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特開2022-67052１４－デオキシコレオンＵを含まないコレウス・フォルスコリ抽出物の組成と合成方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022067052
(43)【公開日】2022-05-02
(54)【発明の名称】１４－デオキシコレオンＵを含まないコレウス・フォルスコリ抽出物の組成と合成方法
(51)【国際特許分類】
A61K 36/53 20060101AFI20220422BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220422BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220422BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220422BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220422BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220422BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220422BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220422BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20220422BHJP
【ＦＩ】
A61K36/53
A61P3/04
A61P29/00
A61P9/00
A61P3/06
A61P43/00 111
A61P1/16
A61P3/10
A23L33/105
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021123635
(22)【出願日】2021-07-28
(31)【優先権主張番号】202041042903
(32)【優先日】2020-10-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(71)【出願人】
【識別番号】521333151
【氏名又は名称】スター ハイ ハーブス ピーヴィーティー エルティーディー．
【氏名又は名称原語表記】ＳＴＡＲ ＨＩ ＨＥＲＢＳ ＰＶＴ ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】ヒレハル，フサイン ミルザ フィロズ
(72)【発明者】
【氏名】ナンジュンダイアー，シンガム セッティー
【テーマコード（参考）】
4B018
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B018ME01
4B018ME03
4B018ME04
4B018MF01
4B018MF06
4B018MF14
4C088AB38
4C088BA08
4C088CA06
4C088CA14
4C088MA16
4C088MA23
4C088MA35
4C088MA37
4C088MA41
4C088MA43
4C088NA20
4C088ZA36
4C088ZA70
4C088ZA75
4C088ZB11
4C088ZC33
4C088ZC35
4C088ZC41
(57)【要約】 （修正有）
【課題】１４－デオキシコレオンＵを含まないコレウス・フォルスコリ抽出物の抽出方法を提供する。
【解決手段】（ａ）原材料を取得すること、（ｂ）原材料の抽出を実施し、抽出物を収集すること、（ｃ）抽出物から油を除去し、抽出物をエタノールに溶解すること、（ｄ）抽出物から余分な油を除去することであって、余分な油は、抽出物の炭化を実施することによって除去すること、（ｅ）抽出物をフィルタリングすること、（ｆ）抽出物を濃縮すること、（ｇ）抽出物を結晶化することであって、結晶化は５～１０℃で３日間行われること、（ｈ）抽出物をフィルタリングすること、（ｉ）抽出物のシリカゲルクロマトグラフィーを実施して画分を分離し、得られた抽出物は、患者に脂肪肝を引き起こす１４－デオキシコレオンＵ化合物を含まないこと、（ｊ）画分を乾燥させてＣ．フォルスコリ抽出物を得ること、を含む方法である。
【選択図】図１
【解決手段】（ａ）原材料を取得すること、（ｂ）原材料の抽出を実施し、抽出物を収集すること、（ｃ）抽出物から油を除去し、抽出物をエタノールに溶解すること、（ｄ）抽出物から余分な油を除去することであって、余分な油は、抽出物の炭化を実施することによって除去すること、（ｅ）抽出物をフィルタリングすること、（ｆ）抽出物を濃縮すること、（ｇ）抽出物を結晶化することであって、結晶化は５～１０℃で３日間行われること、（ｈ）抽出物をフィルタリングすること、（ｉ）抽出物のシリカゲルクロマトグラフィーを実施して画分を分離し、得られた抽出物は、患者に脂肪肝を引き起こす１４－デオキシコレオンＵ化合物を含まないこと、（ｊ）画分を乾燥させてＣ．フォルスコリ抽出物を得ること、を含む方法である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コレウス・フォルスコリの抽出物を合成する方法であって、
（ａ）原材料を取得すること、
（ｂ）原材料の抽出を実施し、抽出物を収集すること、
（ｃ）抽出物から油を除去し、抽出物をエタノールに溶解すること、
（ｄ）抽出物から余分な油を除去することであって、余分な油は、抽出物の炭化を実施することによって除去すること、
（ｅ）抽出物をフィルタリングすること、
（ｆ）抽出物を濃縮すること、
（ｇ）抽出物を結晶化することであって、結晶化は５～１０℃で３日間行われること、
（ｈ）抽出物をフィルタリングすること、
（ｉ）抽出物のシリカゲルクロマトグラフィーを実施して画分を分離し、得られた抽出物は、患者に脂肪肝を引き起こす１４－デオキシコレオンＵ化合物を含まないこと、
（ｊ）画分を乾燥させてＣ．フォルスコリ抽出物を得ること、を含む方法。
（ａ）原材料を取得すること、
（ｂ）原材料の抽出を実施し、抽出物を収集すること、
（ｃ）抽出物から油を除去し、抽出物をエタノールに溶解すること、
（ｄ）抽出物から余分な油を除去することであって、余分な油は、抽出物の炭化を実施することによって除去すること、
（ｅ）抽出物をフィルタリングすること、
（ｆ）抽出物を濃縮すること、
（ｇ）抽出物を結晶化することであって、結晶化は５～１０℃で３日間行われること、
（ｈ）抽出物をフィルタリングすること、
（ｉ）抽出物のシリカゲルクロマトグラフィーを実施して画分を分離し、得られた抽出物は、患者に脂肪肝を引き起こす１４－デオキシコレオンＵ化合物を含まないこと、
（ｊ）画分を乾燥させてＣ．フォルスコリ抽出物を得ること、を含む方法。
【請求項2】
シリカゲルクロマトグラフィーを実施するステップが、
シリカカラムを詰めたガラスカラムを使用すること、
サンプルをカラムにロードすること、
サンプルをヘキサンで１ｍｌ／分の流速で溶出すること、
最初の１０画分を廃棄し、次にヘキサンとジエチルエーテルの組み合わせでグラジエント溶出を開始すること、
１４－デオキシコロンを含む画分を収集し、１００％酢酸エチルで溶出して、１４－デオキシコロンを含まない抽出物を得ること、
抽出物を濃厚なペーストに濃縮し、エタノールを加えること、及び、
エタノールを完全に蒸留し、残留物を乾燥させることを、含む、請求項1に記載の方法。
シリカカラムを詰めたガラスカラムを使用すること、
サンプルをカラムにロードすること、
サンプルをヘキサンで１ｍｌ／分の流速で溶出すること、
最初の１０画分を廃棄し、次にヘキサンとジエチルエーテルの組み合わせでグラジエント溶出を開始すること、
１４－デオキシコロンを含む画分を収集し、１００％酢酸エチルで溶出して、１４－デオキシコロンを含まない抽出物を得ること、
抽出物を濃厚なペーストに濃縮し、エタノールを加えること、及び、
エタノールを完全に蒸留し、残留物を乾燥させることを、含む、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
コレウス・フォルスコリ植物の根を取り、根を粉砕して粉末を得ることにより原料を調製する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
抽出物が抽出器およびアルコールを使用して実施され、アルコールが７０％の濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
抽出物を最初に水で洗浄することによって油を除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
１４－デオキシコレオンＵを含まない抽出物が、肥満の治療のために患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
抽出物が、それを必要とする哺乳動物の除脂肪体重を促進するために、治療有効量で患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
抽出物が、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、ＧＳＨ、ＴＢＲ、ＳＯＤおよびＣＡＤからなる群から選択される上昇した肝酵素を正常化することによって、食餌誘発性肝機能障害を予防し、肝機能を改善する、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
抽出物は、１４－デオキシコレオンＵを含まず、患者の炎症の治療に使用される、請求項1に記載の方法。
【請求項10】
コレウス・フォルスコリ植物の抽出物を含む医薬組成物であって、高脂血症および心血管疾患のリスクに関連する糖尿病の治療に有効である、医薬組成物。
【請求項11】
コレウス・フォルスコリ植物の抽出物を含む医薬組成物であり、医薬組成物は酵素アデニリルシクラーゼを活性化し、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させ、ｃＡＭＰは、ホルモン感受性リパーゼをリン酸化してこの酵素の活性形態を生成するプロテインキナーゼの活性を刺激する、医薬組成物。
【請求項12】
コレウス・フォルスコリ植物の抽出物を含む医薬組成物であって、この組成物は、液体、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、シロップ、エリキシル、植物性医薬品および栄養補助食品を含む群から選択される剤形に処方される、医薬組成物。
【請求項13】
コレウス・フォルスコリ植物の抽出物を含む医薬組成物であって、抽出物の治療有効量が、抽出物が投与される個体の体重１キログラムあたり０．０１ｍｇから５００ｍｇの間である、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、薬草抽出物に関し、特に、コレウス植物の抽出物に関する。本発明は、より具体的にコレウスの抽出物を合成する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
コレウス・フォルスコリ（ＣＦ）は、歴史的にアーユルヴェーダ医学で使用されてきた南アジアのハーブである。コレウス・フォルスコリ植物の根にはフォルスコリが含まれている。フォルスコリは、除脂肪体重を促進し、健康的な代謝機能をサポートすることで、一部の人の健康を改善することが実証されている生物学的に活性な化合物である。 コレウス・フォルスコリ植物は、このような高血圧と胸痛（狭心症）、ならびに喘息などの呼吸器疾患などの治療の心臓疾患に古くから用いられてきた。
【0003】
Ｃ．フォルスコリ抽出物の多くの製剤が開発されており、最先端技術で入手可能である。Ｃ．フォルスコリ抽出物は、肥満、肝毒性、心血管系、呼吸器系、中枢神経系の治療のための重要なファットバーナーを使用することである。現在、ファットバーナーによって引き起こされる脂肪肝の治療に利用できる解決策は、抗肝毒性薬を使用することである。これは、肝毒性を引き起こすＣ．フォルスコリ抽出物に存在する植物成分の一部が原因である。肝臓毒性に関する最近の報告、すなわち、マウスの肝チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）と脂肪肝はＣ．フォルスコリ抽出物に存在する未知の化合物によって肝臓毒性が誘発されることを示した。さらに、この研究は、主成分フォルスコリが肝臓毒性に対してゼロの寄与を示し、人間の消費に対して安全であることを示した。
【0004】
したがって、肝毒性は１４－デオキシコレオンＵを含むＣ．フォルスコリ抽出物 （フォーススリム）の消費によって引き起こされる。マウスでのいくつかのインビボ研究では、コレウス・フォルスコリ抽出物の消費を中止すると毒性効果が元に戻ることも示された。不利な条件では、肝移植が唯一の解決策になるかもしれない。
【0005】
Ｃ．フォルスコリ抽出物の主成分はジテルペン化合物であり、その中で１４－デオキシコレオンＵが肝毒性の主な原因である。したがって、Ｃ．フォルスコリ抽出物中に脂肪肝を積極的に誘導する未知の化合物は１４－デオキシコレオンＵである可能性がある。ファットバーナーの消費によって引き起こされる肝毒性、すなわちコレウス・フォルスコリ抽出物を含む１４－デオキシコレオンＵおよび誘発された肝毒性は通常、いくつかの副作用（文書化および非文書化）を有する可能性がある抗肝毒性薬で治療される。コレウス・フォルスコリエキスは肥満、心血管障害、腺癌などの他の主要な病気の薬として投与されており、治療は通常特定の期間であるため、一般的にコレウス・フォルスコリ抽出物の不連続な使用は完全な解決策とは見なされません。このように、不連続な使用は他の病気の治療に影響を与える。
【0006】
したがって、化合物１４－デオキシコレオンＵが除去され、それによってハーブの栄養補助食品および植物医薬品を含むＣ．フォルスコリ抽出物の安全性、そしてとりわけ健康を確保し、安全が守られるＣ．フォルスコリの抽出物を調製する方法を考え出す必要がある。
【0007】
付加価値および上記の欠点、不利な点、および問題は、以下に詳述するように、本明細書で対処される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
したがって、本発明の主な目的は、Ｃ．フォルスコリ植物の抽出物から１４－デオキシコレオンＵの化合物を除去する方法を提供することである。
【0009】
本発明の別の目的は、患者における肝毒性の原因である化合物１４－デオキシコレオンＵの脱離を伴うＣ．フォルスコリ植物の抽出物を合成する方法を提供することである。
【0010】
本発明のさらに別の目的は、１４－デオキシコレオンＵ化合物を除去してＣ．フォルスコリ植物の抽出物を合成して、この化合物の存在によって引き起こされる肝毒性を低減する方法を提供することである。
【0011】
本発明のさらに他の目的は、肥満の治療に使用するために、１４－デオキシコレオンＵ化合物を含まないＣ．フォルスコリの抽出物を提供することである。
【0012】
本発明のさらに他の目的は、それを必要とする哺乳動物の除脂肪体重を促進するために、１４－デオキシコレオンＵ化合物化合物を含まないＣ．フォルスコリの抽出物を提供することである。。
【0013】
本発明のさらに別の目的は、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、ＧＳＨ、ＴＢＲ、ＳＯＤおよびＣＡＤからなる群から選択される上昇した肝酵素を正常化することにより、食事誘発性肝機能障害を予防し、肝機能を改善する１４－デオキシコレオンＵ化合物を含まないＣ．フォルスコリ抽出物を提供することである。
【0014】
本発明のさらに他の目的は、炎症性疾患の治療のために、１４－デオキシコレオンＵ化合物からのＣ．フォルスコリの抽出物を提供することである。
【0015】
本発明のさらに他の目的は、高脂血症及び心血管疾患のリスクと関連する糖尿病の治療に使用される、１４－デオキシコレオンＵ化合物からのＣ．フォルスコリの抽出物を提供することである。
【0016】
本発明のさらに別の目的は、酵素アデニリルシクラーゼを活性化し、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させる１４－デオキシコレオンＵ化合物を含まないＣ．フォルスコリの抽出物を提供することであり、ここで、ｃＡＭＰは、ホルモン感受性リパーゼをリン酸化して、この酵素の活性型を生成するプロテインキナーゼの活性を刺激する。
【0017】
本発明のさらに他の目的は、液体、粉末、顆粒、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、エリキシル剤、植物性医薬品、及び、栄養補助食品を含む群から選択される剤形に製剤化されている１４－デオキシコレオンＵ化合物を含まないＣ．フォルスコリの抽出物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0018】
本発明の実施形態は、コレウス・フォルスコリ抽出物を合成する方法を提供する。
【0019】
（ａ）原材料をとりだす。
【0020】
（ｂ）原材料の抽出を実施し、抽出物を収集する。
【0021】
（ｃ）抽出物から油を除去し、抽出物をエタノールに溶解する。
【0022】
（ｄ）余分な油を抽出の炭化を行うことにより除去された抽出物から余分な油を取り除く。
【0023】
（ｅ）抽出物をフィルタリングする。
【0024】
（ｆ）抽出物を濃縮する。
【0025】
（ｇ）抽出物を結晶化する。ここで、結晶化は５～１０℃で３日間行われる。
【0026】
