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特開2022-70994幹細胞の培養及び治療のための培地、方法、細胞、及び分泌因子

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022070994

(43)【公開日】2022-05-13

(54)【発明の名称】幹細胞の培養及び治療のための培地、方法、細胞、及び分泌因子

(51)【国際特許分類】

C12N 5/0775 20100101AFI20220506BHJP

A61K 35/28 20150101ALI20220506BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20220506BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20220506BHJP

A61P 1/04 20060101ALI20220506BHJP

A61P 11/00 20060101ALI20220506BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20220506BHJP

A61P 37/02 20060101ALI20220506BHJP

C12N 15/117 20100101ALN20220506BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0775

A61K35/28

A61P35/00

A61P29/00

A61P1/04

A61P11/00

A61P25/00

A61P37/02

C12N15/117 Z

【審査請求】有

【請求項の数】19

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022023751

(22)【出願日】2022-02-18

(62)【分割の表示】P 2018551264の分割

【原出願日】2017-03-30

(31)【優先権主張番号】62/316,131

(32)【優先日】2016-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】503235673

【氏名又は名称】サンバイオ，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤和彦

(72)【発明者】

【氏名】ベタンコート，アライン・エム

(72)【発明者】

【氏名】ウォーターマン，ルース・エス

(72)【発明者】

【氏名】イセット，トーマス・エフ

(57)【要約】

【課題】無投薬多能性幹細胞であり、いくつかの実施形態においては間葉幹細胞を炎症及び免疫を選択的促進又は抑制する個別の多能性タイプ１又はタイプ２の細胞表現型に誘発、活性化、又は起爆することを目的とした、新規の培養培地組成、幹細胞培養方法、及び治療方法を提供すること。
【解決手段】本明細書では、多能性幹細胞において極性化を誘発するのに有用な方法及び培養培地について記載する。さらに、本明細書では、本開示の方法及び培養培地によって作成された、有用な治療薬である多能性細胞について記載する。また、本明細書では、本開示の方法及び培養培地によって作成された、有用な治療薬である多能性細胞によって分泌された細胞外小胞及び因子についても記載する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成するための培地であって、
ａ．Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドと、
ｂ．第２の誘発剤とを含み、前記第２の誘発剤は、異なるＴｏｌｌ様受容体リガンド、神経伝達物質、神経伝達物質様分子、非エリスロポエチンポリペプチド、又は脂質を含む培地。

【請求項2】

前記第２の誘発剤は、ヒスタミン、アセチルコリン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン、メラトニン、リポキシンＡ４、α－メラニン細胞刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、及びロイコトリエンＢ４からなるリストより選択される請求項１に記載の培地。

【請求項3】

ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ（Ａ：Ｕ）、又はこれらの組み合わせを含む請求項１又は２に記載の培地。

【請求項4】

ｉ）低酸素条件、ｉｉ）低酸素模倣、ｉｉｉ）エリスロポエチン、又はｉｖ）これらｉ）、ｉｉ）、又はｉｉｉ）の任意の組み合わせをさらに含む請求項１～３のいずれか一項に記載の培地。

【請求項5】

前記低酸素模倣は、塩化コバルト、デスフェリオキサミン、又はこれらの組み合わせを含む請求項４に記載の培地。

【請求項6】

多能性幹細胞集団をさらに含む請求項１～５のいずれか一項に記載の培地。

【請求項7】

前記多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団を含む請求項６に記載の培地。

【請求項8】

非刺激多能性幹細胞集団に比してＣＸＣＬ９ｍＲＮＡの２０倍超の誘発を生じる請求項１～７のいずれか一項に記載の培地。

【請求項9】

非刺激多能性幹細胞集団において、ｍｉＲ－Ｌｅｔ７ａ／ｄ、ｍｉＲ－１７＿１、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－９２ａ、及びｍｉＲ－１２６０ａからなるリストより選択されるいずれか１つのｍｉＲＮＡの２倍超の誘発を生じる請求項１～７のいずれか一項に記載の培地。

【請求項10】

多能性幹細胞集団であって、請求項１～９のいずれか一項の前記培地から採取された多能性幹細胞集団。

【請求項11】

前記多能性細胞集団は、間葉細胞集団を含む請求項１０に記載の多能性幹細胞集団。

【請求項12】

前記多能性細胞集団は、基本的に、間葉細胞集団からなる請求項１０に記載の多能性幹細胞集団。

【請求項13】

炎症性又は自己免疫性の疾患の処置において使用される請求項１０～１２のいずれかに記載の多能性幹細胞集団。

【請求項14】

炎症性又は自己免疫性の疾患を処置する方法であって、
請求項１～９のいずれか一項の前記培地から採取された免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を、治療効果のある量、被験者に投与することを含む方法。

【請求項15】

非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成する方法であって、前記非刺激多能性幹細胞集団を請求項１～９のいずれか一項に記載の前記培地に接触させることを含む方法。

【請求項16】

前記多能性幹細胞集団は、間葉細胞集団を含む請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記多能性幹細胞集団は、基本的に、間葉細胞集団からなる請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を、治療効果のある量、被験者に投与することをさらに含む請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

細胞外小胞を作成する方法であって、非刺激多能性幹細胞集団を請求項１～９のいずれか一項に記載の前記培地に接触させることを含む方法。

【請求項20】

前記非刺激多能性幹細胞は、間葉幹細胞集団を含む請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記非刺激多能性幹細胞は、基本的に、間葉幹細胞集団からなる請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記細胞外小胞は、前記培地から分離及び／又は精製される請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成する培地であって、
ａ．Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドと、
ｂ．第２の誘発剤とを含み、前記第２の誘発剤は、異なるＴｏｌｌ様受容体リガンド、神経伝達物質、神経伝達物質様分子、非エリスロポチンポリペプチド、又は脂質である培地。

【請求項24】

前記第２の誘発剤は、ヒスタミン、アセチルコリン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン、メラトニン、リポキシンＡ４、αメラニン細胞刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、及びロイコトリエンＢ４からなるリストより選択される請求項２３に記載の培地。

【請求項25】

前記ＴＬＲ４リガンドは、リポ多糖体又はアミノアルキルグルコサミニド４－ホスフェートを含む請求項２３又は２４に記載の培地。

【請求項26】

ｉ）低酸素条件、ｉｉ）低酸素模倣、ｉｉｉ）エリスロポエチン、又はｉｖ）これらｉ）、ｉｉ）、又はｉｉｉ）の任意の組み合わせをさらに含む請求項２３～２５のいずれか一項に記載の培地。

【請求項27】

前記低酸素模倣は、塩化コバルト、デスフェリオキサミン、又はこれらの組み合わせを含む請求項２６に記載の培地。

【請求項28】

多能性幹細胞集団をさらに含む請求項２３～２７のいずれか一項に記載の培地。

【請求項29】

前記多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団を含む請求項２８に記載の培地。

【請求項30】

非刺激多能性幹細胞集団に比してＴＮＦＳＦ１０ｍＲＮＡの２０倍超の誘発を生じる請求項２３～２９のいずれかに記載の培地。

【請求項31】

非刺激多能性幹細胞集団において、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１３０５、ｍｉＲ－５７５、及びｍｉＲ－１９７３からなるリストより選択されるいずれか１つのｍｉＲＮＡの２倍超の誘発を生じる請求項２３～２９に記載の培地。

【請求項32】

多能性又は間葉幹細胞集団であって、
請求項２３～３１のいずれか一項に記載の培地から採取される多能性幹細胞集団。

【請求項33】

前記多能性幹細胞集団は、間葉細胞集団を含む請求項３２に記載の多能性幹細胞集団。

【請求項34】

前記多能性幹細胞集団は、基本的に、間葉細胞集団からなる請求項３２に記載の多能性幹細胞集団。

【請求項35】

腫瘍又は癌の処置に使用される請求項３２～３４のいずれか一項に記載の多能性幹細胞集団。

【請求項36】

腫瘍又は癌の処置方法であって、請求項２３～３１のいずれか一項に記載の培地から採取された多能性幹細胞集団を、治療効果のある量、被験者に投与することを含む方法。

【請求項37】

前記多能性幹細胞集団は、間葉細胞集団を含む請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記多能性幹細胞集団は、基本的に、間葉細胞集団からなる請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成する方法であって、前記非刺激多能性幹細胞集団を請求項２３～３１のいずれか一項に記載の前記培地に接触させることを含む方法。

【請求項40】

前記多能性幹細胞集団は、間葉細胞集団を含む請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記多能性幹細胞集団は、基本的に、間葉細胞集団からなる請求項３９に記載の方法。

【請求項42】

前記免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を、治療効果のある量、被験者に投与することをさらに含む請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

細胞外小胞を作成する方法であって、多能性幹細胞集団を請求項２３～３１のいずれか一項に記載の前記培地に接触させることを含む方法。

【請求項44】

前記多能性幹細胞は、間葉幹細胞集団を含む請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記多能性幹細胞は、基本的に、間葉幹細胞集団からなる請求項４３に記載の方法。

【請求項46】

前記細胞外小胞は、前記培地から分離及び／又は精製される請求項４３～４５に記載の方法。

【請求項47】

分離精製細胞外小胞であって、グルセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、結合プラコグロビン（ＪＵＰ）、デスモプラキン（ＤＳＰ）、モエシン（ＭＳＮ）、ビメンチン（ＶＩＭ）、アクチン（ＡＣＴＢ）、又はアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）タンパク質、又はこれらの一部のうちの１つ以上を高いレベルで含み、前記高いレベルとは、無投薬非刺激間葉幹細胞との比較である分離精製細胞外小胞。

【請求項48】

グルセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、結合プラコグロビン（ＪＵＰ）、デスモプラキン（ＤＳＰ）、モエシン（ＭＳＭ）、ビメンチン（ＶＩＭ）、アクチン（ＡＣＴＢ）、又はアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のうちのいずれか２つ以上を高いレベルで含む請求項４７に記載の分離精製細胞外小胞。

【請求項49】

グルセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、結合プラコグロビン（ＪＵＰ）、デスモプラキン（ＤＳＰ）、モエシン（ＭＳＮ）、ビメンチン（ＶＩＭ）、アクチン（ＡＣＴＢ）、又はアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のうちの７つ全てを高いレベルで含む請求項４７又は４８に記載の分離精製細胞外小胞。

【請求項50】

薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又はキャリアをさらに含む請求項４７～４９に記載の分離精製細胞外小胞。

【請求項51】

腫瘍又は癌を罹患した被験者の処置に使用される請求項４７～５０に記載の分離精製細胞外小胞。

【請求項52】

被験者の癌又は腫瘍を処置する方法であって、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の分離精製細胞外小胞を、治療効果のある量、投与することを含む方法。

【請求項53】

分離精製細胞外小胞であって、
ｍｙｏｓｉｎ－１（ＭＹＨ１）、ｍｙｏｓｉｎ－２（ＭＴＨ２）、ｍｙｏｓｉｎ－７（ＭＹＨ－７）、又は組織因子経路阻害物質２（ＴＦＰＩ２）タンパク質、又はこれらの一部のうちのいずれか１つ以上を高いレベルで含み、
前記高いレベルとは、無投薬非刺激間葉幹細胞との比較である分離精製細胞外小胞。

【請求項54】

ｍｙｏｓｉｎ－１（ＭＹＨ１）、ｍｙｏｓｉｎ－２（ＭＴＨ２）、ｍｙｏｓｉｎ－７（ＭＹＨ－７）、又は組織因子経路阻害物質２（ＴＦＰＩ２）のうちのいずれか２つ以上を高いレベルで含む請求項５３に記載の分離精製細胞外小胞。

【請求項55】

ｍｙｏｓｉｎ－１（ＭＹＨ１）、ｍｙｏｓｉｎ－２（ＭＴＨ２）、ｍｙｏｓｉｎ－７（ＭＹＨ－７）、又は組織因子経路阻害物質２（ＴＦＰＩ２）のうちの４つ全てを高いレベルで含む請求項５３又は５４に記載の分離精製細胞外小胞。

【請求項56】

薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又はキャリアをさらに含む請求項５３～５５にいずれか一項に記載の分離精製細胞外小胞。

【請求項57】

腫瘍又は癌を罹患した被験者の処置に使用される請求項５３～５６のいずれか一項に記載の分離精製細胞外小胞。

【請求項58】

被験者の癌又は腫瘍を処置する方法であって、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の前記分離精製細胞外小胞を、治療効果のある量、投与することを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

多能性幹細胞及び間葉幹細胞は、Ｔｏｌｌ様受容体の選択的刺激により、無投薬又は非刺激状態から炎症誘発（タイプ１）又は抗炎症（タイプ２）表現型に誘発可能である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0002】

本開示は、無投薬多能性幹細胞であり、いくつかの実施形態においては間葉幹細胞を炎症及び免疫を選択的促進又は抑制する個別の多能性タイプ１又はタイプ２の細胞表現型に誘発、活性化、又は起爆することを目的とした、新規の培養培地組成、幹細胞培養方法、及び治療方法を提供する。従って、本開示は、免疫系の炎症反応の変調が望ましい（例えば、癌、視神経炎）有用な処置を提供する。従来の方法と比べて、本発明において、細胞は、より効率的に病変部位に移動してより高いレベルで抗炎症サイトカインを一貫して発現する同質タイプ２集団に導入されてもよく、このため細胞の効能及び有効性がより高くなることが期待される。従来の方法と比べて、本発明において、細胞は、独自の炎症誘発特性を備えて、腫瘍壊死に繋がるあるサイトカインが一貫してより高く発現し、腫瘍内微小環境に効率的に移動する能力を備えた同質タイプ１集団に誘発されてもよく、このため細胞の安全性、効能、及び有効性がより高くなることが期待される。

【課題を解決するための手段】

【0003】

本開示は、炎症及び免疫を選択的に促進又は抑制するために個別の均一な細胞表現型を導入、極性化、活性化、又は起爆することを目的とした新規の幹細胞培養及び治療方法と、培養培地組成とを提供し、細胞ベース治療において使用される既知の培養培地及び方法を上回る顕著な効果を提供する。当該方法及び培地組成は、細胞ベース治療のために使用可能であり、より均一且つ予測可能であり、生体外増殖され、誘発、極性化、活性化、又は起爆された多能性幹細胞の集団を提供するために使用可能である。本開示の種々の実施形態の効果は、患者への導入に際して、予測可能に挙動する均一且つ個別の表現型に多能性幹細胞の培養を誘発、極性化、活性化、又は起爆するために使用できることである。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、間葉幹細胞である。

【0004】

本開示はまた、副産物を生じることを目的とした、新規の幹細胞培養、治療方法、及び培地組成の副産物も提供する。ある実施形態において、副産物は、本開示の新規の幹細胞培養方法及び組成を使用した多能性幹細胞によって作成された馴化媒質である。ある実施形態において、副産物は、本開示の新規の幹細胞培養方法及び組成を使用した多能性幹細胞によって作成された細胞外小胞である。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、間葉幹細胞である。

