(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022074022
(43)【公開日】2022-05-17
(54)【発明の名称】インフルエンザウイルスの核酸アプタマー及び検出
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20220510BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20220510BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20220510BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
C12Q1/68
C12Q1/70
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021170295
(22)【出願日】2021-10-18
(31)【優先権主張番号】P 2020182726
(32)【優先日】2020-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000141897
【氏名又は名称】アークレイ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】特許業務法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】大賀 美咲
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QS36
4B063QX01
(57)【要約】 （修正有）
【課題】Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの核酸アプタマーの提供。
【解決手段】特定の塩基配列、又は、当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは、付加された塩基配列を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーを提供する。
【選択図】図４
【解決手段】特定の塩基配列、又は、当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは、付加された塩基配列を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーを提供する。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は
当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマー。
当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマー。
【請求項2】
配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は
当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸が構成する二次構造においてＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分の構造を保持するように短鎖化された塩基配列
を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマー。
当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸が構成する二次構造においてＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分の構造を保持するように短鎖化された塩基配列
を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマー。
【請求項3】
核酸がＲＮＡである、請求項１又は２に記載の核酸アプタマー。
【請求項4】
アプタマーを構成するヌクレオチドのリボース部位の少なくとも一箇所が、化学修飾されている、請求項１から３のいずれかに記載の核酸アプタマー。
【請求項5】
前記化学修飾が、リボース部位の２'位に対するフルオロ基（２'－Ｆ）若しくはメトキシ基（２'－ＯＭｅ）による修飾、又は水素による置換（２'－ｄｅｏｘｙ）である、請求項４に記載の核酸アプタマー。
【請求項6】
５'末端及び／又は３'末端が修飾されている、請求項１から５のいずれかに記載の核酸アプタマー。
【請求項7】
請求項１又は２に記載の核酸アプタマーと同一の塩基配列又は当該塩基配列と相補的な塩基配列を含み、かつ請求項１又は２に記載の核酸アプタマーに変換可能な、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ。
【請求項8】
請求項１から６のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として含有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出剤。
【請求項9】
請求項１から６のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として含有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルス用診断剤。
【請求項10】
被検査試料に請求項１から６のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出方法。
【請求項11】
被検査試料に請求項１から６のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、インフルエンザウイルスの亜型、株、及びクレードの少なくとも１つを特定又は否定する検査方法。
【請求項12】
Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、
前記アプタマーが、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列からなるモチーフを有する、核酸アプタマー。
前記アプタマーが、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列からなるモチーフを有する、核酸アプタマー。
【請求項13】
前記モチーフは、少なくとも１以上のループ構造を形成し、
前記アプタマーは、前記モチーフを構成する塩基配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに付加された塩基によって形成されたステム構造をさらに有する、請求項１２記載の核酸アプタマー。
前記アプタマーは、前記モチーフを構成する塩基配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに付加された塩基によって形成されたステム構造をさらに有する、請求項１２記載の核酸アプタマー。
【請求項14】
配列番号４の５’末端から１番目～５８番目で示される塩基配列と８５％以上の同一性を有する、請求項１２又は１３に記載の核酸アプタマー。
【請求項15】
Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、
前記アプタマーが、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列からなる第１のモチーフと、配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列からなる第２のモチーフとを有する、核酸アプタマー。
前記アプタマーが、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列からなる第１のモチーフと、配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列からなる第２のモチーフとを有する、核酸アプタマー。
【請求項16】
前記アプタマーは、前記第２のモチーフを含む塩基配列によって形成されるループ構造を有し、前記ループ構造を構成する塩基配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに付加された塩基によって形成されたステム構造をさらに有する、請求項１５に記載の核酸アプタマー。
【請求項17】
配列番号６の５’末端から１番目～７７番目で示される塩基配列に対して８５％以上の同一性を有する、請求項１５又は１６に記載の核酸アプタマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの核酸アプタマーに関する。本開示は、該核酸アプタマーを用いたＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出に関する。
【背景技術】
【0002】
インフルエンザウイルスにはＡ型、Ｂ型、Ｃ型及びＤ型の４つの型があり、季節性インフルエンザとしてヒトに毎年流行を起こすのはＡ型とＢ型である。Ａ型インフルエンザウイルスは、ウイルス表面に突出したタンパク質であるヘマグルチニン（Ｈ１～Ｈ１６の１６種類）とノイラミニダーゼ（Ｎ１～Ｎ９の９種類）の組み合わせによって１４４種類の亜型に分類されており、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２等と表現される。
【0003】
近年、季節性インフルエンザの原因ウイルスとしてヒトに感染し流行しているのは、２００９年に世界的に流行したインフルエンザウイルスＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型（以下、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９ともいう）と、Ｈ３Ｎ２型（以下、Ｈ３Ｎ２ともいう）である。これらのインフルエンザウイルスは高い致死率を示す訳ではないが、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９は、Ｈ３Ｎ２に比べて小児、若年者中心にウイルス性肺炎や脳症を起こす症例が目立ち、Ｈ３Ｎ２は比較的高齢者でインフルエンザ後の細菌性肺炎を起こす症例が目立つといった亜型ごとに異なる臨床経過の報告がある（非特許文献１）。また、複数のＡ亜型が同時期に流行することもあるため、１シーズン中にインフルエンザウイルスに２回感染する患者もいる（非特許文献２）。
Ａ亜型を判別することは、治療観察の観点からだけではなく、反復感染や重複感染予防の観点からも重要性は高い。
Ａ亜型を判別することは、治療観察の観点からだけではなく、反復感染や重複感染予防の観点からも重要性は高い。
【0004】
これまで、亜型を判別するための抗体やアプタマーの開発がされ、これらを用いた亜型判別検査キットも開発されてきている（特許文献１、非特許文献３）。しかしながら、年や地域によって流行する亜型が異なることや、亜型判別のターゲットとなるＨＡやＮＡはウイルス表面上に存在することから変異しやすいため、常に流行株を判別できるとは限らない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０１２－１００６３６号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】インフルエンザ、Vol.19, No.2 (2018-11) P46-47
【非特許文献2】インフルエンザ、Vol.21, No.1 (2020-3) P37
【非特許文献3】Acta Biomaterialia 9 (2013) pp8932-8941
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
既存のアプタマーの中には流行しているインフルエンザウイルスＡ亜型への結合力の低下が見られ、これらのアプタマーを利用して亜型を判別することが困難となっている。
インフルエンザウイルスＡ亜型を判別する診断キットを作成するためには、このウイルスの速いスピードで起こる変異に対応し続けなければならなく、現在の流行株に反応するアプタマーの開発が望まれていた。
インフルエンザウイルスＡ亜型を判別する診断キットを作成するためには、このウイルスの速いスピードで起こる変異に対応し続けなければならなく、現在の流行株に反応するアプタマーの開発が望まれていた。
【0008】
これまで、インフルエンザA亜型判別するためのアプタマーは複数開発されているが、現在のＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型流行株に対して結合するアプタマーは取得されていない。
【0009】
本開示は、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの核酸アプタマーを提供する。
本開示は、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出のための、剤及び方法を提供する。
本開示は、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出のための、剤及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示は、一態様において、配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーに関する。
本開示は、一態様において、配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸が構成する二次構造においてＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する先端領域部分の構造を保持するように短鎖化された塩基配列を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーに関する。
本開示は、一態様において、配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸が構成する二次構造においてＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する先端領域部分の構造を保持するように短鎖化された塩基配列を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーに関する。
【0011】
本開示は、一態様において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、
前記アプタマーが、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列からなるモチーフを有する、核酸アプタマーに関する。
本開示は、一態様において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、
前記アプタマーが、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列からなる第１のモチーフと、配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列からなる第２のモチーフとを有する、核酸アプタマーに関する。
前記アプタマーが、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列からなるモチーフを有する、核酸アプタマーに関する。
本開示は、一態様において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、
前記アプタマーが、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列からなる第１のモチーフと、配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列からなる第２のモチーフとを有する、核酸アプタマーに関する。
【0012】
本開示は、その他の一態様において、本開示の核酸アプタマーを有効成分として含有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出剤に関する。
本開示は、その他の一態様において、本開示の核酸アプタマーを有効成分として含有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルス用診断剤に関する。
