▶ シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022066565
(43)【公開日】2022-04-28
(54)【発明の名称】抗ＮＴＢ－Ａ抗体ならびに関連する組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220421BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220421BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220421BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220421BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220421BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220421BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220421BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K45/00
A61P35/00
A61K47/68
A61P35/02
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022038055
(22)【出願日】2022-03-11
(62)【分割の表示】P 2019238780の分割
【原出願日】2013-12-20
(31)【優先権主張番号】61/745,239
(32)【優先日】2012-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】505314468
【氏名又は名称】シージェン インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】ティム ルイス
(72)【発明者】
【氏名】チェ－リュン ロー
(57)【要約】
【課題】抗ＮＴＢ－Ａ抗体ならびに関連する組成物および方法を提供する。
【解決手段】本発明は、例えば、様々なＮＴＢ－Ａ発現性のがんの処置および診断に、ならびにＮＴＢ－Ａの検出（例えば、細胞上のＮＴＢ－Ａ発現の検出）に有用なＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体を用いた、そのような処置、診断、およびＮＴＢ－Ａ検出の方法もまた提供される。本発明はまた、ＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）を用いた、多発性骨髄腫を処置する方法も提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、例えば、様々なＮＴＢ－Ａ発現性のがんの処置および診断に、ならびにＮＴＢ－Ａの検出（例えば、細胞上のＮＴＢ－Ａ発現の検出）に有用なＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体を用いた、そのような処置、診断、およびＮＴＢ－Ａ検出の方法もまた提供される。本発明はまた、ＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）を用いた、多発性骨髄腫を処置する方法も提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連する出願との相互参照
本出願は、非仮出願であり、２０１２年１２月２１日に出願された米国特許第６１／７４５，２３９号の利益を主張し、その内容は本明細書においてその全体が全ての目的のために参考として援用される。
本出願は、非仮出願であり、２０１２年１２月２１日に出願された米国特許第６１／７４５，２３９号の利益を主張し、その内容は本明細書においてその全体が全ての目的のために参考として援用される。
【0002】
配列表
２０１３年１２月１８日に作成されたＮＴＢＡ－００１１１ＰＣ－ＳＴ２５．ｔｘｔという名前の８キロバイトの配列表が、参考として援用される。
２０１３年１２月１８日に作成されたＮＴＢＡ－００１１１ＰＣ－ＳＴ２５．ｔｘｔという名前の８キロバイトの配列表が、参考として援用される。
【背景技術】
【0003】
背景
ＳＬＡＭＦ６とも呼ばれる、１型１回通過膜糖タンパク質であるＮＴＢ－Ａは、ＣＤ２／ＳＬＡＭサブファミリーに属する免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｉｇ－ＳＦ）のメンバーである。例えば、Ｂｏｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９４：２３５－２４６，２００１を参照。ＮＴＢ－Ａは、その細胞外部分に、Ｎ末端Ｖ型ドメインおよびそれに続くＣ２型ドメインを特徴として有し、他方で、細胞質内部分は３つのチロシンベースのモチーフを含む：２つの免疫レセプターチロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ；ＴｘＹｘｘＶ／Ｉ）および古典的免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ；Ｉ／Ｖ／Ｌ／ＳｘＹｘｘＬ）。同上を参照。そのＩＴＳＭモチーフを通じて、ＮＴＢ－Ａは、ＳＬＡＭ－関連タンパク質ＳＨ２Ｄ１Ａおよび関連するユーイング肉腫活性化転写物（ＥＡＴ）２のＳＨ２ドメインと関係する。Ｂｏｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｆａｌｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３４：１６６３－１６７２，２００４；Ｆｌａｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２：６５２４－６５２７，２００４を参照。
ＳＬＡＭＦ６とも呼ばれる、１型１回通過膜糖タンパク質であるＮＴＢ－Ａは、ＣＤ２／ＳＬＡＭサブファミリーに属する免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｉｇ－ＳＦ）のメンバーである。例えば、Ｂｏｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９４：２３５－２４６，２００１を参照。ＮＴＢ－Ａは、その細胞外部分に、Ｎ末端Ｖ型ドメインおよびそれに続くＣ２型ドメインを特徴として有し、他方で、細胞質内部分は３つのチロシンベースのモチーフを含む：２つの免疫レセプターチロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ；ＴｘＹｘｘＶ／Ｉ）および古典的免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ；Ｉ／Ｖ／Ｌ／ＳｘＹｘｘＬ）。同上を参照。そのＩＴＳＭモチーフを通じて、ＮＴＢ－Ａは、ＳＬＡＭ－関連タンパク質ＳＨ２Ｄ１Ａおよび関連するユーイング肉腫活性化転写物（ＥＡＴ）２のＳＨ２ドメインと関係する。Ｂｏｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｆａｌｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３４：１６６３－１６７２，２００４；Ｆｌａｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７２：６５２４－６５２７，２００４を参照。
【0004】
ＮＴＢ－Ａは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ様Ｔ細胞、Ｔ細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、および好酸球上に発現する。Ｓａｌｏｒｔ ＪＤ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２９－１３６，２０１１；Ｍａｔｅｓａｎｚ－Ｉｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０４－１１２，２０１１；Ｍｕｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７４：１１０－１１８，２００５；Ｂｏｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９４（３）：２３５－２４６；２００１を参照。ＮＴＢ－Ａは、同型相互作用を介して（すなわち、自己リガンドとして）機能することができ、そして、シグナル伝達によるＮＫ細胞機能の正の調節因子として働き、ＮＫ細胞の細胞傷害性を誘導することが示されている。例えば、Ｂｏｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，同上；Ｆａｌｃｏ ｅｔ ａｌ．，同上；Ｆｌａｉｇ ｅｔ ａｌ．，同上を参照。ＮＴＢ－Ａはまた、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）およびＢ細胞リンパ腫の患者由来のＢ細胞上で発現することも示されている。Ｋｏｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １３７：３０７－３１８，２００７を参照。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｂｏｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：２３５－２４６，２００１
【非特許文献2】Ｆａｌｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：１６６３－１６７２，２００４
【非特許文献3】Ｆｌａｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：６５２４－６５２７，２００４
【非特許文献4】Ｓａｌｏｒｔ ＪＤ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２９－１３６，２０１１
【非特許文献5】Ｍａｔｅｓａｎｚ－Ｉｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０４－１１２，２０１１
【非特許文献6】Ｍｕｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７４：１１０－１１８，２００５
【非特許文献7】Ｋｏｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １３７：３０７－３１８，２００７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
権利が請求される発明の概要
１つの局面では、本発明は、ヒトＮＴＢ－Ａに対する特異的結合について、配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と競合する、単離された抗体を提供する。
１つの局面では、本発明は、ヒトＮＴＢ－Ａに対する特異的結合について、配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と競合する、単離された抗体を提供する。
【0007】
他の局面では、本発明は、ヒトＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する単離されたマウスモノクローナル抗体であって、配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む単離されたマウスモノクローナル抗体、またはそのキメラもしくはヒト化形態を提供する。
【0008】
他の局面では、本発明は、ヒトＮＴＢ－ＡにおけるｍＡｂと同一のエピトープに結合する単離された抗体であって、（ｉ）配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０、あるいは（ｉｉ）配列番号３の残基２０～１３７および配列番号４の残基２１～１２８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む単離された抗体を提供する。
【0009】
さらに他の局面では、本発明は、ヒトＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する単離された抗体であって、（ａ）配列番号１の残基２０～１３５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号２の残基２１～１４０と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、あるいは（ｂ）配列番号３の残基２０～１３７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号４の残基２１～１２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、単離された抗体を提供する。いくつかの局面では、そのような抗体は、リファレンス配列に対して８０％の同一性を含み、そして、リファレンス配列と同一のＣＤＲを含む。
【0010】
また他の局面では、本発明は、ヒトＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する単離された抗体であって、（ａ）配列番号１の残基２０～１３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２の残基２１～１４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、あるいは（ｂ）配列番号３の残基２０～１３７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号４の残基２１～１２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインにそれぞれ由来するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む、単離された抗体を提供する。
【0011】
いくつかの実施態様では、本発明の抗体はヒトＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合し、そして、配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨ／ＶＬドメインと同一のＣＤＲを含む。例えば、特定の実施態様では、抗体は、配列番号５～１０にそれぞれ示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、抗体は、配列番号３の残基２０～１３７および配列番号４の残基２１～１２８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨ／ＶＬドメインと同一のＣＤＲを含む。いくつかのそのようなバリエーションでは、抗体は、配列番号１１～１６にそれぞれ示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む。
【0012】
他の実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合し、そして、第二のＣＤＲのセットに対して３か所以下のアミノ酸置換（好ましくは保存的置換）を有するＣＤＲのセット（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲ）を含み、ここで、該第二のＣＤＲのセットは、（ｉ）配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０、または（ｉｉ）配列番号３の残基２０～１３７および配列番号４の残基２１～１２８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨ／ＶＬドメインに由来する。特定のバリエーションでは、第二のＣＤＲのセットは、配列番号５～１０または配列番号１１～１６にそれぞれ示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む。いくつかの局面では、抗体は、ヒトＮＴＢ－Ａに対する特異的結合について、配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と競合する。
【0013】
特定のバリエーションでは、本発明の抗体は、ヒトＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合し、そして、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインを含むヒト化抗体である。例えば、ヒト化ＶＨ／ＶＬドメインは、（ｉ）配列番号１の残基２０～１３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２の残基２１～１４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインにそれぞれ、あるいは、（ｉｉ）配列番号３の残基２０～１３７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号４の残基２１～１２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインにそれぞれ由来し得る。いくつかのそのような実施態様では、ヒト化抗体は、上記で特定されたＶＨ／ＶＬドメインと同一のＣＤＲを含む。特定のバリエーションでは、上記（ｉ）で特定されたＶＨドメインおよびＶＬドメインに由来するヒト化抗体は、配列番号５～１０にそれぞれ示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含み；あるいは、上記（ｉｉ）で特定されたＶＨドメインおよびＶＬドメインに由来するヒト化抗体は、配列番号１１～１６にそれぞれ示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、ヒト化抗体は、（ｉ）ヒトＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合し、（ｉｉ）第二のＣＤＲのセットに対して３か所以下のアミノ酸置換（好ましくは保存的置換）を有するＣＤＲのセット（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３のＣＤＲ）を含み、ここで、該第二のＣＤＲのセットは、上記で特定されたＣＤＲのセット（すなわち、配列番号５～１０および／または配列番号１１～１６にそれぞれ示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３アミノ酸配列を含む、第二のＣＤＲのセット）であり、そして、（ｉｉｉ）ヒトＮＴＢ－Ａに対する特異的結合について、配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と競合する。
【0014】
いくつかの実施態様では、上記の抗体は、免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも部分をさらに含む。免疫グロブリン重鎖定常領域は、天然のヒト定常領域またはその遺伝的に操作された改変体であってよく、例えば、天然のヒト定常領域に対してＦｃγレセプターへの結合が低減された、天然のヒト定常領域の変異形態（例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４ＶおよびＬ２３５Ａおよび／またはＮ２９７Ｄ（Ｋａｂａｔにおいて明らかにされるＥＵインデックスに従った番号付け）の置換を有する改変体）であってよい。適切な重鎖定常領域としては、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の重鎖定常領域が挙げられる。
【0015】
いくつかの実施態様では、上記の抗体は、ＶＨドメインを含む第一のポリペプチド鎖およびＶＬドメインを含む第二のポリペプチド鎖を含む。いくつかのそのようなバリエーションでは、第一のポリペプチド鎖は、ＶＨドメインと融合された免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも部分をさらに含み、そして、第二のポリペプチド鎖は、ＶＬドメインと融合された免疫グロブリン軽鎖定常領域の少なくとも部分をさらに含む。重鎖定常領域は、天然のヒト定常領域またはその遺伝的に操作された改変体であってよく、例えば、天然のヒト定常領域に対してＦｃγレセプターへの結合が低減された、天然のヒト定常領域の変異形態であってよい。適切な重鎖定常領域としては、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の重鎖定常領域が挙げられる。
【0016】
特定のバリエーションでは、上記の抗体は、細胞傷害性作用物質または細胞増殖抑制作用物質と結合体化される。
【0017】
他の局面では、本発明は、上記で定義されるＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする単離された核酸を提供する。本発明はさらに、上記のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供し、そして、そのような発現ベクターを含み、本発明の抗体を産生する方法において用いられ得る宿主細胞を提供する。本発明の抗体を産生するそのような方法は、典型的には、抗体が発現される条件下で宿主細胞を培養する工程および宿主細胞から抗体を単離する工程を含む。
【0018】
さらに他の局面では、本発明は、上記の抗体および薬学的に適合性の成分を含む医薬組成物を提供する。
【0019】
また他の局面では、本発明は、ＮＴＢ－Ａ発現を特徴とするがんを有する患者を処置する方法を提供する。処置方法は、一般的に、上記で説明された抗体の効果的なレジメンを患者に投与する工程を含む。特定の局面では、抗体は、細胞傷害性作用物質または細胞増殖抑制作用物質と結合体化される。いくつかの実施態様では、がんは、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、およびＢ細胞リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））からなる群より選択される。
【0020】
他の局面では、本発明は、多発性骨髄腫を有する患者を処置する方法を提供する。処置方法は、一般的に、ヒトＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する抗体の効果的なレジメンを患者に投与する工程であって、該抗体は、細胞傷害性作用物質または細胞増殖抑制作用物質と結合体化される工程を含む。いくつかのバリエーションでは、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、上記で説明された抗体である。
【0021】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の発明の詳細な説明および添付の図面を参照することで、明らかとなる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒトＮＴＢ－Ａに対する特異的結合について、配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むモノクローナル抗体と競合する、単離された抗体。
（項目２）
前記抗体は、
配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列；
配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列；
配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列；
配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列；
配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列；および
配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記抗体は、
配列番号１の残基２０～１３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインに由来するヒト化ＶＨドメイン、および
配列番号２の残基２１～１４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインに由来するヒト化ＶＬドメイン、を含むヒト化抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記抗体は、
配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列；
配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列；
配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列；
配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列；
配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列；および
配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む、項目３に記載の抗体。
（項目５）
前記抗体は、
配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列；
配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列；
配列番号１３に示されるＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列；
配列番号１４に示されるＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列；
配列番号１５に示されるＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列；および
配列番号１６に示されるＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目６）
前記抗体は、
配列番号３の残基２０～１３７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインに由来するヒト化ＶＨドメイン、および