【0005】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成するための培地であって、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドと、第２の誘発剤とを含み、第２の誘発剤は、異なるＴｏｌｌ様受容体リガンド、神経伝達物質、神経伝達物質様分子、非エリスロポエチンポリペプチド、又は脂質を含む培地について記載する。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ヒスタミン、アセチルコリン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン、メラトニン、リポキシンＡ４、α－メラニン細胞刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、及びロイコトリエンＢ４からなるリストより選択される。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ（Ａ：Ｕ）、又はこれらの組み合わせを含む。ある実施形態において、当該培地は、ｉ）低酸素条件、ｉｉ）低酸素模倣、ｉｉｉ）エリスロポエチン、又はｉｖ）これらｉ）、ｉｉ）、又はｉｉｉ）の任意の組み合わせをさらに含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルト、デスフェリオキサミン、又はこれらの組み合わせを含む。ある実施形態において、培地は、多能性幹細胞集団をさらに含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団を含む。ある実施形態において、当該培地は、非刺激多能性幹細胞集団に比してＣＸＣＬ９ｍＲＮＡの２０倍超の誘発を生じる。ある実施形態において、当該培地は、非刺激多能性幹細胞集団に比して、ｍｉＲ－Ｌｅｔ７ａ／ｄ、ｍｉＲ－１７＿１、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－９２ａ、及びｍｉＲ－１２６０ａからなるリストより選択されるいずれか１つのｍｉＲＮＡの２倍超の誘発を生じる。ある実施形態において、多能性幹細胞集団であって、当該培地から採取される。ある実施形態において、多能性細胞集団は、間葉細胞集団からなる。ある実施形態において、多能性細胞集団は、基本的に、間葉細胞集団からなる。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、炎症性又は自己免疫の疾患の処置において使用されるものである。ある実施形態において、炎症性又は自己免疫性の疾患を処置する方法であって、本段落に記載の培地から採取された免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を、治療効果のある量、被験者に投与することを含む。ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成する方法であって、非刺激多能性幹細胞集団を本段落に記載の培地に接触させることを含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉細胞集団を含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、基本的に、間葉細胞集団からなる。ある実施形態において、当該方法は、本段落に記載の免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を、治療効果のある量、被験者に投与することをさらに含む。本明細書に記載のある実施形態において、細胞外小胞を作成する方法であって、非刺激多能性幹細胞集団を本段落に記載の培地に接触させることを含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団を含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、基本的に、間葉幹細胞集団からなる。ある実施形態において、細胞外小胞は、培地から分離及び／又は精製される。

【0006】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成する培地であって、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドである第１の誘発剤と、第２の誘発剤とを備え、第２の誘発剤は、第１の誘発剤とは異なるＴｏｌｌ様受容体リガンド、神経伝達物質、神経伝達物質様分子、非エリスロポチンポリペプチド、又は脂質である培地について記載する。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ヒスタミン、アセチルコリン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン、メラトニン、リポキシンＡ４、αメラニン細胞刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、及びロイコトリエンＢ４からなるリストより選択される。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、リポ多糖体、アミノアルキルグルコサミニド４－ホスフェート、又はこれらの組み合わせを含む。ある実施形態において、当該培地は、ｉ）低酸素条件、ｉｉ）低酸素模倣、ｉｉｉ）エリスロポエチン、又はｉｖ）これらｉ）、ｉｉ）、又はｉｉｉ）の任意の組み合わせをさらに含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルト、デスフェリオキサミン、又はこれらの組み合わせを含む。ある実施形態において、当該培地は、多能性幹細胞集団をさらに含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団を含む。ある実施形態において、培地は、非刺激多能性幹細胞集団に比してＴＮＦＳＦ１０ｍＲＮＡの２０倍超の誘発を生じる。ある実施形態において、培地は、非刺激間葉幹細胞集団におけるよりも、ｍiＲ－１４６、ｍiＲ－１５５、ｍiＲ－１３０５、ｍiＲ－５７５、及びｍiＲ－１９７３から選択されるいずれか１つのｍiＲＮＡを２倍超の誘発を生じる。本明細書のある実施形態において、多能性幹細胞集団であって、本段落に開示される当該培地から採取される。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団を含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、基本的に、間葉細胞集団からなる。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、腫瘍又は癌の処置に使用されるものである。本明細書のある実施形態において、腫瘍又は癌の処置方法であって、本段落に開示される培地から採取された多能性幹細胞集団を、治療効果のある量、被験者に投与することを含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉細胞集団を含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、基本的に、間葉細胞集団からなる。本明細書のある実施形態において、非刺激間葉幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成する方法であって、非刺激多能性幹細胞集団を本段落に開示される培地に接触させることを含む方法について記載する。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団を含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、基本的に、間葉幹細胞集団からなる。ある実施形態において、当該方法は、免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を、治療効果のある量、被験者に投与することをさらに含む。本明細書におけるある実施形態において、細胞外小胞を作成する方法であって、多能性幹細胞集団を本段落に開示される培地に接触させることを含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団を含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、基本的に、間葉幹細胞集団からなる。ある実施形態において、細胞外小胞は、培地から分離及び／又は精製される。

【0007】

ある実施形態において、分離精製細胞外小胞であって、グルセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、結合プラコグロビン（ＪＵＰ）、デスモプラキン（ＤＳＰ）、モエシン（ＭＳＮ）、ビメンチン（ＶＩＭ）、アクチン（ＡＣＴＢ）、又はアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）タンパク質、又はこれらの複数の部分のうちのいずれか１つ以上を高いレベルで備え、高いレベルとは、無投薬非刺激間葉幹細胞にあるレベルとの比較である分離精製細胞外小胞について本明細書に記載する。ある実施形態において、当該分離精製細胞外小胞は、グルセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、結合プラコグロビン（ＪＵＰ）、デスモプラキン（ＤＳＰ）、モエシン（ＭＳＭ）、ビメンチン（ＶＩＭ）、アクチン（ＡＣＴＢ）、又はアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のうちのいずれか２つ以上を高いレベルで含む。ある実施形態において、当該分離精製細胞外小胞は、グルセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、結合プラコグロビン（ＪＵＰ）、デスモプラキン（ＤＳＰ）、モエシン（ＭＳＮ）、ビメンチン（ＶＩＭ）、アクチン（ＡＣＴＢ）、及びアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のうちの７つ全てを高いレベルで含む。ある実施形態において、当該分離精製細胞外小胞は、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又はキャリアをさらに含む。ある実施形態において、当該分離精製細胞外小胞は、腫瘍又は癌を罹患した被験者の処置に使用されるものである。ある実施形態において、被験者の癌又は腫瘍を処置する方法であって、本段落に記載の分離精製細胞外小胞を、治療効果のある量、投与することを含む。

【0008】

ある実施形態において、分離精製細胞外小胞であって、ｍｙｏｓｉｎ－１（ＭＹＨ１）、ｍｙｏｓｉｎ－２（ＭＴＨ２）、ｍｙｏｓｉｎ－７（ＭＹＨ－７）、又は組織因子経路阻害物質２（ＴＦＰＩ２）タンパク質、又はこれらの複数の部分のうちのいずれか１つ以上を高いレベルで含み、高いレベルとは、無投薬非刺激間葉幹細胞にあるレベルとの比較である分離精製細胞外について本明細書に記載する。ある実施形態において、当該分離精製細胞外小胞は、ｍｙｏｓｉｎ－１（ＭＹＨ１）、ｍｙｏｓｉｎ－２（ＭＴＨ２）、ｍｙｏｓｉｎ－７（ＭＹＨ－７）、又は組織因子経路阻害物質２（ＴＦＰＩ２）のうちのいずれか２つ以上を高いレベルで含む。ある実施形態において、当該分離精製細胞外小胞は、ｍｙｏｓｉｎ－１（ＭＹＨ１）、ｍｙｏｓｉｎ－２（ＭＴＨ２）、ｍｙｏｓｉｎ－７（ＭＹＨ－７）、及び組織因子経路阻害物質２（ＴＦＰＩ２）のうちの４つ全てを高いレベルで含む。ある実施形態において、当該分離精製細胞外小胞は、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又はキャリアから選択される非活性成分をさらに含む。ある実施形態において、分離精製細胞外小胞は、腫瘍又は癌を罹患した被験者の処置において使用されるものである。ある実施形態において、被験者の癌又は腫瘍を処置する方法であって、本段落に記載の分離精製細胞外小胞を、治療効果のある量、投与することを含む。

【0009】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成するための培地であって、第１及び第２の誘発剤を含み、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドであり、第２の誘発剤は、第１の誘発剤とは異なるＴｏｌｌ様受容体リガンド、神経伝達物質、神経伝達物質様分子、エリスロポエチンでないポリペプチド、又は脂質である培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ヒスタミンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、アセチルコリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、グルタミン酸塩である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ノルエピネフリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、エピネフリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、セロトニンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、メラトニンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、リポキシンＡ４である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、αメラニン細胞刺激ホルモンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ロイコトリエンＢ４である。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）である。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ａ：Ｕである）ある実施形態において、当該培地は、第３の誘発剤をさらに含み、第３の誘発剤は、低酸素条件、低酸素模倣、又はエリスロポエチンを含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルトである。ある実施形態において、低酸素模倣は、デスフェリオキサミンである。ある実施形態において、当該培地は、第４の誘発剤をさらに含み、第４の誘発剤は、第３の誘発剤とは異なり、低酸素条件、低酸素模倣、又はエリスロポエチンを含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルトである。ある実施形態において、低酸素模倣は、デスフェリオキサミンである。ある実施形態において、当該培地は、多能性幹細胞集団をさらに含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、非刺激多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、被刺激多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、被誘発多能性幹細胞である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、成人多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、ヒト多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団である。ある実施形態において、当該培地は、ヒト又は動物由来の血清を含まない。ある実施形態において、当該培地は、非刺激多能性幹細胞に比して被刺激幹細胞集団においてＣＸＣＬ９ｍＲＮＡの２０倍超の誘発を生じることができる。ある実施形態において、当該培地は、非刺激多能性幹細胞に比してＣＸＣＬ９ｍＲＮＡの３０倍超の誘発を生じることができる。ある実施形態において、当該培地は、非刺激多能性幹細胞に比してＣＸＣＬ９ｍＲＮＡの５０倍超の誘発を生じることができる。ある実施形態において、この段落に記載されている免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団は、関節リウマチの処置に使用されるものである。ある実施形態において、この段落に記載されている免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団は、糖尿病性神経障害の処置に使用されるものである。ある実施形態において、この段落に記載されている免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団は、クローン病の処置に使用されるものである。ある実施形態において、この段落に記載されている免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団は、急性肺障害の処置に使用されるものである。ある実施形態において、この段落に記載されている免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団は、多発性硬化症の処置に使用されるものである。ある実施形態において、この段落に記載されている免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団は、急性視神経炎の処置に使用されるものである。ある実施形態において、この段落に記載されている免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団は、クラッベ病の処置に使用されるものである。

【0010】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成するための培地であって、第１及び第２の誘発剤を含み、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドであり、第２に誘発剤は、第１の誘発剤とは異なるＴｏｌｌ様受容体リガンド、神経伝達物質、神経伝達物質様分子、エリスロポエチンでないポリペプチド、又は脂質である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ヒスタミンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、アセチルコリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、グルタミン酸塩である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ノルエピネフリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、エピネフリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、セロトニンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、メラトニンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、リポキシンＡ４である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、αメラニン細胞刺激ホルモンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ロイコトリエンＢ４である。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、ＬＰＳである。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、アミノアルキルグルコサミニド－４－ホスフェートである。ある実施形態において、当該培地は、第３の誘発剤をさらに含み、第３の誘発剤は、低酸素条件、低酸素模倣、又はエリスロポエチンを含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルトである。ある実施形態において、低酸素模倣は、デスフェリオキサミンである。ある実施形態において、当該培地は、第４の誘発剤をさらに含み、第４の誘発剤は、第３の誘発剤とは異なり、低酸素条件、低酸素模倣、エリスロポエチンを含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルトである。ある実施形態において、低酸素模倣は、デスフェリオキサミンである。ある実施形態において、当該培地は、多能性幹細胞集団をさらに含む。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、非刺激多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、被刺激多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、被誘発多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、成人多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、ヒト多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団である。ある実施形態において、当該培地は、ヒト又は動物由来の血清を含まない。ある実施形態において、当該培地は、被刺激多能性幹細胞に比して被刺激幹細胞集団においてＴＮＦＳＦ１０ｍＲＮＡの２０倍超の誘発を生じることができる。ある実施形態において、当該培地は、非刺激多能性幹細胞に比してＴＮＦＳＦ１０ｍＲＮＡの３０倍超の誘発を生じることができる。当該培地は、非刺激多能性幹細胞に比してＴＮＦＳＦ１０ｍＲＮＡの５０倍超の誘発を生じることができる。ある実施形態において、この段落に記載されている免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団は、卵巣癌の処置に使用されるものである。ある実施形態において、この段落に記載されている免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団は、乳癌の処置に使用されるものである。

【0011】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成する方法であって、非刺激多能性幹細胞集団を、第１及び第２の誘発剤を含む培地に接触させることを含み、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドであり、第２の誘発剤は、神経伝達物質、エリスロポエチンでないポリペプチド、又は脂質である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ヒスタミンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、アセチルコリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、グルタミン酸塩である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ノルエピネフリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、エピネフリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、セロトニンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、メラトニンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、リポキシンＡ４である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、αメラニン細胞刺激ホルモンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ロイコトリエンＢ４である。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）である。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ａ：Ｕ）である。ある実施形態において、当該培地は、第３の誘発剤をさらに含み、第３の誘発剤は、低酸素条件、低酸素模倣、エリスロポエチン、又はこれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルトである。ある実施形態において、低酸素模倣は、デスフェリオキサミンである。ある実施形態において、当該培地は、第４の誘発剤をさらに含み、第４の誘発剤は、第３の誘発剤とは異なり、低酸素条件、低酸素模倣、エリスロポエチン、又はこれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルトである。ある実施形態において、低酸素模倣は、デスフェリオキサミンである。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、被誘発多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、成人多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、ヒト多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団である。ある実施形態において、当該培地は、ヒト又は動物由来の血清を含まない。ある実施形態において、当該方法は、非刺激多能性幹細胞集団に比して被刺激幹細胞集団においてＣＸＣＬ９ｍＲＮＡの２０倍超の誘発を生じることができる。ある実施形態において、当該方法は、非刺激多能性幹細胞集団に比してＣＸＣＬ９ｍＲＮＡの３０倍超の誘発を生じることができる。ある実施形態において、当該方法は、当該培地は、非刺激多能性幹細胞集団に比してＣＸＣＬ９ｍＲＮＡの５０倍超の誘発を生じることができる。ある実施形態において、前述の方法で作成される極性化多能性幹細胞集団について本明細書に記載する。ある実施形態において、前述の方法で作成される極性化多能性幹細胞集団は、関節リウマチの処置に使用されるものである。ある実施形態において、前述の方法で作成される極性化多能性幹細胞集団は、糖尿病性神経障害の処置に使用されるものである。ある実施形態において、前述の方法で作成される極性化多能性幹細胞集団は、クローン病の処置に使用されるものである。ある実施形態において、前述の方法で作成される多能性幹細胞集団は、急性肺障害の処置に使用されるものである。ある実施形態において、前述の方法で作成される極性化多能性幹細胞集団は、多発性硬化症の処置に使用されるものである。ある実施形態において、前述の方法で作成される極性化多能性幹細胞集団は、急性視神経炎の処置に使用されるものである。ある実施形態において、前述の方法で作成される極性化多能性幹細胞集団は、クラッベ病の処置に使用されるものである。

