特開 2022-66129 アミガサタケ属（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ）活性物質の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022066129

(43)【公開日】2022-04-28

(54)【発明の名称】アミガサタケ属（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ）活性物質の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/062 20060101AFI20220421BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20220421BHJP

   A61K 36/07 20060101ALN20220421BHJP

   C12N 1/14 20060101ALN20220421BHJP

【ＦＩ】

A61K36/062

A61P21/00

A61K36/07

C12N1/14 G

【審査請求】有

【請求項の数】15

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021039083

(22)【出願日】2021-03-11

(31)【優先権主張番号】109135867

(32)【優先日】2020-10-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW

(71)【出願人】

【識別番号】517344446

【氏名又は名称】葡萄王生技股▲ふん▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】陳 勁初

(72)【発明者】

【氏名】李 宜蓁

(72)【発明者】

【氏名】李 宗儒

(72)【発明者】

【氏名】呂 庭宇

(72)【発明者】

【氏名】江 玲慧

(72)【発明者】

【氏名】陳 彦博

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4C088

【Ｆターム（参考）】

4B065AA99X

4B065AC14

4B065BD11

4B065BD16

4B065CA44

4C087AA01

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4C088AC16

4C088AC17

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4C088CA05

4C088CA06

4C088CA11

4C088MA16

4C088MA52

4C088NA14

4C088ZA94

(57)【要約】

【課題】本発明はアミガサタケ属活性物質の新規使用を提供する。
【解決手段】アミガサタケ属活性物質は、サルコペニア改善のための組成物製造のためである。アミガサタケ属活性物質の調製方法はアミガサタケ属菌糸体をプレート培地で１５℃～３０℃、１～２週間培養するステップ（ａ）と、ステップ（ａ）において培養したアミガサタケ属菌糸体をフラスコに植菌し、アミガサタケ属菌糸体を１５℃～３０℃、ｐＨ２～６で、４～７日間培養するステップ（ｂ）と、ステップ（ｂ）において培養したアミガサタケ属菌糸体を発酵タンクに植菌し、アミガサタケ属菌糸体を１５℃～３０℃、ｐＨ２～６で、６～１０日間培養するステップ（ｃ）とを含み、アミガサタケ属活性物質を含有するアミガサタケ属菌糸体発酵培養液を得る。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

サルコペニア改善のためのアミガサタケ属活性物質の使用であって、前記アミガサタケ属活性物質の調製方法が、
アミガサタケ属菌糸体をプレート培地で１５℃～３０℃、１～２週間培養するステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）において培養した前記アミガサタケ属菌糸体をフラスコに植菌し、前記アミガサタケ属菌糸体を１５℃～３０℃、ｐＨ２～６で、４～７日間培養するステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）において培養した前記アミガサタケ属菌糸体を発酵タンクに植菌し、前記アミガサタケ属菌糸体を撹拌しながら１５℃～３０℃、ｐＨ２～６で、６～１０日間培養し、前記アミガサタケ属活性物質を含有するアミガサタケ属菌糸体発酵培養液を形成するステップ（ｃ）と
を含む、使用。

【請求項2】

前記アミガサタケ属菌糸体はアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、アシブトアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｒａｓｓｉｐｅｓ）、コトガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ａｎｇｕｓｔｉｃｅｐｓ）、トガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｏｎｉｃａ）、オオトガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｌａｔａ）、アシボソアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）、およびそれらの組み合わせから選択される請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記アミガサタケ属菌糸体は、食品産業研究開発研究所に受託された受託番号ＢＣＲＣ－３６３５２のアミガサタケ菌糸体である、請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記アミガサタケ属菌糸体活性物質の前記調製方法は、凍結乾燥し、その後ステップ（ｃ）の前記アミガサタケ属菌糸体発酵培養液を挽いて、前記アミガサタケ属活性物質を含有するアミガサタケ属菌糸体凍結乾燥粉末を形成するステップ（ｄ）をさらに含む請求項２に記載の使用。

【請求項5】

前記アミガサタケ属菌糸体活性物質の前記調製方法は、少なくとも１つの溶媒で前記アミガサタケ属菌糸体凍結乾燥粉末を抽出し、前記アミガサタケ属活性物質を含有するアミガサタケ属菌糸体抽出物を形成するステップ（ｅ）をさらに含む請求項４に記載の使用。

