇＡ重鎖可変領域（ＶＤＪ領域）塩基配列のレパートリー解析）
次世代シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ３００ＰＥ）によるＰａｉｒｅｄ－ｅｎｄシーケンシングで得られた個体・組織ごとのＩｇＡ重鎖可変領域の塩基配列データ（ＦＡＳＴｑ ｆｉｌｅ）をウェブサーバー上で公開されている免疫グロブリン配列解析パイプラインＡＳＡＰ（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ｊｕｌ ３０；９：１６８６．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０１６８６．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１８．）を用いて以下の項目のデータを得た。
（１）ＣＤＲ３ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅａｄ ｃｏｕｎｔｓ：ＶＤＪの各遺伝子断片の連結部近傍で超可変領域の一つで、抗原結合における相補性を決定する領域３（相補性決定部位３：ＣＤＲ３）について、この領域のアミノ酸配列の種類とそれぞれのリードカウント
（２）ＩＧＨ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ＶＤＪ領域に見られる体細胞変異（生殖細胞系列との塩基配列の違い）のクローン（リード）ごとの数とクローン数
（３）ＩＧＨ Ｖ－Ｊ ｕｓａｇｅ：可変領域に動員されているＶＤＪ遺伝子断片の種類（属するファミリーの種類）

【0063】

前述のとおり次世代シーケンサーにより得られたデータを評価及び描出した。より具体的には、ヒートマップグラフィックス及び主成分分析（ＰＣＡ）によるクラスタリング分析を、統計解析ソフトウェアＲの統計・ｇｇｂｉｐｌｏｔパッケージを使用して行った。２つのサンプル間の統計的有意性を、マンホイットニーＵ検定（ウィルコクソン符号順位検定）を使用して評価した。ボックスウィスカープロットでは、ボックスは２５パーセンタイルから７５パーセンタイルまで伸び、５０パーセンタイルが内部に描画された。

【0064】

（結果）
結果を図２及び図３に示す。図２において、縦軸は、重鎖のＣＤＲ３の種数を表す。また、図３において、縦軸はリードカウント（同じＣＤＲ３を持つｒｅａｄの数）、横軸はＣＤＲ３配列の数（種類）を表す。なお、図２は、マウスの盲腸、パイエル板、小腸及び脾臓におけるＩｇＡのＶＤＪ遺伝子の連結部であるＣＤＲ３の種数を示し、図３は、図２に対応したマウスの盲腸におけるリードカウント及びＣＤＲ３配列の数を示す。採取したいずれの組織においても、ＶＤＪ遺伝子の連結部であるＣＤＲ３の種数は、対照群と比較してケストース群で多い傾向が見られた（図２）。特に、小腸においては、統計学的な有意差が確認された（図２）。また、対照群（図３（ａ））に比して、ケストース群（図３（ｂ））では、ＣＤＲ３配列の数（種類）が多いほう（グラフの右側）でのリードカウントが増えており、ＣＤＲ３の配列の多様化が促進されたことが示された。

【0065】

以上より、１－ケストースを摂取することで、各組織（特に腸管）におけるＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様性が促進されることが示された。ＩｇＡの可変領域のアミノ酸配列の多様性が促進されることで、体内に侵入してきた多様な物質に対して結合・排出が可能となることから、幅広い種類のアレルギー及び感染症を予防又は改善できることが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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