本開示は、その他の一態様において、被検査試料に本開示の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出方法に関する。
本開示は、その他の一態様において、被検査試料に本開示の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、インフルエンザウイルスの亜型、株、及びクレードの少なくとも１つを特定する方法に関する。
本開示は、その他の一態様において、本開示の核酸アプタマーを有効成分として含有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルス用診断剤に関する。
本開示は、その他の一態様において、被検査試料に本開示の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出方法に関する。
本開示は、その他の一態様において、被検査試料に本開示の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、インフルエンザウイルスの亜型、株、及びクレードの少なくとも１つを特定する方法に関する。
【発明の効果】
【0013】
本開示によれば、一態様において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに結合可能な核酸アプタマーを提供できる。
本開示によれば、一態様において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出のための剤及び方法を提供できる。
本開示によれば、一態様において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出のための剤及び方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
本開示において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスは、一又は複数の実施形態において、２０１９／２０２０シーズンに流行したインフルエンザの臨床分離株であり、一又は複数の実施形態において、２０１９／２０２０シーズンの、ＨＡ遺伝子系統樹のクレード６Ｂ．１Ａに属するＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの臨床分離株である。
【0016】
［核酸アプタマー］
核酸アプタマーは、一般に、ウイルス、タンパク質、ペプチド、糖類、金属イオン、小分子等に特異的に結合するように人工的に創製された核酸リガンドである。
本開示の核酸アプタマーは、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する。
本開示において、核酸は、一又は複数の実施形態において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの類似体を含む。
ＤＮＡ及びＲＮＡは、一又は複数の実施形態において、それぞれ、化学的に修飾をうけたＤＮＡ及び化学的に修飾をうけたＲＮＡを含みうる。
本開示の核酸アプタマーの塩基配列がＤＮＡ又はＲＮＡで表されていても、例えば、チミンとウラシルが変換されるように、読み替えた塩基配列の核酸として、本開示の核酸アプタマーに含まれうる。
核酸アプタマーは、一般に、ウイルス、タンパク質、ペプチド、糖類、金属イオン、小分子等に特異的に結合するように人工的に創製された核酸リガンドである。
本開示の核酸アプタマーは、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する。
本開示において、核酸は、一又は複数の実施形態において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの類似体を含む。
ＤＮＡ及びＲＮＡは、一又は複数の実施形態において、それぞれ、化学的に修飾をうけたＤＮＡ及び化学的に修飾をうけたＲＮＡを含みうる。
本開示の核酸アプタマーの塩基配列がＤＮＡ又はＲＮＡで表されていても、例えば、チミンとウラシルが変換されるように、読み替えた塩基配列の核酸として、本開示の核酸アプタマーに含まれうる。
【0017】
本開示の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸からなる。
本開示の核酸アプタマーの長さは、一又は複数の実施形態において、１００塩基以下であることが好ましく、例えば、９０塩基以下、８０塩基以下、７０塩基以下、６０塩基以下、５０塩基以下又は４０塩基以下である。本開示の核酸アプタマーの長さは、一又は複数の実施形態において、２０塩基以上、３０塩基以上、４０塩基以上又は５０塩基以上である。本開示の核酸アプタマーの長さは、一又は複数の実施形態において、２０塩基～８０塩基又は３０塩基～９０塩基である。
配列番号４から１１の塩基配列は、ＳＥＬＥＸ法と呼ばれるある特定の標的物質に対して強く結合する核酸アプタマーを選抜する方法により得られたものである。ＳＥＬＥＸ法では、ランダム配列を有する核酸ライブラリーを調製し、標的物質に結合した核酸を選別し、ＰＣＲ増幅するサイクルを複数回繰り返すことで、標的物質に強く結合する核酸アプタマーを得ることができる。現在では、様々な改良ＳＥＬＥＸ法が報告されている。
配列番号４から１１の塩基配列は、ＳＥＬＥＸ法によって合計１０サイクルの選別を行い、得られた特異的なウイルスに結合するＲＮＡプールについてクローニングを行ったものである。具体的には、配列中央の３０塩基をランダム領域とするＤＮＡライブラリーを合成し、ＰＣＲ増幅した後、転写してＲＮＡプールを作成し、このＲＮＡプールに対し、標的とするインフルエンザウイルスと結合するＲＮＡを選別、増幅した。このサイクルを１０回繰り返すことによりＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して特異性及び結合性（親和性）の高い、配列番号４から１１に示される塩基配列のアプタマーが得られた。
本開示の核酸アプタマーの長さは、一又は複数の実施形態において、１００塩基以下であることが好ましく、例えば、９０塩基以下、８０塩基以下、７０塩基以下、６０塩基以下、５０塩基以下又は４０塩基以下である。本開示の核酸アプタマーの長さは、一又は複数の実施形態において、２０塩基以上、３０塩基以上、４０塩基以上又は５０塩基以上である。本開示の核酸アプタマーの長さは、一又は複数の実施形態において、２０塩基～８０塩基又は３０塩基～９０塩基である。
配列番号４から１１の塩基配列は、ＳＥＬＥＸ法と呼ばれるある特定の標的物質に対して強く結合する核酸アプタマーを選抜する方法により得られたものである。ＳＥＬＥＸ法では、ランダム配列を有する核酸ライブラリーを調製し、標的物質に結合した核酸を選別し、ＰＣＲ増幅するサイクルを複数回繰り返すことで、標的物質に強く結合する核酸アプタマーを得ることができる。現在では、様々な改良ＳＥＬＥＸ法が報告されている。
配列番号４から１１の塩基配列は、ＳＥＬＥＸ法によって合計１０サイクルの選別を行い、得られた特異的なウイルスに結合するＲＮＡプールについてクローニングを行ったものである。具体的には、配列中央の３０塩基をランダム領域とするＤＮＡライブラリーを合成し、ＰＣＲ増幅した後、転写してＲＮＡプールを作成し、このＲＮＡプールに対し、標的とするインフルエンザウイルスと結合するＲＮＡを選別、増幅した。このサイクルを１０回繰り返すことによりＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して特異性及び結合性（親和性）の高い、配列番号４から１１に示される塩基配列のアプタマーが得られた。
【0018】
［短縮化アプタマー］
一般に、核酸アプタマーの二次構造モデルは予測できる。核酸アプタマーの二次構造は、先端ループ構造とステム構造からなるステム・ループ構造となっている。実際に標的物質と結合する部位は、主に先端ループを含むステム領域（以下、「先端領域部分」ともいう。）であると考えられる。
配列番号４から１１の塩基配列のＲＮＡで構成される本開示の核酸アプタマーの二次構造モデルを、一又は複数の実施形態において、図２及び３に示す。
本開示の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、配列番号４から１１の塩基配列を、二次構造の先端領域部分の構造を壊さない範囲で短縮化した核酸アプタマーを含みうる。
本開示は、一態様において、配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸が構成する二次構造においてＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分の構造を保持するように短鎖化された塩基配列を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーに関する。
本開示において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分とは、一又は複数の実施形態において、上述の二次構造の先端領域部分である。
一般に、核酸アプタマーの二次構造モデルは予測できる。核酸アプタマーの二次構造は、先端ループ構造とステム構造からなるステム・ループ構造となっている。実際に標的物質と結合する部位は、主に先端ループを含むステム領域（以下、「先端領域部分」ともいう。）であると考えられる。
配列番号４から１１の塩基配列のＲＮＡで構成される本開示の核酸アプタマーの二次構造モデルを、一又は複数の実施形態において、図２及び３に示す。
本開示の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、配列番号４から１１の塩基配列を、二次構造の先端領域部分の構造を壊さない範囲で短縮化した核酸アプタマーを含みうる。
本開示は、一態様において、配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸が構成する二次構造においてＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分の構造を保持するように短鎖化された塩基配列を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーに関する。
本開示において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分とは、一又は複数の実施形態において、上述の二次構造の先端領域部分である。
【0019】
本開示の核酸アプタマーにおいて、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分の構造を構成する塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、下記のいずれかの塩基配列が挙げられる。
配列番号４又は７の５’末端から１５番目～４４番目で示される塩基配列；
配列番号４又は７の５’末端から１１番目～４８番目で示される塩基配列
配列番号６の５’末端から１１番目～２５番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から６番目～２８番目及び３８番目～７２番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から１番目～２８番目及び３８番目～７７番目で示される塩基配列。
本開示の核酸アプタマーにおいて、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する先端領域の構造を構成する塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、下記のいずれかの塩基配列が挙げられる。
配列番号４又は７の５’末端から２５番目～４０番目で示される塩基配列；
配列番号４又は７の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列；
配列番号４又は７の５’末端から１５番目～４４番目で示される塩基配列；
配列番号４又は７の５’末端から１１番目～４８番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から１１番目～２５番目で示される塩基配列。
配列番号４又は７の５’末端から１５番目～４４番目で示される塩基配列；
配列番号４又は７の５’末端から１１番目～４８番目で示される塩基配列
配列番号６の５’末端から１１番目～２５番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から６番目～２８番目及び３８番目～７２番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から１番目～２８番目及び３８番目～７７番目で示される塩基配列。
本開示の核酸アプタマーにおいて、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する先端領域の構造を構成する塩基配列としては、一又は複数の実施形態において、下記のいずれかの塩基配列が挙げられる。
配列番号４又は７の５’末端から２５番目～４０番目で示される塩基配列；
配列番号４又は７の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列；
配列番号４又は７の５’末端から１５番目～４４番目で示される塩基配列；
配列番号４又は７の５’末端から１１番目～４８番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から１１番目～２５番目で示される塩基配列。
【0020】
本開示の核酸アプタマーにおける、１若しくは数個の塩基の「欠失、置換若しくは付加」は、一又は複数の実施形態において、二次構造におけるＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分の構造を保持する範囲で導入され、あるいは、同部分の構造以外の場所に導入される。
本開示において、数個とは、一又は複数の実施形態において、２、３、４、又は５である。
本開示において、数個とは、一又は複数の実施形態において、２、３、４、又は５である。
【0021】
配列番号４から１１の塩基配列において塩基の欠失又は置換を含む核酸アプタマーは、対応する塩基配列を有する核酸アプタマーと比較して、一又は複数の実施形態において、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上若しくは９５％以上、又はほぼ同じ若しくは同じレベルの上記結合能を有していてもよい。配列番号４から１１の塩基配列において塩基の欠失又は置換を含む核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、対応する塩基配列を有する核酸アプタマーよりも高いレベルの上記結合能を有していてもよく、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上高くなったレベルの上記結合能を有していてもよい。
【0022】
本開示の核酸アプタマーの結合能は、一又は複数の実施形態において、Ｈ３Ｎ２（Ａｒｋ１８１９００２）インフルエンザウイルスへの結合量に対するＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスへの結合量で評価できる。本開示の核酸アプタマーにおけるＨ３Ｎ２（Ａｒｋ１８１９００２）インフルエンザウイルスへの結合量に対するＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスへの結合量は、一又は複数の実施形態において、３倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上又は９０倍以上である。本開示において、核酸アプタマーのインフルエンザウイルスへの結合量は、ＲＴ－ｑＰＣＲ法により測定できる。具体的には、実施例に記載の方法により測定できる。
【0023】
［短縮化アプタマーのその他の態様１］
本発明者は、配列番号４で示される塩基配列で形成される核酸アプタマーにおいて、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列が、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合性に関与していることを見出した。よって、本開示の核酸アプタマーは、その他の態様として、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列からなるモチーフを有する。