【請求項6】

前記溶媒は純水および／またはエタノールである請求項５に記載の使用。

【請求項7】

前記アミガサタケ属菌糸体活性物質の前記調製方法は、前記アミガサタケ属菌糸体抽出物を乾燥させて前記アミガサタケ属活性物質を得るステップ（ｆ）をさらに含む請求項５または６に記載の使用。

【請求項8】

前記サルコペニアは、筋萎縮、筋肉量の減少、握力の減少および／または筋持続力の減少を含む症候を有する請求項１に記載の使用。

【請求項9】

筋肉量、握力および／または筋持続力の増加のためのアミガサタケ属活性物質の使用であって、前記アミガサタケ属活性物質の調製方法は、
アミガサタケ属菌糸体をプレート培地で１５℃～３０℃、１～２週間培養するステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）において培養した前記アミガサタケ属菌糸体をフラスコに植菌し、前記アミガサタケ属菌糸体を１５℃～３０℃、ｐＨ２～６で、４～７日間培養するステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）において培養した前記アミガサタケ属菌糸体を発酵タンクに植菌し、前記アミガサタケ属菌糸体を撹拌しながら１５℃～３０℃、ｐＨ２～６で、６～１０日間培養し、前記アミガサタケ属活性物質を含有するアミガサタケ属菌糸体発酵培養液を形成するステップ（ｃ）と
を含む、使用。

【請求項10】

前記アミガサタケ属菌糸体は、アミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、アシブトアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｒａｓｓｉｐｅｓ）、コトガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ａｎｇｕｓｔｉｃｅｐｓ）、トガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｏｎｉｃａ）、オオトガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｌａｔａ）、アシボソアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）、およびそれらの組み合わせから選択される請求項９に記載の使用。

【請求項11】

前記アミガサタケ属菌糸体は、食品産業研究開発研究所に受託された受託番号ＢＣＲＣ－３６３５２のアミガサタケ菌糸体である、請求項１０に記載の使用。

【請求項12】

前記アミガサタケ属菌糸体活性物質の前記調製方法は、凍結乾燥し、その後ステップ（ｃ）の前記アミガサタケ属菌糸体発酵培養液を挽いて、前記アミガサタケ属活性物質を含有するアミガサタケ属菌糸体凍結乾燥粉末を形成するステップ（ｄ）をさらに含む請求項１０に記載の使用。

【請求項13】

前記アミガサタケ属菌糸体活性物質の前記調製方法は、少なくとも１つの溶媒で前記アミガサタケ属菌糸体凍結乾燥粉末を抽出し、前記アミガサタケ属活性物質を含有するアミガサタケ属菌糸体抽出物を形成するステップ（ｅ）をさらに含む請求項１２に記載の使用。

【請求項14】

前記溶媒は純水および／またはエタノールである請求項１３に記載の使用。

【請求項15】

前記アミガサタケ属菌糸体活性物質の前記調製方法は、前記アミガサタケ属菌糸体抽出物を乾燥させて前記アミガサタケ属活性物質を得るステップ（ｆ）をさらに含む請求項１３または１４に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アミガサタケ属（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ）活性物質の調製方法およびその使用に関連する。より具体的には、筋萎縮を遅らせるため、筋肉量、筋肉握力、および筋持続力を増加させるため、または、サルコペニア改善用医薬組成物を調製するために、アミガサタケ属活性物質の使用に関連する。

【背景技術】

【0002】

骨格サルコペニア、または、略してサルコペニアは、年齢とともに骨格筋量および骨格筋力が失われ、身体活動が低下する現象を指す。一般的に言えば、３０歳を過ぎると、筋肉量は毎年０．５％～１％失われ、７５歳を過ぎると約４０％、９０歳のとき５０％失われる。アメリカ合衆国およびいくつかのヨーロッパ地域の研究によってサルコペニアの有病率は６０～７０歳の人で約５～１３％、８０歳以上の人で約１１～５０％であることが示された。台湾における研究によってサルコペニアの有病率は６５歳以上の高齢者で約３．９～７．３％であることが示された。

