特開 2022-69217 Ｘｋｒ４ポリペプチド、ＸＲＣＣ４ポリペプチド、および目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022069217

(43)【公開日】2022-05-11

(54)【発明の名称】Ｘｋｒ４ポリペプチド、ＸＲＣＣ４ポリペプチド、および目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20220428BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20220428BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220428BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220428BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220428BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220428BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220428BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220428BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20220428BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20220428BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

C07K14/47 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N1/15

C12Q1/6869 Z

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

G01N33/50 P

【審査請求】未請求

【請求項の数】17

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020178281

(22)【出願日】2020-10-23

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的先端研究開発支援事業、ソロタイプ「画期的医薬品等の創出をめざす脂質の生理活性と機能の解明」研究開発領域、「細胞膜における脂質動態の制御機構の解明とその応用」、及び２０１９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的先端研究開発支援事業ステップタイプ（ＦＯＲＣＥ）、「細胞膜脂質動態の異常による神経疾患発症の理解並びにその治療戦略の提案」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】504132272

【氏名又は名称】国立大学法人京都大学

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100165892

【弁理士】

【氏名又は名称】坂田 啓司

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 淳

(72)【発明者】

【氏名】圓岡 真宏

(72)【発明者】

【氏名】チョウ・パンパン

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045DA14

4B063QA13

4B063QQ02

4B063QQ04

4B063QQ05

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

4B063QS36

4B063QX02

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA87Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA46

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】      （修正有）

【課題】脂質スクランブル活性に関係する分子を特定すること、並びに、Ｘｋｒ４ポリペプチドまたはＸＲＣＣ４ポリペプチド、それらをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質のスクリーニング方法の提供。
【解決手段】Ｘｋｒ４ポリペプチドであって特定のアミノ酸配列を有し、かつＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用なしに細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るポリペプチドである、Ｘｋｒ４ポリペプチド。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｘｋｒ４ポリペプチドであって、
（Ａ）配列番号３～５および３７～３９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（Ｂ）前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（Ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用なしに細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るポリペプチド
である、Ｘｋｒ４ポリペプチド。

【請求項2】

ＸＲＣＣ４ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号７～１２および４２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜における脂質スクランブル活性を誘発し得るポリペプチド
である、ＸＲＣＣ４ポリペプチド。

【請求項3】

配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２７０位のアルギニンを含む、請求項２に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド。

【請求項4】

配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２６５位にメチオニンを含まない、請求項２または３に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド。

【請求項5】

請求項１に記載のＸｋｒ４ポリペプチド、あるいは請求項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項6】

請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項7】

請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項8】

請求項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド；前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１つを含む、Ｘｋｒ４を活性化するための組成物。

【請求項9】

アポトーシスの抑制が関与する状態または疾患の治療または予防用である、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）請求項１に記載のＸｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する可能性のある候補物質とを接触させること；
（２）前記候補物質と接触させた前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および
（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して、低い場合または高い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。

【請求項11】

前記Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質が、前記比較において、前記脂質スクランブル活性が前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性よりも低い場合、前記調節する物質は、アポトーシスの促進が関与する状態または疾患の治療または予防のための薬剤候補である、請求項１０に記載のスクリーニング方法。

【請求項12】

Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドであって、（α）配列番号２または３６に記載のアミノ酸配列からなるＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチド、または（β）前記（α）ポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（α）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する可能性のある候補物質とを接触させること；
（２）前記候補物質と接触させた前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および
（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して高い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。

【請求項13】

Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）請求項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチドが導入され、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質とを接触させること；
（２）前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および
（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質と接触させていな前記細胞における脂質スクランブル活性よりも低い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。

【請求項14】

Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質の存在下で、請求項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチドと、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとを接触させること；
（２）前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの結合を測定すること；および
（３）前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの前記結合が、前記候補物質の非存在下で前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとを接触させた場合の結合よりも低い場合に、前記候補物質を、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。

【請求項15】

前記脂質スクランブル活性が、リン脂質または糖脂質の取込み活性、または細胞膜の内側に位置するリン脂質の露出活性である、請求項１０～１４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

【請求項16】

請求項１４または１５に記載のＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニングのためのキットであって、
請求項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド；前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；および前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または前記発現ベクターを含む宿主細胞からなる群より選択される少なくとも１つを含む、キット。

【請求項17】

目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法であって、
（ａ）細胞のゲノムＤＮＡの複数種の遺伝子のヌクレオチド配列に対応する少なくとも１種のガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む、ガイドＲＮＡライブラリーを準備すること；
（ｂ）前記ガイドＲＮＡライブラリーが導入された細胞集団を得ること；
（ｃ）前記細胞集団から目的とする表現型に基づいて細胞を選択すること；
（ｄ）選択した細胞からゲノムＤＮＡを回収すること；
（ｅ）工程（ｂ）～（ｄ）が所定回数実施されるまで、回収したゲノムＤＮＡから新たなガイドＲＮＡライブラリーを準備し、前記新たなガイドＲＮＡライブラリーを用いて工程（ｂ）～（ｄ）を実施すること；
（ｆ）工程（ｂ）～（ｄ）が所定回数実施された場合に、回収したゲノムＤＮＡ中のガイド配列を決定すること；および
（ｇ）決定されたガイド配列に対応する遺伝子を、前記目的とする表現型に対応する遺伝子として特定する工程を含み、
前記所定回数が少なくとも２回である、特定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、Ｘｋｒ４ポリペプチドまたはＸＲＣＣ４ポリペプチド、それらをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、あるいは前記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。本開示はまた、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節（例えば阻害または誘発）する物質のスクリーニング方法に関する。本開示はまた、Ｘｋｒ４を活性化するための組成物に関する。本開示はまた、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニングするためのキットに関する。本開示はさらに、目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

脳の発生段階では、多数の細胞死が観察され、その細胞死のほとんどがアポトーシスである。アポトーシスは、核の断片化、細胞質の凝集および分断を特徴する細胞死である。アポトーシスでは、ネクローシスなどの他の細胞死と比べて、細胞が組織からすみやかに除去される。脳の発生段階におけるアポトーシスの欠陥は、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）を含む神経発達障害または行動障害と関連し得る。過剰なアポトーシスは、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）および筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患と関連し得る。

【0003】

真核生物のもつ細胞膜はリン脂質二重膜から構成され、リン脂質が非対称に分布している。このリン脂質の非対称的な分布は、ホスファチジルセリンなどのアミノリン脂質を細胞膜の内側（細胞質側）に輸送する酵素であるフリッパーゼにより維持されていると考えられている。細胞がアポトーシス刺激を受けると、リン脂質の非対称的な分布が崩壊し、細胞膜の内側にあったホスファチジルセリンが細胞表面に露出され、食細胞に貪食される。アポトーシスによるホスファチジルセリンの露出に関与するタンパク質であるＸｋｒ８が同定された（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】ＷＯ ２０１４／０７７２７９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本開示は、脂質スクランブル活性に関係する分子を特定することを１つの目的とする。本開示は、脂質スクランブル活性に関係する分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞を提供することを１つの目的とする。本開示は、脂質スクランブル活性を調節（例えば阻害または誘発）する物質をスクリーニングする方法を提供することを１つの目的とする。本開示は、Ｘｋｒ４を活性化するための組成物を提供することを１つの目的とする。本開示は、脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニングするためのキットを提供することを目的とする。本開示はさらに、目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法を提供することを１つの目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、以下の発明を提供する。
［項１］
Ｘｋｒ４ポリペプチドであって、
（Ａ）配列番号３～５および３７～３９のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（Ｂ）前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（Ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用なしに細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るポリペプチド
である、Ｘｋｒ４ポリペプチド。
［項２］
ＸＲＣＣ４ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号７～１２および４２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜における脂質スクランブル活性を誘発し得るポリペプチド
である、ＸＲＣＣ４ポリペプチド。
［項３］
配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２７０位のアルギニンを含む、項２に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド。
［項４］
配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２６５位にメチオニンを含まない、項２または３に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド。
［項５］
項１に記載のＸｋｒ４ポリペプチド、あるいは項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
［項６］
項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［項７］
項５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
［項８］
項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド；前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１つを含む、Ｘｋｒ４を活性化するための組成物。
［項９］
アポトーシスの抑制が関与する状態または疾患の治療または予防用である、項８に記載の組成物。

【0007】

［項１０］
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）項１に記載のＸｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する可能性のある候補物質とを接触させること；
（２）前記候補物質と接触させた前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および
（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して、低い場合または高い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。
［項１１］
前記Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質が、前記比較において、前記脂質スクランブル活性が前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性よりも低い場合、前記調節する物質は、アポトーシスの促進が関与する状態または疾患の治療または予防のための薬剤候補である、項１０に記載のスクリーニング方法。
［項１２］
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドであって、（α）配列番号２または３６に記載のアミノ酸配列からなるＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチド、または（β）前記（α）ポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（α）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する可能性のある候補物質とを接触させること；
（２）前記候補物質と接触させた前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および
（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して高い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。

【0008】

［項１３］
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチドが導入され、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質とを接触させること；
（２）前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および
（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質と接触させていな前記細胞における脂質スクランブル活性よりも低い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。
［項１４］
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法であって、以下の工程：
（１）Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質の存在下で、項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチドと、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとを接触させること；
（２）前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの結合を測定すること；および
（３）前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの前記結合が、前記候補物質の非存在下で前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとを接触させた場合の結合よりも低い場合に、前記候補物質を、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質として選択すること；
を含む、スクリーニング方法。
［項１５］
前記脂質スクランブル活性が、リン脂質または糖脂質の取込み活性、または細胞膜の内側に位置するリン脂質の露出活性である、項１０～１４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

【0009】

［項１６］
項１４または１５に記載のＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニングのためのキットであって、
項２～４のいずれか一項に記載のＸＲＣＣ４ポリペプチド；前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；および前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または前記発現ベクターを含む宿主細胞からなる群より選択される少なくとも１つを含む、キット。
［項１７］
目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法であって、
（ａ）細胞のゲノムＤＮＡの複数種の遺伝子のヌクレオチド配列に対応する少なくとも１種のガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む、ガイドＲＮＡライブラリーを準備すること；
（ｂ）前記ガイドＲＮＡライブラリーが導入された細胞集団を得ること；
（ｃ）前記細胞集団から目的とする表現型に基づいて細胞を選択すること；
（ｄ）選択した細胞からゲノムＤＮＡを回収すること；
（ｅ）工程（ｂ）～（ｄ）が所定回数実施されるまで、回収したゲノムＤＮＡから新たなガイドＲＮＡライブラリーを準備し、前記新たなガイドＲＮＡライブラリーを用いて工程（ｂ）～（ｄ）を実施すること；
（ｆ）工程（ｂ）～（ｄ）が所定回数実施された場合に、回収したゲノムＤＮＡ中のガイド配列を決定すること；および
（ｇ）決定されたガイド配列に対応する遺伝子を、前記目的とする表現型に対応する遺伝子として特定する工程を含み、
前記所定回数が少なくとも２回である、特定方法。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１（ａ）は、ＰＬＢ細胞（ｐａｒｅｎｔａｌ）における脂質スクランブルアッセイを示すグラフである。図１（ｂ）は、Ｘｋｒ４ＷＴを発現するＰＬＢ細胞における脂質スクランブルアッセイを示すグラフである。図１（ｃ）はＸｋｒ４ΔＣを発現するＰＬＢ細胞における脂質スクランブルアッセイを示すグラフである。図１（ｄ）は、ＰＬＢ細胞（ｐａｒｅｎｔａｌ）における蛍光アネキシンＶ染色アッセイの結果を示すグラフである。図１（ｅ）は、Ｘｋｒ４ＷＴを発現するＰＬＢ細胞における蛍光アネキシンＶ染色アッセイの結果を示すグラフである。図１（ｆ）はＸｋｒ４ΔＣを発現するＰＬＢ細胞における蛍光アネキシンＶ染色アッセイの結果を示すグラフである。薄い灰色はＳＴＳ処理なし（コントロール）を示し、濃い灰色はＳＴＳ処理あり（アポトーシス刺激）を示す。バーはＰＣ取込み、ＰＳ露出が陽性の領域を示す。

【図2】図２上段は、生き状態のＸｋｒ４ＷＴ－ＧＦＰを発現するＰＬＢ細胞をそれぞれ示す顕微鏡写真である。図２下段は、生き状態のＸｋｒ４ΔＣ－ＧＦＰを発現するＰＬＢ細胞をそれぞれ示す共焦点顕微鏡写真である。図２左列は、ＧＦＰ由来の蛍光を示す顕微鏡写真である。図２中列は、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）を示す顕微鏡写真である。図２右は、蛍光写真とＤＩＣ写真との重合せ写真を示す。スケールバーは１０μｍを示す。

【0011】

【図3】図３（ａ）は、カスパーゼ阻害剤の非存在下でのＸｋｒ４ＷＴ発現細胞における脂質スクランブルアッセイの結果を示すグラフである。図３（ｂ）は、カスパーゼ阻害剤の存在下でのＸｋｒ４ＷＴ発現細胞における脂質スクランブルアッセイの結果を示すグラフである。図３（ｃ）は、カスパーゼ阻害剤の非存在下でのＸｋｒ４Δ発現細胞における脂質スクランブルアッセイの結果を示すグラフである。図３（ｄ）は、カスパーゼ阻害剤の存在下でのＸｋｒ４ΔＣ発現細胞における脂質スクランブルアッセイの結果を示すグラフである。薄い灰色は、ＳＴＳ処理なし（コントロール）を示し、濃い灰色はＳＴＳ処理あり（アポトーシス刺激）を示す。バーはＰＣ取込みが陽性の領域を示す。

【図4】図４（ａ）は、Ｘｋｒ４ＷＴまたはＸｋｒ４ΔＣ発現細胞からの細胞膜溶解物のＢＮ－ＰＡＧＥ後のウェスタンブロッティングを示す写真である。黒矢頭はＸｋｒ４単量体を示し、灰色矢頭はＸｋｒ４二量体を示す。図４（ｂ）上段は、Ｘｋｒ４ＷＴまたはＸｋｒ４ΔＣ発現細胞からの細胞膜溶解物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のウェスタンブロッティングを示す写真である。図４（ｂ）下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。

【0012】

【図5】図５（ａ）は、２種類のユビキタスなスクランブラーゼであるＸｋｒ８およびＴＭＥＭ１６Ｆが欠失したＢａ／Ｆ３細胞（ＢＤＫＯ）を用いて恒常的に脂質スクランブル活性を示す細胞を樹立するストラテジーを示す模式図である。図５（ｂ）は、Ｘｋｒ４ΔＣを発現するＢＤＫＯ細胞集団からの恒常的にＰＣを取り込む細胞を選別するストラテジーの結果を示す一連のグラフである。

【図6】図６（ａ）は、Ｘｋｒ４ΔＣを発現するトランスフェクタント（parental）におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図６（ｂ）は、６回ソーティングを行ったＰＣ６におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図６（ｃ）は、Ｘｋｒ４に対するｓｇＲＮＡを発現するＰＣ細胞（ＰＣ６＋ｓｇＸｋｒ４）におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図６（ｄ）上段は、Ｘｋｒ４を検出するためのウェスタンブロッティングを示す写真である。図６（ｄ）下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。

【図7】図７（ａ）は、１ＬＰＣ０における脂質スクランブルアッセイの結果を示すグラフである。図７（ｂ）は、１ＬＰＣ３における脂質スクランブルアッセイの結果を示すグラフである。図７（ｃ）は、２ＬＰＣ０における脂質スクランブルアッセイの結果を示すグラフである。図７（ｄ）は、２ＬＰＣ１における脂質スクランブルアッセイの結果を示すグラフである。バーはＰＣ取込みが陽性の領域を示す。

【0013】

【図8】図８（ａ）は、Ｘｋｒ４全長または各種Ｘｋｒ４バリアントを発現するＢＤＫＯ細胞におけるＰＣ取込みアッセイの結果を示すグラフである。図８（ｂ）は、蛍光アネキシンＶ染色アッセイの結果を示すグラフである。バーはＰＳ露出が陽性の領域を示す。

【図9】図９（ａ）上段は、Ｘｋｒ４バリアントを発現するトランスフェクタントの細胞ライセートのＢＮ－ＰＡＧＥ後のウェスタンブロッティングを示す写真である。黒矢頭はＸｋｒ４単量体を示し、灰色矢頭はＸｋｒ４二量体を示す。図９（ａ）中段は、所定のＸｋｒ４バリアントを発現するトランスフェクタントの細胞ライセートのＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のウェスタンブロッティングを示す写真である。図９（ａ）下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。図９（ｂ）上段は、所定のＸｋｒ４バリアントを発現するトランスフェクタントの細胞ライセートのＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のウェスタンブロッティングを示す写真である。図９（ｂ）下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。

【0014】

【図10】図１０（ａ）は、細胞外にマグネシウムイオンもカルシウムイオンも含まない条件下でのＰＣ取込みを示すグラフである。図１０（ｂ）は、細胞外にマグネシウムイオンを含むがカルシウムを含まない条件下でのＰＣ取込みを示すグラフである。図１０（ｃ）は、細胞外にマグネシウムイオンを含まないがカルシウムイオンを含む条件下でのＰＣ取込みを示すグラフである。図１０（ｄ）は、細胞外にマグネシウムイオンもカルシウムイオンも含む条件下でのＰＣ取込みを示すグラフである。図１０（ａ）～（ｄ）において、バーはＰＣ取込みが陽性の領域を示す。図１０（ｅ）は、細胞外カルシウム濃度に依存するＰＣ取込みを示すグラフである。

【図11】図１１（ａ）は、ＰＣ取込みに対するカルシウムイオノフォアの影響を示すグラフである。図１１（ｂ）は、Ｆｌｕｏ４－ＡＭに対する細胞外カルシウム、ならびにカルシウムイオノフォアの影響を示すグラフである。図１１（ｃ）は、Ｘｋｒ４ＷＴまたはＸｋｒ４ΔＣを発現するトランスフェクタントにおけるＰＣ取込み活性を示す一連のグラフである。図１１（ｃ）において、薄い灰色はＳＴＳ処理なしを示し、濃い灰色はＳＴＳ処理ありを示し、バーはＰＣ取込みが陽性の領域を示す。

【図12】図１２はリバイバルスクリーニングのフロー図である。

【0015】

【図13】図１３（ａ）は樹立されたＣＡＤ ＫＯ ＰＬＢ細胞のシーケンス分析を示す。ＣＡＤ^＋／＋において下線を付した配列はｓｇＲＮＡターゲット配列を示す。ＣＡＤ^－／－において破線で示した領域は両方の対立遺伝子で削除されたヌクレオチド（７ｂｐｓ）を示す。図１３（ｂ）上段はＣＡＤのウェスタンブロッティングを示す写真である。親細胞およびＣＡＤ ＫＯ ＰＬＢ細胞からの全細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用した後、抗ＣＡＤ抗体を使用したウェスタンブロッティングに適用した。図１３（ｂ）下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。図１３（ｃ）はＤＮＡ断片化アッセイを示す写真である。親細胞およびＣＡＤ ＫＯ ＰＬＢ細胞をＳＴＳで４時間刺激し、可溶化バッファーで可溶化し、アガロースゲルに適用した。

【図14】図１４（ａ）は、リバイバルスクリーニングにおいてＸｋｒ４ΔＣ－ＲＦＰが陽性であり、ＰＣ取込みが陰性である細胞を含む細胞集団（ｓｇＰＣ０：ソートなし）のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図１４（ｂ）は、リバイバルスクリーニングにおいてＸｋｒ４ΔＣ－ＲＦＰ陽性かつＰＣ取込み陰性の細胞を含む細胞集団（ｓｇＰＣ２：２回ソート）のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図１４（ｃ）は、リバイバルスクリーニングにおいてＸｋｒ４ΔＣ－ＲＦＰ陽性かつＰＣ取込み陰性の細胞を含む細胞集団（ｓｇＰＣ３：３回ソート）のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。バーはＰＣ取込みが陰性の領域を示す。

【0016】

【図15】図１５は、ｓｇＰＣ４細胞集団のゲノムＤＮＡに組み込まれたｓｇＲＮＡ全体のＮＧＳ分析を示すグラフである。Ｘ軸は、６種のターゲットｓｇＲＮＡのうち３種超のターゲットｓｇＲＮＡが回収された遺伝子のリストを示す。Ｙ軸は、リードにおいて同じ遺伝子に対応する異なるｓｇＲＮＡの合計値を示す。シトクロムＣ（ＣＹＣＳ）およびＡＰＡＦ１に対応するドット付近に各用語（ＣＹＣＳ、ＡＰＡＦ１）を表記する。

【図16】図１６（ａ）はｓｇＰＣ６細胞集団のフローサイトメトリーによるＰＣ取込みを示すグラフである。図１６（ｂ）はｓｇＰＣ６細胞集団のフローサイトメトリーによるカスパーゼ３活性を示すグラフである。実線で囲んだ領域はソートされた領域を示す。

【図17】図１７は、ｓｇＰＣ４細胞におけるターゲットｓｇＲＮＡの読取り合計値に対するｓｇＰＣ７細胞におけるターゲットｓｇＲＮＡの読取り合計値の比を示す棒グラフである。

【0017】

【図18】図１８（ａ）上段はＰＬＢ細胞におけるカスパーゼ３活性を示すグラフである。図１８（ａ）下段はＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図１８（ｂ）上段はＸＲＣＣ４に対するｓｇＲＮＡを用いたＰＬＢ細胞におけるカスパーゼ３活性を示すグラフである。図１８（ｂ）下段はＸＲＣＣ４に対するｓｇＲＮＡを用いたＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図１８（ｃ）上段はＣＹＣＳに対するｓｇＲＮＡを用いたＰＬＢ細胞におけるカスパーゼ３活性を示すグラフである。図１８（ｃ）下段はＣＹＣＳに対するｓｇＲＮＡを用いたＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図１８（ｄ）上段はＡＰＡＦ１に対するｓｇＲＮＡを用いたＰＬＢ細胞におけるカスパーゼ３活性を示すグラフである。図１８（ｄ）下段はＡＰＡＦ１に対するｓｇＲＮＡを用いたＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図１８（ａ）～（ｄ）上段におけるバーは、カスパーゼ３活性陽性の領域を示す。図１８（ａ）～（ｄ）下段におけるバーはＰＣ取込み陽性の領域を示す。

【0018】

【図19】図１９（ａ）は、ＸＲＣＣ４ノックアウトＰＬＢ細胞の配列分析を示す図である。ＸＲＣＣ４^＋／＋において下線を付したヌクレオチド配列は、ＸＲＣＣ４に対するｓｇＲＮＡターゲット配列を示す。ＸＲＣＣ４^－／－における破線は削除されたヌクレオチド（４ｂｐ）配列を示し、下線を付したヌクレオチドは追加されたヌクレオチド（１ｐｂ）を示す。図１９（ｂ）はＣＡＤ、Ｖ５およびＸＲＣＣ４のウェスタンブロッティングを示す写真である。Ｐａｒｅｎｔａｌ細胞、ＣＡＤ ＫＯ（ＣＡＤ^－／－）ＰＬＢ細胞か、ＣＡＤ／ＸＲＣＣ４ダブルＫＯ（ＣＡＤ^－／－ ＸＲＣＣ４^－／－）ＰＬＢ細胞、およびＶ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧの発現を発現するＣＡＤ^－／－ ＸＲＣＣ４^－／－ ＰＬＢ細胞から全細胞ライセートを調製し、調製した全細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた後、抗Ｖ５抗体、抗ＣＡＤ抗体、および抗ＸＲＣＣ４抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。図１９（ｂ）下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。図１９（ｃ）上段は、ＸＲＣＣ４に関するウェスタンブロッティングを示す写真である。図１９（ｃ）中段は、活性化型カスパーゼ３に関するウェスタンブロッティングを示す写真である。Ｃ末端にＲＦＰを融合したＸＲＣＣ４ ＷＴまたはＸＲＣＣ４ ２ＤＡを発現するＰＬＢ細胞を、ＳＴＳを用いてアポトーシス刺激を与えた。前記細胞からの全細胞ライセートを調製し、細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた後、所定の抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。図１９（ｃ）下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。