本発明者は、配列番号４で示される塩基配列で形成される核酸アプタマーにおいて、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列が、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合性に関与していることを見出した。よって、本開示の核酸アプタマーは、その他の態様として、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列からなるモチーフを有する。
【0024】
本態様のモチーフは、特に限定されない一又は複数の実施形態において、１つ以上のループ構造を有していてもよく、好ましくは２つのループ構造と、２つのループ構造間に位置する１つのステム構造とを有していてもよい。本態様の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、２つのループ構造と、２つのループ構造間に位置する１つのステム構造とにより形成された構造とを有する。
【0025】
本開示において「ループ構造」とは、一本鎖核酸において、塩基対を形成せず一本鎖のループ状（環状）の構造をいう。ループ構造は、一又は複数の実施形態において、ステム構造を形成する二本鎖間に位置し、塩基対を形成しないループ状の構造ということもできる。ループ構造を形成する塩基数は、一又は複数の実施形態において、５以上５０以下（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、３４、３５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）である。
【0026】
本開示において「ステム構造」とは、一本鎖核酸が１組以上の相補的な塩基同士が塩基対を形成して形成された鎖状の構造をいう。ステム構造は、一又は複数の実施形態において、構成する塩基の一部又は連続する２以上の塩基が互いに完全に又は部分的に塩基対を形成して形成された鎖状の構造であってもよい。ステム構造を形成する塩基数は、一又は複数の実施形態において、２以上２０以下（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０）である。
本態様の核酸アプタマーのステム構造は、一又は複数の実施形態において、連続した２つのＧ－Ｃ塩基対を含む。
本態様の核酸アプタマーのステム構造は、一又は複数の実施形態において、連続した２つのＧ－Ｃ塩基対を含む。
【0027】
本態様の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、前記モチーフを構成する塩基配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに、２以上の塩基が付加されていてもよく、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００若しくはそれ以上の塩基が付加されていてもよい。一又は複数の実施形態において、付加された塩基の一部又は全部が、塩基対を形成してステム構造を形成してもよい。
【0028】
本態様の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、少なくとも１以上のループ構造を形成する前記モチーフと、該モチーフを構成する塩基配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに付加された塩基によって形成されたステム構造とを含む。ループ構造を形成する塩基は、一又は複数の実施形態において、５以上２０以下（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０）である。
該形態の核酸アプタマーの特に限定されない一又は複数の実施形態としては、下記のいずれかの塩基配列を含む核酸等が挙げられる。
配列番号４の５’末端から１５番目～４４番目で示される塩基配列；
配列番号４の５’末端から１４番目～４５番目で示される塩基配列；
配列番号４の５’末端から１３番目～４６番目で示される塩基配列；
配列番号４の５’末端から１２番目～４７番目で示される塩基配列；
配列番号４の５’末端から１１番目～４８番目で示される塩基配列
該形態の核酸アプタマーの特に限定されない一又は複数の実施形態としては、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列からなるモチーフを有し、かつ、上記５つの配列のいずれかと８５％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸が挙げられる。当該アプタマーは、一又は複数の実施形態において、上記のモチーフの塩基配列が保持されている。
該形態の核酸アプタマーの特に限定されない一又は複数の実施形態としては、下記のいずれかの塩基配列を含む核酸等が挙げられる。
配列番号４の５’末端から１５番目～４４番目で示される塩基配列；
配列番号４の５’末端から１４番目～４５番目で示される塩基配列；
配列番号４の５’末端から１３番目～４６番目で示される塩基配列；
配列番号４の５’末端から１２番目～４７番目で示される塩基配列；
配列番号４の５’末端から１１番目～４８番目で示される塩基配列
該形態の核酸アプタマーの特に限定されない一又は複数の実施形態としては、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列からなるモチーフを有し、かつ、上記５つの配列のいずれかと８５％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸が挙げられる。当該アプタマーは、一又は複数の実施形態において、上記のモチーフの塩基配列が保持されている。
【0029】
本態様の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、上記のモチーフを有し、かつ配列番号４の５’末端から１番目～５８番目で示される塩基配列と８５％以上の同一性を有する。該態様の核酸アプタマーは、特に限定されない一又は複数の実施形態において、１つ以上のループ構造と１つ以上のステム構造を有し、好ましくは前記モチーフによって形成される２つのループ構造及び２つのループ構造間に位置する１つのステム構造と、該モチーフの５’末端及び３’末端に位置するステム構造とを有していてもよい。
【0030】
本開示の核酸アプタマーにおける「配列番号で示される塩基配列と８５％以上の同一性を有する核酸アプタマー」とは、核酸アプタマーが、当該規定される塩基配列そのものであるか、又は該塩基配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する。２つの核酸の「同一性％」は、視覚的検査又は数学的計算により決定することができる。２つの核酸の「同一性％」は、一又は複数の実施形態において、容易に入手可能な配列比較コンピュータープログラムを用いて実施することができる。コンピュータープログラムとしては、一又は複数の実施形態において、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（University of Wisconsin、U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387）、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al. (1999) ibid-Ch. 18）、及びＦＡＳＴＡ（Atschul et al. (1990） J. Mol. Biol. 403-410）等が挙げられる。
８５％以上の同一性を有する核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能及び／又は結合能を有する部分の構造を保持しうる。８５％以上の同一性を有する核酸アプタマーは、対応する塩基配列を有する核酸アプタマーと比較して、一又は複数の実施形態において、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上若しくは９５％以上、又はほぼ同じ若しくは同じレベルの上記結合能を有していてもよい。８５％以上の同一性を有する核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、対応する塩基配列を有する核酸アプタマーよりも高いレベルの上記結合能を有していてもよく、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上高くなったレベルの上記結合能を有していてもよい。
８５％以上の同一性を有する核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能及び／又は結合能を有する部分の構造を保持しうる。８５％以上の同一性を有する核酸アプタマーは、対応する塩基配列を有する核酸アプタマーと比較して、一又は複数の実施形態において、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上若しくは９５％以上、又はほぼ同じ若しくは同じレベルの上記結合能を有していてもよい。８５％以上の同一性を有する核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、対応する塩基配列を有する核酸アプタマーよりも高いレベルの上記結合能を有していてもよく、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上高くなったレベルの上記結合能を有していてもよい。
【0031】
［短縮化アプタマーのその他の態様２］
本発明者は、配列番号６で示される塩基配列で形成される核酸アプタマーにおいて、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列と配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列とが、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合性に関与していることを見出した。よって、本開示の核酸アプタマーは、その他の態様として、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列からなる第１のモチーフと、配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列からなる第２のモチーフとを有する。
本発明者は、配列番号６で示される塩基配列で形成される核酸アプタマーにおいて、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列と配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列とが、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合性に関与していることを見出した。よって、本開示の核酸アプタマーは、その他の態様として、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列からなる第１のモチーフと、配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列からなる第２のモチーフとを有する。
【0032】
第１のモチーフは、特に限定されない一又は複数の実施形態において、ステム・ループ構造を有する。ループ構造を形成する塩基は、一又は複数の実施形態において、５以上１０以下（例えば、５、６、７、８、９又は１０）である。
【0033】
本態様の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、前記第２のモチーフを含む塩基配列によって形成されるループ構造を有していてもよい。本態様の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、該ループ構造を形成する塩基配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに、２以上２０以下（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０）の塩基が付加されていてもよい。付加された塩基は、一又は複数の実施形態において、一部又は全部が塩基対を形成してステム構造を形成してもよい。
【0034】
本態様の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、前記第１のモチーフによって形成されるステム・ループ構造と、前記第２のモチーフを含む塩基配列によって形成されるループ構造と、前記ループ構造を構成する塩基配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに付加された塩基によって形成されたステム構造とを含み、第１のモチーフによって形成されるステム・ループ構造は、第２のモチーフを含む塩基配列によって形成されるループ構造とステム構造を介して連結している。
該形態の核酸アプタマーの特に限定されない一又は複数の実施形態としては、下記のいずれかの塩基配列を含む核酸等が挙げられる。
配列番号６の５’末端から６番目～２８番目及び３８番目～７２番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から５番目～２８番目及び３８番目～７３番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から４番目～２８番目及び３８番目～７４番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から３番目～２８番目及び３８番目～７５番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から２番目～２８番目及び３８番目～７６番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から１番目～２８番目及び３８番目～７７番目で示される塩基配列。
該形態の核酸アプタマーの特に限定されない一又は複数の実施形態としては、上記の第１のモチーフ及び第２のモチーフを有し、かつ、上記６つの配列のいずれかと８５％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸が挙げられる。当該アプタマーは、一又は複数の実施形態において、上記の第１及び第２のモチーフの塩基配列が保持されている。
該形態の核酸アプタマーの特に限定されない一又は複数の実施形態としては、下記のいずれかの塩基配列を含む核酸等が挙げられる。
配列番号６の５’末端から６番目～２８番目及び３８番目～７２番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から５番目～２８番目及び３８番目～７３番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から４番目～２８番目及び３８番目～７４番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から３番目～２８番目及び３８番目～７５番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から２番目～２８番目及び３８番目～７６番目で示される塩基配列；
配列番号６の５’末端から１番目～２８番目及び３８番目～７７番目で示される塩基配列。
該形態の核酸アプタマーの特に限定されない一又は複数の実施形態としては、上記の第１のモチーフ及び第２のモチーフを有し、かつ、上記６つの配列のいずれかと８５％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸が挙げられる。当該アプタマーは、一又は複数の実施形態において、上記の第１及び第２のモチーフの塩基配列が保持されている。
【0035】
本態様の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、上記の第１のモチーフ及び第２のモチーフを有し、かつ、配列番号６の５’末端から１番目～７７番目で示される塩基配列に対して８５％以上の同一性を有する。該態様の核酸アプタマーは、特に限定されない一又は複数の実施形態において、１つ以上のループ構造と１つ以上のステム構造を有し、好ましくは第１のモチーフを含むループ構造と、該ループ構造と連結する第２のモチーフによって形成されるステム・ループ構造と、第１のモチーフを含むループ構造の５’末端及び３’末端に位置するステム構造とを有していてもよい。
【0036】
［化学修飾］
本開示の核酸アプタマーは、上述のとおり、化学修飾を受けた態様を含みうる。