【0003】

筋肉は、力および動きを生み出す器官としてだけでなく、サイトカインを生成し放出する内分泌器官としても特定されている。したがって、サルコペニアに苦しむことは病気の発生率を増加させ、生活の質を低下させ、死さえ引き起こし得る。しかしながら、現在、サルコペニアに対する効果的な治療はない。

【0004】

アミガサタケ属は、世界的に有名な大型の食用菌類であり、その子実体は、形状において羊の胃袋のような不規則な窪みとひだを有することからその名前が付けられた。アミガサタケ属は美味しくて栄養価が高く、その栄養素含有量は牛乳および魚と同等である。アミガサタケ属は、タンパク質および炭水化物が豊富なだけではなく、様々な微量元素および１９種のアミノ酸をも含有する。この菌類は腸と胃に効き、消化を補助し、痰を切り、および気（Ｑｉ）を調整するという効果を有し、脾臓および胃、消化不良および息切れを治療するために使用され得る。

【0005】

現在のところ、アミガサタケ属がサルコペニアを改善するために使用できたり、筋肉量、握力および筋持続力を増加させるために使用できることを示す関連研究はない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本開示は、アミガサタケ属活性物質の調製方法を提供し、その方法は、特定の方法でアミガサタケ属菌糸体から抽出し、新たな用途にその使用を適用する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示の一実施形態によれば、アミガサタケ属活性物質の使用が提供され、アミガサタケ属活性物質はサルコペニアの改善に使用される。アミガサタケ属活性物質の調製方法は、
アミガサタケ属菌糸体をプレート培地で１５℃～３０℃、１～２週間培養するステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）において培養したアミガサタケ属菌糸体をフラスコに植菌し、アミガサタケ属菌糸体を１５℃～３０℃、ｐＨ２～６で、４～７日間培養するステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）において培養したアミガサタケ属菌糸体を発酵タンクに植菌し、アミガサタケ属菌糸体を撹拌しながら１５℃～３０℃、ｐＨ２～６で、６～１０日間培養し、アミガサタケ属活性物質を含有するアミガサタケ属菌糸体発酵培養液を形成するステップ（ｃ）と
を含む。

【0008】

本開示の別の実施形態によれば、アミガサタケ属活性物質の使用が提供され、アミガサタケ属活性物質は筋肉量、握力および／または筋持続力の増加に使用される。アミガサタケ属活性物質の調製方法は、
アミガサタケ属菌糸体をプレート培地で１５℃～３０℃、１～２週間培養するステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）において培養したアミガサタケ属菌糸体をフラスコに植菌し、アミガサタケ属菌糸体を１５℃～３０℃、ｐＨ２～６で、４～７日間培養するステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）において培養したアミガサタケ属菌糸体を発酵タンクに植菌し、アミガサタケ属菌糸体を撹拌しながら１５℃～３０℃、ｐＨ２～６で、６～１０日間培養し、アミガサタケ属活性物質を含有するアミガサタケ属菌糸体発酵培養液を形成するステップ（ｃ）と
を含む。

【0009】

一実施形態において、アミガサタケ属菌糸体は、アミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、アシブトアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｒａｓｓｉｐｅｓ）、コトガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ａｎｇｕｓｔｉｃｅｐｓ）、トガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｏｎｉｃａ）、オオトガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｌａｔａ）、アシボソアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）、およびそれらの組み合わせから選択される。

【0010】

一実施形態において、アミガサタケ属菌糸体は、食品産業研究開発研究所（Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に受託された受託番号ＢＣＲＣ－３６３５２のアミガサタケ菌糸体である。

【0011】

一実施形態において、アミガサタケ属菌糸体活性物質の調製方法は、凍結乾燥し、その後ステップ（ｃ）のアミガサタケ属菌糸体発酵培養液を挽いて、アミガサタケ属活性物質を含有するアミガサタケ属菌糸体凍結乾燥粉末を形成するステップ（ｄ）をさらに含む。

【0012】

一実施形態において、アミガサタケ属菌糸体活性物質の調製方法は、少なくとも１つの溶媒でアミガサタケ属菌糸体凍結乾燥粉末を抽出し、アミガサタケ属活性物質を含有するアミガサタケ属菌糸体抽出物を形成するステップ（ｅ）をさらに含む。

【0013】

一実施形態において、溶媒は純水および／またはエタノールである。
一実施形態において、アミガサタケ属菌糸体活性物質の調製方法はアミガサタケ属菌糸体抽出物を乾燥させてアミガサタケ属活性物質を得るステップ（ｆ）をさらに含む。