配列番号４の残基２１～１２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインに由来するヒト化ＶＬドメイン、を含むヒト化抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目７）
前記抗体は、
配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列；
配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列；
配列番号１３に示されるＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列；
配列番号１４に示されるＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列；
配列番号１５に示されるＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列；および
配列番号１６に示されるＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む、項目６に記載の抗体。
（項目８）
配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む単離されたマウスモノクローナル抗体、またはそのキメラもしくはヒト化形態。
（項目９）
配列番号５（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）、および配列番号７（ＣＤＲ３）で示される相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに配列番号８（ＣＤＲ４）、配列番号９（ＣＤＲ５）、および配列番号１０（ＣＤＲ６）で示される軽鎖ＣＤＲ配列を含む単離されたヒト化モノクローナル抗体であって、それぞれのＣＤＲ中に０、１、２または３か所の保存的アミノ酸置換を有する、抗体。
（項目１０）
さらに免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも部分を含む、項目１から９のいずれか１つに記載の抗体。
（項目１１）
前記抗体は、ＶＨドメインを含む第一のポリペプチド鎖およびＶＬドメインを含む第二のポリペプチド鎖を含む、項目１から１０のいずれか１つに記載の抗体。
（項目１２）
前記第一のポリペプチド鎖は、ＶＨドメインと融合された免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも部分をさらに含み、そして、前記第二のポリペプチド鎖は、ＶＬドメインと融合された免疫グロブリン軽鎖定常領域の少なくとも部分をさらに含む、項目１１に記載の抗体。
（項目１３）
前記重鎖定常領域は、天然のヒト定常領域に対してＦｃγレセプターへの結合が低減された、天然のヒト定常領域の変異形態である、項目１０または１２に記載の抗体。
（項目１４）
前記重鎖定常領域は、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選択されるアイソタイプのものである、項目１０、１２、または１３のいずれか１つに記載の抗体。
（項目１５）
前記抗体は、細胞傷害性作用物質または細胞増殖抑制作用物質と結合体化される、項目１から１４のいずれか１つに記載の抗体。
（項目１６）
項目１から１５のいずれか１つによって定義されるＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする単離された核酸。
（項目１７）
医薬組成物であって、以下：
項目１から１５のいずれか１つに記載の抗体；および
薬学的に適合性の成分、を含む、医薬組成物。
（項目１８）
ＮＴＢ－Ａ発現を特徴とするがんを有する患者を処置する方法であって：
項目１から１５のいずれか１つに記載の抗体の効果的なレジメンを患者に投与する工程、を含む方法。
（項目１９）
前記がんは、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、およびＴ細胞リンパ腫もしくはＢ細胞リンパ腫からなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｂ細胞リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、項目１９に記載の方法。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒトＮＴＢ－Ａに対する特異的結合について、配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むモノクローナル抗体と競合する、単離された抗体。
（項目２）
前記抗体は、
配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列；
配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列；
配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列；
配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列；
配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列；および
配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記抗体は、
配列番号１の残基２０～１３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインに由来するヒト化ＶＨドメイン、および
配列番号２の残基２１～１４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインに由来するヒト化ＶＬドメイン、を含むヒト化抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記抗体は、
配列番号５に示されるＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列；
配列番号６に示されるＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列；
配列番号７に示されるＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列；
配列番号８に示されるＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列；
配列番号９に示されるＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列；および
配列番号１０に示されるＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む、項目３に記載の抗体。
（項目５）
前記抗体は、
配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列；
配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列；
配列番号１３に示されるＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列；
配列番号１４に示されるＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列；
配列番号１５に示されるＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列；および
配列番号１６に示されるＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目６）
前記抗体は、
配列番号３の残基２０～１３７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインに由来するヒト化ＶＨドメイン、および
配列番号４の残基２１～１２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインに由来するヒト化ＶＬドメイン、を含むヒト化抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目７）
前記抗体は、
配列番号１１に示されるＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列；
配列番号１２に示されるＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列；
配列番号１３に示されるＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列；
配列番号１４に示されるＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列；
配列番号１５に示されるＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列；および
配列番号１６に示されるＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列を含む、項目６に記載の抗体。
（項目８）
配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む単離されたマウスモノクローナル抗体、またはそのキメラもしくはヒト化形態。
（項目９）
配列番号５（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）、および配列番号７（ＣＤＲ３）で示される相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに配列番号８（ＣＤＲ４）、配列番号９（ＣＤＲ５）、および配列番号１０（ＣＤＲ６）で示される軽鎖ＣＤＲ配列を含む単離されたヒト化モノクローナル抗体であって、それぞれのＣＤＲ中に０、１、２または３か所の保存的アミノ酸置換を有する、抗体。
（項目１０）
さらに免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも部分を含む、項目１から９のいずれか１つに記載の抗体。
（項目１１）
前記抗体は、ＶＨドメインを含む第一のポリペプチド鎖およびＶＬドメインを含む第二のポリペプチド鎖を含む、項目１から１０のいずれか１つに記載の抗体。
（項目１２）
前記第一のポリペプチド鎖は、ＶＨドメインと融合された免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも部分をさらに含み、そして、前記第二のポリペプチド鎖は、ＶＬドメインと融合された免疫グロブリン軽鎖定常領域の少なくとも部分をさらに含む、項目１１に記載の抗体。
（項目１３）
前記重鎖定常領域は、天然のヒト定常領域に対してＦｃγレセプターへの結合が低減された、天然のヒト定常領域の変異形態である、項目１０または１２に記載の抗体。
（項目１４）
前記重鎖定常領域は、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選択されるアイソタイプのものである、項目１０、１２、または１３のいずれか１つに記載の抗体。
（項目１５）
前記抗体は、細胞傷害性作用物質または細胞増殖抑制作用物質と結合体化される、項目１から１４のいずれか１つに記載の抗体。
（項目１６）
項目１から１５のいずれか１つによって定義されるＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする単離された核酸。
（項目１７）
医薬組成物であって、以下：
項目１から１５のいずれか１つに記載の抗体；および
薬学的に適合性の成分、を含む、医薬組成物。
（項目１８）
ＮＴＢ－Ａ発現を特徴とするがんを有する患者を処置する方法であって：
項目１から１５のいずれか１つに記載の抗体の効果的なレジメンを患者に投与する工程、を含む方法。
（項目１９）
前記がんは、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、およびＴ細胞リンパ腫もしくはＢ細胞リンパ腫からなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｂ細胞リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、項目１９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
定義
異なって定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、説明される方法および組成物の属する分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で用いられる場合、以下の用語および句は、異なって特定されない限りそれらに与えられた意味を有する。
異なって定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、説明される方法および組成物の属する分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で用いられる場合、以下の用語および句は、異なって特定されない限りそれらに与えられた意味を有する。
【0024】
「抗体－薬物結合体」は、細胞傷害性作用物質または細胞増殖抑制作用物質と結合体化された抗体をいう。典型的には、抗体－薬物結合体は、細胞表面上の標的抗原（例えば、ＮＴＢ－Ａ）に結合し、続いて細胞内に抗体－薬物結合体が内部移行し、そして薬物が放出される。
【0025】
「ポリペプチド」または「ポリペプチド鎖」は、天然で産生されたか、または合成的に産生されたかに拘わらず、ペプチド結合によって繋がったアミノ酸残基の重合体である。約１０アミノ酸残基より少ないポリペプチドは、通常「ペプチド」と呼ばれる。
【0026】
「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド性の構成要素（例えば、炭水化物基）も含み得る。炭水化物および他の非ペプチド性置換基は、そのタンパク質が産生される細胞によってタンパク質に添加され得、そして細胞のタイプに応じて変化し得る。タンパク質は、本明細書においてそれらのアミノ酸骨格構造の点から定義される；置換基（例えば、炭水化物基）は、一般的には特定されないが、それに拘わらず、存在してよい。
【0027】
本明細書において、「アミノ末端」および「カルボキシル末端」という用語は、ポリペプチド内の位置を示すために用いられる。文脈が許容する場合、これらの用語は、ポリペプチドの特定の配列または部分を指して、近接または相対位置を示すために用いられる。例えば、ポリペプチド内のリファレンス配列のカルボキシル末端に位置する特定の配列は、リファレンス配列のカルボキシル末端に近接して存在するが、必ずしも完全長ポリペプチドのカルボキシル末端になくてもよい。
【0028】
本明細書において、「抗体」という用語は、抗原の存在への応答において身体によって産生され、抗原に結合する免疫グロブリンタンパク質、ならびにその抗原結合フラグメントおよび操作された改変体を示すために用いられる。したがって、「抗体」という用語は、例えば、インタクトなモノクローナル抗体（例えば、ハイブリドーマ技術を用いて産生された抗体）および抗原結合抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメント）を含む。遺伝的に操作されたインタクトな抗体およびフラグメント、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、リニア抗体、多価もしくは多重特異性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体等もまた含まれる。したがって、「抗体」という用語は、抗体の抗原結合部位を含み、その抗原に対して特異的に結合することのできる任意のタンパク質を含むように拡張的に用いられる。「抗体」という用語はまた、抗体それ自体（「裸の抗体」）または細胞増殖抑制薬物もしくは細胞傷害性薬物と結合体化された抗体も含む。
【0029】
「遺伝的に操作された抗体」という用語は、アミノ酸配列が天然の抗体のアミノ酸配列から変化している抗体を意味する。抗体の生成における組み換えＤＮＡ技術の妥当性により、天然の抗体に見出されるアミノ酸の配列に制限される必要はない；抗体は所望の特性を得るために再設計され得る。可能なバリエーションは、多数であり、ただ１つもしくは数アミノ酸の変化から、例えば、可変領域もしくは定常領域の完全な再設計までの範囲におよぶ。定常領域の変化は、一般的に、例えば、補体の固定、細胞との相互作用、および他のエフェクター機能といった特性を改善または変化させるために行われる。典型的には、可変領域の変化は、抗原結合の特性を改善するため、可変領域の安定性を改善するため、または免疫原性のリスクを低減するために行われる。
【0030】
「抗体の抗原結合部位」は、その抗原と結合するのに十分な抗体の部分である。そのような領域の最小限は、典型的には、可変領域またはその遺伝的に操作された改変体である。単一ドメインの結合部位は、ラクダ抗体から生成することができ（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ａｎｄ Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇ． １２：１３１－１４０，１９９９；Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ． １９：９２１－９３０，２０００を参照）、または、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）を産生する他の生物種のＶＨドメインから生成することができる（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許第６，２４８，５１６号を参照）。特定のバリエーションでは、抗原結合部位は、天然に、または非天然に（例えば、変異誘発され）存在する重鎖可変領域または軽鎖可変領域あるいはその組み合わせの、２つのみの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するポリペプチド領域である（例えば、Ｐｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：３６７－３６９，１９９３；Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２５：９２１－９２９，２００７を参照）。より一般的には、抗体の抗原結合部位は、共通のエピトープに結合する重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインの両方を含む。本発明に関して言えば、抗体は、抗原結合部位に加えて１つ以上の構成要素（例えば、抗体の第二の抗原結合部位（同一もしくは異なるエピトープに、または同一もしくは異なる抗原に結合し得る）、ペプチドリンカー、免疫グロブリン定常領域、免疫グロブリンヒンジ、両親媒性ヘリックス（Ｐａｃｋ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３１：１５７９－１５８４，１９９２を参照）、非ペプチドリンカー、オリゴヌクレオチド（Ｃｈａｕｄｒｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５０：２３－２６，１９９９を参照）、細胞増殖抑制薬物もしくは細胞傷害性薬物等）を含み得、そして、単量体または多量体タンパク質であり得る。抗体の抗原結合部位を含む分子の例は、当該分野で公知であり、例えば、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、ダイアボディ、ｄＡｂ、ミニボディ、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ融合物、二重特異性（ｓｃＦｖ）４－ＩｇＧ、および二重特異性（ｓｃＦｖ）２－Ｆａｂが挙げられる。（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
５６：３０５５－３０６１，１９９６；Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３：１３０１－１３１２，１９９６；Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８：４４９－４５４，１９９７；Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １３：３６１－３６７，２０００；およびＬｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６７：２１３－２２６，２００２．を参照。）
５６：３０５５－３０６１，１９９６；Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３：１３０１－１３１２，１９９６；Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８：４４９－４５４，１９９７；Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １３：３６１－３６７，２０００；およびＬｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６７：２１３－２２６，２００２．を参照。）
【0031】
本明細書で用いられる場合、「免疫グロブリン」という用語は、実質的に免疫グロブリン遺伝子にコードされた１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。免疫グロブリンの１つの形は、脊椎動物における天然（ｎａｔｉｖｅ）の（すなわち、天然（ｎａｔｕｒａｌ）の）抗体の基本構造単位を構成する。この形は、４量体であり、免疫グロブリン鎖の２つの同一のペアからなり、それぞれのペアは１つの軽鎖と１つの重鎖を有する。それぞれのペアにおいて、軽鎖可変領域および重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）は、共に抗原への結合の主な要因であって、そして、定常領域は抗体エフェクター機能の主な要因である。免疫グロブリンタンパク質の５つのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）が、高等脊椎動物において同定されている。ＩｇＧは、主要なクラスを含む；ＩｇＧは、通常、血漿中に見出される２番目に豊富なタンパク質として存在する。ヒトにおいて、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４という４つのサブクラスから構成される。ＩｇＧクラスの重鎖定常領域は、ギリシャ記号γを用いて同定される。例えば、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンは、γ１重鎖定常領域を含む。それぞれの免疫グロブリン重鎖は、生物種における与えられたサブクラスについて本質的に不変な定常領域タンパク質ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３；ＩｇＧ３はＣＨ４ドメインもまた含む）から構成される定常領域を有する。ヒトおよび非ヒト免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ配列は当該分野で公知である。（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ １：１１－１８，１９８１；Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：４０７１－４０７９，１９８２；Ｋｅｎｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：６６６１－６６６５，１９８２；Ｓｅｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１：７１９－７２６，１９８３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７，１９８８；Ａｍｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：２０５５－２０６５，１９８０；Ｒｕｓｃｏｎｉ ａｎｄ
Ｋｏｈｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：３３０－３３４，１９８５；Ｂｏｓｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３７９１－３８０６，１９８４；Ｂｏｔｈｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９８：３８０－３８２，１９８２；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４２：３３３－３４１，１９９５；Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ２２：１９５－２０８，１９８５；Ｋｉｎｄｓｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ １：３３５－３４３，１９８２；Ｂｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：１６５－１７４，１９８２；Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：２４５－２４９，１９９３；およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２２８を参照。）免疫グロブリンの構造および機能のレビューについては、Ｐｕｔｎａｍ，Ｔｈｅ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｖ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，４９－１４０，１９８７；およびＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１：１６９－２１７，１９９４を参照。「免疫グロブリン」という用語は、本明細書においてその一般的な意味で用いられ、文脈に依存して、インタクトの抗体、その構成要素の鎖、または鎖のフラグメントを示す。
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：２０５５－２０６５，１９８０；Ｒｕｓｃｏｎｉ ａｎｄ
Ｋｏｈｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：３３０－３３４，１９８５；Ｂｏｓｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３７９１－３８０６，１９８４；Ｂｏｔｈｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９８：３８０－３８２，１９８２；ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４２：３３３－３４１，１９９５；Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ２２：１９５－２０８，１９８５；Ｋｉｎｄｓｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ １：３３５－３４３，１９８２；Ｂｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：１６５－１７４，１９８２；Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：２４５－２４９，１９９３；およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２２８を参照。）免疫グロブリンの構造および機能のレビューについては、Ｐｕｔｎａｍ，Ｔｈｅ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｖ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，４９－１４０，１９８７；およびＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１：１６９－２１７，１９９４を参照。「免疫グロブリン」という用語は、本明細書においてその一般的な意味で用いられ、文脈に依存して、インタクトの抗体、その構成要素の鎖、または鎖のフラグメントを示す。
【0032】
全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは２１４アミノ酸）は、アミノ末端の可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸をコードする）によって、およびカルボキシル末端のカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によってコードされる。全長免疫グロブリン重鎖（約５０ｋＤａまたは４４６アミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸をコードする）およびガンマ、ミュー、アルファ、デルタもしくはイプシロン定常領域遺伝子（約３３０アミノ酸をコードする）によってコードされ、後者は、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとして定義する。軽鎖および重鎖内において、可変領域および定常領域は約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた約１０アミノ酸以上（１０ ｍｏｒｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）の「Ｄ」領域も含む。（一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．，第２版 １９８９），Ｃｈ．７を参照）。
【0033】
免疫グロブリンの軽鎖可変領域または重鎖可変領域（本明細書においてそれぞれ「軽鎖可変ドメイン」（「ＶＬドメイン」）または「重鎖可変ドメイン」（「ＶＨドメイン」）とも呼ばれる）は、３つの超可変性領域（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる）によって分断された「フレームワーク」領域から構成される。フレームワーク領域は、抗原のエピトープへの特異的結合のためにＣＤＲを整列させるように働く。したがって、「超可変領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗原結合の主な要因である抗体のアミノ酸残基をいう。アミノ末端からカルボキシル末端に、ＶＬドメインおよびＶＨドメインの両方は、以下のフレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲ領域を含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。それぞれのドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７および１９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３，１９８９の定義に従う。Ｋａｂａｔはまた、異なる重鎖の間または異なる軽鎖の間の対応する残基が同一の数字を割り当てられる、広く用いられるナンバリングの規定（Ｋａｂａｔナンバリング）を提供する。ＶＬドメインのＣＤＲ１、２および３は、それぞれ本明細書において、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３とも呼ばれる；ＶＨドメインのＣＤＲ１、２および３は、それぞれ本明細書において、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３とも呼ばれる。
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７および１９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３，１９８９の定義に従う。Ｋａｂａｔはまた、異なる重鎖の間または異なる軽鎖の間の対応する残基が同一の数字を割り当てられる、広く用いられるナンバリングの規定（Ｋａｂａｔナンバリング）を提供する。ＶＬドメインのＣＤＲ１、２および３は、それぞれ本明細書において、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３とも呼ばれる；ＶＨドメインのＣＤＲ１、２および３は、それぞれ本明細書において、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３とも呼ばれる。
【0034】
文脈が異なる意味を要求しない限り、本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体のみに限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、それが産生される方法をいうのではなく、単一のクローンに由来する抗体をいい、単一のクローンとしては、任意の真核性、原核性、またはファージクローンが挙げられる。
【0035】
リファレンスの可変ドメインに「由来する」免疫グロブリンのＶＨドメインまたはＶＬドメインは、全体的または実質的にリファレンスの可変ドメインに由来するＣＤＲの一部またはすべてを含む遺伝的に操作されたＶＨドメインまたはＶＬドメインを意味する。いくつかのバリエーションでは、得られた可変ドメインは、ヒト化ＶＨドメインまたはヒト化ＶＬドメインである。リファレンスの可変ドメインに「由来する」ＶＨドメインまたはＶＬドメインを含む抗体は、典型的には、リファレンスの可変ドメインを含む抗体の結合特性を保持している。
【0036】
「ヒト化ＶＨドメイン」または「ヒト化ＶＬドメイン」という用語は、非ヒトドナー免疫グロブリン（例えば、マウスまたはラット）に全体的または実質的に由来するＣＤＲの一部または全部、ならびにヒト免疫グロブリン配列に全体的または実質的に由来する可変ドメインフレームワーク配列を含む免疫グロブリンのＶＨドメインまたはＶＬドメインをいう。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。いくつかの例では、ヒト化抗体は、適切な結合特性を促進するためにヒト可変ドメインフレームワーク領域内にいくつかの非ヒト残基を保持する（例えば、抗体がヒト化される場合に、結合アフィニティを保存するために、フレームワーク内の変異が必要とされ得る）。
【0037】
「ヒト化抗体」は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインの１つまたは両方を含む抗体である。免疫グロブリン定常領域が存在する必要はないが、それがある場合は、ヒト免疫グロブリン定常領域に全体的または実質的に由来する。
【0038】
ヒト化抗体内のＣＤＲは、それぞれのＣＤＲの間で少なくとも６０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の対応する残基（Ｋａｂａｔによって定義されるように）が同一である場合、非ヒト抗体中の対応するＣＤＲに「実質的に由来」するという。ＣＤＲが非ヒト免疫グロブリンに実質的に由来するヒト化ＶＨドメインまたはヒト化ＶＬドメインの特定のバリエーションでは、ヒト化ＶＨドメインまたはヒト化ＶＬドメインのＣＤＲは、６以下（例えば、５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下）のアミノ酸置換（好ましくは、保存的置換）を、対応する非ヒトＶＨまたはＶＬのＣＤＲに対する全ての３つのＣＤＲにわたって有する。抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインの可変領域フレームワーク配列、あるいは、存在するならば免疫グロブリン定常領域の配列は、Ｋａｂａｔによって定義される対応する残基の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が同一である場合、ヒトＶＨフレームワーク配列またはヒトＶＬフレームワーク配列あるいはヒト定常領域に、それぞれ「実質的に由来」する。したがって、ＣＤＲを除くヒト化抗体の全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分に全体的または実質的に由来する。
【0039】
抗体は、典型的には単離された形態で提供される。これは、抗体は、典型的には、その生産または精製によって生じる干渉タンパク質および他の夾雑物の少なくとも５０％ｗ／ｗ純度であることを意味するが、該抗体が、その利用を容易にすることを意図する薬学的に許容可能なキャリアまたは他のビヒクルの過剰と組み合わせられる可能性を除外するものではない。抗体は、時には、生産または精製に由来する干渉タンパク質および夾雑物の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５または９９％ｗ／ｗ純度である。
【0040】
抗体のその標的抗原への特異的結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ－１のアフィニティを意味する。特異的結合は、少なくとも１つの無関係な標的に対して起こる非特異的結合から、規模において検出可能なほど高く、区別可能である。特異的結合は、特定の官能基の間の結合または特定の空間的適合（例えば、鍵と鍵穴型）の形成の結果であり得るが、それに対して、非特異的結合は、通常ファンデルワールス力の結果である。
【0041】
「エピトープ」という用語は、抗原上の抗体が結合する部位をいう。エピトープは、連続するアミノ酸、または１つ以上のタンパク質の３次フォールディングによって並置される非連続のアミノ酸から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露においても保持されるが、それに対して、３次フォールディングから形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒による処置において失われる。エピトープは、典型的には、少なくとも３つ、より一般的には少なくとも５つまたは８～１０個のアミノ酸を特有の空間的コンフォメーション中に含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ｉｎ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照。
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照。
【0042】
同一の、または重複するエピトープを認識する抗体が、標的抗原に対する他の抗体の結合に対して競合するある抗体の能力を示す単純なイムノアッセイにおいて同定され得る。抗体のエピトープは、接触残基を同定するためにその抗原に結合された抗体のＸ線結晶学によってもまた定義され得る。あるいは、抗原におけるある抗体の結合を低減または消滅させるアミノ酸変異の全てが、他の抗体の結合を低減または消滅させる場合、２つの抗体は同一のエピトープを有する（ただし、そのような変異は抗原構造における全体的な変化をもたらすものではないという条件で）。ある抗体の結合を低減または消滅させるアミノ酸変異の一部が、他の抗体の結合を低減または消滅させる場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
【0043】
抗体間の競合は、試験下の抗体が、リファレンス抗体の共通の抗原に対する特異的結合を阻害するアッセイによって、測定される（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０：１４９５，１９９０を参照）。試験抗体の過剰（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍）が、競合的結合アッセイにおいて測定されるリファレンス抗体の結合を、少なくとも５５％、しかし好ましくは７５％、９０％または９９％の割合で阻害する場合、試験抗体はリファレンス抗体と競合する。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）は、リファレンス抗体と同一のエピトープに結合する抗体、および立体障害が生じる程度にリファレンス抗体が結合するエピトープと十分に近接した近隣のエピトープに結合する抗体を含む。競合アッセイによって同定される抗体はまた、標的タンパク質のコンフォメーションの変化をもたらすことで間接的にリファレンス抗体と競合する抗体であって、それにより試験抗体が結合するエピトープと異なるエピトープへのリファレンス抗体の結合を妨げる抗体も含む。
【0044】
「発現ユニット」および「発現カセット」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、そして、目的のポリペプチドをコードする核酸セグメントであって、宿主細胞中で核酸セグメントの発現を提供することができる核酸セグメントを示す。発現ユニットは、典型的には、転写プロモーター、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、および転写ターミネーターを、全て作動可能なコンフィギュレーションで含む。転写プロモーターおよびターミネーターに加えて、発現ユニットは、他の核酸セグメント（例えば、エンハンサーまたはポリＡ化シグナル）をさらに含み得る。
【0045】
本明細書で用いられる場合、「発現ベクター」という用語は、１つ以上の発現ユニットを含む、直鎖上または環状の核酸分子をいう。１つ以上の発現ユニットに加えて、発現ベクターは、追加的な核酸セグメント（例えば、１つ以上の複製の起点または１つ以上の選択可能マーカー）もまた含み得る。発現ベクターは、一般的に、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来する、あるいは、両方の要素を含み得る。
【0046】
本明細書で説明されるタンパク質に関して、配列番号で特定されるアミノ酸残基と対応するアミノ酸残基への参照は、そのような残基の翻訳後改変体を含む。
【0047】
「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物の被検体を含む。
【0048】
「有効量」という用語は、本明細書で説明される抗ＮＴＢ－Ａ抗体の投与によるＮＴＢ－Ａ発現性の障害の処置に関しては、ＮＴＢ－Ａ発現性の障害の発生を妨げるか、または１つ以上の症状を改善するのに十分なそのような抗体の量をいう。抗体の有効量は、「効果的なレジメン」における本発明の方法に従って投与される。「効果的なレジメン」という用語は、障害の予防的または治療的処置を実現するために適当な、投与される抗体の量および投薬頻度の組み合わせをいう。
【0049】
アミノ酸置換を、保存的または非保存的として分類するために、以下のアミノ酸置換は保存的置換と考える：トレオニン、アラニン、またはアスパラギンによって置換されるセリン；プロリンまたはセリンによって置換されるトレオニン；アスパラギン酸、ヒスチジン、またはセリンによって置換されるアスパラギン；グルタミン酸またはアスパラギンによって置換されるアスパラギン酸；グルタミン、リシン、またはアスパラギン酸によって置換されるグルタミン酸；アルギニン、リシン、またはグルタミン酸によって置換されるグルタミン；チロシンまたはアスパラギンによって置換されるヒスチジン；リシンまたはグルタミンによって置換されるアルギニン；イソロイシン、ロイシン、またはバリンによって置換されるメチオニン；ロイシン、バリン、またはメチオニンによって置換されるイソロイシン；バリン、イソロイシン、またはメチオニンによって置換されるロイシン；チロシンまたはトリプトファンによって置換されるフェニルアラニン；トリプトファン、ヒスチジン、またはフェニルアラニンによって置換されるチロシン；トレオニンによって置換されるプロリン；セリンによって置換されるアラニン；グルタミン酸、グルタミン、またはアルギニンによって置換されるリシン；メチオニン、イソロイシン、またはロイシンによって置換されるバリン；およびフェニルアラニンまたはチロシンによって置換されるトリプトファン。保存的置換はまた、同一のクラスのアミノ酸の間の置換も意味する。クラスは以下の通りである：グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖方向に影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族性側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【0050】
２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大限一致するように整列された際に同一である場合、２つのアミノ酸配列は、「１００％のアミノ酸配列同一性」を有する。配列比較は、標準的なソフトウェアプログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって製作された、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューター処理スイートに含まれるプログラム）を用いて行うことができる。最適整列を決定することにより、２つの核酸配列またはアミノ酸配列を比較する他の方法は、当業者に周知である。（例えば、Ｐｅｒｕｓｋｉ ａｎｄ Ｐｅｒｕｓｋｉ，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２３－１５１中の、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），“Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９７）；Ｂｉｓｈｏｐ（ｅｄ．），Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．
１９９８）を参照。）２つのアミノ酸配列は、２つの配列が互いに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する場合、「実質的配列同一性」を有すると考えられる。
１９９８）を参照。）２つのアミノ酸配列は、２つの配列が互いに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する場合、「実質的配列同一性」を有すると考えられる。
【0051】
パーセント配列同一性は、Ｋａｂａｔナンバリング規定によって最大限整列された抗体配列によって決定される。整列の後、対象の抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の可変領域全体）がリファレンス抗体の同一の領域と比較された場合、対象の抗体領域およびリファレンス抗体領域の間のパーセント配列同一性は、対象の抗体領域およびリファレンス抗体領域両方において同一のアミノ酸に占められる位置の数を、ギャップはカウントせずに、２つの領域の整列された位置の総数で割り、パーセントに変換するために１００を掛けたものである。
【0052】
１つ以上の言及された要素を「含む」組成物または方法は、特に言及されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を含む組成物は、抗体を単独で、または他の成分と組み合わせて含み得る。
【0053】
値の範囲の指定は、該範囲内の、またはそれを定義する全ての整数を含む。
【0054】
抗体のエフェクター機能は、ＩｇのＦｃ領域の寄与による機能をいう。そのような機能は、例えば、抗体依存性細胞傷害、抗体依存性細胞貪食、または補体依存性細胞傷害であり得る。そのような機能は、例えば、貪食もしくは溶解活性を有する免疫細胞上のＦｃレセプターへのＦｃ領域の結合によって、または補体系の成分へのＦｃ領域の結合によってもたらされ得る。典型的には、Ｆｃ結合細胞または補体成分によって媒介される効果は、ＮＴＢ－Ａ標的細胞の阻害および／または除去をもたらす。抗体のＦｃ領域は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）発現細胞を集め得、それらを抗体に覆われた標的細胞と並置し得る。ＩｇＧについての表面ＦｃＲ（ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩ１（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ６４）を含む）を発現する細胞は、ＩｇＧで覆われた細胞の破壊についてエフェクター細胞として働き得る。そのようなエフェクター細胞としては、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球および好酸球が挙げられる。ＩｇＧによるＦｃγＲの係合は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を活性化させる。ＡＤＣＣは、膜孔形成タンパク質およびプロテアーゼの分泌を介してＣＤ１６＋エフェクター細胞によって媒介され、他方で、貪食は、ＣＤ３２＋およびＣＤ６４＋エフェクター細胞によって媒介される（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｐａｕｌ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｎ．Ｙ．，１９９７，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３，１７および３０；Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９：１６５９－６９，２００４；Ａｋｅｗａｎｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１：４０６１－６５，２００１；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． ５３：１９９－２０７，１９９９を参照）。ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰに加えて、細胞結合抗体のＦｃ領域はまた、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発する補体古典経路も活性化させ得る。補体系のＣ１ｑは、抗体が抗原と複合体となっている場合に、抗体のＦｃ領域に結合する。細胞結合抗体へのＣ１ｑの結合は、Ｃ３コンベルターゼを生成するＣ４およびＣ２のタンパク質分解活性化を含む事象のカスケードを開始し得る。Ｃ３コンベルターゼによるＣ３ｂへのＣ３の切断は、終末補体成分（Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９を含む）の活性化を可能にする。集合的に、これらのタンパク質は、抗体に覆われた細胞上に膜侵襲複合体孔を形成する。これらの孔は、細胞膜の完全性を破壊し、標的細胞を死滅させる（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ ｅｄ．，Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．， ２００５，Ｃｈａｐｔｅｒ ２を参照）。
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｐａｕｌ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｎ．Ｙ．，１９９７，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３，１７および３０；Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９：１６５９－６９，２００４；Ａｋｅｗａｎｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６１：４０６１－６５，２００１；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． ５３：１９９－２０７，１９９９を参照）。ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰに加えて、細胞結合抗体のＦｃ領域はまた、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発する補体古典経路も活性化させ得る。補体系のＣ１ｑは、抗体が抗原と複合体となっている場合に、抗体のＦｃ領域に結合する。細胞結合抗体へのＣ１ｑの結合は、Ｃ３コンベルターゼを生成するＣ４およびＣ２のタンパク質分解活性化を含む事象のカスケードを開始し得る。Ｃ３コンベルターゼによるＣ３ｂへのＣ３の切断は、終末補体成分（Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９を含む）の活性化を可能にする。集合的に、これらのタンパク質は、抗体に覆われた細胞上に膜侵襲複合体孔を形成する。これらの孔は、細胞膜の完全性を破壊し、標的細胞を死滅させる（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ ｅｄ．，Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．， ２００５，Ｃｈａｐｔｅｒ ２を参照）。