【0019】

【図20】図２０（ａ）はＸＲＣＣ４^－／－細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２０（ｂ）はＸＲＣＣ４ ＷＴを発現するＸＲＣＣ４^－／－細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２０（ｃ）はＸＲＣＣ４ ２ＤＡを発現するＸＲＣＣ４^－／－細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。薄い灰色はコントロールを示し、濃い灰色はＳＴＳ処理ありを示す。バーはＰＣ取込みが陽性の領域を示す。図２０（ｄ）はＸｋｒ４ΔＣ Ｑ３３２Ｅ発現細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２０（ｅ）はＸＲＣＣ４に対するｓｇＲＮＡを導入したＸｋｒ４ΔＣ Ｑ３３２Ｅ発現細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２０（ｆ）はＣＹＣＳに対するｓｇＲＮＡを導入したＸｋｒ４ΔＣ Ｑ３３２Ｅ発現細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。薄い灰色は、ｓｇＲＮＡを導入していないＸｋｒ４ΔＣＱ３３２Ｅ発現細胞におけるＰＣ取込みを示す。

【図21】図２１（上段）はＶ５（Ｘｋｒｓ）のウェスタンブロッティングを示す写真である。図２１（中段）はＲＦＰ（ＸＲＣＣ４）のウェスタンブロッティングを示す写真である。ＸＲＣＣ４ ＷＴ－ＲＦＰを共発現するまたは発現しないＮ末端にＶ５をタグ付けしたＸｋｒを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞からの総細胞ライセートを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングに適用した。図２１下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。

【0020】

【図22】図２２（ａ）は、Ｘｋｒ４を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２２（ｂ）は、Ｘｋｒ８を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２２（ｃ）は、Ｘｋｒ９を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２２（ｄ）は、Ｘｋｒ４およびＸＣＣＲ４ ＷＴを共発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２２（ｅ）は、Ｘｋｒ８およびＸＣＣＲ４ ＷＴを共発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２２（ｆ）は、Ｘｋｒ９およびＸＣＣＲ４ ＷＴを共発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２２（ａ）～（ｆ）において、薄い灰色はＳＴＳ処理なし（コントロール）を示し、濃い灰色はＳＴＳ処理あり（アポトーシス刺激）を示し、バーはＰＣ取込みが陽性の領域を示す。図２２（ｇ）は、Ｘｋｒ４を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるカスパーゼ３活性を示すグラフである。図２２（ｈ）は、Ｘｋｒ８を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるカスパーゼ３活性を示すグラフである。図２２（ｉ）は、Ｘｋｒ９を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるカスパーゼ３活性を示すグラフである。図２２（ｊ）は、Ｘｋｒ４およびＸＲＣＣ４を共発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるカスパーゼ３活性を示すグラフである。図２２（ｋ）は、Ｘｋｒ８およびＸＲＣＣ４を共発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるカスパーゼ３活性を示すグラフである。図２２（ｌ）は、Ｘｋｒ９およびＸＲＣＣ４を共発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるカスパーゼ３活性を示すグラフである。図２２（ｇ）～（ｌ）において、薄い灰色はＳＴＳ処理なし（コントロール）を示し、濃い灰色はＳＴＳ処理あり（アポトーシス刺激）を示し、バーはカスパーゼ３活性が陽性の領域を示す。

【0021】

【図23】図２３（ａ）はＣ末端にＲＦＰをタグ付けしたＸＲＣＣ４ ＷＴ（ＸＲＣＣ４ ＷＴ－ＲＦＰ）を発現するトランスフェクタントの顕微鏡写真である。図２３（ｂ）はＮ末端にＲＦＰをタグ付けしたＸＲＣＣ４ ＷＴ（ＲＦＰ－ＸＲＣＣ４ ＷＴ）を発現するトランスフェクタントの顕微鏡写真である。図２３（ｃ）はＣ末端にＲＦＰをタグ付けしたＸＲＣＣ４ ２ＤＡ（ＸＲＣＣ４ ２ＤＡ－ＲＦＰ）を発現するトランスフェクタントの顕微鏡写真である。図２３（ｄ）はＮ末端にＲＦＰをタグ付けしたＸＲＣＣ４ ２ＤＡ（ＲＦＰ－ＸＲＣＣ４ ２ＤＡ）を発現するトランスフェクタントの顕微鏡写真である。矢頭は細胞質ＸＲＲＣ４を示す。スケールバーは１０μｍを示す。

【0022】

【図24】図２４（ａ）上段はＲＦＰ－ＸＲＣＣ４ ＷＴまたは２ＤＡのウェスタンブロッティングを示す写真である。Ｖ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧおよびＮ末端にＲＦＰを融合したＸＲＣＣ４ ＷＴを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞、およびＶ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧおよびＮ末端にＲＦＰを融合したカスパーゼ非切断型ＸＲＣＣ４ ２ＤＡを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞に対してＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えた。前記細胞からの総細胞ライセートを調製し、前記細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた後、抗ＲＦＰ抗体を用いたウェスタンブロッティングにかけた。図２４（ａ）下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。図２４（ｂ）はＶ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧおよびＮ末端ＲＦＰ融合ＸＲＣＣ４ ＷＴを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞のＰＣ取込み活性を示すグラフである。図２４（ｃ）はＶ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧおよびＮ末端ＲＦＰ融合ＸＲＣＣ４ ２ＤＡを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞のＰＣ取込み活性を示すグラフである。図２４（ｂ）および（ｃ）において、薄い灰色はＳＴＳ処理なし（コントロール）を示し、濃い灰色はＳＴＳ処理あり（アポトーシス刺激）を示し、バーはＰＣ取込みが陽性の領域を示す。

【図25】図２５はＸＲＣＣ４ドメインの略図である。ＸＬＦはＸＬＦバインディングドメインを示す。Ｄｉｍｅｒは二量化ドメインを示す。ＤＮＡ Ｌｉｇ ＩＶはＤＮＡ ＬｉｇＩＶ結合ドメインを示す。アミノ酸２６５位と２６６位との間はカスパーゼ認識サイトである。アミノ酸２７０－２７５は核局在化シグナル（ＮＬＳ）領域を示す。

【0023】

【図26】図２６（ａ）はＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞（ＸＲＣＣ４^－／－）におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２６（ｂ）はＸＲＣＣ４ ＷＴ（１－３３６）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２６（ｃ）はＮ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４（１１６－３３６）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２６（ｄ）はＮ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４（１５６－３３６）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２６（ｅ）はＮ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４（２０４－３３６）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２６（ｆ）はＮ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４（２４８－３３６）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２６（ｇ）はＮ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４（２５６－３３６）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２６（ｈ）はＮ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４（２２６－３３６）（「ΔＮ」ともいう）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２６（ｉ）はＣ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４（１－３０５）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２６（ｊ）はＣ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４（１－２８５）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２６（ｋ）はＣ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４（１－２６５）（「ΔＣ」ともいう）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図２６（ｌ）はＰＣ取込みを引き起こすＸＲＣＣ４断片（「Ｍｉｎｉ」ともいう）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。ＰＣ取込みアッセイは１０μＭ ＳＴＳを用いて実施した。薄い灰色はＳＴＳ処理なし（コントロール）を示し、濃い灰色はＳＴＳ処理あり（アポトーシス刺激）を示す。バーはＰＣ取込みが陽性の領域を示す。

【0024】

【図27】図２７（ａ）上段はＮ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４－ＲＦＰのウェスタンブロッティングを示す写真である。白抜き矢頭は、ＸＲＣＣ４－ＲＦＰの予想タンパク質サイズを示す。黒矢頭は、カスパーゼで切断されたＸＲＣＣ４のＣ末端断片を示す。アスタリスクは、分解産物を示す。図２７（ｂ）はＸＲＣＣ４の天然変性領域（ＩＤＲ）分析を示す。ＸＲＣＣ４のアミノ酸配列をソフトウェアＩＵＰｒｅｄ２Ａで解析し、そのスコアを示す。矢印は、カスパーゼ３切断部位を示す。図２７（ｃ）はＣ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４－ＲＦＰのウェスタンブロッティングを示す写真である。図２７（ｄ）はＸＲＣＣ４ΔＣ－ＲＦＰおよびＸＲＣＣ４ΔＮ－ＲＦＰのウェスタンブロッティングを示す写真である。図２７（ｅ）は所定の生物種におけるＸＲＣＣ４アミノ酸配列のアライメントを示す。下線は、ヒトのＸＲＣＣ４においてカスパーゼ切断部位の後のイソロイシンを示し、該イソロイシンはいくつかの生物種において同様の疎水性アミノ酸バリンに変更されている。実線で囲ったアミノ酸配列は所定の生物種において保存されている。図２７（ｆ）はＸＲＣＣ４（Ｍｉｎｉ）－ＲＦＰのウェスタンブロッティングを示す写真である。図２７（ａ、ｃ、ｄおよびｆ）において、Ｘｋｒｃ４およびＣ末端にＲＦＰが融合された所定のＸＲＣＣ４を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞にＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えた。前記細胞からの総細胞ライセートを調製し、前記細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた後、抗ＲＦＰ抗体を用いたウェスタンブロッティングにかけた。図２７（ａ、ｃ、ｄおよびｆ）下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。全細胞ライセートのローディング量を下部に示す（μｇ）。

【0025】

【図28】図２８（ａ）は合成ペプチドＣ２０およびＣ２１のアミノ酸配列を示す図である。下線は、カスパーゼ認識サイトを示す。実線で囲ったアミノ酸配列はＮＬＳを示す。図２８（ｂ）は合成ペプチドＣ２０およびＣ２１を用いたＰＳを露出するスクランブル活性を示すグラフである。図２８（ｃ）ＰＳ露出活性の定量化（任意単位 ＡＵ）を示す棒グラフである。１（ＡＵ）はＣ２０を導入したＸｋｒ４ΔＣ発現細胞の蛍光強度に対応する。

【図29】図２９（ａ）はＲＦＰをＣ末端に融合したＸＲＣＣ４ ＷＴの細胞内分布を示す顕微鏡写真である。図２９（ｂ）はＲＦＰをＣ末端に融合したＸＲＣＣ４変異体（Ｒ２７０Ａ）の細胞内分布を示す顕微鏡写真である。図２９（ｃ）はＲＦＰをＣ末端に融合したＸＲＣＣ４変異体（Ｋ２７１Ａ）の細胞内分布を示す顕微鏡写真である。図２９（ｄ）はＲＦＰをＣ末端に融合したＸＲＣＣ４変異体（Ｒ２７２Ａ）の細胞内分布を示す顕微鏡写真である。図２９（ｅ）はＲＦＰをＣ末端に融合したＸＲＣＣ４変異体（Ｒ２７３Ａ）の細胞内分布を示す顕微鏡写真である。図２９（ｆ）はＲＦＰをＣ末端に融合したＸＲＣＣ４変異体（Ｒ２７５Ａ）の細胞内分布を示す顕微鏡写真である。Ｖ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞を、所定のＲＦＰ融合ＸＲＣＣ４変異体でトランスフェクトし、前記ＲＦＰ融合ＸＲＣＣ４変異体の細胞内分布を共焦点顕微鏡で分析した。核染色にはＤＲＡＱ５を使用した。ＤＩＣは微分干渉コントラストを示す。スケールバーは２０μｍを示す。

【0026】

【図30】図３０（ａ）はＸＲＣＣ４ ＷＴを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図３０（ｂ）はＸＲＣＣ４変異体（Ｒ２７０Ａ）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図３０（ｃ）はＸＲＣＣ４変異体（Ｋ２７１Ａ）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図３０（ｄ）はＸＲＣＣ４変異体（Ｒ２７２Ａ）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図３０（ｅ）はＸＲＣＣ４変異体（Ｒ２７３Ａ）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。図３０（ｆ）はＸＲＣＣ４変異体（Ｒ２７５Ａ）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。ＰＣ取込みアッセイは１０μＭ ＳＴＳを用いて実施した。薄い灰色はＳＴＳ処理なし（コントロール）を示し、濃い灰色はＳＴＳ処理あり（アポトーシス刺激）を示す。バーはＰＣ取込みが陽性の領域を示す。

【0027】

【図31】図３１（ａ）上段はＸＲＣＣ４変異体のウェスタンブロッティングを示す写真である。Ｖ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧおよびＸＲＣＣ４－ＲＦＰを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞に対してＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えた。前記細胞からの全細胞ライセートを調製し、前記細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた後、抗ＲＦＰ抗体を用いたウェスタンブロッティングにかけた。図３１（ａ）下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。図３１（ｂ）は合成ペプチドを用いたＰＳを露出させるスクランブル活性を示す棒グラフである。下線はアラニン置換したアミノ酸部位を示す。ＸＲＣＣ４断片の変異体 Ｃ２０－Ｒ２７０ＡおよびＣ２０－Ｋ２７１Ａを、ＢＤＫＯ細胞またはＶ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧ（ΔＣ）を発現する細胞にエレクトロポレーションにて導入し、ＰＳ露出アッセイを行った。ＰＳ露出活性の定量化は、Ｃ２０を導入したＶ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧ発現細胞の蛍光強度を１（任意単位 ＡＵ）として示す。エラーバーは３重サンプルの平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。Ｐ値はスチューデントのｔ検定に従って計算した。ＮＳは有意でないことを示す。

【図32】図３２（ａ）上段はＳＰＯＴ－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧおよびＸＲＣＣ４－ＷＴ－２Ａ－ＲＦＰまたはＸＲＣＣ４－Ｒ２７０Ａ－２Ａ－ＲＦＰを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞の坑ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロッティングを示す写真である。図３２（ｂ）中段はＳＰＯＴ－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧおよびＸＲＣＣ４－ＷＴ－２Ａ－ＲＦＰまたはＸＲＣＣ４－Ｒ２７０Ａ－２Ａ－ＲＦＰを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞の坑ＸＲＣＣ４抗体を用いたウェスタンブロッティングを示す写真である。図３２（ｃ）下段はローディングコントロールとしてのＣＢＢ染色したＰＶＤＦメンブレンを示す写真ある。図３２（ｂ）はＳＰＯＴ－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧおよびＸＲＣＣ４－ＷＴ－２Ａ－ＲＦＰまたはＸＲＣＣ４－Ｒ２７０Ａ－２Ａ－ＲＦＰを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞におけるＰＣ取込みを示すグラフである。ＰＣ取込みアッセイは１０μＭ ＳＴＳを用いて実施した。図３２（ｂ）において、薄い灰色はＳＴＳ処理なし（コントロール）を示し、濃い灰色はＳＴＳ処理あり（アポトーシス刺激）を示し、バーはＰＣ取込みが陽性の領域を示す。蛍光強度の中央値は、ＷＴにおいて１３９であり、Ｒ２７０Ａにおいて２９．２であった。

【図33】図３３はＸｋｒ４相互作用物質に関するラベルフリー定量を示す分布図である。ＰＬＢ細胞の細胞膜画分を可溶化し、抗ＳＰＯＴナノボディ結合ビーズを用いて免疫沈降させて、Ｘｋｒ４相互作用物質を沈殿させた。その後、沈殿物を質量分析にかけた。Ｘ軸は、ＳＴＳを用いたＸＲＣＣ４ ＷＴのペプチド数を、ＳＴＳを用いていないＸＲＣＣ４ ＷＴのペプチド数で除した値を示す。Ｙ軸は、ＳＴＳを用いたＸＲＣＣ４ ＷＴのペプチド数を、ＳＴＳを用いたＸＲＣＣ４ Ｒ２７０Ａのペプチド数で除した値を示す。

【図34】図３４（ａ）はＸｋｒ４を用いて免疫沈降して同定された２つのＸＲＣＣ４ペプチドの領域を示す模式図である。図３４（ｂ）はＸＲＣＣ４ペプチド１の遷移の抽出イオンクロマトグラムである。ペプチド１を、ＰＲＭメソッドを用いたターゲット質量分析によって分析した。図３４（ｃ）はＸＲＣＣ４の相対量をＸｋｒ４の相対量で標準化した値を示す棒グラフである。図３４（ｄ）はＸＲＣＣ４ペプチド２の遷移の抽出イオンクロマトグラムである。ペプチドを、ＰＲＭメソッドを用いたターゲット質量分析によって分析した。図３４（ｅ）はＸＲＣＣ４の相対量をＸｋｒ４の相対量で標準化した値を示す棒グラフである。図３４（ｃ）および（ｅ）において、生細胞においてＸｋｒ４で沈殿させたＸＲＣＣ４の相対量が１となるように、ＸＲＣＣ４の相対量をＸｋｒ４の相対量を用いて標準化した。

【図35】図３５（ａ）はＸｋｒ４免疫沈降物におけるＸＲＣＣ４の検出を示すウェスタンブロッティングの写真である。ＳＰＯＴ融合Ｘｋｒ４と共に回収されたＸＲＣＣ４ ＷＴ免疫沈殿物が検出された。図３５（ｂ）はＸＲＣＣ４ペプチドの局在を示す顕微鏡写真である。Ｃ２０－ＴＭＲをエレクトロポレーションにより、Ｘｋｒ４ＷＴ－ＧＦＰまたはＸｋｒ４ΔＣ－ＧＦＰを発現するＨＣＴ１１６細胞に導入した。得られた細胞を共焦点顕微鏡で観察した。図３５（ｃ）は、図３５（ｂ）右列（Ｍａｒｇｅｄ）に示す写真中、白点線矢印に沿ってラインスキャン分析した結果を示すグラフである。ＧＦＰ由来の蛍光強度およびＴＭＲ由来の蛍光強度を示す。図３５（ｃ）において、Ｙ軸は任意単位（ＡＵ）を示し、スケールバーは２０μｍを示す。

【発明を実施するための形態】

【0028】

Ｘｋｒ４ポリペプチド
「Ｘｋｒ４」は、Ｘｋｒファミリーに属し、１０回膜貫通領域を有する膜タンパク質である。Ｘｋｒ４は、特定の組織、例えば脳または皮膚で発現する。Ｘｋｒ４は、例えばヒト、マウス、ブタを含む哺乳動物由来のＸｋｒ４であってよい。Ｘｋｒ４は、例えば鳥類、爬虫類、両生類または魚類におけるＸｋｒ４の相同タンパク質であってよい。Ｘｋｒ４のアミノ酸配列は、例えば公的に提供されるデータベースから入手可能であり、例えばＧｅｎｅＢｎａｋから入手可能である。理論に拘泥するものではないが、Ｘｋｒ４は、例えばアポトーシス刺激を受けた細胞において、カスパーゼによりその一部が切断され、二量体を形成し得る。二量体を形成したＣ末端切断型のＸｋｒ４は、後述するＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用を通じて、脂質スクランブル活性を示し得る。

【0029】

Ｘｋｒ４は、例えば以下に示す配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるまたは含むマウス由来のＸｋｒ４である。

【0030】

Ｘｋｒ４は、例えば以下に示す配列番号３５に記載のアミノ酸配列からなるまたは含むヒト由来のＸｋｒ４である。

【0031】

Ｘｋｒ４は、例えば配列番号１または３５に記載のアミノ酸配列において、１～１００個、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列からなる、または含む。Ｘｋｒ４は、例えば配列番号１または３５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列からなる、または含む。

【0032】

「Ｘｋｒ４ポリペプチド」は、（Ａ）配列番号３～５および３７～３９のいずれかに記載のアミノ酸配列（具体的なアミノ酸配列を以下に示す）からなるポリペプチド；または（Ｂ）前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（Ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用なしに細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るポリペプチドである。

【0033】

【0034】

配列番号３に記載のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較して、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３２２位におけるイソロイシン（Ｉ）がセリン（Ｓ）に置換されている（Ｉ３２２Ｓ）。

【0035】

配列番号４に記載のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較して、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３３１位におけるロイシン（Ｌ）がフェニルアラニン（Ｆ）に置換されている（Ｌ３３１Ｆ）。

【0036】

配列番号５に記載のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較して、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３３２位におけるグルタミン（Ｑ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている（Ｑ３３２Ｅ）。

【0037】

配列番号３７に記載のアミノ酸配列は、配列番号３６に記載のアミノ酸配列と比較して、配列番号３５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３２５位におけるイソロイシン（Ｉ）がセリン（Ｓ）に置換されている（Ｉ３２５Ｓ）。

【0038】

配列番号３８に記載のアミノ酸配列は、配列番号３６に記載のアミノ酸配列と比較して、配列番号３５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３３４位におけるロイシン（Ｌ）がフェニルアラニン（Ｆ）に置換されている（Ｌ３３４Ｆ）。

【0039】

配列番号３９に記載のアミノ酸配列は、配列番号３６に記載のアミノ酸配列と比較して、配列番号３５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３３５位におけるグルタミン（Ｑ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている（Ｑ３３５Ｅ）。

【0040】

Ｘｋｒ４ポリペプチドは、後述するＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用なしに、細胞膜において脂質スクランブル活性を示すことができる。Ｘｋｒ４ポリペプチドによる脂質スクランブル活性は、例えばヒトＰＬＢ９８５細胞（本明細書中「ＰＬＢ細胞」ともいう）（文献２６）における脂質スクランブル活性（例えばＰＣ取込み活性）である。

【0041】

「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸を含み、任意の長さのアミノ酸のポリマーを意味する。「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換性があるように使用される。アミノ酸は、遺伝子によってコードされる２０種のアミノ酸、およびそれ以外の修飾アミノ酸を含む。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、例えば、天然源（細胞）由来であってもよく、遺伝子組み換え技術などにより人工的に調製されたものであってよい。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、例えば天然源または人工的に調製した後の試薬から単離または精製されたものであってよい。ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を単離する方法または精製する方法は、周知であり、例えばＨＰＬＣを用いてよい。

【0042】

本明細書において、前記（Ｂ）に係るＸｋｒ４ポリペプチドを「Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体」ともいう。

【0043】

Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば遺伝子工学技術により調製することができる。Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば本明細書に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから、転写および翻訳させることにより調製することができる。Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば後述するＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害または誘発する物質のスクリーニング方法に利用することができる。

【0044】

Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体は、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列において、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３２２位のイソロイシンに代えてセリン、３３１位のロイシンに代えてフェニルアラニン、および３３２位のグルタミンに代えてグルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体は、例えば配列番号３５に記載のアミノ酸配列において、配列番号３５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３２５位のイソロイシンに代えてセリン、３３４位のロイシンに代えてフェニルアラニン、および３３５位のグルタミンに代えてグルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。

【0045】

アミノ酸の「欠失」は、所定のアミノ酸配列における任意の位置のアミノ酸残基が失われていること意味する。Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体は、例えば前記（Ａ）に係るＸｋｒ４ポリペプチドのアミノ酸配列において、そのＮ末端、Ｃ末端、および／またはＮ末端とＣ末端の間のアミノ酸配列におけるアミノ酸が失われていてもよい。１つの実施形態において、前記アミノ酸の欠失を有するＸｋｒ４ポリペプチドの変異体は、前記（Ａ）に係るＸｋｒ４ポリペプチドのアミノ酸配列において、そのＮ末端またはＮ末端とＣ末端の間のアミノ酸配列におけるアミノ酸が失われていてもよい。