核酸がＲＮＡである場合、リボヌクレアーゼ耐性を付加するために、核酸アプタマーの塩基配列中に化学修飾したリボヌクレオチドを有していてもよい。このような核酸アプタマーは、例えば、核酸アプタマー中のリボヌクレオチドのリボース部位の２'－ＯＨ基を、常法によりフルオロ基（２'－Ｆ）に又はメトキシ基（２'－ＯＭｅ）に、あるいは同リボース部位の２'位を水素に置換（２'－ｄｅｏｘｙ）することにより得られる。
これらの化学修飾は、ピリミジンヌクレオチド部位がリボヌクレアーゼにより分解されやすいので、ピリミジンヌクレオチドに対してより有効である。
これらの化学修飾は、一又は複数の実施形態において、二次構造におけるＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分の構造以外の場所に導入される。これらの化学修飾は、一又は複数の実施形態において、ループ領域のピリミジンヌクレオチドのリボース基について行なわれる。
本開示の核酸アプタマーは、上述のとおり、化学修飾を受けた態様を含みうる。
核酸がＲＮＡである場合、リボヌクレアーゼ耐性を付加するために、核酸アプタマーの塩基配列中に化学修飾したリボヌクレオチドを有していてもよい。このような核酸アプタマーは、例えば、核酸アプタマー中のリボヌクレオチドのリボース部位の２'－ＯＨ基を、常法によりフルオロ基（２'－Ｆ）に又はメトキシ基（２'－ＯＭｅ）に、あるいは同リボース部位の２'位を水素に置換（２'－ｄｅｏｘｙ）することにより得られる。
これらの化学修飾は、ピリミジンヌクレオチド部位がリボヌクレアーゼにより分解されやすいので、ピリミジンヌクレオチドに対してより有効である。
これらの化学修飾は、一又は複数の実施形態において、二次構造におけるＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分の構造以外の場所に導入される。これらの化学修飾は、一又は複数の実施形態において、ループ領域のピリミジンヌクレオチドのリボース基について行なわれる。
【0037】
化学修飾は、その他の一又は複数の実施形態において、核酸アプタマーの５'末端及び／又は３'末端のインバースドデオキシチミジン（ｉｄＴ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による修飾であってもよい。これらにより、アプタマーＲＮＡのリボヌクレアーゼ耐性が向上する。
化学修飾により、生体中での分解による活性の低下を抑制することができるため、本開示の核酸アプタマーを生体内で抗ウイルス作用を発揮する医薬組成物とすることもできる。
本開示は、その他の態様において、本開示の核酸アプタマーを有効成分とする、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに抗ウイルス作用を発揮する医薬組成物に関する。
本開示において、「本開示の核酸アプタマーを有効成分とする」とは、一又は複数の実施形態において、後述する中間体を含有する形態も含まれうる。
化学修飾により、生体中での分解による活性の低下を抑制することができるため、本開示の核酸アプタマーを生体内で抗ウイルス作用を発揮する医薬組成物とすることもできる。
本開示は、その他の態様において、本開示の核酸アプタマーを有効成分とする、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに抗ウイルス作用を発揮する医薬組成物に関する。
本開示において、「本開示の核酸アプタマーを有効成分とする」とは、一又は複数の実施形態において、後述する中間体を含有する形態も含まれうる。
【0038】
［標識体］
本開示の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、後述するとおり、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出に用いることができる。
本開示の核酸アプタマーは、検出のために標識化された態様を含む。
標識は、検出方法によって適宜選択でき、一又は複数の実施形態において、蛍光色素、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、ビオチン、放射性物質などが挙げられる。
本開示の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、後述するとおり、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出に用いることができる。
本開示の核酸アプタマーは、検出のために標識化された態様を含む。
標識は、検出方法によって適宜選択でき、一又は複数の実施形態において、蛍光色素、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、ビオチン、放射性物質などが挙げられる。
【0039】
［中間体］
本開示は、一態様において、本開示の核酸アプタマーに、in vivo又はin vitroにおいて変換可能な中間体に関する。
中間体としては、本開示の核酸アプタマーの塩基配列の同一の塩基配列又は当該塩基配列と相補的な塩基配列を含み、in vitroでの遺伝子操作手段又は生体内若しくは細胞内での反応により本開示の核酸アプタマーに変換されうる、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、及びＲＮＡが挙げられる。これらのＤＮＡ及びＲＮＡには、これらの化学修飾体、及びこれらの組み合わせが含まれうる。
本開示は、一態様において、本開示の核酸アプタマーと同一の塩基配列又は当該塩基配列と相補的な塩基配列を含み、かつ本開示の核酸アプタマーに変換可能な、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡに関する。
本開示は、一態様において、本開示の核酸アプタマーに、in vivo又はin vitroにおいて変換可能な中間体に関する。
中間体としては、本開示の核酸アプタマーの塩基配列の同一の塩基配列又は当該塩基配列と相補的な塩基配列を含み、in vitroでの遺伝子操作手段又は生体内若しくは細胞内での反応により本開示の核酸アプタマーに変換されうる、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、及びＲＮＡが挙げられる。これらのＤＮＡ及びＲＮＡには、これらの化学修飾体、及びこれらの組み合わせが含まれうる。
本開示は、一態様において、本開示の核酸アプタマーと同一の塩基配列又は当該塩基配列と相補的な塩基配列を含み、かつ本開示の核酸アプタマーに変換可能な、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡに関する。
【0040】
［製造方法］
本開示のアプタマーは、一又は複数の実施形態において、塩基配列に基づいて化学合成して製造することができる。ＤＮＡアプタマーは、ＤＮＡ合成機を用いて、ｄＮＴＰを材料として、末端塩基から化学合成することができる。ＲＮＡの合成には、リボース部位の２'水酸基の保護が必要であり、保護基として種々のアミダイトが開発されてきており、２－ｃｙａｎｏｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ（ＣＥＭ）基を用いることができる。
本開示のアプタマーは、一又は複数の実施形態において、合成目的のＲＮＡアプタマーに対応する上記ＤＮＡを化学合成し、これをＰＣＲ増幅し、増幅されたＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼによる転写反応によりＲＮＡアプタマーを合成する方法（in vitro転写法）により製造することができる。
本開示のアプタマーは、一又は複数の実施形態において、相補的ＲＮＡから、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを使用することにより得ることも可能である。
本開示のアプタマーは、一又は複数の実施形態において、塩基配列に基づいて化学合成して製造することができる。ＤＮＡアプタマーは、ＤＮＡ合成機を用いて、ｄＮＴＰを材料として、末端塩基から化学合成することができる。ＲＮＡの合成には、リボース部位の２'水酸基の保護が必要であり、保護基として種々のアミダイトが開発されてきており、２－ｃｙａｎｏｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ（ＣＥＭ）基を用いることができる。
本開示のアプタマーは、一又は複数の実施形態において、合成目的のＲＮＡアプタマーに対応する上記ＤＮＡを化学合成し、これをＰＣＲ増幅し、増幅されたＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼによる転写反応によりＲＮＡアプタマーを合成する方法（in vitro転写法）により製造することができる。
本開示のアプタマーは、一又は複数の実施形態において、相補的ＲＮＡから、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを使用することにより得ることも可能である。
【0041】
［検出方法］
本開示の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、後述するとおり、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出に用いることができる。
本開示は、一態様において、被検査試料に本開示の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出方法（以下、「本開示の検出方法」ともいう）に関する。本開示の検出方法は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸アプタマーを被検査試料に接触させること、及び本開示の核酸アプタマーと前記試料中のＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスとの結合を測定することを含む。あるいは、本開示の検出方法は、本開示の核酸アプタマーを被検査試料に接触させること、及び本開示の核酸アプタマーが、前記試料中のＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに結合するかどうかを測定することを含む。
有効成分として作用させるとは、一又は複数の実施形態において、検出の指標として使用すること、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに結合させること、あるいは、検出メカニズムの主要な因子として使用することを含む。
本開示において、ウイルスの検出とは、あるサンプル中に当該ウイルスを検出することを含み、当該ウイルスを含有することが疑われるサンプル中に当該ウイルスが存在すること又は存在しないことを確認することを含む。
サンプル中に当該ウイルスの存在又は不存在が確認できれば、サンプル中に含まれているインフルエンザウイルスの亜型、株、クレード（系統）の少なくとも１つが特定又は否定することができる。
本開示は、一態様において、被検査試料に本開示の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、インフルエンザウイルスの亜型、株、及びクレードの少なくとも１つを特定又は否定する検査方法に関する。本開示の検査方法は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸アプタマーを被検査試料に接触させること、及び本開示の核酸アプタマーと前記試料中のＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスとの結合を測定することを含む。あるいは、本開示の検査方法は、本開示の核酸アプタマーを被検査試料に接触させること、及び本開示の核酸アプタマーが、前記試料中のＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに結合するかどうかを測定することを含む。
本開示の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、後述するとおり、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出に用いることができる。
本開示は、一態様において、被検査試料に本開示の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出方法（以下、「本開示の検出方法」ともいう）に関する。本開示の検出方法は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸アプタマーを被検査試料に接触させること、及び本開示の核酸アプタマーと前記試料中のＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスとの結合を測定することを含む。あるいは、本開示の検出方法は、本開示の核酸アプタマーを被検査試料に接触させること、及び本開示の核酸アプタマーが、前記試料中のＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに結合するかどうかを測定することを含む。
有効成分として作用させるとは、一又は複数の実施形態において、検出の指標として使用すること、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに結合させること、あるいは、検出メカニズムの主要な因子として使用することを含む。
本開示において、ウイルスの検出とは、あるサンプル中に当該ウイルスを検出することを含み、当該ウイルスを含有することが疑われるサンプル中に当該ウイルスが存在すること又は存在しないことを確認することを含む。
サンプル中に当該ウイルスの存在又は不存在が確認できれば、サンプル中に含まれているインフルエンザウイルスの亜型、株、クレード（系統）の少なくとも１つが特定又は否定することができる。
本開示は、一態様において、被検査試料に本開示の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、インフルエンザウイルスの亜型、株、及びクレードの少なくとも１つを特定又は否定する検査方法に関する。本開示の検査方法は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸アプタマーを被検査試料に接触させること、及び本開示の核酸アプタマーと前記試料中のＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスとの結合を測定することを含む。あるいは、本開示の検査方法は、本開示の核酸アプタマーを被検査試料に接触させること、及び本開示の核酸アプタマーが、前記試料中のＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに結合するかどうかを測定することを含む。
【0042】
本開示における被検査試料としては、一又は複数の実施形態において、被験者の鼻腔・咽頭拭い液及び鼻汁等の採取検体等や、それら検体をニワトリ受精卵及び培養細胞等に与えて感染・増殖させることで得られた溶液等が挙げられる。被検査試料としては、一又は複数の実施形態において、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９株を含有する試料、又は含有する可能性のある試料が挙げられる。
【0043】
蛍光標識核酸アプタマーを用いる検出方法
本開示の検出方法の一又は複数の実施形態として、蛍光標識化した本開示の核酸アプタマーを用いる方法を説明する。
フルオロセイン、ローダミン、テキサスレッド等の蛍光色素で標識した本開示の核酸アプタマーを、被験試料と接触させて結合反応を行い、結合しなかった核酸アプタマーを除去した後、蛍光あるいはその強度を検出及び／又は測定することにより、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出、あるいはその量を測定できる。例えば、標識アプタマーＲＮＡあるいは被験試料のいずれかを固定化した基板を用いて行うことができる。
また、標識アプタマーや被験物質のいずれかを固定化しない方法としては、結合時に蛍光発光する物質を用いて、本開示のアプタマー及び被験試料のいずれかを標識し、結合時の蛍光あるいはその強度を検出、測定することにより行うことも可能である。このような蛍光色素としては、例えば、フルオロセイン、ローダミン、テキサスレッド等が挙げられる。
本開示の検出方法の一又は複数の実施形態として、蛍光標識化した本開示の核酸アプタマーを用いる方法を説明する。