【0055】
「抗体依存性細胞傷害」（または「ＡＤＣＣ」とも）という用語は、抗体に覆われた標的細胞と、溶解活性を有する免疫細胞（エフェクター細胞とも呼ばれる）との相互作用に依存して細胞死を誘導する機構である。そのようなエフェクター細胞としては、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージおよび好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、標的細胞に結合したＩｇのＦｃ領域に、抗原結合部位を介して付着する。抗体に覆われた標的細胞の死は、エフェクター細胞活性の結果として生じる。
【0056】
「抗体依存性細胞貪食」（または「ＡＤＣＰ」とも）という用語は、抗体に覆われた細胞が、ＩｇのＦｃ領域に結合する貪食免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球および樹状細胞）によって、全体的または部分的に取り込まれる過程をいう。
【0057】
「補体依存性細胞傷害」（または、「ＣＤＣ」とも）という用語は、最終的には標的細胞膜中の孔の形成に至る一連の酵素反応を、標的に結合した抗体のＦｃ領域が活性化させる、細胞死を誘導する機構をいう。典型的には、抗原－抗体複合体（例えば、抗体に覆われた標的細胞上の抗原－抗体複合体）は、補体成分Ｃ１ｑに結合して活性化させ、続いてＣ１ｑが、標的細胞死を引き起こす補体カスケードを活性化させる。補体の活性化は、標的細胞表面上の補体成分の堆積もまた引き起こし得、そのため、白血球上の補体レセプター（例えば、ＣＲ３）と結合することにより、ＡＤＣＣが促進される。
【0058】
「細胞傷害性効果」は、標的細胞の除去、消滅および／または死滅をいう。「細胞傷害性作用物質」は、細胞に対して細胞傷害性効果を有する作用物質をいう。細胞傷害性作用物質は、抗体と結合体化され得る、または抗体と組み合わせて投与され得る。
【0059】
「細胞増殖抑制効果」は、細胞の増殖の阻害をいう。「細胞増殖抑制作用物質」は、細胞に対して細胞増殖抑制効果を有し、それにより、細胞の特定のサブセットの成長および／または拡大を阻害する作用物質をいう。細胞増殖抑制作用物質は、抗体と結合体化され得る、または抗体と組み合わせて投与され得る。
【0060】
「薬学的に許容可能」という用語は、動物における使用、そしてより具体的にはヒトにおける使用について、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されている、もしくは承認可能な、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識される薬局方に挙げられていることを意味する。「薬学的に適合性の成分」という用語は、抗ＮＴＢ－Ａ抗体と共に製剤化される薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。
【0061】
「薬学的に許容可能な塩」という句は、抗ＮＴＢ－Ａ抗体もしくはその結合体または抗ＮＴＢ－Ａ抗体と共に投与される作用物質の薬学的に許容可能な有機塩または無機塩をいう。代表的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐトルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１，１’メチレン ビス－（２ ヒドロキシ ３ ナフトエート））が挙げられる。薬学的に許容可能な塩は、他の分子（例えば、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオン）の包含を含み得る。対イオンは、親の化合物上の電荷を安定させる任意の有機部分または無機部分であり得る。さらに、薬学的に許容可能な塩は、電荷を帯びた複数の原子をその構造中に有し得る。電荷を帯びた複数の原子が薬学的に許容可能な塩の部分であるような例は、複数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に許容可能な塩は、電荷を帯びた１つ以上の原子および／または１つ以上の対イオンを有し得る。
【0062】
文脈から異なることが明らかでない限り、値が「約（ａｂｏｕｔ）」Ｘまたは「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」Ｘとして表現される場合、Ｘの述べられた値は、±１０％までの正確さであることが理解される。
【0063】
グリコシル化は、抗体を発現させるために使用される宿主細胞に依存する。潜在的な治療剤としての組み換え抗体の発現に用いられる細胞のタイプが天然細胞であることは稀であるため、非天然細胞において組み換え的に発現した抗体と、それらの天然細胞において発現した同一のプライマリの重鎖および軽鎖の配列の抗体との間で、抗体のグリコシル化パターンにおける著しいバリエーションが生じ得る。げっ歯類起源の哺乳動物細胞株（例えば、ＳＰ２／０、ＣＨＯまたはＢＨＫ）は、ヒトのグリコシル化とある程度の類似性を有するグリコシル化を与えることができる。しかしながら、いくつかのヒト構成要素は失われ得（例えば、２，６－結合シアル化）、そして、通常ヒトには見出されない他の構成要素が多数存在し得る（例えば、ヒト細胞には通常存在しない末端シアル酸（例えば、ＮｅｕＧｃ）またはヒト細胞には通常存在しない形で他のガラクトースに連結された末端ガラクトース（Ｇａｌ－Ｇａｌ構造））。ＣＨＯ細胞において発現した組み換えＩｇＧは、マウス骨髄腫細胞において発現した組み換え免疫グロブリンと比較して、一般的にガラクトシル化の程度が低い。したがって、ＣＨＯ細胞において産生された組み換えＩｇＧは、マウス骨髄腫細胞株において産生されるｒＩｇＧと比較してより高いレベルのＧ０グリカンを含み得る。
【0064】
抗体のグリコシル化構造は、従来の炭水化物分析の技術によって分析することができ、炭水化物分析の技術としては、レクチンクロマトグラフィー、ＮＭＲ、質量分析法、ＨＰＬＣ、ゲル浸透クロマトグラフィー、単糖組成分析、逐次酵素消化、および電荷に基づいてオリゴ糖を分離するために高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィーを用いる、パルス電流測定検出を有する高性能アニオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。分析的な目的のためにオリゴ糖を遊離させる方法としては、酵素的処理（一般的にペプチドＮ－グリコシダーゼ Ｆ／エンド－ ベータ－ガラクトシダーゼを用いて行われる）、主にＯ－連結構造を遊離させるために過酷なアルカリ環境を用いる排出、ならびにＮ－およびＯ－連結オリゴ糖の両方を遊離させるために無水ヒドラジンを用いる化学的方法が挙げられる。
【0065】
したがって、組み換え的に発現した抗体のグリコシル化パターンは、発現の行われる細胞のタイプ（例えば、ＣＨＯ）の特性であり得、そして、上記の技術のいずれによっても、他の細胞タイプ、特に他の生物種の細胞（例えば、マウスおよびヒト）からのものと区別可能に異なり得る。
【0066】
詳細な説明
Ｉ．総論
本発明は、ＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する抗体を提供する。前記抗体は、例えば、様々なＮＴＢ－Ａ発現性のがんの処置および診断に、ならびにＮＴＢ－Ａの検出（例えば、細胞上のＮＴＢ－Ａ発現の検出）に有用である。本発明の抗体を用いた、そのような処置、診断、およびＮＴＢ－Ａ検出の方法もまた提供される。
Ｉ．総論
本発明は、ＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する抗体を提供する。前記抗体は、例えば、様々なＮＴＢ－Ａ発現性のがんの処置および診断に、ならびにＮＴＢ－Ａの検出（例えば、細胞上のＮＴＢ－Ａ発現の検出）に有用である。本発明の抗体を用いた、そのような処置、診断、およびＮＴＢ－Ａ検出の方法もまた提供される。
【0067】
本発明はまた、ＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）を用いた、多発性骨髄腫を処置する方法も提供する。抗ＮＴＢ－Ａ ＡＤＣを用いた多発性骨髄腫細胞の死滅を実証したのは、本発明者らが最初であると考えられる。多発性骨髄腫の処置のための抗ＮＴＢ－Ａ ＡＤＣは、例えば、本明細書で説明される抗ＮＴＢ－Ａ抗体を含むＡＤＣを含み得る。１つの局面では、前記方法は、ヒトＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する抗体であって、細胞傷害性作用物質と結合体化された抗体を、必要とする患者に投与する工程を含む。
【0068】
ＩＩ．標的分子
異なって指示されない限り、ＮＴＢ－Ａは、ヒトＮＴＢ－Ａを意味する。代表的なヒト配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９６ＤＵ３を割り当てられている。４つのスプライシングバリアントのアイソフォームが公知である。成熟細胞外領域は、Ｑ９６ＤＵ３の残基２２～２２６の範囲にある。
異なって指示されない限り、ＮＴＢ－Ａは、ヒトＮＴＢ－Ａを意味する。代表的なヒト配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９６ＤＵ３を割り当てられている。４つのスプライシングバリアントのアイソフォームが公知である。成熟細胞外領域は、Ｑ９６ＤＵ３の残基２２～２２６の範囲にある。
【0069】
文脈からそうでないことが明らかではない限り、ＮＴＢ－Ａへの参照は、少なくともタンパク質の細胞外ドメインを意味し、そして、通常は切断シグナルペプチド（Ｑ９６ＤＵ３のアミノ酸１～２１）を除く完全長タンパク質を意味する。
【0070】
ＩＩＩ．本発明の抗体
１つの局面では、本発明は、成熟ＮＴＢ－Ａ細胞外領域のエピトープ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９６ＤＵ３のアミノ酸残基２２～２２６内に存在するエピトープ）に対して特異的に結合する単離された抗ＮＴＢＡ抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明に従った抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、ヒトＮＴＢ－Ａ抗原への結合について、本発明者らによって同定および単離された抗ＮＴＢ－Ａ ｍＡｂと同一のＶＨ／ＶＬドメインを有するモノクローナル抗体と競合することができる。特定の局面では、本発明に従った抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、本明細書で同定されるようなマウス抗体、またはそのキメラ形態もしくはヒト化形態である。
１つの局面では、本発明は、成熟ＮＴＢ－Ａ細胞外領域のエピトープ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９６ＤＵ３のアミノ酸残基２２～２２６内に存在するエピトープ）に対して特異的に結合する単離された抗ＮＴＢＡ抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明に従った抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、ヒトＮＴＢ－Ａ抗原への結合について、本発明者らによって同定および単離された抗ＮＴＢ－Ａ ｍＡｂと同一のＶＨ／ＶＬドメインを有するモノクローナル抗体と競合することができる。特定の局面では、本発明に従った抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、本明細書で同定されるようなマウス抗体、またはそのキメラ形態もしくはヒト化形態である。
【0071】
その標的抗原に対する抗体のアフィニティを測定する１つの方法は、抗体の見かけ上の解離定数を測定することによる。いくつかの局面では、本明細書で説明される抗体は、０．１ｎＭから１０ｎＭ、好ましくは０．１ｎＭから５ｎＭ、さらに好ましくは０．１ｎＭから２ｎＭまたは０．１ｎＭから１ｎＭの範囲内の、ＮＴＢ－Ａに対する見かけ上の解離定数（ｋｄ）を有する。
【0072】
ｍＡｂ１１Ａ１というマウス抗ＮＴＢ－Ａモノクローナル抗体が、同定および特性評価された。マウス１１Ａ１抗体は、ＩｇＧ１抗体である。ｍＡｂ１１Ａ１は、ＮＴＢ－Ａの完全長細胞外領域（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９６ＤＵ３の残基２２～２２６）に対して０．１３ｎＭのｋｄで結合するが、ＮＴＢ－Ａアイソフォーム４（アクセッション番号Ｑ９６ＤＵ３の残基１８～１２８が喪失）には結合しないことが見出された。ｍＡｂ２６Ｂ７という第二の抗体もまた、同定および特性評価された。ｍＡＢ２６Ｂ７は、競合的結合アッセイ（実施例５を参照）において、ヒトＮＴＢ－Ａへの結合について、ｍＡｂ１１Ａ１と競合することが見出され、そして、ＮＴＢ－Ａに対して０．１６ｎＭのｋｄで結合した。マウスｍＡｂ１１Ａ１および２６Ｂ７のそれぞれについてのＶＨ、ＶＬ、およびＶＨ／ＶＬのＫａｂａｔＣＤＲアミノ酸配列が決定され、以下の表１および表２に示される。１１Ａ１抗体および２６Ｂ７抗体は、カニクイザルＮＴＢ－Ａに結合しなかった。
【表1】
【0073】
したがって、特定の実施態様では、本発明は、（ｉ）配列番号１の残基２０～１３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび（ｉｉ）配列番号２の残基２１～１４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む単離されたマウス（抗体）、またはそのキメラもしくはヒト化形態を提供する。マウス抗体と同様に、そのキメラもしくはヒト化形態はヒトＮＴＢ－Ａに結合するが、カニクイザルＮＴＢ－Ａには結合しない。
【0074】
特定の実施態様では、本発明は、ヒトＮＴＢ－Ａに対する特異的結合について（ｉ）配列番号１の残基２０～１３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび（ｉｉ）配列番号２の残基２１～１４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と競合する、単離された抗体を提供する。
【0075】
本発明はさらに、（ａ）配列番号１の残基２０～１３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２の残基２１～１４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、あるいは（ｂ）配列番号３の残基２０～１３７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号４の残基２１～１２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むｍＡｂと同一のヒトＮＴＢ－Ａのエピトープに対して特異的に結合する、単離された抗体を提供する。特定のバリエーションでは、抗体は、（ｉ）Ｘ線共結晶解析、（ｉｉ）アレイ型オリゴペプチドスキャニング（時には、重複ペプチドスキャンまたはペップスキャン分析とも呼ばれる）、（ｉｉｉ）部位指向性変異導入（例えば、アラニンスキャニング変異導入）、および（ｉｖ）Ｈ／Ｄ交換質量分析から選択されるエピトープマッピングの方法によって決定される、前述のｍＡｂと同一のヒトＮＴＢ－Ａのエピトープに結合する。これらのエピトープマッピングの方法は、当該分野で周知であり、本発明に従って容易に用いることができる。
【0076】
本発明はまた、ヒトＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する単離された抗体であって、（ｉ）配列番号１の残基２０～１３５または配列番号３の残基２０～１３７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；および／または（ｉｉ）配列番号２の残基２１～１４０または配列番号４の残基２１～１２８と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、単離された抗体も提供する。典型的には、抗体が重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方を含む場合、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、表１の同一のリファレンス抗体に対応する（すなわち、典型的には、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、それぞれ配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０と、あるいはそれぞれ配列番号３の残基２０～１３７および配列番号４の残基２１～１２８と、特定された配列同一性を有する）。
【0077】
本発明はまださらに、ヒトＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する単離された抗体であって、（ｉ）配列番号１の残基２０～１３５または配列番号３の残基２０～１３７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインに由来するＶＨドメイン、および／または（ｉｉ）配列番号２の残基２１～１４０または配列番号４の残基２１～１２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインに由来するＶＬドメインを含む、単離された抗体を提供する。例えば、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、（ａ）配列番号１の残基２０～１３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび／または配列番号２の残基２１～１４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、あるいは（ｂ）配列番号３の残基２０～１３７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび／または配列番号４の残基２１～１２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインに、それぞれ由来し得る。得られたＶＨドメインまたはＶＬドメインの可変ドメインフレームワーク配列は、リファレンス配列の免疫グロブリン配列（例えば、異なる生物種（例えば、ヒト）に由来する免疫グロブリン配列）と異なる免疫グロブリン配列に、全体的または実質的に由来し得る。したがって、特定の実施態様では、本発明は、本明細書でさらに説明されるように、上記（ａ）または（ｂ）で特定されるＶＨドメインおよびＶＬドメインの１つまたは両方に由来する、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインの１つまたは両方を含むヒト化抗体を提供する。必ずではないが典型的には、ヒト化抗体は、ヒト可変ドメインフレームワーク領域内に、ドナー生物種由来のいくつかの非ヒト残基を保持する。
【0078】
本発明はまださらに、ＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号５（ＣＤＲ１）、配列番号６（ＣＤＲ２）、および配列番号７（ＣＤＲ３）で明らかにされる相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに配列番号８（ＣＤＲ４）、配列番号９（ＣＤＲ５）、および配列番号１０（ＣＤＲ６）で明らかにされる軽鎖ＣＤＲ配列を含み、それぞれのＣＤＲ中に０、１、２または３か所の保存的アミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を提供する。いくつかの局面では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。いくつかの局面では、それぞれのＣＤＲ中には０または１か所の保存的アミノ酸置換が存在する。そのような抗体は、例えば、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体であり得る。
【0079】
本発明はまださらに、ＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号１１（ＣＤＲ１）、配列番号１２（ＣＤＲ２）、および配列番号１３（ＣＤＲ３）で明らかにされる相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）決定領域（ＣＤＲ）配列、ならびに配列番号１４（ＣＤＲ４）、配列番号１５（ＣＤＲ５）、および配列番号１６（ＣＤＲ６）で明らかにされる軽鎖ＣＤＲ配列を含み、それぞれのＣＤＲ中に０、１、２または３か所の保存的アミノ酸置換を有するモノクローナル抗体を提供する。いくつかの局面では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。そのような抗体は、例えば、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはベニヤ化抗体であり得る。
【0080】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の方法によって、特異的結合についてアッセイされ得る。用いることができるイムノアッセイとしては、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素アッセイ、ゲル拡散沈降素アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、および補体固定アッセイといった技術を用いたアッセイシステムが挙げられるが、それに限定されない。そのようなアッセイはありふれたものであり、当該分野で周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，１９８８）において説明されるアッセイのようなありふれたアッセイもまた行われ得る。加えて、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は、モノクローナル抗体の結合分析に普通に用いられる多様な表面プラズモン共鳴アッセイ方式の単に１つである。他の参考（例えば、Ｔｈｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ Ｍｏｒｒｉｓ ｅｄ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）において、抗体を結合するために用いることができる方法であって、抗体のＮＴＢ－Ａに対する結合特異性に関して比較可能な情報を提供することが期待される代替の方法が説明される。
【0081】
抗体が、ヒトＮＴＢ－Ａに対する特異的結合について、１１Ａ１ｍＡｂのＶＨドメインおよびＶＬドメイン（すなわち、配列番号１の残基２０～１３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２の２１～１４０残基に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン）を含むｍＡｂと競合するかを評価するため、以下の競合的結合アッセイが用いられる。
【0082】
このアッセイは、１１Ａ１マウスＩｇＧ１抗体（すなわち、天然の抗体の二価構造中の１１Ａ１ＶＨドメインおよびＶＬドメイン）を含む「リファレンス抗体」を利用する。ＮＴＢ－Ａ陽性Ｒａｍｏｓ細胞が、９６ウェルＶ底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中に、ウェルあたり２×１０５細胞で蒔かれる。２倍濃縮抗体（２０μｇ／ｍｌが、非標識サンプル抗体の２倍開始濃度である）の５倍連続希釈が、その０．０１８８μｇ／ｍＬのＫｄ値の２倍の濃度（０．０３７６μｇ／ｍＬ）の、ＡＦ６４７標識１１Ａ１マウス抗体の２倍定常濃縮物を含むＦＡＣｓバッファー（ＰＢＳ＋２％ ウシ胎児血清＋０．０２％ アジ化ナトリウム）中で調製される。抗体溶液は、光から保護されながら、細胞と共に１時間氷上でインキュベートされる。細胞は、ＦＡＣｓバッファーで２回洗浄され、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析される。データは、最大の結合に対するパーセントとして表される。サンプル抗体が、リファレンス抗体のＮＴＢ－Ａへの結合を、非標識サンプル抗体の１０μｇ／ｍｌの濃度において最大の結合の４５％より低い（すなわち、０から４５％）レベルまで低減させる場合、サンプル抗体は、ＮＴＢ－Ａへの特異的結合について標識リファレンス抗体と「競合」する。いくつかの局面では、サンプル抗体が、非標識サンプル抗体の１０μｇ／ｍｌの濃度において最大の結合の３０％より低いレベルまでリファレンス抗体のＮＴＢ－Ａへの結合を低減させる場合、抗体は結合について競合する。いくつかの局面では、サンプル抗体が、非標識サンプル抗体の１０μｇ／ｍｌの濃度において最大の結合の２０％より低いレベルまでリファレンス抗体のＮＴＢ－Ａへの結合を低減させる場合、抗体は結合について競合する。いくつかの局面では、サンプル抗体が、非標識サンプル抗体の１０μｇ／ｍｌの濃度において最大の結合の１０％より低いレベルまでリファレンス抗体のＮＴＢ－Ａへの結合を低減させる場合、抗体は結合について競合する。いくつかの局面では、サンプル抗体が、非標識サンプル抗体の１０μｇ／ｍｌの濃度において最大の結合の５％より低いレベルまでリファレンス抗体のＮＴＢ－Ａへの結合を低減させる場合、抗体は結合について競合する。いくつかの局面では、サンプル抗体が、非標識サンプル抗体の１０μｇ／ｍｌの濃度において最大の結合の２％より低い、また１％より低いレベルまでリファレンス抗体のＮＴＢ－Ａへの結合を低減させる場合、抗体は結合について競合する。図２から理解することができるように、マウス１１Ａ１抗体は、結合について、それ自身および２６Ｂ７抗体と競合する。１１Ａ１抗体は、結合についてＮＴ－７抗体と競合しない。
【0083】
いくつかの実施態様では、抗ＮＴＢＡ抗体は、表１に挙げられた抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインと実質的に同一である重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインを含む。
【0084】