【0046】

配列番号３～５のいずれかに記載のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失を有するＸｋｒ４ポリペプチドの変異体は、例えば５００～５６３アミノ酸長、５２０～５６３アミノ酸長、５４０～５６３アミノ酸長、５５０～５６３アミノ酸長、５６０～５６３アミノ酸長、５６１アミノ酸長、５６２アミノ酸長、または５６３アミノ酸長であってよい。配列番号３７～３８のいずれかに記載のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失を有するＸｋｒ４ポリペプチドの変異体は、例えば５００～５６６アミノ酸長、５２０～５６６アミノ酸長、５４０～５６６アミノ酸長、５５０～５６６アミノ酸長、５６０～５６６アミノ酸長、５６５または５６６アミノ酸長であってよい。

【0047】

アミノ酸の「付加」は、所定のアミノ酸配列における任意の位置にアミノ酸残基が追加または挿入されていることを意味する。Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体は、例えば前記（Ａ）に係るＸｋｒ４ポリペプチドのアミノ酸配列において、そのＮ末端、Ｃ末端、および／またはＮ末端とＣ末端の間のアミノ酸配列においてアミノ酸が追加または挿入されていてもよい。１つの実施形態において、Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体は、前記（Ａ）に係るＸｋｒ４ポリペプチドのアミノ酸配列において、そのＮ末端またはＮ末端とＣ末端の間のアミノ酸配列においてアミノ酸が付加または挿入されていてもよい。

【0048】

配列番号３～５のいずれかに記載のアミノ酸配列においてアミノ酸の付加を有するＸｋｒ４ポリペプチドの変異体は、例えば５６５～６００アミノ酸長、５６５～５９０アミノ酸長、５６５～５８０アミノ酸長、５６５～５７０アミノ酸長、５６９アミノ酸長、５６８アミノ酸長、５６７アミノ酸長、５６６アミノ酸長、または５６５アミノ酸長であってよい。配列番号３７～３８のいずれかに記載のアミノ酸配列においてアミノ酸の付加を有するＸｋｒ４ポリペプチドの変異体は、例えば５６８～６００アミノ酸長、５６８～５９０アミノ酸長、５６８～５８０アミノ酸長、５６８～５７０アミノ酸長、５６９アミノ酸長、または５６８アミノ酸であってよい。

【0049】

アミノ酸の「置換」は、所定のアミノ酸配列における任意の位置のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味する。アミノ酸の置換は、例えば保存的置換であってよい。アミノ酸の「保存的置換」は、ポリペプチド内のアミノ酸残基が、側鎖について類似の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性）を有するアミノ酸の群のうちの他のアミノ酸残基で置き換えられていることを意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなる； 脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンからなる； アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンからなる； 芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる； 塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる； 酸性側鎖を有するアミノ酸の群は、グルタミン酸塩およびアスパラギン酸からなる； 並びに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンからなる。例示的なアミノ酸の保存的置換は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンである。

【0050】

Ｘｋｒ４ポリペプチドは、機能的なポリペプチド（例えばＳＰＯＴまたはＦＬＡＧなどのタグ配列、もしくは緑色蛍光タンパク質などの標識タンパク質）が融合されていてもよい。融合タンパク質におけるＸｋｒ４ポリペプチドの変異体は、前記融合タンパク質のアミノ酸配列から機能的なポリペプチドのアミノ酸配列を除いた、アミノ酸配列を有する。

【0051】

「配列同一性」は、最適にアライメント（整列）された２つのポリヌクレオチド配列間または２つのアミノ酸列間の配列類似性を意味する。２つの比較される配列の両方における位置が同一の塩基またはアミノ酸である場合、前記２つの分子はその位置において同一である。同一性の割合（％）は、２つの配列において同一である位置の数を、比較される位置の総数で割り算し、１００を掛け算した値である。配列同一性は、商業的または公的に入手可能なソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ＋を用いて算出することができる。

【0052】

１つの実施形態において、Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体のアミノ酸配列とＸｋｒ４ポリペプチドのアミノ酸配列との配列同一性は、Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体のアミノ酸配列と、配列番号３～５および３７～３９（例えば配列番号３７）のいずれかに記載のアミノ酸配列とから算出される。

【0053】

「アミノ酸残基の番号付け」は、特定の配列においてＮ末端（左端）からＣ末端（右端）から昇順に数字を割り当てることで設定される。例えばＡＳＧの配列において、左端のアミノ酸であるアラニン（Ａ）には１位を割り当て、右端のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）には３位が割り当てられる。

【0054】

Ｘｋｒ４の「脂質スクランブル活性」は、例えばリン脂質または糖脂質の取込み活性、または細胞膜の内側に位置するリン脂質の露出活性を含む。「リン脂質」は、細胞膜を構成するリン脂質である。リン脂質は、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンまたはホスファチジルイノシトールである。「糖脂質」は、細胞膜を構成する糖脂質である。糖脂質は、例えばグリセロ糖脂質またはスフィンゴ糖脂質である。

【0055】

リン脂質または糖脂質の「取込み活性」は、細胞外に存在するリン脂質または糖脂質を、前記細胞の細胞膜に取り込む作用である。リン脂質または糖脂質の取込み活性は、例えば蛍光標識したリン脂質または糖脂質を用いて測定することができる。リン脂質または糖脂質の取込み活性は、例えば、蛍光標識化リン脂質または糖脂質をＸｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞（たとえばＰＬＢ細胞）の培養培地に添加し、蛍光標識化リン脂質または糖脂質が前記細胞の細胞膜に取り込ませた後に、取り込まれた蛍光標識したリン脂質または糖脂質に由来する蛍光を検出することにより測定することができる。蛍光標識としては、例えばニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）およびＴｏｐＦｌｕｏｒなどの蛍光物質を用いることができる。リン脂質または糖脂質への蛍光標識は、公知の方法を用いて実施することができる。蛍光標識化リン脂質または糖脂質は商業的に入手可能である。

【0056】

リン脂質または糖脂質の取込み活性は、例えば、Ｘｋｒ４ポリペプチドを恒常的に発現するＰＬＢ細胞を、マイクロウェルプレートにて培養し、その培養液に蛍光標識化リン脂質または糖脂質を添加して、細胞膜に取り込ませる。所定時間経過後に、未反応の蛍光標識化リン脂質または糖脂質を含む培養培地を新たな培養培地に交換した後に、例えばプレートリーダーにて細胞膜に取り込まれた蛍光標識化リン脂質または糖脂質由来の蛍光を測定することができる。測定した蛍光強度を、陰性対照由来の蛍光強度と比較して、リン脂質または糖脂質の取込みの有無または程度を決定することができる。Ｘｋｒ４ポリペプチドを恒常的に発現するＰＬＢ細胞における蛍光強度が、例えば陰性対照における蛍光強度よりも高い、例えば少なくとも２倍、３倍、５倍、または１０倍高い場合に、リン脂質または糖脂質の取込みがあると判定してよい。

【0057】

リン脂質または糖脂質の取込み活性は、例えば、上記と同様にして、蛍光標識化リン脂質または糖脂質を取り込ませたＸｋｒ４ポリペプチドを恒常的に発現するＰＬＢ細胞を、マイクロウェルプレートから回収し、回収した細胞懸濁液をフローサイトメトリー法にて測定することができる。所定の蛍光強度を示す細胞集団の割合を、陰性対照由来の細胞集団の割合と比較して、リン脂質または糖脂質の取込みの有無または程度を決定することができる。所定の蛍光強度を示す細胞集団の割合は、例えば１個の細胞あたりの蛍光強度を示す細胞の分布図において、所定のゲートを設け、そのゲートを上回る細胞数を測定した細胞の総数で除することで算出することができる。所定のゲートは、例えば陰性対照の１個の細胞あたりの蛍光強度を示す細胞の分布図において、所定の蛍光強度を示す細胞集団の割合が３％以下となる位置に設定することができる。Ｘｋｒ４ポリペプチドを恒常的に発現するＰＬＢ細胞における前記所定のゲート中の細胞集団の割合が、例えば陰性対照における前記所定のゲート中の細胞集団の割合よりも高い、例えば少なくとも２倍、３倍、５倍、または１０倍高い場合に、リン脂質または糖脂質の取込みがあると判定してよい。

【0058】

１つの実施形態において、リン脂質または糖脂質の取込み活性は、ＮＢＤで標識したホスファチジルコリン（ＮＢＤ－ＰＣ）またはホスファチジルセリン（ＮＢＤ－ＰＳ）を用いた、ＰＣ、ＰＳ取込み活性であってよい。

【0059】

リン脂質の「露出活性」は、リン脂質の非対称性を示す細胞膜において、その内側に位置するホスファチジルセリン（ＰＳ）またはホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を、細胞膜の外側に露出させる作用である。リン脂質の露出活性は、例えばＰＳまたはＰＥに結合する分子に蛍光標識した検出試薬を用いて測定することができる。リン脂質の露出活性は、例えば検出試薬をＸｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞（たとえばＰＬＢ細胞）の培養培地に添加して、所定時間経過後に、細胞膜に結合した検出試薬に由来する蛍光を検出することにより測定することができる。蛍光標識としては、例えばＣｙ５、Ａｌｅｘａ６５７などの蛍光物質を用いることができる。ＰＳまたはＰＥに結合する分子としては、例えばアネキシンＶを用いることができる。ＰＳまたはＰＥへの蛍光標識は、公知の方法を用いて実施することができる。蛍光標識されたアネキシンＶは商業的に入手可能である。

【0060】

リン脂質の露出は、例えばＸｋｒ４ポリペプチドを恒常的に発現するＰＬＢ細胞を、マイクロウェルプレートにて培養し、その培養液に検出試薬を添加して、細胞膜の外側に露出したＰＳまたはＰＥに結合させる。所定時間経過後に、未反応の検出試薬を含む培養培地を新たな培養培地に交換した後に、例えばプレートリーダーにて細胞膜に結合した検出試薬由来の蛍光を測定することができる。測定した蛍光強度を、陰性対照由来の蛍光強度と比較して、リン脂質の露出活性の有無または程度を決定することができる。陰性対照としては、例えば野生型のＰＬＢ細胞（Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現していない）を用いたことを除いて同様にして試験を行った結果であってよい。

【0061】

リン脂質の露出活性は、例えば、上記と同様にして、検出試薬を結合させた、Ｘｋｒ４ポリペプチドを恒常的に発現するＰＬＢ細胞を、マイクロウェルプレートから回収し、回収した細胞懸濁液をフローサイトメトリー法にて測定することができる。所定の蛍光強度を示す細胞集団の割合を、陰性対照由来の細胞集団の割合と比較して、リン脂質の露出活性の有無または程度を決定することができる。所定の蛍光強度を示す細胞集団の割合は、例えば１個の細胞あたりの蛍光強度を示す細胞の分布図において、所定のゲートを設け、そのゲートを上回る細胞数を測定した細胞の総数で除することで算出することができる。所定のゲートは、例えば陰性対照の１個の細胞あたりの蛍光強度を示す細胞の分布図において、所定の蛍光強度を示す細胞集団の割合が３％以下となる位置に設定することができる。

【0062】

１つの実施形態において、Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体は、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列における連続する５００～６００アミノ酸長、５２０～５８０アミノ酸長、５３０～５７０アミノ酸長、５４０～５７０アミノ酸長、または５５０～５７０のアミノ酸長のアミノ酸配列からなり、かつ前記アミノ酸長のアミノ酸配列において、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３２２位のイソロイシンに代えてセリン、３３１位のロイシンに代えてフェニルアラニン、および３３２位のグルタミンに代えてグルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ前記変異体のアミノ酸配列とＸｋｒ４ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し； および前記変異体が、ＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用なしに細胞膜において脂質スクランブル活性を示す。

【0063】

１つの実施形態において、Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体は、例えば配列番号３５に記載のアミノ酸配列における連続する５００～６００アミノ酸長、５２０～５８０アミノ酸長、５３０～５７０アミノ酸長、５４０～５７０アミノ酸長、または５５０～５７０のアミノ酸長のアミノ酸配列からなり、かつ前記アミノ酸長のアミノ酸配列において、配列番号３５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３２５位のイソロイシンに代えてセリン、３３４位のロイシンに代えてフェニルアラニン、および３３５位のグルタミンに代えてグルタミン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ前記変異体のアミノ酸配列とＸｋｒ４ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し； および前記変異体が、ＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用なしに細胞膜において脂質スクランブル活性を示す。

【0064】

「ＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用なしに細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得る」は、Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体が、後述するＸＲＣＣ４ポリペプチドが存在しない状況下、Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体を発現する細胞の細胞膜において、ＰＣ取込み活性を示すことを意味する。例えば、Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体は、ＸＲＣＣ４ポリペプチドが存在しない状況下での、Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体（例えば配列番号３７に記載のアミノ酸配列からなる）を発現するＰＬＢ細胞（被検体）におけるＰＣ取込み活性と、前記Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体を発現しないことを除いて同一のＰＬＢ細胞（陰性対照）におけるＰＣ取込み活性とを比較し、陰性対照のＰＣ取込み活性よりも被検体のＰＣ取込み活性が高い場合、例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍高い場合、ＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用なしに細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得ると特定される。前記ＰＣ取込み活性は、本明細書に開示した方法（例えばフローサイトメトリーを利用した方法）により測定することができる。

【0065】

Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体に関する用語「陰性対照の細胞」は、Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体を発現していないことを除いて、ＰＣ取込み活性の測定に用いたＸｋｒ４ポリペプチドの変異体を発現する細胞と同じ細胞である。前記陰性対照の細胞としては、例えば野生型のＰＬＢ細胞（Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現していない）であってよい。

【0066】

Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体は、例えば本明細書に開示したアミノ酸長、アミノ酸置換、配列同一性、および脂質スクランブル活性（例えばＰＣ取込み活性）の任意の組合せを有する。

【0067】

ＸＲＣＣ４ポリペプチド
「ＸＲＣＣ４」は、ＤＮＡ修復タンパク質であり、ヒトではＸＲＣＣ４遺伝子にコードされている。ＸＲＣＣ４は、核内に局在し得る。ＸＲＣＣ４は、例えばヒト、マウス、ブタを含む哺乳動物由来のＸＲＣＣ４であってよい。ＸＲＣＣ４は、例えば鳥類、爬虫類、両生類または魚類におけるＸＲＣＣ４の相同タンパク質であってよい。ＸＲＣＣ４のアミノ酸配列は、例えば公的に提供されるデータベースから入手可能であり、例えばＧｅｎｅＢｎａｋから入手可能である。理論に拘泥するものではないが、ＸＲＣＣ４は、例えばアポトーシス刺激を受けた細胞において、カスパーゼによりその一部が切断され、切断されたＸＲＣＣ４ポリペプチドが、細胞質に拡散する。ＸＲＣＣ４ポリペプチドは、二量体を形成したＣ末端切断型のＸｋｒ４との相互作用を通じて、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発し得る。

【0068】

ＸＲＣＣ４は、例えば以下に示す配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるまたは含むヒト由来のＸＲＣＣ４である。

【0069】

ＸＲＣＣ４は、例えば配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列からなる、または含む。ＸＲＣＣ４は、例えば配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列からなる、または含む。

【0070】

「ＸＲＣＣ４ポリペプチド」は、（ａ）配列番号７～１２および４２のいずれかに記載のアミノ酸配列（具体的なアミノ酸配列を以下に示す）からなるポリペプチド；または（ｂ）前記（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜における脂質スクランブル活性を誘発し得るポリペプチドである。

【0071】

配列番号７に記載のアミノ酸配列は、配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち、配列番号６に記載のアミノ酸配列の番号付けに従って、２６６位～２８５位の連続する２０アミノ酸長のアミノ酸配列である。

【0072】

配列番号８に記載のアミノ酸配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列と比較して、配列番号６に記載のアミノ酸配列の番号付けに従って、２７１位におけるリジン（Ｋ）がアラニン（Ａ）に置換されている（Ｋ２７１Ａ）。

【0073】

配列番号９に記載のアミノ酸配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列と比較して、配列番号６に記載のアミノ酸配列の番号付けに従って、２７２位におけるアルギニン（Ｒ）がアラニン（Ａ）に置換されている（Ｒ２７２Ａ）。

【0074】

配列番号１０に記載のアミノ酸配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列と比較して、配列番号６に記載のアミノ酸配列の番号付けに従って、２７３位におけるアルギニン（Ｒ）がアラニン（Ａ）に置換されている（Ｋ２７３Ａ）。

【0075】

配列番号１１に記載のアミノ酸配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列と比較して、配列番号６に記載のアミノ酸配列の番号付けに従って、２７５位におけるアルギニン（Ｒ）がアラニン（Ａ）に置換されている（Ｋ２７５Ａ）。

【0076】

配列番号１２に記載のアミノ酸配列は、配列番号６に記載のアミノ酸配列の番号付けに従って、２５６位～２８５位の連続する３０アミノ酸長のアミノ酸配列である。

【0077】

配列番号４２に記載のアミノ酸配列は、配列番号６に記載のアミノ酸配列の番号付けに従って、２５６位～３３６位の連続する８１アミノ酸長のアミノ酸配列である。

【0078】

ＸＲＣＣ４ポリペプチドは、二量体を形成したＣ末端切断型のＸｋｒ４との相互作用により、細胞膜においてＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を示し得る。ＸＲＣＣ４ポリペプチドによるＸｋｒ４の脂質スクランブル活性は、例えばＰＬＢ細胞における脂質スクランブル活性（例えばＰＣ取込み活性）である。

【0079】

本明細書において、前記（ｂ）に係るＸＲＣＣ４ポリペプチドを「ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体」ともいう。

【0080】

ＸＲＣＣ４ポリペプチドは、例えば公知の方法（例えば遺伝子工学技術または化学合成技術）に従って調製することができる。ＸＲＣＣ４ポリペプチドは、例えば本明細書に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから、転写および翻訳させることにより調製することができる。ＸＲＣＣ４ポリペプチドは、例えば後述するＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法に、またはＸｋｒ４を活性化するための組成物の１つの成分として利用することができる。

【0081】

ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、例えば１８～１００アミノ酸長、１８～８０アミノ酸長、１８～６０アミノ酸長、または１８～５０アミノ酸長；１９～１００アミノ酸長、１９～８０アミノ酸長、１９～６０アミノ酸長、または１９～５０アミノ酸長；あるいは２０～１００アミノ酸長、２０～８０アミノ酸長、２０～６０アミノ酸長、または２０～５０アミノ酸長のアミノ酸配列からなる。ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、例えば、配列番号４２に記載のアミノ酸配列における連続する５０～８０のアミノ酸配列を含み、かつ５０～１００アミノ酸長、６０～１００アミノ酸長、または７０～１００アミノ酸長；５０～９０アミノ酸長、６０～９０アミノ酸長、または７０～９０アミノ酸長；あるいは７０～１００アミノ酸長、７０～９０アミノ酸長、７５～９０アミノ酸長、または７５～８５アミノ酸長のアミノ酸配列からなる。ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、例えば、配列番号７または１２に記載のアミノ酸配列を含み、かつ１８～１００アミノ酸長、１８～８０アミノ酸長、１８～６０アミノ酸長、または１８～５０アミノ酸長；１９～１００アミノ酸長、１９～８０アミノ酸長、１９～６０アミノ酸長、または１９～５０アミノ酸長；あるいは２０～１００アミノ酸長、２０～８０アミノ酸長、２０～６０アミノ酸長、または２０～５０アミノ酸長のアミノ酸配列からなる。

【0082】

ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、例えば、配列番号７または１２に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号６に記載のアミノ酸配列における連続する１８～１００アミノ酸長、１８～８０アミノ酸長、１８～６０アミノ酸長、または１８～５０アミノ酸長；１９～１００アミノ酸長、１９～８０アミノ酸長、１９～６０アミノ酸長、または１９～５０アミノ酸長；あるいは２０～１００アミノ酸長、２０～８０アミノ酸長、２０～６０アミノ酸長、または２０～５０アミノ酸長のアミノ酸配列からなる。

【0083】

ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、例えばその変異体のアミノ酸長が２０～５０である場合、前記（ａ）に係るＸＲＣＣ４ポリペプチドのアミノ酸配列において１～５個、１～４個、１～３個、２個または１個のアミノ酸付加、置換または欠失もしくはそれらの組合せを含む。ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、例えばその変異体のアミノ酸長が５１～１００である場合、前記（ａ）に係るＸＲＣＣ４ポリペプチドのアミノ酸配列において１～１５個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、２個または１個のアミノ酸付加、置換または欠失もしくはそれらの組合せを含む。

【0084】

１つの実施形態において、ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２７０位のアルギニンを含む。１つの実施形態において、ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２６５位にメチオニンを含まない。１つの実施形態において、ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２７０位のアルギニンを含み、かつ、２６５位にメチオニンを含まない。

【0085】

１つの実施形態において、ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、以下の群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：配列番号６に記載のアミノ酸配列の番号付けに従って、Ｋ２７１Ａ、Ｒ２７２Ａ、Ｋ２７３ＡおよびＫ２７５Ａ。１つの実施形態において、ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、例えば配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、２７０位のアルギニンおよび以下の群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換のいずれか一方または両方を含み、かつ２６５位にメチオニンを含まない：配列番号６に記載のアミノ酸配列の番号付けに従って、Ｋ２７１Ａ、Ｒ２７２Ａ、Ｋ２７３ＡおよびＫ２７５Ａ。

【0086】

ＸＲＣＣ４ポリペプチドは、機能的なポリペプチド（例えばＳＰＯＴまたはＦＬＡＧなどのタグ配列、もしくは緑色蛍光タンパク質などの標識タンパク質）が融合されていてもよい。融合タンパク質におけるＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、前記融合タンパク質のアミノ酸配列から機能的なポリペプチドのアミノ酸配列を除いた、アミノ酸配列を有する。

【0087】

ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、配列番号７～１２のいずれかに記載のアミノ酸配列において欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し；前記変異体が、１８～１００アミノ酸長、１８～８０アミノ酸長、１８～６０アミノ酸長、または１８～５０アミノ酸長；１９～１００アミノ酸長、１９～８０アミノ酸長、１９～６０アミノ酸長、または１９～５０アミノ酸長；あるいは２０～１００アミノ酸長、２０～８０アミノ酸長、２０～６０アミノ酸長、または２０～５０アミノ酸長のアミノ酸配列からなり；前記変異体のアミノ酸配列とＸＲＣＣ４ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し；および前記変異体が、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜において脂質スクランブル活性を誘発し得る。

【0088】

１つの実施形態において、ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体のアミノ酸配列とＸＲＣＣ４ポリペプチドのアミノ酸配列との配列同一性は、ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体のアミノ酸配列と、配列番号７～１２（例えば配列番号１２）のいずれかに記載のアミノ酸配列とから算出される。

【0089】

「Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜において脂質スクランブル活性を誘発し得る」は、ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体が導入され、かつＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞の細胞膜において、前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体がＰＣ取込み活性を誘発することを意味する。例えば、ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体が導入され、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現するＰＬＢ細胞（被検体）におけるＰＣ取込み活性と、前記変異体が導入されていないことを除いて同一のＰＬＢ細胞（陰性対照）におけるＰＣ取込み活性とを比較し、陰性対照のＰＣ取込み活性よりも被検体のＰＣ取込み活性が高い場合、例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍高い場合、前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体はＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜において脂質スクランブル活性を誘発し得ると特定される。前記ＰＣ取込み活性は、本明細書に開示した方法（例えばフローサイトメトリーを利用した方法）により測定することができる。