【0012】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成する方法であって、非刺激多能性幹細胞集団を、第１及び第２の誘発剤を含む培地に接触させることを含み、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドであり、第２の誘発剤は、神経伝達物質、エリスロポエチンでないポリペプチド、又は脂質である方法について本明細書に記載する。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ヒスタミンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、アセチルコリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、グルタミン酸塩である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ノルエピネフリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、エピネフリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、セロトニンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、メラトニンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、リポキシンＡ４である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、αメラニン細胞刺激ホルモンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ロイコトリエンＢ４である。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、ＬＰＳである。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、アミノアルキルグルコサミニド４－ホスフェートである。ある実施形態において、当該培地は、第３の誘発剤をさらに含み、第３の誘発剤は、低酸素条件、再酸素模倣、エリスロポエチン、又はこれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルトである。ある実施形態において、低酸素模倣は、デスフェリオキサミンである。ある実施形態において、当該培地は、第４の誘発剤をさらに含み、第４の誘発剤は、第３の誘発剤とは異なり、低酸素条件、低酸素模倣、エリスロポエチン、又はこれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルトである。ある実施形態において、低酸素模倣は、デスフェリオキサミンである。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、被誘発多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、成人多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、ヒト多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団である。ある実施形態において、当該培地は、ヒト又は動物由来の血清を含まない。ある実施形態において、当該方法は、非刺激多能性幹細胞集団に比して被刺激幹細胞集団においてＴＮＦＳＦ１０ｍＲＮＡの２０倍超の誘発を生じることができる。ある実施形態において、当該方法は、非刺激多能性幹細胞集団に比してＴＮＦＳＦ１０ｍＲＮＡの３０倍超の誘発を生じることができる。ある実施形態において、当該方法は、非刺激多能性幹細胞集団に比してＴＮＦＳＦ１０ｍＲＮＡの５０倍超の誘発を生じることができる。ある実施形態において、前述の方法によって作成される極性化多能性幹細胞集団について本明細書に記載する。ある実施形態において、前述の方法で作成された極性化多能性幹細胞集団は、卵巣癌の処置に使用されるものである。ある実施形態において、前述の方法で作成された極性化多能性幹細胞集団は、乳癌の処置に使用されるものである。

【0013】

ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団から分泌された因子について本明細書に記載する。ある実施形態において、因子は、被刺激多能性幹細胞に接触した培地から分離されたものである。ある実施形態において、分離方法は、遠心分離、抽出、析出、ろ過、及び凍結のうちのいずれか１つ以上を含む。ある実施形態において、因子は、炎症誘発である。ある実施形態において、因子は、抗炎症である。ある実施形態において、因子は、細胞外小胞である。ある実施形態において、因子は、サイトカインである。ある実施形態において、因子は、ケモカインである。ある実施形態において、因子は、ｍｉＲＮＡである。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）で刺激されたものである。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）である。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ａ：Ｕ）である。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）で刺激されたものである。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、リポ多糖体である。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、アミノアルキルグルコサミニド４－ホスフェートである。ある実施形態において、誘発剤は、低酸素条件又は低酸素模倣である。ある実施形態において、低酸素条件は、低酸素模倣である。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルトである。ある実施形態において、低酸素模倣は、デスフェリオキサミンである。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団は、エリスロポエチンで刺激されたものである。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団は、ヒスタミンで刺激されたものである。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団は、アセチルコリンで刺激されたものである。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団は、グルタミン酸塩で刺激されたものである。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団は、エピネフリンで刺激されたものである。ある実施形態は、被刺激多能性幹細胞集団は、セロトニンで刺激されたものである。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団は、リポキシンＡ４で刺激されたものである。ある実施形態において、被刺激多能性細胞集団は、αメラニン細胞刺激ホルモンで刺激されたものである。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団は、ロイコトリエンＢ４で刺激されたものである。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団は、ヒト又は動物由来の血清を伴うことなく刺激されたものである。ある実施形態において、被刺激多能性細胞集団は、被誘発多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、被刺激多能性細胞集団は、成人多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、被刺激多能性細胞集団は、ヒト多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団は、間葉幹細胞集団である。ある実施形態において、被刺激多能性細胞集団は、タイプ１間葉幹細胞集団である。ある実施形態において、タイプ１間葉幹細胞集団は、非刺激間葉幹細胞集団に比して高いレベルでＴＮＦＳＦ１０ｍＲＮＡを発現する。ある実施形態において、被刺激多能性細胞集団は、タイプ２間葉幹細胞集団である。ある実施形態において、タイプ２間葉幹細胞集団は、非刺激間葉幹細胞集団に比して高いレベルでＣＸＣＬ９ｍＲＮＡを発現する。ある実施形態において、因子は、関節リウマチの処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、糖尿病性神経障害の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、クローン病の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、急性肺障害の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、多発性硬化症の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、急性視神経炎の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、クラッベ病の処置に使用される処置方法において使用されるものである。

【0014】

ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドを含む培地で刺激された間葉幹細胞集団から分泌された細胞外小胞について本明細書に記載する。ある実施形態において、当該培地は、エリスロポエチン及び低酸素条件又は低酸素模倣を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、卵巣癌の処置に使用されるものである。ある実施形態において、細胞外小胞は、乳癌の処置に使用されるものである。

【0015】

ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドを含む培地で刺激された間葉幹細胞集団から分泌された細胞外小胞について本明細書に記載する。ある実施形態において、当該培地は、エリスロポエチン及び低酸素条件又は低酸素模倣を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、関節リウマチの処置に使用されるものである。ある実施形態において、細胞外小胞は、糖尿病性神経障害の処置に使用されるものである。ある実施形態において、細胞外小胞は、クローン病の処置に使用されるものである。ある実施形態において、細胞外小胞は、急性肺障害の処置に使用されるものである。ある実施形態において、細胞外小胞は、多発性硬化症の処置に使用されるものである。ある実施形態において、細胞外小胞は、急性視神経炎の処置に使用されるものである。ある実施形態において、細胞外小胞は、クラッベ病の処置に使用されるものである。

【0016】

ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団から分泌された因子を作成する方法であって、非刺激多能性幹細胞集団を誘発剤を含む培地に接触させることと、非刺激多能性幹細胞集団で培地を培養することと、培地を採取することとを含み、培地で培養することにより、非刺激多能性幹細胞集団から被刺激多能性幹細胞集団を作成し、結果として、被刺激多能性幹細胞集団から少なくとも１つの因子の分泌を生じる方法について本明細書に記載する。ある実施形態において、当該方法は、更に培地から因子を分離することを含む。ある実施形態において、分離することは、遠心分離、抽出、析出、ろ過、及び凍結のうちのいずれか１つ以上を含む。ある実施形態において、因子は、炎症誘発である。ある実施形態において、因子は、抗炎症である。ある実施形態において、因子は、細胞外小胞である。ある実施形態において、因子は、サイトカインである。ある実施形態において、因子は、ケモカインである。ある実施形態において、因子は、ｍｉＲＮＡである。ある実施形態において、誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドである。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）である。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ａ：Ｕ）である。ある実施形態において、誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドである。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、リポ多糖である。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、アミノアルキルグルコサミニド４－ホスフェートである。ある実施形態において、誘発剤は、低酸素条件又は低酸素模倣である。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルトである。ある実施形態において、低酸素模倣は、デスフェリオキサミンである。ある実施形態において、誘発剤は、エリスロポエチンである。ある実施形態において、誘発剤は、ヒスタミンである。ある実施形態において、誘発剤は、アセチルコリンである。ある実施形態において、誘発剤は、グルタミン酸塩である。ある実施形態において、誘発剤は、エピネフリンである。ある実施形態において、誘発剤は、セロトニンである。ある実施形態において、誘発剤は、リポキシンＡ４である。ある実施形態において、誘発剤は、メラニン裁縫刺激ホルモンである。ある実施形態において、誘発剤は、ロイコトリエンＢ４である。ある実施形態において、当該培地は、ヒト又は動物由来の血清を含有しない。ある実施形態において、被刺激多能性細胞集団は、被誘発多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、被刺激多能性細胞集団は、成人多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、被刺激多能性細胞集団は、ヒト多能性幹細胞集団である。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞は、間葉幹細胞集団である。ある実施形態において、被刺激多能性細胞は、タイプ１間葉幹細胞集団である。ある実施形態において、タイプ１間葉幹細胞集団は、非刺激間葉幹細胞集団より高いレベルでＴＮＦＳＦ１０ｍＲＮＡを発現する。ある実施形態において、被刺激多能性細胞集団は、タイプ２間葉幹細胞集団である。ある実施形態において、タイプ２間葉幹細胞集団は、非刺激間葉幹細胞集団より高いレベルでＣＸＣＬ９を発現する。ある実施形態において、因子は、卵巣癌の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、乳癌の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、関節リウマチの処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、糖尿病性神経障害の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、クローン病の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、急性肺障害の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、多発性硬化症の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、急性視神経炎の処置に使用されるものである。ある実施形態において、因子は、クラッベ病の処置に使用されるものである。

【0017】

ある実施形態において、間葉幹細胞集団から分泌された細胞外用法を作成する方法であって、非刺激間葉幹細胞集団をＴＬＲ４リガンドを含む培地に接触させることと、培地を非刺激間葉幹細胞集団で培養することと、培地を採取することとを備え、培地で培養することで、非刺激間葉幹細胞集団から被刺激間葉幹細胞集団を作成し、結果として、被刺激間葉幹細胞集団から少なくとも１つの細胞外小胞の分泌を生じる。ある実施形態において、当該培地は、エリスロポエチン及び低酸素条件又は低酸素模倣を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、卵巣癌の処置に使用されるものである。

【0018】

ある実施形態において、間葉幹細胞集団から分泌された細胞外小胞を作成する方法であって、非刺激間葉幹細胞集団をＴＬＲ３リガンドを含む培地に接触させることと、培地を非刺激間葉幹細胞集団で培養することと、培地を採取することとを備え、培地で培養することにより、非刺激間葉幹細胞集団から被刺激間葉幹細胞集団を作成し、結果として、被刺激間葉幹細胞集団から少なくとも１つの細胞外小胞の分泌を生じる方法について本明細書に記載する。ある実施形態において、当該培地は、エリスロポエチン及び低酸素条件又は低酸素模倣を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、関節リウマチの処置に使用されるものである。ある実施形態において、細胞外小胞は、糖尿病性神経障害の処置に使用されるものである。ある実施形態において、細胞外小胞は、クローン病の処置に使用される。ある実施形態において、細胞外小胞は、急性肺障害の処置において使用される。ある実施形態において、細胞外小胞は、多発性硬化症の処置において使用される。ある実施形態において、細胞外小胞は、急性視神経炎の処置において使用される。ある実施形態において、細胞外小胞は、クラッベ病の処置において使用される。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ＭｙＤ８８依存性Ｔｏｌｌ様受容体経路を示す。

【図2】細胞外小胞及び分泌因子を使用した、本明細書に記載の治療方法の概略フローチャートを示す。

【図3A】ＴＬＲ３との組み合わせによる誘発剤の刺激に応じた間葉幹細胞によるＣＸＣＬ９ｍＲＮＡ発現の誘発を示す。

【図3B】ＴＬＲ３との組み合わせによる誘発剤の刺激に応じた間葉幹細胞によるＣＸＣＬ９ｍＲＮＡ発現の誘発を示す。

【図4A】ＴＬＲ４との組み合わせによる誘発剤の刺激に応じた間葉幹細胞によるＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬとしても既知である）ｍＲＮＡ発現を示す。

【図4B】ＴＬＲ４との組み合わせによる誘発剤の刺激に応じた間葉幹細胞によるＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬとしても既知である）ｍＲＮＡ発現を示す。

【図5A】ＴＬＲ４で誘発された間葉幹細胞内のｍｉＲＮＡの誘発又は減少を示す。

【図5B】ＴＬＲ３で誘発された間葉幹細胞内のｍｉＲＮＡの誘発又は減少を示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本明細書に記載の方法は、炎症誘発又は抗炎症の特性のいずれかを持つように多能性幹細胞を誘発するのに有用である。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）結合（炎症誘発特性に対してはＴＬＲ４、抗炎症特性に対してはＴＬＲ３）と第２の薬剤との組み合わせにより、ＴＬＲ結合を単独で使用した場合より強い表現型を生じる。このようなより強い表現型（炎症誘発又は抗炎症のいずれか）は、治療上、有用である。例えば、炎症誘発多能性幹細胞は、新生物（腫瘍又は癌等）との戦いに効用を有し、抗炎症多能性幹細胞は、炎症性又は自己免疫の障害との戦いに効用を有する。

【0021】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成するための培地であって、第１及び第２の誘発剤を備え、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドであり、第２の誘発剤は、第１の誘発剤とは異なるＴｏｌｌ様受容体リガンド、神経伝達物質、神経伝達物質様分子、エリスロポエチンでないポリペプチド、又は脂質である培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成する培地であって、第１及び第２の誘発剤を備え、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドであり、第２の誘発剤は、第１の誘発剤とは異なるＴｏｌｌ様受容体リガンド、神経伝達物質、神経伝達物質様分子、エリスロポエチンでないポリペプチド、又は脂質である培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成する方法であって、非刺激多能性幹細胞集団を第１及び第２の誘発剤を含む培地に接触させることを備え、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドであり、第２の誘発剤は、神経伝達物質、エリスロポエチンでないポリペプチド、又は脂質である方法について本明細書に記載する。ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成する方法であって、非刺激多能性幹細胞集団を第１及び第２の誘発剤を含む培地に接触させることを備え、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドであり、第２の誘発剤は、神経伝達物質、エリスロポエチンでないポリペプチド、又は脂質である方法について本明細書に記載する。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団から分泌された因子について本明細書に記載する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドを含む培地で刺激された間葉幹細胞集団から分泌された細胞外小胞について本明細書に記載する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドを含む培地で刺激された間葉幹細胞集団から分泌された細胞外小胞について本明細書に記載する。ある実施形態において、当該培地は、エリスロポエチン及び低酸素条件又は低酸素模倣を含む。ある実施形態において、被刺激多能性幹細胞集団から分泌された因子を作成するための方法であって、非刺激多能性幹細胞集団を誘発剤を含む培地に接触させることと、非刺激多能性幹細胞集団で培地を培養することと、培地を採取することとを備え、培地で培養することにより、非刺激多能性幹細胞集団から被刺激多能性幹細胞集団を作成し、結果として、被刺激多能性幹細胞集団から少なくとも１つの因子の分泌を生じる方法について本明細書に記載する。ある実施形態において、間葉幹細胞集団から分泌された細胞外小胞を作成するための方法であって、非刺激間葉幹細胞集団をＴＬＲ４リガンドを含む培地に接触させることと、非刺激間葉幹細胞集団で培地を培養することと、培地を採取することとを備え、培地で培養することにより、非刺激間葉幹細胞集団から被刺激観桜間葉幹細胞集団を作成し、結果として、被刺激間葉幹細胞集団から少なくとも１つの細胞外小胞の分泌を生じる方法について本明細書に記載する。ある実施形態において、間葉幹細胞集団から分泌された細胞外小胞を作成するための方法であって、非刺激間葉幹細胞集団をＴＬＲ３リガンドを含む培地に接触させることと、非刺激間葉幹細胞集団で培地を培養することと、培地を採取することとを備え、培地で培養することにより、非刺激間葉幹細胞集団から被刺激間葉幹細胞集団を作成し、結果として、被刺激間葉幹細胞集団から少なくとも１つの細胞外小胞の分泌を生じる方法について本明細書に記載する。ある実施形態において、当該培地は、エリスロポエチン及び低酸素条件又は低酸素模倣を含む。
＜特定の定義＞