フルオロセイン、ローダミン、テキサスレッド等の蛍光色素で標識した本開示の核酸アプタマーを、被験試料と接触させて結合反応を行い、結合しなかった核酸アプタマーを除去した後、蛍光あるいはその強度を検出及び／又は測定することにより、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出、あるいはその量を測定できる。例えば、標識アプタマーＲＮＡあるいは被験試料のいずれかを固定化した基板を用いて行うことができる。
また、標識アプタマーや被験物質のいずれかを固定化しない方法としては、結合時に蛍光発光する物質を用いて、本開示のアプタマー及び被験試料のいずれかを標識し、結合時の蛍光あるいはその強度を検出、測定することにより行うことも可能である。このような蛍光色素としては、例えば、フルオロセイン、ローダミン、テキサスレッド等が挙げられる。
【0044】
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いる検出方法
本開示の検出方法の一又は複数の実施形態として、蛍光標識をしない本開示の核酸アプタマーを用いる方法を説明する。
ＳＰＲ法は、センサーチップ上に固定化された分子と、センサーチップ上を通過する分子が結合して生じる微細な質量変化を、反射光の屈折率の変化として検出することができる。本開示のアプタマーＲＮＡあるいは標的物質のいずれかを周知の方法でセンサーチップ上の金薄膜表面に固定化し、これに被験物質あるいはアプタマーＲＮＡを供給することで、これらの分子の結合反応をリアルタイムで測定する。
ＳＰＲ法を利用した装置として、例えば、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＢｉａｃｏｒｅＴ１００がある。
本開示の検出方法の一又は複数の実施形態として、蛍光標識をしない本開示の核酸アプタマーを用いる方法を説明する。
ＳＰＲ法は、センサーチップ上に固定化された分子と、センサーチップ上を通過する分子が結合して生じる微細な質量変化を、反射光の屈折率の変化として検出することができる。本開示のアプタマーＲＮＡあるいは標的物質のいずれかを周知の方法でセンサーチップ上の金薄膜表面に固定化し、これに被験物質あるいはアプタマーＲＮＡを供給することで、これらの分子の結合反応をリアルタイムで測定する。
ＳＰＲ法を利用した装置として、例えば、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＢｉａｃｏｒｅＴ１００がある。
【0045】
イムノクロマトグラフィー法を用いる検出方法
本開示の検出方法の一又は複数の実施形態として、イムノクロマトグラフィー法を用いる方法を説明する。
一形態として、サンプルを展開する試験片（支持体）の検出部位にウイルスを固定するための捕捉用物質として本開示の核酸アプタマーを使用するイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。
一形態として、試験片（支持体）の検出部位に固定されたウイルスに結合して標識するための捕捉用物質として本開示の核酸アプタマーを使用するイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。
一形態として、１種類又は２種類の本開示の核酸アプタマーを、サンプルを展開する試験片（支持体）の検出部位にウイルスを固定するための捕捉用物質、及び、試験片（支持体）の検出部位に固定されたウイルスに結合して標識するための捕捉用物質として使用するイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。
標識するための捕捉用物質として使用する本開示の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、標識化された態様の本開示の核酸アプタマーを使用できる。
本開示の検出方法の一又は複数の実施形態として、イムノクロマトグラフィー法を用いる方法を説明する。
一形態として、サンプルを展開する試験片（支持体）の検出部位にウイルスを固定するための捕捉用物質として本開示の核酸アプタマーを使用するイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。
一形態として、試験片（支持体）の検出部位に固定されたウイルスに結合して標識するための捕捉用物質として本開示の核酸アプタマーを使用するイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。
一形態として、１種類又は２種類の本開示の核酸アプタマーを、サンプルを展開する試験片（支持体）の検出部位にウイルスを固定するための捕捉用物質、及び、試験片（支持体）の検出部位に固定されたウイルスに結合して標識するための捕捉用物質として使用するイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。
標識するための捕捉用物質として使用する本開示の核酸アプタマーは、一又は複数の実施形態において、標識化された態様の本開示の核酸アプタマーを使用できる。
【0046】
［診断方法］
本開示の検出方法及び検査方法は、インフルエンザの診断方法に利用できる。
本開示は、その他の態様において、本開示の検出方法又は検査方法により被検査試料中にＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスが存在するか否かを確認すること、及び、その結果から、前記試料を提供した対象が当該ウイルスに感染しているかどうかを判断することを含む診断方法に関する。
本開示の検出方法及び検査方法は、インフルエンザの診断方法に利用できる。
本開示は、その他の態様において、本開示の検出方法又は検査方法により被検査試料中にＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスが存在するか否かを確認すること、及び、その結果から、前記試料を提供した対象が当該ウイルスに感染しているかどうかを判断することを含む診断方法に関する。
【0047】
［検出剤、診断剤、キット］
本開示は、一態様において、本開示の検出方法、検査方法、又は診断方法に用いるための、本開示の核酸アプタマーを有効成分として含有する、検出剤、診断剤、又はキットに関する。
検出剤は、本開示の検出方法及び検査方法に用いることができる。
診断剤は、本開示の診断方法に用いることができる。診断薬の一又は複数の実施形態として、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する治療薬のコンパニオン診断薬が挙げられる。
キットは、本開示の検出方法、検査方法、診断方法に用いることができる。
検出剤、診断剤、及びキットの製造に際しては、適宜、周知の薬学的に許容可能な希釈剤、安定化剤、その他の担体などと組み合わせて用いる。これらは、本開示の核酸アプタマーのほか、検出に用いる試薬や試験片が含まれてもよい。
本開示は、一態様において、本開示の検出方法、検査方法、又は診断方法に用いるための、本開示の核酸アプタマーを有効成分として含有する、検出剤、診断剤、又はキットに関する。
検出剤は、本開示の検出方法及び検査方法に用いることができる。
診断剤は、本開示の診断方法に用いることができる。診断薬の一又は複数の実施形態として、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する治療薬のコンパニオン診断薬が挙げられる。
キットは、本開示の検出方法、検査方法、診断方法に用いることができる。
検出剤、診断剤、及びキットの製造に際しては、適宜、周知の薬学的に許容可能な希釈剤、安定化剤、その他の担体などと組み合わせて用いる。これらは、本開示の核酸アプタマーのほか、検出に用いる試薬や試験片が含まれてもよい。
【0048】
本開示は以下の限定されない一又は複数の実施形態に関しうる。
〔１〕 配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマー。
〔２〕 配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸が構成する二次構造においてＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分の構造を保持するように短鎖化された塩基配列を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマー。
〔３〕 核酸がＲＮＡである、〔１〕、〔２〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマー。
〔４〕 アプタマーを構成するヌクレオチドのリボース部位の少なくとも一箇所が、化学修飾されている、〔１〕から〔３〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマー。
〔５〕 前記化学修飾が、リボース部位の２'位に対するフルオロ基（２'－Ｆ）若しくはメトキシ基（２'－ＯＭｅ）による修飾、又は水素による置換（２'－ｄｅｏｘｙ）である、〔４〕に記載の核酸アプタマー。
〔６〕 ５'末端及び／又は３'末端が修飾されている、〔１〕から〔５〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマー。
〔７〕 〔１〕、〔２〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーと同一の塩基配列又は当該塩基配列と相補的な塩基配列を含み、かつ〔１〕、〔２〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーに変換可能な、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ。
〔８〕 〔１〕から〔６〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として含有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出剤。
〔９〕 〔１〕から〔６〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として含有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルス用診断剤。
〔１０〕 被検査試料に〔１〕から〔６〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出方法。
〔１１〕 被検査試料に〔１〕から〔６〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、インフルエンザウイルスの亜型、株、及びクレードの少なくとも１つを特定又は否定する検査方法。
〔１２〕 Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、
前記アプタマーが、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列からなるモチーフを有する、核酸アプタマー。
〔１３〕 前記モチーフは、少なくとも１以上のループ構造を形成し、
前記核酸アプタマーは、前記モチーフを構成する塩基配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに付加された塩基によって形成されたステム構造をさらに有する、〔１２〕記載の核酸アプタマー。
〔１４〕 配列番号４の５’末端から１番目～５８番目で示される塩基配列と８５％以上の同一性を有する、〔１２〕又は〔１３〕に記載の核酸アプタマー。
〔１５〕 Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、
前記アプタマーが、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列からなる第１のモチーフと、配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列からなる第２のモチーフとを有する、核酸アプタマー。
〔１６〕 前記アプタマーは、前記第２のモチーフを含む塩基配列によって形成するループ構造を有し、前記ループ構造を構成する塩基配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに付加された塩基によって形成されたステム構造をさらに有する、〔１５〕に記載の核酸アプタマー。
〔１７〕 配列番号６の５’末端から１番目～７７番目で示される塩基配列に対して８５％以上の同一性を有する、〔１５〕又は〔１６〕に記載の核酸アプタマー。
〔１〕 配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマー。
〔２〕 配列番号４から１１のいずれかで示される塩基配列、又は当該塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸が構成する二次構造においてＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対する結合能を有する部分の構造を保持するように短鎖化された塩基配列を含む核酸からなる、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマー。
〔３〕 核酸がＲＮＡである、〔１〕、〔２〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマー。
〔４〕 アプタマーを構成するヌクレオチドのリボース部位の少なくとも一箇所が、化学修飾されている、〔１〕から〔３〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマー。
〔５〕 前記化学修飾が、リボース部位の２'位に対するフルオロ基（２'－Ｆ）若しくはメトキシ基（２'－ＯＭｅ）による修飾、又は水素による置換（２'－ｄｅｏｘｙ）である、〔４〕に記載の核酸アプタマー。
〔６〕 ５'末端及び／又は３'末端が修飾されている、〔１〕から〔５〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマー。
〔７〕 〔１〕、〔２〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーと同一の塩基配列又は当該塩基配列と相補的な塩基配列を含み、かつ〔１〕、〔２〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーに変換可能な、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ。
〔８〕 〔１〕から〔６〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として含有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出剤。
〔９〕 〔１〕から〔６〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として含有する、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルス用診断剤。
〔１０〕 被検査試料に〔１〕から〔６〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスの検出方法。
〔１１〕 被検査試料に〔１〕から〔６〕及び〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の核酸アプタマーを有効成分として作用させる工程を含む、インフルエンザウイルスの亜型、株、及びクレードの少なくとも１つを特定又は否定する検査方法。
〔１２〕 Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、
前記アプタマーが、配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目で示される塩基配列からなるモチーフを有する、核酸アプタマー。
〔１３〕 前記モチーフは、少なくとも１以上のループ構造を形成し、
前記核酸アプタマーは、前記モチーフを構成する塩基配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに付加された塩基によって形成されたステム構造をさらに有する、〔１２〕記載の核酸アプタマー。
〔１４〕 配列番号４の５’末端から１番目～５８番目で示される塩基配列と８５％以上の同一性を有する、〔１２〕又は〔１３〕に記載の核酸アプタマー。
〔１５〕 Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスに対して結合能を有する核酸アプタマーであって、