【0090】

ＸＲＣＣ４ポリペプチドの変異体は、例えば本明細書に開示したアミノ酸長、アミノ酸置換、配列同一性、および脂質スクランブル活性（例えばＰＣ取込み活性）の任意の組合せを有する。

【0091】

ペプチドまたはタンパク質の細胞への「導入」または「導入する」は、前記ペプチドまたはタンパク質を細胞内に存在させることである。前記ペプチドまたはタンパク質の細胞への導入は、前記ペプチドまたはタンパク質を細胞外から細胞内に入れること、および前記ペプチドまたはタンパク質を細胞内で発現させることを含む。前記ペプチドまたはタンパク質の細胞への導入は、公知の方法に従って実施することができる。前記ペプチドまたはタンパク質を細胞外から細胞内に入れることは、例えばリポフェクションまたはエレクトロポレーションによって実施することができる。前記ペプチドまたはタンパク質を細胞内で発現させることは、例えば前記ペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクトし、前記細胞内で前記ペプチドまたはタンパク質を発現させることによって、実施することができる。１つの実施形態において、ＸＲＣＣ４ポリペプチドまたはＸＲＣＣ４ポリペプチドは、リポフェクションまたはエレクトロポレーションにより細胞内に導入することができる。

【0092】

ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」は、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体形態であり、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、例えば一本鎖、二本鎖または多鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む重合体を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖のポリヌクレオチド（センスまたはアンチセンス等）および二本鎖のポリヌクレオチドを含む。所定のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、例えば公知の方法（例えば遺伝子工学技術または化学合成技術）に従って調製することができ、または商業的に入手可能である。

【0093】

１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示したＸｋｒ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示したＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、Ｘｋｒ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、同一のポリヌクレオチドに含んでもよく、別個のポリヌクレオチドに含んでもよい。

【0094】

発現ベクター
「発現ベクター」は、宿主細胞中にて外来ポリヌクレオチドの導入、複製または発現を可能にする遺伝要素である。発現ベクターは、例えば別のポリヌクレオチド、すなわちインサートがプロモーターに作動可能に連結されることで、宿主細胞内において前記別のポリヌクレオチドの複製、転写または発現を行わせ得る。発現ベクターは、例えば宿主細胞のゲノムに安定に組込まれるかまたは独立の遺伝要素（たとえばエピソーム、プラスミド）として存在してよい。発現ベクターは、例えばプラスミド、ファージ、ウイルスまたはコスミドである。別のポリヌクレオチドを連結するための発現ベクターは、例えば公知の方法（例えば遺伝子工学技術）に従って調製することができ、または商業的に入手可能である。

【0095】

「作動可能に連結された」は、連結されたポリヌクレオチドが、意図された様式にて機能できること、すなわち意図された様式にて転写され、場合により翻訳されることを示す。意図された様式は、例えばテトラサイクリンなどの添加物が存在した場合に、連結されたポリヌクレオチドの転写、場合により翻訳を可能にするような条件、または高発現または低発現などの発現量を示す。

【0096】

１つの実施形態において、発現ベクターは、本明細書に開示したポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、発現ベクターは、本明細書に開示したＸｋｒ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、発現ベクターは、本明細書に開示したＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、発現ベクターは、Ｘｋｒ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、およびＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、同一の発現ベクターに含んでもよく、別個の発現ベクターに含んでもよい。

【0097】

宿主細胞
「宿主細胞」は、ベクター分子を挿入できる細胞、即ち真核細胞または原核細胞である。宿主細胞は、例えば真核細胞または原核細胞である。真核細胞としては、例えば哺乳類、鳥類および魚類由来の細胞、または植物細胞（例えば真核性藻類細胞を含む）を含む。哺乳類宿主細胞は、例えばヒトＰＬＢ９８５細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ２９３）細胞および幼若ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトＢ細胞、ＣＶ－１／ＥＢＮＡ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＰｅｒＣ６細胞およびＭＤＣＫ細胞を含む。原核細胞の宿主細胞は、例えば酵母細胞および大腸菌細胞を含む。宿主細胞は、例えば脳または皮膚由来の細胞である。宿主細胞は、例えば神経系の細胞である。宿主細胞は、例えばＸＲＣＣ４およびＸｋｒ４のいずれか一方または両方がノックアウトされた細胞であってよい。宿主細胞は、例えば公的機関から入手可能であり、または商業的に入手可能である。

【0098】

１つの実施形態において、宿主細胞は、本明細書に開示したポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む。宿主細胞は、例えば前記ポリヌクレオチドの一部または全部が組込まれたゲノムを含む。宿主細胞は、例えば前記発現ベクターの一部または全部が組込まれたゲノムを含む。宿主細胞は、例えばゲノムとは独立した遺伝要素として前記発現ベクターを含む。

【0099】

Ｘｋｒ４を活性化するための組成物
「Ｘｋｒ４を活性化するための組成物」は、Ｘｋｒ４による脂質スクランブル活性を誘発することができる要素を含む。前記成分は、例えば本明細書に開示したＸＲＣＣ４ポリペプチド、それらをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。前記組成物は、例えば前記要素を、賦形剤、保存剤、緩衝剤、ｐＨ調製剤などの添加剤と混合することにより調製することができる。

【0100】

１つの実施形態において、Ｘｋｒ４を活性化するための組成物は、本明細書に開示したＸＲＣＣ４ポリペプチド；前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる群より選択される少なくとも１つを含む。Ｘｋｒ４を活性化するための組成物は、例えば後述するアポトーシスの抑制が関与する状態または疾患を治療または予防するために利用することができる。

【0101】

「アポトーシスの抑制が関与する状態または疾患」は、アポトーシスの抑制によって誘発され得る状態または疾患である。アポトーシスの抑制が関与する状態または疾患は、例えば神経系の臓器または細胞においてアポトーシスの抑制によって誘発され得る状態または疾患である。アポトーシスの抑制が関与する状態または疾患は、例えば神経系の臓器もしくは細胞におけるがん、甲状腺刺激ホルモンの上昇、または注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）を含む神経発達障害または行動障害である。

【0102】

「治療」は、所定の状態または症状を維持し、低減し、または消失させることを目的して、処置を行うことを意味する。所定の状態または症状を維持し、低減し、または消失させることを目的して行う処置は、例えば所定の組成物を投与することを含む。治療を目的とする組成物は、例えば状態または疾患の発症中または発症後に投与することができる。

【0103】

「予防」は、所定の状態または症状の発症を抑制することを目的して、処置を行うことを意味する。所定の状態または症状の発症を抑制することを目的して行う処置は、例えば所定の組成物を投与することを含む。予防を目的とする組成物は、例えば状態または疾患の発症前に投与することができる。

【0104】

Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質のスクリーニング方法
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質のスクリーニング方法は、（１）本明細書に開示したＸｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する可能性のある候補物質とを接触させること；（２）前記候補物質と接触させた前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して、低い場合または高い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質として選択することを含む。

【0105】

「Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞」は、本明細書に開示したＸｋｒ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、調製することができる。１つの実施形態において、前記細胞は、アポトーシス刺激（例えばスタウロスポリン（ＳＴＳ）を用いたアポトーシス刺激）を受けることなく、Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する。

【0106】

「Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する可能性のある候補物質」は、例えばＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドに直接的または間接的に影響して、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発もしくは増加、または阻害もしくは低減させることが期待される物質である。前記調節する可能性のある候補物質は、例えば、低分子化合物、タンパク質（例えば抗体）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。

【0107】

前記調節する可能性のある候補物質は、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する可能性のある候補物質またはＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質を含む。「Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する可能性のある候補物質」は、細胞または動物においてＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発もしくは増加させることが期待される物質である。「Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質」は、細胞または動物においてＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害もしくは低減させることが期待される物質である。

【0108】

前記細胞と前記候補物質との「接触」または「接触させる」ことは、前記細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節（例えば誘発または阻害）する可能性のある候補物質と両者の接触が可能な状況下に置くことである。前記接触させることは、例えば、前記細胞を培養する培養液中に、前記候補物質を添加することであってよい。

【0109】

脂質スクランブル活性は、例えばリン脂質または糖脂質の取込み活性、または細胞膜の内側に位置するリン脂質の露出活性である。脂質スクランブル活性の測定は、本明細書に開示した方法（例えばフローサイトメトリーを利用した方法）に従って測定することができる。

【0110】

１つの実施形態において、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質のスクリーニング方法は、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法である。Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法は、例えば（１）本明細書に開示したＸｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質とを接触させること；（２）前記候補物質を接触させた前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％以下である場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質として選択することを含む。Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質は、アポトーシスの促進が関与する状態または疾患の治療または予防のための薬剤候補として利用することができる。

【0111】

「アポトーシスの促進が関与する状態または疾患」は、アポトーシスの促進によって誘発され得る状態または疾患である。アポトーシスの促進が関与する状態または疾患は、例えば神経系の臓器においてアポトーシスの促進によって誘発され得る状態または疾患である。アポトーシスの促進が関与する状態または疾患は、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）および筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患である。

【0112】

１つの実施形態において、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節する物質のスクリーニング方法は、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質のスクリーニング方法である。Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質のスクリーニング方法は、例えば（１）本明細書に開示したＸｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する可能性のある候補物質とを接触させること；（２）前記候補物質を接触させた前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、９倍、または１０倍高い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質として選択することを含む。Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する可能性のある候補物質は、アポトーシスの抑制が関与する状態または疾患の治療または予防のための薬剤候補として利用することができる。

【0113】

「アポトーシスの抑制が関与する状態または疾患」は、アポトーシスの促進によって誘発され得る状態または疾患である。アポトーシスの促進が関与する状態または疾患は、例えば神経系の臓器においてアポトーシスの促進によって誘発され得る状態または疾患である。アポトーシスの促進が関与する状態または疾患は、例えば本明細書に開示した状態または疾患、例えばＡＤＨＤであってよい。

【0114】

Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質のスクリーニング方法
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質のスクリーニング方法は、（１）Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドであって、（α）配列番号２または３６に記載のアミノ酸配列からなるＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチド、または（β）前記（α）ポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（α）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する可能性のある候補物質とを接触させること；（２）候補物質と接触させた前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質を接触させていない前記細胞における脂質スクランブル活性と比較して高い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘発する物質として選択することを含む。

【0115】

「Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチド」は、細胞の細胞膜中で二量体を形成し得るＸｋｒ４の断片である。理論に拘泥するものではないが、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドは、本明細書に開示したＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用を通じて、脂質スクランブル活性を示し得る。Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば本明細書に開示したＸｋｒ４がカスパーゼにより切断されたポリペプチドである。

【0116】

Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば（α）配列番号２または３６に記載のアミノ酸配列（具体的なアミノ酸配列を以下に示す）からなるＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチド、または（β）前記（α）ポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を有し、かつ前記（α）のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、かつＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得るポリペプチドである。

【0117】

Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば遺伝子工学技術により調製することができる。Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば本明細書に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから、転写および翻訳させることにより調製することができる。

【0118】

Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば配列番号２に記載のアミノ酸配列において、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３２２位がセリン、３３１位がフェニルアラニン、および３３２位がグルタミンではない。Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば配列番号３６に記載のアミノ酸配列において、配列番号３５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸残基の番号付けに従って、３２５位がセリン、３３４位がフェニルアラニン、および３３５位がグルタミン酸ではない。

【0119】

Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば配列番号２または３６に記載のアミノ酸配列において、１～１００個、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸欠失、置換、または付加もしくはそれらの組合せを含むアミノ酸配列からなる、または含む。Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば配列番号２または３６に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列からなる、または含む。

【0120】

本明細書において、前記（β）に係るＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを「Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体」ともいう。

【0121】

Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドは、例えば本明細書において、Ｘｋｒ４ポリペプチドについて開示したアミノ酸長、アミノ酸置換、および配列同一性の任意の組合せを有する。

【0122】

「ＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得る」は、本願明細書に開示したＸＲＣＣ４ポリペプチドの存在下、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体を発現する細胞の細胞膜において、前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体がＰＣ取込み活性を示すことを意味する。例えば、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体は、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドの変異体を発現するＰＬＢ細胞による、ＸＲＣＣ４ポリペプチドが存在する状況下でのＰＣ取込み活性が、前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドが存在しないことを除いて同一の条件下でのＰＣ取込み活性よりも高い場合、例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍高い場合、ＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得ると特定される。前記ＰＣ取込み活性は、本明細書に開示した方法（例えばフローサイトメトリーを利用した方法）により測定することができる。

【0123】

ＸＲＣＣ４ポリペプチドとの相互作用により細胞膜において脂質スクランブル活性を示し得ると特定された候補物質は、アポトーシスの抑制が関与する状態または疾患の治療または予防のための薬剤候補として利用することができる。

【0124】

Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法
１つの実施形態において、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法は、（１）本明細書に開示したＸＲＣＣ４ポリペプチドが導入され、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質とを接触させること；（２）前記細胞における脂質スクランブル活性を測定すること；および（３）前記脂質スクランブル活性が、前記候補物質と接触させていな前記細胞における脂質スクランブル活性よりも低い場合に、前記候補物質をＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質として選択することを含む。

【0125】

「ＸＲＣＣ４ポリペプチドが導入され、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞」は、例えばＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞に、ＸＲＣＣ４ポリペプチドまたその変異体をリポフェクションまたはエレクトロポレーションにより細胞内に入れることによって調製することができる。ＸＲＣＣ４ポリペプチドまたその変異体が導入され、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドを発現する細胞は、例えばＸＲＣＣ４ポリペプチドまたその変異体およびＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは２つ以上のポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む１つまたは２つ以上の発現ベクターを、宿主細胞に導入することによって調製することができる。

【0126】

前記細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質との接触は、例えば、前記細胞を培養する培養液に、前記候補物質を添加することによって実施することができる。前記細胞と、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質との接触は、例えば前記候補物質を添加した所定時間経過後に、未反応の候補物質を取り除くために、前記培養培地を取り除くことを含んでよい。

【0127】

前記実施形態において、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質として選択された物質は、例えば細胞膜中で二量体を形成したＸＲＣＣ４ポリペプチドと、ＸＲＣＣ４ポリペプチドとの直接的または間接的な相互作用を阻止または低減させ得る物質である。

【0128】

１つの実施形態において、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニング方法は、（１）Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質の存在下で、本明細書に開示したＸＲＣＣ４ポリペプチドと、Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとを接触させること；（２）前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの結合を測定すること；および（３）前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとの前記結合が、前記候補物質の非存在下で前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドと前記Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドとを接触させた場合の結合よりも低い場合に、例えば５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％以下である場合に、前記候補物質を、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質として選択することを含む。

【0129】

前記実施形態に係る工程（１）は、例えば支持体に固定したＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドに、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質およびＸＲＣＣ４ポリペプチドを添加することであってよい。一例において、前記実施形態に係る工程（１）は、例えばマイクロウェルプレートのプレート面（支持体）にＣ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドに吸着などにより固定する。Ｃ末端切断型Ｘｋｒ４ポリペプチドが固定されたマイクロウェルプレートに、Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する可能性のある候補物質と、蛍光物質で標識されたＸＲＣＣ４ポリペプチドを含む溶液を添加することであってよい。この例において、工程（２）は、未結合の蛍光物質で標識されたＸＲＣＣ４ポリペプチドを除去した後に、マイクロウェルプレートに残存する蛍光物質標識化ＸＲＣＣ４ポリペプチド由来の蛍光を測定することであってよい。

【0130】

スクリーニング用のキット
Ｘｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニングのためのキットが提供される。前記キットは、本明細書に開示したＸＲＣＣ４ポリペプチド；前記ＸＲＣＣ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター；および前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または前記発現ベクターを含む宿主細胞からなる群より選択される少なくとも１つ、２つ、または３つを含む。

【0131】

前記キットの構成要素は、例えば別々の容器内に存在してもよく、または単一の容器に混合されてもよい。前記キットは、例えばＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を阻害する物質のスクリーニングに用いるための説明書を含んでもよい。

【0132】

目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法
本発明の１つの実施形態は、目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法を提供する。

【0133】

「表現型」は、所定の環境下で遺伝子の働きの結果つくられる生物の形質を意味する。目的とする表現型は、例えばアポトーシス過程での脂質スクランブル活性などの反応、特定の物質の存在下で誘導されるタンパク質、特定の刺激後に分泌される物質であってよい。

【0134】

「遺伝子」は、遺伝現象において形質を支配する基本単位を意味する。遺伝子は、例えばタンパク質をコードする遺伝情報を担う単位である。遺伝子は、生体を構成するタンパク質または酵素をコードする構造遺伝子と、構造遺伝子の発現を制御するタンパク質因子をコードする調節遺伝子とに大別される。１つの形質は、複数の構造遺伝子と調節遺伝子とによって支配される。

【0135】

目的とする表現型に「対応する遺伝子」は、目的とする表現型に影響を与える遺伝子である。対応する遺伝子は、例えば目的とする表現型に直接的に作用するものでも、間接的に作用するものであってよい。目的とする表現型が特定の環境下で発現するタンパク質である場合、そのタンパク質をコードする構造遺伝子は、前記目的とする表現型に直接的に作用する遺伝子としてよい。前記例において、そのタンパク質の発現を制御するタンパク質因子をコードする調節遺伝子は、前記目的とする表現型に間接的に作用する遺伝子としてよい。

【0136】

＜工程ａ＞
前記特定方法は、（ａ）細胞のゲノムＤＮＡの複数種の遺伝子のヌクレオチド配列に対応する少なくとも１種のガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む、ガイドＲＮＡライブラリーを準備することを含む。

【0137】

細胞の「ゲノムＤＮＡ」は、細胞が有する遺伝子全体を意味する。ゲノムＤＮＡに関する各遺伝子の配列情報、動物種に関する情報、および遺伝子に対応する表現型（例えばタンパク質）に関する情報を含む情報は、例えば公的に提供されるデータベースから入手可能である。細胞のゲノムＤＮＡは、例えば特定の生物種由来の細胞のゲノムＤＮＡである。細胞のゲノムＤＮＡは、例えば特定の生物種のある特定の個体由来の均質なゲノムＤＮＡであっても、特定の生物種の複数の別個体由来の不均一なゲノムＤＮＡであってもよい。１つの実施形態において、細胞のゲノムＤＮＡは、特定の生物種のある特定の個体由来の均質なゲノムＤＮＡである。１つの実施形態において、細胞のゲノムＤＮＡは、特定の生物種の複数の別個体由来の不均一なゲノムＤＮＡであってもよい。

【0138】

「ガイドＲＮＡ」は、ガイド配列に連結されたｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ）とｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｃｒＲＮＡ）とが連結されたｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅＲＮＡ）である。ガイドＲＮＡは、例えばＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を含む。ゲノムＤＮＡに組み込まれたガイドＲＮＡと表現する場合、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡに転写されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡを包含する。

【0139】

「Ｃａｓ９」は、ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９と称されるヌクレアーゼであり、約１６０キロダルトンの分子量を有する。Ｃａｓ９のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は公知であり、それらの配列は公的に提供されるデータベースから入手することができる。Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、商業的に入手可能である。

【0140】

「ガイド配列」は、特定の生物種のゲノムＤＮＡの所定の遺伝子のヌクレオチド配列中の標的配列にハイブリダイズすることができる、前記標的配列に相補的な配列を含む。ガイド配列は、例えば１０～３０ヌクレオチド長、１５～２５ヌクレオチド長、１８～２２ヌクレオチド長、２０～２１ヌクレオチド長を有する。ガイド配列とその対応する標的配列との間の配列同一性は、例えば８０％～１００％、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上または１００％である。ガイド配列と標的配列の最適なアライメントは、配列を整列させるための任意のアルゴリズム（例えばＮＣＢＩＢＬＡＳＴ）を用いて決定することができる。

【0141】

「ガイドＲＮＡライブラリー」は、細胞のゲノムＤＮＡの複数種の遺伝子のヌクレオチド配列中の少なくとも１種の標的配列に対するガイドＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡライブラリーの各ガイドＲＮＡは、例えばレンチウイルスまたはレトロウイルス内部に格納された状態であってよい。この場合、ガイドＲＮＡライブラリーは、ウイルス型のガイドＲＮＡライブラリー（例えばレンチウイルス型またはレトロウイルス型のガイドＲＮＡライブラリー）とも称する。例えば、特定の生物種の細胞がそのゲノムＤＮＡに２２，０００種の遺伝子を含み、ガイドＲＮＡライブラリーが前記ゲノムＤＮＡの個々の遺伝子に対するガイドＲＮＡを含む場合であって、ガイドＲＮＡが各遺伝子につき異なる６種類の標的配列に対するガイド配列を含む場合、前記ガイドＲＮＡライブラリーは、１３２，０００種類のｓｇＲＮＡを含むこととなる。ガイドＲＮＡライブラリーは、公知の方法に従って調製することができ、ガイドＲＮＡライブラリーは、例えばWang, et al. (2014). Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science 343, 80に記載の方法に従って、調製することができる。ガイドＲＮＡライブラリーは、例えば商業的に入手可能である。レンチウイルス型のガイドＲＮＡライブラリーは、例えばＧｅｃｋｏ ｓｇＲＮＡライブラリー（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１０００００００４９）であってよい。

【0142】

ガイドＲＮＡライブラリーの「準備」または「準備する」は、例えばガイドＲＮＡライブラリーの細胞への導入が可能な状態に置くこと含む。例えばガイドＲＮＡライブラリーが液中で凍結されている場合、ガイドＲＮＡライブラリーを含む凍結物を溶かすことを含む。ガイドＲＮＡライブラリーの準備は、例えばガイドＲＮＡライブラリーを調製することを含んでもよい。

【0143】

＜工程ｂ＞
前記特定方法は、（ｂ）前記ガイドＲＮＡライブラリーが導入された細胞集団を得ることを含む。

【0144】

ガイドＲＮＡライブラリーの「導入」または「導入する」は、例えばガイドＲＮＡライブラリー（例えばレンチウイルス型のガイドＲＮＡライブラリー）と細胞集団とを接触させることを含む。ガイドＲＮＡライブラリーが導入された細胞集団は、細胞のゲノムに導入されたガイドＲＮＡが組み込まれる。ガイドＲＮＡライブラリーが導入された細胞集団は、例えば細胞１個あたり１種類のガイドＲＮＡが導入されるような割合で、ガイドＲＮＡライブラリーが導入される。細胞１個あたり１種類のガイドＲＮＡが導入されるような割合は、例えば、前記ガイドＲＮＡライブラリーを構成するガイドＲＮＡの個数に対して、前記細胞集団を構成する細胞の個数が例えば５倍、１０倍または１５倍となるようにして、ガイドＲＮＡライブラリーを細胞集団に導入することによって実施することができる。

【0145】

ウイルス型のガイドＲＮＡライブラリーを用いる場合、細胞集団に前記ウイルス型のガイドＲＮＡライブラリーを感染させることにより、ガイドＲＮＡライブラリーを細胞集団に導入することができる。レンチウイルス型のガイドＲＮＡライブラリーを用いる場合、ガイドＲＮＡを細胞のゲノムに効率的に組み込むことができる。レンチウイルス型のガイドＲＮＡライブラリーを用いる場合、細胞集団は、増殖率が低いまたはほとんど増殖しない細胞（例えば、神経細胞、アポトーシス過程の細胞、組織中の細胞）の集団であっても、ガイドＲＮＡを細胞のゲノムに効率的に組み込むことができる。１つの実施形態において、ガイドＲＮＡライブラリーが導入された細胞集団は、増殖率が低いまたはほとんど増殖しない細胞の集団である。