【0022】

規定のない限り、本明細書において使用されるすべての技術的用語は、本発明の属する技術分野において通常の技術を有する当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書及び添付の請求書において使用される通り、単数形の不定冠詞及び定冠詞は、文脈上明記のない限り、複数の参照も含む。本明細書中の「又は」という任意の参照は、言及のない限り、「及び／又は」を包含することが意図されるものである。

【0023】

本明細書において使用される通り、指摘のない限り、「約」という用語は、言及された量に近い量を言うものであり、例えば、１０％、５％、又は１％に収まる量を言うものである。

【0024】

「多能性幹細胞」という用語は、多数の異なるタイプの細胞を生じることのできる細胞を意味する。「間葉幹細胞」という用語は、元来、間充組織に由来する幹細胞を意味する。この用語は、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、又は筋細胞のうちの少なくとも２つ以上に分化可能な細胞をいう。間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、成人組織の任意のタイプから分離される。一般的に、間葉幹細胞は、骨髄、脂肪組織、臍帯、又は抹消血から分離される。好適な態様において、ＭＳＣは、骨髄又は脂肪組織から得られる吸引脂肪組織より得られる。「多能性」又は「多分化能性」という用語はまた、多能性幹細胞、被誘発多分化能性幹細胞、又は任意の化学的又は遺伝学的手段を使用して多分化能性ステージに誘発された細胞を包含する。ある実施形態において、本開示の多能性又は多分化能性幹細胞は、間葉幹細胞である。

【0025】

「生物学的活性」という用語は、転写、翻訳、リン酸化反応又はアセチル化又は分解等の翻訳後タンパク質修飾、分泌、細胞分裂、アポトーシス、又は細胞運動性のうちの１つ以上を言う。生物学的活性を誘発する物質は、これらの生物学的活性のいずれかを増減するであろう。

【0026】

本明細書に記載の多能性及び間葉幹細胞を参照した「集団」という用語は、分子的に同一であるか、又は高度に類似した複数の細胞を言う。集団は、ヒト組織から分離されるか、又は培養で増殖可能である。本明細書において提供される任意の集団は、多能性幹細胞又は間葉幹細胞等の言及された細胞から「基本的になる」ものとすることができる。本明細書において使用される通り、「基本的になる」とは、細胞集団が細胞組成の観点から略純粋であることを意味する。例えば、細胞は、約８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％超純粋とすることができる。

【0027】

「細胞治療」又は「細胞ベース治療」という用語は、損傷を受けた組織又は器官の置換又は修復、免疫反応の調節、及び炎症性症候及び癌の減少等を非限定的に含む疾患又は障害に関連付けられた１つ以上の症候を予防、処置、又は改善するための、ヒト又は動物の細胞の移植を意味する。細胞治療は、誘発培地から採取された多能性又は間葉の幹細胞を、治療効果のある量、投与することによって達成することができる。

【0028】

「被験者」という用語は、動物、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、又はマウス）又は霊長類（例えば、サル又はヒト）を含む哺乳類を言う。ある実施形態において、被験者は、ヒトである。

【0029】

「低酸素条件」又は「低酸素」という用語は、約１１％の通常の生理学的酸素レベルに比較して酸素欠乏した疾患の下、細胞又は培地を培養することを言う。

【0030】

「処置する」「処置」及び「処置すること」という用語は、患者又は被験者を参照して直接使用するとき、任意の癌、任意の腫瘍又は新生物、炎症性障害、自己免疫疾患、又は移植器官及び組織の拒絶を含む免疫を介した疾患を非限定的に含む障害に関連付けられた１つ以上の症候を改善することを言い、ここでの改善は、本発明によって産出された免疫調節（すなわち、免疫学的に極性化された）細胞又は本発明によって産出された免疫調節細胞を含む薬剤組成を、このような処置を必要とする被験者に投与した結果として達成される。

【0031】

「非刺激」又は「無投薬」という用語は、本開示の方法による処置、極性化、又は誘発の施されていない細胞集団を言う。フレッシュ又は凍結された初代分離間葉幹細胞は、非刺激又は無投薬と考えられる。Ｔｏｌｌ様受容体リガンド、エリスロポエチン、低酸素、又は低酸素模倣のうちの少なくとも１つを欠いた化合物又は組成で既に処置された細胞は、非刺激と考えられる。

【0032】

「自己免疫障害」という用語は、被験者の免疫反応によって自身の細胞、組織、及び／又は器官に生じさせられた細胞、組織、及び／又は器官の損傷によって特徴づけられる、被験者の疾患を言う。

【0033】

「炎症性疾患」という用語は、免疫細胞の活性化の強化、サイトカイン、ケモカイン、又は免疫細胞の活性又は補充を引き起こすその他の因子の分泌を特徴とする疾患を言う。

【0034】

「細胞外小胞」という用語は、血液、リンパ液、尿、唾液、及び細胞培養の病変培地を含む真核流体に存在する細胞由来小胞を言う。これらの細胞外小胞は、細胞エンドソーム及び原形質膜に由来し、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡを含む）、タンパク質、ポリペプチド、脂質、及び小分子を含むことができる。細胞外小胞は、細胞由来の小さな小胞であり、エキソソーム、微小小胞、及びアポトーシス小体を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、エキソソームを含むか、エキソソームからなるか、基本的にエキソソームからなる。

【0035】

ある実施形態において、本明細書に記載の主題の方法及び組成は、疾患の処置に使用されるものである。ある実施形態において、本明細書に記載の主題の方法及び組成は、ヒトの疾患の処置に使用されるものである。ある実施形態において、本明細書に記載の主題の方法及び組成は、家畜の疾患の処置に使用されるものである。ある実施形態において、本明細書に記載の主題の方法及び組成は、ヒト以外の動物の処置に使用されるものである。ある実施形態において、ヒト以外の動物は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、又はヤギである。
＜培地＞

【0036】

ある実施形態において、本明細書に記載の培地は、ヒト又はその他の動物由来の細胞、幹細胞、多能性幹細胞、間葉幹細胞の培養に使用されるものである。ある実施形態において、本明細書に記載の培地は、ヒト又はその他の動物由来の細胞、幹細胞、多能性幹細胞、又は間葉幹細胞における個別の表現型の作成に使用されるものである。ある実施形態において、本明細書に記載の培地は、本明細書において具体的に記載された成分に加え、細胞培養のための標準培地成分を含む。例えば、ある非限定的実施形態において、培地は、ビタミン、ミネラル、塩分、糖分、アミノ酸、ピルビン酸、ホルモン、ヒト血清、ウシ胎児血清、ウシ胎仔血清、脂質、タンパク質、染料、ｐＨ緩衝剤、及びこれらの組み合わせを含む。ある実施形態において、当該培地は、濃縮培養サプリメントである。ある実施形態において、当該培地は、少なくとも２倍の濃縮である。ある実施形態において、当該培地は、少なくとも１０倍の濃縮である。ある実施形態において、当該培地は、少なくとも１００倍の濃縮である。ある実施形態において、当該培地は、非限定的な例として、水等の任意の好適な水性溶媒の添加によってもどされた乾燥粉末製剤である。ある実施形態において、当該培地は、殺菌される。ある実施形態において、当該培地は、任意の好適な容器にパッケージ化されて供給される。ある実施形態において、当該培地は、殺菌ろ過される。ある実施形態において、当該培地は、非限定的な例として、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、又はＲＰＭＩ等の標準培養培地の製剤を含有することができる。ある実施形態において、当該培地は、ヒト又はその他の動物由来の血清を備えない。
＜ＴＬＲ４リガンド＞

【0037】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成するための培地であって、第１及び第２の誘発剤を備え、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを備え、第２の誘発剤は、生物学的活性を有する分子を含む培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、ＴＬＲリガンドは、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドを含む。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、リポ多糖体を含む。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、アミノアルキルグルコサミニド４－ホスフェートを含む。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、約１０ｐｇ／ｍＬから約１０μｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬから約１０μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬから約１μｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬ、又は約５ｎｇ／ｍＬから約２５ｎｇ／ｍＬの濃度である。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、少なくとも１０ｐｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、少なくとも１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、少なくとも１μｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、少なくとも１０μｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、１ｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、１００ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、１０ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、１ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、５００μｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、２００μｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、１００μｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。
＜ＴＬＲ３リガンド＞

【0038】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成するための培地であって、第１及び第２の誘発剤を備え、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを備え、第２に誘発剤は、生物学的活性を有する分子を含む培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、ＴＬＲリガンドは、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドを含む。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ａ：Ｕ）を含む。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、約１０ｐｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬから約１００μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬから約１０μｇ／ｍＬ、約０．２５μｇ／ｍＬから約７．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬから約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬから約２．５μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬから約１．５μｇ／ｍＬの濃度である。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、少なくとも１０ｐｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、少なくとも１ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、少なくとも１μｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、少なくとも１０μｇ／ｍＬの濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、１ｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、１００ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、１０ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、１ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、５００μｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、２００μｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、１００μｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する。
＜追加の薬剤＞

【0039】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成するための培地であって、第１及び第２の誘発剤を備え、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを備え、第２の誘発剤は、生物学的活性を有する分子を含む培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、図１を参照すると、第２の誘発剤は、ＴＬＲシグナリング経路の阻害物質又は活性物質を含む。ある実施形態において、ＴＬＲリガンドは、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドを含む。ある実施形態において、ＴＬＲリガンドは、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドを含む。ある実施形態において、第２の誘発剤は、生物学的活性を有する分子を含む。ある実施形態において、第２の誘発剤は、第１の誘発剤とは異なるＴｏｌｌ様受容体リガンド、神経伝達物質、死刑伝達物質様分子、小分子、ポリペプチド、又は脂質である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、アセチルコリン、αメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、セロトニン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、ヒスタミン、リポキシンＡ４、ロイコトリエンＢ４、及びこれらの任意の組み合わせより選択される。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ヒスタミンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、アセチルコリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、αメラニン細胞刺激ホルモンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、グルタミン酸塩である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ノルエピネフリンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、エピネフリンである。ある実施形態において、第二の誘発剤は、セロトニンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、メラトニンである。ある実施形態において、第２の誘発剤は、リポキシンＡ４である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、リポキシンＢ４である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、ロイコトリエンＢ４である。ある実施形態において、第２の誘発剤は、エリスロポエチンでない。ある実施形態において、第２の誘発剤は、低酸素条件又は低酸素模倣でない。ある実施形態において、第２の誘発剤は、塩化コバルトでない。ある実施形態において、第２の誘発剤は、デスフェリオキサミンでない。ある実施形態において、ヒスタミン、アセチルコリン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン、メラトニン、リポキシンＡ４、αメラニン細胞刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、及びロイコトリエンＢ４はすべて、ＭＣＳ２誘発の増加又は増強に有用である。ある実施形態において、ヒスタミン、アセチルコリン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン、メラトニン、リポキシンＡ４、αメラニン細胞刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、及びロイコトリエンＢ４はすべて、ＭＳＣ１誘発の増加又は増強に有用である。ある実施形態において、アセチルコリン、グルタミン酸塩、及びリポキシンＡ４は、ＭＳＣ２誘発の増加又は増強に有用である。ある実施形態において、セロトニン、メラトニン、リポキシンＡ４、及びロイコトリエンＢ４は、ＭＳＣ１誘発の増加又は増強に有用である。
＜アセチルコリン（ＡｃＨ）＞

【0040】

ある実施形態において、第２の誘発剤は、アセチルコリンを含む。ある実施形態において、ＡｃＨの濃度は、約１ナノモルから約１００マイクロモルである。ある実施形態において、ＡｃＨの濃度は、少なくとも１ナノモルである。ある実施形態において、ＡｃＨの濃度は、少なくとも１０ナノモルである。ある実施形態において、ＡｃＨの濃度は、少なくとも１００ナノモルである。ある実施形態において、ＡｃＨの濃度は、少なくとも１マイクロモルである。ある実施形態において、ＡｃＨの濃度は、少なくとも１０マイクロモルである。ある実施形態において、ＡｃＨの濃度は、１００マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＡｃＨの濃度は、１０マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＡｃＨの濃度は、１マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＡｃＨの濃度は、１００ナノモル未満である。ある実施形態において、ＡｃＨの濃度は、１０ナノモル未満である。
＜αメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）＞

【0041】

ある実施形態において、第２の誘発剤は、αメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）を含む。ある実施形態において、ＭＳＨの濃度は、約１００ピコモルから約１００ナノモルである。ある実施形態において、ＭＳＨの濃度は、少なくとも１００ピコモルである。ある実施形態において、ＭＳＨの濃度は、少なくとも１ナノモルである。ある実施形態において、ＭＳＨの濃度は、少なくとも１０ナノモルである。ある実施形態において、ＭＳＨの濃度は、１００ナノモル未満である。ある実施形態において、ＭＳＨの濃度は、１ナノモル未満である。
＜メラトニン（ＭＥＬ）＞

【0042】

ある実施形態において、第２の誘発剤は、メラトニン（ＭＥＬ）を含む。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、約１ナノモルから約１００マイクロモルである。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、少なくとも１ナノモルである。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、少なくとも１０ナノモルである。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、少なくとも１００ナノモルである。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、少なくとも１マイクロモルである。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、少なくとも１０マイクロモルである。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、１００マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、１００マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、１０マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、１マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、１００ナノモル未満である。ある実施形態において、ＭＥＬの濃度は、１０ナノモル未満である。
＜セロトニン（５－ＨＴ）＞

【0043】

ある実施形態において、第２の誘発剤は、セロトニン（５－ＨＴ）を含む。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、約１００ピコモルから約１００マイクロモルである。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、少なくとも１００ピコモルである。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、少なくとも１ナノモルである。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、少なくとも１０ナノモルである。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、少なくとも１００ナノモルである。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、少なくとも１マイクロモルである。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、少なくとも１０マイクロモルである。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、１００マイクロモル未満である。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、１０マイクロモル未満である。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、１マイクロモル未満である。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、１００ナノモル未満である。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、１０ナノモル未満である。ある実施形態において、５－ＨＴの濃度は、１ナノモル未満である。
＜グルタミン酸塩（ＧＬＵ）＞

【0044】

ある実施形態において、第２の誘発剤は、グルタミン酸塩（ＧＬＵ）を含む。ある実施形態において、ＧＬＵの濃度は、約１０ナノモルから約１ミリモルである。ある実施形態において、ＧＬＵの濃度は、少なくとも１０ナノモルである。ある実施形態において、ＧＬＵの濃度は、少なくとも１００ナノモルである。ある実施形態において、ＧＬＵの濃度は、少なくとも１マイクロモルである。ある実施形態において、ＧＬＵの濃度は、少なくとも１０マイクロモルである。ある実施形態において、ＧＬＵの濃度は、少なくとも１００マイクロモルである。ある実施形態において、ＧＬＵの濃度は、１ミリモル未満である。ある実施形態において、ＧＬＵの濃度は、１００マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＧＬＵの濃度は、１０マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＧＬＵの濃度は、１マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＧＬＵの濃度は、１００ナノモル未満である。
＜ノリエピネフリン（ＮＥＰＩ）＞