（ｈ）抽出物をフィルタリングする。
【0027】
（ｉ）抽出物のシリカゲルクロマトグラフィーを実施して結晶を分離し、得られた抽出物は、患者に脂肪肝を引き起こす１４－デオキシコレオンＵ化合物を含まない。
【0028】
（ｊ）残留物を乾燥させてＣ．フォルスコリ抽出物（１－９９％）を得る。
【0029】
本発明の一実施形態によれば、シリカゲルクロマトグラフィーを実施するステップは、シリカカラムが充填されたガラスカラムを使用することを含む。シリカカラムの長さが２フィートであり、シリカカラムの直径は２．５インチである。サンプルがカラムにロードされる。サンプルは、１ｍｌ／分の流速でヘキサンで溶出される。最初の１０個のフラクションは廃棄され、その後、ヘキサンとジエチルエーテルの組み合わせで（１００：０）から（８０:２０）までグラジエント溶出が開始される。１４－デオキシコレオンを含む画分を収集し、１００％酢酸エチルで溶出して、１４－デオキシコロエンを含まない抽出物を取得する。抽出物は、濃厚なペーストになるまで濃縮し、エタノールを添加する。エタノールを完全に留去し、残留物を乾燥させる。
【0030】
本発明の実施形態によれば、原材料は、コレウス・フォルスコリ植物の根を取り、粉末を得るために根を粉砕することによって製造される。
【0031】
本発明の実施形態によれば、抽出は、アルコールは７０％の濃度を有し、抽出及びアルコールを用いて行われる。
【0032】
本発明の実施形態によれば、油は水との最初の洗浄抽出により除去される。
【0033】
本発明の一実施形態によれば１４－デオキシコレオンＵを含まない抽出物が、肥満の治療のために患者に投与される。
【0034】
本発明の実施形態によれば、抽出物は、その必要のある哺乳動物における除脂肪体重を促進するために患者に治療有効量で投与される。
【0035】
本発明の実施形態によれば、抽出を防止食餌誘発性肝障害とは、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、ＧＳＨ、ＴＢＲ、ＳＯＤ及びＣＡＤからなる群から選択される肝臓酵素の上昇を正常化し、肝機能を改善する。
【0036】
本発明の実施形態によれば、抽出物は、１４－デオキシコレオンＵを含まず、患者における炎症の治療のために使用される。
【0037】
本発明の別の実施形態によれば、製薬組成物は、コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）植物の抽出物を含み、高脂血症及び心血管疾患のリスクと関連する糖尿病の治療に有効である。
【0038】
本発明の実施形態によれば、医薬組成物は、
コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）植物の抽出物を含む医薬組成物であり、医薬組成物は酵素アデニリルシクラーゼを活性化し、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させ、ｃＡＭＰは、ホルモン感受性リパーゼをリン酸化してこの酵素の活性形態を生成するプロテインキナーゼの活性を刺激する。
コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）植物の抽出物を含む医薬組成物であり、医薬組成物は酵素アデニリルシクラーゼを活性化し、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させ、ｃＡＭＰは、ホルモン感受性リパーゼをリン酸化してこの酵素の活性形態を生成するプロテインキナーゼの活性を刺激する。
【0039】
本発明の実施形態によれば、コレウス・フォルスコリ植物の抽出物を含む医薬組成物は、組成物は、液体、粉末、顆粒、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、エリキシル剤、植物性医薬品および栄養補助食品を含む群から選択される剤形に製剤化される。
【0040】
本発明の実施形態によれば、抽出物の治療有効量は、抽出物が投与される個体の体重１キログラムあたり０．０１ｍｇから５００ｍｇの間である、コレウス・フォルスコリ植物の抽出物を含む。
【0041】
実施形態のこれらおよび他の態様は、本明細書でより良く理解し、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮すると理解されるであろう。なお、以下の説明は、好ましい実施形態及び多くの具体的な詳細を示すが、例示のために与えられ、限定ではなくことが理解されるべきである。多くの変更および修正がその精神から逸脱することなく、本明細書の実施形態の範囲内で行うことができ、本明細書の実施形態は、すべての修飾を含む。
【0042】
他の目的、特徴および利点は、好ましい実施形態の以下の説明および添付の図面から当業者に生じるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0043】
【図5】図５は、試験化合物への曝露後に倒立光学顕微鏡によって撮影された３Ｔ３Ｌ１細胞の画像を示している。（A）条件培地、（B）標準メトホルミン、薬剤（１００μＭ）、及び（C）を４００μｇ／ｍｌの本発明の実施形態による、２４時間細胞を処理したＣ．フォルスコリ根の抽出物。
【図6】図６は、与えられた未処理の３Ｔ３Ｌ１細胞における蛍光２-（N-（７-ニトロベンズ-２-オキサ-１,３-ジアゾール-４-イル）アミノ）-２-デオキシグルコース（２-NBDG）の存在を表現グラフを重ね本発明の実施形態による、（カラーラインブラック）と、標準的な薬物処理細胞（メトホルミン、１００μＭ）（赤色の線）および１００μｇ／ｍｌのＣ．フォルスコリ根抽出物処理した細胞（緑色のライン）。
【発明を実施するための形態】
【0044】
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面に対してなされ、その中で実施され得る特定の実施形態は、例示のために示されている。実施形態は、当業者が実施形態を実施することを可能にするのに十分詳細に説明され、論理的、機械的、電子的および他の変更は、実施形態の範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解されるべきである。以下の詳細な説明は限定的な意味で解釈されるべきではない。
【0045】
本発明の様々な実施形態は、コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の組成物及び方法を提供する患者における脂肪肝の原因となるフリーから１４－デオキシコレオンＵ化合物を抽出する。
【0046】
図１は、本発明の実施形態によれば、コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の抽出物を合成する方法に関与する種々の工程を示すフローチャートである。図１に関して、コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の抽出物を合成する方法は、原材料の採取（ａ）、原材料の抽出の実行と抽出物の収集（ｂ）、抽出物からの油の除去、および抽出物のエタノールへの溶解（ｃ）、抽出物から余分な油を取り除く（ｄ）を含む。余分な油は、抽出物の炭化を行うことによって除去される。抽出物をろ過する（ｅ）。抽出物を濃縮する（ｆ）。抽出物は５－１０℃で３日間結晶化される（ｇ）。抽出物をろ過する（ｈ）。画分を分離するための抽出物のシリカゲルクロマトグラフィー、ここで、得られた抽出物は、患者に脂肪肝を引き起こす１４－デオキシコレオンＵ化合物を含まない（ｉ）。画分を乾燥させて、Ｃ．フォルスコリ抽出物（１～９９％）を得る（ｊ）。
【0047】
本発明の一実施形態によれば、シリカゲルクロマトグラフィーを実施するステップは、シリカカラムが充填されたガラスカラムを使用することを含む。シリカカラムの長さが２フィートであり、シリカカラムの直径は２.５インチである。サンプルがカラムにロードされる。サンプルは、１ｍｌ／分の流速でヘキサンで溶出される。最初の１０個のフラクションは廃棄され、その後、ヘキサンとジエチルエーテルの組み合わせで（１００：０）から（８０:２０）までグラジエント溶出が開始される。１４-デオキシコレオンを含む画分を収集し、１００％酢酸エチルで溶出して、１４－デオキシコロエンを含まない抽出物を取得する。抽出物は、濃厚なペーストになるまで濃縮し、エタノールを添加する。エタノールを完全に蒸留し、残留物を乾燥させて、Ｃ．フォルスコリ抽出物（１～９９％）を得る。
【0048】
本発明の実施形態によれば、原材料をコレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）植物の根を取り、粉末を得るために根を粉砕することによって製造される。
【0049】
本発明の実施形態によれば、抽出は、アルコールは７０％の濃度を有し、抽出及びアルコールを用いて行われる。
【0050】
本発明の実施形態によれば、油は水との最初の洗浄抽出により除去される。
【0051】
本発明の一実施形態によれば１４－デオキシコレオンＵを含まない抽出物が、肥満の治療のために患者に投与される。
【0052】
本発明の実施形態によれば、抽出物は、その必要のある哺乳動物における除脂肪体重を促進するために患者に治療有効量で投与される。
【0053】
本発明の一実施形態によれば、抽出物はＳＧＯＴおよびＳＧＰＴからなる群から選択される上昇した肝酵素を正常化することにより、食事誘発性肝機能障害を予防し、肝機能を改善する。
【0054】
本発明の実施形態によれば、抽出物は、１４－デオキシコレオンＵを含まず、患者の炎症の治療に使用される。
【0055】
本発明の別の実施形態によれば、高脂血症および心血管疾患のリスクに関連する糖尿病の治療に有効である、コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）植物の抽出物を含む医薬組成物。
【0056】
本発明の実施形態によれば、コレウス・フォルスコリ植物の抽出物を含む医薬組成物であり、医薬組成物は酵素アデニリルシクラーゼを活性化し、ｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させ、ｃＡＭＰは、ホルモン感受性リパーゼをリン酸化してこの酵素の活性形態を生成するプロテインキナーゼの活性を刺激する。
【0057】
本発明の実施形態によれば、コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）植物の抽出物を含む医薬組成物は、組成物は、液体、粉末、顆粒、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、エリキシル、植物性医薬品および栄養補助食品を含む群から選択される剤形に処方される。
【0058】
本発明の実施形態によれば、コレウス・フォルスコリ植物の抽出物を含む医薬組成物であって、抽出物の治療有効量が、抽出物が投与される個体の体重１キログラムあたり０．０１ｍｇから５００ｍｇの間である。
【0059】
実験の詳細
インビトロ抗炎症活性Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）根
この研究では、Ｃ．フォルスコリの根の抽出物の抗炎症作用を、リポ多糖（ＬＰＳ２μｇ／ｍｌ）で刺激したＴＨＰ１-ヒト末梢血急性単球性白血病細胞株でサイトカインの相対蛍光強度であるインターロイキン１０（ＩＬ１０）をフローサイトメトリーで測定することにより評価した。Ｃ．フォルスコリの非細胞毒性濃度を同定するためのＭＴＴ [３-（４,５-ジメチルチアゾール-２-イル）-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド]アッセイによって決定されたＴＨＰ１細胞の細胞生存率（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）２４時間の曝露期間後のそれぞれの細胞株の抽出物。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の根の抽出物は、潜在的に強力な抗炎症薬として分類されるＬＰＳ事前刺激細胞におけるＩＬ１０の抗炎症性サイトカインの発現を有意に抑制した。中のＩＬ１０の平均蛍光強度パーセンテージは、それぞれ対照９.８０、ＬＰＳ ３１、７０およびＣ．フォルスコリ２５、０５である。
インビトロ抗炎症活性Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）根
この研究では、Ｃ．フォルスコリの根の抽出物の抗炎症作用を、リポ多糖（ＬＰＳ２μｇ／ｍｌ）で刺激したＴＨＰ１-ヒト末梢血急性単球性白血病細胞株でサイトカインの相対蛍光強度であるインターロイキン１０（ＩＬ１０）をフローサイトメトリーで測定することにより評価した。Ｃ．フォルスコリの非細胞毒性濃度を同定するためのＭＴＴ [３-（４,５-ジメチルチアゾール-２-イル）-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド]アッセイによって決定されたＴＨＰ１細胞の細胞生存率（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）２４時間の曝露期間後のそれぞれの細胞株の抽出物。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の根の抽出物は、潜在的に強力な抗炎症薬として分類されるＬＰＳ事前刺激細胞におけるＩＬ１０の抗炎症性サイトカインの発現を有意に抑制した。中のＩＬ１０の平均蛍光強度パーセンテージは、それぞれ対照９.８０、ＬＰＳ ３１、７０およびＣ．フォルスコリ２５、０５である。
【0060】
試験管内抗糖尿病活性Ｃ．フォルスコリ根で（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）
この研究は、３Ｔ３Ｌ１細胞株を使用して、Ｃ．フォルスコリ根のエタノール抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）のインビトロ抗糖尿病活性を評価することを目的としている。根抽出物の細胞毒性効果は３-（４,５-ジメチルチアゾール-２-イル）-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって決定した。グルコース取り込みを誘導する能力およびグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）のトランスロケーションとの相関は、３Ｔ３Ｌ１細胞でフローサイトメトリーによって測定した。さらに、Ｃ．フォルスコリの根の抽出物（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）のαアミラーゼ活性に対する阻害効果は、比色法によって決定された。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）抽出物の異なる濃度は、２４時間処理した後、３Ｔ３Ｌ１細胞上の任意の毒性を示さなかった。根エキスで刺激で、６２.３４％と３Ｔ３Ｌ１細胞の７６.８６％はそれぞれ、グルコース取り込みおよびＧＬＵＴ４発現を示した。比色アッセイはＣ．フォルスコリ根のエタノール葉抽出物は、２３８.６５／ｍｌのαアミラーゼ酵素阻害濃度（IC５０）値の活性に対して有意な阻害効果を有することを示した。この研究の結果に基づき、C.がフォルスコリことは明らかである。フォルスコリの根の抽出物は、標準的な薬剤であるメトホルミンやアカルボースと比較した場合、有望な抗糖尿病効果を示し、３Ｔ３Ｌ１細胞に対して無毒であった。このように、さらに、抗糖尿病用途での可能な代替治療として推奨するために調べることができる。
この研究は、３Ｔ３Ｌ１細胞株を使用して、Ｃ．フォルスコリ根のエタノール抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）のインビトロ抗糖尿病活性を評価することを目的としている。根抽出物の細胞毒性効果は３-（４,５-ジメチルチアゾール-２-イル）-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって決定した。グルコース取り込みを誘導する能力およびグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）のトランスロケーションとの相関は、３Ｔ３Ｌ１細胞でフローサイトメトリーによって測定した。さらに、Ｃ．フォルスコリの根の抽出物（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）のαアミラーゼ活性に対する阻害効果は、比色法によって決定された。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）抽出物の異なる濃度は、２４時間処理した後、３Ｔ３Ｌ１細胞上の任意の毒性を示さなかった。根エキスで刺激で、６２.３４％と３Ｔ３Ｌ１細胞の７６.８６％はそれぞれ、グルコース取り込みおよびＧＬＵＴ４発現を示した。比色アッセイはＣ．フォルスコリ根のエタノール葉抽出物は、２３８.６５／ｍｌのαアミラーゼ酵素阻害濃度（IC５０）値の活性に対して有意な阻害効果を有することを示した。この研究の結果に基づき、C.がフォルスコリことは明らかである。フォルスコリの根の抽出物は、標準的な薬剤であるメトホルミンやアカルボースと比較した場合、有望な抗糖尿病効果を示し、３Ｔ３Ｌ１細胞に対して無毒であった。このように、さらに、抗糖尿病用途での可能な代替治療として推奨するために調べることができる。
【0061】
インビボでの肝臓保護活動Ｃ．フォルスコリ根