【0014】

一実施形態において、サルコペニアは、筋萎縮、筋肉量の減少、握力の減少および／または筋持続力の減少を含む症候を有する。
本発明の上記の態様および他の態様を理解するためにより明確にかつより容易にするために、以下の実施形態は、添付の図面とともに詳細に説明するために与えられる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】アミガサタケ属菌糸体の水抽出物はグルココルチコイド－デキサメタゾンで誘導されたマウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２の筋萎縮を回復できることを示す図。

【図2】アミガサタケ属菌糸体のエタノール抽出物はグルココルチコイド－デキサメタゾンで誘導されたマウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２の筋萎縮を回復できることを示す図。

【発明を実施するための形態】

【0016】

実施例１ アミガサタケ属菌糸体培養
この実施例で使用するアミガサタケ属は、台湾の食品産業研究開発研究所の生物資源研究センター（ＢＣＲＣ）から取り寄せたものであり、アミガサタケ属株は、受託番号ＢＣＲＣ－３６３５２のアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）である。しかしながら、本発明で使用されるアミガサタケ属は、アミガサタケに限られず、アシブトアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｒａｓｓｉｐｅｓ）、コトガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ａｎｇｕｓｔｉｃｅｐｓ）、トガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｃｏｎｉｃａ）、オオトガリアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｅｌａｔａ）、アシボソアミガサタケ（Ｍｏｒｃｈｅｌｌａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ）および上記の種の組み合わせからも選択され得る。他の実施形態において、本発明はまた他種のアミガサタケ属、およびそれに限られないものを使用することができる。

【0017】

（１）プレート培養：アミガサタケ属菌糸体をプレート上に植菌し、１５～３０℃で１～２週間培養（この実施例では２５℃で７日間培養）した。プレート培地の組成はポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）、炭素源および窒素源を含み得、特に限定はされない。

【0018】

（２）フラスコ培養：プレート培養が完了した後、菌糸体を掻き取り、フラスコに植菌し、その後１５℃～３０℃、ｐＨ２～６、回転速度１１０～１５０ｒｐｍで振盪しながら４～７日間培養した（この実施例では培養物は２５℃、ｐＨ５、回転速度１２０ｒｐｍで７日間振盪された）。この振盪培養物は以下の表１に示される培地で培養された。

【0019】

【表1】

【0020】

上記の培地配合において、包括的な炭素源および窒素源は穀物（小麦粉など）または豆類（大豆粉、緑豆粉、大豆種子粉、シナモン粉など）から選択され得る。糖類はグルコース、フルクトース、マルトース、スクロースなど、無機塩類は硫酸マグネシウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸鉄などであり得る。特に、表１の培地配合は単に一実施例であり、特別な制限はないので、成分を使用中の必要に応じて調節し得るか、または、市販の培地を使用し得る。

【0021】

（３）発酵タンクでの培養：（２）においてタンクで培養された菌糸体を、１５℃～３０℃、タンク圧力０．５～１．０ｋｇ／ｃｍ^２、ｐＨ２～６、撹拌速度５０～１５０ｒｐｍ、および通気速度０．１～１．５ＶＶＭで６～１０日間発酵タンク中に植菌し、アミガサタケ属菌糸体発酵培養液を形成した（この実施例では、条件を２５℃、タンク圧力０．５ｋｇ／ｃｍ^２、ｐＨ５、撹拌速度８０ｒｐｍおよび通気速度１．０ＶＶＭ（空気）１４日間に設定した）。発酵タンク内で使用される培養培地は、ステップ（２）においてフラスコ培養中で使用した培養培地と同じであり得る。このアミガサタケ属菌糸体発酵培養液は、本発明のアミガサタケ属菌糸体活性物質を含有する。アミガサタケ属菌糸体発酵培養液は、凍結乾燥ステップによるアミガサタケ属菌糸体発酵培養液の凍結乾燥粉末としてさらに調製され得る。この実施例において、１００Ｌのアミガサタケ属菌糸体発酵培養液から約３ｋｇの凍結乾燥粉末を得ることができる。