したがって、特定の実施態様では、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、（ａ）表１に挙げられたＶＨドメインのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である重鎖可変ドメインならびに／あるいは（ｂ）表１に挙げられたＶＬドメインのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である軽鎖可変ドメインを有する。特定のバリエーションでは、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、（ａ）表１に挙げられたＶＨドメインのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および／または（ｂ）表１に挙げられたＶＬドメインのアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。抗体が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方を含むいくつかの実施態様では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、表１の同一のリファレンス抗体と対応する。例えば、より具体的なバリエーションでは、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、以下のＶＨ／ＶＬ配列ペアから選択されるそれぞれのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む：（Ｉ）配列番号１の残基２０～１３５および配列番号２の残基２１～１４０；ならびに（ＩＩ）配列番号３の残基２０～１３７および配列番号４の残基２１～１２８。
【0085】
いくつかの実施態様では、本発明の抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、表１に挙げられる抗ＮＴＢ－Ａ抗体の１つ以上のＣＤＲを含む。表１のＶＨドメインおよびＶＬドメインのＫａｂａｔＣＤＲは、以下の表２においても明らかにされる。
【表2】
【0086】
例えば、特定のバリエーションでは、抗体は、表１に挙げられる抗体の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３領域のうちの少なくとも１つ）および／または対応する軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３領域のうちの少なくとも１つ）を含む。典型的な実施態様では、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、表１に挙げられた抗体の、２つもしくは３つの重鎖ＣＤＲおよび／または２つもしくは３つの軽鎖ＣＤＲを有する。いくつかのバリエーションでは、抗ＮＴＢ－Ａ抗体が、表１に挙げられる抗体の少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを有する場合に、抗体は少なくとも１つの対応する軽鎖ＣＤＲをさらに含む。
【0087】
特定のバリエーションでは、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、重鎖および／または軽鎖可変ドメインを含み、重鎖および／または軽鎖可変ドメインは、（ａ）表１に挙げられる抗体について示される重鎖および／または軽鎖ＣＤＲと対応する３つのＣＤＲのセット、および（ｂ）４つのフレームワーク領域のセットを有する。例えば、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、重鎖および／または軽鎖可変ドメインを含み得、重鎖または軽鎖可変ドメインは、（ａ）３つのＣＤＲのセットであって、表１に挙げられる抗体に由来するＣＤＲのセット、および（ｂ）４つのフレームワーク領域のセットであって、表１に挙げられる同一の抗体のフレームワーク領域のセットと同一である、またはそれと異なる（例えば、ヒトフレームワーク領域に由来する）フレームワーク領域のセットを有する。
【0088】
特定のバリエーションでは、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、（Ｉ）（ａ）表１に挙げられる抗体について示される重鎖ＣＤＲと対応する３つのＣＤＲのセット、および（ｂ）４つのフレームワーク領域のセットを有する重鎖可変ドメイン；ならびに（ＩＩ）表１に挙げられる抗体について示される軽鎖ＣＤＲと対応する３つのＣＤＲのセット、および（ｂ）４つのフレームワーク領域のセットを有する軽鎖可変ドメインの両方を含む。典型的な実施態様では、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲの両方は、表１に挙げられる同一の抗体に由来する。
【0089】
いくつかの実施態様では、本発明に従う抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、表１に挙げられるＶＬまたはＶＨドメインのＣＤＲに対して０、１、２、３、または４か所のアミノ酸置換（好ましくは、保存的置換）を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。特定のバリエーションでは、例えば、本発明に従う抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、ＣＤＲ１－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３の重鎖ＣＤＲを含み、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ２－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３のうち少なくとも１つは、表１に挙げられるＶＨドメインに対して０、１、２、３、または４か所のアミノ酸置換（好ましくは、保存的置換）を含む。他のバリエーションでは、本発明に従う抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、ＣＤＲ１－Ｌ１、ＣＤＲ２－Ｌ２、およびＣＤＲ３－Ｌ３の軽鎖ＣＤＲを含み、ＣＤＲ１－Ｌ１、ＣＤＲ２－Ｌ２、およびＣＤＲ３－Ｌ３のうち少なくとも１つは、表１に挙げられるＶＬドメインに対して０、１、２、３、または４か所のアミノ酸置換（好ましくは、保存的置換）を含む。特定の実施態様では、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、上記の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのセットの両方を含む。特に適切な抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、ＣＤＲ１－Ｌ１、ＣＤＲ２－Ｌ２、およびＣＤＲ３－Ｌ３のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインならびにＣＤＲ１－Ｈ１、ＣＤＲ２－Ｈ２、およびＣＤＲ３－Ｈ３のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含み、重鎖および軽鎖ＣＤＲの該セットは、表１に挙げられるＶＨドメインおよびＶＬドメインのＣＤＲに対して、６か所以下、典型的には５か所以下、より典型的には４か所以下、そして最も典型的には３か所以下のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）を有する；いくつかのそのようなバリエーションでは、６か所以下のアミノ酸置換は、表１に挙げられる同一の抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのＣＤＲに対するものである。
【0090】
特定の実施態様では、本発明の抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、表１に挙げられるＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインにそれぞれ由来するヒト化ＶＨドメインおよび／またはヒト化ＶＬドメインを含む。特定のバリエーションでは、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、表１に挙げられるＶＨドメインおよびＶＬドメインにそれぞれ由来するヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインの両方を含む。典型的には、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインは、表１に挙げられる同一の抗体に由来する。
【0091】
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体のＣＤＲを、ヒト「アクセプター」抗体配列中に移植した、遺伝的に操作された抗体である（例えば、Ｑｕｅｅｎ，ＵＳ５，５３０，１０１および５，５８５，０８９；Ｗｉｎｔｅｒ，ＵＳ５，２２５，５３９；Ｃａｒｔｅｒ，ＵＳ６，４０７，２１３；Ａｄａｉｒ，ＵＳ５，８５９，２０５；およびＦｏｏｔｅ，ＵＳ６，８８１，５５７を参照）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の合成物、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖細胞系領域配列であり得る。したがって、ヒト化抗体は、ドナー抗体に全体的または実質的に由来するＣＤＲを一部または全部、ならびに、存在する場合には、ヒト抗体配列に全体的または実質的に由来する可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化ＶＨドメインは、ドナー抗体ＶＨドメインに全体的または実質的に由来する、少なくとも１つ、２つ、および通常は３つ全てのＣＤＲ、ならびにヒト抗体ＶＨドメインに全体的または実質的に由来する可変領域フレームワーク配列を有する；そのようなヒト化ＶＨドメインは、ヒト重鎖定常領域配列に全体的または実質的に由来する免疫グロブリン重鎖定常領域に、典型的にはアミノ末端に、連結され得る。同様に、ヒト化ＶＬドメインは、ドナー抗体ＶＬドメインに全体的または実質的に由来する、少なくとも１つ、２つ、および通常は３つ全てのＣＤＲ、ならびにヒト抗体ＶＬドメインに全体的または実質的に由来する可変領域フレームワーク配列を有する；そのようなヒト化ＶＬドメインは、ヒト軽鎖定常領域配列に全体的または実質的に由来する免疫グロブリン軽鎖定常領域に、典型的にはアミノ末端に、連結され得る。典型的には、ヒト化抗体は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインの両方を含む。必ずではないが一般的には、ヒト化抗体は、適切な結合特性を促進するために、ヒト可変ドメインフレームワーク領域内にいくつかの非ヒト残基を保持する（例えば、抗体がヒト化される場合に、結合アフィニティを保存するために、フレームワーク内の変異が必要とされ得る）。
【0092】
ヒト化抗体はしばしば非ヒト抗体に由来するＣＤＲ（好ましくは、Ｋａｂａｔによって定義される）を６つ全て取り込むが、全てより少ない（例えば、少なくとも３、４、または５つの）非ヒト抗体由来のＣＤＲによってもまた、作製することができる（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９：３０７６，２００２；Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，３２０：４１５－４２８，２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３６：１０７９－１０９１，１９９９；Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：１４３２－１４４１，２０００）。いくつかの局面では、ヒト化抗体は、６つのＣＤＲ全てを取り込むが、ＣＤＲのうちの１つ以上に、０、１、２、または３か所の保存的置換を有する。
【0093】
ヒト可変領域フレームワーク残基に由来する特定のアミノ酸は、ＣＤＲのコンフォメーションおよび／または抗原への結合に対する潜在的な影響に基づく置換のために選択され得る。そのような可能な影響の調査は、モデリング、特定の位置のアミノ酸の特性の試験、または特定のアミノ酸の置換もしくは変異導入の効果の経験的観察による。
【0094】
例えば、マウス可変領域フレームワーク残基と、選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間でアミノ酸が異なる際、ヒトフレームワークアミノ酸は、マウス抗体由来のアミノ酸が以下に該当することが合理的に期待される場合、マウス抗体由来の等価なフレームワークアミノ酸によって置換することができる：
（１）非共有的に直接抗原に結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）その他の様態でＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域の約６Å以内にある）；または
（４）重鎖および軽鎖の間の相互作用を媒介する。
（１）非共有的に直接抗原に結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）その他の様態でＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域の約６Å以内にある）；または
（４）重鎖および軽鎖の間の相互作用を媒介する。
【0095】
他の可能なバリエーションは、マウス抗体のＣＤＲ中の特定の残基を、ヒトＣＤＲ配列に由来する、典型的には、例示されたヒト化抗体の設計で用いられたヒトアクセプター配列のＣＤＲに由来する対応する残基と置換することである。いくつかの抗体では、ＣＤＲの部分のみ、つまり結合に必要とされるＣＤＲ残基のサブセット（ＳＤＲと呼ばれる）がヒト化抗体において結合を保持するために必要とされる。抗原に接触せず、ＳＤＲ中にないＣＤＲ残基は、以前の研究に基づいて（例えば、ＣＤＲ Ｈ２中の残基Ｈ６０～Ｈ６５は、しばしば不要である）、Ｃｈｏｔｈｉａ超可変性ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１，１９８７）の外部にあるＫａｂａｔＣＤＲの領域から、分子モデリングにより、および／または経験的に、あるいはＧｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４１：８６３，２００４において説明されるように、同定され得る。ヒト化抗体において、１つ以上のドナーＣＤＲ残基が存在しない、またはドナーＣＤＲの全体が削除されている位置では、そのようなその位置を占めるアミノ酸は、アクセプター抗体配列中の対応する位置（Ｋａｂａｔナンバリングによる）を占めるアミノ酸であり得る。そのような置換は、ヒト化抗体におけるマウスアミノ酸の数を減少させること、およびその結果として潜在的な免疫原性を減少させることについて潜在的に有利である。しかしながら、置換はまた、アフィニティの変化をもたらすこともあり、そして、アフィニティの顕著な低減は、好ましくは避けられる。さらなるバリエーションでは、ヒト化抗ＮＴＢ－Ａ抗体のＣＤＲ（その他の点では、表１に挙げられる抗体のＣＤＲと同一となる）中の１つ以上の残基は、表１に挙げられる異なる抗体のＣＤＲに由来する対応する残基によって置き換えられ得る。ＣＤＲ中の置換のための位置および置換されるアミノ酸はまた、経験的にも選択され得る。
【0096】
好ましくはないが、例えば、ＣＤＲと接触していないフレームワーク残基において、または潜在的なＣＤＲ接触残基もしくはＣＤＲ内のアミノ酸においてさえ、他のアミノ酸置換を行うことができる。バリアントのヒト化配列においてなされる置き換えは、置き換えられるアミノ酸に関して、しばしば保存的である。好ましくは、保存的であるか否かに拘わらず、そのような置き換えは、結合アフィニティまたはヒト化抗体の効力、すなわち、ヒトＮＴＢ－Ａに結合する能力もしくはがん細胞の成長を阻害する能力に対して実質的に効果を有しない。
【0097】
好ましい抗ＮＴＢ－Ａ抗体またはその結合体化形態（例えば、抗体－薬物結合体）は、培養において、動物モデルにおいて、または臨床試験において増殖するがん性の細胞上で示されるように、がん（例えば、細胞の成長、組織への転移および／または致死性）を阻害する。動物モデルは、ＮＴＢ－Ａ発現性ヒト腫瘍細胞株を、適切な免疫不全げっ歯類系統（例えば、胸腺欠損ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に移植することにより、形成され得る。これらの腫瘍細胞株は、免疫不全げっ歯類宿主中で、皮下注射による固形腫瘍として、または静脈内注射による播種性腫瘍として、確立され得る。一旦宿主内で確立されれば、これらの腫瘍モデルは、抗ＮＴＢ－Ａ抗体またはその結合体化形態の治療的有効性を評価するために適用され得る。
【0098】
特定のバリエーションでは、本発明の抗ＮＴＢＡ抗体は、免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域）の少なくとも部分と連結されたＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む。例えば、いくつかの実施態様では、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、第一および第二のポリペプチド鎖を含み、第一のポリペプチド鎖は免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも部分と連結された本明細書で説明されるＶＨドメインを含み、そして第二のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン軽鎖定常領域の少なくとも部分と連結された本明細書で説明されるＶＬドメインを含む。典型的には、ＶＨドメインまたはＶＬドメインは、免疫グロブリン定常領域のアミノ末端またはその部分のアミノ末端に連結される。抗体が第一および第二のポリペプチド鎖を含む特定のバリエーションでは、第一および第二のポリペプチド鎖は、インタクトな天然の抗体の重鎖および軽鎖に対応するドメイン構造を有し、例えば、第一のポリペプチド（重）鎖は、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３のアミノ末端からカルボキシル末端までのドメイン構造を有し、第二のポリペプチド（軽）鎖は、ＶＬ－ＣＬのアミノ末端からカルボキシル末端までのドメイン構造を有する。
【0099】
他の実施態様では、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、単一のポリペプチド鎖内に連結された、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分（例えば、ＣＨ１ドメインの欠落した重鎖定常領域）を含む一本鎖抗体である。例えば、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ＶＨ／ＶＬまたはＶＬ／ＶＨ（アミノ末端／カルボキシル末端）のいずれかの方向の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として構築され得、ｓｃＦｖは、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むが、ＣＨ１ドメインの欠落した定常領域）に（典型的にはアミノ末端に）連結される。ｓｃＦｖは、典型的には、リンカー（例えば、免疫グロブリンヒンジ領域に由来するリンカー）を介して定常領域に連結される。
【0100】
定常領域の選択は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害、抗体依存性細胞貪食および／または補体依存性細胞傷害のどれが所望されるかに、部分的には依存し得る。例えば、ヒトアイソタイプ（ｉｓｏｔｏｐｅ）ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は強い補体依存性細胞傷害を有し、ヒトアイソタイプＩｇＧ２は弱い補体依存性細胞傷害を有し、そしてヒトアイソタイプＩｇＧ４は補体依存性細胞傷害を欠く。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３はまた、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４より強い細胞媒介エフェクター機能も誘導する。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。抗体は、例えば、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む４量体として、分離した重鎖と軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、あるいは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインがスペーサーを通して連結された一本鎖抗体として、発現され得る。加えて、所望の場合には、定常領域は変異させられ得る。いくつかの局面では、天然のヒト定常領域の変異形態は、天然のヒト定常領域に対してＦｃγレセプターへの結合が低減される。
【0101】
ヒト定常領域は、異なる個体間で、アロタイプのバリエーションおよびアイソアロタイプのバリエーションを示す、つまり、定常領域は、１つ以上の多型位置で異なる個体において異なり得る。アイソアロタイプは、あるアイソアロタイプを認識する血清が１つ以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合する点で、アロタイプと異なる。
【0102】
軽鎖および／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端の１つまたは複数のアミノ酸（例えば、重鎖のＣ末端リシン）は、分子のある割合または全体において、喪失、または誘導体化され得る。置換は、エフェクター機能（例えば、補体媒介細胞傷害またはＡＤＣＣ）を低減または増大させるため（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８３４，５９７号；およびＬａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
１０３：４００５，２００６を参照）、またはヒトにおける半減期を延長するため（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９：６２１３，２００４を参照）に、定常領域において行われ得る。
１０３：４００５，２００６を参照）、またはヒトにおける半減期を延長するため（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９：６２１３，２００４を参照）に、定常領域において行われ得る。
【0103】
代表的な置換としては、アミノ酸位置２３４、２３５、２３７、２３９、２６７、２９８、２９９、３２６、３３０、または３３２において天然のアミノ酸にシステイン残基が導入されるアミノ酸置換、好ましくはヒトＩｇＧ１アイソタイプにおけるＳ２３９Ｃ変異（ＵＳ ２０１００１５８９０９）が挙げられる。いくつかの局面では、追加的なシステイン残基の存在は、鎖間のジスルフィド結合の形成を可能にする。そのような鎖間ジスルフィド結合の形成は立体障害をもたらし得、それによりＦｃ領域－ＦｃγＲ結合相互作用のアフィニティを低減させ得る。ＩｇＧ定常領域のＦｃ領域に導入された、またはそれに近接して導入されたシステイン残基はまた、治療的作用物質との結合体化（すなわち、薬物のマレイミド誘導体といったチオール特異的試薬を用いた細胞傷害性薬物のカップリング）のための部位としても働き得る。治療的作用物質の存在は立体障害をもたらし、それにより、さらにＦｃ領域－ＦｃγＲ結合相互作用のアフィニティを低減させる。位置２３４、２３５、２３６および／または２３７のいずれかにおける他の置換は、Ｆｃγレセプター、特にＦｃγＲＩレセプターのアフィニティを低減させる（例えば、ＵＳ６，６２４，８２１、ＵＳ５，６２４，８２１を参照）。
【0104】
抗体のインビボでの半減期もまた、そのエフェクター機能に対して影響し得る。抗体の半減期は、その治療的活性を改変するために増加または減少させられ得る。ＦｃＲｎは、β２－ミクログロブリンと非共有結合的に関係するＭＨＣクラスＩ抗原と、構造的に類似のレセプターである。ＦｃＲｎは、ＩｇＧの異化およびそれらの組織間の経細胞輸送を調節する（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８：７３９－７６６，２０００；Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｒｅｓ． ２５：９７－１１３，２００２）。ＩｇＧ－ＦｃＲｎ相互作用は、ｐＨ６．０（細胞内小胞のｐＨ）では起こるが、ｐＨ７．４（血液のｐＨ）では起こらない；この相互作用は、ＩｇＧが循環へと再利用されることを可能にする（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，２０００，同上；Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，２００２，同上）。ＦｃＲｎ結合に関係するヒトＩｇＧ１上の領域は、マッピングされている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：６５９１－６０４，２００１）。ヒトＩｇＧ１の位置Ｐｒｏ２３８、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｐ３１２、Ｇｌｕ３８０、Ｇｌｕ３８２またはＡｓｎ４３４におけるアラニン置換は、ＦｃＲｎ結合を促進する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，同上）。これらの置換を有するＩｇＧ１分子は、より長い血清半減期を有する。結果として、これらの改変ＩｇＧ１分子は、それらのエフェクター機能を達成することができ、したがって、非改変ＩｇＧ１と比較してより長い期間にわたって、それらの治療的有効性を発揮することができる。ＦｃＲｎへの結合を向上させる他の代表的な置換としては、位置２５０のＧｌｎおよび／または位置４２８のＬｅｕが挙げられる。定常領域における全ての位置について、ＥＵナンバリングが用いられる。