【0045】

ある実施形態において、第２の誘発剤は、ノルエピネフリン（ＮＥＰＩ）を含む。ある実施形態において、ＮＥＰＩの濃度は、約１００ピコモルから約１００ナノモルである。ある実施形態において、ＮＥＰＩの濃度は、少なくとも１００ピコモルである。ある実施形態において、ＮＥＰＩの濃度は、少なくとも１ナノモルである。ある実施形態において、ＮＥＰＩの濃度は、少なくとも１０ナノモルである。ある実施形態において、ＮＥＰＩの濃度は、１００ナノモル未満である。ある実施形態において、ＮＥＰＩの濃度は、１０ナノモル未満である。ある実施形態において、ＮＥＰＩの濃度は、１ナノモル未満である。
＜ヒスタミン（ＨＩＳ）＞

【0046】

ある実施形態において、第２の誘発剤は、ヒスタミン（ＨＩＳ）を含む。ある実施形態において、ＨＩＳの濃度は、約１０ナノモルから約１ミリモルである。ある実施形態において、ＨＩＳの濃度は、少なくとも１０ナノモルである。ある実施形態において、ＨＩＳの濃度は、少なくとも１００ナノモルである。ある実施形態において、ＨＩＳの濃度は、少なくとも１マイクロモルである。ある実施形態において、ＨＩＳの濃度は、少なくとも１０マイクロモルである。ある実施形態において、ＨＩＳの濃度は、少なくとも１００マイクロモルである。ある実施形態において、ＨＩＳの濃度は、１ミリモル未満である。ある実施形態において、ＨＩＳの濃度は、１００マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＨＩＳの濃度は、１０マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＨＩＳの濃度は、１マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＨＩＳの濃度は、１００ナノモル未満である。
＜リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）＞

【0047】

ある実施形態において、第２の誘発剤は、リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）を含む。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、約１００ピコモルから約１ミリモルである。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、少なくとも１００ピコモルである。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、少なくとも１ナノモルである。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、少なくとも１０ナノモルである。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、少なくとも１００ナノモルである。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、少なくとも１マイクロモルである。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、少なくとも１０マイクロモルである。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、少なくとも１００マイクロモルである。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、１ミリモル未満である。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、１００マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、１０マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、１マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、１００ナノモル未満である。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、１０ナノモル未満である。ある実施形態において、ＬＸＡ４の濃度は、１ナノモル未満である。
＜ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）＞

【0048】

ある実施形態において、第２の誘発剤は、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）を含む。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、約１００ピコモルから約１ミリモルである。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、少なくとも１００ピコモルである。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、少なくとも１ナノモルである。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、少なくとも１０ナノモルである。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、少なくとも１００ナノモルである。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、少なくとも１マイクロモルである。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、少なくとも１０マイクロモルである。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、少なくとも１００マイクロモルである。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、１ミリモル未満である。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、１００マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、１００マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、１マイクロモル未満である。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、１００ナノモル未満である。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、１０ナノモル未満である。ある実施形態において、ＬＴＢ４の濃度は、１ナノモル未満である。
＜低酸素＞

【0049】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成するための培地であって、第１及び第２の誘発剤を備え、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを備え、第２の誘発剤は、生物学的活性を有する分子を含む。ある実施形態において、生物学的活性を有する分子は、異なるＴｏｌｌ様受容体リガンド、神経伝達物質、神経伝達物質様分子、非エリスロポエチンポリペプチド、又は脂質を含む。ある実施形態において、生物学的活性を有する分子は、ヒスタミン、アセチルコリン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、エピネフリン、セロトニン、メラトニン、リポキシンＡ４、αメラニン細胞刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、及びロイコトリエンＢ４からなるリストより選択される。ある実施形態において、ＴＬＲリガンドは、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドを含む。ある実施形態において、ＴＬＲリガンドは、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドを含む。ある実施形態において、第２の誘発剤は、アセチルコリン、αメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、セロトニン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、ヒスタミン、リポキシンＡ４、ロイコトリエンＢ４、及びこれらの任意の組み合わせより選択される。ある実施形態において、第３の誘発剤は、再酸素条件又は低酸素模倣である。ある実施形態において、第３の誘発剤は、エリスロポエチンを含む。

【0050】

ある実施形態において、本明細書に記載の培地は、低酸素条件を含む。ある実施形態において、低酸素条件は、低酸素又は酸素欠乏環境における培養を含む。ある実施形態において、低酸素環境は、１０％未満の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、８％未満の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、６％未満の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、５％未満の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、４％未満の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、３％未満の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、２．５％未満の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、２．０％未満の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、１．５％未満の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、１．０％未満の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、０．５％未満の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、有効０％の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、０．５％から３．０％の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、０．５％から２．５％の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、０．５％から２．０％の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、０．５％から１．５％の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、０．５％から１．０％の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、１．０％から２．０％の酸素を有する。ある実施形態において、低酸素環境は、１．５％から２．０％の酸素を有する。

【0051】

ある実施形態において、本明細書に記載の培地は、低酸素模倣を含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、塩化コバルトを含む。ある実施形態において、塩化コバルトは、約５０μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約１００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約２００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約３００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約４００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約５００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約６００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約７００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約８００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約９００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約１ｍＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約１０μＭから約１ｍＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約１０μＭから約８００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約１０μＭから約５００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約１０μＭから約４００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約１０μＭから約３００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約５０μＭから約３００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約１００μＭから約３００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、塩化コバルトは、約１５０μＭから約３００μＭの濃度で存在する。

【0052】

ある実施形態において、本明細書に記載の培地は、低酸素模倣を含む。ある実施形態において、低酸素模倣は、デスフェリオキサミンを含む。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約５０μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約２００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約３００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約４００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約５００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約６００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約７００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約８００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約９００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約１ｍＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約１０μＭから１ｍＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約１０μＭから８００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約１０μＭから５００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約１０μＭから４００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約１０μＭから３００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約５０μＭから３００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約１００μＭから３００μＭの濃度で存在する。ある実施形態において、デスフェリオキサミンは、約１５０μＭから３００μＭの濃度で存在する。

【0053】

ある実施形態において、本明細書に記載の培地は、エリスロポエチンを含む。ある実施形態において、本発明の培地は、組換エリスロポエチンを含む。ある実施形態において、本発明の培地は、ヒト組換エリスロポエチンを含む。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、約０．１ｎｇ／ｍＬから約１．０ｍｇ／ｍＬである。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、約０．１ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬである。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、約０．１ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬである。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、約０．１ｎｇ／ｍＬから約１０ｎｇ／ｍＬである。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、約０．１ｎｇ／ｍＬから約１．０ｎｇ／ｍＬである。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、約０．２ｎｇ／ｍＬから約０．８ｎｇ／ｍＬである。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、約０．３ｎｇ／ｍＬから約０．６ｎｇ／ｍＬである。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、１０ｍｇ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、５ｍｇ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、１ｍｇ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、１００ｎｇ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、３０ｎｇ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、１０ｎｇ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、５ｎｇ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、４ｎｇ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、１ｎｇ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、０．８ｎｇ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、１ｎｇ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、５Ｕ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、１Ｕ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、０．５Ｕ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、０．１Ｕ／ｍＬ未満である。ある実施形態において、エリスロポエチンの量は、０．０５Ｕ／ｍＬ未満である。

【0054】

ある実施形態において、非刺激多能性幹細胞集団から免疫学的に極性化された多能性幹細胞集団を作成するための培地であって、第１及び第２の誘発剤を備え、第１の誘発剤は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを備え、第２の誘発剤は、生物学的活性を有する分子を含む培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、ＴＬＲリガンドは、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドを含む。ある実施形態において、ＴＬＲリガンドは、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）を含む。ある実施形態において、第２の誘発剤は、アセチルコリン、αメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、セロトニン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、ヒスタミン、リポキシンＡ４、ロイコトリエンＢ４、及びこれらの任意の組み合わせより選択される。ある実施形態において、当該培地は、第３の誘発剤を含む。ある実施形態において、第３の誘発剤は、低酸素条件又は低酸素模倣を含む。ある実施形態において、第３の誘発剤は、エリスロポエチンを含む。ある実施形態において、当該培地は、第４の誘発剤を含む。ある実施形態において、第４の誘発剤は、エリスロポエチンを含む。ある実施形態において、第４の誘発剤は、低酸素条件又は低酸素模倣を含む。
＜多能性幹細胞＞

【0055】

ある実施形態において、多能性幹細胞とともに使用される方法及び培養培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、多能性幹細胞集団とともに使用される方法及び培養培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、当該培地は、１つ以上の多能性幹細胞を含む。ある実施形態において、当該培地は、１つ以上の無投薬多能性幹細胞を含む。ある実施形態において、当該培地は、１つ以上の非刺激多能性幹細胞を含む。ある実施形態において、当該培地は、１つ以上の被刺激多能性幹細胞を含む。ある実施形態において、多能性幹細胞は、ヒト由来のものである。ある実施形態において、多能性幹細胞は、初代ヒト細胞である。ある実施形態において、多能性幹細胞は、血液から分離される。ある実施形態において、多能性幹細胞は、臍帯血から分離される。ある実施形態において、多能性幹細胞は、胎盤から分離される。ある実施形態において、多能性幹細胞は、歯髄から分離される。ある実施形態において、多能性幹細胞は、月経血から分離される。ある実施形態において、多能性幹細胞は、胎児から分離される。ある実施形態において、多能性幹細胞は、吸引脂肪組織から分離される。ある実施形態において、多能性幹細胞は、生検から分離される。
＜間葉幹細胞＞

【0056】

ある実施形態において、間葉幹細胞とともに使用される方法及び培養培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、間葉幹細胞集団とともに使用される方法及び培養培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、当該培地は、１つ以上の間葉幹細胞を含む。ある実施形態において、当該培地は、１つ以上の無投薬間葉幹細胞を含む。ある実施形態において、当該培地は、１つ以上の非刺激間葉幹細胞を含む。ある実施形態において、当該培地は、１つ以上の被刺激間葉幹細胞を含む。ある実施形態において、間葉幹細胞は、ヒト由来のものである。ある実施形態において、間葉幹細胞は、初代ヒト細胞である。ある実施形態において、間葉幹細胞は、血液から分離される。ある実施形態において、間葉幹細胞は、臍帯血から分離される。ある実施形態において、間葉幹細胞は、胎盤から分離される。ある実施形態において、間葉幹細胞は、歯髄から分離される。ある実施形態において、間葉幹細胞は、月経血から分離される。ある実施形態において、間葉幹細胞は、胎児から分離される。ある実施形態において、間葉幹細胞は、脂肪吸引組織から分離される。ある実施形態において、間葉幹細胞は、生検から分離される。
＜タイプ１極性化多能性幹細胞＞

【0057】

ある実施形態において、多能性又は間葉幹細胞における免疫学的極性化を誘発する方法について本明細書に記載する。ある実施形態において、多能性幹細胞における免疫学的極性化を誘発する培地について本明細書に記載する。ある実施形態において、極性化多能性幹細胞について本明細書に記載する。ある実施形態において、当該細胞は、タイプ１極性化を示す。タイプ１極性化は、炎症誘発メディエータの発現又は解放を特徴とする。ＴＬＲ４リガンドで処置した細胞は、タイプ１極性化を示すであろう。タイプ１極性化は、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）の発現を特徴とする。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、ＴＮＦＳＦ１０の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して２倍、ＴＮＦＳＦ１０の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して５倍、ＴＮＦＳＦ１０の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して１０倍、ＴＮＦＳＦ１０の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して５０倍、ＴＮＦＳＦ１０の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して１００倍、ＴＮＦＳＦ１０の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して２００倍、ＴＮＦＳＦ１０の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して５００倍、ＴＮＦＳＦ１０の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して１０００倍、ＴＮＦＳＦ１０の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して１００００倍、ＴＮＦＳＦ１０の発現を誘発する。

【0058】

ある実施形態において、タイプ１極性化多能性又は間葉幹細胞について本明細書に記載する。ある実施形態において、タイプ１極性化多能性幹細胞は、ＴＮＦＳＦ１０を発現する。ある実施形態において、タイプ１極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して２倍多くのＴＮＦＳＦ１０を発現する。ある実施形態において、タイプ１極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して５倍多くのＴＮＦＳＦ１０を発現する。ある実施形態において、タイプ１極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して１０倍多くのＴＮＦＳＦ１０を発現する。ある実施形態において、タイプ１極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して５０倍多くのＴＮＦＳＦ１０を発現する。ある実施形態において、タイプ１極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して１００倍多くのＴＮＦＳＦ１０を発現する。ある実施形態において、タイプ１極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して５００倍多くのＴＮＦＳＦ１０を発現する。ある実施形態において、タイプ１極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して１０００倍多くのＴＮＦＳＦ１０を発現する。ある実施形態において、タイプ１極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して１００００倍多くのＴＮＦＳＦ１０を発現する。

【0059】

ある実施形態において、タイプ１極性化多能性又は間葉幹細胞について本明細書に記載する。ある実施形態において、タイプ１極性化多能性幹細胞は、非刺激多能性幹細胞に比較してあるｍｉＲＮＡを高いレベルで発現する。ある実施形態において、増補ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１３０５、ｍｉＲ－５７５、及びｍｉＲ－１９７３のうちのいずれか１つ以上を含む。ある実施形態において、増補ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１３０５、ｍｉＲ－５７５、及びｍｉＲ－１９７３のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つすべてを含む。これらのｍｉＲＮＡのいずれか１つのレベルは、非刺激多能性幹細胞集団に比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、又は５倍以上増補可能である。ある実施形態において、タイプ１極性化多能性幹細胞は、非刺激多能性幹細胞に比較してあるｍｉＲＮＡを低減レベルで発現する。ある実施形態において、低減ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ－２４－３ｐを含む。このｍｉＲＮＡのレベルは、非刺激多能性細胞集団に比較して少なくとも約２倍、３倍、４倍、又は５倍以上低減可能である。
＜タイプ２極性化多能性幹細胞＞

【0060】

ある実施形態において、多能性又は間葉幹細胞における免疫学的タイプ２極性化を誘発する方法について本明細書に記載する。ある実施形態において、多能性幹細胞におけるタイプ２極性化を誘発する培地について本明細書に記載する。タイプ２極性化は、抗炎症メディエータの発現又は解放を特徴とする。ＴＬＲ３リガンドで処置された細胞は、タイプ２極性化を示すである。タイプ２極性化は、ＣＸＬ９の発現を特徴とする。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、ＣＸＣＬ９の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して２倍、ＣＸＣＬ９の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して５倍、ＣＸＣＬ９の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して１０倍、ＣＸＣＬ９の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較し５０倍、ＣＸＣＬ９の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して１００倍、ＣＸＣＬ９の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して２００倍、ＣＸＣＬ９の発現を誘発する。ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地は、非刺激細胞に比較して５００倍、ＣＸＣＬ９の発現を誘発する。

【0061】

ある実施形態において、タイプ２極性化多能性又は間葉幹細胞について本明細書に記載する。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、ＣＸＣＬ９を発現する。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して２倍多くのＣＸＣＬ９を発現する。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して５倍多くのＣＸＣＬ９を発現する。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して１０倍多くのＣＸＣＬ９を発現する。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して５０倍多くのＣＸＣＬ９を発現する。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して１００倍多くのＣＸＣＬ９を発現する。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して２００倍多くのＣＸＣＬ９を発現する。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞に比較して５００倍多くのＣＸＣＬ９を発現する。