【0146】

ガイドＲＮＡライブラリーが導入された細胞集団は、Ｃａｓ９を発現する。前記Ｃａｓ９は、例えばＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡが前記細胞集団の細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることで発現されよい。前記Ｃａｓ９は、例えばガイドＲＮＡライブラリーが導入される細胞集団のゲノムＤＮＡに、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列が組み込まれることで発現されてよい。

【0147】

ガイドＲＮＡライブラリーが導入される「細胞集団」は、例えば培養細胞または組織中の細胞集団であってよい。組織中の細胞集団は、例えば、体外に取り出された組織中の細胞集団；非ヒト哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類の動物における組織中の細胞集団；組織培養により構築された組織中の細胞集団であってよい。細胞集団が培養細胞である場合、前記培養細胞は、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列が組み込まれていてよい。細胞集団が組織中の細胞集団である場合、前記細胞集団に導入されるガイドＲＮＡライブラリー中のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列を含んでいてよい。

【0148】

ガイドＲＮＡライブラリーが導入された細胞集団に、例えば、所定の刺激を与えて、目的とする表現型を誘発してもよい。例えば目的とする表現型がアポトーシス過程で観察される作用（例えば脂質スクランブル活性）である場合、ガイドＲＮＡライブラリーが導入された細胞集団にアポトーシス刺激（例えばスタウロスポリン（ＳＴＳ）添加によるアポトーシス刺激）を与えてもよい。

【0149】

＜工程ｃ＞
前記特定方法は、（ｃ）前記細胞集団から目的とする表現型に基づいて細胞（cells）を選択することを含む。工程（ｃ）で選択された細胞（cells）に導入されているガイドＲＮＡのバラエティーは、工程（ｂ）の細胞集団に導入されているガイドＲＮＡのバラエティーと比べて、目的とする表現型に対応する遺伝子の配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡが富化されていることが期待される。

【0150】

工程（ｃ）は、例えば、目的とする表現型を示す細胞と、前記表現型を示さない細胞とを区別して、目的とする表現型を示さない細胞を回収することを含む。工程（ｃ）は、例えば、目的とする表現型を示す細胞と、前記表現型を示さない細胞とを区別して、目的とする表現型を示す細胞を回収することを含む。前記細胞集団が個々に分離された細胞の集団である場合、工程（ｃ）は、例えば蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（Ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｄｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＭＡＣＳ）を用いて実施することができる。例えば、目的とする表現型を示す細胞に結合する蛍光試薬を用いた場合、前記蛍光試薬由来の蛍光が所定の値以上を示す細胞と、それ未満の値を示す細胞とを区別して、目的とする表現型を示さない細胞を回収することができる。

【0151】

前記細胞集団が組織中の細胞の集団である場合、工程（ｃ）は、例えばレーザーマイクロダイセクション用いて実施することができる。例えば、目的とする表現型を示さない細胞に結合する蛍光試薬を用いた場合、顕微鏡下で前記蛍光試薬由来の蛍光を発する細胞または領域を、前記蛍光を発していない細胞または領域とを区別して、目的とする表現型を示さない細胞をレーザーで切り出すことによって回収することができる。

【0152】

＜工程ｄ＞
前記特定方法は、（ｄ）選択した細胞からゲノムＤＮＡを回収することを含む。工程（ｄ）で回収されたゲノムＤＮＡでは、工程（ｂ）で細胞集団に導入されたガイドＲＮＡのバラエティーと比べて、目的とする表現型に対応する遺伝子の配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡが富化されている。

【0153】

ゲノムＤＮＡの回収は、公知の方法に従って、調製することができる。ゲノムＤＮＡの回収は、例えばエタノール沈殿法または商業的に入手可能なゲノムＤＮＡ抽出キットを用いて実施することができる。

【0154】

＜工程ｅ＞
前記特定方法は、工程（ｂ）～（ｄ）が所定回数実施されるまで、回収したゲノムＤＮＡから新たなガイドＲＮＡライブラリーを準備し、前記新たなガイドＲＮＡライブラリーを用いて工程（ｂ）～（ｄ）を実施することを含む。工程（ｂ）～（ｄ）を所定回数実施することで、目的とする表現型に対応する遺伝子の配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡがより富化されることが期待される。

【0155】

「所定回数」は、少なくとも２回、例えば２回、３回、４回または５回以上であってよい。所定回数は、多いほど目的とする表現型に対応する遺伝子の配列に相補的な配列を含むガイドＲＮＡがより富化されることが期待されるが、一方で、実施により多くの労力が必要とされる。１つの実施形態において、所定回数は、３回である。

【0156】

「新たなガイドＲＮＡライブラリー」は、工程（ｄ）で回収したゲノムＤＮＡに組み込まれたガイドＲＮＡを回収し、回収したガイドＲＮＡを用いて調製されたガイドＲＮＡライブラリーを意味する。ゲノムＤＮＡに組み込まれたガイドＲＮＡは、例えばガイドＲＮＡを含む領域をＰＣＲにより増幅し、増幅したＰＣＲ産物を回収することによって、回収することができる。この例では、ガイドＲＮＡは、ＰＣＲによってガイドＲＮＡを増幅するための配列をさらに含む。レンチウイルス型のガイドＲＮＡライブラリーを調製する場合、回収したガイドＲＮＡをレンチウイルスベクターに挿入してプラスミドを調製する。調製したプラスミドを用いて宿主細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした宿主細胞を培養して、レンチウイルスを生成させることにより、レンチウイルス型のガイドＲＮＡライブラリーを調製することができる。

【0157】

＜工程ｆ＞
前記特定方法は、（ｆ）工程（ｂ）～（ｄ）が所定回数実施された場合に、回収したゲノムＤＮＡ中のガイド配列を決定することを含む。工程（ｆ）は、例えば、工程（ｄ）で回収したゲノムＤＮＡに組み込まれたガイドＲＮＡを含む領域を、ＰＣＲにより増幅し、増幅したＰＣＲ産物をシークエンサーにかけることにより、ガイドＲＮＡに含まれるガイド配列を決定することができる。

【0158】

＜工程ｇ＞
前記特定方法は、（ｇ）決定されたガイド配列に対応する遺伝子を、前記目的とする表現型に対応する遺伝子として特定する工程を含む。工程（ｇ）は、例えば工程（ｆ）で決定したガイドＲＮＡのガイド配列と所定の配列同一性（例えば９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％）を示す配列を含む遺伝子は、工程（ａ）の細胞（特定の生物種の細胞）のゲノムＤＮＡに関する情報を含むデータベースを検索することで見出すことができ、見出された遺伝子を、目的とする表現型に対応する遺伝子と特定することによって実施することができる。

【0159】

本明細書に開示した目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法を実施することにより、目的とする表現型に対応する遺伝子が特定された細胞に富んだ細胞集団が得られる。本発明の１つの実施形態は、目的とする表現型に対応する遺伝子が特定された細胞に富んだ細胞集団を製造する方法を提供する。また、本明細書に開示した目的とする表現型に対応する遺伝子を特定する方法を実施することにより、目的とする表現型に対応する遺伝子が特定された細胞であって、前記表現型を示すまたは示さない細胞に富んだ細胞集団が得られる。本発明の１つの実施形態は、目的とする表現型に対応する遺伝子が特定された細胞であって、前記表現型を示すまたは示さない細胞に富んだ細胞集団を製造する方法を提供する。

【0160】

本明細書中で述べた用語の定義または具体例は、本明細書に開示した任意の態様または実施形態における対応する用語に適宜適用される。

【0161】

以下に、本発明を例示することを意図したて実施例を記載するが、下記実施例は本発明をいかようにも限定するものではない。実施例に記載されている組成物および方法は本発明の一部を構成する。

【0162】

［実施例］
材料および方法
後述する実施例において、下記する材料および方法を用いた。
（細胞培養）
マウスインターロイキン３（ＩＬ－３）に依存性のＢａ／Ｆ３細胞（文献２４）は、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、抗生物質（Ｎａｃａｌａｉ）、５５μＭのβ２－メルカプトエタノールおよび４５ｕｎｉｔｓ／ｍｌのＩＬ－３を含有するＲＰＭＩ１６４０（ＷＡＫＯ）中で培養した（文献２５）。ヒトＰＬＢ９８５細胞は、１０％ＦＣＳ、抗生物質および５５μＭのβ２－メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ＨＥＫ２９３ＴおよびＨＣＴ１１６（理研バイオリソースセンター）細胞は、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を含有するＤＭＥＭ（ＷＡＫＯ）で維持した。

【0163】

（プラスミド）
単量体のＥＧＦＰがＮ末端およびＣ末端にタグ付けされたマウスＸｋｒ４、およびそのカスパーゼ切断型のＸｋｒ４ΔＣをコードするＤＮＡを、Ｃａｓ９およびＢｌａｓｔを除去したｌｅｎｔｉＣａｓ９－ｂｌａｓｔベクター（本明細書中「ｐｌｅｎｔｉ」ともいう）に導入した（文献１５、Ａｄｄｇｅｎｅ＃５２９６２）。Ｎ末端にＶ５がタグ付けされ、かつＣ末端にＦＬＡＧがタグ付けされたマウスＸｋｒ４（Ｖ５－Ｘｋｒ４－ＦＬＡＧ）、Ｘｋｒ４ΔＣ、ならびに点突然変異（３３２番目のグルタミンがグルタミン酸で置換されている（Ｑ３３２Ｅ）、３３１番目のロイシンがフェニルアラニンで置換されている（Ｌ３３１Ｆ）、および３２２番目のイソロイシンがセリンで置換されている（Ｉ３２２Ｓ））を有するＸｋｒ４変異体をコードするＤＮＡを、ｐＮＥＦベクター（文献１０）およびｐＭＸｓ－ｐｕｒｏベクター（文献２７）にそれぞれ導入した。ヒトＸｋｒ４、Ｘｋｒ８、およびＸｋｒ９ ｃＤＮＡは、そのＮ末端にＶ５をタグ付けされ、内因性のリボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）駆動性のピューロマイシン耐性遺伝子を有するｐｌｅｎｔｉに導入した。Ｖ５－Ｘｋｒ４－ＦＬＡＧおよびＶ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧも同様にレンチウイルスベクターに導入した。Ｎ末端にＳＰＯＴがタグ付けされ、かつＣ末端にＦＬＡＧがタグ付けされたマウスＸｋｒ４ΔＣ（ＳＰＯＴＸｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧ）、およびＮ末端にＶ５がタグ付けされ、かつＣ末端にｔａｇＲＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）がタグ付けされたマウスＸｋｒ４ΔＣ（Ｘｋｒ４ΔＣ－ＲＦＰ）をｐｌｅｎｔｉベクターに挿入した。

【0164】

ヒトＸＲＣＣ４のｃＤＮＡは、ＰＬＢ細胞から生成した第１のｃＤＮＡ鎖をテンプレートとして使用してＰＣＲにより増幅した。以下のＸＲＣＣ４変異体を、ｐｌｅｎｔｉベクターにおいてＮ末端またはＣ末端にｔａｇＲＦＰを融合させた：野生型（ＷＴ）、カスパーゼ非切断型（２ＤＡ）、カスパーゼ切断Ｎ末端断片（ΔＣ、１－２６５）およびＣ末端断片（ΔＮ、２６６－３３６）、欠失変異体（１１６－３３６、１５６－３３６、２０４－３３６、２４６－３３６、２５６－３３６、１－３０５、１－２８５、２５６－２８５）、核移行シグナルにおける変異体（２７０番目のアルギニンがアラニンで置換されている（Ｒ２７０Ａ）、２７１番目のリジンがアラニンで置換されている（Ｋ２７１Ａ）、２７２番目のアルギニンがアラニンで置換されている（Ｒ２７２Ａ）、２７３番目のアルギニンがアラニンで置換されている（Ｒ２７３Ａ）、２７５番目のアルギニンがアラニンで置換されている（Ｒ２７５Ａ））。自己切断性２Ａペプチド（Ｔ２Ａ；ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１５））配列を、ＸＲＣＣ４のｃＤＮＡとＴａｇＲＦＰとの間に導入して、ＸＲＣＣ４－ＷＴ－２Ａ－ＲＦＰまたはＸＲＣＣ４－Ｒ２７０Ａ－２Ａ－ＲＦＰを作成した。ＸＲＣＣ４に対するショートガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が細胞内で安定して発現された場合、ＸＲＣＣ４－ｓｇＲＮＡ）に対してサイレンシング変異を導入した（ＸＲＣＣ４ ｃＤＮＡにおけるＸＲＣＣ４ ｓｇＲＮＡターゲットシーケンス ５’－ｔｇｇａｇａｃｔｇａｔｃｔｔｔａｔａａｇｃｇｇ－３’（配列番号１６）を、５’－ｔｔａｇａａａｃａｇａｔｃｔａｔａｃａａａｃｇｔ－３’（配列番号１７）に変更した。下線はＰＡＭ配列を示す）。

【0165】

ｌｅｎｔｉＣａｓ９－ＢｌａｓｔにおけるＦＬＡＧ配列をＨＡに置き換え、Ｃａｓ９－ＨＡを発現させるために用いた。マウスＸｋｒ４（５’－ｇｃｇｇｃｇｃｔｇｔｇｃｃｔｇｃｇｃｃｔ－３’：配列番号１８）、ヒトＸＲＣＣ４（５’－ｔｇｇａｇａｃｔｇａｔｃｔｔｔａｔａａｇ－３’：配列番号１９）、ヒトＡＰＡＦ１（５’－ａｇｃａｔｔｇｔａｇａａｔｇａｔａｃｇｔ－３’：配列番号２０）、ヒト・シトクロムＣ（５’－ａｃａｇｃｃｇｃｃａａｔａａｇａａｃａａ－３’：配列番号２１）に対するｓｇＲＮＡのためのレンチウイルス発現ベクターは、ｐｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－Ｐｕｒｏベクター（文献１５、Ａｄｄｇｅｎｅ＃５２９６３）を用いて構築した。ＸＲＣＣ４ ＫＯ細胞を樹立するために、ＸＲＣＣ４に対するｓｇＲＮＡを、ｐｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ（ｐｕｒｏ－）ベクターに挿入し、次のように構築した： ｐｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－ｐｕｒｏにおけるＥＦ１αプロモーターおよびピューロマイシン耐性遺伝子をＳｍａＩおよびＭｌｕＩ部位での切除により除去し、Ｔ４ポリメラーゼを用いて平滑末端を生成させた後にＴ４リガーゼでライゲーションした。ヒトＣＡＤ（５’－ｇａａｃａｔｃｇｃｇｇｃｃｇａｇａｃｃｃ－３’：配列番号２２）、およびマウスＸｋｒ８（５’－ｃｔｔａｇａｃｇｔｇｇｔｃｇｔａｇｇｃｃ－３’：配列番号２３）に対するｓｇＲＮＡを発現させるために、ｐＸ３３０ベクター（文献２８）を使用した。

【0166】

（細胞株の樹立）
ＴＭＥＭ１６Ｆを欠くＢａ／Ｆ３細胞を準備した（文献２９）。Ｘｋｒ８に対するｓｇＲＮＡをコードするｐＸ３３０ベクターをＴＭＥＭ１６Ｆ ＫＯ Ｂａ／Ｆ３細胞にエレクトロポレーションし、その３日後に限界希釈を行った。各クローンからゲノムＤＮＡを回収した後、ゲノムＤＮＡにおけるＸｋｒ８ロケーティング領域をシーケンシングのために増幅し、Ｘｋｒ８がノックアウトされていることを確認した（本明細書中「ＢＤＫＯ」という）。ＣＡＤに対するｓｇＲＮＡをコードするｐＸ３３０ベクターを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９でトランスフェクトしたＰＬＢ細胞にエレクトロポレーションし、限界希釈を行って単一クローンを得た。ＣＡＤ欠失は、ゲノムのシーケンシング、ウェスタンブロッティング、およびアポトーシス刺激後のＤＮＡ断片化アッセイにより確認した。ＸＲＣＣ４ノックアウト細胞は、ＸＲＣＣ４に対するｓｇＲＮＡをコードするレンチウイルスの感染によって樹立した。単一クローンは限界希釈法により得られ、ＸＲＣＣ４のノックアウトは、ゲノムシーケンシングおよび抗ＸＲＣＣ４抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。

【0167】

レトロウイルスは、レトロウイルスベクターｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ、ｐＧａｇ－ｐｏｌ ＩＲＥＳ－ｂｓｒ（北村俊雄博士から贈与された）およびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ（理研）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによって調製した。トランスフェクションの４８時間後に、レトロウイルスを含む培養上清を回収、ろ過し、６，０００×ｇで１６時間、遠心分離して濃縮し、Ｂａ／Ｆ３細胞に感染させるために用いた。２．０μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択することにより、安定なトランスフェクタントを得た。

【0168】

Ｃａｓ９－ＨＡ、Ｘｋｒｓ、ＸＲＣＣ４およびそれらの変異体のｓｇＲＮＡまたはｃＤＮＡの発現のためのレンチウイルスは、レンチウイルスベクターｐＣＭＶ－ＶＳＶＧ－ＲＳＶ－Ｒｅｖ（理研）およびｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐ（理研）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることにより作製した。レンチウイルスを含む培養上清を回収し、ろ過し、６，０００×ｇで１６時間、遠心分離して濃縮し、ＢＤＫＯ、ＰＬＢおよびＨＣＴ１１６細胞を観戦させるために用いた。
幾つかの実験では、２．０μｇ／ｍｌピューロマイシンまたは１０μｇ／ｍｌブラストサイジンを用いて細胞を培養することにより、安定なトランスフェクタントを選択した。

【0169】

（スタウロスポリン（ＳＴＳ）によるアポトーシス刺激）
ＰＬＢ細胞を、５×１０^５細胞／ｍｌにて播種した。翌日、細胞を計数し、１×１０^６細胞／ｍｌとなるように予め３７℃となるように保温した新しい培地に再懸濁し、細胞懸濁培地を培養インキュベーターにて２時間インキュベートした。ＳＴＳ（ＬＣラボラトリーズ）を前記細胞懸濁培地に終濃度１０μＭとなるよう添加し、所定時間インキュベートした。幾つかの実験では、アポトーシス刺激の１時間前に、全カスパーゼ（pan-caspase）阻害剤である２０μＭのＱ－ＶＤ－ＯＰｈ（Ｃａｙｍａｎ）を前処理しました。

【0170】

（脂質スクランブルアッセイ）
１×１０^６細胞を１ｍＭ ＣａＣｌ_２およびＭｇＣｌ_２を含有するＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）（ＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇ）にて洗浄し、５００μｌのＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇに再懸濁して、氷上で７分間インキュベートした。１μＭのニトロベンゾオキサジアゾールをコンジュゲートしたホスファチジルコリン（本明細書中「ＮＢＤ－ＰＣ」ともいう、Ａｖａｎｔｉ）を含む等量のＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇを細胞懸濁液に加え、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、５ｍｇ／ｍｌの脂肪酸非含有ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むＨＢＳＳ／Ｃａ／Ｍｇを１μＭのＤＡＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）と共に５分間混合して、取り込まれなかったＮＢＤ－ＰＣを除去した。取り込まれたＮＢＤ－ＰＣを有する残留する蛍光シグナルを、フローサイトメトリーにより、非ネクローシス細胞集団（ＤＡＰＩ陰性）において測定した。細胞数に応じて、他のパラメーターは同じ比率となるよう変更した。ＮＢＤ－ＰＣ取込みは、インキュベーション温度４℃または１５℃のいずれかで実施した。

【0171】

脂質スクランブルに必要な細胞外二価カチオンを観察するために、細胞を、所定濃度のＣａＣｌ_２および／またはＭｇＣｌ_２を含むまたは含まない５００μｌのＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）および１４０ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした後に、脂質スクランブルアッセイを行った。１μＭのＮＢＤＰＣを含む等量のＨＥＰＥＳバッファーを加え、氷上で所定時間インキュベートした。ＮＢＤ－ＰＣと共にインキュベートした後、サンプルを５ｍｇ／ｍｌの脂肪酸非含有ＢＳＡおよび１μＭのＤＡＰＩを含むＨＥＰＥＳバッファーと混合し、フローサイトメトリーにより分析した。幾つかの実験では、２μＭのＡ２３１８７（Ｓｉｇｍａ）を、ＮＢＤ－ＰＣを含有するバッファーの細胞懸濁液に加え、氷上で４分間インキュベートした。

【0172】

（細胞内カルシウム流入の測定）
２５０万個のＸｋｒ４ΔＣ Ｑ３３２Ｅを発現するＢＤＫＯ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中、１μＭのＦｌｕｏ４－ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて前処理し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、５×１０^５細胞をＨＥＰＥＳバッファーで１回洗浄し、０．１２５ｍＭのカルシウムまたは２ｍＭのカルシウムを含むＨＥＰＥＳバッファーに再懸濁した。氷上で１０分間インキュベートした後、細胞を１０μｇ／ｍｌのＰＩ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を含むＨＥＰＥＳバッファーを用いて、２μＭのＡ２３１８７と共にまたは無しにおいて、１分間混合した。Ｆｌｕｏ４シグナルはフローサイトメーターにて観察した。

【0173】

（アネキシンＶ染色）
ＰＳ露出は、アネキシンＶ－Ｃｙ５（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて染色することにより測定した。５×１０^５細胞を２００μｌの氷冷アネキシンバッファー（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２）に再懸濁し、アネキシンＶＣｙ５を含む等量のアネキシンバッファーと混合しました。氷上で１５分間インキュベートした後、ＤＡＰＩを終濃度１μＭにて添加した。非ネクローシス細胞集団（ＤＡＰＩ陰性）中のアネキシンＶ－Ｃｙ５シグナルをフローサイトメトリーにより分析した。

【0174】

（ｃＤＮＡライブラリーの構築、およびＸｋｒ４ΔＣ変異体の同定）
ｃＤＮＡライブラリーを調製するために、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して１０^７個のＰＣ６細胞から調製し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ－ｄＴ３０＜スーパー＞ｍＲＮＡ精製キット（Ｔａｋａｒａ）を使用してｍＲＮＡ精製を行った。ｃＤＮＡライブラリーを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＳＭＡＲＴｅｒ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用説明書に幾つかの変更を加えて用い、前記精製ｍＲＮＡから作製した。簡潔には、ｍＲＮＡを、キットに付属されたＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＳＭＡＲＴｅｒ ＣＤＳプライマーおよびＳＭＡＲＴｅｒオリゴを用い、逆転写酵素によって第１のｃＤＮＡ鎖生成に適用し、続いてプライマー５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’（配列番号２４）および５’－ＣＧＧＧＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＡＣＡＣＣＡ－３’（配列番号２５）を用いたＰｒｉｍｅｓｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｔａｋａｒａ）によって第２のｃＤＮＡ鎖を生成した。増幅したｃＤＮＡを１％アガロースゲルにロードし、臭化エチジウムで染色し、ＬＥＤライト下で２つの部分に分離した： 低分子量（ＬＭＷ）（１．０－２．５ｋｂｐｓ）および高分子量（ＨＭＷ）（２．５－６．０ｋｂｐｓ）。ｃＤＮＡを切り出したゲルから精製し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（文献３０）を用いてＮｃｏＩで切断したｐＭＸｓ－ＨｉＦｉベクターに挿入し、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂコンピテントセル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｎｔｉｆｉｃ）にエレクトロポレーションし、ＨＭＷおよびＬＭＷ ｃＤＮＡライブラリーのそれぞれについて１０枚の１５ｃｍ Ｌｙｓｏｇｅｎｙブロス（ＬＢ）寒天プレートに播種した。翌日、コロニーをＬＢ培地で収集し、Ｍａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）に適用した。各ライブラリーのクローン数は、ＨＭＷで２１００万であり、ＬＭＷで６１０万であった。ｐＭＸｓ－ＨｉＦｉベクターを、以下の配列をｐＭＸｓベクター（文献２７）のＢａｍＨＩおよびＳａｌＩサイトに挿入した、それらをアニーリングすることより構築した。
５’－ｇｇａｔｃｃｃａｇａａｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａａｃｃａｔｇｇｔｃｔｃａｔｃｇｔａｃｃｃｃｇｃｃａｇｃａｃａｇｔｇｇｔｃｇａｃ－３’（配列番号２６）