前記アプタマーが、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列からなる第１のモチーフと、配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列からなる第２のモチーフとを有する、核酸アプタマー。
〔１６〕 前記アプタマーは、前記第２のモチーフを含む塩基配列によって形成するループ構造を有し、前記ループ構造を構成する塩基配列の５’末端及び３’末端のそれぞれに付加された塩基によって形成されたステム構造をさらに有する、〔１５〕に記載の核酸アプタマー。
〔１７〕 配列番号６の５’末端から１番目～７７番目で示される塩基配列に対して８５％以上の同一性を有する、〔１５〕又は〔１６〕に記載の核酸アプタマー。
【0049】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例0050】
１．インフルエンザウイルスＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９に特異的なアプタマーのin vitroでの選別
（１－１）臨床分離株の取得、樹立
（１－１－１）インフルエンザ感染者からの検体採取
２０１８／２０１９シーズン及び２０１９／２０２０シーズンにインフルエンザ感染を疑った患者の鼻腔を専用のスワブで拭いとる、若しくは鼻汁を採取し、アークレイ社製インフルエンザ抗原検出キットＳＰＯＴＣＨＥＭ ＦＬＯＲＡ ＦｌｕＡＢを用いて感染の有無を判断した。インフルエンザＡ型陽性であれば患者の鼻汁をキット付属のスワブで採取し、５００～１０００μｌのＶＴＭ（Ｃｏｐａｎ社製）もしくは抗生物質－抗真菌薬混合液（ナカライテスク社製、以下抗生剤）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に懸濁した。
（１－１－２）インフルエンザウイルスの分離培養
Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞を翌日１００％コンフルエントになるように１２ウェルプレートに播種し、一晩３７℃、５％ＣＯ2環境下で培養した。翌日、１００％コンフルエントになった細胞の上清を除去し、５００μｌのＰＢＳ（－）で２回洗浄した。インフルエンザ感染者から採取した希釈検体２００μｌをＭＤＣＫ細胞に添加し、３０分間３４℃５％ＣＯ2環境下でインキュベーションし、ウイルスを細胞表面に接着させた。抗生剤とアセチルトリプシン２．５μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加したＤＭＥＭ培地８００μｌを添加して３４℃５％ＣＯ2環境下で５～７日間培養した。
培養日数ごとに培養上清を１０～５０μｌ採取し、インフルエンザ抗原検出キットキット（アークレイ社製）で測定し、培養上清中のウイルス量をモニタリング、インフルエンザの型判別を行った。
（１－１－３）臨床分離株の亜型判別、ヘマグルチニン遺伝子の塩基配列解析
ウイルス量が増加した細胞の培養上清を全量回収し、３０００ｒｐｍで遠心分離し、その上清を回収した（ウイルス溶液）。このうち上清１４０μｌに含まれるインフルエンザウイルスのＲＮＡを、ウイルスＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。抽出したＲＮＡに対して、リアルタイムＰＣＲ法にて亜型判別を行った。ヘマグルチニン遺伝子の配列解析のため、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商品名）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで抽出したウイルスＲＮＡを逆転写反応し、ＰＣＲによるヘマグルチニン遺伝子全長の増幅を行った。アガロース電気泳動により目的サイズの断片が増幅されたことを確認し、この断片の塩基配列解析を行った。リアルタイムＰＣＲ、クローニング、シーケンスに用いたプライマー、及びプロトコールは、インフルエンザ診断マニュアル第４版を参考にして実施した。
その結果得られた臨床分離株は、ＨＡ遺伝子系統樹のクレード６Ｂ．１Ａに属するＨ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスのウイルス株（以下、［Ａｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）］ともいう）と、クレード３Ｃ．２ａに属するＨ３Ｎ２型インフルエンザウイルスのウイルス株（以下、［Ａｒｋ１８１９００２（Ｈ３Ｎ２）］ともいう）であることが確認された。
（１－１）臨床分離株の取得、樹立
（１－１－１）インフルエンザ感染者からの検体採取
２０１８／２０１９シーズン及び２０１９／２０２０シーズンにインフルエンザ感染を疑った患者の鼻腔を専用のスワブで拭いとる、若しくは鼻汁を採取し、アークレイ社製インフルエンザ抗原検出キットＳＰＯＴＣＨＥＭ ＦＬＯＲＡ ＦｌｕＡＢを用いて感染の有無を判断した。インフルエンザＡ型陽性であれば患者の鼻汁をキット付属のスワブで採取し、５００～１０００μｌのＶＴＭ（Ｃｏｐａｎ社製）もしくは抗生物質－抗真菌薬混合液（ナカライテスク社製、以下抗生剤）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に懸濁した。
（１－１－２）インフルエンザウイルスの分離培養
Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞を翌日１００％コンフルエントになるように１２ウェルプレートに播種し、一晩３７℃、５％ＣＯ2環境下で培養した。翌日、１００％コンフルエントになった細胞の上清を除去し、５００μｌのＰＢＳ（－）で２回洗浄した。インフルエンザ感染者から採取した希釈検体２００μｌをＭＤＣＫ細胞に添加し、３０分間３４℃５％ＣＯ2環境下でインキュベーションし、ウイルスを細胞表面に接着させた。抗生剤とアセチルトリプシン２．５μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加したＤＭＥＭ培地８００μｌを添加して３４℃５％ＣＯ2環境下で５～７日間培養した。
培養日数ごとに培養上清を１０～５０μｌ採取し、インフルエンザ抗原検出キットキット（アークレイ社製）で測定し、培養上清中のウイルス量をモニタリング、インフルエンザの型判別を行った。
（１－１－３）臨床分離株の亜型判別、ヘマグルチニン遺伝子の塩基配列解析
ウイルス量が増加した細胞の培養上清を全量回収し、３０００ｒｐｍで遠心分離し、その上清を回収した（ウイルス溶液）。このうち上清１４０μｌに含まれるインフルエンザウイルスのＲＮＡを、ウイルスＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。抽出したＲＮＡに対して、リアルタイムＰＣＲ法にて亜型判別を行った。ヘマグルチニン遺伝子の配列解析のため、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商品名）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで抽出したウイルスＲＮＡを逆転写反応し、ＰＣＲによるヘマグルチニン遺伝子全長の増幅を行った。アガロース電気泳動により目的サイズの断片が増幅されたことを確認し、この断片の塩基配列解析を行った。リアルタイムＰＣＲ、クローニング、シーケンスに用いたプライマー、及びプロトコールは、インフルエンザ診断マニュアル第４版を参考にして実施した。
その結果得られた臨床分離株は、ＨＡ遺伝子系統樹のクレード６Ｂ．１Ａに属するＨ１Ｎ１ｐｄｍ０９型インフルエンザウイルスのウイルス株（以下、［Ａｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）］ともいう）と、クレード３Ｃ．２ａに属するＨ３Ｎ２型インフルエンザウイルスのウイルス株（以下、［Ａｒｋ１８１９００２（Ｈ３Ｎ２）］ともいう）であることが確認された。
【0051】
以下に示す（１－２）から（１－４）のＳＥＬＥＸ法による核酸アプタマーの選別は、インフルエンザ診断マニュアル第４版を参考に条件を改変して実施した。
（１－２）ＲＮＡランダムプールの作成
以下に示す、中央の３０塩基をランダム領域とする一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のライブラリーを合成してテンプレートとし（配列番号１）、５'末端プライマー（配列番号２）、及び３'末端プライマー（配列番号３）を用いてＰＣＲを行った。
配列番号１：ＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ－（Ｎ）３０－ＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴ
配列番号２：ＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ
配列番号３：ＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧ
次いでＴ７ Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、in vitroでの転写を行い、増幅されたＤＮＡライブラリーをＲＮＡライブラリーに変換した。
（１－２）ＲＮＡランダムプールの作成
以下に示す、中央の３０塩基をランダム領域とする一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のライブラリーを合成してテンプレートとし（配列番号１）、５'末端プライマー（配列番号２）、及び３'末端プライマー（配列番号３）を用いてＰＣＲを行った。
配列番号１：ＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ－（Ｎ）３０－ＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴ
配列番号２：ＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ
配列番号３：ＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧ
次いでＴ７ Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、in vitroでの転写を行い、増幅されたＤＮＡライブラリーをＲＮＡライブラリーに変換した。
【0052】
（１－３）in vitroにおける選別
上記（１－２）で得られたＲＮＡライブラリー（１０μｇ＝４30≒１．１５×１０18通りの異なるＲＮＡ配列）をＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に溶解した。ＲＮＡのコンフォメーションの平衡を促進するために、９５℃で２分間処理して変性させた後、室温で１０分間冷却した。非特異的にターゲットに結合するＲＮＡを除去するため、コンペティターとしてｔＲＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉのトータルｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製））をＲＮＡライブラリー溶液に加えた後、ターゲットとなるウイルス溶液を加えた。各選別サイクルにおいて、最初に、カウンターウイルスとしてＡｒｋ１８１９００２（Ｈ３Ｎ２）を使用し、ネガティブセレクションを行った。このウイルスに結合しなかったＲＮＡを回収し、次いでＡｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）を反応させてポジティブセレクションを行った。各選別サイクルで用いたＲＮＡ（ＲＮＡｐｏｏｌ）、ウイルスタンパク質（Ｃｏｕｎｔｅｒ／ｔａｒｇｅｔ）及びｔＲＮＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）の分子比は表１に示した通りである。
上記（１－２）で得られたＲＮＡライブラリー（１０μｇ＝４30≒１．１５×１０18通りの異なるＲＮＡ配列）をＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に溶解した。ＲＮＡのコンフォメーションの平衡を促進するために、９５℃で２分間処理して変性させた後、室温で１０分間冷却した。非特異的にターゲットに結合するＲＮＡを除去するため、コンペティターとしてｔＲＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉのトータルｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社製））をＲＮＡライブラリー溶液に加えた後、ターゲットとなるウイルス溶液を加えた。各選別サイクルにおいて、最初に、カウンターウイルスとしてＡｒｋ１８１９００２（Ｈ３Ｎ２）を使用し、ネガティブセレクションを行った。このウイルスに結合しなかったＲＮＡを回収し、次いでＡｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）を反応させてポジティブセレクションを行った。各選別サイクルで用いたＲＮＡ（ＲＮＡｐｏｏｌ）、ウイルスタンパク質（Ｃｏｕｎｔｅｒ／ｔａｒｇｅｔ）及びｔＲＮＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）の分子比は表１に示した通りである。
【0053】
ＲＮＡ、ウイルスタンパク質及びｔＲＮＡの混合液１００μＬを室温で１０分間インキュベートした後、"Ｐｏｐ－ｔｏｐ"フィルターホルダー（Ｃｙｔｉｖａ社製）に装着した湿潤済みニトロセルロース・アセテート・フィルター（ＨＡ ＷＰフィルター，０．４５μｍ，径１３．０ｍｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通し、タンパク質に結合したＲＮＡをフィルター上に捕捉させた。その後、１ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでフィルターを洗浄した。フィルター上に捕捉されたウイルスタンパク質に結合したＲＮＡはＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，７Ｍ Ｕｒｅａ，ｐＨ７．４）で溶出し、エタノール沈殿法にてＲＮＡを精製した。精製したＲＮＡに対して、プライマー（配列番号３）、０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２５Ｕ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ付属緩衝液を用いて、２０μｌの反応液中で逆転写反応をし、ｃＤＮＡを得た。ｄＮＴＰｓと逆転写酵素は、変性及びアニーリングステップ（９５℃で２分間処理後、室温で５分間インキュベート）の後、加えた。逆転写は４２℃で４５分間行った。
【0054】
逆転写反応後の混合液２０μｌに８０μｌのＰＣＲ用混合液（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（ＴａＫａＲａＢｉｏ社製），１μＭプライマー）を加え、ＰＣＲによる増幅を行った。ＰＣＲ反応液は９５℃で３０秒間加熱後、９５℃、２０秒；５４℃、１５秒；７２℃、１５秒のサイクルを、適正サイズの産物のバンドが得られるまでの回数（１０－１８サイクル）繰り返した。得られたＰＣＲ産物はエタノール沈殿により精製し、転写反応に用いた。In vitro転写反応はＴ７Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅキットを用いて、３７℃、オーバーナイトで行った。転写合成したＲＮＡ溶液をＤＮａｓｅ Ｉ処理し、反応液を８％変性ポリアクリルアミドゲルで分画した。ＲＮＡをゲルから抽出し、エタノール沈殿により精製した後に定量し、次回の選別及び増幅サイクルに用いた。
【0055】
（１－４）選別方法及び増幅サイクル
インフルエンザウイルスに対する特異性と高い親和性を有するＲＮＡアプタマーを得るために、表１に示したようにＲＮＡとウイルスタンパク質量は選別サイクルごとに変更した。非特異的に結合するＲＮＡの濃縮を避けるために、第２、第４、第６、第８、第９及び第１０の各選別サイクルでは、フィルターではなく９６穴タイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を使用した。プレートでの選別のために、最初にｐＨ８．０のホウ酸緩衝液１ｍｌあたり上記ウイルスタンパク質１００μｇを各ウェルに固定化し、ＢＳＡ（１％ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でブロックした。次いで、各ウェルを洗浄し、選別に使用した。