本研究は、ラットにおけるコレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）パラセタモールに対するルート（ＰＣＭは２g／ｋｇ b.w.、P.O）誘導された肝毒性のエタノール抽出物のための肝保護可能性を評価するために行った。２用量を２５０ｍｇ／ｋｇ及び５００ｍｇの／ｋｇ体重をＰＣＭ（２ｇ／ｋｇ）を誘発肝損傷に対する肝保護可能性の評価のために行った。でコレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の経口投与 シリマリン（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を標準的な肝保護剤として使用した。血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、総ビリルビン（ＴＢＲ）、総タンパク質（ＴＰ）及びカタラーゼ（ＣＡＴ）のような生化学的パラメーターが推定された。さらに、組織病理学的研究も実施された。結果は、毒性対照と比較した場合、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴ、およびＴＢＲの有意な減少と、ＧＳＨ、ＴＰ、ＳＯＤ、およびＣＡＴレベルの増加を明らかにした。５００ ｍｇ／ｋｇb.w.の用量のエタノール抽出物 ２５０ｍｇ／ｋｇよりも強力であることがわかった。Ｃ．フォルスコリ根（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）のエタノール抽出物は、ラットにおけるＰＣＭ誘発肝障害に対する有望な肝臓保護効果を正当化するようである。
本研究は、ラットにおけるコレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）パラセタモールに対するルート（ＰＣＭは２g／ｋｇ b.w.、P.O）誘導された肝毒性のエタノール抽出物のための肝保護可能性を評価するために行った。２用量を２５０ｍｇ／ｋｇ及び５００ｍｇの／ｋｇ体重をＰＣＭ（２ｇ／ｋｇ）を誘発肝損傷に対する肝保護可能性の評価のために行った。でコレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の経口投与 シリマリン（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を標準的な肝保護剤として使用した。血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、総ビリルビン（ＴＢＲ）、総タンパク質（ＴＰ）及びカタラーゼ（ＣＡＴ）のような生化学的パラメーターが推定された。さらに、組織病理学的研究も実施された。結果は、毒性対照と比較した場合、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴ、およびＴＢＲの有意な減少と、ＧＳＨ、ＴＰ、ＳＯＤ、およびＣＡＴレベルの増加を明らかにした。５００ ｍｇ／ｋｇb.w.の用量のエタノール抽出物 ２５０ｍｇ／ｋｇよりも強力であることがわかった。Ｃ．フォルスコリ根（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）のエタノール抽出物は、ラットにおけるＰＣＭ誘発肝障害に対する有望な肝臓保護効果を正当化するようである。
【0062】
Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の肝保護作用
研究は、オスのウィスターアルビノラット（１８０-２００g）を使用して実施された。これらは、インドのカルナータカ州にあるバーラティ薬科大学マンディア校の動物園から入手した。動物をグループ化し、ポリアクリルケージ（３８x２３x１０cm）に収容し、ケージあたり６匹以下の動物を飼育し、標準的な実験室条件（温度２５±２C）で暗闇と明かりのサイクル（１２／１２時間）で維持した。すべての動物は、実験開始前の１週間、実験室の状態に置かれた。倫理的認可は、実験前に施設内動物倫理委員会（ＩＡＥＣ）から取得された（１１３５／PO／Re／S／０７／CPCSEA）。
研究は、オスのウィスターアルビノラット（１８０-２００g）を使用して実施された。これらは、インドのカルナータカ州にあるバーラティ薬科大学マンディア校の動物園から入手した。動物をグループ化し、ポリアクリルケージ（３８x２３x１０cm）に収容し、ケージあたり６匹以下の動物を飼育し、標準的な実験室条件（温度２５±２C）で暗闇と明かりのサイクル（１２／１２時間）で維持した。すべての動物は、実験開始前の１週間、実験室の状態に置かれた。倫理的認可は、実験前に施設内動物倫理委員会（ＩＡＥＣ）から取得された（１１３５／PO／Re／S／０７／CPCSEA）。
【0063】
研究デザイン
いずれかのセックスの３０匹のウィスターアルビノラットを研究に使用した。それらはランダムに５つのグループに分けられ、各グループに６匹のラットがいた。
グループI：正常対照ラット（蒸留水を経口投与）
グループII：蒸留水+パラセタモール（２g／ｋｇ体重、経口）（毒性コントロール）
グループIII：シリマリン（５０ｍｇ／ｋｇ／day p.o）+パラセタモール（２g／ｋｇ体重、経口）（陽性対照）
グループIV：Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（それぞれ２５０ｍｇ／ｋｇ／日）+パラセタモール（２g／ｋｇ体重、経口）
グループV：Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（それぞれ５００ｍｇ／ｋｇ ／日）+パラセタモール（２g／ｋｇ体重、経口）
いずれかのセックスの３０匹のウィスターアルビノラットを研究に使用した。それらはランダムに５つのグループに分けられ、各グループに６匹のラットがいた。
グループI：正常対照ラット（蒸留水を経口投与）
グループII：蒸留水+パラセタモール（２g／ｋｇ体重、経口）（毒性コントロール）
グループIII：シリマリン（５０ｍｇ／ｋｇ／day p.o）+パラセタモール（２g／ｋｇ体重、経口）（陽性対照）
グループIV：Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（それぞれ２５０ｍｇ／ｋｇ／日）+パラセタモール（２g／ｋｇ体重、経口）
グループV：Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（それぞれ５００ｍｇ／ｋｇ ／日）+パラセタモール（２g／ｋｇ体重、経口）
【0064】
生化学的研究
血液サンプルは、治療の１０日目に眼窩後神経叢に穴を開けることによってすべての動物から採取された。血液を２５００rpmで１５分間遠心分離することにより血清を分離し、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、総ビリルビン、および総タンパク質のレベルを、市販の酵素キット（ＡＧＡＰＰＥ、インド）および自動分析装置（化学分析装置（ＣＡ ２００５））を使用して分析した。
血液サンプルは、治療の１０日目に眼窩後神経叢に穴を開けることによってすべての動物から採取された。血液を２５００rpmで１５分間遠心分離することにより血清を分離し、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、総ビリルビン、および総タンパク質のレベルを、市販の酵素キット（ＡＧＡＰＰＥ、インド）および自動分析装置（化学分析装置（ＣＡ ２００５））を使用して分析した。
【0065】
組織病理学
肝臓の一部を採取し、すぐに１０％ホルマリンで固定した後、７０、８０、９５％のアルコール（エタノール）と絶対アルコールをそれぞれ２回ずつ昇順で脱水した。組織をキシレンで透明にし、パラフィンワックスに包埋した。回転ミクロトームを使用して厚さ５～６ミクロンの連続切片を取得し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。染色された切片を顕微鏡下で検査して、パラセタモールチャレンジによる肝臓組織の構造の変化、および試験抽出物と標準薬による前処理による肝臓構造の改善を分析した。
肝臓の一部を採取し、すぐに１０％ホルマリンで固定した後、７０、８０、９５％のアルコール（エタノール）と絶対アルコールをそれぞれ２回ずつ昇順で脱水した。組織をキシレンで透明にし、パラフィンワックスに包埋した。回転ミクロトームを使用して厚さ５～６ミクロンの連続切片を取得し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。染色された切片を顕微鏡下で検査して、パラセタモールチャレンジによる肝臓組織の構造の変化、および試験抽出物と標準薬による前処理による肝臓構造の改善を分析した。
【0066】
結果
さまざまな生化学的パラメーターに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の影響を表１に示す。血清ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴおよびＴＢＲの活性は増加し、ＧＳＨ、ＳＯＤ、ＣＡＴおよびTBは、正常な対照群と比較して、パラセタモールを与えられた動物で著しく減少したことが観察された。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの投与は、パラセタモールによって誘発された血清パラメーターの上昇を低下させた。標準的なシリマリン５０ｍｇ／ｋｇ体重の治療は、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴ、ＴＢＲの非常に有意な（Ｐ<０.００１）減少と、ＧＳＨ、ＳＯＤ、およびTBの増加を示した。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（２５０ｍｇ／ｋｇ体重および５００ｍｇ／ｋｇ体重）で治療した動物は、毒性対照群と比較して、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴおよびＴＢＲの適度に有意な（Ｐ<０.０５）減少、およびＧＳＨ、ＳＯＤ、およびTBレベルの増加を示した。正常ラットの肝臓切片の組織病理学的検査は、細胞質および核を有する正常な肝細胞を示したが、パラセタモール処置群は、肝細胞のバルーニング、リンパ球の浸潤および細胞境界の喪失のような様々な程度の脂肪変性を示した。５００ｍｇ／ｋｇの用量でのＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の投与は、肝臓の組織学的構造におけるこれらの欠陥を有意に正常化した。
さまざまな生化学的パラメーターに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の影響を表１に示す。血清ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴおよびＴＢＲの活性は増加し、ＧＳＨ、ＳＯＤ、ＣＡＴおよびTBは、正常な対照群と比較して、パラセタモールを与えられた動物で著しく減少したことが観察された。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの投与は、パラセタモールによって誘発された血清パラメーターの上昇を低下させた。標準的なシリマリン５０ｍｇ／ｋｇ体重の治療は、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴ、ＴＢＲの非常に有意な（Ｐ<０.００１）減少と、ＧＳＨ、ＳＯＤ、およびTBの増加を示した。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（２５０ｍｇ／ｋｇ体重および５００ｍｇ／ｋｇ体重）で治療した動物は、毒性対照群と比較して、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴおよびＴＢＲの適度に有意な（Ｐ<０.０５）減少、およびＧＳＨ、ＳＯＤ、およびTBレベルの増加を示した。正常ラットの肝臓切片の組織病理学的検査は、細胞質および核を有する正常な肝細胞を示したが、パラセタモール処置群は、肝細胞のバルーニング、リンパ球の浸潤および細胞境界の喪失のような様々な程度の脂肪変性を示した。５００ｍｇ／ｋｇの用量でのＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の投与は、肝臓の組織学的構造におけるこれらの欠陥を有意に正常化した。
【0067】
アルビノウィスターラットのパラセタモール誘発肝毒性における血清ＳＧＰＴ（ＡＳＴ）レベルに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果
【0068】
オスのアルビノウィスターラットのパラセタモール誘発肝毒性の血清中のＳＧＰＴレベルに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果。対照は３６５±３.４ＩＵ／Ｌの血清中のＳＧＰＴレベルを示したが、パラセタモール治療後、それは８１６±２.１ＩＵ／Ｌに増加した。一方、Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）を２５０ ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した後、中毒ラットにパラセタモールのbw poを投与すると、ＳＧＰＴレベルは７２１±１ＩＵ／Ｌおよび５３６±０.９ＩＵ ／にそれぞれ減少した（表１）。これらのデータは、Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）が酸化ストレスを軽減することにより、パラセタモール誘発性損傷から肝臓を保護する可能性があることを示唆している。
【0069】
パラセタモールにおけるＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の血清ＳＧＯＴのレベルの効果は、アルビノウィスターラットの肝毒性を誘発した。
オスのアルビノウィスターラットのパラセタモール誘発肝毒性の血清中のＳＧＯＴレベルに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果。対照は、血清中のＳＧＯＴレベルが３７０±０.５６ＩＵ／Ｌであったが、パラセタモール治療後、９１８±２.１０ＩＵ／Ｌに増加した。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）を２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した後、パラセタモール中毒ラットの体重は６９８±１.２０ ＩＵ／Ｌおよび５５８±１.４ＩＵ／Ｌに減少した。 それぞれ（表－１）。
オスのアルビノウィスターラットのパラセタモール誘発肝毒性の血清中のＳＧＯＴレベルに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果。対照は、血清中のＳＧＯＴレベルが３７０±０.５６ＩＵ／Ｌであったが、パラセタモール治療後、９１８±２.１０ＩＵ／Ｌに増加した。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）を２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した後、パラセタモール中毒ラットの体重は６９８±１.２０ ＩＵ／Ｌおよび５５８±１.４ＩＵ／Ｌに減少した。 それぞれ（表－１）。
【0070】
パラセタモールでレベルビリルビン、血清総上のＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果は、アルビノウィスターラットの肝毒性を誘発した。
パラセタモールの血清中レベルビリルビン合計でＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果は、オスのアルビノラットを酔わせる。対照は、血清中のビリルビンレベルが（０.０４±０.０００３）ｍｇ／ｄＬであることを示したが、パラセタモールの後、それは（０.２０±０.００８）ｍｇ／ｄＬに増加した。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）を２５０ｍｇ／ｋｇ体重および５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量でパラセタモール中毒ラットに投与した後、ビリルビンレベルは（０.１５±０.０１）ｍｇ／ｄＬおよび０.１１±０.００４ｍｇ／ｄＬに減少した。 。ビリルビンレベルの低下は、０.０４±０.０００３ｍｇ／ｄＬ対照群でも観察された（表－１）。
パラセタモールの血清中レベルビリルビン合計でＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果は、オスのアルビノラットを酔わせる。対照は、血清中のビリルビンレベルが（０.０４±０.０００３）ｍｇ／ｄＬであることを示したが、パラセタモールの後、それは（０.２０±０.００８）ｍｇ／ｄＬに増加した。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）を２５０ｍｇ／ｋｇ体重および５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量でパラセタモール中毒ラットに投与した後、ビリルビンレベルは（０.１５±０.０１）ｍｇ／ｄＬおよび０.１１±０.００４ｍｇ／ｄＬに減少した。 。ビリルビンレベルの低下は、０.０４±０.０００３ｍｇ／ｄＬ対照群でも観察された（表－１）。