【0175】

（ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング）
ＨＭＷのｃＤＮＡライブラリーを、レトロウイルスベクターｐＧａｇ－ｐｏｌ ＩＲＥＳ－ｂｓｒおよびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇを用いて、１０枚の１０ｃｍプレートのＨＥＫ２９３Ｔ細胞（各２×１０^６細胞）にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、上清を回収し、０．２２μｍのフィルターでろ過し、遠心分離した（６，０００×ｇ、１６時間、４℃）。翌日、ウイルスペレットを、前記上清の２０倍の濃度にて培地に再懸濁し、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｎａｃａｌａｉ）の存在下で、１×１０^６細胞／ｍｌの濃度のＢＤＫＯ細胞と共に混合した。感染後６時間で、培地を新しい培地に交換し、３日間培養し、脂質スクランブルアッセイに適用した。その後、フローサイトメトリーＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で選別（sort）した。数ラウンド（３～４回）のソーティング後に、１０^７細胞からゲノムＤＮＡを、後述するフェノール／クロロホルム抽出によって調製し、組み込まれたｃＤＮＡをＰｒｉｍｅｓｔａｒ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼと、プライマー５’－ｃｃｃａｔａｔｇｇｃｃａｔａｔｇａｇａｔｃｔｔａ－３’（配列番号２７）および５’－ｃａａａａｔｇｇｃｇｔｔａｃｔｔａａｇｃｔａｇｃ－３’（配列番号２８）とを用いたＰＣＲによって増幅した。その後、増幅産物を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒを用いたＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩにより切断されたｐＣＸ４ＢＳＲ（文献３１）に挿入した。大腸菌ＤＨ１０Ｂへのエレクトロポレーションの後、第２のｃＤＮＡライブラリーを精製し、次のラウンドのスクリーニングに適用した。スクリーニング後、ゲノムＤＮＡを調製し、組み込まれたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に適用し、アガロースゲルから切り出してｐＣＸ４ＢＳＲベクターに挿入した。ベクターに挿入された配列をシーケンシングにかけ、得られた配列をＢｌａｓｔサーチにより分析した。

【0176】

（ゲノムＤＮＡ精製）
ｃＤＮＡライブラリースクリーニング後、ゲノムＤＮＡを以下のように調製した。簡潔には、１０００万個の細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む１ｍｌのＧｅｎｏｍｅ Ｌｙｓｉｓバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ＳＤＳ）に再懸濁して、５５℃で３時間インキュベートした。次いで、等量のイソプロパノールを加え、穏やかに反転させた。出現したスプール状のＤＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄し、５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを含む１ｍｌのＴＥに再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートし、室温で一晩回転させた。翌日、前記ＤＮＡ溶液にＴＥ飽和フェノールを加えてよく混合し、遠心分離して上清液を回収し、次いで、再度ＴＥ飽和フェノール抽出にかけた。次に、ＤＮＡを含む上清を等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールと混合し、遠心分離した。その上清（約５００μｌ）を１／１０量の３Ｍ 酢酸ナトリウムおよび２倍量の１００％エタノールと混合し、穏やかに反転させた。スロープ状のＤＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄し、１００μｌのＴＥに再懸濁し、６５℃で１０分間インキュベートして、４℃で保存した。

【0177】

（脂質スクランブル活性が強い細胞の樹立）
脂質スクランブルアッセイを行うために、ＢＤＫＯ細胞をＶ５－Ｘｋｒ４ΔＣＦＬＡＧおよびＣａｓ９－ＨＡでトランスフェクトした。４，０００万個の細胞を、終濃度１μＭのＮＢＤ－ＰＣを用いた脂質スクランブルアッセイにかけた。１５℃で７分間ＮＢＤ－ＰＣと共にインキュベートした後、細胞膜上の外層における脂質を、５分間の脂肪酸非含有ＢＳＡによって除去し、ＮＢＤ－ＰＣを取り込んだ細胞をＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩを用いて選別し、ＤＡＰＩで染色された死細胞をゲートアウトした。収集した細胞を展開し、次のソーティングに適用した。ソーティングを６回繰り返し、脂質スクランブル活性が強い細胞が得られた。得られた高脂質スクランブル細胞（ｈｉｇｈ ｌｉｐｉｄ－ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）をＰＣ６と称する。

【0178】

（ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリーを用いたリバイバルスクリーニング）
Ｃａｓ９－ＨＡおよびＸｋｒ４ΔＣ－ＲＦＰを発現するＣＡＤ ＫＯ ＰＬＢ細胞に、Ｇｅｃｋｏ ｓｇＲＮＡライブラリーＡ＆Ｂ（文献１５、Ａｄｄｇｅｎｅ＃１０００００００４９）を約４０％の感染効率にて感染させた。細胞を２．０μｇ／ｍｌのピューロマイシンと共に２日間、ピューロマイシン無しで３日間培養した後、前記細胞を１５０ｍｌの新たな培地に５×１０^５細胞／ｍｌの濃度で播種した。翌日、２０ｍｌ培地中の２０００万個のＰＬＢ細胞を、培養インキュベーターにて３時間培養し、２０μｌの１０ｍＭ ＳＴＳ（終濃度１０μＭ）で刺激し、３時間インキュベートした。次いで、細胞をＮＢＤ－ＰＣ取込みアッセイにかけ、ＮＢＤ－ＰＣ取込みが欠失した細胞をフローサイトメトリーにて回収した。約５万個の細胞を１回の実験で集め、これを１日に５回実施した： 総数１×１０^８個の細胞を１次スクリーニングにかけた。合計２７０，０００個の細胞をフローサイトメトリーで収集し、Ｇｅｎｏ Ｐｌｕｓ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ抽出キット（Ｖｉｏｇｅｎｅ）に適用して、得られたゲノムＤＮＡ（合計３μｇ）をＰＣＲにかけて、Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ ＧＸＬポリメラーゼとプライマー５’－ｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃ－３’（配列番号２９）および５’－ｔａｔｃｃａｔｃｔｔｔｇｃａｃｃｃｇｇｇｃ－３’（配列番号３０）とを用いて組込まれたｓｇＲＮＡエンコードを、３２チューブ用の２５μｌスケールにて増幅した。ＰＣＲ条件は以下のとおりである： ９５℃で３分間の変性、その後９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、６８℃で３０秒の２８サイクル、および６８℃で３０秒の最終伸長。ＰＣＲ反応混合物を１本の１．５ｍｌチューブにプールし、そこから１６０μｌをアガロースゲルにロードして４２５ｂｐｓのバンドを切り出した。ＰＣＲ産物は、Ｇｅｌ／ＰＣＲ抽出キット（Ｆａｓｔｇｅｎｅ）を使用して精製し、ＮｄｅＩおよびＳｍａＩで切断したｐｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ－ｐｕｒｏベクター（２５０ｎｇ）と混合し、５０℃で１時間ＮＥＢｕｉｌｄｅｒと共にインキュベートし、エタノール沈殿にかけた。次に、沈殿物を１５７．５μｌの１０％グリセロールに再懸濁し、そこから１０３μｌの溶液を６３μｌのＤＨ１０Ｂと混合した。３つの７０μｌの混合物をエレクトロポレーションキュベットに移し、ＮＥＰＡ Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｎｅｐａ Ｇｅｎｅ）を使用して２７００Ｖでパルスし、５ｍｌ ＳＯＣに再懸濁し、３７℃で２時間、穏やかに振とうしながら培養し、１５ｃｍ ＬＢプレート（１プレートあたり１ｍｌ）に播種した。翌日、コロニーをカウントし（２２０万クローン）、ＰＢＳ中に回収し、Ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（Ｒｏｃｈｅ）にかけた。得られたプラスミドを使用してレンチウイルスを生成し、次のラウンドのソーティングにかけ、ＮＢＤ－ＰＣ陰性の細胞集団が明確に現れるまで繰り返した。

【0179】

ＮＢＤ－ＰＣ取込みが陰性であり、かつカスパーゼ３活性な細胞を、以下のように、フローサイトメトリーにより収集した： ｓｇＲＮＡライブラリーを、Ｘｋｒ４ΔＣ－ＲＦＰを発現するＣＡＤ ＫＯ ＰＬＢ細胞により低い感染力（１０％）で感染させ、各細胞に単一のｓｇＲＮＡレンチウイルスを導入した。１週間のピューロマイシン選択の後、ＲＦＰ陽性およびＰＣ取込み陰性の細胞をフローサイトメトリーで収集し、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドを２分間用いて固定化し、メタノールで透過処理を行い、抗活性化型カスパーゼ３抗体で染色し、カスパーゼ３活性陽性細胞を選別した。

【0180】

（局在試験（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ））
Ｘｋｒ４のＥＧＦＰ融合体またはＸＲＣＣ４のｔａｇＲＦＰ融合体の局在は、ＣＦＩ Ｐｌａｎ Ａｐｏ １００×油浸対物レンズ、１．４０ＮＡまたはＣＦＩ Ｐｌａｎ Ａｐｏ ４０×ドライ対物レンズ、０．９５ＮＡを使用したＮｉｋｏｎ Ａ１共焦点顕微鏡により観察した。ＸＲＣＣ４のｔａｇＲＦＰ融合体の局在を視覚化するために、ＸＲＣＣ４およびその変異体を発現するＰＬＢ細胞を、１０μＭＳＴＳを用いて、または用いずに２．５時間処理し、５ｍｇ／ｍｌの脂肪酸非含有ＢＳＡおよび２０μＭのＤＲＡＱ５（ＢｉｏＳｔａｔｕｓ）を含む氷冷ＨＢＳＳ中に再懸濁した。観察前に、細胞をガラス底ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に播種し、蛍光画像を取得した。微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像も取得して、細胞の形態を視覚化した。画像はｉｍａｇｅＪ１．５２ｐにより処理した。

【0181】

（ＤＮＡ断片化アッセイ）
５×１０^５個のＰＬＢ細胞およびＣＡＤ ＫＯ細胞を、１０μＭのＳＴＳを用いて４時間刺激した。細胞を収集して、ＰＢＳで１回洗浄し、１００μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを含む５００μＬのＧｅｎｏｍｅ Ｌｙｓｉｓバッファーで溶解し、５５℃で一晩インキュベートしました。ゲノムＤＮＡを沈殿させるために、５００μｌのイソプロパノールを加えて混合し、２０，０００×ｇで５分間遠心分離した。沈殿物を７０％エタノールでリンスし、２０μｌのＴＥバッファーに再懸濁した。サンプルを１％アガロースゲルにロードし、ＤＮＡ断片化を紫外線下で臭化エチジウムを用いて染色することにより視覚化した。

【0182】

（合成ペプチドのエレクトロポレーション）
ＸＲＣＣ４のアミノ酸２６６－２８５（Ｃ２０：ＩＡＰＳＲＫＲＲＱＲＭＱＲＮＬＧＴＥＰＫ（配列番号７））、Ｎ末端にメチオニンを有するＣ２０（Ｃ２１：ＭＩＡＰＳＲＫＲＲＱＲＭＱＲＮＬＧＴＥＰＫ（配列番号１３））、２７０番目のアルギニンがアラニンで置換されているＣ２０（Ｃ２０－Ｒ２７０Ａ：ＩＡＰＳＡＫＲＲＱＲＭＱＲＮＬＧＴＥＰＫ（配列番号１４））、２７１番目のリジンがアラニンで置換されているＣ２０（Ｃ２０－Ｋ２７１Ａ：ＩＡＰＳＲＡＲＲＱＲＭＱＲＮＬＧＴＥＰＫ（配列番号８））に対応する合成ペプチドは、ＳＣＲＵＭ社（東京、日本）から入手した。これらのペプチドを、終濃度１０μＭにて１００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中の１×１０^６細胞に添加した。エレクトロポレーションは、ＥＬＥＰＯ２１（Ｎｅｐａ Ｇｅｎｅ）によって実施した。エレクトロポレーション後、細胞を、直ちに３７℃に予め温めた１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０と混合した。その半分（５×１０^５細胞）を上記のようにアネキシンＶ－Ｃｙ５で染色し、フローサイトメトリーにて分析した。

【0183】

Ｃ２０の局在は、Ｘｋｒ４ＷＴ－ＧＦＰまたはＸｋｒ４ΔＣＧＦＰを発現するＨＣＴ１１６にて観察された。簡潔には、２×１０^４個の細胞を、ペプシン可溶化ラットコラーゲンタイプＩ（Ｎｉｐｐｉ）５μｇ／ｃｍ^２コーティングガラス底２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）に播種し、２日間培養した。テトラメチルローダミンで標識したＣ２０（Ｃ２０－ＴＭＲ）を、３００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中に希釈して、終濃度２μＭとし、ＣＵＹ９００－１３－３－５接着細胞電極（adherent cell electrode）を備えたＥＬＥＰＯ２１にてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞をＰＢＳ中の４％ＰＦＡを用いてＲＴにて１０分間固定化し、共焦点顕微鏡にて観察した。

【0184】

（ブルーネイティブＰＡＧＥ（ＢＮ－ＰＡＧＥ））
ＢＮ－ＰＡＧＥは、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。可溶化膜画分を調製するために、１×１０^８細胞を６ｍｌの冷却したバッファーＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ｐ－ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ ＮａＦ）に再懸濁し、氷上のＤｏｕｎｃｅホモジナイゼーション（６０回ストローク）を用いて破壊した。次いで、等量の冷却したバッファーＢ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ スクロース、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ｐ－ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ ＮａＦ）を添加し、４℃、８００×ｇにて１０分間遠心分離した。上清を回収し、さらに４℃、８，０００×ｇにて１０分間遠心した。ペレットを除去した後、上清を４℃、１００，０００×ｇにて５０分間の超遠心分離にかけた。ペレット化した膜画分を、可溶化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ６－アミノカプロン酸、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ｐ－ＡＰＭＳＦ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｎａｃａｌａｉ）、１ｍＭ ＮａＦおよび１％ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ）（Ｄｏｊｉｎｄｏ）／０．０１％コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＳ）（Ｓｉｇｍａ））と共に４℃にて３時間インキュベートすることにより溶解させた。４℃、２０、０００×ｇで３０分間の遠心分離を実施して、不溶性の物質を除去した。可溶化膜画分の量を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定し、可溶化バッファーを用いて０．６μｇ／μｌに調整した。次に、サンプルを、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ４－１６％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードし、１５０Ｖにて３５分間４℃での電気泳動により分離した。カソードバッファー中のＣＢＢ Ｇ－２５０濃度を０．０２から０．００２％に変更し、サンプルをさらに１５０Ｖにて１２０分間電気泳動した。ゲルをＳＤＳランニングバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９０ｍＭ グリシン、０．１％ＳＤＳ、（ｐＨ８．３））を用いてＲＴにて２０分間インキュベートし、次いで、０．１Ａにて１時間ＰＶＤＦメンブレンに転写し、ウェスタンブロッティングを行った。

【0185】

（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
全細胞ライセートを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライ）を含む可溶化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ６－アミノカプロン酸、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ｐ－ＡＰＭＳＦ、１ｍＭ ＮａＦおよび１％ＤＤＭ／０．０１％ＣＨＳ）またはＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）を用い、４℃にて１時間インキュベートして調製した。インキュベーション後、サンプルを４℃にて２０，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を回収し、タンパク質濃度をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットにより測定した。次いで、サンプルを、可溶化バッファーおよび５×ＳＤＳサンプルバッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％ＳＤＳ、２５％グリセロール、５％メルカプトエタノール、０．０５％ブロモフェノールブルー）を用いて、０．１～１．０μｇ／μｌに調整し、１０％ポリアクリルアミドゲル（ＢＩＯＣＲＡＦＴ）にロードした。サンプルを、３５ｍＡにて４０分間電気泳動し、０．１Ａにて６０分間ＰＶＤＦメンブレンに転写した。前記メンブレンを５，０００倍希釈した抗Ｖ５－ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５，０００倍希釈した抗ＦＬＡＧ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）、４，０００倍希釈した抗ｔＲＦＰウサギｐＡｂ（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ＡＢ２３３）、２，０００倍希釈した抗ＸＲＣＣ４マウスｍＡｂ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｃ－４）、５００倍希釈した抗ＣＡＤマウスｍＡｂ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｆ－１１）、４，０００倍希釈した抗切断型カスパーゼ３ウサギｍＡｂ（細胞シグナリングテクノロジー ＃９６６１）、またはＧＳＴ－Ｘｋｒ４ Ｎ末端（アミノ酸１～１１０）を用いて免疫したウサギで生じたＸｋｒ４に対する抗血清の５，０００倍希釈物を用い、次いで、１０，０００倍希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウスまたはウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏ）を用いてプローブ化した。化学発光シグナルは、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、ＦＵＳＩＯＮ化学発光イメージングシステム（Ｖｉｌｂｅｒ）にて検出した。化学発光後のＰＶＤＦメンブレン上の総タンパク質は、ＣＢＢ染色（ＷＡＫＯ）によって視覚化した。前記メンブレンをＣＢＢ染色バッファー（０．２５％ＣＢＢ Ｒ２５０、５０％メタノール、１０％酢酸）と共に室温にて２～３０分間インキュベートし、次いで、脱染バッファー（１０％メタノールおよび１０％酢酸）により洗浄した。

【0186】

（免疫沈降）
ＳＰＯＴタグ（文献３２）をＸｋｒ４のＮ末端に融合させた。ＳＰＯＴ－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧおよびＸＲＣＣ４－ＲＦＰを発現する１０００万個のＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞を、４００ｇでの５分間の遠心分離により回収し、１０μＭ ＳＴＳによる３７℃での２．５時間のアポトーシス刺激後に、アネキシンバッファーで洗浄した。次いで、膜画分を調製し、上記のように可溶化した。膜ライセートを抗ＳＰＯＴナノボディ結合磁性アガロースビーズ（ＳＰＯＴ－Ｔｒａｐ、ＣｈｒｏｍｏＴｅｋ）と共にインキュベートし、４℃にて２時間回転させた。前記ビーズを、冷却した洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ６－アミノカプロン酸、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、および０．０３％ＤＤＭ／０．００３％ＣＨＳ）で３回洗浄し、質量分析にかけるか、またはサンプルバッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、５％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）により９５℃で５分間沸騰して溶出させた。溶出されたサンプルを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより分析した。

【0187】

（質量分析）
免疫沈降後に、磁性アガロースビーズＳＰＯＴ－Ｔｒａｐを、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムでさらに２回洗浄した。前記ビーズ上のタンパク質を、２００ｎｇのトリプシン／Ｌｙｓ－Ｃミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、３７℃にて１６時間消化した。消化された生成物を、還元し、アルキル化し、酸性化し、およびＧＬ－Ｔｉｐ ＳＤＢ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて脱塩した。溶出液を、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器で蒸発させ、０．１％のトリフルオロ酢酸および３％のアセトニトリル（ＡＣＮ）中に溶解した。得られたペプチドのＬＣＭＳ／ＭＳ分析を、ナノエレクトロスプレーイオンソース（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介してＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計に接続されたＥＡＳＹ－ｎＬＣ １２００ ＵＨＰＬＣにて行った。ペプチドを、内径７５μｍ×１５０ｍｍ １８の逆相カラム（Ｎｉｋｋｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｓ）にて、０～１００分間で４～３２％の直接的なＡＣＮ勾配、続いて、１０分間で８０％にＡＣＮを増加させることで、分離した。質量分析計は、最大デューティサイクルが３秒のデータ依存取得モード（ｄａｔａｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）で操作した。ＭＳ１スペクトルは、１２０，０００の分解能、４×１０^５の自動ゲインコントロール（ＡＧＣ）ターゲット、および３７５～１，５００ｍ／ｚの質量範囲で測定した。ＨＣＤ ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ＡＧＣターゲットが１×１０^４、分離ウィンドウが１．６ｍ／ｚ、最大注入時間が１００ミリ秒、および正規化した衝突エネルギーが３０の線形イオントラップにて取得した。ダイナミックエックスクルージョンは、２０秒に設定した。生データは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒバージョン２．３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＳｅｑｕｅｓｔＨＴ検索エンジンを使用して、マウスＸｋｒ４タンパク質を補足してヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）に限定したＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに対して直接分析した。検索パラメーターは以下とした： （ａ）酵素としてのトリプシンが最大２つの消失切断（missed cleavages）；（ｂ）プリカーサー質量の許容が１０ｐｐｍ；（ｃ）断片質量許容が０．６Ｄａ；（ｄ）固定修飾としてのシステインのカルバミドメチル化；および（ｅ）可変修飾としてのタンパク質Ｎ末端のアセチル化およびメチオニンの酸化。ペプチドは、パーコレーターノードを用いて偽発見率１％にてフィルターをかけた。ラベル無しのプリカーサーイオン定量を、プリカーサーイオン定量化ノードを使用して実行し、すべてのペプチドにわたる各サンプルの存在度（abundance value）の合計が等しくなるように正規化を行った。

【0188】

ヒトＸＲＣＣ４およびマウスＸｋｒ４の選択された複数のペプチドを、高解像度ＭＳを用いたＭＳ／ＭＳベースのターゲット定量法であるＰＲＭによって測定した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、ナノエレクトロスプレーイオンソース（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介してＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計に接続されたＥＡＳＹ－ｎＬＣ １２００ ＵＨＰＬＣにて実行した。ターゲットＭＳ／ＭＳスキャンは、解像度が７０，０００、ＡＧＣターゲットが２×１０^５、分離ウィンドウが４．０ｍ／ｚ、最大注入時間が２秒、および正規化された衝突エネルギーが２７のタイムスケジュールされたインクルージョンリスト（inclusion list）により取得した。遷移のタイムアライメントおよび相対定量化は、ＰｉｎＰｏｉｎｔバージョン１．４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。

【0189】

（ＮＧＳデータのマッピング）
生データは、ｆａｓｔｑファイル（ｓｇＲＮＡ配列およびバーコード配列を含む）および２つのリファレンスｃｓｖファイル（リファレンスｓｇＲＮＡ配列を含む）として受けた。リファレンスファイルには、各リファレンスｓｇＲＮＡ配列は、それが取得されたオリジナルの遺伝子に従って列挙され、ユニーク識別タグ（ＵＩＤ）が割り当てられている。いずれの場合も、６つのユニークリファレンスｓｇＲＮＡ配列（異なるＵＩＤを有する）が同じ遺伝子に由来した。

【0190】

ｆａｓｔｑファイルおよびリファレンスｃｓｖファイルは、３つの内製コンピューターコードを用いて処理した。第１のコード（文献３３）は、ｆａｓｔｑファイル中の遺伝子からバーコード配列を除去し、次いで、すべての配列（ｆａｓｔｑファイル中の遺伝子およびリファレンスファイル中のｓｇＲＮＡシーケンスの両方）を整数シーケンス（シトシン＝１、アデニン＝２など）に変換する。このコードは、整数配列の２つのリストを出力し、その１つはｆａｓｔｑファイルに含まれる遺伝子に関し、もう１つは２つのリファレンスファイルに含まれるｓｇＲＮＡに関する。次いで、これらの出力は、第２のコード（Ｃ＋＋で記述される）によって読み取られ、それは、リファレンスリスト中で各ｓｇＲＮＡがｆａｓｔｑファイル中の遺伝子のなかで出現する回数をカウントする。次に、これらのカウントは、第３のコード（Ｒで記述される）に転換され、それは、リファレンスリストから各ｓｇＲＮＡがｆａｓｔｑファイル中の遺伝子のなかで出現する回数を示すスプレッドシートを作成する。このスプレッドシートを作成するために、我々はまずそれらが元来取得された遺伝子に従ってリファレンスｓｇＲＮＡをグループ分けする。次に、そのグループを、ｆａｓｔｑファイルの遺伝子のなかで少なくとも１回出現したリファレンスｓｇＲＮＡの数に従ってランク付けする。