【0062】

ある実施形態において、非刺激細胞集団との比較時、少なくとも２倍、以下の遺伝子のいずれかを発現するタイプ２極性化多能性又は間葉幹細胞について本明細書に記載する。すなわち、ＣＸＣＬ９、ＥＧＦＲ、ＩＲＦ１、Ａ２Ｍ、ＦＡＳ、ＩＬ２ＲＧ、ＭＭＰ３、ＧＢＰ１、ＩＳＧ１５、ＦＣＧＲ１、ＮＦＫＢ１、ＮＯＳ２Ａ、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＪＡＫ２、ＳＴＡ２、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＯＣＳ１、又はＩＲＦ１である。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞集団との比較時、少なくとも２倍、以下の遺伝子のいずれかを発現する。すなわち、ＥＰＯＲ、Ｆ２Ｒ、ＳＴＡＭ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＡＳ２、ＭＹＣ、ＳＨ２Ｂ１、又はＣＳＦ２ＲＢである。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞集団との比較時、少なくとも１０倍、以下の遺伝子のいずれかを発現する。すなわち、ＣＸＣＬ９、ＧＢＰ１、ＩＳＧ１５、ＳＯＣＳ１、ＭＭＰ３、ＪＡＫ２、又はＩＲＦ１である。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激細胞集団との比較時、少なくとも２０倍、以下の遺伝子のいずれかを発現する。すなわち、ＣＸＣＬ９、ＧＢＰ１、ＩＳＧ１５、又はＳＯＣＳ１である。

【0063】

ある実施形態において、タイプ２極性化多能性又は間葉幹細胞について本明細書に記載する。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激多能性幹細胞に非悪してあるｍｉＲＮＡを高いレベルで発現する。ある実施形態において、増補ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－Ｌｅｔ７ａ／ｄ、ｍｉＲ－１７＿１、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－９２ａ、及びｍｉＲ－１２６０ａのうちのいずれか１つ以上を含む。ある実施形態において、増補ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－Ｌｅｔ７ａ／ｄ、ｍｉＲ－１７＿１、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－９２ａ、又はｍｉＲ－１２６０ａのうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つすべてを含む。ある実施形態において、タイプ２極性化多能性幹細胞は、非刺激多能性幹細胞に比較してあるｍｉＲＮＡを低減レベルで発現する。ある実施形態において、低減ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ－２２２を含む。このｍｉＲＮＡのレベルは、非刺激多能性細胞集団に比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、又は５倍以上、低減可能である。
＜細胞均一性＞

【0064】

ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地により、培養後の極性化多能性細胞の均一性を増加することができる。いくつかの実施形態において、細胞の６０％超がタイプ１マーカを発現する。いくつかの実施形態において、細胞の７０％超がタイプ１マーカを発現する。いくつかの実施形態において、細胞の８０％超がタイプ１マーカを発現する。いくつかの実施形態において、細胞の９０％超がタイプ１マーカを発現する。いくつかの実施形態において、細胞の９５％超がタイプ１マーカを発現する。いくつかの実施形態において、細胞の９８％超がタイプ１マーカを発現する。ある実施形態において、タイプ１マーカは、ＴＮＦＳＦ１０である。マーカは、任意の好適な方法、例えば、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ、ウェスタンブロット、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット、又はデジタルＰＣＲによって測定可能である。

【0065】

ある実施形態において、本開示の方法及び培養培地により、培養後の極性化多能性細胞の均一性を増加することができる。いくつかの実施形態において、細胞の６０％超がタイプ２マーカを発現する。いくつかの実施形態において、細胞の７０％超がタイプ２マーカを発現する。いくつかの実施形態において、細胞の８０％超がタイプ２マーカを発現する。いくつかの実施形態において、細胞の９０％超がタイプ２マーカを発現する。いくつかの実施形態において、細胞の９５％超がタイプ２マーカを発現する。いくつかの実施形態において、細胞の９８％超がタイプ２マーカを発現する。ある実施形態において、タイプ２マーカは、ＣＸＣＬ９である。マーカは、任意の好適な方法、例えば、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ、ウェスタンブロット、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット、又はデジタルＰＣＲによって測定可能である。
＜方法＞

【0066】

ある実施形態において、本明細書に記載の方法は、培養培地と多能性幹細胞との間である接触量を可能とするものである。ある実施形態において、多能性細胞は、本開示の培地又は誘発剤に２４時間未満、接触する。ある実施形態において、多能性細胞は、本開示の培地又は誘発剤に８時間未満、接触する。ある実施形態において、多能性細胞は、本開示の培地又は誘発剤に４時間未満、接触する。ある実施形態において、多能性細胞は、本開示の培地又は誘発剤に２時間未満、接触する。ある実施形態において、多能性細胞は、本開示の培地又は誘発剤に１時間未満、接触する。ある実施形態において、多能性細胞は、本開示の培地又は誘発剤に１分超、接触する。ある実施形態において、多能性細胞は、本開示の培地又は誘発剤に１時間超、接触する。。ある実施形態において、多能性細胞は、本開示の培地又は誘発剤に２時間超、接触する。。ある実施形態において、多能性細胞は、本開示の培地又は誘発剤に４時間超、接触する。。ある実施形態において、多能性細胞は、本開示の培地又は誘発剤に８時間超、接触する。
＜分泌炎症誘発因子＞

【0067】

ある実施形態において、本明細書に記載の方法及び培養培地により、非刺激多能性幹細胞に、治療効果のある因子を分泌させる。ある実施形態において、因子は、間葉幹細胞細胞によって分泌される。ある実施形態において、因子は、炎症誘発である。ある実施形態において、因子は、ＴＬＲ４リガンドでの刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、ＬＰＳ又はアミノアルキルグルコサミニドを含む。ある実施形態において、因子は、ＴＬＲ４リガンド、エリスロポエチン、及び低酸素条件での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、因子は、ＴＬＲ４リガンド、エリスロポエチン、低酸素条件、及びアセチルコリン、αメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、セロトニン、グルタミン酸塩、ノルピネフリン、ヒスタミン、リポキシンＡ４、ロイコトリエンＢ４、及びこれらの組み合わせから選択された追加の誘発剤での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、当該分泌因子は、サイトカインである。ある実施形態において、因子は、ＴＬＲ４リガンド、並びにアセチルコリン、αメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、セロトニン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、ヒスタミン、リポキシンＡ４、ロイコトリエンＢ４、及びこれらの任意の組み合わせから選択された追加の誘発剤での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－３を含む。ある実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－６を含む。ある実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－８を含む。ある実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１７を含む。ある実施形態において、サイトカインは、インターフェロンβを含む。ある実施形態において、分泌因子は、ケモカインを含む。ある実施形態において、ケモカインは、ＬＩＦを含む。ある実施形態において、ケモカインは、ＧＭ－ＣＳＦを含む。ある実施形態において、ケモカインは、ＭＩＧを含む。ある実施形態において、ケモカインは、ＭＣＰ－１を含む。ある実施形態において、ケモカインは、ＴＲＩＬを含む。ある実施形態において、分泌因子は、ｍＩＲＮＡを含む。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１４６を含む。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１５５を含む。ある実施形態において、分泌因子は、サイトカイン、ケモカイン、又はｍｉＲＮＡの組み合わせを含む。ある実施形態において、分泌因子は、被刺激細胞培養培地から分離されず、被験者の処置に使用可能な馴化培地の残り全てとともに存在するか、被験者に投与される細胞集団に接触する。
＜分泌抗炎症因子＞

【0068】

ある実施形態において、本明細書に記載の方法及び培養培地により、被刺激多能性幹細胞に、治療効果のある因子を分泌させる。ある実施形態において、因子は、間葉幹細胞によって分泌される。ある実施形態において、因子は、抗炎症である。ある実施形態において、因子は、ＴＬＲ３リガンドでの刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）又はポリ（Ａ：Ｕ）を含む。ある実施形態において、因子は、ＴＬＲ３リガンド、エリスロポエチン、及び低酸素条件での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、因子は、ＴＬＲ３リガンド、エリスロポエチン、低酸素条件、及びアセチルコリン、αメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、セロトニン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、ヒスタミン、リポキシンＡ４、ロイコトリエンＢ４、及びこれらの任意の組み合わせから選択される追加の誘発剤での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、分泌因子は、サイトカインである。ある実施形態において、因子は、ＴＬＲ３リガンド、及びアセチルコリン、αメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、セロトニン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、ヒスタミン、リポキシンＡ４、ロイコトリエンＢ４、及びこれらの任意の組み合わせから選択される追加の誘発剤での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、分泌因子は、サイトカインである。ある実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－４を含む。ある実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１０である。ある実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１３を含む。ある実施形態において、サイトカインは、ＴＧＦβを含む。ある実施形態において、分泌因子は、ケモカインを含む。ある実施形態において、ケモカインは、ＣＸＣＬ９を含む。ある実施形態において、ケモカインは、ＣＣＬ５を含む。ある実施形態において、ケモカインは、ＣＸＣＬ１０を含む。ある実施形態において、分泌因子は、ｍｉＲＮＡを含む。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＬｅＴ７ａ／ｄを含む。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１７／９２ａを含む。ある実施形態において、分泌因子は、サイトカイン、ケモカイン、又はｍｉＲＮＡの組み合わせを含む。ある実施形態において、分泌因子は、プラスたグランジンＥ２を含む。ある実施形態において、分泌因子は、インドールアミン２，３－ジオキシダーゼを含む。ある実施形態において、分泌因子は、被刺激細胞培養培地から分離されず、被験者の処置に使用可能な馴化培地の残りすべてとともに存在するか、又は被験者に投与される細胞集団に接触する。
＜分泌因子の分離＞

【0069】

ある実施形態において、本明細書に記載の分泌因子は、本開示の被刺激多能性幹細胞集団に接触した培養培地から分離される。ある実施形態において、本明細書に記載の分泌因子は、本開示の被刺激間葉幹細胞集団に接触した培養培地から分離される。ある実施形態において、培養培地は、被刺激細胞集団に１時間超、接触されたものである。ある実施形態において、培養培地は、被刺激細胞集団に２時間超、接触されたものである。ある実施形態において、培養培地は、被刺激細胞集団に４時間超、接触されたものである。ある実施形態において、培養培地は、被刺激細胞集団に８時間超、接触されたものである。ある実施形態において、培養培地は、被刺激細胞集団に２４時間超、接触されたものである。ある実施形態において、分泌因子は、ろ過、遠心分離、析出、クロマトグラフィ、及び凍結を非限定的に含む任意の好適な方法で培養培地から分離される。ある実施形態において、分泌因子は、培養培地から分離されない。
＜分泌炎症誘発細胞外小胞＞

【0070】

細胞外小胞は、血液、尿、及び細胞培養の病変培地を含む、多数且つ恐らくは全ての真核流体に存在する細胞由来小胞である。これらの細胞外小胞は、細胞エンドソーム及び原形質膜に由来し、ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡを含む）、タンパク質、ポリペプチド、脂質、及び小分子を含み得る。細胞外小胞は、細胞由来の小さな小胞であり、エキソソーム、微小小胞、及びアポトーシス小体を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、エキソソームを含む。ある実施形態において、本明細書に記載の方法及び培養培地により、被刺激多能性幹細胞に、治療効果のある細胞外小胞を分泌させる。ある実施形態において、細胞外小胞は、間葉幹細胞によって分泌される。ある実施形態において、細胞外小胞は、炎症誘発である。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＴＬＲ４リガンドでの刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドは、ＬＰＳ又はアミノアルキルグルコサミドを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＴＬＲ４リガンド、エリスロポエチン、及び低酸素条件での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＴＬＲ４リガンド、エリスロポエチン、低酸素条件、及びアセチルコリン、αメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、セロトニン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、ヒスタミン、リポキシンＡ４、ロイコトリエンＢ４、及びこれらの任意の組み合わせから選択された追加の誘発剤での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＴＬＲ４リガンド、並びにアセチルコリン、αメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、セロトニン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、ヒスタミン、リポキシンＡ４、ロイコトリエンＢ４、及びこれらの任意の組み合わせから選択された追加の誘発剤での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、細胞外小胞は、サイトカインを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＩＬ－３を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＩＬ－６を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＩＬ－８を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＩＬ－１７を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、インターフェロンβを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ケモカインを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＬＩＦを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＧＭ－ＣＳＦを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＭＩＧを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＭＣＰ－１を含む。ある実施形態において、ケモカインは、ＴＲＡＩＬを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ｍｉＲＮＡを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ｍｉＲ－１４６を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ｍｉＲ－１５５を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、サイトカイン、ケモカイン、又はｍｉＲＮＡの組み合わせを含む。ある実施形態において、炎症誘発細胞外小胞は、非刺激無投薬多能性細胞集団から分泌された細胞外小胞に比べて増強された１つ以上のタンパク質を含む。ある実施形態において、１つ以上のタンパク質は、無投薬非刺激多能性幹細胞からの細胞外小胞に比べて、グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、結合プラコグロビン（ＪＵＰ）、デスモプラキン（ＤＳＰ）、モエシン（ＭＳＮ）、ビメンチン（ＶＩＭ）、アクチン（ＡＣＴＢ）、又はアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のうちのいずれか１つ以上をより高いレベルで含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、無投薬非刺激多能性幹細胞からの細胞外小胞に比べて、グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、結合プラコグロビン（ＪＵＰ）、デスモプラキン（ＤＳＰ）、モエシン（ＭＳＮ）、ビメンチン（ＶＩＭ）、アクチン（ＡＣＴＢ）、又はアネキシンＡ２（ＡＮＸＡ２）のうちのいずれか２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つ全てをより高いレベルで含む。ある実施形態において、これらのタンパク質のうちのいずれかは、非刺激多能性細胞に比べて２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、又は２０倍以上、増強可能である。ある実施形態において、炎症誘発細胞外小胞は、非刺激無投薬多能性細胞集団から分泌される細胞外小胞に比べて低減された１つ以上のタンパク質を含む。ある実施形態において、１つ以上のタンパク質は、トロンボスポンジン－１（ＴＨＢＳ１）、コラーゲンα２（ＶＩ）鎖（ＣＯＬ６Ａ２）、デコリン（ＤＣＮ）、インスリン様成長因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）、リジルオキシダーゼホモログ２（ＬＯＸＬ２）、ビグリカン（ＢＧＮ）、又はコラーゲンα－３（ＶＩ）鎖（ＣＯＬ６Ａ３）のうちのいずれか１つ以上を低減レベルで含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、トロンボスポンジン－１（ＴＨＢＳ１）、コラーゲンα２（ＶＩ）鎖（ＣＯＬ６Ａ２）、デコリン（ＤＣＮ）、インスリン様成長因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）、リジルオキシダーゼホモログ２（ＬＯＸＬ２）、ビグリカン（ＢＧＮ）、又はコラーゲンα－３（ＶＩ）鎖（ＣＯＬ６Ａ３）のうちのいずれか２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つ全てを低減レベルで含む。ある実施形態において、これらのタンパク質のいずれかは、非刺激多能性細胞に比べて２倍、３倍、５倍、又は１０倍以上、低減可能である。
＜分泌抗炎症細胞外小胞＞