【0071】
Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）治療が肝酵素活性に及ぼす影響
抗酸化酵素活性のための治療法の効果。表－１は、肝臓の酸化的損傷を示す肝臓組織のＴＰ、ＧＳＨ、ＳＯＤ、およびＣＡＴ活性の変化を示している。ラットをパラセタモールに曝露すると、他のグループと比較して、ＴＰ（２.８３±０.２７）、ＧＳＨ（１０±１.１）、ＳＯＤ（２０±０.４）、ＣＡＴ（４１±１.１）（Ｐ<０.０５）の酵素活性がそれぞれ大幅に低下した。２５０ｍｇ／ｋｇ.bwのＣ．フォルスコリ+ＰＣＭを投与されたラットは、それぞれ有意に上昇したレベルのＴＰ（３.５１±０.０７）、ＧＳＨ（１７±１.１９）、ＳＯＤ（４０±１.１）ＣＡＴ（５３.５±０.８）を示した。５００ｍｇ／ｋｇ.bwＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）+ＰＣＭの投与は、ＴＰ（４.１３±０.２５）、ＧＳＨ（２３±０.９５）、およびＳＯＤ（５６±１.６）ＣＡＴ（５８.６±０.８８）のレベルの有意な増加を示したパラセタモール群（Ｐ<０.０５）であるが、対照ではない。対照的に、Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の処理は、酵素（ＴＰ、ＧＳＨ、ＳＯＤ、およびＣＡＴ）活性の有意な改善をもたらした（表－１）。
抗酸化酵素活性のための治療法の効果。表－１は、肝臓の酸化的損傷を示す肝臓組織のＴＰ、ＧＳＨ、ＳＯＤ、およびＣＡＴ活性の変化を示している。ラットをパラセタモールに曝露すると、他のグループと比較して、ＴＰ（２.８３±０.２７）、ＧＳＨ（１０±１.１）、ＳＯＤ（２０±０.４）、ＣＡＴ（４１±１.１）（Ｐ<０.０５）の酵素活性がそれぞれ大幅に低下した。２５０ｍｇ／ｋｇ.bwのＣ．フォルスコリ+ＰＣＭを投与されたラットは、それぞれ有意に上昇したレベルのＴＰ（３.５１±０.０７）、ＧＳＨ（１７±１.１９）、ＳＯＤ（４０±１.１）ＣＡＴ（５３.５±０.８）を示した。５００ｍｇ／ｋｇ.bwＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）+ＰＣＭの投与は、ＴＰ（４.１３±０.２５）、ＧＳＨ（２３±０.９５）、およびＳＯＤ（５６±１.６）ＣＡＴ（５８.６±０.８８）のレベルの有意な増加を示したパラセタモール群（Ｐ<０.０５）であるが、対照ではない。対照的に、Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の処理は、酵素（ＴＰ、ＧＳＨ、ＳＯＤ、およびＣＡＴ）活性の有意な改善をもたらした（表－１）。
【0072】
本研究は、Ｃ．フォルスコリ抽出物（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）が有意なinvivo肝保護活性を有することを示している。したがって、Ｃ．フォルスコリ抽出物は、急性肝障害に対する効果的な保護剤に発展する可能性がある。
【0073】
【表1】
【0074】
ＳＧＯＴ：血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、ＳＧＰＴ：血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、ＧＳＨ：グルタチオン、ＳＯＤ：スーパーオキシドジスムターゼ、ＴＢＲ：総ビリルビン、ＴＰ：総タンパク質、ＣＡＴ:カタラーゼ
【0075】
すべての値は、各グループの６匹のラットの平均±ＳＥＭとして表される。P ０.０５は、コントロールとは有意に異なる値を示す。
【0076】
インビボでの抗肥満活性をＣ．フォルスコリ根（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）
本研究の目的は、カフェテリア食を与えられたマウスにおけるＣ．フォルスコリの根のエタノール抽出物の抗肥満活性を評価することである。メスのスイスアルビノマウスを５つのグループに分け、通常食とカフェテリア食、標準薬のシンバスタチン（１０ ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ．フォルスコリ（２５０および５００ ｍｇ／ｋｇ）を４０日間毎日摂取した。こうした体重、体格指数（ＢＭＩ）、肥満のリー・インデックス（ＬＩＯ）、食料消費量、血清グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、高比重リポタンパク質（HDL）、低密度リポタンパク質（LDL）、動脈硬化指数や臓器などのパラメータ重量はＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の抗肥満活性を評価するために検討した。その結果、HDLと運動活性の有意な増加および食物摂取、体重の有意な減少があった、ＢＭＩ、ＬＩＯ、総コレステロール、トリグリセリド、LDL及びグルコースに対向するＣ．フォルスコリ抽出物（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）で見られた カフェテリアダイエットの結果。現在の調査結果はＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）のエタノール抽出物は、物理的および生化学的パラメーターの正常なレベルを維持することにより、有意な抗肥満活性を有することを示唆している。
本研究の目的は、カフェテリア食を与えられたマウスにおけるＣ．フォルスコリの根のエタノール抽出物の抗肥満活性を評価することである。メスのスイスアルビノマウスを５つのグループに分け、通常食とカフェテリア食、標準薬のシンバスタチン（１０ ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ．フォルスコリ（２５０および５００ ｍｇ／ｋｇ）を４０日間毎日摂取した。こうした体重、体格指数（ＢＭＩ）、肥満のリー・インデックス（ＬＩＯ）、食料消費量、血清グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、高比重リポタンパク質（HDL）、低密度リポタンパク質（LDL）、動脈硬化指数や臓器などのパラメータ重量はＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の抗肥満活性を評価するために検討した。その結果、HDLと運動活性の有意な増加および食物摂取、体重の有意な減少があった、ＢＭＩ、ＬＩＯ、総コレステロール、トリグリセリド、LDL及びグルコースに対向するＣ．フォルスコリ抽出物（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）で見られた カフェテリアダイエットの結果。現在の調査結果はＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）のエタノール抽出物は、物理的および生化学的パラメーターの正常なレベルを維持することにより、有意な抗肥満活性を有することを示唆している。
【0077】
材料と方法
抗肥満活性の実験プロトコール：
雌のスイスアルビノマウス（２２_２６gm）を、それぞれ６匹のマウスからなる６つのグループにランダムに分け、次のように処理した。
グループI：標準的な実験用飼料、すなわち通常の食事を受け取った。
グループII：ペレットの形でカフェテリアダイエットを受けた。
グループIII：シンバスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ、経口）を毎日投与した。
グループIV：Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）（２５０ ｍｇ／ｋｇ、経口）を毎日投与した。
グループV：C.（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）
抗肥満活性の実験プロトコール：
雌のスイスアルビノマウス（２２_２６gm）を、それぞれ６匹のマウスからなる６つのグループにランダムに分け、次のように処理した。
グループI：標準的な実験用飼料、すなわち通常の食事を受け取った。
グループII：ペレットの形でカフェテリアダイエットを受けた。
グループIII：シンバスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ、経口）を毎日投与した。
グループIV：Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）（２５０ ｍｇ／ｋｇ、経口）を毎日投与した。
グループV：C.（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）
【0078】
肥満誘発のためのカフェテリア食の準備：ハリスとクルカルニさんにより記載された方法は、いくつかの修正を加えて行きた。カフェテリアダイエット（さまざまな人間のスナック食品を含む非常に口当たりが良く、エネルギーが豊富な動物用ダイエット）（コンデンスミルク４８g+パン４８g）、（チョコレート１８g+ビスケット３６g+乾燥ココナッツ３６g）の３つのダイエットで構成されている）、（チーズ４８g+ボイルドポテト６０g）。カフェテリア食は、ペレットの形で、それぞれ６匹のマウスからなる５つのグループに４０日間与えられた。
【0079】
評価されるパラメータ
体重
マウスの体重（g）は、各グループの１、１０、２０、３０、および４０日に記録された。
体重
マウスの体重（g）は、各グループの１、１０、２０、３０、および４０日に記録された。
【0080】
ボディマスインデックスと肥満の風下インデックス：マウスの肥満度指数（ＢＭＩ）と肥満の風下指数（ＬＩＯ）は、研究の１日目と４０日目（つまり、初期および最終体重と身長）に記録され、式を使用して測定された。
ＢＭＩ ＝体重（gm）／（高さcm）２
ＬＩＯ ＝体重（gm）（１／３）／鼻腔の長さcm
ＢＭＩ ＝体重（gm）／（高さcm）２
ＬＩＯ ＝体重（gm）（１／３）／鼻腔の長さcm
【0081】
食料消費
食物消費研究は１、１０、２０、３０および４０日に実施され、１時間、２時間、および３時間の時間間隔で記録された。食物消費量は、グリッドに残っている食物の量を最初の食物重量から差し引くことによって推定された。
食物消費研究は１、１０、２０、３０および４０日に実施され、１時間、２時間、および３時間の時間間隔で記録された。食物消費量は、グリッドに残っている食物の量を最初の食物重量から差し引くことによって推定された。
【0082】
結果
体重のＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の効果：２.示すマウスの正常および実験群における体重に対するＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の効果。カフェテリアダイエットグループは、通常のダイエットグループと比較して、１０、２０、３０、および４０日目に体重の有意な（Ｐ<０.００１）増加を示した。シンバスタチンで治療されたカフェテリア食餌を与えられたマウスは、カフェテリア食餌群と比較して、１０、２０、３０、および４０日目に体重の有意な（Ｐ<０.０５- Ｐ<０.００１）減少を示した。Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）グループ（５００ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は、カフェテリアダイエットグループと比較して、２０、３０、および４０日で体重の有意な（Ｐ<０.０５- Ｐ<０.００１）減少を示した。
体重のＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の効果：２.示すマウスの正常および実験群における体重に対するＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の効果。カフェテリアダイエットグループは、通常のダイエットグループと比較して、１０、２０、３０、および４０日目に体重の有意な（Ｐ<０.００１）増加を示した。シンバスタチンで治療されたカフェテリア食餌を与えられたマウスは、カフェテリア食餌群と比較して、１０、２０、３０、および４０日目に体重の有意な（Ｐ<０.０５- Ｐ<０.００１）減少を示した。Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）グループ（５００ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は、カフェテリアダイエットグループと比較して、２０、３０、および４０日で体重の有意な（Ｐ<０.０５- Ｐ<０.００１）減少を示した。
【0083】
【表2】
【0084】
すべての値は、平均±ＳＥＭ、n＝６、通常の食事グループと比較してp ０.００１、カフェテリアの食事グループと比較してp ０.００５、p ０.００１として表される。
【0085】
Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）がＢＭＩ（ボディマス指数）およびＬＩＯ（肥満のリー指数）に及ぼす影響：正常および実験群のマウスのＢＭＩおよびＬＩＯに対するＣ．フォルスコリの影響を表３に示す。カフェテリアの食事をマウスに与えると、通常の食事を与えたマウスと比較して、最終的なＢＭＩとＬＩＯが大幅に（Ｐ<０.００１）増加することがわかった。シンバスタチンで処置したマウスを与えカフェテリア食は、Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（５００ｍｇ／ｋｇ）の基は、カフェテリア食群と比較して最終的なＢＭＩとＬＩＯの有意な（Ｐ<０.００１）減少を示した。
【0086】
【表3】
【0087】
すべての値は平均±ＳＥＭ、n ＝ ６、ＢＭＩとして表される。ボディマス指数、ＬＩＯ：肥満のリー指数、通常の食事グループと比較してp ０.００１、カフェテリアの食事グループと比較してp ０.００５、p ０.００１
【0088】
食料消費のＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の効果：表４はＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）が正常および実験群のマウスの摂餌量に及ぼす影響を示している。正常食餌群と比較して、食物消費は大幅であることが判明した（Ｐ<０.００１）、１、１０、２０、３０及び４０日目に増加した。シンバスタチンを投与したマウスは、カフェテリア食群と比較して、３０日目と４０日目に食物消費量の有意な（Ｐ<０.０１、Ｐ<０.００１）減少を示した。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（５００ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスは、カフェテリア食群と比較して、３０日目と４０日目に有意に（Ｐ<０.０５、Ｐ<０.０１）摂餌量の減少を示した。
【0089】
【表4】
【0090】
すべての値は、平均±ＳＥＭ、n＝６、通常の食事グループと比較してp ０.００１、カフェテリアの食事グループと比較してp ０.００５、p ０.００１として表される。
【0091】
生化学的プロファイルに対するＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の影響：正常および実験群のマウスの生化学的プロファイルに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の影響を表５に示す。
カフェテリア食をマウスに与えると、正常に与えられたマウスと比較して、血清グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、ＬＤＬ、動脈硬化指数のレベルが大幅（Ｐ<０.００１）に増加し、HDLのレベルが大幅（Ｐ<０.００１）に減少することがわかった。シンバスタチン、Ｃ．フォルスコリ（５００ミリグラム／ｋｇ）群で治療されたカフェテリア食餌を与えられたマウスは、カフェテリアダイエットグループと比較した場合、ＨＤＬのレベルにおいて、血清グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、ＬＤＬ、ＡＩのレベルの有意な（P <0.001）減少と有意な（P <0.001）増加を示した。
カフェテリア食をマウスに与えると、正常に与えられたマウスと比較して、血清グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、ＬＤＬ、動脈硬化指数のレベルが大幅（Ｐ<０.００１）に増加し、HDLのレベルが大幅（Ｐ<０.００１）に減少することがわかった。シンバスタチン、Ｃ．フォルスコリ（５００ミリグラム／ｋｇ）群で治療されたカフェテリア食餌を与えられたマウスは、カフェテリアダイエットグループと比較した場合、ＨＤＬのレベルにおいて、血清グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、ＬＤＬ、ＡＩのレベルの有意な（P <0.001）減少と有意な（P <0.001）増加を示した。
【0092】
【表5】
【0093】
すべての値は平均±ＳＥＭ、n＝６、HDLとして表される。高密度リポタンパク質、LDL：低密度リポタンパク質、AI：アテローム発生指数、通常の食事グループと比較してp ０.００１、カフェテリアの食事グループと比較してp ０.００５、p ０.００１。