【0191】

上記のマッピング手順では、Ｒが文字列データ（生の遺伝子配列）を読み取って処理する能力と、大量の整数データをループする際のＣ＋＋の速度を利用している。

【0192】

［実施例１］
恒常的に脂質スクランブル活性を示すＸｋｒ４変異体
Ｘｋｒ４は、アポトーシス過程においてカスパーゼによりそのＣ末端が切断される。Ｃ末端が切断されたＸｋｒ４は、二量体を形成し、スクランブラーゼ活性を生じる。これにより、細胞膜の内側に位置しているホスファチジルセリン（ＰＳ）が細胞膜の外側に露出される。しかし、Ｘｋｒ４のＣ末端の切断のみで、ＰＳが細胞膜の外側に露出するには十分ではない（文献１２）。

【0193】

野生型のＸｋｒ４（Ｘｋｒ４ＷＴ）をコードする遺伝子を有するプラスミド、およびカスパーゼによりそのＣ末端が切断されたＸｋｒ４（本明細書中「Ｘｋｒ４ΔＣ」ともいう）をコードする遺伝子（文献１５）を有するプラスミドをＰＬＢ細胞にトランスフェクトし、Ｘｋｒ４ＷＴおよびＸｋｒ４ΔＣを恒常的に発現するトランスフェクタントをそれぞれ調製した。

【0194】

ＰＬＢ細胞および前記トランスフェクタントの各々に対して、スタウロスポリン（ＳＴＳ）によるアポトーシス刺激を与え、各細胞によるニトロベンゾオキサジアゾールをコンジュゲートしたホスファチジルコリン（ＮＢＤ－ＰＣ）の取込みを、フローサイトメトリーを用いて測定した（図１（ａ）～（ｃ））（上記「材料および方法」の（ＳＴＳによるアポトーシス刺激）および（脂質スクランブルアッセイ）参照）。

【0195】

ＰＬＢ細胞（ｐａｒｅｎｔａｌ）では、ＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）も与えた場合（ＳＴＳ）も、細胞へのホスファチジルコリン（ＰＣ）の取込みは観察されなかった（図１（ａ））。Ｘｋｒ４ＷＴを発現するトランスフェクタント（本明細書中「Ｘｋｒ４ＷＴ発現細胞」ともいう）では、ＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えた場合、細胞へのＰＣ取込みが観察された（図１（ｂ）ＳＴＳ）。これらの結果は、Ｘｋｒ４ＷＴが、アポトーシス刺激により脂質スクランブラーゼ活性が生じることを示す。

【0196】

Ｘｋｒ４ΔＣを発現するトランスフェクタント（本明細書中「Ｘｋｒ４ΔＣ発現細胞」ともいう）では、ＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えなかった場合、細胞へのＰＣ取込みは観察されなかった（図１（ｃ）Ｃｏｎｔｒｏｌ）。この結果は、細胞によるＰＣ取込みにおいて、Ｘｋｒ４のＣ末端切断だけでは、培養液に添加されたＰＣを取り込むためのスクランブラーゼ活性を生じさせるのに十分ではないことを示す。Ｘｋｒ４ΔＣ発現細胞にＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えた場合、細胞へのＰＣ取込みが観察された（図１（ｃ）ＳＴＳ）。この結果は、Ｘｋｒ４ΔＣが、アポトーシス刺激によりスクランブル活性を生じるＸｋｒ４ＷＴと同様に、アポトーシス刺激により脂質スクランブル活性を生じることを示す。

【0197】

ＰＬＢ細胞（ｐａｒｅｎｔａｌ）、Ｘｋｒ４ＷＴおよびＸｋｒ４ΔＣを発現するトランスフェクタントについてアネキシンＶ染色を行った（図１（ｄ）～（ｆ））（上記「材料および方法」の（アネキシンＶ染色）参照）。図１（ｅ）および（ｆ）は、ＰＣ取込みが生じたトランスフェクタントＸｌｒ４ＷＴおよびＸｋｒ４ΔＣでは（図１（ｂ）および（ｃ））、ＰＳが露出されることを示す。これらの結果は、Ｘｋｒ４ΔＣが、ＰＣ取込みだけでなく、アポトーシス刺激によってＰＳ露出が生じることを示す。

【0198】

Ｘｋｒ４ＷＴおよびＸｋｒ４ΔＣのＣ末端にＥＧＦＰがタグ付けされたＸｋｒ４ＷＴ－ＧＦＰおよびＸｋｒ４ΔＣ－ＧＦＰを発現するＰＬＢ細胞をそれぞれ調製した。ＳＴＳによるアポトーシス刺激後、Ｘｋｒ４ΔＣは、Ｘｋｒ４ＷＴと同様、細胞膜上に局在していた（図２）。この結果は、Ｘｋｒ４ΔＣが、Ｘｋｒ４ＷＴと同様に、アポトーシス刺激により細胞膜上で脂質スクランブル活性を生じることを示す。

【0199】

Ｘｋｒ４ＷＴまたはＷｋｒ４ΔＣを発現するＰＬＢ細胞を、全カスパーゼ阻害剤Ｑ－ＶＤ－ＯＰｈと共に培養した後、ＳＴＳを用いて３時間アポトーシス刺激を与えた（図３）。Ｘｋｒ４ＷＴ発現細胞は、カスパーゼ阻害剤を用いて前処理すると、ＳＴＳによるアポトーシス刺激による脂質スクランブル活性が生じなかった（図３（ａ）および（ｂ））。Ｗｋｒ４ΔＣ発現細胞でも、Ｘｋｒ４ＷＴ発現細胞の場合と同様の結果が得られた（図３（ｃ）および（ｄ））。図１～図３により示される結果は、Ｘｋｒ４ΔＣが、Ｘｋｒ４ＷＴと同様に、アポトーシス刺激により誘導されるカスパーゼによって細胞膜上で脂質スクランブル活性を生じることを示す。

【0200】

Ｘｋｒ４ＷＴまたはＷｋｒ４ΔＣを発現するＰＬＢ細胞の細胞膜溶解液を調製し、ブルーネイティブＰＡＧＥ（ＢＮ－ＰＡＧＥ）またはＳＤＳ－ＰＡＧＥによる生化学的分析を行った（図４）。ＢＮ－ＰＡＧＥによる生化学的分析は、抗Ｘｋｒ４抗体を用いたウェスタンブロッティングは、アポトーシス刺激前は、Ｘｋｒ４ＷＴは単量体で存在し、Ｘｋｒ４ΔＣは二量体で存在することを示す（図４（ａ））。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる生化学的分析は、Ｘｋｒ４またはＸｋｒ４ΔＣがそれぞれ対応する分子量を有することを示す（図４（ｂ））。これらの結果は、Ｘｋｒ４ΔＣが、Ｘｋｒ４ＷＴと同様に、細胞膜上で二量体を形成するが、脂質スクランブル活性を生じるには十分ではないことを示す。

【0201】

（脂質スクランブル活性が強い細胞の樹立）
Ｘｋｒ４がどのように活性化されるかを理解するために、恒常的な脂質スクランブル活性を示す細胞を取得する。２種類のユビキタスなスクランブラーゼであるＸｋｒ８（文献１０）およびＴＭＥＭ１６Ｆ（文献９）が欠失したＢａ／Ｆ３細胞（ＢＤＫＯ）においてＸｋｒ４ΔＣを安定的に発現するトランスフェクタントを調製した。培養により増殖させたトランスフェクタントに対して脂質スクランブルアッセイを行い、ＮＢＤ－ＰＣ由来の蛍光強度が高いトランスフェクタント、即ちＰＣを取り込む細胞をフローサイトメトリーにより回収する過程を、６回繰り返した（図５（ａ））。前記過程を繰り返すことにより、ＮＢＤ－ＰＣ由来の蛍光強度が高いトランスフェクタントを得た（図５（ｂ））。図５（ｂ）の各グラフは、前記過程を実施した回数（ＰＣ０～ＰＣ５）に応じたフローサイトメトリーの結果を示し、各グラフ中の実線で囲った四角の領域は、非ネクローシス細胞集団においてＰＣを取り込む細胞（ＰＣ－ｕｐｔａｋｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ）を示す。

【0202】

前記過程の繰り返し回数が増える（ＰＣ０からＰＣ５）に従って、この領域に含まれるトランスフェクタントの数が増加した。Ｘｋｒ４ΔＣを発現するトランスフェクタントから出発して（図６（ａ））、前記過程を６回繰り返すことによって、アポトーシス刺激なしに、恒常的に脂質スクランブル活性を示す細胞（ＰＣ６）が得られた（図６（ｂ））。Ｘｋｒ４に対するｓｇＲＮＡレンチウイルスをＰＣ６細胞に感染させた。得られた感染ＰＣ６細胞（ＰＣ６＋ｓｇＸｒｋ４）では、ＰＣ取込みは観察されなかった（図６（ｃ））。ＰＣ６またはＰＣ６＋ｓｇＸｋｒ４の細胞ライセート全体をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、抗Ｖ５抗体を使用したウェスタンブロッティング（ＷＢ）を行った（図６（ｄ））。前記ＷＢにより、Ｖ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧが検出される。このＷＢの結果は、ＰＣ６＋ｓｇＸｒｋ４がＸｋｒ４を発現していないことを示す。これらの結果は、ＰＣ６細胞における恒常的な脂質スクランブル活性が、Ｘｋｒ４に依存することを示す。

【0203】

（ｃＤＮＡライブラリーの構築、およびＸｋｒ４ΔＣ変異体の同定）
ＰＣ６におけるＸｋｒ４に依存する恒常的な脂質スクランブル活性は、Ｘｋｒ４ΔＣに作用する内因性のタンパク質をコードする遺伝子に突然変異が導入されたことに起因する可能性がある。ＰＣ６細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いて第１のｃＤＮＡ鎖を生成させた。得られた第１のｃＤＮＡを、プライマー５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－３’（配列番号３１）および５’－ＣＧＧＧＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＡＣＡＣＣＡ－３’（配列番号３２）を用いたＰＣＲによって第２のｃＤＮＡ鎖を生成させた。得られた第２のｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により、低分子量（ＬＭＷ）（１．０－２．５ｋｂｐｓ）のｃＮＤＡと、高分子量（ＨＭＷ）（２．５－６．０ｋｂｐｓ）のｃＤＮＡとに分離した。ＬＭＷおよびＨＭＷのそれぞれを有するプラスミドを用いて、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂを形質導入した。この結果、ＬＭＷについて６１０万形の形質導入体クローンを含むＬＭＷのｃＤＮＡライブラリーが得られ、およびＨＭＷについて２１００万の形質導入体クローンを含むＬＭＷのｃＤＮＡライブラリーが得られた。

【0204】

（ｃＤＮＡライブラリースクリーニング）
ＨＭＷの第１のｃＤＮＡライブラリーを、レトロウイルスベクターｐＧａｇ－ｐｏｌ ＩＲＥＳ－ｂｓｒおよびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクタントからレトロウイルスを回収した。回収したレトロウイルスをＢＤＫＯ細胞に感染させ、１ＬＰＣ０細胞集団を得た。１ＬＰＣ０細胞集団を、脂質スクランブルアッセイにかけ、フローサイトメトリーにより脂質スクランブル活性を有する細胞（０.６％）を得た（図７（ａ））。得られた細胞集団を培養して、再度、脂質スクランブルアッセイにかけて、脂質スクランブル活性を有する細胞集団を得る過程を３回繰り返し、１ＬＰＣ３細胞集団中で脂質スクランブル活性を有する細胞（９１.９％）を得た（図７（ｂ））。１ＬＰＣ３細胞集団から得られた前記細胞のゲノムＤＮＡを調製し（上記「材料および方法」に記載の（ゲノムＤＮＡ生成）を参照）、前記ゲノムＤＮＡに組込まれたＨＭＷの第１のｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡを、プライマー５’－ｃｃｃａｔａｔｇｇｃｃａｔａｔｇａｇａｔｃｔｔａ－３’（配列番号３３）および５’－ｃａａａａｔｇｇｃｇｔｔａｃｔｔａａｇｃｔａｇｃ－３’ （配列番号３４）を用いたＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動した結果、いくつかのバンドが観察された。このため、前記ＰＣＲ断片を用いて第２のｃＤＮＡライブラリーを調製した。

【0205】

第１のｃＤＮＡライブラリーと同様にして、第２のｃＤＮＡライブラリーからレトロウイルスを調製し、調製したウイルスを用いてＢＤＫＯ細胞に感染させ、２ＬＰＣ０細胞集団を得た。２ＬＰＣ０細胞集団を、脂質スクランブルアッセイにかけ、フローサイトメトリーにより脂質スクランブル活性を有する細胞（１１.７％）を得た（図７（ｃ））。得られた細胞集団（２ＬＰＣ１）を培養して、脂質スクランブルアッセイにかけた結果、脂質スクランブル活性を有する細胞が９２.５％得られた（図７（ｄ））。２ＬＰＣ１細胞集団から得られた前記細胞のゲノムＤＮＡに組込まれた第２のｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動した結果、ほぼ単一のバンドが観察された。得られたＰＣＲ断片をシーケンシングした。その結果、同定された遺伝子はすべて、Ｘｋｅｒ４に対して単一の点突然変異（Ｉ３２２Ｓ、Ｌ３３１Ｆ、またはＱ３３２Ｅ）を有するＸｋｒ４ΔＣ変異体をコードしていた。この結果は、ＰＣ６におけるＸｋｒ４に依存する恒常的な脂質スクランブル活性は、同定された点突然変異によってＸｋｒ４ΔＣ自体が変化することによって生じたものであることを示す。

【0206】

Ｘｋｒ４は第１～第１０の膜貫通領域を有し、Ｉ３２２Ｓは第４の膜貫通領域における変異であり、Ｌ３３１ＦおよびＱ３３２Ｅは第５の膜貫通領域における変異である。

【0207】

［実施例２］
恒常的な活性型Ｘｋｒ４変異体の特徴
全長（ＦＬ）のＸｋｒ４、Ｘｋｒ４ΔＣ（「ΔＣ」ともいう）、前記点突然変異を有するＸｋｒ４ΔＣ（それぞれ「ΔＣ Ｉ３２２Ｓ」、「ΔＣ Ｌ３３１Ｆ」および「ΔＣ Ｑ３３２Ｅ」という）、全長Ｘｋｒ４に点突然変異Ｑ３３２Ｅを有するＦＬ Ｑ３３２ＥをＢＤＫＯ細胞（ｐａｒｅｎｔａｌ）において発現するトランスフェクタントをそれぞれ調製した。

【0208】

調製したトランスフェクタントについて、脂質スクランブルアッセイを行った（図８（ａ））。このアッセイでは、ＳＴＳによるアポトーシス刺激は与えていない。脂質スクランブルアッセイを開始後、ΔＣ Ｉ３２２Ｓ、ΔＣ Ｌ３３１ＦおよびΔＣ Ｑ３３２Ｅを発現するＢＤＫＯ細胞では、時間の経過にともなってＰＣ取込みが増加することが観察された（図８（ａ））。細胞膜の内側に位置するＰＳが細胞膜の外側に露出しているかを試験するために、調製したトランスフェクタントについてアネキシンＶ染色を行った（図８（ｂ））（上記「材料および方法」の（アネキシンＶ染色）参照）。図８（ｂ）は、ＰＣ取込みが増加したトランスフェクタント（ΔＣ Ｉ３２２Ｓ、ΔＣ Ｌ３３１ＦおよびΔＣ Ｑ３３２Ｅ）では、ＰＳが露出されていることを示す。Ｑ３３２Ｅを有する全長のＸｋｒ４（ＦＬ Ｑ３３２Ｅ）では、ＰＣ取込みもＰＳ露出も観察されなかった（図８（ａ）および（ｂ））。これらの結果は、Ｘｋｒ４のＣ末端の切断と、同定された点突然変異（ΔＣ Ｉ３２２Ｓ、ΔＣ Ｌ３３１ＦまたはΔＣ Ｑ３３２Ｅ）との組合せによって、Ｘｋｒ４による脂質スクランブル活性およびＰＳ露出が生細胞であっても生じることを示す。

【0209】

調製したトランスフェクタントから全細胞ライセートを調製し、細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥ後に、Ｖ５－Ｘｋｒ４－ＦＬＡＧを検出するための抗Ｖ５抗体を用いたウェスタンブロッティングに適用し、Ｘｋｒ４を検出した。その結果は、各トランスフェクタントは、対応する分子量を有するＸｋｒ４をそれぞれ発現していた（図９（ａ）上段）。Ｘｋｒ４ＦＬ、Ｑ３３２Ｅを有するＸｋｒ４ＦＬ（Ｘｋｒ４ＦＬ－Ｑ３３２Ｅ）、Ｘｋｒ４ΔＣ、Ｑ３３２Ｅを有するＸｋｒ４ΔＣ（Ｘｋｒ４ΔＣ－Ｑ３３２Ｅ）をそれぞれ発現するトランスフェクタントから全細胞ライセートを調製し、細胞ライセートをＢＮ－ＰＡＧＥ後に、Ｖ５－Ｘｋｒ４－ＦＬＡＧを検出するための抗Ｖ５抗体を用いたウェスタンブロッティングに適用し、Ｘｋｒ４を検出した。この結果、Ｘｋｒ４ΔＣ－Ｑ３２２Ｅは、Ｘｋｒ４ΔＣと同様、二量体を形成していた（図９（ｂ）上段）。これは、Ｘｋｒ４ΔＣによる二量体化は、同定された点突然変異Ｑ３２２Ｅによって影響を受けないことを示す。図８および図９で示された結果は、Ｃ末端の切断によって二量体を形成したＸｋｒ４は、同定された点突然変異によって、立体構造が変化して活性化され得ることを示す。これらの結果は、Ｃ末端の切断によって二量体を形成したＸｋｒ４が、何らかの活性化因子によって調節される構造変化により、脂質スクランブル活性を生じるようになる可能性を示唆する。

【0210】

同定された点突然変異を有するＸｋｒ４変異体を用い、脂質スクランブル活性に必須の成分を特定する。カルシウムイオンもマグネシウムイオンも含まない緩衝液中のＸｋｒ４ΔＣ Ｑ３３２Ｅ発現細胞は、前記緩衝液にＮＢＤ－ＰＣを添加してもＰＣを取り込まなかった（図１０（ａ））。緩衝液中にカルシウムイオンを含めることで、緩衝液中のＸｋｒ４ΔＣ Ｑ３３２Ｅ発現細胞は、ＰＣを取り込んだ（図１０（ｃ）および（ｄ））。緩衝液中に含めるカルシウムイオン濃度を増加させると、Ｘｋｒ４ΔＣ Ｑ３３２Ｅ発現細胞によるＰＣの取込み量が増加した（図１０（ｅ））。

【0211】

Ｘｋｒ４ΔＣ Ｑ３３２Ｅを発現するトランスフェクタントを、細胞外カルシウムイオン濃度０ｍＭ、０.１２５ｍＭまたは２ｍＭを含む条件下で、ＮＢＤ－ＰＣと混合し、前記トランスフェクタントによるＰＣ取込みを調べた。ＰＣ取込みアッセイにおいて、２μＭ カルシウムイオノフォアＡ２３１８７を含めた場合（Ａ２３）と含めなかった場合（－）とで、ＰＣ取込みに変化はなかった（図１１（a））。Ｘｋｒ４ΔＣ Ｑ３３２Ｅを発現するトランスフェクタントを、１μＭのＦｌｕｏ４－ＡＭと共に３０分間インキュベートし、０．１２５ｍＭまたは２ｍＭの細胞外カルシウムの存在下、２μＭのＡ２３１８７を用いて刺激し、フローサイトメトリーにて分析した。Ａ２３１８７を用いて刺激した場合と刺激しなかった場合とで、Ｆｌｕｏ４－ＡＭ取込みに変化はなかった（図１１（ｂ））。これらの結果は、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７はＸｋｒ４によるスクランブル活性を増強させるものではないことを示し、これは、Ｘｋｒ４の細胞外領域のカルシウムが重要であることを示唆する。Ｘｋｒ４ＷＴまたはＸｋｒ４ΔＣを発現するトランスフェクタントを、０．４ｍＭのカルシウムを含む培地中でＳＴＳと共に３時間培養し、次いで、２．５ｍＭの細胞外カルシウムを含むまたは含まない条件下で、ＰＣ取込みアッセイを実施した。ＳＴＳによるアポトーシス刺激によって活性化されたＸｋｒ４ＦＬもＸｋｒ４ΔＣも脂質スクランブル活性にカルシウムが必要であった（図１１（ｃ））。このため、Ｘｋｒ４の細胞外領域のカルシウムが脂質スクランブル活性に重要であることは、生きている細胞におけるＸｋｒ４ΔＣ変異体に特異的なものではないことを示す。

【0212】

［実施例３］
リバイバルスクリーニングによるＸｋｒ４活性化因子の同定
細胞外カルシウムの存在下で、Ｘｋｒ４は２つのステップで活性化される。１つのステップは、Ｃ末端の切断によって誘発される二量体化である。もう１つのステップは、実施例２において示唆されたように、何らかの活性化因子によって調節される構造変化である。死にかけている細胞において当該活性化要因を特定するために、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリーを利用する。しかしながら、一般に、死にかけている細胞を用いて、ターゲットｓｇＲＮＡを濃縮することは、該細胞が増殖しないために困難である。この困難性を克服するために、「リバイバルスクリーニング」と称する新たなスクリーニング系を開発した（上記「材料および方法」の（ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリーを用いたリバイバルスクリーニング）参照）。

【0213】

リバイバルスクリーニングでは、レンチウイルスが感染して細胞ゲノムＤＮＡに組込まれたターゲットｓｇＲＮＡが復活し、スクリーニングの次のラウンドのためのｓｇＲＮＡライブラリーにおいて濃縮される。これは、レンチウイルスのｓｇＲＮＡが細胞に感染して、感染細胞のゲノムＤＮＡに当該ｓｇＲＮＡが組み込まれる。特定の指標に基づいてｓｇＲＮＡが組み込まれた細胞を選択することによって、前記細胞から、前記指標に対応するｓｇＲＮＡが濃縮される。選択された感染細胞からゲノムＤＮＡを調製し、ゲノムＤＮＡに組込まれたｓｇＲＮＡを回収して、新たなレンチウイルスｓｇＲＮＡライブラリーを生成する。この結果、リバイバルスクリーニングでは、スクリーニングの次のラウンドのために調製されるｓｇＲＮＡライブラリーにおいて、特定の指標に対応するｓｇＲＮＡが濃縮される（図１２）。