Ｒｅｓ． ２５：９７－１１３，２００２）。ＩｇＧ－ＦｃＲｎ相互作用は、ｐＨ６．０（細胞内小胞のｐＨ）では起こるが、ｐＨ７．４（血液のｐＨ）では起こらない；この相互作用は、ＩｇＧが循環へと再利用されることを可能にする（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，２０００，同上；Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，２００２，同上）。ＦｃＲｎ結合に関係するヒトＩｇＧ１上の領域は、マッピングされている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：６５９１－６０４，２００１）。ヒトＩｇＧ１の位置Ｐｒｏ２３８、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｐ３１２、Ｇｌｕ３８０、Ｇｌｕ３８２またはＡｓｎ４３４におけるアラニン置換は、ＦｃＲｎ結合を促進する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，同上）。これらの置換を有するＩｇＧ１分子は、より長い血清半減期を有する。結果として、これらの改変ＩｇＧ１分子は、それらのエフェクター機能を達成することができ、したがって、非改変ＩｇＧ１と比較してより長い期間にわたって、それらの治療的有効性を発揮することができる。ＦｃＲｎへの結合を向上させる他の代表的な置換としては、位置２５０のＧｌｎおよび／または位置４２８のＬｅｕが挙げられる。定常領域における全ての位置について、ＥＵナンバリングが用いられる。
【0105】
保存されているＡｓｎ２９７に共有結合したオリゴ糖は、ＩｇＧのＦｃ領域がＦｃγＲに結合する能力に関係する（Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：４９６３－６９，１９９６；Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：２６－３１，１９９７）。ＩｇＧにおけるこのグリコフォームの操作は、ＩｇＧ媒介ＡＤＣＣを顕著に向上させ得る。このグリコフォームへのバイセクティングＮ－アセチルグルコサミン改変の追加(Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：１７６－１８０，１９９９；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ７４：２８８－９４，２００１)、ま
たはこのグリコフォームからのフコースの除去（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７：２６７３３－４０，２００２；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：６５９１－６０４，２００３；Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６４：２１２７－３３，２００４）は、ＩｇＧのＦｃとＦｃγＲとの間の結合を向上させ、それによりＩｇ媒介ＡＤＣＣ活性を促進する、ＩｇＧのＦｃの操作の２つの例である。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：２６－３１，１９９７）。ＩｇＧにおけるこのグリコフォームの操作は、ＩｇＧ媒介ＡＤＣＣを顕著に向上させ得る。このグリコフォームへのバイセクティングＮ－アセチルグルコサミン改変の追加(Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：１７６－１８０，１９９９；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ７４：２８８－９４，２００１)、ま
たはこのグリコフォームからのフコースの除去（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７：２６７３３－４０，２００２；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８：６５９１－６０４，２００３；Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６４：２１２７－３３，２００４）は、ＩｇＧのＦｃとＦｃγＲとの間の結合を向上させ、それによりＩｇ媒介ＡＤＣＣ活性を促進する、ＩｇＧのＦｃの操作の２つの例である。
【0106】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の溶剤曝露アミノ酸の全体的な置換は、変化したＦｃγＲ結合アフィニティを有するＩｇＧバリアントを生成する（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：６５９１－６０４，２００１）。親ＩｇＧ１と比較した際、Ｔｈｒ２５６／Ｓｅｒ２９８、Ｓｅｒ２９８／Ｇ１ｕ３３３、Ｓｅｒ２９８／Ｌｙｓ３３４、またはＳｅｒ２９８／Ｇ１ｕ３３３／Ｌｙｓ３３４におけるＡｌａへの置換を含むこれらのバリアントのサブセットは、ＦｃγＲへの結合アフィニティおよびＡＤＣＣ活性の両方における上昇を示す（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，同上；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３６：１２３９－４９，２００４）。
【0107】
抗体の補体固定活性（Ｃ１ｑ結合およびＣＤＣ活性の両方）は、Ｌｙｓ３２６およびＧｌｕ３３３における置換によって向上され得る（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６：２５７１－２５７５，２００１）。ヒトＩｇＧ２骨格上の同一の置換は、Ｃ１ｑにあまり結合せず、補体活性化活性に重篤な欠陥のある抗体アイソタイプを、Ｃ１ｑに結合し、ＣＤＣを媒介するアイソタイプに転換し得る（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，同上）。複数の他の方法もまた、抗体の補体固定活性を向上させるために適用されている。例えば、ＩｇＭの１８アミノ酸カルボキシル末端テールピース（ｔａｉｌ ｐｉｅｃｅ）を、ＩｇＧのカルボキシル末端に移植することは、それらのＣＤＣ活性を大幅に促進する。これは、通常は検出可能なＣＤＣ活性を有しないＩｇＧ４においてさえ観察される（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：２２２６－３６，１９９５）。また、ＩｇＧ１重鎖のカルボキシ末端の近くに位置するＳｅｒ４４４のＣｙｓへの置換は、ＩｇＧ１のテールとテールとの二量体化を誘導し、単量体ＩｇＧ１に対して２００倍のＣＤＣ活性の増加を伴う（Ｓｈｏｐｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：２９１８－２２，１９９２）。加えて、Ｃ１ｑへの特異性を有する二重特異性ダイアボディコンストラクトもまた、ＣＤＣ活性を与える（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５：６２９－３１，１９９７）。
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６：２５７１－２５７５，２００１）。ヒトＩｇＧ２骨格上の同一の置換は、Ｃ１ｑにあまり結合せず、補体活性化活性に重篤な欠陥のある抗体アイソタイプを、Ｃ１ｑに結合し、ＣＤＣを媒介するアイソタイプに転換し得る（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，同上）。複数の他の方法もまた、抗体の補体固定活性を向上させるために適用されている。例えば、ＩｇＭの１８アミノ酸カルボキシル末端テールピース（ｔａｉｌ ｐｉｅｃｅ）を、ＩｇＧのカルボキシル末端に移植することは、それらのＣＤＣ活性を大幅に促進する。これは、通常は検出可能なＣＤＣ活性を有しないＩｇＧ４においてさえ観察される（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：２２２６－３６，１９９５）。また、ＩｇＧ１重鎖のカルボキシ末端の近くに位置するＳｅｒ４４４のＣｙｓへの置換は、ＩｇＧ１のテールとテールとの二量体化を誘導し、単量体ＩｇＧ１に対して２００倍のＣＤＣ活性の増加を伴う（Ｓｈｏｐｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：２９１８－２２，１９９２）。加えて、Ｃ１ｑへの特異性を有する二重特異性ダイアボディコンストラクトもまた、ＣＤＣ活性を与える（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５：６２９－３１，１９９７）。
【0108】
補体活性は、重鎖のアミノ酸残基３１８、３２０、および３２２のうちの少なくとも１つの、異なる側鎖を有する残基（例えば、Ａｌａ）への変異によって低減され得る。３つの残基のうちの任意の１つの位置にある他のアルキル置換非イオン残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、もしくはＶａｌ）、または芳香族非極性残基（例えば、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｒｏ）もまた、Ｃ１ｑ結合を低減または消失させる。Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔは、Ｃ１ｑ結合活性を低減または消失させるために、残基３２０および３２２においては用いることができるが、残基３１８ではできない。３１８（Ｇｌｕ）残基の極性残基による置き換えは、Ｃ１ｑ結合活性を改変させ得るが、消失させるとは限らない。残基２９７（Ａｓｎ）のＡｌａとの置き換えは、溶解活性の除去をもたらすが、Ｃ１ｑへのアフィニティに対してはわずかに低減させる（約３分の１に弱くなる）のみである。この変更は、グリコシル化部位、および補体活性化に必要とされる炭水化物の存在を破壊する。この部位での任意の他の置換もまた、グリコシル化部位を破壊する。以下の変異およびその任意の組み合わせもまた、Ｃ１ｑ結合を低減させる：Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ａ、およびＰ３１１Ｓ（国際公開第０６／０３６２９１号を参照）。
【0109】
ヒト定常領域への参照は、任意の天然のアロタイプ、または天然のアロタイプ中の多型部位を占める残基の任意の並べ替えを有する定常領域を含む。また、天然のヒト定常領域に対して、１、２、５、または１０か所までの変異が存在し得る（例えば、Ｆｃガンマレセプター結合を低減させるため、またはＦｃＲｎへの結合を増加させるために上記で示される変異）。
【0110】
ＩＶ．核酸および産生の方法
本発明はさらに、上記で説明されたＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン（追加的なポリペプチドセグメント（例えば、免疫グロブリン定常領域と対応するポリペプチドセグメント）と連結されたＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含むポリペプチドを含む）のいずれかをコードする核酸を提供する。典型的には、核酸はまた、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む成熟ポリペプチドのアミノ末端に融合されたシグナルペプチドもコードする。核酸上のコード配列は、コード配列の発現を確実にするための調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル等）と作動可能に連結され得る。核酸は、単離された形態で存在し得る、または１つ以上のベクターにクローニングされ得る。核酸は、例えば、固相合成または重複するオリゴヌクレオチドのＰＣＲによって、合成され得る。ＶＨドメインおよびＶＬドメイン（例えば、分離された重鎖および軽鎖を含む抗体に関して）の両方をコードする複数の核酸は、１つの連続的な核酸として連結されてもよく（例えば、発現ベクター内に）、または分離されてもよい（例えば、それら自体の発現ベクターにそれぞれクローニングされ得る）。
本発明はさらに、上記で説明されたＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン（追加的なポリペプチドセグメント（例えば、免疫グロブリン定常領域と対応するポリペプチドセグメント）と連結されたＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含むポリペプチドを含む）のいずれかをコードする核酸を提供する。典型的には、核酸はまた、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む成熟ポリペプチドのアミノ末端に融合されたシグナルペプチドもコードする。核酸上のコード配列は、コード配列の発現を確実にするための調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル等）と作動可能に連結され得る。核酸は、単離された形態で存在し得る、または１つ以上のベクターにクローニングされ得る。核酸は、例えば、固相合成または重複するオリゴヌクレオチドのＰＣＲによって、合成され得る。ＶＨドメインおよびＶＬドメイン（例えば、分離された重鎖および軽鎖を含む抗体に関して）の両方をコードする複数の核酸は、１つの連続的な核酸として連結されてもよく（例えば、発現ベクター内に）、または分離されてもよい（例えば、それら自体の発現ベクターにそれぞれクローニングされ得る）。
【0111】
抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、典型的には、１つ以上の抗体鎖をコードする１つ以上の核酸の組み換え発現によって産生される。組み換えポリヌクレオチドコンストラクトは、典型的には、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む１つ以上のポリペプチド鎖のコード配列と作動可能に連結された発現制御配列（天然で関係する、または異種性のプロモーター領域を含む）を含む。好ましくは、発現制御配列は、真核性宿主細胞の形質転換または形質導入をすることのできるベクター中の、真核性プロモーターシステムである。一旦適切な宿主中にベクターが組み込まれたら、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現、ならびに交差反応する抗体の回収および精製に適切な条件下で維持される。
【0112】
第一および第二のポリペプチド鎖（例えば、重鎖および軽鎖）を含む抗体を発現させる特定の実施態様では、２つのポリペプチド鎖は、抗体分子全体の発現のために、宿主細胞中の分離されたベクターから共発現され得る。２本鎖抗体を発現させる他の実施態様では、２つのポリペプチド鎖は、抗体分子全体の発現のために、宿主細胞中の同一のベクター内の別々の発現ユニットから共発現され得る。
【0113】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードする核酸セグメントを発現させるのに好ましい宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）を参照。インタクトな異種性タンパク質を分泌することのできる複数の適切な宿主細胞株が、当該分野で開発されており、細胞株としては、ＣＨＯ細胞株（例えば、ＤＧ４４）、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、および非抗体産生骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０およびＮＳ０を含む）が挙げられる。好ましくは、細胞は非ヒトである。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列（例えば、複製の起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ８９：４９，１９８６）、および必要なプロセッシング情報部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリＡ化部位）および転写ターミネーター配列）を含み得る。好ましい発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス等に由来するプロモーターである。Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１１４９，１９９２を参照。
【0114】
一旦発現したら、抗体は当該分野の標準的な手順（ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む）に従って精製され得る（一般的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２)を参照）。
【0115】
Ｖ．抗体薬物結合体
抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、細胞傷害性成分または細胞増殖抑制成分（その薬学的に許容可能な塩を含む）と結合体化され得、抗体薬物結合体（ＡＤＣ）を形成し得る。抗体との結合体化に特に適切な成分は、細胞傷害性作用物質（例えば、化学療法用作用物質）、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体もしくは放射性化合物、または毒素（これらの成分は、集合的に治療的作用物質と呼ばれる）である。例えば、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、細胞傷害性作用物質（例えば、化学療法用作用物質）、または毒素（例えば、細胞増殖抑制作用物質もしくは細胞致死性作用物質（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素））と結合体化され得る。細胞傷害性作用物質の有用なクラスの例としては、例えば、ＤＮＡ副溝結合物質、ＤＮＡアルキル化作用物質、およびチューブリン阻害物質が挙げられる。代表的な細胞傷害性作用物質としては、例えば、オーリスタチン、カンプトテシン、カリケアミシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ３、ＤＭ４）、タキサン、ベンゾジアゼピン（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）およびビンカアルカロイドが挙げられる。
抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、細胞傷害性成分または細胞増殖抑制成分（その薬学的に許容可能な塩を含む）と結合体化され得、抗体薬物結合体（ＡＤＣ）を形成し得る。抗体との結合体化に特に適切な成分は、細胞傷害性作用物質（例えば、化学療法用作用物質）、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体もしくは放射性化合物、または毒素（これらの成分は、集合的に治療的作用物質と呼ばれる）である。例えば、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、細胞傷害性作用物質（例えば、化学療法用作用物質）、または毒素（例えば、細胞増殖抑制作用物質もしくは細胞致死性作用物質（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素））と結合体化され得る。細胞傷害性作用物質の有用なクラスの例としては、例えば、ＤＮＡ副溝結合物質、ＤＮＡアルキル化作用物質、およびチューブリン阻害物質が挙げられる。代表的な細胞傷害性作用物質としては、例えば、オーリスタチン、カンプトテシン、カリケアミシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１、ＤＭ２、ＤＭ３、ＤＭ４）、タキサン、ベンゾジアゼピン（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）およびビンカアルカロイドが挙げられる。
【0116】
抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、プロドラッグ変換酵素と結合体化され得る。プロドラッグ変換酵素は、抗体と組み換え的に融合することができる、または公知の方法を用いて抗体と化学的に結合体化することができる。代表的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、ベータグルクロニダーゼ、ペニシリン－Ｖ－アミダーゼ、ペニシリン－Ｇ－アミダーゼ、β－ラクタマーゼ、β－グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼおよびカルボキシペプチダーゼＡである。
【0117】
治療的作用物質をタンパク質と、そして特に抗体と結合体化する技術は周知である（例えば、Ａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０ １４：１－９；Ｓｅｎｔｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．，２００８，１４（３）：１５４－１６９を参照）。治療的薬剤は、抗体から切り出され（例えば、加水分解によって、タンパク質分解によって、または切断作用物質によって）ない限りはその活性が低減されるような様態で結合体化され得る。いくつかの局面では、治療的作用物質は、切断可能なリンカーによって抗体に付着することができ、リンカーは、ＮＴＢ－Ａ発現性のがん細胞の細胞内環境において切断に対して感受性であるが、細胞外環境に対しては実質的に感受性でなく、それにより、結合体は、ＮＴＢ－Ａ発現性のがん細胞に内部移行された際に抗体から切り出される（例えば、エンドソーム環境においてはｐＨ感受性もしくはプロテアーゼ感受性によって、リソソーム環境においてまたはカベオラ（ｃａｖｅｏｌｅａｒ）環境において）いくつかの局面では、治療的作用物質はまた、切断可能でないリンカーによっても抗体に付着することができる。
【0118】
典型的には、ＡＤＣは治療的作用物質と抗ＮＴＢ－Ａ抗体との間にリンカー領域を含む。上記のように、典型的には、リンカーは細胞内の条件下で切断可能であり得、それにより、細胞内環境において（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラの内部において）、リンカーの切断によって、抗体から治療的作用物質が放出される。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素（リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼを含む）によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。切断作用物質としては、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンが挙げられ得る（例えば、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｐｈａｒｍ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７－１２３，１９９９を参照）。最も典型的であるのは、ＮＴＢ－Ａ発現性の細胞に存在する酵素によって切断可能なペプチジルリンカーである。例えば、がん性組織において高発現しているチオール依存性プロテアーゼカテプシンＢによって切断可能なペプチジルリンカーが用いられ得る（例えば、Ｐｈｅ－ＬｅｕまたはＶａｌ－Ｃｉｔペプチドを含むリンカー）。
【0119】
切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、すなわち、特定のｐＨ値において加水分解に対して感受性であり得る。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解可能な酸不安定リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス－アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタール等）が、用いられ得る（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；第５，８２４，８０５号；第５，６２２，９２９号；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｐｈａｒｍ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７－１２３，１９９９；Ｎｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１４６５３－１４６６１，１９８９を参照）。そのようなリンカーは、中性ｐＨ条件（例えば、血液中の条件）下において比較的安定だが、ｐＨ５．５または５．０（概ねリソソームのｐＨ）より低いｐＨでは、不安定である。
【0120】
他のリンカーは、還元性条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。ジスルフィドリンカーとしては、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシニミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシニミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシニミジル－３－（２－ピリジルジチオ）ブチレート）ならびにＳＭＰＴ（Ｎ－スクシニミジル－オキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジル－ジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを用いて形成することができるリンカーが挙げられる（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７：５９２４－５９３１，１９８７；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ． Ｗ． Ｖｏｇｅｌ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ． Ｐｒｅｓｓ，１９８７）を参照。米国特許第４，８８０，９３５号もまた参照）。
【0121】
リンカーはまた、マロン酸リンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １５：１３８７－９３，１９９５）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ． ３：１２９９－１３０４，１９９５）、または３’－Ｎ－アミド類縁体（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ． ３：１３０５－１２，１９９５）でもあり得る。
【0122】
リンカーはまた、切断可能でないリンカー（例えば、マレイミド－アルキレン－、またはマレイミド－アリルリンカー）であって、治療的作用物質に直接付着され、そして抗体のタンパク質分解によって放出されるリンカーであり得る。
【0123】