【0094】
臓器重量に対するＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の効果：表６は、正常および実験群のマウスの臓器重量に対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果を示している。そのようなカフェテリア食群における肝臓および小腸などの臓器の重量が（Ｐ<０.００１）が正常食餌群に比べて有意に増加することが見出された。シンバスタチンを投与したマウスは、カフェテリア食群と比較して、肝臓（Ｐ<０.０１）や小腸（Ｐ<０.００１）などの臓器重量の有意な減少を示した。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（５００ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスは、カフェテリア食群と比較して、肝臓と小腸の重量が大幅に（Ｐ<０.０５）減少したことを示した。カフェテリア食群と他の実験群の脳、胃、心臓、肺、腎臓の臓器重量に有意差はなかった。
【0095】
【表6】
【0096】
カフェテリア食を与えられたマウスにおけるＣ．フォルスコリ根のエタノール抽出物の抗肥満活性
本研究の目的は、カフェテリア食を与えられたマウスにおけるＣ．フォルスコリの根のエタノール抽出物の抗肥満活性を評価することであった。メスのスイスアルビノマウスを５つのグループに分け、通常食とカフェテリア食、標準薬のシンバスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（２５０および５００ｍｇ／ｋｇ）を４０日間毎日摂取した。体重、肥満度指数（ＢＭＩ）、肥満のリー指数（ＬＩＯ）、食物消費量、血清グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、高密度リポタンパク質（HDL）、低密度リポタンパク質（LDL）、アテローム発生指数、臓器などのパラメーターＣ．フォルスコリの抗肥満活性を評価するために、体重を調べた。結果として反対である総コレステロール、トリグリセリド、LDL及びグルコースがＣ．フォルスコリ抽出物（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）で見られたHDL及び摂餌量の有意な減少、体重、ＢＭＩ、ＬＩＯと運動活性の有意な増加があった カフェテリアダイエットの結果。現在の調査結果はＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）のエタノール抽出物は、物理的および生化学的パラメーターの正常なレベルを維持することにより、有意な抗肥満活性を有することを示唆している。
本研究の目的は、カフェテリア食を与えられたマウスにおけるＣ．フォルスコリの根のエタノール抽出物の抗肥満活性を評価することであった。メスのスイスアルビノマウスを５つのグループに分け、通常食とカフェテリア食、標準薬のシンバスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（２５０および５００ｍｇ／ｋｇ）を４０日間毎日摂取した。体重、肥満度指数（ＢＭＩ）、肥満のリー指数（ＬＩＯ）、食物消費量、血清グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、高密度リポタンパク質（HDL）、低密度リポタンパク質（LDL）、アテローム発生指数、臓器などのパラメーターＣ．フォルスコリの抗肥満活性を評価するために、体重を調べた。結果として反対である総コレステロール、トリグリセリド、LDL及びグルコースがＣ．フォルスコリ抽出物（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）で見られたHDL及び摂餌量の有意な減少、体重、ＢＭＩ、ＬＩＯと運動活性の有意な増加があった カフェテリアダイエットの結果。現在の調査結果はＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）のエタノール抽出物は、物理的および生化学的パラメーターの正常なレベルを維持することにより、有意な抗肥満活性を有することを示唆している。
【0097】
材料と方法
抗肥満活性の実験プロトコール
雌のスイスアルビノマウス（２２_２６gm）を、それぞれ６匹のマウスからなる６つのグループにランダムに分け、次のように処理した。
抗肥満活性の実験プロトコール
雌のスイスアルビノマウス（２２_２６gm）を、それぞれ６匹のマウスからなる６つのグループにランダムに分け、次のように処理した。
【0098】
グループI：標準的な実験用飼料、すなわち通常の食事を受け取った。
グループII：ペレットの形でカフェテリアダイエットを受けた。
グループIII：シンバスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ、経口）を毎日投与した。
グループIV：Ｃ．フォルスコリ（２５０ｍｇ／ｋｇ、経口）を毎日投与した。
グループV：Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）
グループII：ペレットの形でカフェテリアダイエットを受けた。
グループIII：シンバスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ、経口）を毎日投与した。
グループIV：Ｃ．フォルスコリ（２５０ｍｇ／ｋｇ、経口）を毎日投与した。
グループV：Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）
【0099】
肥満の誘発のためのカフェテリア食の準備：ハリスとクルカルニによって記述された方法は、いくつかの修正を加えて従われた。カフェテリアダイエット（さまざまな人間のスナック食品を含む非常に口当たりが良く、エネルギーが豊富な動物用ダイエット）（コンデンスミルク４８g＋パン４８g）、（チョコレート１８g＋ビスケット３６g＋乾燥ココナッツ３６g）の３つのダイエットで構成されている。）、（チーズ４８g＋ボイルドポテト６０g）。カフェテリア食は、ペレットの形で、それぞれ６匹のマウスからなる５つのグループに４０日間与えられた。
【0100】
評価されるパラメータ
体重：マウスの体重（g）は、各グループの１、１０、２０、３０、および４０日に記録された。
体重：マウスの体重（g）は、各グループの１、１０、２０、３０、および４０日に記録された。
【0101】
ボディマスインデックスと肥満の風下インデックス：マウスの肥満度指数（ＢＭＩ）と肥満の風下指数（ＬＩＯ）は、研究の１日目と４０日目（つまり、初期および最終体重と身長）に記録され、式を使用して測定された。
ＢＭＩ ＝体重（gm）／（高さcm）２
ＬＩＯ ＝体重（gm）（１／３）／鼻腔の長さcm
ＢＭＩ ＝体重（gm）／（高さcm）２
ＬＩＯ ＝体重（gm）（１／３）／鼻腔の長さcm
【0102】
食物消費：食物消費研究は１、１０、２０、３０および４０日に実施され、１時間、２時間および３時間の時間間隔で記録された。食物消費量は、グリッドに残っている食物の量を最初の食物重量から差し引くことによって推定された。
【0103】
結果
体重のＣ．フォルスコリの効果：表７は、正常群と実験群のマウスの臓器重量に対するＣ．フォルスコリの影響を示している。カフェテリアダイエットグループは、通常のダイエットグループと比較して、１０、２０、３０、および４０日目に体重の有意な（Ｐ<０.００１）増加を示した。シンバスタチンで治療されたカフェテリア食餌を与えられたマウスは、カフェテリア食餌群と比較して、１０、２０、３０、および４０日目に体重の有意な（Ｐ<０.０５- Ｐ<０.００１）減少を示した。Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）グループ（５００ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は、カフェテリアダイエットグループと比較して、２０、３０、および４０日で体重の有意な（Ｐ<０.０５- Ｐ<０.００１）減少を示した。
体重のＣ．フォルスコリの効果：表７は、正常群と実験群のマウスの臓器重量に対するＣ．フォルスコリの影響を示している。カフェテリアダイエットグループは、通常のダイエットグループと比較して、１０、２０、３０、および４０日目に体重の有意な（Ｐ<０.００１）増加を示した。シンバスタチンで治療されたカフェテリア食餌を与えられたマウスは、カフェテリア食餌群と比較して、１０、２０、３０、および４０日目に体重の有意な（Ｐ<０.０５- Ｐ<０.００１）減少を示した。Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）グループ（５００ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は、カフェテリアダイエットグループと比較して、２０、３０、および４０日で体重の有意な（Ｐ<０.０５- Ｐ<０.００１）減少を示した。
【0104】
【表7】
【0105】
すべての値は、平均±ＳＥＭ、n＝６、通常の食事グループと比較してp ０.００１、カフェテリアの食事グループと比較してp ０.００５、p ０.００１として表される。
【0106】
Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）がＢＭＩ（ボディマス指数）およびＬＩＯ（肥満のリー指数）に及ぼす影響：正常および実験群のマウスのＢＭＩおよびＬＩＯに対するＣ．フォルスコリの影響を表８に示す。カフェテリアの食事をマウスに与えると、通常の食事を与えたマウスと比較して、最終的なＢＭＩとＬＩＯが大幅に（Ｐ<０.００１）増加することがわかった。シンバスタチン、Ｃ．フォルスコリ（５００ｍｇ／ｋｇ）グループで処理されたカフェテリア食餌を与えられたマウスは、カフェテリア食餌グループと比較した場合、最終的なＢＭＩおよびＬＩＯの有意な（Ｐ<０.００１）減少を示した。
【0107】
【表8】
【0108】
すべての値は平均±ＳＥＭ、n＝６、ＢＭＩとして表される。ボディマス指数、ＬＩＯ：肥満のリー指数、通常の食事グループと比較してp ０.００１、カフェテリアの食事グループと比較してp ０.００５、p ０.００１
【0109】
Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の食物消費への影響：表９は、正常群と実験群のマウスの摂餌量に対するＣ．フォルスコリの影響を示している。正常食餌群と比較して、食物消費は大幅であることが判明した（Ｐ<０.００１）、１、１０、２０、３０及び４０日目に増加した。シンバスタチンを投与したマウスは、カフェテリア食群と比較して、３０日目と４０日目に食物消費量の有意な（Ｐ<０.０１、Ｐ<０.００１）減少を示した。Ｃ．フォルスコリ（５００ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスは、カフェテリアの食餌群と比較して、３０日目と４０日目に有意に（Ｐ<０.０５、Ｐ<０.０１）摂餌量の減少を示した。
【0110】
【表9】
【0111】
すべての値は、平均±ＳＥＭ、n＝６、通常の食事グループと比較してp ０.００１、カフェテリアの食事グループと比較してp ０.００５、p ０.００１として表される。
【0112】
生化学的プロファイルに対するＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の影響：正常および実験群のマウスの生化学的プロファイルに対するＣ．フォルスコリの影響を表１０に示す。マウスにカフェテリア食を給餌（Ｐ<０.００１）有意に発見された有意血清グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、LDL、動脈硬化指数と（Ｐ<０.００１）のレベルを増加正常を与えたマウスと比較した場合、HDLのレベルを低下させるダイエット。シンバスタチンで処置したマウスを与えカフェテリア食は、Ｃ．フォルスコリ（５００ミリグラム／ｋｇ）のグループは、血清グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、LDL、AIと有意（Ｐ<０.００１）の増加のレベルの有意な（Ｐ<０.００１）減少を示したカフェテリアダイエットグループと比較した場合のHDLのレベルで。
【0113】
【表10】
【0114】
すべての値は平均±ＳＥＭ、n＝６、HDLとして表される。高密度リポタンパク質、LDL：低密度リポタンパク質、AI：アテローム発生指数、通常の食事グループと比較してp ０.００１、カフェテリアの食事グループと比較してp ０.００５、p ０.００１。
【0115】
Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の臓器重量への影響
表１１は、正常群と実験群のマウスの臓器重量に対するＣ．フォルスコリの影響を示している。そのようなカフェテリア食群における肝臓および小腸などの臓器の重量が（Ｐ<０.００１）が正常食餌群に比べて有意に増加することが見出された。シンバスタチンを投与したマウスは、カフェテリア食群と比較して、肝臓（Ｐ<０.０１）や小腸（Ｐ<０.００１）などの臓器重量の有意な減少を示した。Ｃ．フォルスコリ（５００ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスは、カフェテリア食群と比較して、肝臓と小腸の重量が大幅に（Ｐ<０.０５）減少したことを示した。カフェテリア食群と他の実験群の脳、胃、心臓、肺、腎臓の臓器重量に有意差はなかった。
表１１は、正常群と実験群のマウスの臓器重量に対するＣ．フォルスコリの影響を示している。そのようなカフェテリア食群における肝臓および小腸などの臓器の重量が（Ｐ<０.００１）が正常食餌群に比べて有意に増加することが見出された。シンバスタチンを投与したマウスは、カフェテリア食群と比較して、肝臓（Ｐ<０.０１）や小腸（Ｐ<０.００１）などの臓器重量の有意な減少を示した。Ｃ．フォルスコリ（５００ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスは、カフェテリア食群と比較して、肝臓と小腸の重量が大幅に（Ｐ<０.０５）減少したことを示した。カフェテリア食群と他の実験群の脳、胃、心臓、肺、腎臓の臓器重量に有意差はなかった。
【0116】
【表11】
【0117】
すべての値は、平均±ＳＥＭ、n＝６、通常の食事グループと比較してp ０.００１、カフェテリアの食事グループと比較してp ０.００５、p ０.００１として表される。
【0118】
ラットのパラセタモール誘発肝毒性に対するColeusフォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の肝保護活性の評価
本研究は、ラットにおけるパラセタモール（ＰＣＭ２g／ｋｇb.w.,p.o）誘発性肝毒性に対するコレウス・フォルスコリ根（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）のエタノール抽出物のための肝臓保護の可能性を評価するために実施した。コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）を２５０ｍｇ／ｋｇと５００ｍｇ／ｋｇ体重の２回経口投与して、ＰＣＭ（２g／ｋｇ）誘発性肝障害に対する肝保護の可能性を評価した。 シリマリン（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を標準的な肝保護剤として使用した。血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、総ビリルビン（ＴＢＲ）、総タンパク質（ＴＰ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）などの生化学的パラメーターが推定された。さらに、組織病理学的研究も実施された。結果は、毒性対照と比較した場合、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴ、およびＴＢＲの有意な減少と、ＧＳＨ、ＴＰ、ＳＯＤ、およびＣＡＴレベルの増加を明らかにした。５００ｍｇ／ｋｇb.w.の用量のエタノール抽出物２５０ｍｇ／ｋｇよりも強力であることがわかった。Ｆｏｒｃｓｌｉｍのエタノール抽出物は、ラットのＰＣＭ誘発肝障害に対する有望な肝保護効果を正当化するようである。
本研究は、ラットにおけるパラセタモール（ＰＣＭ２g／ｋｇb.w.,p.o）誘発性肝毒性に対するコレウス・フォルスコリ根（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）のエタノール抽出物のための肝臓保護の可能性を評価するために実施した。コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）を２５０ｍｇ／ｋｇと５００ｍｇ／ｋｇ体重の２回経口投与して、ＰＣＭ（２g／ｋｇ）誘発性肝障害に対する肝保護の可能性を評価した。 シリマリン（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を標準的な肝保護剤として使用した。血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、総ビリルビン（ＴＢＲ）、総タンパク質（ＴＰ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）などの生化学的パラメーターが推定された。さらに、組織病理学的研究も実施された。結果は、毒性対照と比較した場合、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴ、およびＴＢＲの有意な減少と、ＧＳＨ、ＴＰ、ＳＯＤ、およびＣＡＴレベルの増加を明らかにした。５００ｍｇ／ｋｇb.w.の用量のエタノール抽出物２５０ｍｇ／ｋｇよりも強力であることがわかった。Ｆｏｒｃｓｌｉｍのエタノール抽出物は、ラットのＰＣＭ誘発肝障害に対する有望な肝保護効果を正当化するようである。