【0022】

（４）抽出物の調製：（３）の凍結乾燥粉末を抽出するために純水またはエタノールを溶媒として使用した。
水抽出物：初めに、２００ｇのアミガサタケ属菌糸体発酵培養液の凍結乾燥粉末をその凍結乾燥粉末の体積の２０倍の体積の蒸留水に加え、その後１００℃で３０分間加熱し、凍結乾燥粉末を溶解した。冷却後、凍結乾燥プロセスを行い、アミガサタケ属菌糸体発酵培養液の水抽出物を得た。

【0023】

エタノール抽出物：２００ｇのアミガサタケ属菌糸体発酵培養液凍結乾燥粉末をその凍結乾燥粉末の重量の２０倍の重量のエタノールに加え、超音波で一時間振盪し、その後濾過して上清を得た。上清を減圧下で濃縮し、アミガサタケ属菌糸体発酵培養液のエタノール抽出物を得た。

【0024】

抽出ステップを通して、高濃度のアミガサタケ属活性物質を得ることができる。アミガサタケ属活性物質の種類は、アミガサタケ属菌糸体発酵培養液（菌糸体および透明な液体／上清）、発酵培養液凍結乾燥粉末、水抽出物、エタノール抽出物、水抽出物とエタノール抽出物との混合物、水抽出物またはエタノール抽出物の凍結乾燥粉末、または他の剤形を含む。以下の実施例において、水抽出物およびエタノール抽出物は筋萎縮を改善するアミガサタケ属活性物質の種類として使用される。実施例３において、水抽出物およびエタノール抽出物を徹底的に混合し、給餌試験でアミガサタケ属活性物質として使用される「抽出混合物」を得た。一実施形態において、水抽出物とエタノール抽出物との混合比は重量で１：１である。

【0025】

実施例２ アミガサタケ属活性物質（水抽出物およびエタノール抽出物）による筋萎縮の改善
現在、デキサメタゾンを使用してマウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２で筋萎縮を誘導する実験がある。Ｃｈｅｎ－Ｙｕａｎ Ｃｈｉｕ、Ｒｏｎｇ－Ｓｅｎ Ｙａｎｇ、Ｍｅｅｉ－Ｌｉｎｇ Ｓｈｅｕ、Ｄｉｎｇ－Ｃｈｅｎｇ Ｃｈａｎ、Ｔｉｎｇ－Ｈｕａ Ｙａｎｇ、Ｋｅｈ－Ｓｕｎｇ Ｔｓａｉ、Ｃｈｉｈ－Ｋａｎｇ Ｃｈｉａｎｇ、Ｓｈｉｎｇ－Ｈｗａ Ｌｉｕによって行われた論文、「Ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ－ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎｄｕｃｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ａｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｉｃｅ ｖｉａ ａ ＲＡＧＥ－ｍｅｄｉａｔｅｄ、ＡＭＰＫ－ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ、ＡＫｔ ｐａｔｈｗａｙ」、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、２０１６ Ｆｅｂ；２３８（３）：４７０－８２を参照されたい。この論文では、合成グルココルチコイド－デキサメタゾンを使用して、サルコペニア研究のための筋萎縮モデルとして、分化したＣ２Ｃ１２の萎縮を誘導し、筋萎縮の重症度を筋管の形態および直径の観察により測定している。そのような方法にしたがって、本実験では、分化したマウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２をＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオジン）で染色し、筋萎縮におけるアミガサタケ属菌糸体活性物質の効果を評価した。本実験方法は以下である。

【0026】

（１）マウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２を回収し細胞懸濁液濃度を調整した後、細胞を６ウェルプレートに細胞密度１×１０^５～２×１０^５で細胞増殖培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清）とともにプレーティングした。

【0027】

（２）（１）の６ウェルプレートを３７℃の５％ＣＯ_２インキュベータに２日間置き、その後顕微鏡下で観察した。７０％の集密度まで細胞が増殖したとき、分化培地（ＤＭＥＭ、２％ウマ血清）を誘導のために加えた。２日ごとに新しい分化培地に置換した。分化プロセスはあわせて７日であった。