前のサイクルで得たＲＮＡプールを、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ中で９５℃、２分間変性させた。続いて、室温で１０分間冷却した後、ｔＲＮＡを加え、ウイルスタンパク質が固定化されたウェルに添加した。１０分間インキュベートした後、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ３００μｌ（第２及び第３回目の選別サイクルでは４回、第６及び第８回目の選別サイクルでは６回、第９及びび第１０回目の選別サイクルでは８回）で洗浄し、結合していないＲＮＡを除いた。その後、ウイルスタンパク質結合ＲＮＡを、加熱したＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，７Ｍ Ｕｒｅａ，ｐＨ７．４）で回収し、エタノールで沈殿精製後、逆転写、ＰＣＲ及びin vitroにおける転写により再生した。
インフルエンザウイルスに対する特異性と高い親和性を有するＲＮＡアプタマーを得るために、表１に示したようにＲＮＡとウイルスタンパク質量は選別サイクルごとに変更した。非特異的に結合するＲＮＡの濃縮を避けるために、第２、第４、第６、第８、第９及び第１０の各選別サイクルでは、フィルターではなく９６穴タイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を使用した。プレートでの選別のために、最初にｐＨ８．０のホウ酸緩衝液１ｍｌあたり上記ウイルスタンパク質１００μｇを各ウェルに固定化し、ＢＳＡ（１％ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でブロックした。次いで、各ウェルを洗浄し、選別に使用した。
前のサイクルで得たＲＮＡプールを、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ中で９５℃、２分間変性させた。続いて、室温で１０分間冷却した後、ｔＲＮＡを加え、ウイルスタンパク質が固定化されたウェルに添加した。１０分間インキュベートした後、Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ３００μｌ（第２及び第３回目の選別サイクルでは４回、第６及び第８回目の選別サイクルでは６回、第９及びび第１０回目の選別サイクルでは８回）で洗浄し、結合していないＲＮＡを除いた。その後、ウイルスタンパク質結合ＲＮＡを、加熱したＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，７Ｍ Ｕｒｅａ，ｐＨ７．４）で回収し、エタノールで沈殿精製後、逆転写、ＰＣＲ及びin vitroにおける転写により再生した。
【0056】
【表1】
【0057】
（１－５）ＲＮＡの濃縮評価
高親和性のアプタマーが濃縮されていく進行状況とその特異性を評価するため、第０、第１、第５及び第１０回目の選別サイクルにおけるＲＮＡプールの結合活性をフィルター結合定量法（ＲＴ－ｑＰＣＲ法）で解析した。各選別サイクルのＲＮＡプールを準備しＡｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）とＡｒｋ１８１９００２（Ｈ３Ｎ２）と溶液中で結合させた。結合反応は、モル濃度で１０倍過剰の大腸菌ｔＲＮＡを非特異的競争阻害剤として加え、５０ｎＭのＲＮＡと１．５８μｇのウイルスタンパク質（ヘマグルチニン分子量換算で５００ｎＭ）を混合して行った。反応液をニトロセルロース・アセテート・フィルターに通し、ウイルスに結合したＲＮＡをフィルター上に捕捉させて、２ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。フィルター上に捕捉されたウイルスタンパク質結合ＲＮＡは２００μｌのＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒに浸して加熱して溶出させ、エタノール沈殿法でＲＮＡを回収した。ＲＮＡ全量を２０μＭ プライマー（配列番号３），０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ，２５Ｕ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ付属緩衝液を含む２０μｌの反応液中で逆転写した。リアルタイムＰＣＲ用試薬ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ社製）を１０μｌ、５μＭフォワードプライマー １μｌ、５μＭリバースプライマー １μｌ、ｃＤＮＡ９μｌを混ぜて逆転写産物を鋳型にｑＰＣＲを実施した。結合活性は、第０回目の選別サイクルにおけるＲＮＡプールのウイルスへの結合量を１とした場合の、各選別サイクルにおけるＲＮＡプールのＲＮＡ結合量の比で表した（図１）。第１０回目の選別サイクル後のフィルターに捕捉されたＲＮＡの割合は、Ａｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）に結合するＲＮＡは７．０倍となり、Ａｒｋ１８１９００２（Ｈ３Ｎ２）に結合するＲＮＡは２．０倍となった。
高親和性のアプタマーが濃縮されていく進行状況とその特異性を評価するため、第０、第１、第５及び第１０回目の選別サイクルにおけるＲＮＡプールの結合活性をフィルター結合定量法（ＲＴ－ｑＰＣＲ法）で解析した。各選別サイクルのＲＮＡプールを準備しＡｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）とＡｒｋ１８１９００２（Ｈ３Ｎ２）と溶液中で結合させた。結合反応は、モル濃度で１０倍過剰の大腸菌ｔＲＮＡを非特異的競争阻害剤として加え、５０ｎＭのＲＮＡと１．５８μｇのウイルスタンパク質（ヘマグルチニン分子量換算で５００ｎＭ）を混合して行った。反応液をニトロセルロース・アセテート・フィルターに通し、ウイルスに結合したＲＮＡをフィルター上に捕捉させて、２ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。フィルター上に捕捉されたウイルスタンパク質結合ＲＮＡは２００μｌのＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒに浸して加熱して溶出させ、エタノール沈殿法でＲＮＡを回収した。ＲＮＡ全量を２０μＭ プライマー（配列番号３），０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ，２５Ｕ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ付属緩衝液を含む２０μｌの反応液中で逆転写した。リアルタイムＰＣＲ用試薬ＰｏｗｅｒＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ社製）を１０μｌ、５μＭフォワードプライマー １μｌ、５μＭリバースプライマー １μｌ、ｃＤＮＡ９μｌを混ぜて逆転写産物を鋳型にｑＰＣＲを実施した。結合活性は、第０回目の選別サイクルにおけるＲＮＡプールのウイルスへの結合量を１とした場合の、各選別サイクルにおけるＲＮＡプールのＲＮＡ結合量の比で表した（図１）。第１０回目の選別サイクル後のフィルターに捕捉されたＲＮＡの割合は、Ａｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）に結合するＲＮＡは７．０倍となり、Ａｒｋ１８１９００２（Ｈ３Ｎ２）に結合するＲＮＡは２．０倍となった。
【0058】
（１－６）アプタマーの分析
個別のアプタマーを得るために、第１０回目の選別サイクルで得たＰＣＲ産物をＴＡクローニング・ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、大腸菌にトランスフォームした。プラスミド精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で個々のプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ塩基配列を解読し、そのＤＮＡ塩基配列に相当するＲＮＡ塩基配列を求めた。配列が解読されたＲＮＡのクローンは全部で１０種類の配列に分類された。
個別のアプタマーを得るために、第１０回目の選別サイクルで得たＰＣＲ産物をＴＡクローニング・ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、大腸菌にトランスフォームした。プラスミド精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で個々のプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ塩基配列を解読し、そのＤＮＡ塩基配列に相当するＲＮＡ塩基配列を求めた。配列が解読されたＲＮＡのクローンは全部で１０種類の配列に分類された。
【0059】
Ｐ３０－１０－ｈ１－１：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＵＡＧＵＡＧＣＣＣＧＧＧＵＧＵＧＧＧＵＵＵＡＵＧＧＵＣＧＣＣＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号４）
Ｐ３０－１０－ｈ１－２：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＣＧＡＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧＧＵＧＧＧＵＧＧＧＣＧＣＧＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号５）
Ｐ３０－１０－ｈ１－３：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＵＧＵＣＧＡＵＧＵＧＵＡＵＣＵＵＡＵＵＵＧＵＵＵＧＵＵＵＧＵＵＵＧＵＵＵＧＵＵＵＧＵＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号６）
Ｐ３０－１０－ｈ１－４：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＵＡＵＧＧＧＵＵＧＡＧＵＵＣＵＧＵＡＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号７）
Ｐ３０－１０－ｈ１－５：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＵＣＣＣＣＵＣＣＣＵＣＧＵＡＵＣＧＵＡＵＧＵＧＣＧＵＵＵＧＣＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号８）
Ｐ３０－１０－ｈ１－６：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＵＡＧＵＡＧＣＣＣＧＧＧＵＧＵＧＧＧＵＵＵＡＵＧＧＣＣＧＣＣＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号９）
Ｐ３０－１０－ｈ１－７：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＵＡＧＵＡＧＣＣＣＧＧＧＵＧＵＧＧＧＵＵＵＡＵＧＧＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号１０）
Ｐ３０－１０－ｈ１－８：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＣＧＡＵＵＧＵＧＵＵＧＵＧＧＵＧＧＧＵＧＧＧＣＧＣＧＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号１１）
Ｐ３０－１０－ｈ１－９：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＣＡＵＵＵＧＵＧＧＧＵＧＧＵＧＵＧＧＧＵＧＧＣＵＧＵＵＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号１２）
Ｐ３０－１０－ｈ１－１０：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＧＵＣＧＧＵＧＵＡＵＡＡＵＵＧＵＡＧＵＵＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号１３）
Ｐ３０－１０－ｈ１－２：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＣＧＡＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧＧＵＧＧＧＵＧＧＧＣＧＣＧＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号５）
Ｐ３０－１０－ｈ１－３：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＵＧＵＣＧＡＵＧＵＧＵＡＵＣＵＵＡＵＵＵＧＵＵＵＧＵＵＵＧＵＵＵＧＵＵＵＧＵＵＵＧＵＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号６）
Ｐ３０－１０－ｈ１－４：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＵＡＵＧＧＧＵＵＧＡＧＵＵＣＵＧＵＡＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号７）
Ｐ３０－１０－ｈ１－５：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＵＣＣＣＣＵＣＣＣＵＣＧＵＡＵＣＧＵＡＵＧＵＧＣＧＵＵＵＧＣＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号８）
Ｐ３０－１０－ｈ１－６：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＵＡＧＵＡＧＣＣＣＧＧＧＵＧＵＧＧＧＵＵＵＡＵＧＧＣＣＧＣＣＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号９）
Ｐ３０－１０－ｈ１－７：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＵＡＧＵＡＧＣＣＣＧＧＧＵＧＵＧＧＧＵＵＵＡＵＧＧＵＣＧＵＣＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号１０）
Ｐ３０－１０－ｈ１－８：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＣＧＡＵＵＧＵＧＵＵＧＵＧＧＵＧＧＧＵＧＧＧＣＧＣＧＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号１１）
Ｐ３０－１０－ｈ１－９：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＣＡＵＵＵＧＵＧＧＧＵＧＧＵＧＵＧＧＧＵＧＧＣＵＧＵＵＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号１２）
Ｐ３０－１０－ｈ１－１０：ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＧＵＣＧＧＵＧＵＡＵＡＡＵＵＧＵＡＧＵＵＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＵＵＧＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ（配列番号１３）
【0060】
Ａｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）をターゲットとして選別されたＲＮＡの塩基配列のうち、アプタマーＰ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）は、全体の６３．５％を占め、また、アプタマーＰ３０－１０－ｈ１－２（配列番号５）は、全体の１７．３％を占めていた。Ｐ３０－１０－ｈ１－３（配列番号６）、Ｐ３０－１０－ｈ１－４（配列番号７）はそれぞれ全体の３．８％、Ｐ３０－１０－ｈ１－５～Ｐ３０－１０－ｈ１－１０（配列番号８～１３）はそれぞれ全体の１．９％を占めていた。さらに、Ｐ３０－１０－ｈ１－６及びＰ３０－１０－ｈ１－７は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１と比べて１塩基のみ異なる配列であった。二次構造解析ソフト「Ｔｈｅ ｍｆｏｌｄ Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ」（ｈｔｔｐ：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ／ＲＮＡ－Ｆｏｌｄｉｎｇ－Ｆｏｒｍ上で解析可能）を用いて得られたアプタマーの二次構造予測を行った。二次構造は各アプタマーＲＮＡにつき複数の構造が予測される場合があるが、それぞれのアプタマーＲＮＡにつき最も安定と予測された構造を示した（図２及び３）。