【0119】
Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の肝保護作用：研究は、オスのウィスターアルビノラット（１８０-２００g）を使用して実施された。これらは、インドのカルナータカ州にあるバーラティ薬科大学マンディア校の動物園から入手した。動物をグループ化し、ポリアクリルケージ（３８x２３x１０cm）に収容し、ケージあたり６匹以下の動物を飼育し、標準的な実験室条件（温度２５±２C）で暗闇と明かりのサイクル（１２／１２時間）で維持した。すべての動物は、実験開始前の１週間、実験室の状態に置かれた。倫理的認可は、実験前に施設内動物倫理委員会（ＩＡＥＣ）から取得された（１１３５／PO／Re／S／０７／CPCSEA）。
【0120】
研究デザイン
いずれかのセックスの３０匹のウィスターアルビノラットを研究に使用した。それらはランダムに５つのグループに分けられ、各グループに６匹のラットがいた。
いずれかのセックスの３０匹のウィスターアルビノラットを研究に使用した。それらはランダムに５つのグループに分けられ、各グループに６匹のラットがいた。
【0121】
グループI：正常対照ラット（蒸留水を経口投与）
グループII：蒸留水+パラセタモール（２ g／ｋｇ体重、経口）（毒性コントロール）
グループIII：シリマリン（５０ ｍｇ／ｋｇ ／ day p.o）+パラセタモール（２ g／ｋｇ体重、経口）（陽性対照）
グループIV：Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（それぞれ２５０ｍｇ／ｋｇ／日）+パラセタモール（２g／ｋｇbw、経口）
グループV：Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（それぞれ５００ｍｇ／ｋｇ／日）+パラセタモール（２g／ｋｇbw、経口）
グループII：蒸留水+パラセタモール（２ g／ｋｇ体重、経口）（毒性コントロール）
グループIII：シリマリン（５０ ｍｇ／ｋｇ ／ day p.o）+パラセタモール（２ g／ｋｇ体重、経口）（陽性対照）
グループIV：Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（それぞれ２５０ｍｇ／ｋｇ／日）+パラセタモール（２g／ｋｇbw、経口）
グループV：Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（それぞれ５００ｍｇ／ｋｇ／日）+パラセタモール（２g／ｋｇbw、経口）
【0122】
生化学的研究：血液サンプルは、治療の１０日目に眼窩後神経叢に穴を開けることによってすべての動物から採取された。血液を２５００rpmで１５分間遠心分離することにより血清を分離し、ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、総ビリルビン、および総タンパク質のレベルを、市販の酵素キット（AGAPPE、インド）および自動分析装置（化学分析装置（CA ２００５））を使用して分析した。
【0123】
組織病理学：肝臓の一部を収集し、すぐに１０％ホルマリンで固定した後、７０、８０、９５％のアルコール（エタノール）の昇順およびそれぞれ２回の絶対アルコールで脱水した。組織をキシレンで透明にし、パラフィンワックスに包埋した。回転ミクロトームを使用して厚さ５～６ミクロンの連続切片を取得し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。染色された切片を顕微鏡下で検査して、パラセタモールチャレンジによる肝臓組織の構造の変化、および試験抽出物と標準薬による前処理による肝臓構造の改善を分析した。
【0124】
【表12】
【0125】
ＳＧＯＴ：血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、ＳＧＰＴ：血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、ＧＳＨ：グルタチオン、ＳＯＤ：スーパーオキシドジスムターゼ、ＴＢＲ：総ビリルビン、ＴＰ：総タンパク質、ＣＡＴ:カタラーゼ
【0126】
すべての値は、各グループの６匹のラットの平均±ＳＥＭとして表される。P ０.０５は、コントロールとは有意に異なる値を示す。
【0127】
結果：さまざまな生化学的パラメーターに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の影響を表１２に示す。血清ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴおよびＴＢＲの活性は増加し、ＧＳＨ、ＳＯＤ、ＣＡＴおよびTBは、正常な対照群と比較して、パラセタモールを与えられた動物で著しく減少したことが観察された。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの投与は、パラセタモールによって誘発された血清パラメーターの上昇を低下させた。標準的なシリマリン５０ｍｇ／ｋｇ体重の治療は、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴ、ＴＢＲの非常に有意な（Ｐ<０.００１）減少と、ＧＳＨ、ＳＯＤ、およびTBの増加を示した。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）（２５０ｍｇ／ｋｇ体重および５００ｍｇ／ｋｇ体重）で治療した動物は、毒性対照群と比較して、ＳＧＰＴ、ＳＧＯＴおよびＴＢＲの適度に有意な（Ｐ<０.０５）減少、およびＧＳＨ、ＳＯＤ、およびTBレベルの増加を示した。 正常ラットの肝臓切片の組織病理学的検査は、細胞質および核を有する正常な肝細胞を示したが、パラセタモール処置群は、肝細胞のバルーニング、リンパ球の浸潤および細胞境界の喪失のような様々な程度の脂肪変性を示した。５００ｍｇ／ｋｇの用量でのＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の投与は、肝臓の組織学的構造におけるこれらの欠陥を有意に正常化した。
【0128】
アルビノウィスターラットにおけるパラセタモール誘発性肝毒性におけるＣ．フォルスコリの影響（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の血清ＳＧＰＴ（AST）レベル：オスのアルビノウィスターラットのパラセタモール誘発肝毒性の血清中のＳＧＰＴレベルに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果。対照は３６５±３.４ＩＵ／Ｌの血清中のＳＧＰＴレベルを示したが、パラセタモール治療後、それは８１６±２.１ＩＵ／Ｌに増加した。一方、Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）を２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した後、中毒ラットにパラセタモールのbwpoを投与すると、ＳＧＰＴレベルは７２１±１ＩＵ／Ｌおよび５３６±０.９ＩＵ／に減少したそれぞれL（表１２）。これらのデータは、Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）が酸化ストレスを軽減することにより、パラセタモール誘発性損傷から肝臓を保護する可能性があることを示唆している。
【0129】
アルビノウィスターラットのパラセタモール誘発肝毒性における血清ＳＧＯＴレベルに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果：オスのアルビノウィスターラットにおけるパラセタモール誘発肝毒性の血清中のＳＧＯＴレベルに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果。対照は、血清中のＳＧＯＴレベルが３７０±０.５６ＩＵ／Ｌであったが、パラセタモール治療後、９１８±２.１０ＩＵ／Ｌに増加した。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）を２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した後、パラセタモール中毒ラットの体重は６９８±１.２０ＩＵ／Ｌおよび５５８±１.４ＩＵ／Ｌにそれぞれ減少した（表－１２）。
【0130】
アルビノウィスターラットのパラセタモール誘発肝毒性における血清総ビリルビンレベルに対するＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の効果：パラセタモールの血清中レベルビリルビン合計でＣ．フォルスコリの効果は、オスのアルビノラットを酔わせる。対照は、血清中のビリルビンレベルが（０.０４±０.０００３）ｍｇ／ｄＬであることを示したが、パラセタモールの後、それは（０.２０±０.００８）ｍｇ／ｄＬに増加した。Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）を２５０ｍｇ／ｋｇ体重および５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量でパラセタモール中毒ラットに投与した後、ビリルビンレベルは（０.１５±０.０１）ｍｇ／ｄＬおよび０.１１±０.００４ｍｇ／ｄＬに減少した。ビリルビンレベルの低下は、０.０４±０.０００３ｍｇ／ｄＬ対照群でも観察された（表－１２）。
【0131】
Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）治療が肝酵素活性に及ぼす影響：抗酸化酵素活性のための治療法の効果。表１２は、肝臓の酸化的損傷を示す肝臓組織のＴＰ、ＧＳＨ、ＳＯＤ、およびＣＡＴ活性の変化を示している。ラットをパラセタモールに曝露すると、他のグループと比較して、ＴＰ（２.８３±０.２７）、ＧＳＨ（１０±１.１）、ＳＯＤ（２０±０.４）、ＣＡＴ（４１±１.１）（Ｐ<０.０５）の酵素活性がそれぞれ大幅に低下した。２５０ｍｇ／ｋｇ.bwのＣ．フォルスコリ+ＰＣＭを投与されたラットは、それぞれ有意に上昇したレベルのＴＰ（３.５１±０.０７）、ＧＳＨ（１７±１.１９）、ＳＯＤ（４０±１.１）ＣＡＴ（５３.５±０.８）を示した。５００ｍｇ／ｋｇ.bwＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）+ＰＣＭの投与は、ＴＰ（４.１３±０.２５）、ＧＳＨ（２３±０.９５）、およびＳＯＤ（５６±１.６）ＣＡＴ（５８.６±０.８８）のレベルの有意な増加を示したパラセタモール群（Ｐ<０.０５）であるが、対照ではない。対照的に、Ｃ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の処理は、酵素（ＴＰ、ＧＳＨ、ＳＯＤ、およびＣＡＴ）活性の有意な改善をもたらした（表－１２）。
【0132】
本研究は、Ｃ．フォルスコリ抽出物（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）が有意なinvivo肝保護活性を有することを示している。したがって、Ｃ．フォルスコリ抽出物は、急性肝障害に対する効果的な保護剤に発展する可能性がある。
【0133】
コレウス・フォルスコリ根（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）のエタノール抽出物の抗炎症作用
本研究では、ＦＯＲＣＳＬＩＭの抗炎症効力は、リポ多糖で評価した（ＬＰＳの２μｇ／ｍｌ）をＴＨＰ１刺激サイトカインの相対蛍光強度を測定することによって、ヒト末梢血急性単球性白血病細胞株を、インターロイキン１０（ＩＬ１０）フローサイトメトリー分析による。ＭＴＴ[３（４,５ジメチルチアゾール２イル）２,５ジフェニルテトラゾリウムブロミド]アッセイによって決定されたＴＨＰ１細胞の細胞生存率は、２４時間の曝露後にそれぞれの細胞株のＦＯＲＣＳＬＩＭの非細胞毒性濃度を特定する期間。ＦＯＲＣＳＬＩＭは、潜在的に強力な抗炎症薬として分類されるＬＰＳ前刺激細胞におけるＩＬ１０の抗炎症性サイトカイン発現を有意に抑制した。中のＩＬ１０の平均蛍光強度パーセンテージは、それぞれ対照９.８０、ＬＰＳ ３１、７０およびＣ．フォルスコリ２５、０５である。
本研究では、ＦＯＲＣＳＬＩＭの抗炎症効力は、リポ多糖で評価した（ＬＰＳの２μｇ／ｍｌ）をＴＨＰ１刺激サイトカインの相対蛍光強度を測定することによって、ヒト末梢血急性単球性白血病細胞株を、インターロイキン１０（ＩＬ１０）フローサイトメトリー分析による。ＭＴＴ[３（４,５ジメチルチアゾール２イル）２,５ジフェニルテトラゾリウムブロミド]アッセイによって決定されたＴＨＰ１細胞の細胞生存率は、２４時間の曝露後にそれぞれの細胞株のＦＯＲＣＳＬＩＭの非細胞毒性濃度を特定する期間。ＦＯＲＣＳＬＩＭは、潜在的に強力な抗炎症薬として分類されるＬＰＳ前刺激細胞におけるＩＬ１０の抗炎症性サイトカイン発現を有意に抑制した。中のＩＬ１０の平均蛍光強度パーセンテージは、それぞれ対照９.８０、ＬＰＳ ３１、７０およびＣ．フォルスコリ２５、０５である。
【0134】
ＭＴＴアッセイ：ＭＴＴアッセイは、ＴＨＰ１細胞の生存率を評価するために実行された。ウェルあたり２０,０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、６.２５、１２.５、２５、５０、１００μｇ／ｍｌのＣ．フォルスコリで２４時間処理して、さらなる研究に最適な濃度を決定した。インキュベーション期間後、使用済み培地を除去し、１００μlの０.５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ試薬を３７℃で４時間添加する。これは、代謝的に活性な細胞によるＭＴＴの減少によりホルマザン結晶が生成される。それらは細胞から放出され、１００μlのＤＭＳＯ（シグマアルドリッチ、ＵＳＡ）を使用して溶解された。ＭＴＴアッセイでは、ホルマザンの蓄積は生細胞のミトコンドリア活性を直接反映する。これは、細胞の生存率の間接的な測定値である。プレートをジャイラトリーシェーカーで１０～２０分間撹拌し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（バイオテク、ＵＳＡ）を使用して５７０ｎｍで吸光度を測定した。細胞生存率のパーセンテージは、以下の式（数１）を使用して計算される。
【0135】
【数1】
【0136】
抗炎症活性：抗炎症活性を評価するために、ＴＨＰ１-ヒト末梢血急性単球性白血病細胞株を６ウェルプレートで培養し、ＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（２μｇ／ｍｌ）+ＦＯＲＣＳＬＩＭ（５０μｇ／ｍｌ）および任意の処理を行っていない未処理の３つの異なる培養条件で処理した。簡単に説明すると、細胞を２μｇ／ｍｌのＬＰＳで３時間前刺激して炎症を誘発し、刺激後、細胞を５０μｇ／ｍｌのＦＯＲＣＳＬＩＭで処理するか、２ｍｌのＤＭＥＭ培地で単独で刺激したＬＰＳ（ネガティブコントロール）で処理した。細胞を２４時間インキュベートし、遠心分離管（ＢＤバイオサイエンス）に回収し、レミで３００×gで５分間遠心分離した。R-８℃で遠心分離し、DPBSで２回洗浄した。ペレット化した細胞を０.５ｍｌのBDCytofix／Cytopermとともに室温で１０分間インキュベートし、０.５％ウシ血清アルブミン溶液（１xPBSおよび０.１％アジ化ナトリウム）で洗浄した。細胞を２０μlのPEマウス抗ヒトインターロイキン１０（ＩＬ１０）と別々に２５℃の暗所で３０分間インキュベートし、BDFACSキャリバーフローサイトメーター（BDバイオサイエンス）を使用して発現を測定し、セルクエストプロソフトウェアのバージョン６でデータを分析した。
【0137】
統計分析：すべてのデータはマイクロソフトエクセル２００７バージョンを使用して分析され、計算された標準誤差を使用して平均のグラフ表示が作成された。フローサイトメトリーデータはセルクエストプロソフトウェアのバージョン６を使用して分析した。
【0138】
結果：抗炎症活性：
ＦＯＲＣＳＬＩＭは、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ細胞におけるＩＬ１０阻害を通じて有意な抗炎症効果を示す。インビトロ細胞株におけるＬＰＳ誘発性炎症は、炎症を研究するための標準的なパラダイムを表している。現在の研究は、抗炎症性サイトカインであるＩＬ１０の発現を評価することにより、ＴＨＰ-１細胞に対する抗炎症作用を誘発するＦＯＲＣＳＬＩＭの能力を示している。ＬＰＳ刺激細胞のみで、未処理グループより２～３倍高い発現を示した。しかし、ＬＰＳ刺激後のＦＯＲＣＳＬＩＭ処理細胞は、ＬＰＳ単独処理細胞よりも低い発現を示していた。ＩＬ１０コントロール９.８０、ＬＰＳ１１.４３、ＦＯＲＣＳＬＩＭ２５.０５および標準３１.７０の平均蛍光強度パーセンテージ。この研究の結果はＣ．フォルスコリの根の抽出物（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）が炎症関連疾患の治療のための強力で有望な天然化合物であることを有意に示している。