【0028】

（３）細胞分化７日目、約９０％の細胞が筋管を形成した後、１μＭデキサメタゾンおよび実施例１で得られた単一の用量のアミガサタケ属菌糸体水抽出物（１０μｇ／ｍｌ）またはエタノール抽出物（１μｇ／ｍｌ）を添加した。アミガサタケ属菌糸体の抽出物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、その毒性が細胞増殖に影響を与えないように、試験中ＤＭＳＯの濃度が０．１％になるように調整して添加した。対照群は０．１％ＤＭＳＯで処理し、全ての実験群および対照群を三重反復試験で行った。細胞を３７℃の５％ＣＯ_２インキュベータで２４時間培養した後、続いて試験実験を行った。

【0029】

（４）筋管が委縮したとき、その幅は有意に減少する。倒立顕微鏡を使用して４０×に拡大された視野下で、６０個の細胞が各繰り返しで取られ、Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して、筋萎縮の程度を決定するために筋管の幅を計算した。

【0030】

（５）各試験を３回繰り返し、数値を平均±ＳＤ（標準偏差）で表す。統計的方法は各項目のパーセンテージを分析するために対応ありｔ検定を使用し、ｐ値が０．０５未満のとき有意差を決定した。

【0031】

（６）アミガサタケ属菌糸体水抽出物（ＷＭｅ）の実験結果を以下の図１および表２に示す。図において、濃赤の部分は筋管である。デキサメタゾンで処理したＣ２Ｃ１２筋管（右上）は対照群（左上）より、有意に小さい直径（３０．３９μｍ→１９．９８μｍ）を有し、このモデルが筋萎縮を引き起こすことを証明した。アミガサタケ属菌糸体水抽出物は、デキサメタゾン誘導された筋肉直径の減少を有意に回復することができた（右下、１９．９８μｍ→２９．３７μｍ）。また、アミガサタケ属菌糸体水抽出物のみの処理（左下）は筋肉量に有意な影響を有さなかった。

【0032】

【表2】

【0033】

（７）アミガサタケ属菌糸体エタノール抽出物（エタノール、ＥＭｅ）の実験結果を以下の図２および表３に示す。デキサメタゾンで処理したＣ２Ｃ１２筋管（右上）は、対照群（左上）より、有意に小さい直径を有する。アミガサタケ属菌糸体エタノール抽出物の添加はデキサメタゾンによる筋肉直径の減少を有意に回復することができた（１９．９８→３０．７０μｍ、右下）。また、アミガサタケ属菌糸体エタノール抽出物のみの処理は、筋肉量に有意な影響を有さなかった（左下）。

【0034】

【表3】

【0035】

上記の実験によって、本発明のアミガサタケ属活性物質は、デキサメタゾン誘導された筋萎縮を改善する効果を有することが確かめられ、それは薬学的に許容されるキャリヤ、賦形剤、希釈剤、またはアジュバントと組み合わせて医薬組成物を調製できるか、または、サルコペニアの予防／治療のために食品添加物としても使用できる。

【0036】

実施例３ アミガサタケ属活性物質（水／エタノール抽出混合物）による筋肉量、筋肉握力、および筋持続力の増加
現在のところ、ギプス固定（ＩＭ、固定された機械的機構を使用してマウス後肢を固定し筋萎縮を引き起こす）を使用してマウス骨格筋萎縮を誘導する実験がある。Ｐｅｔｅｒ Ｂｉａｌｅｋ、Ｃａｒｌ Ｍｏｒｒｉｓ、Ｊａｓｃｈａ Ｐａｒｋｉｎｇｔｏｎ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｔ． Ａｎｄｒｅ、Ｊａｎｅ Ｏｗｅｎｓ、Ｐａｕｌ Ｙａｗｏｒｓｋｙ、Ｈｏｗａｒｄ Ｓｅｅｈｅｒｍａｎ、およびＳｃｏｔｔ Ａ． Ｊｅｌｉｎｓｋｙの論文、「Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｉｓｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ａｔｒｏｐｈｙ」、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１１ Ｏｃｔ；４３（１９）：１０７５－１０８６を参照することができる。本実験において、同じ方法を使用して、ギプス固定（ＩＭ）によるマウスに骨格筋萎縮を誘導した。７日間ＩＭを誘導した後、ＩＭを除去し、筋肉握力試験を測定し、その後１８～２０ｍ／分の固定された速度で３０分まで電気刺激を避けるようにトレッドミルで走らせた後、筋持続力試験を測定した（電気刺激の回数による）。試験の終わりに、マウスを屠殺し、後肢の骨格筋を除去し、重量を計測し、および記録して、筋肉量、筋肉握力および筋持続力の増加におけるアミガサタケ属菌糸体抽出混合物の結果を評価した。