典型的には、リンカーは、細胞外環境に対して実質的に感受性でなく、それは、約２０％以下、典型的には約１５％以下、より典型的には約１０％以下、そしてさらにより典型的には約５％以下、約３％以下、もしくは約１％以下のＡＤＣサンプル中のリンカーが、ＡＤＣが細胞外環境（例えば、血漿中）に存在する際に切断されることを意味している。リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性でないかどうかは、例えば、（ａ）ＡＤＣ（「ＡＤＣサンプル」）および（ｂ）等モル量の結合体化されていない抗体もしくは治療的作用物質（「対照サンプル」）の両方を独立に、予め決められた時間（例えば、２、４、８、１６、もしくは２４時間）の間、血漿とインキュベートする工程、および次に、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定される、ＡＤＣサンプル中に存在する結合体化されていない抗体もしくは治療的作用物質の量と、対照サンプル中に存在する結合体化されていない抗体もしくは治療的作用物質の量とを比較する工程によって決定することができる。
【0124】
リンカーはまた、細胞性の内部移行を促進し得る。リンカーは、治療的作用物質と結合体化される場合に、細胞性の内部移行を促進し得る（すなわち、本明細書で説明されるＡＤＣもしくはＡＤＣ誘導体のリンカー－治療的作用物質成分の環境において）。あるいは、リンカーは、治療的作用物質および抗ＮＴＢ－Ａ抗体の両方と結合体化される場合に、細胞性の内部移行を促進し得る（すなわち、本明細書で説明されるＡＤＣの環境において）。
【0125】
代表的な抗体－薬物結合体としては、オーリスタチンに基づく抗体－薬物結合体が挙げられ、それは、その薬物構成成分がオーリスタチン薬物であることを意味する。オーリスタチンは、チューブリンに結合し、微小管動態ならびに核および細胞の分裂に干渉することが示されており、そして抗がん活性を有する。典型的には、オーリスタチンに基づく抗体－薬物結合体は、オーリスタチン薬物と抗ＮＴＢ－Ａ抗体との間にリンカーを含む。リンカーは、例えば、切断可能なリンカー（例えば、ペプチジルリンカー）または切断可能でないリンカー（例えば、抗体の分解によって放出されるリンカー）であり得る。オーリスタチンは、オーリスタチンＥまたはその誘導体であり得る。オーリスタチンは、例えば、オーリスタチンＥとケト酸との間で形成されるエステルであり得る。例えば、オーリスタチンＥは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応して、それぞれＡＥＢおよびＡＥＶＢを生成し得る。他の典型的なオーリスタチンとしては、ＭＭＡＦ、およびＭＭＡＥが挙げられる。代表的なオーリスタチンの合成および構造は、米国公開第７，６５９，２４１号、第７，４９８，２９８号、第２００９－０１１１７５６号、第２００９－００１８０８６、および第７，９６８，６８７号において説明され、それぞれは、その全体が本明細書において、全ての目的のために参考として援用される。
【0126】
代表的なオーリスタチンに基づく抗体薬物結合体としては、以下に示されるｖｃＭＭＡＥ、ｖｃＭＭＡＦおよびｍｃＭＭＡＦ抗体薬物結合体、またはその薬学的に許容可能な塩が挙げられ、ここで、Ａｂは本明細書で説明される抗体であり、そしてｖａｌ－ｃｉｔはバリン－シトルリンジペプチドを表す。
薬物ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）は、抗体あたりの薬物－リンカー分子の数であるｐで表される。文脈に依存して、ｐは、平均薬物ローディングとも呼ばれる抗体あたりの薬物－リンカー分子の平均の数を表し得る。ｐは１から２０の範囲であり、そして好ましくは１から８である。いくつかの好ましい実施態様では、ｐが平均薬物ローディングを表す場合に、ｐは約２から約５の範囲である。いくつかの実施態様では、ｐは、約２、約３、約４、または約５である。調製物における抗体あたりの薬物の平均の数は、従来の手段（例えば、質量分析、ＨＩＣ、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣ）によって特性評価され得る。いくつかの局面では、抗ＮＴＢＡ抗体は、抗体のシステイン残基を通じて薬物－リンカーに付着され得る。いくつかの局面では、システイン残基は、操作により抗体中に存在するシステイン残基である。他の局面では、システイン残基は、鎖間ジスルフィドシステイン残基である。
【化1】
薬物ローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）は、抗体あたりの薬物－リンカー分子の数であるｐで表される。文脈に依存して、ｐは、平均薬物ローディングとも呼ばれる抗体あたりの薬物－リンカー分子の平均の数を表し得る。ｐは１から２０の範囲であり、そして好ましくは１から８である。いくつかの好ましい実施態様では、ｐが平均薬物ローディングを表す場合に、ｐは約２から約５の範囲である。いくつかの実施態様では、ｐは、約２、約３、約４、または約５である。調製物における抗体あたりの薬物の平均の数は、従来の手段（例えば、質量分析、ＨＩＣ、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣ）によって特性評価され得る。いくつかの局面では、抗ＮＴＢＡ抗体は、抗体のシステイン残基を通じて薬物－リンカーに付着され得る。いくつかの局面では、システイン残基は、操作により抗体中に存在するシステイン残基である。他の局面では、システイン残基は、鎖間ジスルフィドシステイン残基である。
【0127】
ＶＩ．適用
他の局面では、本発明は、ＮＴＢＡ発現性の細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ様Ｔ細胞、Ｔ細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、および好酸球を含む）の生物学的活性を調節するために、本明細書で説明される抗ＮＴＢ－Ａ抗体を用いる方法を提供する。そのような方法には、例えば、ＮＴＢ－Ａ発現性の細胞の活性を阻害する（例えば、細胞の増殖を阻害する）方法が含まれる。そのような方法にはさらに、例えば、ＮＴＢ－Ａ発現性の細胞に関係する疾患または障害を処置する方法が含まれる。
他の局面では、本発明は、ＮＴＢＡ発現性の細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ様Ｔ細胞、Ｔ細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、および好酸球を含む）の生物学的活性を調節するために、本明細書で説明される抗ＮＴＢ－Ａ抗体を用いる方法を提供する。そのような方法には、例えば、ＮＴＢ－Ａ発現性の細胞の活性を阻害する（例えば、細胞の増殖を阻害する）方法が含まれる。そのような方法にはさらに、例えば、ＮＴＢ－Ａ発現性の細胞に関係する疾患または障害を処置する方法が含まれる。
【0128】
例えば、本発明の抗ＮＴＢＡ抗体は、裸の抗体として、またはその抗体薬物結合体として、ＮＴＢ－Ａ発現性のがんを処置するために用いることができる。いくつかのそのようながんは、タンパク質（例えば、例示された抗体のうちの１つを用いるイムノアッセイにより）またはｍＲＮＡのレベルのいずれかで測定される、検出可能なレベルのＮＴＢ－Ａを示す。いくつかのそのようながんは、好ましくは同一の患者に由来する、同じタイプの非がん性組織に対して、上昇したレベルのＮＴＢ－Ａを示す。処置の対象となるがん細胞上のＮＴＢ－Ａの代表的なレベルは、細胞あたり５０００～１５００００ＮＴＢ－Ａ分子であるが、それより高いまたは低いレベルでも処置され得る。がんにおけるＮＴＢ－Ａのレベルは、必要に応じて、処置を実行する前に測定され得る。
【0129】
ＮＴＢ－Ａ発現を伴い、そして処置の対象となるがんの例としては、血液悪性腫瘍（Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞悪性腫瘍を含む）が挙げられる。いくつかの実施態様では、がんは、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、またはＴ細胞もしくはＢ細胞リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））である。処置は、これらの種類の原発性または転移性の腫瘍を有する患者に対して適用することができる。処置はまた、従来の処置に不応性である患者、またはそのような処置への応答に続いて再発した患者に対しても適用され得る。
【0130】
関連する局面では、本発明は、ＮＴＢ－Ａに対して特異的に結合する抗体を含む抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）を用いて多発性骨髄腫を処置する方法を提供する。この局面の特定のバリエーションでは、多発性骨髄腫の処置のための抗ＮＴＢ－Ａ ＡＤＣは、本明細書で説明される抗ＮＴＢ－Ａ抗体（例えば、配列番号１の残基２０～１３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２の残基２１～１４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインに、それぞれ由来するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むヒト化抗体）を含む。他の局面では、多発性骨髄腫の処置のための抗ＮＴＢ－Ａ ＡＤＣは、本明細書で説明される抗体とは異なる抗体であって、ＮＴＢ－Ａの細胞外ドメインに対して特異的に結合する抗体を含む。抗ＮＴＢ－Ａ抗体の集合は、当該分野で公知である。抗ＮＴＢ－Ａの追加的な抗体は、例えば、ＮＴＢ－Ａまたはその１つ以上の細胞外ドメインで免疫することによって、新規に製作され得る。そのような免疫原は、天然の原料から、ペプチド合成により、または組み換え発現により、得ることができる。ＮＴＢ－Ａに対するヒト抗体は、当該分野で公知の様々な技術によって提供され得る。
【0131】
本発明の抗ＮＴＢＡ抗体は、裸の抗体として、またはその抗体薬物結合体として、Ｂ細胞に関連する疾患または障害（例えば、Ｂ細胞の数の過剰、過活動Ｂ細胞、または機能不全のＢ細胞を特徴とする、Ｂ細胞に関連する疾患）を処置するために用いることができる。これらの疾患は、炎症性疾患および自己免疫疾患を含む。本発明の方法によって処置可能な代表的な疾患としては、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、炎症性腸疾患、ぜんそく、アレルギー、セリアック病、移植片対宿主病、および移植拒絶反応が挙げられる。
【0132】
本発明は、本明細書で説明される疾患および障害の、単剤療法としての、または、例えば、そのような疾患および／または障害の処置の標準の治療と組み合わせた治療としての処置の方法を包含する。したがって、がんの処置の方法は、本発明の抗体もしくは抗体薬物結合体の有効量を、追加的な抗がん作用物質またはがんの症状を緩和する他の作用物質と組み合わせて必要とする患者に投与することを含む。自己免疫疾患の処置の方法は、本発明の抗体もしくは抗体薬物結合体の有効量を、自己免疫疾患の処置のための追加的な治療的作用物質と組み合わせて必要とする患者に投与することを含む。炎症性疾患の処置の方法は、本発明の抗体もしくは抗体薬物結合体の有効量を、炎症性疾患の処置のための追加的な治療的作用物質と組み合わせて必要とする患者に投与することを含む。
【0133】
抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、単独で、またはその結合体として、有効レジメンにおいて投与され、有効レジメンは、がんの発症を遅らせ、がんの重篤度を低減させ、がんのさらなる悪化を阻害し、および／または少なくとも1つのがんの徴候または症状を緩和する、投薬量
、投与の経路、および投与の頻度を意味する。いくつかの例では、治療的有効性は、既存対照または同一患者における過去の経験に対して、個々の患者において観察され得る。他の例では、治療的有効性は、非処置患者の対照集団に対して、処置患者の集団における前臨床または臨床試験において実証され得る。
、投与の経路、および投与の頻度を意味する。いくつかの例では、治療的有効性は、既存対照または同一患者における過去の経験に対して、個々の患者において観察され得る。他の例では、治療的有効性は、非処置患者の対照集団に対して、処置患者の集団における前臨床または臨床試験において実証され得る。
【0134】
抗ＮＴＢ－Ａ抗体の代表的な投薬量は、患者の体重に対して０．１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ、より典型的には１ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇから１２ｍｇ／ｋｇ、もしくは１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ１、または２ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇから１２ｍｇ／ｋｇ、もしくは２ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇから１２ｍｇ／ｋｇ、もしくは３ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇである。モノクローナル抗体またはその抗体薬物結合体の代表的な投薬量は、被検体の体重に対して０．１ｍｇ／ｋｇから７．５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇから７．５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇから７．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇから７．５ｍｇ／ｋｇ、または２ｍｇ／ｋｇから７．５ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇから７．５ｍｇ／ｋｇ、あるいは０．１～２０、または０．５～５ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｋｇ）、あるいは固定投薬量として１０～１５００または２００～１５００ｍｇである。いくつかの方法では、患者は、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも３ｍｇ／ｋｇの用量を投与され、３週間に１回またはそれ以上投与される。投薬量は、投与の頻度、患者の状態および以前の処置に対する応答に依存し、存在する場合には、とりわけ、以前の処置が予防的であるか治療的であるか、および障害が急性であるか慢性であるか、に依存する。
【0135】
投与は、典型的には非経口である。投与はまた、腫瘍内に直接局在化もされ得る。静脈内または皮下投与による全身の循環への投与が好ましい。静脈内投与は、例えば、ある期間（例えば、３０～９０分間）の点滴によるもの、または単回ボーラス注射によるものであり得る。
【0136】
投与の頻度は、因子の中でも、循環中の抗体または結合体の半減期、患者の状態および投与の経路に依存する。頻度は、日ごと、週ごと、月ごと、四半期ごと、または患者の状態もしくは処置されるがんの進行の変化に対応した不規則な間隔であり得る。静脈内投与の代表的な頻度は、連続的な一連の処置にわたって、週に２回と四半期ごととの間であるが、より高いもしくは低い頻度の投薬もまた可能である。他の静脈内投与の代表的な頻度は、連続的な一連の処置にわたって、週ごとまたは４週間ごとに３回の間であるが、より高いもしくは低い頻度の投薬もまた可能であるが。皮下投与については、代表的な投薬頻度は、日ごとから月ごとであるが、より高いもしくは低い頻度の投薬もまた可能である。
【0137】
投与される投薬量の回数は、がんの性質（例えば、急性症状を示すか、慢性症状を示すか）および処置への障害の応答に依存する。急性障害または慢性障害の急性増悪については、１回と１０回との間の投薬はしばしば十分である。必要に応じて分割した形態の、単回ボーラス投薬は、時には急性障害または慢性障害の急性増悪について十分である。処置は、急性障害の再発または急性増悪について繰り返され得る。慢性障害については、抗体は、定期的な間隔、例えば、週ごと、２週間ごと、月ごと、四半期ごと、６か月ごとで、少なくとも１、５、または１０年の間、または患者の生涯にわたって投与され得る。
【0138】
非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは滅菌されており、実質的に等張で、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は、単位投薬剤形（すなわち、単回投与のための投薬量）で提供される。医薬組成物は、１つ以上の生理的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤または補助剤を用いて製剤化され得る。製剤は、選択される投与の経路に依存する。注射については、抗体は水性の溶液に、好ましくは生理的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩水もしくは酢酸緩衝液（注射の部位の不快感を低減するため））に製剤化され得る。溶液は、製剤用作用物質（例えば、懸濁、安定化、および／または分散作用物質）を含み得る。あるいは、抗体は、使用前の適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）との構成のために、凍結乾燥形態であり得る。液体製剤中の抗体の濃度は、例えば、１～１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、１０ｍｇ／ｍｌ）であり得る。
【0139】
本発明の抗体による処置は、化学療法、放射線、幹細胞治療、外科的処置、その他の処置される障害に対して有効な処置と組み合わせられ得る。抗ＮＴＢ－Ａ抗体と共に投与され得る他の作用物質の有用なクラスとしては、例えば、がん性細胞上で発現する他のレセプターの抗体、抗チューブリン作用物質（例えば、オーリスタチン）、ＤＮＡ副溝結合物質、ＤＮＡ複製阻害物質、アルキル化作用物質（例えば、白金錯体（例えば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）およびトリ核白金錯体ならびにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸物質、抗代謝物質、化学療法増感物質、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、孔形成化合物（ｐｒｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、プリン抗代謝物質、ピューロマイシン、放射線増感物質、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害物質、ビンカアルカロイド等が挙げられる。
【0140】
抗ＮＴＢ－Ａ抗体による処置は、上記で説明される任意の他の作用物質またはレジメンと、抗体単独または抗体薬物結合体として必要に応じて組み合わせられ、ＮＴＢ－Ａ発現性のがん（例えば、多発性骨髄腫、ＡＭＬ、ＮＨＬ）を有する患者の進行のない生存時間または全体の生存時間の中央値を、特に再燃または不応性の場合に、同一の処置（例えば、化学療法）であるが単独のまたは結合体としての抗ＮＴＢ－Ａ抗体を伴わない処置と比較して、少なくとも３０％または４０％、しかし好ましくは５０％、６０％から７０％、または１００％の割合でさえ、もしくはそれより長く増加させ得る。加えて、もしくは代替的に、単独のまたは結合体としての抗ＮＴＢ－Ａ抗体を含む処置（例えば、標準的化学療法）は、ＮＴＢ－Ａ発現性のがんを有する患者の完全奏効率、部分奏効率、または客観的奏効率（完全＋部分）を、同一の処置（例えば、化学療法）であるが抗ＮＴＢ－Ａ抗体を伴わない処置と比較して、少なくとも３０％または４０％、しかし好ましくは５０％、６０％から７０％、または１００％の割合でさえ増加させ得る。
【0141】
典型的には、臨床試験（例えば、フェーズＩＩ、フェーズＩＩ／ＩＩＩまたはフェーズＩＩＩ試験）において、標準的療法に抗ＮＴＢ－Ａ抗体を加えて処置された患者の進行のない生存の中央値および／または奏効率における先述の増加は、標準的療法単独（またはプラシーボを加えて）を受ける患者の対照グループに対して、統計的に有意であった（例えば、ｐ＝０．０５または０．０１あるいは０．００１のレベルで）。完全および部分奏効率は、がんについての臨床試験において広く用いられる客観的な基準（例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅおよび／またはＦｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって挙げられる、または承認されるような）によって決定される。
【0142】
他の適用では、本発明の抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、臨床診断もしくは処置に関して、または研究において、ＮＴＢ－Ａの検出に用いられ得る。がん上のＮＴＢＡの発現は、そのがんが本発明の抗体による処置の対象となることを示す。抗体はまた、ＮＴＢ－Ａを有する細胞および様々な刺激に対するそれらの応答を検出する実験室的研究のための研究試薬として、販売もされ得る。このような使用では、抗ＮＴＢ－Ａ抗体は、蛍光分子、スピン標識分子、酵素、または放射性同位体で標識され得、そしてＮＴＢ－Ａについてのアッセイを行うために必要な試薬を全て有するキットの形態で提供され得る。抗体はまた、例えば、アフィニティクロマトグラフィーによって、ＮＴＢ－Ａを精製するためにも用いられ得る。
【0143】
上記または以下で言及される全ての特許出願、他の刊行物、アクセッション番号等は、それぞれの個々の項目が、具体的および個々にそのように参考として援用されることが示されている場合と同程度に、その全体が本明細書において全ての目的のために参考として援用される。異なる時点で、アクセッション番号に、異なるバージョンの配列が関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられているバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合は、アクセッション番号に言及する、実際の出願日または優先権出願の早い方を意味する。同様に、異なる時点で刊行物の異なるバージョンが発行されていた場合、異なる指示がない限り、本出願の有効な出願日に最も近く発行されたバージョンを意味する。本発明の任意の特徴、工程、要素、実施態様、または局面は、特に異なって指示されない限り任意の他のものと組み合わせて用いられ得る。本発明は、明快さおよび理解のため、例証または例示の形で一部の詳細を説明されたが、添付された特許請求の範囲の範囲内で、特定の変化または改変を行い得るということが明らかである。
【実施例0144】
実施例１：多発性骨髄腫細胞株におけるＮＴＢ－Ａの発現
Ａｍｏ－１、ＪＪＮ－３、Ｋａｒｐａｓ－６２０、ＫＭＳ－１２－ＢＭ、ＭＯＬＰ－８、ＯＰＭ－２（ＤＳＭＺ；ＲＰＭＩ１６４０＋２０％ＦＢＳ）、Ｌ－３６３（ＤＳＭＺ；ＲＰＭＩ１６４０＋１５％ＦＢＳ）、ＬＰ－１、ＳＫ－ＭＭ－２（ＤＳＭＺ；ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）、ＥＪＭ（ＤＳＭＺ；ＥＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ）、ＭＭ．１Ｒ、ＭＭ．１Ｓ、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＲＰＭＩ－８２２６（ＡＴＣＣ；ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）、およびＵ－２６６（ＡＴＣＣ；ＲＰＭＩ１６４０＋１５％ＦＢＳ）細胞株を、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。５００，０００細胞を、ＦＡＣｓバッファー（ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウム）中で４５分間、氷上で、抗ＮＴＢ－Ａ抗体ＮＴ－７および１１Ａ１を用いて染色した。ＰＥ結合体化二次抗体を検出に用いた。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、染色された細胞を分析した。
Ａｍｏ－１、ＪＪＮ－３、Ｋａｒｐａｓ－６２０、ＫＭＳ－１２－ＢＭ、ＭＯＬＰ－８、ＯＰＭ－２（ＤＳＭＺ；ＲＰＭＩ１６４０＋２０％ＦＢＳ）、Ｌ－３６３（ＤＳＭＺ；ＲＰＭＩ１６４０＋１５％ＦＢＳ）、ＬＰ－１、ＳＫ－ＭＭ－２（ＤＳＭＺ；ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）、ＥＪＭ（ＤＳＭＺ；ＥＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ）、ＭＭ．１Ｒ、ＭＭ．１Ｓ、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＲＰＭＩ－８２２６（ＡＴＣＣ；ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）、およびＵ－２６６（ＡＴＣＣ；ＲＰＭＩ１６４０＋１５％ＦＢＳ）細胞株を、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。５００，０００細胞を、ＦＡＣｓバッファー（ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウム）中で４５分間、氷上で、抗ＮＴＢ－Ａ抗体ＮＴ－７および１１Ａ１を用いて染色した。ＰＥ結合体化二次抗体を検出に用いた。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、染色された細胞を分析した。
【0145】
１５中５つの多発性骨髄腫細胞株、Ｋａｒｐａｓ６２０、ＥＪＭ、ＭＭ．１Ｒ、ＭＭ．１ＳおよびＵ－２６６上で、ＮＴＢ－Ａが発現していることが示された。
【0146】
実施例２：多発性骨髄腫患者サンプルにおけるＮＴＢ－Ａの発現