ＦＯＲＣＳＬＩＭは、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ細胞におけるＩＬ１０阻害を通じて有意な抗炎症効果を示す。インビトロ細胞株におけるＬＰＳ誘発性炎症は、炎症を研究するための標準的なパラダイムを表している。現在の研究は、抗炎症性サイトカインであるＩＬ１０の発現を評価することにより、ＴＨＰ-１細胞に対する抗炎症作用を誘発するＦＯＲＣＳＬＩＭの能力を示している。ＬＰＳ刺激細胞のみで、未処理グループより２～３倍高い発現を示した。しかし、ＬＰＳ刺激後のＦＯＲＣＳＬＩＭ処理細胞は、ＬＰＳ単独処理細胞よりも低い発現を示していた。ＩＬ１０コントロール９.８０、ＬＰＳ１１.４３、ＦＯＲＣＳＬＩＭ２５.０５および標準３１.７０の平均蛍光強度パーセンテージ。この研究の結果はＣ．フォルスコリの根の抽出物（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）が炎症関連疾患の治療のための強力で有望な天然化合物であることを有意に示している。
【0139】
図２は、本発明の実施形態によれば、ＦＯＲＣＳＬＩＭに２４時間曝露続いてＬＰＳで前刺激ＴＨＰ１細胞における平均抗炎症性サイトカイン（ＩＬ１０）のフローサイトメトリーのヒストグラムである。ＬＰＳは陽性対照として機能した（ｎ＝３、平均±標準誤差）。
【0140】
ＨｅｐＧ２細胞におけるエタノール誘発の酸化損傷のコレウス・フォルスコリのインビトロ肝保護効果（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）
現在の研究は、ＨｅｐＧ２細胞株におけるエタノールに対するそのin vitro肝臓保護活動のためのコレウス・フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）のエタノール抽出物を評価することを目的とした。これに関して、細胞毒性研究は、阻害濃度５０％を決定するために３-（４,５-ジメチルチアゾー／ｍｌの用量が選択された。毒性は、エタノール（１００ｍＭ）を使用して誘導した。抽出物のインビトロでの肝保護活性は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼのような生化学的パラメーターのレベルの変化、および乳酸デヒドロゲナー／ｍｌで最大の保護を伴う用量依存的な細胞保護活性を示した。抽出物のパーセント細胞生存率は、４００μｇ／ｍｌＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）は、より標準的な薬物、シリマリン（５０μｇ／ｍｌ）のそれとよく匹敵した、すなわち、７０.３２％であった。
現在の研究は、ＨｅｐＧ２細胞株におけるエタノールに対するそのin vitro肝臓保護活動のためのコレウス・フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）のエタノール抽出物を評価することを目的とした。これに関して、細胞毒性研究は、阻害濃度５０％を決定するために３-（４,５-ジメチルチアゾー／ｍｌの用量が選択された。毒性は、エタノール（１００ｍＭ）を使用して誘導した。抽出物のインビトロでの肝保護活性は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼのような生化学的パラメーターのレベルの変化、および乳酸デヒドロゲナー／ｍｌで最大の保護を伴う用量依存的な細胞保護活性を示した。抽出物のパーセント細胞生存率は、４００μｇ／ｍｌＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）は、より標準的な薬物、シリマリン（５０μｇ／ｍｌ）のそれとよく匹敵した、すなわち、７０.３２％であった。
【0141】
メソッド
化学薬品
ＨｅｐＧ２細胞株は、インドのプネにある国立細胞科学センターから入手した。医薬品や化学薬品はさまざまな会社から購入した。詳細は次のとおりである。ダルベッコの改良イーグル培地、シリマリンシグマアルドリッチ、スプルースストリート、セントルイス、中国。FC試薬、生化学キットメルクスペシャリティ・プライベート・リミテッド、ムンバイ、インド。ウシ胎児血清は、インドのムンバイにあるHimedia研究所から購入した。エタノール-常熟陽原化学、中国。使用した他のすべての化学薬品と溶媒は分析グレードのものであった。
化学薬品
ＨｅｐＧ２細胞株は、インドのプネにある国立細胞科学センターから入手した。医薬品や化学薬品はさまざまな会社から購入した。詳細は次のとおりである。ダルベッコの改良イーグル培地、シリマリンシグマアルドリッチ、スプルースストリート、セントルイス、中国。FC試薬、生化学キットメルクスペシャリティ・プライベート・リミテッド、ムンバイ、インド。ウシ胎児血清は、インドのムンバイにあるHimedia研究所から購入した。エタノール-常熟陽原化学、中国。使用した他のすべての化学薬品と溶媒は分析グレードのものであった。
【0142】
インビトロ細胞毒性活性の決定：５０％細胞毒性濃度（ＣＴＣ５０）はテトラゾリウムアッセイを使用してミトコンドリア合成を推定することによって決定された。 ＨｅｐＧ２細胞（５.０×３細胞／ウェル）を、２５、５０、１００、３００、１０００、および２０００μｇ／ｍｌの濃度のＣ．フォルスコリ１００μlの存在下で７２時間９６ウェル培養プレートで維持した。インキュベーション期間の終わりに、ウェル内の薬液を廃棄し、５０μlの３-（４,５-ジメチルチアゾール２イル）２,５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を改変イーグル培地（ＭＥＭ）フェノールレッドなしで各ウェルに加えた。プレートを穏やかに振とうし、５％CO２雰囲気中３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、上澄みを除去した。その後、５０μlのプロパノールを添加し、プレートを穏やかに振とうして形成されたホルマザンを可溶化し、続いて室温で３０分間一定に振とうしながらインキュベートした。吸光度（光学濃度[OD]）は、マイクロプレートリーダー（バイオテック・インスツルメンツ社、ウィヌースキ、VT）を用いて５４０ｎｍで読み取った。パーセントの成長阻害は、以下の式を用いて計算した。
％成長阻害＝（正常対照の平均OD-試験群の平均OD／正常対照の平均OD）×１００
％成長阻害＝（正常対照の平均OD-試験群の平均OD／正常対照の平均OD）×１００
【0143】
Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）のインビトロ肝保護活性：Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の肝保護活性は、よく維持されたＨｅｐＧ２細胞を使用して評価された。エタノールを肝毒性物質として使用し、シリマリンを標準的な陽性対照として使用した。摂取したエタノールの毒性濃度は１００mMであった。Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）と標準の濃度の違いは、ＭＴＴアッセイの結果に基づいている。実験グループは、以下のように３回実施された。
【0144】
グループI（コントロール）：
通常のコントロール：細胞を１００μlの無血清培地で２４時間処理した。
通常のコントロール：細胞を１００μlの無血清培地で２４時間処理した。
【0145】
ジメチルスルホキシド（DMSO）コントロール：細胞を、DMSO（０.３％v ／
【0146】
シリマリンコントロール：／
【0147】
Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）コントロール：／
【0148】
グループII（毒素治療）：細胞を１００mMエタノールを含む１００μlの無血清培地で２４時間処理した。
【0149】
グループIII（シリマリン治療）：細胞を、５０および１００μｇ／ｍｌの濃度のシリマリンを含む１００mMエタノールを含む１００μlの無血清培地で２４時間処理した。
【0150】
グループIVＣ．フォルスコリ治療（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）：／ｍｌの濃度のＣ．フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）を含む１００mMエタノーーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）漏出アッセイが、エコライン診断キットを使用した標準的な方法に従ってすべてのグループに対して実行された。
【0151】
結果：抽出物のインビトロでの肝保護活性、Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）は、研究の結果を表１３に示す。本調査はＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）のエタノール抽出物は、肝損傷を誘導したエタノールに対する肝保護効果を示し、そのことを示す。 抽出物のＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）が４００μｇに／／／ｍｌ）と十分に匹敵した。この研究により、Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）抽出物は、エタノール誘発細胞毒性に対してすべての試験用量で有意な肝保護活性を示したことが明らかになった。
【0152】
【表13】
【0153】
の抗脂肪生成活性を評価するためのinvitroアプローチ
３Ｔ３Ｌ１細胞株におけるコレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）根エキス
本研究は、抗脂肪生成を決定するために行うだけでなく、抗高脂血症活性は、３Ｔ３Ｌ１マウス脂肪細胞株を用いて、コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）で抽出した。ＭＴＴアッセイは、抽出物を使用して、３Ｔ３Ｌ１細胞株に対する細胞生存率の研究を行った。３Ｔ３Ｌ１細胞株におけるコレウス・フォルスコリの抗高脂血症活性オルリスタットを参照標準として使用した請求膵リパーゼ及びオイルレッドO染色を用いて、脂質蓄積研究の阻害によって評価した。結果Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）は、２００μｇの濃度で２５.８２％を示した。これは、細胞生存率が５０μｇで３８.３４％のシンバスタチンと比較した場合に高くなった。脂質蓄積は、試験抽出物およびシンバスタチンによってそれぞれ４９.９８％および３３.４３％で実質的に阻害されたが、トリグリセリドの分解の阻害による成熟３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞における膵リパーゼの阻害％は、Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）及びオルリスタットに対してそれぞれ、４００μｇで５４.８２％および４９.８３％であることが見出された。
３Ｔ３Ｌ１細胞株におけるコレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）根エキス
本研究は、抗脂肪生成を決定するために行うだけでなく、抗高脂血症活性は、３Ｔ３Ｌ１マウス脂肪細胞株を用いて、コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）で抽出した。ＭＴＴアッセイは、抽出物を使用して、３Ｔ３Ｌ１細胞株に対する細胞生存率の研究を行った。３Ｔ３Ｌ１細胞株におけるコレウス・フォルスコリの抗高脂血症活性オルリスタットを参照標準として使用した請求膵リパーゼ及びオイルレッドO染色を用いて、脂質蓄積研究の阻害によって評価した。結果Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）は、２００μｇの濃度で２５.８２％を示した。これは、細胞生存率が５０μｇで３８.３４％のシンバスタチンと比較した場合に高くなった。脂質蓄積は、試験抽出物およびシンバスタチンによってそれぞれ４９.９８％および３３.４３％で実質的に阻害されたが、トリグリセリドの分解の阻害による成熟３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞における膵リパーゼの阻害％は、Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）及びオルリスタットに対してそれぞれ、４００μｇで５４.８２％および４９.８３％であることが見出された。
【0154】
細胞株と培地
３Ｔ３Ｌ１細胞株は、細胞科学国立センター（NCCS）、プネ、インドから入手した。細胞株のストック培養物を、１０％を補充したDMEM培地で培養したウシ胎児血清を不活性化し、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）を、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、及びアンホテリシンB（５ ｍｇ／ｍｌ）でのCO２雰囲気中で ３７℃コンフルエントになるまで。Нe細胞を０.２％トリプシン、PBS溶液中の０.０２％EDTAで解離した。すべての実験は、９６ウェルマイクロタイタープレート（コーニング、ＵＳＡ）で実施された。
３Ｔ３Ｌ１細胞株は、細胞科学国立センター（NCCS）、プネ、インドから入手した。細胞株のストック培養物を、１０％を補充したDMEM培地で培養したウシ胎児血清を不活性化し、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）を、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、及びアンホテリシンB（５ ｍｇ／ｍｌ）でのCO２雰囲気中で ３７℃コンフルエントになるまで。Нe細胞を０.２％トリプシン、PBS溶液中の０.０２％EDTAで解離した。すべての実験は、９６ウェルマイクロタイタープレート（コーニング、ＵＳＡ）で実施された。
【0155】
３Ｔ３Ｌ１細胞における植物抽出物のインビトロ細胞生存率の
細胞生存率に対する植物抽出物の効果は、ＭＴＴアッセイによって実行された。植物抽出物のインビトロ細胞毒性を試験するために、ＭＴＴアッセイは２５μｇから４００μｇにまでの範囲の選択された植物の試験抽出物の濃度で細胞生存度を評価するために行った。マイクロタイタープレートの部分単層に、１００μlの異なる試験濃度の試験薬を添加した。プレートを５％CO２雰囲気中３７℃で２４時間インキュベートした。総量の最終濃度が０.５ｍｇ／ｍｌになるＭＴＴ試薬をウェルに加え、さらに３時間インキュベートした。ＭＴＴ試薬を１００μlのDMSOに交換した。シンバスタチンを陽性対照として使用した。ELISAリーダーを使用して５７０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を読み取った。IC５０値は、線形回帰方程式を使用して決定された。パーセントの成長阻害は、以下の式を用いて計算した。
細胞生存率に対する植物抽出物の効果は、ＭＴＴアッセイによって実行された。植物抽出物のインビトロ細胞毒性を試験するために、ＭＴＴアッセイは２５μｇから４００μｇにまでの範囲の選択された植物の試験抽出物の濃度で細胞生存度を評価するために行った。マイクロタイタープレートの部分単層に、１００μlの異なる試験濃度の試験薬を添加した。プレートを５％CO２雰囲気中３７℃で２４時間インキュベートした。総量の最終濃度が０.５ｍｇ／ｍｌになるＭＴＴ試薬をウェルに加え、さらに３時間インキュベートした。ＭＴＴ試薬を１００μlのDMSOに交換した。シンバスタチンを陽性対照として使用した。ELISAリーダーを使用して５７０ｎｍおよび６３０ｎｍで吸光度を読み取った。IC５０値は、線形回帰方程式を使用して決定された。パーセントの成長阻害は、以下の式を用いて計算した。
【0156】
インビトロで３Ｔ３Ｌ１細胞において、コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の抗肥満の研究：
膵臓リパーゼ阻害アッセイ
所定のサンプルの膵リパーゼ阻害活性は、基質としてpニトロフェニルパルミテート（pNPP）を使用して決定される。反応条件下での酵素はpNPPを加水分解して、着色物質であり、４１０ｎｍでモニターできるpニトロフェノールを放出する。細胞をさまざまな濃度の粗抽出物（２５～～／ｍｌで調製した。リパーゼ（０.１ ｍｇ）を７ris-bu er（５０ mM、pH ８）に溶解し、細胞上清に添加した。混合物を１５分間撹拌し、２０００rpmで１０分間遠心分離した。透明な上澄みを回収した。異なる濃度の所定のサンプル（またはオルリスタット）を０.５ｍｌのリパーゼ溶液と混合した。それを３７℃で３０分間インキュベートした。次に、１ｍｌの基質pNPP（２プロパノール中３mM）をすべてのチューブに添加した。混合物を３７℃で２時間インキュベートした後、その吸光度をブランクに対して４１０ｎｍで記録した。コントロールには、テストサンプルを除くすべての成分が含まれていた。オルリスタットを陽性対照として使用した。
膵臓リパーゼ阻害アッセイ