【0071】

ある実施形態において、本明細書に記載の方法及び培養培地により、被刺激多能性幹細胞に、治療効果のある細胞外小胞を分泌させる。ある実施形態において、細胞外小胞は、間葉幹細胞によって分泌される。ある実施形態において、細胞外小胞は、抗炎症である。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＴＬＲ３リガンドでの刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）又はポリ（Ａ：Ｕ）を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＴＬＲ３リガンド、エリスロポエチン、及び低酸素条件での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＴＬＲ３リガンド、エリスロポエチン、低酸素条件、及びアセチルコリン、αメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、セロトニン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、ヒスタミン、リポキシンＡ４、ロイコトリエンＢ４、及びこれらの組み合わせから選択された追加の誘発剤での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、細胞外小胞は、サイトカインを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＴＬＲ３リガンド、並びにアセチルコリン、αメラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、セロトニン、グルタミン酸塩、ノルエピネフリン、ヒスタミン、リポキシンＡ４、ロイコトリエンＢ４、及びこれらの組み合わせから選択された追加の誘発剤での刺激に応じて分泌される。ある実施形態において、細胞外小胞は、サイトカインを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＩＬ－４を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＩＬ－１０を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＩＬ－１３を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＴＧＦβを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ケモカインを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＣＸＣＬ９を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＣＣＬ５を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ＣＸＣＬ１０を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ｍｉＲＮＡを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ｍｉＲＬｅｔ７ａ／ｄを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、ｍｉＲ－１７／９２ａを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、サイトカイン、ケモカイン、又はｍｉＲＮＡの組み合わせを含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、プロスタグランジンＥ２を含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、インドールアミン２，３－ジオキシダーゼを含む。ある実施形態において、抗炎症細胞外小胞は、非刺激多能性細胞集団から分泌された細胞外小胞に比べて増強された１つ以上のタンパク質を含む。ある実施形態において、１つ以上のタンパク質は、無投薬非刺激多能性幹細胞からの細胞外小胞に比べて、ミオシン－１（ＭＹＨ１）、ミオシン－２（ＭＴＨ２）、ミオシン－７（ＭＹＨ－７）、又は組織因子経路阻害物質２（ＴＦＰＩ２）のうちのいずれか１つ以上をより高いレベルで含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、無投薬非刺激多能性幹細胞からの細胞外小胞に比べて、ミオシン－１（ＭＹＨ１）、ミオシン－２（ＭＴＨ２）、ミオシン－７（ＭＹＨ－７）、又は組織因子経路阻害物質２（ＴＦＰＩ２）のうちのいずれか２つ、３つ、又は４つ全てをより高いレベルで含む。ある実施形態において、これらのタンパク質のいずれかは、非刺激多能性細胞に比べて、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、又は２０倍多く増強可能である。ある実施形態において、抗炎症細胞外小胞は、無投薬非刺激多能性細胞集団から分泌された細胞外小胞に比べて低減された１つ以上のタンパク質を含む。ある実施形態において、１つ以上のタンパク質は、無投薬非刺激多能性幹細胞からの細胞外小胞に比べて、コラーゲンα－１（Ｉ）鎖（ＣＯＬ６Ａ３）、スルフヒドリルオキシダーゼ－１（ＱＳＯＸ１）、デコリン－７（ＤＣＮ）、コラーゲンα－２（ＶＩ）鎖（ＣＯＬ６Ａ２）、トロンボスポンジン（ＴＨＢＳ１）、又はコラーゲンα－１（Ｉ）鎖（ＣＯＬ１Ａ１）のうちのいずれか１つ以上を低減レベルで含む。ある実施形態において、細胞外小胞は、無投薬非刺激多能性幹細胞からの細胞外小胞に比べて、コラーゲンα－１（Ｉ）鎖（ＣＯＬ６Ａ３）、スルフヒドリルオキシダーゼ－１（ＱＳＯＸ１）、デコリン－７（ＤＣＮ）、コラーゲンα－２（ＶＩ）鎖（ＣＯＬ６Ａ２）、トロンボスポンジン（ＴＨＢＳ１）、又はコラーゲンα－１（Ｉ）鎖（ＣＯＬ１Ａ１）のうちのいずれか２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ全てを低減レベルで含む。ある実施形態において、これらのタンパク質のいずれかは、非刺激多能性細胞に比べて、２倍、３倍、５倍、又は１０倍以上、低減可能である。
＜細胞外小胞の分離＞

【0072】

ある実施形態において、本明細書に記載の細胞外小胞は、本開示の被刺激多能性幹細胞集団に接触した培養培地から分離される。ある実施形態において、細胞外小胞は、本開示の被刺激間葉幹細胞集団に接触した培養培地から分離される。ある実施形態において、培養培地は、被刺激細胞集団に１時間超、接触されたものである。ある実施形態において、培養培地は、被刺激細胞集団に２時間超、接触されたものである。ある実施形態において、培養培地は、被刺激細胞集団に４時間超、接触されたものである。ある実施形態において、培養培地は、被刺激細胞集団に８時間超、接触されたものである。ある実施形態において、培養培地は、被刺激細胞集団に２４時間超、接触されたものである。細胞外小胞は、培養培地から分離及び／又は精製可能である。培養培地から細胞外小胞を分離する公的な方法は、当分野において既知である。ある実施形態において、細胞外用法は、ろ過、遠心分離、超遠心分離、密度勾配分離、析出、免疫親和性分離、クロマトグラフィ、及び凍結を非限定的に含む任意の好適な方法により、培養培地から分離される。ある実施形態において、細胞外小胞は、培養培地から分離されない。
＜治療方法＞

【0073】

ある実施形態において、治療効果のある方法、培養培地、細胞、分泌因子、及び細胞外小胞について本明細書に記載する。例えば、図２は、本明細書に記載の方法、培養培地、細胞、分泌因子、及び細胞外小胞の非限定的処置プロトコルのフローチャートを示す。ある実施形態において、本明細書に記載の方法、培養培地、細胞、分泌因子、及び細胞外小胞は、癌の処置に有用である。ある実施形態において、本明細書に記載の方法、培養培地、細胞、分泌因子、及び細胞外小胞は、自己免疫疾患の処置に有用である。ある実施形態において、本明細書に記載の方法、培養培地、細胞、分泌因子、及び細胞外小胞は、抗炎症疾患の処置に有用である。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドを含む培地で処置された多能性幹細胞は、癌の治療に有用である。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドを含んだ培地で処置された他の静幹細胞は、自己免疫又は炎症性疾患の処置に有用である。

【0074】

ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドを含んだ培地で処置された間葉幹細胞は、癌の治療に有用である。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドを含む培地で治療された間葉幹細胞は、自己免疫又は炎症性疾患の処置に有用である。ある実施形態において、多能性幹細胞をＴＬＲ４リガンドに接触させることを含む方法で処置された多能性幹細胞は、癌の処置に有用である。ある実施形態において、多能性幹細胞をＴＬＲ３リガンドに接触させることを含む方法で処置された多能性幹細胞は、自己免疫又は炎症性疾患の処置に有用である。ある実施形態において、間葉幹細胞をＴＬＲ４リガンドに接触させることを含む方法で処置された間葉幹細胞は、癌の処置に有用である。ある実施形態において、間葉幹細胞をＴＬＲ３リガンドに接触すさせることを含む方法で処置された間葉幹細胞は、自己免疫又は炎症性疾患の処置に有用である。

【0075】

ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドを含む培地で処置された多能性幹細胞は、癌の処置に有用である。ある実施形態において、ＴＬＲ４リガンドを含む培地で処置された多能性幹細胞から分泌された因子又は細胞外小胞は、癌の処置に有用である。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドを含む培地で処置された間葉幹細胞は、自己免疫又は炎症性疾患の処置に有用である。ある実施形態において、ＴＬＲ３リガンドを含む培地で処置された間葉幹細胞から分泌された因子又は細胞外小胞は、自己免疫又は炎症性疾患の処置に有用である。

【0076】

ある実施形態において、多能性幹細胞をＴＬＲ４リガンドに接触させることを含む方法で処置された多能性幹細胞から分泌された細胞外小胞又は因子は、癌の処置に有用である。ある実施形態において、多能性幹細胞をＴＬＲ３リガンドに接触させることを含む方法で処置された多能性幹細胞から分泌された細胞外小胞又は因子は、自己免疫又は炎症性疾患の処置に有用である。ある実施形態において、間葉幹細胞をＴＬＲ４リガンドに接触させることを含む方法で処置された間葉幹細胞から分泌された細胞外小胞又は因子は、癌の処置に有用である。ある実施形態において、間葉幹細胞をＴＬＲ３リガンドに接触させることを含む方法で処置された間葉幹細胞から分泌された細胞外小胞又は因子は、自己免疫又は炎症性疾患の処置に有用である。

【0077】

本開示は、（ａ）多能性幹細胞の集団を提供することと、（ｂ）幹細胞集団を本明細書に記載の培地のいずれかに接触させることと、（ｃ）適切な疾患の下、細胞を培養することと（ｄ）被刺激細胞を被験者に投与することとを含む細胞治療方法を提供する。ある実施形態において、本開示は、（ａ）間葉幹細胞の集団を提供することと、（ｂ）幹細胞集団を本明細書に記載の培地のいずれかに接触させることと、（ｃ）適切な疾患の下、細胞を培養することと、（ｄ）被刺激細胞を被験者に投与することとをそなえる細胞治療方法を提供する。ある実施形態において、細胞集団は、容器からの除去、遠心分離、超遠心分離、ろ過、透析、洗浄、及び殺菌中性緩衝食塩水等の適切な希釈剤中での懸濁を含むステップにより、細胞及び培地の双方を含む容器から採取される。
＜自己免疫及び炎症性疾患＞

【0078】

ある実施形態において、本開示の方法、細胞、培養培地、細胞外小胞、及び分泌因子は、自己免疫疾患の処置のためのもである。ある実施形態において、本開示の方法、細胞、培養培地、細胞外小胞、及び分泌因子は、急性視神経炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶結性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎及び睾丸炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、閉塞性細気管支炎、心筋症、脂肪便症、慢性疲労症候群（ＣＦ１ＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集疾患、円板状紅斑性狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、タイプ１又は免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性免疫症候群ｓ、リウマチ性多発筋痛症、多発性皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、レイノー病、ライター症候群、サルコイドーシス、強皮症、全身性進行性硬化症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、ティッフマン症候群、全身性紅斑性狼瘡、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎疱疹性皮膚炎等の血管炎、白斑、ヴェグナー肉芽腫症、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、神経系の自己免疫疾患、家族性地中海熱、ランバート・イートン筋無力症候群症候群、交感性眼炎、多腺性内分泌障害、又は尋常性乾癬の処置のためのものである。

【0079】

ある実施形態において、本開示の方法、細胞、培養培地、細胞外小胞、及び分泌因子は、炎症性障害の処置のためのものである。ある実施形態において、炎症性障害は、クローン病、タイプ１糖尿病、関節リウマチ、炎症性腸疾患、尋常性乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、全身性紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、潰瘍性大腸炎、自己免疫溶血性貧血、不妊、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、血小板減少性紫斑病、ギラン・バレー症候群症候群、アレルギー、喘息、アトピー性疾患、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、再生不良性貧血、臓器移植後の拒絶である。ある実施形態において、炎症性障害は、急性視神経炎、糖尿病性神経障害、クラッベ病、急性肺障害、クローン病セリアック病、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、脳炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性骨溶解、アレルギー障害、敗血性ショック、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、炎症性血管炎（例えば、結節性多発動脈炎、ヴェグナー肉芽腫症、高安動脈炎、側頭部動脈炎、リンパ腫様肉芽腫症）、外傷後血管形成（例えば、形成後の再狭窄）、未分化型脊椎関節炎、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、慢性肝炎、又は慢性ウィルス又は細菌感染の結果として生じる慢性炎症である。
＜癌＞

【0080】

ある実施形態において、本開示の方法、細胞、培養培地、細胞外小胞、及び分泌因子は、癌の処置のためのものである。ある実施形態において、本開示の方法、細胞、培養培地、細胞外小胞、及び分泌因子は、腫瘍の処置のためのものである。ある実施形態において、本開示の方法、細胞、培養培地、細胞外小胞、及び分泌因子は、癌の処置の増補のためのものである。ある実施形態において、癌は、成人急性リンパ性白血病、小児急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、小児急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、肝外癌、膀胱癌、骨肉腫、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、星細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、脳腫瘍、上衣腫、髄芽腫髄芽腫、髄上皮腫、中間型松果体実質腫瘍、中分化、テント上原始神経外胚葉腫瘍及び松果体芽細胞腫、脳及び脊髄腫瘍、乳癌、男性乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性子宮頸癌、子宮頸癌、小児癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、大腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ－細胞リンパ腫、胎児腫瘍、中枢神経系、子宮内膜癌、上衣芽腫、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、腫瘍のユーイング肉ファミリー、頭蓋外細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫眼癌、胆嚢癌、胃（胃）癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍、頭蓋外細胞腫瘍、卵巣性腺外胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、成人（原発性）肝細胞（肝臓）癌、肝細胞（肝臓）癌、組織球症、ランゲルハンス細胞、成人ホジキンリンパ腫、小児ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、膵島細胞腫瘍（膵臓内分泌腺）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、小児喉頭癌、白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、白血病、小児急性リンパ芽球性白血病、白血病、成人急性骨髄性白血病、白血病、小児急性骨髄性白血病、白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞、口唇癌および口腔癌、成人（原発性）肝臓癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞、肺癌、小細胞、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連、リンパ腫、バーキット、リンパ腫、皮膚Ｔ－細胞、成人ホジキンリンパ腫、小児ホジキンリンパ腫、成人非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、マクログロブリン血症、ワルデンストローム、骨悪性線維性組織球腫と骨肉腫、髄芽腫髄芽腫、髄上皮腫、メラノーマ、メラノーマ、眼内（眼）、メルケル細胞癌腫、成人悪性中皮腫、中皮腫、不顕性原発性を伴う頸部扁平上皮癌、口腔癌、多内分泌腺腫瘍症候群、多発骨髄腫／形質細胞新生物菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、慢性骨髄性白血病、成人骨髄性白血病、小児急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性障害、副鼻腔癌及び鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、成人非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口の癌、口腔癌、口唇及び口咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵島細胞腫瘍膵臓癌、乳頭腫症、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、中分化の松果体実質腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠期乳癌、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂尿管、移行細胞癌、第１５染色体の変更を伴う気道癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、唾液腺癌、腫瘍のユーイング肉ファミリー肉腫、カポジ肉腫肉腫、成人軟組織、小児軟組織肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌、皮膚癌（メラノーマ）、メルケル細胞皮膚癌腫、小細胞肺癌、小腸癌、成人軟組織肉腫、小児軟組織肉腫、扁平上皮細胞癌腫、転移性不顕性原発性扁平上皮頸部癌、胃（胃）癌、テント上原始神経外胚葉腫瘍、皮膚Ｔ－細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌腫、甲状腺癌、腎盂尿管の移行細胞癌、妊娠期絨毛腫瘍、未知の原発性部位、尿管及び腎盂の癌腫、移行細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮内膜、子宮肉腫、ぶどう膜メラノーマ、膣癌癌、外陰癌、ワルデンストロームマクログロブリン血症、又はウィルムス腫瘍である。
＜投与スケジュール＞