【0037】

（１）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを動物実験に使用し、各群６匹のマウスで、対照群（Ｓｈａｍ群）、ＩＭ群、およびアミガサタケ属菌糸体抽出混合物群に分けた。対照群およびＩＭ群のマウスに等量の二次純水（ｄｄＨ_２Ｏ）を与え、試験物質（すなわち、アミガサタケ属菌糸体の水／エタノール抽出混合物）を５００ｍｇ／ｋｇの濃度で与えた。試験物質は胃管によって経口で給餌され、使用した体積は１０ｍＬ／ｋｇ体重／回であった。試験物質は投与前に新たに調製した。マウスを毎日の給餌後継続的に観察し、体重、食物摂取、および水摂取を記録した。

【0038】

（２）サルコペニアを誘導するために、マウスをギプス固定（ＩＭ）で処理し、同時にアミガサタケ属菌糸体の水／エタノール抽出混合物を１４日間与えた。その後、マウスで筋肉握力および筋持続力（電気刺激の回数による）を試験した。試験の終わりに、マウスを屠殺し、後肢の骨格筋を除去し、重量を計測し、および記録した。

【0039】

試験結果は全て平均±ＳＤで表され、実験データの統計的分析にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０）を使用した。統計的方法に関して、群間の差を決定するために１元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）および事後ダネットの検定（ｐｏｓｔ－ｈｏｃ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔ）を使用した。統計的結果のｐ値が０．０５未満（ｐ＜０．０５）である場合、２群間に有意差があることが決定される。

【0040】

マウス筋肉握力試験の結果を以下の表４に示す。筋肉握力試験は、マウスの最大握力を測定し、高い値ほど良い。１４日目に、ＩＭ群はＳｈａｍ群よりも筋肉握力が低下し、アミガサタケ属菌糸体水／エタノール抽出混合物群はＩＭ群よりも筋肉握力が有意に増加した。

【0041】

【表4】

【0042】

マウス筋持続力試験の結果を以下の表５に示す。記録された電気刺激の回数が多いほど、持続力が悪い。１４日目では、ＩＭで処理された群の筋持続力は、記録された電気刺激の回数が増加したので（３．００→５００．８３）有意に減少した。しかしながら、アミガサタケ属菌糸体水／エタノール抽出混合物における記録された電気刺激の回数はＩＭ群のそれよりも有意に低かった（５００．８３→７８．５０）。

【0043】

【表5】

【0044】

マウスを屠殺した後、後肢の骨格筋を除去し、重量を計測した。体重測定結果を以下の表６に示す。ＩＭの腓腹筋の重量は対照群（Ｓｈａｍ群）のそれよりも低く、アミガサタケ属菌糸体水／エタノール抽出混合物群はＩＭ群と比較して、有意に腓腹筋重量が増加した。これらの発見によって本発明のアミガサタケ属菌糸体水／エタノール抽出混合物は、筋肉重量を増加させることができることが証明された。

【0045】

【表6】

【0046】

実施例４ 組成物の調製
上記の実験により、本発明のアミガサタケ属活性物質（水／エタノール抽出混合物）は筋肉量、筋肉握力および筋持続力の増加に影響を与え、医学分野でアミガサタケ属の新たな適用として使用できることが確かめられた。したがって、特にアミガサタケ属の活性物質を適用するために、アミガサタケ属活性物質を含有する組成物が製造され、その有効量が治癒効果を達成するために対象に投与される。

【0047】

上記の「有効量」は、サルコペニアの回復、および／または、筋肉量、握力および／または筋持続力の増加の前述の効果を生み出すのに十分な量を指す。インビトロ細胞培養実験に基づいて、前述の有効量は、各培養で使用された細胞培養培地の全体積に基づいて「μｇ／ｍｌ」として定義される。動物モデル実験に基づいて、前述の有効量は「ｇ／６０ｋｇ体重／日」として定義される。それに加えて、インビトロ細胞培養実験によって得られた有効量のデータは以下の式によって動物使用の妥当な有効量に変換できる。