所定のサンプルの膵リパーゼ阻害活性は、基質としてpニトロフェニルパルミテート（pNPP）を使用して決定される。反応条件下での酵素はpNPPを加水分解して、着色物質であり、４１０ｎｍでモニターできるpニトロフェノールを放出する。細胞をさまざまな濃度の粗抽出物（２５～～／ｍｌで調製した。リパーゼ（０.１ ｍｇ）を７ris-bu er（５０ mM、pH ８）に溶解し、細胞上清に添加した。混合物を１５分間撹拌し、２０００rpmで１０分間遠心分離した。透明な上澄みを回収した。異なる濃度の所定のサンプル（またはオルリスタット）を０.５ｍｌのリパーゼ溶液と混合した。それを３７℃で３０分間インキュベートした。次に、１ｍｌの基質pNPP（２プロパノール中３mM）をすべてのチューブに添加した。混合物を３７℃で２時間インキュベートした後、その吸光度をブランクに対して４１０ｎｍで記録した。コントロールには、テストサンプルを除くすべての成分が含まれていた。オルリスタットを陽性対照として使用した。
【0157】
阻害率は、次の式（数２）を使用して計算された。
【0158】
【数2】
【0159】
インビトロで３Ｔ３Ｌ１細胞において、コレウス・フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の抗脂肪生成の研究：
オイルレッドO染色法を、抗脂肪生成の研究のための植物抽出物の試験濃度は細胞毒性試験及び試験で得られた結果に基づいて決定する３Ｔ３Ｌ１細胞で行ったし、脂肪小滴形成の阻害に対する植物抽出物の効果を決定したオイルレッドＯ染色法の定量化による。
オイルレッドO染色法を、抗脂肪生成の研究のための植物抽出物の試験濃度は細胞毒性試験及び試験で得られた結果に基づいて決定する３Ｔ３Ｌ１細胞で行ったし、脂肪小滴形成の阻害に対する植物抽出物の効果を決定したオイルレッドＯ染色法の定量化による。
【0160】
脂質（オイルレッドＯ）染色：１０００μlの細胞懸濁液を、試験剤なしで、必要な細胞密度（ウェルあたり１０６細胞）で６ウェルプレートに播種した。細胞を約７２時間増殖させた。サンプル抽出物と２％不活化FBS濃度を添加したDMEMを作成することにより、１０００mcｇ／ｍｌのストック溶液を調製した。プレートを５％CO２雰囲気中３７℃で２４時間インキュベートした後、使用済み培地を除去した。
【0161】
細胞固定は、PBSで穏やかに洗浄することにより培地から細胞を除去して行った。１０％ホルマリンを各ウェルに加え、３０分から１時間インキュベートした。標準的な手順に基づいて細胞染色を行った。吸光度を４９２ｎｍでELISAリーダーで読み取った。
【0162】
処理済みサンプルのオイルレッドO強度は、次の式を使用して未処理サンプルと比較して計算された。
【0163】
【数3】
【0164】
結果
インビトロで３Ｔ３Ｌ１細胞中のコレウス・フォルスコリの抗肥満の研究：
膵リパーゼ活性アッセイの目的は、膵リパーゼ活性を阻害することによって体内への脂質吸収を阻害する植物抽出物の能力を知ることであった。膵リパーゼの加水分解によって形成される２つの主な生成物は、脂肪酸と２-モノアシルグリセロールである。膵リパーゼ活性は、肥満の原因として知られているモノグリセリドと遊離脂肪酸の体内への吸収を促進することで作用することが知られている。身体へのC. Ｃ．フォルスコリエキス防止の脂質蓄積の膵リパーゼ活性の阻害に。オルリスタットは比較の標準薬として選ばれ、FDAによって承認され、中枢作用性の抗肥満薬とは別に肥満治療に利用できる。この抽出物は、膵臓のリパーゼ阻害を介して作用する。未処理の細胞株は０％のリパーゼ阻害活性を示した。オルリスタットは４９.８３％のリパーゼ阻害活性を示し、抽出物は用量依存的な阻害活性の増加を示した。つまり、５０μｇで１１.６８％のリパーゼ阻害活性、４００μｇで５４.８２％のリパーゼ阻害活性がそれぞれ報告された（表１４および１５）。
インビトロで３Ｔ３Ｌ１細胞中のコレウス・フォルスコリの抗肥満の研究：
膵リパーゼ活性アッセイの目的は、膵リパーゼ活性を阻害することによって体内への脂質吸収を阻害する植物抽出物の能力を知ることであった。膵リパーゼの加水分解によって形成される２つの主な生成物は、脂肪酸と２-モノアシルグリセロールである。膵リパーゼ活性は、肥満の原因として知られているモノグリセリドと遊離脂肪酸の体内への吸収を促進することで作用することが知られている。身体へのC. Ｃ．フォルスコリエキス防止の脂質蓄積の膵リパーゼ活性の阻害に。オルリスタットは比較の標準薬として選ばれ、FDAによって承認され、中枢作用性の抗肥満薬とは別に肥満治療に利用できる。この抽出物は、膵臓のリパーゼ阻害を介して作用する。未処理の細胞株は０％のリパーゼ阻害活性を示した。オルリスタットは４９.８３％のリパーゼ阻害活性を示し、抽出物は用量依存的な阻害活性の増加を示した。つまり、５０μｇで１１.６８％のリパーゼ阻害活性、４００μｇで５４.８２％のリパーゼ阻害活性がそれぞれ報告された（表１４および１５）。
【0165】
図３は本発明の実施形態による、２０X,倍でのＭＴＴ細胞生存率アッセイの画像を示す。
【0166】
【表14】
【0167】
【表15】
【0168】
【表16】
【0169】
この研究は、３Ｔ３Ｌ１細胞株を使用して、Ｃ．フォルスコリ根のエタノール抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）のインビトロ抗糖尿病活性を評価することを目的としている。根エキスの細胞毒性効果は３-（４,５-ジメチルチアゾール-２-イル）-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって決定した。グルコース取り込みを誘導する能力およびグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）のトランスロケーションとの相関は、３Ｔ３Ｌ１細胞でフローサイトメトリーによって測定した。さらに、Ｃ．フォルスコリの根の抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）のαアミラーゼ活性に対する阻害効果は、比色法によって決定された。さまざまな濃度のＣ．フォルスコリ根抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）は、２４時間の処理後、３Ｔ３Ｌ１細胞に対して毒性を示さなかった。根エキスで刺激で、６２.３４％と３Ｔ３Ｌ１細胞の７６.８６％はそれぞれ、グルコース取り込みおよびＧＬＵＴ４発現を示した。比色分析は、Ｃ．フォルスコリの根のエタノー／ｍｌのαアミラーゼ酵素阻害濃度（IC５０）値の活性に対して有意な阻害効果を有することを示した。この研究では、Ｃ．フォルスコリの根の抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）が、標準薬のメトホルミンやアカルボースと比較して有望な抗糖尿病効果を示し、３Ｔ３Ｌ１細胞に対して無毒であったことは明らかである。このように、さらに、抗糖尿病用途での可能な代替治療として推奨するために調べることができる。
【0170】
材料と方法
細胞培養
３Ｔ３Ｌ１細胞株は、インドのマハラシュトラ州プネにある国立細胞科学センター（NCCS）から入手し、１０％FBS、１０,０００ユニットのペニシリンG、１０,０００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを添加したDMEM（高グルコース）で培養した。 １０mM HEPES（４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジンエタンスルホン酸）、３７℃、５％CO２雰囲気。
細胞培養
３Ｔ３Ｌ１細胞株は、インドのマハラシュトラ州プネにある国立細胞科学センター（NCCS）から入手し、１０％FBS、１０,０００ユニットのペニシリンG、１０,０００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを添加したDMEM（高グルコース）で培養した。 １０mM HEPES（４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジンエタンスルホン酸）、３７℃、５％CO２雰囲気。
【0171】
細胞毒性アッセイ：Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の葉抽出物の細胞毒性は、ＭＴＴアッセイによって決定された。黄色のテトラゾリウム塩であるＭＴＴ（３-（４,５-ジメチルチアゾール-２-イル）-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、生細胞ミトコンドリアによって生成される乳酸デヒドロゲナーゼ酵素の作用によってホルマザン結晶に変換される。ウェルあたり２０×１０４細胞／２００μLの密度の３Ｔ３Ｌ１細胞を、９６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。使用済み培地を、DMEMで希釈したさまざまな濃度の葉抽出物（２５～／ｍｌ）と交換し、５％CO２、３７℃の温度で２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、細胞を０.５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬で処理し、３７℃の温度で２時間インキュベーートリーダーで５７０ｎｍで測定した。細胞生存率は、未処理の細胞を１００％生存集団と見なし、次の式を使用して計算した。
【0172】
【数4】
【0173】
グルコース取り込みアッセイ：６ウェルプレートに、３Ｔ３Ｌ１細胞を２×１０５細胞／２ｍｌの密度で播種し、５％CO２で３７℃で一晩インキュベートした。その後、使用済み培地を除去し、細胞をDPBSで洗浄し、１００μＭの２NBDGを含む２ｍｌのグルコースを含まない培地で実験化合物および対照で処理し、２時間インキュベートした。処理の終わりに、培地をすべてのウェルから除去し、D-PBSで洗浄した。トリプシン処理によって細胞を回収し、DPBSで洗浄した後、２５℃で３００×ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞を０.５ｍｌのD-PBSに再懸濁した。FACSキャリバー、BDバイオサイエンス社、ＵＳＡをFL１チャネルで蛍光強度を測定することにより、２NBDGの細胞取り込みを分析し、クエストプロソフトウェアをセルに使用された、BDバイオサイエンス社、ＵＳＡは、データ分析に使用した。
【0174】
結果
３Ｔ３Ｌ１細胞株に対するＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の細胞毒性効果：
所定の試験化合物、様々な濃度でＣ．フォルスコリ根（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）抽出物は、（２５～４００μｇ／ｍｌ）で２４時間処理した後３Ｔ３Ｌ１細胞に対する細胞毒性を示さかなった。３Ｔ３Ｌ１細胞の処理に使用されるＣ．フォルスコリ根抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の濃度とそれぞれの生存率を表１７に示す。図４は、３Ｔ３Ｌ１細胞の細胞生存率は、本発明の実施形態によれば、Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）抽出物および対照薬剤の１００μＭの異なる濃度で処理した。図５は、試験化合物への曝露後に倒立光学顕微鏡によって撮影された３Ｔ３Ｌ１細胞の画像を示している。本発明の実施形態による、（Ａ）馴化培地、（Ｂ）標準メトホルミン薬（１００μ／ｍｌのＣ．フォルスコリ根（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）抽出物で処理した細胞を２４時間。メトホルミンは標準的な抗糖尿病薬であり、インビトロの細胞ベー±SDとして表される[表１７]。
３Ｔ３Ｌ１細胞株に対するＣ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の細胞毒性効果：
所定の試験化合物、様々な濃度でＣ．フォルスコリ根（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）抽出物は、（２５～４００μｇ／ｍｌ）で２４時間処理した後３Ｔ３Ｌ１細胞に対する細胞毒性を示さかなった。３Ｔ３Ｌ１細胞の処理に使用されるＣ．フォルスコリ根抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）の濃度とそれぞれの生存率を表１７に示す。図４は、３Ｔ３Ｌ１細胞の細胞生存率は、本発明の実施形態によれば、Ｃ．フォルスコリ（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）抽出物および対照薬剤の１００μＭの異なる濃度で処理した。図５は、試験化合物への曝露後に倒立光学顕微鏡によって撮影された３Ｔ３Ｌ１細胞の画像を示している。本発明の実施形態による、（Ａ）馴化培地、（Ｂ）標準メトホルミン薬（１００μ／ｍｌのＣ．フォルスコリ根（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）抽出物で処理した細胞を２４時間。メトホルミンは標準的な抗糖尿病薬であり、インビトロの細胞ベー±SDとして表される[表１７]。
【0175】
グルコース取り込みアッセイ
蛍光デオキシグルコシアナログである２NBDGを使用して、３Ｔ３Ｌ１細胞におけるグルコースの細胞取り込みを調べた。結果は、２-NBDGを取り込んだ細胞の量が、未処理の細胞と比較した場合、Ｃ．フォルスコリ抽出物で処理された細胞の集団で多かったことを示した。メトホルミンで-処理された細胞は、２-NBDGの最も高い細胞取り込みを示した。相対平均蛍光強度値を図６と図７に示す。図６は、所与の未処理の３Ｔ３Ｌ１細胞における蛍光２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）の存在についてのオーバーレイされた発現グラフ（黒色線）を示し、標準的な薬物処理細胞（メトホルミン、１００μＭ）（赤色線）、および、本発明の実施形態による、１００μｇ／ｍＬのＣ．フォルスコリ根抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）処理細胞（緑色線）を示す。図７は、所与の未処理の３Ｔ３Ｌ１細胞（黒色の線）、および、標準的な薬物処理細胞（メトホルミン１００μＭ、赤色の線）、および、本発明の実施形態による、１００μｇ ／ ｍＬのＣ．フォルスコリ抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）処理細胞（緑色の線）の重ね合わせた蛍光強度を示す。
蛍光デオキシグルコシアナログである２NBDGを使用して、３Ｔ３Ｌ１細胞におけるグルコースの細胞取り込みを調べた。結果は、２-NBDGを取り込んだ細胞の量が、未処理の細胞と比較した場合、Ｃ．フォルスコリ抽出物で処理された細胞の集団で多かったことを示した。メトホルミンで-処理された細胞は、２-NBDGの最も高い細胞取り込みを示した。相対平均蛍光強度値を図６と図７に示す。図６は、所与の未処理の３Ｔ３Ｌ１細胞における蛍光２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）の存在についてのオーバーレイされた発現グラフ（黒色線）を示し、標準的な薬物処理細胞（メトホルミン、１００μＭ）（赤色線）、および、本発明の実施形態による、１００μｇ／ｍＬのＣ．フォルスコリ根抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）処理細胞（緑色線）を示す。図７は、所与の未処理の３Ｔ３Ｌ１細胞（黒色の線）、および、標準的な薬物処理細胞（メトホルミン１００μＭ、赤色の線）、および、本発明の実施形態による、１００μｇ ／ ｍＬのＣ．フォルスコリ抽出物（ＦＯＲＣＳＬＩＭ）処理細胞（緑色の線）の重ね合わせた蛍光強度を示す。
【0176】
フローサイトメトリーによる３Ｔ３Ｌ１細胞株でのグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）発現研究：フローサイトメトリーによるＧＬＵＴ４発現研究の統計デーーサイトメトリーによる３Ｔ３Ｌ１細胞株でのグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）発現研究を示す。
【0177】
【表17】
【0178】
本発明は、脂肪肝の主な原因である１４－デオキシコレオンＵ化合物を含まないコレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）の抽出物を提供する。本発明は、誘発された肝毒性を防ぎ、したがって、コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ） 抽出物を消費に対して完全に安全にする。コレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）抽出物から１４－デオキシコレオンＵを完全に除去すると、組成物を安全に摂取できる。したがって、本発明のコレウス・フォルスコリ（Ｆｏｒｃｓｌｉｍ）抽出物は、副作用なしに、肥満、心血管障害、腺癌などの治療に長期間使用される。
【0179】
本明細書中で用いられる表現や用語は、説明の目的のためであり、限定するものではないのが理解されるべきである。したがって、本明細書の実施形態は好ましい実施形態に関して説明されてきたが、当業者は本明細書の実施形態が、完全な明細書または非仮出願に提示された特許請求の範囲の精神および範囲内で修正して実施できることを認識するであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【外国語明細書】