【0081】

ある実施形態において、本開示の方法、細胞、培養培地、細胞外小胞、及び分泌因子は、癌、自己免疫障害、又は炎症性障害の処置を必要とする被験者に投与するためのものである。ある実施形態において、本開示の方法、細胞、及び誘発培地は、異なる投与経路を包含する。ある実施形態において、投与経路は、皮下、頭頂、筋肉内、静脈、腫瘍内、眼内、網膜内、硝子体内、又は頭蓋内である。ある実施形態において、細胞は、腫瘍部位又は炎症部位に直接投与可能である。

【0082】

ある実施形態において、本開示の方法、細胞、培養培地、細胞外小胞、及び分泌因子は、癌、自己免疫障害、又は免疫介在性炎症性疾患の処置を必要とする被験者に投与するためのものである。ある実施形態において、本開示の方法、細胞、及び誘発培地は、異なる投薬回数を包含する。ある実施形態において、本開示の細胞及び方法は、１日に１回、１週間に１回、１ヶ月に１回、１年に１回投与される。ある実施形態において、本開示の細胞及び方法は、１日に２回、１週間に２回、１ヶ月に２回、１年に２回投与される。ある実施形態において、本開示の細胞及び方法は、１日に３回、１週間に３回、１ヶ月に３回、１年に３回投与される。ある実施形態において、本開示の細胞及び方法は、１日に４回、１週間に４回、１ヶ月に４回、１年に４回投与される。ある実施形態において、初期処置に続いて、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、又は１２回の維持投薬が行われる。ある実施形態において、維持投薬は、少なくとも１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、又は１０年以上、継続される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも１×１０６個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも２×１０６個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも３×１０６個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも４×１０６個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも５×１０６個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも６×１０６個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも７×１０６個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも８×１０６個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも９×１０６個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも１×１０７個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも２×１０７個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも３×１０７個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも４×１０７個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも５×１０７個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも６×１０７個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも７×１０７個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも８×１０７個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも９×１０７個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも１×１０８個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも２×１０８個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも３×１０８個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも４×１０８個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも５×１０８個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも６×１０８個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも７×１０８個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも８×１０８個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも９×１０８個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも１×１０９個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも２×１０９個の細胞が投与される。ある実施形態において、１回の投薬につき、少なくとも３×１０９個の細胞が投与される。
＜薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、及びキャリア＞

【0083】

本開示の細胞、培地、及び細胞外小胞は、投与、安定性、均一性、生体利用効率、又はこれらの任意の組み合わせを向上及び改善するために、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又はキャリアと組み合わせることができる。ある実施形態において、本開示の細胞外小胞又は細胞は、無菌溶液中に懸濁して投与される。ある実施形態において、溶液は、０．９％のＮａＣｌを含む。ある実施形態において、溶液は、例えば、アセテート、クエン酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、ホスフェート、重炭酸塩、ヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）等の緩衝剤、例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、又はポロキサマー１８８等の界面活性剤、グルコース、デキストロース、マンノース、マニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、又はデキストラン４０等のポリオール／二糖類／多糖類、例えば、アスコルビン酸又はメチオニン等の抗酸化剤、例えば、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ等のキレート化剤のうちの１つ以上をさらに含む。ある実施形態において、本開示の細胞外小胞は、投与に先立ち、凍結乾燥及び再構成により、輸送／保管される。ある実施形態において、凍結乾燥細胞外小胞製剤は、マニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、及びデキストラン４０等の増量剤を含む。
＜実施例＞

【0084】

以下の実施例は、例示を意図するものであり、本明細書に記載の発明を限定するものでない。
＜実施例１－Ｔｏｌｌ様受容体及び特定誘導体の組み合わせによる間葉幹細胞起爆の強化＞

【0085】

図３Ａ及び図３Ｂを参照すると、ＴＬＲ３によるタイプ２間葉幹細胞起爆は、アセチルコリン（ＡＣＨ）、グルタミン酸塩（ＧＬＵ）、及びリポキシンＡ４（ＬａＸ４）でさらに強化される。ヒト骨髄由来間葉幹細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）及び０．５ｎｇ／ｍＬのヒト組換エリスロポエチンを使用してタイプ２間葉細胞に誘発される。すべてのＲＮＡが分離、精製され、ｃＤＮＡに逆転写せれる。定量リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲグリーンマスターミックスを使用して実施した。データは、定量比較ＣＴ法を使用し、目標遺伝子発現を１８ＳｒＲＮＡハウスキーピング遺伝子に標準化することによって解析し、未処置コントロールより数倍の増加を示した。ＣＸＣＬ９遺伝子発現は、誘発に続いて著しく増加した。エラーバーは、＋／－標準誤差（ＳＥＭ）を表す。図３Ａ及び図３Ｂに２つの独立した実験として示される通り、ＴＬＲ３と、ＡＣＨ（図３Ａでは約２４倍、図３Ｂでは約３７倍）、ＧＬＵ（図３Ａでは約３１７．４倍、図３Ｂでは約５９倍）、ＬＡＸ４（図３Ａでは約３２倍、図３Ｂでは約４７倍）のいずれか、又はこれら３つすべての組み合わせによる間葉幹細胞の刺激により、結果として、ＴＬＲ３（図３Ａでは約８．８倍、図３Ｂでは約２２倍）、ＡＣＨ（図３Ａでは約３．７倍、図３Ｂでは約２０倍）、ＧＬＵ（図３Ａでは約１．４倍、図３Ｂでは約１６倍）、又はＬＡＸ４（図３Ａでは約－Ａ倍、図３Ｂでは約１３倍）のいずれかを単独で使用するよりも、ＣＸＣＬ９の発現が増える。

【0086】

図４Ａ及び図４Ｂを参照すると、ＴＬＲ４によりタイプ１間葉幹細胞の起爆は、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、セロトニン（５－ＨＴ）、メラトニン（ＭＥＬ）でさらに強化される。ヒト骨髄由来間葉幹細胞は、リポ多糖体（ＬＰＳ）と０．５ｎｇ／ｍＬのヒト組換エリスロポエチンとを使用して、タイプ１間葉幹細胞に誘発される。すべてのＲＮＡが分離、精製され、ｃＤＮＡに逆転写せれる。定量リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲグリーンマスターミックスを使用して実施した。データは、定量比較ＣＴ法を使用し、目標遺伝子発現を１８ＳｒＲＮＡハウスキーピング遺伝子に標準化することによって解析し、未処置コントロールより数倍の増加を示した。ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬとしても既知である）遺伝子発現は、誘発に続いて著しく増加した。エラーバーは、＋／－標準誤差（ＳＥＭ）を表す。図４Ａ及び図４Ｂに２つの独立した実験として示される通り、ＴＬＲ４と、ＬＴＢ４（図４Ａでは約８７５，４５７倍、図４Ｂでは約１５，４３７倍）、５－ＨＴ（図４Ｂでは約１２，３２３倍）、ＭＥＬ（図４Ｂでは約５，５５５倍）、又は３つすべての組み合わせ（図４Ｂでは約２２，２３８倍）のいずれかの組み合わせで間葉幹細胞を刺激することにより、結果として、これらのいずれかを単独で使用した場合よりＴＮＦＳＦ１０の発現が多くなる。ＴＬＲ４（図４Ａでは約４２５，８５４倍、図４Ｂでは約７，５６７倍）、ＬＴＢ４（図４Ａでは約４９倍、図４Ｂでは約４９倍）、５－ＨＴ（図４Ｂでは約３３３倍）、又はＭＥＬ（図４Ｂでは約４８９倍）である。
＜実施例２－起爆間葉幹細胞で分泌された因子の解析＞

【0087】

広範の生物活性分子の分泌（すなわち、セクレトーム）は、ＭＣＳがその治療効果を達成し、目標疾患組織に最も影響を有する可能性のある重要なメカニズムである。我々は、このような生物活性因子に対する既知の貢献主体として、エキソソーム［細胞外小胞、ＥＶ又は多小胞体、ＭＥＢとも称される］を含む。エキソソームは、付近の細胞に影響し得る分泌小胞である。我々は、潜在的にＭＳＣによる貢献を受ける分子として、マイトジェン、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質、血管新生、エキソソーム、炎症性／免疫変調生物活性因子を含む。

【0088】

無投薬ＭＳＣ、ＭＳＣ１、及びＭＳＣ２セクレトーム／エキソソームは、メーカの指示（ＨｕｍａｎＧｒｏｕｐＩ＆ＩＩ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に従ったＢｉｏ－Ｐｌｅｘ生物活性因子、ＳｉｓｔｅｍｉｃＩｎｃ（ＵＫ），ＰｈａｌａｎｘＢｉｏｔｅｃｈｇｒｏｕｐ（ＣＡ）によるｍｉＲＮＡ解析、Ｃ－ＭＳ／ＭＳＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ、ＣＡ）による次世代タンパク質シーケンシングにり試験し、次いでウェスタンプロット解析、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、及びＲＴ－ｑＰＣＲで査定した。

【0089】

無投薬ＭＳＣ、ＭＳＣ１、及びＭＳＣ２からの病変培地を収集し、生物活性因子解析に先立って遠心分離で浄化した。ＭＳＣ１は、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを使用したヒト骨髄由来間葉幹細胞で４８時間処置することにより、刺激した。ＭＳＣ２は、１μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）を使用したヒト骨髄由来間葉幹細胞を４８時間処置することにより、刺激した。すべてのレベルは、サンプル中のタンパク質総濃度で標準化し、さらに未処置投薬ＭＳＣレベルで標準化した。４倍超のレベルについては、統計的に有意であると考慮した。データは、３つ超の実験を代表するものであり、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンプロット解析でさらに査定した。結果を以下の表１に示す。

【表1】

【0090】

結果は、ＭＳＣ１及びＭＳＣ２によって分泌される、明白な非重複分泌因子の組を示している。一般的に、炎症誘発因子は、ＭＳＣ１によって分泌され、抗炎症因子は、ＭＳＣ２によって分泌される。
＜実施例３－起爆海洋幹細胞によって分泌される細胞外小胞のタンパク質含有量の解析＞

【0091】

無投薬ＭＳＣ、ＭＳＣ１、及びＭＳＣ２からの細胞外小胞を分離し、液体クロマトグラフィ［ＬＣ］－質量分析［ＭＳ］／ＥｘｏＱｕｉｃｋ－ＴＣキット（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）を使用したＭＳによって解析した。要するに、無投薬、ＭＳＣ１、及びＭＳＣ２からの病変培地は、血清／動物質を含まない培地において培養の４８時間後に収集し、遠心分離で浄化した。ＭＳＣ１は、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと５ｎｇ／ｍＬのヒト組換エリスロポエチンを使用して、アッセイに先立って４８時間、ヒト骨髄由来間葉幹細胞の処置によって刺激した。ＭＳＣ２は、１μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）及び５ｎｇ／ｍＬのヒト組換エリスロポエチンを使用して、アッセイに先立って４８時間、ヒト骨髄由来間葉幹細胞の処置によって刺激した。細胞外小胞ペレットは、１００℃にて１５分、２００μＬの改質ＲＩＰＡ緩衝剤（２．０％ＳＤＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８，５、１Ｘ完全プロテアーゼ阻害物質（Ｒｏｃｈｅ））に溶解した。溶解物は、遠心分離で浄化し、タンパク質濃度をＱｕｂｉｔフルオロメータ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で判定した。抽出されたタンパク質１０μｇは、ＭＥＳ緩衝システムにおいて１０％ＢｉｓＴｒｉｓＮｕＰａｇｅミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥにより処理した。移行ウィンドウ（２ｃｍレーン）を実施し、ＰｒｏＧｅｓｔロボット（ＤｉｇｉＬａｂ）を使用してゲル内消化を行った。各消化サンプルの半分をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＱＥｘａｃｔｉｖｅにインタフェースされたＷａｔｅｒｓＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙＨＰＬＣシステムを備えたナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳで解析した。ペプチドは、トラップカラム上に搭載し、２時間の逆位相勾配を使用して、３５０ｎＬ／分、７５μＭ解析カラムで溶出した。双方のカラムは、ＬｕｎａＣ１８樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）でパック化した。ＭＳ／ＭＳについては１５個の最も豊富なイオンを選択した。結果を以下の表２に示す。

【表2】

＜実施例４－起爆間葉幹細胞によって発現されたｍｉＲＮＡの解析＞

【0092】

マイクロＲＮＡ［ｍｉＲＮＡ］は、細胞運命の判定に重要であった約２０年前、線虫において最初に記載された。ヒトにおけるｍｉＲＮＡの存在は、十数年前に最初に記載された。ｍｉＲＮＡプロファイル研究は、ｍｉＲＮＡが異なる器官において異なる展開段階で選択的に発現されることを実証した。ＭＳＣの異なる組織源に対するｍｉＲＮＡシグニチャは、増殖、自己複製、及び分化能等、幹細胞特性の維持に関与するｍｉＲＮＡのパターンを規定した。ＭＳＣ１及びＭＳＣ２ｍｉＲＮＡプロファイルは、起爆された細胞から解析を行い、未処置無投薬ＭＳＣと比較して独自の発現パターンを明らかにした。データは、３名超の別のドナーからの少なくとも３つの独立した実験を代表するものである。データは、無投薬ＭＳＣ＝１との比較で相対的な発言として表現されている。例えば、ＭＳＣ１中に構築された炎症誘発ｍｉＲＮＡの発現の増強は、その予測された炎症性表現型に一致する。ＭＳＣ１は、アッセイに先立ち、４時間、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳと５ｎｇ／ｍＬのヒト組換エリスロポエチンでヒト骨髄由来間葉幹細胞を処置することによって刺激した。ＭＳＣ２は、アッセイに先立ち、４時間、１μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）と５ｎｇ／ｍＬのヒト組換エリスロポエチンとでヒト骨髄由来間葉幹細胞を処置することによって刺激した。

【0093】

図５Ａ（ＭＳＣ１）及びＢ（ＭＳＣ２）は、これらの実験結果を示している。ＭＳＣ１刺激細胞外小胞については、ｍｉＲ－１４６（約２．７倍）、ｍｉＲ－１５５（約３．３倍）、ｍｉＲ－１３０５（約２．３倍）、ｍｉＲ－５７５（約２．１倍）、及びｍｉＲ－１９７３（約２．３倍）のレベルがすべて、非刺激ＭＳＣに比べて２倍多く誘発され、ｍｉＲ－２４－３ｐのレベルが約２倍低減した。ＭＳＣ２－刺激細胞外小胞については、ｍｉＲ－Ｌｅｔ７ａ／ｄ（約３．４倍）、ｍｉＲ－１７＿１（約６．５倍）、ｍｉＲ－９２ａ（約６．５倍）、及びｍｉＲ－１２６０ａ（約２．４倍）のレベルがすべて、非刺激ＭＳＣに比べて２倍多く誘発され、ｍｉＲ－２２２のレベルが約２倍低減した。

【0094】

本明細書中、本発明の好適な実施形態について図示及び説明したが、当業者にとって、このような実施形態が例示のみを目的として提供されるものであることは明らかであろう。当業者は、本発明から逸脱することなく、多数の修正、変更、及び置換に思い至るであろう。本発明の実施に際し、本明細書に記載の本発明の実施形態の種々の代替が採用されてもよいことが理解されなければならない。

【図1】