凍結ヒト多発性骨髄腫患者骨髄吸引サンプル（５００万～１０００万細胞）を、ＢｉｏＳｅｒｖｅ（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ），Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）、およびＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ（Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入した。ＭＭ患者骨髄細胞を３７℃で解凍し、予め温められたＲＰＭＩ１６４０培地に移し、そして細胞の凝集を最小化するために室温で１０分間ＤＮａｓｅＩ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）により処理した。次に、細胞を遠心分離（１，４００ｒｐｍ；５分）し、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳに再懸濁し、そして、トリパンブルー排除法によって細胞数／生存を測定した。次に、患者細胞を遠心分離し、氷上のＦＡＣｓバッファー（ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ、＋０．０２％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、いかなる残骸も取り除くように１００μｍセルストレーナーによってろ過し、そして１００μＬの細胞懸濁液を染色のためにＶ底９６ウェルプレートのウェルに分注した（１．２×１０５～１．０×１０６生存細胞数／ウェル）。患者骨髄吸引細胞を、抗ｈＣＤ３８－ＦＩＴＣ、抗ｈＣＤ４５－ＡＰＣ、およびＰＥ結合体化抗ＮＴＢ－Ａ（クローン：ＮＴ－７）もしくはアイソタイプ対照ＩｇＧにより３重染色した（氷上で３０分）。染色した細胞を、ＦＡＣｓバッファー中で２回洗浄し、ＦＡＣｓＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーによる分析を行った。ＮＴＢ－Ａの細胞表面の発現を、多発性骨髄腫細胞ＣＤ３８＋／ＣＤ４５－にゲーティングされた亜集団について定量した。ＣＤ１３８（クローン：１Ｄ４）陽性対照多発性骨髄腫抗原の発現もまた測定した。
凍結ヒト多発性骨髄腫患者骨髄吸引サンプル（５００万～１０００万細胞）を、ＢｉｏＳｅｒｖｅ（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ），Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）、およびＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ（Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入した。ＭＭ患者骨髄細胞を３７℃で解凍し、予め温められたＲＰＭＩ１６４０培地に移し、そして細胞の凝集を最小化するために室温で１０分間ＤＮａｓｅＩ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）により処理した。次に、細胞を遠心分離（１，４００ｒｐｍ；５分）し、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳに再懸濁し、そして、トリパンブルー排除法によって細胞数／生存を測定した。次に、患者細胞を遠心分離し、氷上のＦＡＣｓバッファー（ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ、＋０．０２％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、いかなる残骸も取り除くように１００μｍセルストレーナーによってろ過し、そして１００μＬの細胞懸濁液を染色のためにＶ底９６ウェルプレートのウェルに分注した（１．２×１０５～１．０×１０６生存細胞数／ウェル）。患者骨髄吸引細胞を、抗ｈＣＤ３８－ＦＩＴＣ、抗ｈＣＤ４５－ＡＰＣ、およびＰＥ結合体化抗ＮＴＢ－Ａ（クローン：ＮＴ－７）もしくはアイソタイプ対照ＩｇＧにより３重染色した（氷上で３０分）。染色した細胞を、ＦＡＣｓバッファー中で２回洗浄し、ＦＡＣｓＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーによる分析を行った。ＮＴＢ－Ａの細胞表面の発現を、多発性骨髄腫細胞ＣＤ３８＋／ＣＤ４５－にゲーティングされた亜集団について定量した。ＣＤ１３８（クローン：１Ｄ４）陽性対照多発性骨髄腫抗原の発現もまた測定した。
【0147】
１５中１３の患者サンプルの表面上で、ＮＴＢ－Ａが発現していることが示された。以下の表３を参照：
【表3-1】
【表3-2】
【0148】
実施例３：抗体選択
ＮＴＢ－Ａ抗体産生マウスの脾臓およびリンパ節から回収したリンパ球を、骨髄腫細胞に融合した。融合細胞を、ハイブリドーマ生育培地中で一晩回復させた。回復に続いて、細胞をスピンダウンし、次に半固体培地中に播種した。ハイブリドーマをインキュベートし、ＩｇＧ産生ハイブリドーマクローンを選び取った。ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングし、ＮＴＢ－Ａ陽性細胞の表面上の蛍光シグナルの測定によって、４７８中３１３のハイブリドーマクローンが、ＮＴＢ－Ａ細胞外ドメインに対して特異的に結合することが見出された。細胞外ドメインＮＴＢ－Ａへの蛍光標識ＡＤＣの特異的結合を、２．０μｇ／ｍｌの濃度のＮＴＢ－Ａ発現性の多発性骨髄腫細胞のパネルを用いて、フローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）によって確認した。ＮＴＢ－Ａに結合する３１３のハイブリドーマを、国際出願第２０１１／１０９３０８号において説明される方法を用いてｖｃ－ＭＭＡＥと直接結合体化するために、展開した。直接結合体化された抗体のパネルを、結合アッセイおよび細胞傷害アッセイにおいて試験した。多発性骨髄腫細胞株との細胞傷害について、３１３のＮＴＢＡ－Ａ結合ＡＤＣをスクリーニングした。細胞傷害研究を、適切な生育培地にウェルあたり１５，０００の多発性骨髄腫細胞を播種することにより行った。細胞ベースの結合アッセイのために、抗ＮＴＢ－Ａ ｖｃＭＭＡＥ４－ロード抗体薬物結合体を、細胞上で１２．５、５０．０、および２００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で試験し、３７℃で合計９６時間インキュベートした。細胞の生存を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）蛍光アッセイを用いて測定し、ＡＤＣの効能を、非処理対照細胞に対する生存のパーセントに基づいて評価した。ＩＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて作った用量曲線から生成した。細胞傷害の閾値は、５０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０に設定した。ＡＤＣとして最も強力な６９の抗ＮＴＢＡモノクローナル抗体が、次へ進んだ。６９の最も強力なＡＤＣのうち６つのみが、１２．５ｎｇ／ｍｌより小さいＩＣ５０値を示した。飽和結合曲線およびＫｄ値を、高度に細胞傷害性の抗ＮＴＢ－Ａ ＡＤＣの小さいパネルについてフローサイトメトリーによって測定した。抗ＮＴＢ－Ａ １１Ａ１および２６Ｂ７抗体を有するＡＤＣが、最も細胞傷害性であることが決定された。
ＮＴＢ－Ａ抗体産生マウスの脾臓およびリンパ節から回収したリンパ球を、骨髄腫細胞に融合した。融合細胞を、ハイブリドーマ生育培地中で一晩回復させた。回復に続いて、細胞をスピンダウンし、次に半固体培地中に播種した。ハイブリドーマをインキュベートし、ＩｇＧ産生ハイブリドーマクローンを選び取った。ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングし、ＮＴＢ－Ａ陽性細胞の表面上の蛍光シグナルの測定によって、４７８中３１３のハイブリドーマクローンが、ＮＴＢ－Ａ細胞外ドメインに対して特異的に結合することが見出された。細胞外ドメインＮＴＢ－Ａへの蛍光標識ＡＤＣの特異的結合を、２．０μｇ／ｍｌの濃度のＮＴＢ－Ａ発現性の多発性骨髄腫細胞のパネルを用いて、フローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）によって確認した。ＮＴＢ－Ａに結合する３１３のハイブリドーマを、国際出願第２０１１／１０９３０８号において説明される方法を用いてｖｃ－ＭＭＡＥと直接結合体化するために、展開した。直接結合体化された抗体のパネルを、結合アッセイおよび細胞傷害アッセイにおいて試験した。多発性骨髄腫細胞株との細胞傷害について、３１３のＮＴＢＡ－Ａ結合ＡＤＣをスクリーニングした。細胞傷害研究を、適切な生育培地にウェルあたり１５，０００の多発性骨髄腫細胞を播種することにより行った。細胞ベースの結合アッセイのために、抗ＮＴＢ－Ａ ｖｃＭＭＡＥ４－ロード抗体薬物結合体を、細胞上で１２．５、５０．０、および２００ｎｇ／ｍＬの最終濃度で試験し、３７℃で合計９６時間インキュベートした。細胞の生存を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）蛍光アッセイを用いて測定し、ＡＤＣの効能を、非処理対照細胞に対する生存のパーセントに基づいて評価した。ＩＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて作った用量曲線から生成した。細胞傷害の閾値は、５０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０に設定した。ＡＤＣとして最も強力な６９の抗ＮＴＢＡモノクローナル抗体が、次へ進んだ。６９の最も強力なＡＤＣのうち６つのみが、１２．５ｎｇ／ｍｌより小さいＩＣ５０値を示した。飽和結合曲線およびＫｄ値を、高度に細胞傷害性の抗ＮＴＢ－Ａ ＡＤＣの小さいパネルについてフローサイトメトリーによって測定した。抗ＮＴＢ－Ａ １１Ａ１および２６Ｂ７抗体を有するＡＤＣが、最も細胞傷害性であることが決定された。
【0149】
実施例４：抗ＮＴＢ－Ａ内部移行アッセイ
マウス１１Ａ１抗体ｍｃＭＭＡＦ結合体を、そのＮＴＢ－Ａ＋細胞株Ｕ－２６６中に内部移行する能力について評価した（図１）。
マウス１１Ａ１抗体ｍｃＭＭＡＦ結合体を、そのＮＴＢ－Ａ＋細胞株Ｕ－２６６中に内部移行する能力について評価した（図１）。
【0150】
Ｕ－２６６抗原陽性細胞を、５μｇ／ｍＬの、抗ヒトＮＴＢ－Ａ抗体薬物結合体である１１Ａ１－ｍｃＭＭＡＦ（マレイミドカプロイルリンカー（ｍｃ）を介して、システイン結合を介した抗体あたり薬物４つのストイキオメトリに結合体化された抗有糸分裂作用物質ＭＭＡＦ）と４℃で３０分間、シェーカー上でインキュベートした。細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ウシ胎児血清で３回洗浄し、次に２つの同一の９６ウェルＵ底プレート（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中に、ウェルあたり５×１０５細胞／１００μＬでプレートアウトした。１つのプレートを３７℃に配置し、他方を４℃に配置した。１つのサンプルは、時間０のために、直ちに洗浄および染色した。両方のプレートから０．５、１、２、８、および２４時間の時点で細胞を回収し、低温洗浄バッファー（ＰＢＳ＋２．５％ウシ胎児血清）で２回洗浄し、そして、１０μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）により、氷上で光から保護して３０分間染色した。再び細胞を洗浄バッファーで２回洗浄し、５００μＬのＰＢＳ＋１％パラホルムアルデヒドによって固定した。一旦全ての細胞を回収および染色したら、ＦＡＣｓＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上でそれらを分析し、そして、データは、時間０のＭＦＩのパーセントとして表現された。
【0151】
実施例５：ＡＤＣ細胞傷害アッセイ
抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）を、マウス抗ＮＴＢ－Ａモノクローナル抗体１１Ａ１および２６Ｂ７について調製した。抗有糸分裂作用物質モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を、カテプシンで切断可能なバリン－シトルリン（ｖｃ）リンカーを介して抗ＮＴＢ－Ａ ｍＡｂに結合体化し、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を、マレイミドカプロイル（ｍｃ）リンカーを介して、米国特許第７，６５９，２４１号および第７，４９８２９８号において説明されるように、システイン結合を介した抗体あたり薬物４つのストイキオメトリに結合体化した。抗ＮＴＢ－Ａ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（４）ＡＤＣおよび抗ＮＴＢ－Ａ－ｍｃ－ＭＭＡＦ（４）ＡＤＣを、１０点の用量曲線（１，０００ｎｇ／ｍＬ～０．０５０８１ｎｇ／ｍＬ）を作製するために、培地中で３倍に連続的に希釈し、９６ウェルアッセイプレート中で培養した多発性骨髄腫細胞にアプライした。Ｋａｒｐａｓ－６２０、ＥＪＭ、ＭＭ．１Ｒ、ＭＭ．１Ｓ、Ｕ－２６６（ＮＴＢ－Ａ＋）、およびＬ３６３（ＮＴＢ－Ａ－）多発性骨髄腫細胞株を、抗ＮＴＢ－Ａ ＡＤＣにより４連で処理し、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。細胞を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ蛍光細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて生存についてアッセイし、そしてＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてデータを収集した。用量効果曲線およびＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算した。
抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）を、マウス抗ＮＴＢ－Ａモノクローナル抗体１１Ａ１および２６Ｂ７について調製した。抗有糸分裂作用物質モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を、カテプシンで切断可能なバリン－シトルリン（ｖｃ）リンカーを介して抗ＮＴＢ－Ａ ｍＡｂに結合体化し、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を、マレイミドカプロイル（ｍｃ）リンカーを介して、米国特許第７，６５９，２４１号および第７，４９８２９８号において説明されるように、システイン結合を介した抗体あたり薬物４つのストイキオメトリに結合体化した。抗ＮＴＢ－Ａ－ｖｃ－ＭＭＡＥ（４）ＡＤＣおよび抗ＮＴＢ－Ａ－ｍｃ－ＭＭＡＦ（４）ＡＤＣを、１０点の用量曲線（１，０００ｎｇ／ｍＬ～０．０５０８１ｎｇ／ｍＬ）を作製するために、培地中で３倍に連続的に希釈し、９６ウェルアッセイプレート中で培養した多発性骨髄腫細胞にアプライした。Ｋａｒｐａｓ－６２０、ＥＪＭ、ＭＭ．１Ｒ、ＭＭ．１Ｓ、Ｕ－２６６（ＮＴＢ－Ａ＋）、およびＬ３６３（ＮＴＢ－Ａ－）多発性骨髄腫細胞株を、抗ＮＴＢ－Ａ ＡＤＣにより４連で処理し、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。細胞を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ蛍光細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて生存についてアッセイし、そしてＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてデータを収集した。用量効果曲線およびＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算した。
【化2】
【化3】
【0152】
実施例６：競合的結合アッセイ
本実施例で説明されるアッセイは、１１Ａ１マウス抗体と結合について競合するサンプル抗体の能力を評価するために用いられる方法を詳述する。この特定の研究のために、２６Ｂ７抗体およびＮＴ－７抗体（クローン：ＮＴ－７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１７２０８））の１１Ａ１抗体と競合する能力を評価した。また１１Ａ１抗体のそれ自体と競合する能力についても評価した。アッセイは、マウス１１Ａ１ ＩｇＧ１抗体を含む「リファレンス抗体」（すなわち、天然（ｎａｔｉｖｅ）（天然（ｎａｔｕｒａｌ））の抗体の２価構造中のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、すなわち、イムノグロブリン鎖の２つの同一のペアからなる４量体であって、それぞれのペアは、１つの軽鎖および１つの重鎖を有する）を利用する。
本実施例で説明されるアッセイは、１１Ａ１マウス抗体と結合について競合するサンプル抗体の能力を評価するために用いられる方法を詳述する。この特定の研究のために、２６Ｂ７抗体およびＮＴ－７抗体（クローン：ＮＴ－７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１７２０８））の１１Ａ１抗体と競合する能力を評価した。また１１Ａ１抗体のそれ自体と競合する能力についても評価した。アッセイは、マウス１１Ａ１ ＩｇＧ１抗体を含む「リファレンス抗体」（すなわち、天然（ｎａｔｉｖｅ）（天然（ｎａｔｕｒａｌ））の抗体の２価構造中のＶＨドメインおよびＶＬドメイン、すなわち、イムノグロブリン鎖の２つの同一のペアからなる４量体であって、それぞれのペアは、１つの軽鎖および１つの重鎖を有する）を利用する。
【0153】
細胞あたり約２４，５００のＮＴＢ－Ａ表面分子を発現させる指数増殖ＮＴＢ－Ａ陽性細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞）を回収し、等張リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、氷上で保管した。ＮＴＢ－Ａ陽性細胞は、氷上の９６ウェルＶ底プレートのウェルに、ウェルあたり１００μＬの体積中のウェルあたり２×１０５細胞で、分注した。
【0154】
蛍光標識（例えば、ＡＦ６４７）と結合体化したリファレンス抗体の２倍濃縮物を、ＰＢＳ／ＦＢＳ（２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳ／０．０２％アジ化ナトリウム）中で調製し、１倍濃縮物が０．０１８８μｇ／ｍＬ（１１Ａ１ｍＡｂのＫｄ値濃度）と等しくなるようにした。次に、このＰＢＳ／ＦＢＳ／標識Ａｂ溶液を、９６ウェル希釈プレート（２００μＬ／ウェル）のウェルに分注した。ウェルの行Ａは、ＰＢＳ／ＦＢＳ／標識Ａｂ溶液中の非標識サンプル抗体の最初の２倍ミックスのために残した（以下の項目（４）を参照）；対照のために十分なウェルもまた残した。
【0155】
非標識サンプル抗体（競合的結合について評価される）の２倍濃縮物を、ＰＢＳ／ＦＢＳ ＡＦ標識Ａｂ溶液（２０μｇ／ｍＬのサンプル抗体；したがって、１倍濃縮物は１０μｇ／ｍＬに等しい）中で調製した。次に、非標識サンプル抗体の２倍濃縮物を、９６ウェル希釈プレートの最初の列のウェルに分注した。次に、サンプルを５倍の希釈系列（最初のサンプル希釈から５０μＬを、次の行の２００μＬのＰＢＳ／ＦＢＳ／標識Ａｂ溶液に加え、それをプレートの行から行へと繰り返す）で連続的に希釈した。
【0156】
十分なウェル（例えば、ウェルＡ１からＡ６）を、フローサイトメトリーのセットアップおよび非染色ウェルのために残し、ＰＢＳ／ＦＢＳのみ（標識リファレンス抗体なし）を加えた。これらのウェルは、非染色対照（０％染色）として用いた。十分なウェル（例えば、ウェルＡ７からＡ１２）をまた、１００％染色として働くように残し、非標識サンプル抗体なしのＰＢＳ／ＦＢＳ／標識Ａｂ溶液を入れた。
【0157】
次に、希釈プレートの１００μＬの希釈されたサンプルを、Ｖ底プレートの細胞（１００μＬ）の対応するウェルに２連で移動させ、１倍の濃縮物を得た。次に、これらのサンプルを光から保護して氷上で１時間インキュベートした。
【0158】
次に、ＰＢＳ／ＦＢＳで細胞を２回洗浄した。例えば、プレートを１０００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、上清を捨て、細胞を分散させるためにプレートをボルテックスし、そして洗浄バッファー（ＰＢＳ／ＦＢＳ）を加えた（約２００μＬ／ウェル／洗浄）；最後のスピンの後、プレートを裏返し、穏やかに乾燥させた。
【0159】
洗浄に続いて、細胞ペレットを２５０μＬのＰＢＳ／ＦＢＳに再懸濁し、そして、フローサイトメーター（例えば、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で分析するまで、光から保護して２～８℃で細胞を保管した。
【0160】
フローサイトメーター上では、目的の細胞集団を、集団プロットを得るための前方散乱および側方散乱集団（ＦＳＣ／ＳＳＣ）のゲーティングにより単離し、蛍光標識の蛍光シグナルを取得した。
【0161】
次に、フローサイトメトリーのデータを、シグモイド用量－応答分析（可変勾配）を用いて分析した。非標識抗体のＩＣ５０を、あてはめた曲線から決定した（すなわち、標識リファレンス抗体が最大結合の５０％を示す非標識サンプル抗体の濃度）。
【0162】
１１Ａ１抗体は、それ自体と、および抗体２６Ｂ７と競合したが、抗体ＮＴ－７とは競合しなかった。非標識サンプル抗体の１０ｕｇ／ｍｌの濃度における最大の結合の４５％未満まで（好ましくは、２０％未満まで、または１０％未満にまでも）１１Ａ１結合を低減させるこれらの抗体のみが、ＮＴＢ－Ａへの結合について１１Ａ１と競合すると考えられる。
【0163】
１１Ａ１および２６Ｂ７抗体を、米国特許第７，８７４，０６７号において説明されるＦＡＣＳに基づく競合アッセイを用いて、４８０．１２抗体との競合についても試験した。１１Ａ１および２６Ｂ７抗体は、そのようなアッセイでは、４８０．１２抗体と結合について競合しなかった（データは示されていない）。
【0164】
実施例７：ｍＡｂアフィニティ測定および結合特異性
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７と結合体化したマウス抗ヒトＮＴＢ－Ａ抗体（１１Ａ１および２６Ｂ７）の用量滴定を用いて、飽和結合曲線を生成した。抗原陽性Ｒａｍｏｓ細胞を、９６ウェルＶ底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に、ウェルあたり１×１０５細胞で播種した。２倍濃縮抗体の３倍連続希釈をＦＡＣｓバッファー（ＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清＋０．０２％アジ化物）中で調製し、２連で細胞に加えた。抗体溶液を氷上で１時間、光から保護して細胞とインキュベートした。細胞をＦＡＣｓバッファーで２回洗浄し、そしてＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によりＫＤ値を決定した。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７と結合体化したマウス抗ヒトＮＴＢ－Ａ抗体（１１Ａ１および２６Ｂ７）の用量滴定を用いて、飽和結合曲線を生成した。抗原陽性Ｒａｍｏｓ細胞を、９６ウェルＶ底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に、ウェルあたり１×１０５細胞で播種した。２倍濃縮抗体の３倍連続希釈をＦＡＣｓバッファー（ＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清＋０．０２％アジ化物）中で調製し、２連で細胞に加えた。抗体溶液を氷上で１時間、光から保護して細胞とインキュベートした。細胞をＦＡＣｓバッファーで２回洗浄し、そしてＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によりＫＤ値を決定した。
【0165】
マウス抗ヒトＮＴＢ－Ａ抗体１１Ａ１および２６Ｂ７を、Ｕ－２６６多発性骨髄腫細胞、ならびに２９３－Ｆ１７／ｈＮＴＢ－Ａアイソフォーム４および２９３－Ｆ１７／カニクイザルＮＴＢ－Ａの安定な形質導入体に対する結合について試験した。細胞を、ＦＡＣＳバファー（ＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清＋０．０２％アジ化物）中で２．５×１０５細胞／ウェルで播種し、そして氷上で４５分間２μｇ／ｍＬの抗体とインキュベートした。細胞を２回洗浄し、氷上で光から保護して３０分間、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）により染色した。細胞を再びＦＡＣｓバッファーで２回洗浄し、そして、５００μＬの１×ＰＢＳ＋１％パラホルムアルデヒドで固定した。染色された細胞を、ＦＡＣｓ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で分析した。
【化4】
【0166】
実施例８：インビボＭＭ異種移植研究
ＮＯＤｓｃｉｄＩＬ２レセプターガンマ鎖ノックアウト（ＮＳＧ）マウスを用いて、腫瘍細胞が骨髄区画に局在化する、多発性骨髄腫の播種性細胞株モデルを開発する。１００万個のＭＭ．１Ｒ多発性骨髄腫細胞または５００万個のＵ－２６６多発性骨髄腫細胞をマウスに移植し、次に、腫瘍細胞移植の５日後に抗ＮＴＢ－Ａ抗体薬物結合体を投薬する。４つのｖｃＭＭＡＥ分子をロードしたｖｃＭＭＡＥ抗ＮＴＢ－Ａ抗体薬物結合体を、１．０および３．０ｍｇ／ｋｇの単回用量で腹腔内注射によりマウスに送達する。多発性骨髄腫腫瘍細胞により分泌される循環ラムダ軽鎖Ｉｇのレベルについて、抗体薬物結合体の投薬後、２から３週間ごとにＥＬＩＳＡアッセイによりマウス血清をモニターする。それぞれの研究グループのマウスは、疾患進行の徴候、および罹患率について評価し、疾患の進行した徴候により屠殺する。対照および処置研究グループについて、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存プロットを生成し、それぞれのＡＤＣ用量レベルにおいて観察された抗腫瘍活性の、ビヒクル対照もしくは非結合対照ＡＤＣに対する有意性を決定するために統計的分析を行う。
ＮＯＤｓｃｉｄＩＬ２レセプターガンマ鎖ノックアウト（ＮＳＧ）マウスを用いて、腫瘍細胞が骨髄区画に局在化する、多発性骨髄腫の播種性細胞株モデルを開発する。１００万個のＭＭ．１Ｒ多発性骨髄腫細胞または５００万個のＵ－２６６多発性骨髄腫細胞をマウスに移植し、次に、腫瘍細胞移植の５日後に抗ＮＴＢ－Ａ抗体薬物結合体を投薬する。４つのｖｃＭＭＡＥ分子をロードしたｖｃＭＭＡＥ抗ＮＴＢ－Ａ抗体薬物結合体を、１．０および３．０ｍｇ／ｋｇの単回用量で腹腔内注射によりマウスに送達する。多発性骨髄腫腫瘍細胞により分泌される循環ラムダ軽鎖Ｉｇのレベルについて、抗体薬物結合体の投薬後、２から３週間ごとにＥＬＩＳＡアッセイによりマウス血清をモニターする。それぞれの研究グループのマウスは、疾患進行の徴候、および罹患率について評価し、疾患の進行した徴候により屠殺する。対照および処置研究グループについて、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存プロットを生成し、それぞれのＡＤＣ用量レベルにおいて観察された抗腫瘍活性の、ビヒクル対照もしくは非結合対照ＡＤＣに対する有意性を決定するために統計的分析を行う。
【図1】
【図2】
【配列表】
【外国語明細書】