【0048】

一般に（Ｒｅａｇａｎ－Ｓｈａｗら、２００８）、１「μｇ／ｍｌ」単位（インビトロ細胞培養実験の有効量に基づく）は、１「ｍｇ／ｋｇ体重／日」単位（ラットモデル実験の有効量に基づく）と同等であり得、ラットの代謝速度はヒトの代謝速度の６倍であることに基づくと、有効なヒトの用量を見出すことができる。

【0049】

したがって、インビトロ細胞培養実験の５００μｇ／ｍｌに基づいたマウスにおける使用の有効量は、５００ｍｇ／ｋｇ体重／日（すなわち、０．５ｇ／ｋｇ体重／日）として計算される。さらに、前述の代謝速度の違いを考慮すると、ヒトへの使用の有効量は５ｇ／６０ｋｇ体重／日とみなされ得る。

【0050】

上記に報告された試験結果に基づいて、ラット実験に基づいて検証された用量は５００ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、したがって、ヒトへの使用の妥当な有効な用量は２．４ｇ／６０ｋｇ体重／日である。

【0051】

一実施形態において、組成物に含有されるアミガサタケ属活性物質の有効量は５００ｍｇ／６０ｋｇ～１０ｇ／６０ｋｇ体重／日である。
組成物はさらに添加剤を含む。好ましい一実施形態において、添加剤は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収促進剤、甘味料、またはそれらの組み合わせであり得る。賦形剤は、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはそれらの組み合わせから選択され得る。ベンジルエタノール、パラベンなどのこの防腐剤は、医薬組成物の貯蔵寿命を延ばす。希釈剤は水、エタノール、プロピレングリコール、グリセロール、またはそれらの組み合わせから選択され得る。充填剤は、ラクトース、ヌガー、高分子量のエチレングリコール、またはそれらの組み合わせから選択され得る。吸収促進剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ラウロカプラム、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、またはそれらの組み合わせから選択され得る。甘味料は、アセスルファムＫ、アスパルテーム、サッカリン、スクラロース、ネオテーム、またはそれらの組み合わせから選択され得る。上に列挙された添加剤に加えて、使用に適した他の添加剤がアミガサタケ属活性物質の医学的効果に影響を与えることなく要件に基づいて選択されてよい。

【0052】

組成物は医学分野において異なる製品として開発され得る。好ましい一実施形態において、組成物は医薬品、飼料、飲料、栄養補助食品、乳製品、食品、または健康食品である。

【0053】

組成物は受取人の必要に応じて異なる形態を取り得る。好ましい一実施形態において、組成物は粉末、薬用ドロップ、造粒、坐剤、マイクロカプセル、アンプル（ａｍｐｏｕｌｅ／ａｍｐｕｌｅ）、液体スプレー、または坐剤の形態である。

【0054】

本発明の組成物は動物またはヒトに使用することができる。アミガサタケ属活性物質の効果に影響を与えることなく、アミガサタケ属活性物質を含む組成物は、任意の医薬形態で作られ得、薬のタイプに応じて適した方法で動物またはヒトに投与され得る。

【0055】

組成物１：アミガサタケ属活性物質として水抽出物（２０ｗｔ％）をとり（ｔａｋｅ）、防腐剤としてのベンジルエタノール（８ｗｔ％）、希釈剤としてのグリセリン（７ｗｔ％）とよく混合し、精製水（６５ｗｔ％）に溶解し、液体の形態の本発明の医薬組成物を製造した。前述のｗｔ％は組成物の総重量に対する各成分の比を意味する。後の使用のために４℃で保管する。

【0056】

組成物２：アミガサタケ属活性物質としてエタノール抽出物（１５ｗｔ％）を使用し、防腐剤としてのベンジルエタノール（５ｗｔ％）、希釈剤としてのグリセリン（１０ｗｔ％）とよく混合し、精製水（７０ｗｔ％）に溶解し、液体の形態の本発明の医薬組成物を製造した。前述のｗｔ％は組成物の総重量に対する各成分の比を意味する。後の使用のために４℃で保管する。

【0057】

本発明が実施形態とともに開示されたが、これは本発明を限定することを意図していない。当業者は、上記の教示を考慮した後、上記の実施形態の含有量に適切な変更をすることができ、それでもなお本出願の特許請求の範囲の効果を達成することができる。したがって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲の対象となる。

【図1】

【図2】

【外国語明細書】