【0214】

（ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡライブラリーを用いたリバイバルスクリーニング）
リバイバルスクリーニングを容易に実行にするために、アポトーシスＤＮａｓｅ ＣＡＤ（文献１４）を欠失させたＰＬＢ細胞を樹立する。ＣＡＤに対するｓｇＲＮＡをコードするｐＸ３３０ベクターを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９でトランスフェクトしたＰＬＢ細胞にエレクトロポレーションし、限界希釈を行って単一クローンを得ることによって、ＣＡＤ ＫＯ ＰＬＢ細胞を樹立した（図１３）。Ｃ末端にｔａｇＲＦＰを融合させたＸｋｒ４ΔＣ（Ｘｋｒ４ΔＣ－ＲＦＰ）をコードするＤＮＡ配列が挿入されたプラスミドを調製した。ＣＡＤ ＫＯ ＰＬＢ細胞を、前記プラスミドを用いてトランスフェクションした。得られたトランスフェクタントに、レンチウイルスｓｇＲＮＡライブラリーを感染させた。レンチウイルスｓｇＲＮＡライブラリーはヒト全遺伝子の各遺伝子につき６つの異なるターゲットｓｇＲＮＡを含む（文献１５）。

【0215】

レンチウイルスｓｇＲＮＡライブラリーで感染させた細胞を、ＳＴＳで３時間刺激して、アポトーシス刺激を与えた後、ＰＣ取込みアッセイを行った。ＲＦＰ陽性であり、かつＰＣ取込みが陰性である細胞集団をフローサイトメトリーにより回収した（図１４（ａ））。回収した細胞からゲノムＤＮＡを調製し、ゲノムＤＮＡに組み込まれたｓｇＲＮＡ領域を回収して、再度、レンチウイルスｓｇＲＮＡライブラリーを作製した。作製したレンチウイルスｓｇＲＮＡライブラリーを、前記トランスフェクタントに感染させ、感染細胞にＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えた後、ＰＣ取込みアッセイを行った。このサイクルを３回繰り返すことで、２４．５％のＰＣ取込み陰性の細胞を含む細胞集団（ｓｇＰＣ３）を得た（図１３（ｃ））。このサイクルをさらに１回繰り返し、ｓｇＰＣ４細胞集団を得た。

【0216】

ｓｇＰＣ４細胞集団のゲノムＤＮＡを回収して、回収したゲノムＤＮＡ中に組み込まれたｓｇＲＮＡをコードする領域を増幅し、増幅断片を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析にかけ、遺伝子マッピングを行った（上記「材料および方法」の（ＮＧＳデータのマッピング）参照）。１種または２種のｓｇＲＮＡに対応する遺伝子を除外した後、得られた遺伝子を総リード数のスコアに基づいてランク付けした（図１３）。ランク付けした１４位までの遺伝子を以下の表にまとめた。

【表1】

【0217】

表１で示されるように、チトクロームＣ（ＣＹＣＳ）およびＡＰＡＦ１が上位１４位までの遺伝子リスト中に見出された。ＣＹＣＳは、アポトーシス刺激を受けるとミトコンドリアから放出される。次いで、ＣＹＣＳはＡＰＡＦ１に結合し、カスパーゼ９（Ｃａｓｐ９）およびカスパーゼ３（Ｃａｓｐ３）を順次活性化する。このように、ＣＹＣＳおよびＡＰＡＦ１はいずれも、カスパーゼ９の活性化に必要な因子である。この結果は、リバイバルスクリーニングがアポトーシス過程において二量体Ｘｋｒ４による脂質スクランブル活性を調節する何らかの活性化因子を探索するために機能していることを示す。

【0218】

前記活性化因子の候補遺伝子を絞り込むために、さらなるスクリーニングを行った。ｓｇＲＮＡライブラリーが導入された細胞の中で、ＲＦＰが陽性であり、かつＰＣ取込みが陰性である細胞を含む細胞集団（ｓｇＰＣ５）をフローサイトメトリーにより回収した。回収したｓｇＰＣ６細胞を、固定し、透過処理を行いった。その後、処理された細胞に抗活性化型カスパーゼ３抗体による染色を行い、カスパーゼ３活性化細胞の分類を行った。前記ｓｇＰＣ６細胞からレンチウイルスｓｇＲＮＡライブラリーを作製して、前記レンチウイルスｓｇＲＮＡを用いて得られたｓｇＰＣ６細胞集団を用いてさらにスクリーニングを行った（図１６）。

【0219】

前記スクリーニングにより得られたｓｇＰＣ７細胞からゲノムＤＮＡに組込まれたｓｇＲＮＡを含む領域について、前記と同様にしてＮＧＳ分析を行った。ＮＧＳ分析により得られた遺伝子を総リード数のスコアに基づいてランク付けし、８位までの遺伝子を以下の表にまとめた。

【表2】

【0220】

表２で示されるように、ＸＲＣＣ４と称される遺伝子が、読取りの合計値においてＣＹＣＳおよびＡＰＡＦ１よりも高かった。ｓｇＰＣ７のＮＧＳ分析で示されたＸＲＣＣ４の読取りの合計値（表２）は、ｓｇＰＣ４のＮＧＳ分析で示されたＸＲＣＣ４の読取りの合計値（表１）と比べて、４０倍以上濃縮されたことを示す（図１７）。この結果は、ＸＲＣＣ４が、Ｘｋｒ４の活性化因子として最も有力な候補であることを示す。

【0221】

［実施例４］
カスパーゼ切断型ＸＲＣＣ４によるＸｋｒ４の調節
実施例３において、Ｘｋｒ４の活性化因子として示された上位３つの候補遺伝子に対するｓｇＲＮＡを導入したＰＬＢ細胞に対してＳＴＳによるアポトーシス刺激を与え、前記細胞におけるカスパーゼ３活性およびＰＣ取込みに対する影響を調べた（図１８）。ＸＲＣＣ４に対するｓｇＲＮＡを用いても、前記細胞におけるカスパーゼ３活性に対する影響は観察されなかった（図１８（ａ）上段および図１８（ｂ）上段）。ＣＹＣＳまたはＡＰＡＦ１に対するｓｇＲＮＡを用いた場合、前記細胞におけるカスパーゼ３活性が低下した（図１８（ｃ）上段および図１８（ｄ）上段）。これらの結果は、アポトーシス過程において、ＣＹＣＳおよびＡＰＡＦ１はカスパーゼ３よりも上流に影響を及す因子であり、ＸＲＣＣ４はカスパーゼ３よりも下流に影響を及ぼす因子であることを示す。前記３つの遺伝子に対するｓｇＲＮＡを用いた場合、前記細胞におけるＰＣ取込みは低下した（図１８（ａ）～（ｄ）下段）。これらの結果は、ＸＲＣＣ４は、アポトーシス過程においてカスパーゼ３よりも下流において影響を及ぼし、結果的に脂質スクランブル活性に影響を及ぼす因子であることを示す。

【0222】

アポトーシス刺激を受けた細胞におけるＰＣ取込みに対するＸＲＣＣ４の影響を調べるために、ＸＲＣＣ４ノックアウトＰＬＢ細胞（ＸＲＣＣ４^－／－細胞）を調製した（図１９（ａ））。調製したＸＲＣＣ４^－／－細胞がＸＲＣＣ４を発現していないことは、坑ＣＡＤ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより確認した（図１９（ｂ））。ＸＲＣＣ４は、アミノ酸２６５（文献１６、１７）にカスパーゼ－３の切断部位を有し、アポトーシス刺激により切断される。この切断部位の２つのアスパラギン酸をアラニンとする変異（２ＤＡ）により、カスパーゼによる切断に対して耐性となる（図１９（ｃ）上段、ＸＲＣＣ４ ２ＤＡ（ＳＴＳ ＋））。前記ＸＲＣＣ４^－／－細胞を、野生型のＸＲＣＣ４（ＷＲＣＣ４ ＷＴ）またはカスパーゼ非切断型のＸＲＣＣ４（ＸＲＣＣ４ ２ＤＡ）をコードする遺伝子を有するプラスミドを用いてトランスフェクトした。得られたトランスフェクタントに対してＳＴＳによるアポトーシス刺激を与え、前記トランスフェクタントにおけるＰＣ取込みに対する影響を、ＮＢＤ－ＰＣを用いた脂質スクランブルアッセイにより調べた（図２０（ａ）～（ｃ））。ＸＲＣＣ４^－／－細胞では、ＳＴＳによるアポトーシス刺激後のＰＣ取込みは観察されなかった（図２０（ａ））。ＸＲＣＣ４ ＷＴを発現するＸＲＣＣ４^－／－細胞では、ＳＴＳによるアポトーシス刺激後のＰＣ取込みが観察された（図２０（ｂ））。これらの結果は、ＸＲＣＣ４がアポトーシス刺激による脂質スクランブル活性に関与することを示す。ＸＲＣＣ４ ２ＤＡを発現するＸＲＣＣ４^－／－細胞では、ＳＴＳによるアポトーシス刺激後のＰＣ取込みは観察されなかった（図２０（ｃ））。この結果は、カスパーゼによるＸＲＣＣ４の切断が、アポトーシス刺激によるＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節することを示す。

【0223】

恒常的な脂質スクランブル活性を与える点突然変異（Ｑ３２２Ｅ）を有するＣ末端切断型Ｘｋｒ４変異体（Ｘｋｒ４ΔＣ Ｑ３２２Ｅ）を発現するＰＬＢ細胞に、ＸＲＣＣ４およびＣＹＣＳに対するｓｇＲＮＡを導入した。前記細胞に対してＳＴＳによるアポトーシス刺激を与え、前記細胞におけるＰＣ取込みに対する影響を調べた（図２０（ｅ）～（ｆ））。ＸＲＣＣ４に対するｓｇＲＮＡおよびＣＹＣＳに対するｓｇＲＮＡのいずれを用いても、前記細胞におけるＰＣ取込みに影響はなかった。これらの結果は、カスパーゼによるＸＲＣＣ４の切断が、アポトーシス刺激によるＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節するとの上記示唆を裏付ける。また、これらの結果は、Ｘｋｒ４ΔＣにおいて恒常的な脂質スクランブル活性を与える点突然変異は、アポトーシス刺激による脂質スクランブル活性におけるＸＲＣＣ４の関与を回避できることを示す。

【0224】

Ｎ末端にＶ５をタグ付けしたＸｋｒ４、Ｘｋｒ８およびＸｋｒ８を発現するコードするプラスミドを用いてＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞をトランスフェクトし、各Ｘｋｒを発現するトランスフェクタントを作製した。さらに、ＸＲＣＣ４ ＷＴ－ＲＦＰを発現すようにトランスフェクトし、各ＸｋｒおよびＸＲＣＣ４ ＷＴを共発現するトランスフェクタントを作製した。ＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞（ＸＲＣＣ４^－／－）、各Ｘｋｒを発現するトランスフェクタント、および各ＸｋｒおよびＸＲＣＣ４ ＷＴを共発現するトランスフェクタントの全細胞ライセートを調製し、前記細胞ライセートをＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングに適用した。ウェスタンブロッティングでは、抗Ｖ５抗体（図２１上段）および抗ＲＦＰ抗体（図２１中段）を用いた。図２１は、所定のトランスフェクトが調製されたことを示す。

【0225】

作製した前記トランスフェクタントについて脂質スクランブルアッセイを行った（図２２）。ＳＴＳによるアポトーシス刺激により、試験したすべてのトランスフェクトでカスパーゼ３活性が観察された（図２２（ｇ）～（ｌ））。ＸＲＣＣ４をノックアウトしたＰＬＢ細胞においてＸｋｒ４を発現させて、ＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えても、ＰＣ取込みは観察されなかった（図２２（ａ））。さらにＸＲＣＣ４ ＷＴを発現させると、ＰＣ取込みが観察された（図２２（ｄ））。これらの結果は、カスパーゼによるＸＲＣＣ４の切断が、アポトーシス刺激によるＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節するとの上記示唆を裏付ける。

【0226】

Ｘｋｒ４に変えて、Ｘｋｒ８またはＸｋｒ９を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞では、ＸＲＣＣ４ ＷＴを共発現させていなくても、ＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えると、ＰＣ取込みが観察された（図２２（ｂ）および（ｃ））。これらの結果は、アポトーシス刺激による脂質スクランブル活性を調節において、カスパーゼによるＸＲＣＣ４の切断はＸｋｒ４に特異的な活性化因子であることを示す。

【0227】

ＸＲＣＣ４は、核内のＤＮＡ修復複合体の構成要素である（文献１８、１９）。Ｃ末端にＲＦＰをタグ付けしたＸＲＣＣ４ ＷＴ（ＸＲＣＣ４ ＷＴ－ＲＦＰ）を発現するトランスフェクタントにおいて、ＸＲＣＣ４は核内にのみ観察された（図２３（ａ）上段）。ＸＲＣＣ４ ＷＴ－ＲＦＰを発現する前記トランスフェクタントにＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えた場合、ＸＲＣＣ４は細胞質にも観察された（図２３（ａ）下段）。Ｎ末端にＲＦＰをタグ付けしたＸＲＣＣ４ ＷＴ（ＲＦＰ－ＷＲＣＣ４ ＷＴ）を発現するトランスフェクタントでは、ＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えても、ＸＲＣＣ４は核内にのみ観察された（図２３（ｂ））。これらの結果は、ＸＲＣＣ４は、アポトーシス刺激により切断され、Ｃ末端断片が細胞質に拡散したことを示す。

【0228】

Ｃ末端またはＮ末端にＲＦＰをタグ付けしたカスパーゼ非切断型のＸＲＣＣ４（ＸＲＣＣ４ ２ＤＡ－ＲＦＰまたはＲＧＰ－ＸＲＣＣ４ ２ＤＡ）を発現するトランスフェクタントでは、アポトーシスを与えても（ＳＴＳ＋）与えなくても（ＳＴＳ－）、ＸＲＣＣ４は細胞内にのみ観察された（図２３（ｃ）および（ｄ））。カスパーゼ非切断型のＸＲＣＣ４ ２ＤＡは、ＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えても、切断されず（図２４（ａ）左から４番目のレーン）、ＰＣ取込みも生じなかった（図２４（ｃ））。ＸＲＣＣ４ ＷＴは、ＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えると、切断され（図２４（ａ）左から２番目のレーン）、ＰＣ取込みが生じた（図２４（ｂ））。これらの結果は、アポトーシス刺激によるＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を調節するのに、カスパーゼによって生じたＸＲＣＣ４のＣ末端断片が核内から細胞質に拡散することが重要であることを示す。

【0229】

［実施例５］
細胞質のＸＲＣＣ４断片によるＸｋｒ４の調節
ＸＲＣＣ４／Ｎは、二量体化ドメインおよびＤＮＡ修復タンパク質の結合ドメインとして機能する（文献１８、２０、２１）（図２５）。Ｘｋｒ４を調節するＸＲＣＣ４の最小領域を決定するために、全長の野生型ＸＣＣＲ４（１－３３６）からＮ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４の欠失変異体（１１６－３３６、１５６－３３６、２０４－３３６、２４８－３３６、２５６－３３６および２２６－３３６（ΔＮ）、Ｃ末端が部分的に欠失したＸＲＣＣ４の欠失変異体（１－３０５、１－２８５および１－２６５（ΔＣ））、および短鎖長のＸＲＣＣ４断片（Ｍｉｎｉ）を発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞を作製した。前記細胞に対して、脂質スクランブルアッセイを行った（図２６）。カスパーゼ切断部位（アミノ酸２６５位と２６６位との間）よりＮ末端側の１０アミノ酸を含むＸＲＣＣ４／２５６－３３６は、ＰＣ取込みを示した（図２６（ｇ）、図２７（ａ））。カスパーゼ切断部位よりＮ末端側のＸＲＣＣ４／Ｎと比較して、カスパーゼ切断部位よりＣ末端側のＸＲＣＣ４／Ｃには、天然変性領域を有する既知の結合パートナーはなかった（図２７（ｂ））。ＸＲＣＣ４／１－２８５は、カスパーゼ切断部位よりＣ末端側の２０アミノ酸しか含んでいないが、ＰＣ取込みを示した（図２６（ｊ）、図２７（ｃ））。カスパーゼ切断型ΔＮは完全なＰＣ取込みを示さなかった（図２６（ｈ））。カスパーゼ切断型ΔＣはＰＣ取込みを示さなかった（図２６（ｋ））。これらの結果は、切断されたＸＲＣＣ４のＣ末端断片においてアミノ酸２６６位のイソロイシンが露出される必要があることを示す。実際、ＸＲＣＣ４／２５６－２８５（Ｍｉｎｉ）（カスパーゼ切断部位よりＣ末端側の２０アミノ酸とＮ末端側の１０アミノ酸を含む）は、ＰＣ取込みを示した（図２６（ｌ）、図２７（ｆ））。これらの結果は、アミノ酸２５６位－２８５位の配列を含むＸＲＣＣ４のＣ末端断片がアポトーシス刺激によるＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘導するのに十分であることを示す。

【0230】

ＸＲＣＣ４／２５６－２８５（Ｍｉｎｉ）のうち、アポトーシス刺激によるＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘導するアミノ酸配列を調べるために、より短いペプチド断片を調製した。ＸＲＣＣ４のアミノ酸２６６位～２８５位の２０アミノ酸長からなるペプチド（Ｃ２０）およびＣ２０のＮ末端にメチオニンをさらに含むペプチド（Ｃ２１）を人工的に合成した（図２８（ａ））。合成ペプチドＣ２０またはＣ２１を、Ｘｋｒ４ ＷＴまたはＸｋｒ４ΔＣを発現するＢＤＫＯ細胞にエレクトロポレーションにて導入し、ＰＳ露出アッセイを行った（図２８（ｂ）および（ｃ））。合成ペプチドＣ２０およびＸｋｒ４ΔＣとの組合せにおいてＰＳ露出が観察された。この結果は、ＸＲＣＣ４のアミノ酸２６６位～２８５位の配列を含むペプチドがアポトーシス刺激によるＸｋｒ４の脂質スクランブル活性を誘導するのに十分であることを示す。

【0231】

さらに、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、合成ペプチドＣ２０におけるＸｋｒ４を調節するための重要なアミノ酸残基を決定するために、ＸＲＣＣ４中の正に帯電したアミノ酸残基（２７０位のアルギニン、２７１位のリジン、２７２位のアルギニン、２７３位のアルギニンおよび２７５位のアルギニン）をアラニンに置換したペプチド Ｃ２０－Ｒ２７０Ａ、Ｃ２０－Ｋ２７１Ａ、Ｃ２０－Ｒ２７２Ａ、Ｃ２０－Ｒ２７３ＡおよびＣ２０－Ｒ２７５Ａを調製した。ＸＲＣＣ４断片の変異体 Ｃ２０－Ｒ２７０Ａ、Ｃ２０－Ｋ２７１Ａ、Ｃ２０－Ｒ２７２ＡおよびＣ２０－Ｒ２７３Ａは細胞質に分布し（図２９（ａ～ｅ））、ＸＲＣＣ４断片の変異体 Ｃ２０－Ｒ２７５Ａは核内に分布した（図２９（ｆ））。前記ＸＲＣＣ４断片の変異体をコードするプラスミドを用いてＶ５－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞をトランスフェクトし、ＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えた。ＸＲＣＣ４断片の変異体 Ｃ２０－Ｋ２７１Ａ、Ｃ２０－Ｒ２７２Ａ、Ｃ２０－Ｒ２７３ＡおよびＣ２０－Ｒ２７５ＡではＰＣ取込み活性が観察され（図３０（ｃ～ｆ）、図３１（ａ））、ＸＲＣＣ４断片の変異体 Ｃ２０－Ｒ２７０ＡではＰＣ取込み活性は観察されなかった（図３０（ｂ）、図３１（ａ））。これらの結果は、ＸＲＣＣ４断片の核での分布は脂質スクランブル活性に必要ではないことを示す。ＸＲＣＣ４断片の変異体 Ｃ２０－Ｒ２７０ＡはＸｋｒ４を完全に活性化しなかった（図３１（ｂ））。この結果は、２７０位のアルギニン残基がＸｋｒ４を調節するのに重要であることを示す。

【0232】

［実施例６］
Ｘｋｒ４とＸＲＣＣ４のＣ末端断片との直接的な結合
Ｘｋｒ４が細胞質のＸＲＣＣ４断片によってどのように活性化されるかを調べるために、ＳＰＯＴおよびＦＬＡＧタグを融合したＸｋｒ４ΔＣ（ＳＰＯＴ－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧ）を、ＸＲＣＣ４ ＷＴまたはＸＲＣＣ４ Ｒ２７０Ａを発現するＸＲＣＣ４ ＫＯ ＰＬＢ細胞で発現させた（図３２（ａ））。期待されたように、ＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えた場合、ＳＰＯＴ－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧは、ＸＲＣＣ４ ＷＴとの組合せにより、脂質スクランブル活性を効率的に誘発し（図３２（ｂ）上段）、一方、ＸＲＣＣ４ Ｒ２７０Ａとの組合せでは、脂質スクランブル活性を十分に誘発しなかった（図３２（ｂ）下段）。

【0233】

前記細胞の細胞膜ライセートを調製し、前記細胞膜ライセートを、抗ＳＰＯＴナノボディを用いた免疫沈降に適用し、質量分析にかけた。この質量分析により、坑ＳＰＯＴナノボディを用いた免疫沈降によって回収されたＳＰＯＴ－Ｘｋｒ４ΔＣ－ＦＬＡＧに会合していたペプチドが同定されることが期待される。ラベルフリー定量は、ＸＲＣＣ４ ＷＴが最も信頼性の高いアポトーシス依存性のＸｋｒ４相互作用物質の１つであることを明らかにした（図３３）。ＸＲＣＣ４／Ｃの２つの隣接するトリプシン消化ペプチド１（アミノ酸２８６位～２９６位：ＭＡＰＱＥＮＱＬＱＥＫ（配列番号４０））およびペプチド２（アミノ酸２９７位～３１０位：ＥＮＳＲＰＤＳＳＬＰＥＴＳＫ（配列番号４１））が質量分析により同定された（図３４（ａ））。並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を用いた標的定量（targeted quantification）は、前記２つのペプチドが、ＸＲＣＣ４ ＷＴを発現する細胞にＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えた後に、増加したことを示す（図３４（ｂ～ｅ））。

【0234】

ＸＲＣＣ４ ＷＴ由来のペプチド断片とＸｋｒ４との相互作用は、ＳＴＳによるアポトーシス刺激を与えた細胞からの全細胞ライブラリーを、Ｘｋｒ４免疫沈降して得られた沈殿物を、ＸＲＣＣ４を検出するウェスタンブロッティングにより確認した（図３５（ａ））。前記相互作用をインタクト細胞において確認するために、蛍光ＴＭＲをコンジュゲートしたＣ２０ペプチド（Ｃ２０－ＴＭＲ）をエレクトロポレーションによりＸｋｒ４ ＷＴ－ＧＦＰまたはＸｋｒ４ΔＣ－ＧＦＰを発現するＨＣＴ１１６細胞に導入し、導入したＣ２０－ＴＭＲとＸｋｒ４ ＷＴ－ＧＦＰまたはＸｋｒ４ΔＣ－ＧＦＰとの局在を観察した（図３５（ｂ）および（ｃ））。ＧＦＰ由来の蛍光強度はＸｋｒ４の細胞内の分布を反映する。図３５（ｃ）中段および下段におけるＧＦＰ由来の蛍光強度におけるピークは、細胞膜を反映する。図３５（ｄ）下段は、Ｃ２０－ＴＥＭ由来の蛍光強度のピークと、Ｘｋｒ４ΔＣ－ＧＦＰ由来の蛍光強度のピークとが重なることを示す。この結果は、各タンパク質ＸＲＣＣ４のペプチド断片が、細胞死の過程にある細胞において原形質膜タンパク質であるＸｋｒ４と直接会合することによって、脂質スクランブル活性を誘導することを示す。

【0235】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

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【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【配列表】

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