【0061】
２．フィルター結合定量法（ＲＴ－ｑＰＣＲ法）によるアプタマーと各ウイルスタンパク質との親和性解析
上記１．で選別された１０個のアプタマーとインフルエンザウイルス臨床分離株Ａｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）との結合効率をフィルター結合定量法（前述１－５）によって求めた（比較例１，２、及び実験例１～１０）。その結果を表２及び図４に示す。
比較例として、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに特異的な公知のアプタマーであるＤ－１２（配列番号１４）及びＤ－２６（配列番号１５）を用いた（特開２０１２－１００６３６）。なお、Ｄ－２６は、ピリミジン塩基の２'位のＯＨをＦに置換したＤ２６（２'－Ｆ）として用いた。
アプタマーＤ１２：ＧＧＡＧＣＵＣＡＧＣＣＵＵＣＡＣＵＧＣＣＡＡＡＧＵＧＣＧＡＧＧＣＡＧＵＧＵＧＧＵＧＣＵＧＵＣＣＵＡＣＧＡＧＵＵＣＵＡＡＡＧＵＵＣＧＵＵＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＵＣＡＡＣＡＵＧＵＵＵＡＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＵＣＧＧＡＵＣＣ（配列番号１４）
アプタマーＤ２６：ＧＧＡＧＣＵＣＡＧＣＣＵＵＣＡＣＵＧＣＣＡＡＡＡＡＧＵＵＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＵＵＧＣＧＡＧＣＵＧＡＵＣＣＧＧＵＧＡＣＵＧＧＣＵＡＣＡＧＧＡＧＧＣＣＵＵＧＵＣＣＡＣＧＧＣＣＧＵＡＵＵＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＵＣＧＧＡＵＣＣ（配列番号１５）
上記１．で選別された１０個のアプタマーとインフルエンザウイルス臨床分離株Ａｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）との結合効率をフィルター結合定量法（前述１－５）によって求めた（比較例１，２、及び実験例１～１０）。その結果を表２及び図４に示す。
比較例として、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに特異的な公知のアプタマーであるＤ－１２（配列番号１４）及びＤ－２６（配列番号１５）を用いた（特開２０１２－１００６３６）。なお、Ｄ－２６は、ピリミジン塩基の２'位のＯＨをＦに置換したＤ２６（２'－Ｆ）として用いた。
アプタマーＤ１２：ＧＧＡＧＣＵＣＡＧＣＣＵＵＣＡＣＵＧＣＣＡＡＡＧＵＧＣＧＡＧＧＣＡＧＵＧＵＧＧＵＧＣＵＧＵＣＣＵＡＣＧＡＧＵＵＣＵＡＡＡＧＵＵＣＧＵＵＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＵＣＡＡＣＡＵＧＵＵＵＡＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＵＣＧＧＡＵＣＣ（配列番号１４）
アプタマーＤ２６：ＧＧＡＧＣＵＣＡＧＣＣＵＵＣＡＣＵＧＣＣＡＡＡＡＡＧＵＵＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＵＵＧＣＧＡＧＣＵＧＡＵＣＣＧＧＵＧＡＣＵＧＧＣＵＡＣＡＧＧＡＧＧＣＣＵＵＧＵＣＣＡＣＧＧＣＣＧＵＡＵＵＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＵＣＧＧＡＵＣＣ（配列番号１５）
【0062】
アプタマーＰ３０－１０－ｈ１－１、Ｐ３０－１０－ｈ１－２、Ｐ３０－１０－ｈ１－３、Ｐ３０－１０－ｈ１－４、Ｐ３０－１０－ｈ１－５、Ｐ３０－１０－ｈ１－６、Ｐ３０－１０－ｈ１－７、及びＰ３０－１０－ｈ１－８（実験例１～８）は、Ａｒｋ１８１９００２（Ｈ３Ｎ２）に比べてＡｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）に対する結合量が多かった。Ｐ３０－１０－ｈ１－１、Ｐ３０－１０－ｈ１－２、Ｐ３０－１０－ｈ１－３、Ｐ３０－１０－ｈ１－４、Ｐ３０－１０－ｈ１－５、Ｐ３０－１０－ｈ１－６、Ｐ３０－１０－ｈ１－７及びＰ３０－１０－ｈ１－８は既存のアプタマーＤ１２及びＤ２６（２′－Ｆ）と比較して強い結合力を持つアプタマーであることが示された。Ａｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）、Ａｒｋ１８１９００２（Ｈ３Ｎ２）に対するアプタマーＲＮＡ結合量は表２に示す通りであった。
【0063】
【表2】
【0064】
＜変異型アプタマーの結合評価＞
アプタマーの標的物質への結合に必要な配列を同定するため、図６に示す通り、一部配列を欠損、挿入もしくは変異させた変異型アプタマーを作成し、Ａｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）との結合性を評価した。
具体的には、ＳＥＬＥＸ法により取得したアプタマー（Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）及びＰ３０－１０－ｈ１－３（配列番号６））に対してビオチン修飾したものを用い、このビオチン修飾アプタマーのウイルスタンパク質へ結合が、未標識の変異型アプタマーを添加することによってどの程度阻害されるかを測定することで、変異型アプタマーのウイルスタンパク質への結合能を評価した。
アプタマーの標的物質への結合に必要な配列を同定するため、図６に示す通り、一部配列を欠損、挿入もしくは変異させた変異型アプタマーを作成し、Ａｒｋ１９００７（Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９）との結合性を評価した。
具体的には、ＳＥＬＥＸ法により取得したアプタマー（Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）及びＰ３０－１０－ｈ１－３（配列番号６））に対してビオチン修飾したものを用い、このビオチン修飾アプタマーのウイルスタンパク質へ結合が、未標識の変異型アプタマーを添加することによってどの程度阻害されるかを測定することで、変異型アプタマーのウイルスタンパク質への結合能を評価した。
【0065】
図２に記載したように予測されるＲＮＡアプタマーの二次構造に基づくと、ウイルスタンパク質への結合に必要な領域（モチーフ）はステム・ループ構造の配列であると推定される。
Ｐ３０－１０－ｈ１－１において、まず初めに、図７に記載の領域を欠損させた４つの変異型アプタマー（配列番号１６～１９）を作成し、これらのアプタマー結合阻害活性を評価した。
具体的には、Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ１（配列番号１６）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の３’末端から１６塩基を欠損させた。Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ２（配列番号１７）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から７～１０番目の塩基及び４９～５２番目の塩基を欠損させた。Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ３（配列番号１８）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から１８～２４番目の塩基を欠損させた。Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ４（配列番号１９）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から３０～３５番目の塩基を欠損させた。
その結果、Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ３（配列番号１８）及びＰ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ４（配列番号１９）の変異型アプタマーはビオチン修飾アプタマーの結合阻害活性を示さなかった。このため、これらの変異型アプタマーで欠損させた部位がウイルスタンパク質への結合に必要な領域（モチーフ）であると推定された（図８）。つまり、配列番号４の５’末端から１７番目～２４番目及び５’末端から３０番目～３５番目で示される塩基配列は、ウイルスタンパク質への結合に必要となりうるコア配列（モチーフ）であると予想される。
Ｐ３０－１０－ｈ１－１において、まず初めに、図７に記載の領域を欠損させた４つの変異型アプタマー（配列番号１６～１９）を作成し、これらのアプタマー結合阻害活性を評価した。
具体的には、Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ１（配列番号１６）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の３’末端から１６塩基を欠損させた。Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ２（配列番号１７）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から７～１０番目の塩基及び４９～５２番目の塩基を欠損させた。Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ３（配列番号１８）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から１８～２４番目の塩基を欠損させた。Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ４（配列番号１９）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から３０～３５番目の塩基を欠損させた。
その結果、Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ３（配列番号１８）及びＰ３０－１０－ｈ１－１＿Ｄ４（配列番号１９）の変異型アプタマーはビオチン修飾アプタマーの結合阻害活性を示さなかった。このため、これらの変異型アプタマーで欠損させた部位がウイルスタンパク質への結合に必要な領域（モチーフ）であると推定された（図８）。つまり、配列番号４の５’末端から１７番目～２４番目及び５’末端から３０番目～３５番目で示される塩基配列は、ウイルスタンパク質への結合に必要となりうるコア配列（モチーフ）であると予想される。
【0066】
これらは二つのループ構造を指していることから、図９の通り、二つのループ構造をつなぐ領域の塩基に変異を加えた変異型アプタマーを６種作製した（配列番号２０～２５）。作製した変異型アプタマーにおいて、del1及びdel2は欠損型（図９の四角枠内の塩基を欠損）、in1及びin2は挿入型（図９の矢印箇所に挿入）、mt1及びmt2は点変異型（図９の四角枠内の塩基を置換）の変異型アプタマーである。具体的には、Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿ｄｅｌ１（配列番号２０）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から２７番目の塩基（Ｃ）を欠損させ、３８番目の塩基（Ｇ）を欠損させた。Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿ｄｅｌ２（配列番号２１）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から２５及び２６番目の塩基（ＡＧ）を欠損させ、３８及び３９番目の塩基（ＧＵ）を欠損させた。Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿ｉｎ１（配列番号２２）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から２７番目の塩基（Ｃ）と２８番目の塩基（Ｃ）との間に１塩基（Ａ）を挿入し、３７番目の塩基（Ｇ）と３８番目の塩基（Ｇ）との間に１塩基（Ａ）を挿入した。Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿ｉｎ２（配列番号２３）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から２７番目の塩基（Ｃ）と２８番目の塩基（Ｃ）との間に２塩基（ＣＣ）を挿入し、３７番目の塩基（Ｇ）と３８番目の塩基（Ｇ）との間に２塩基（ＧＧ）を挿入した。Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿ｍｔ１（配列番号２４）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から３９番目の塩基（Ｕ）をＣに変異させた。Ｐ３０－１０－ｈ１－１＿ｍｔ２（配列番号２５）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－１（配列番号４）の５’末端から２７番目の塩基（Ｃ）をＡに変異させた。
これらの変異型アプタマーのＨ１Ｎ１ｐｄｍ０９型ウイルスタンパク質に対する結合阻害活性を評価した結果、いずれの変異型アプタマーにおいても結合阻害活性を示さなかった（図１０）。したがって、二つのループ構造を含むステム・ループ構造（配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目）がウイルスタンパク質への結合に重要な領域（モチーフ）であることが示された。
これらの変異型アプタマーのＨ１Ｎ１ｐｄｍ０９型ウイルスタンパク質に対する結合阻害活性を評価した結果、いずれの変異型アプタマーにおいても結合阻害活性を示さなかった（図１０）。したがって、二つのループ構造を含むステム・ループ構造（配列番号４の５’末端から１６番目～４３番目）がウイルスタンパク質への結合に重要な領域（モチーフ）であることが示された。
【0067】
Ｐ３０－１０－ｈ１－３（配列番号６）についても同様に、図１１の通り３種類の変異型アプタマー（配列番号２６～２８）を作成し、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ０９型ウイルスタンパク質に対する結合阻害活性を評価した。Ｐ３０－１０－ｈ１－３＿ｃｏｍｐｌ１（配列番号２６）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－３（配列番号６）の５’末端から３１番目～３５番目の塩基を変異させた。具体的には、３１番目の塩基（Ｕ）をＡに、３２番目の塩基（Ａ）をＧに、３３番目の塩基（Ｕ）をＡに、３４番目の塩基（Ｃ）をＵに、３５番目の塩基（Ｕ）をＡに変異させた。Ｐ３０－１０－ｈ１－３＿ｃｏｍｐｌ２（配列番号２７）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－３（配列番号６）の５’末端から１５番目～２１番目の塩基を変異させた。具体的には、１５番目の塩基（Ｃ）をＡに、１６番目の塩基（Ａ）をＣに、１７番目の塩基（Ｇ）をＵに、１８番目の塩基（Ａ）をＵに、１９番目の塩基（Ａ）をＣに、２０番目の塩基（Ｇ）をＵに、２１番目の塩基（Ｕ）をＧに変異させた。Ｐ３０－１０－ｈ１－３＿ｄｅｌ１（配列番号２８）は、Ｐ３０－１０－ｈ１－３（配列番号６）の５’末端から３９～６２番目の２４塩基を欠失させた。
その結果、Ｐ３０－１０－ｈ１－３＿ｃｏｍｐｌ２及びＰ３０－１０－ｈ１－３＿ｄｅｌ１の結合阻害活性が低下した（図１２）。したがって、これらの変異させた領域がウイルスタンパク質への結合に重要であることが示唆された。つまり、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列及び配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列は、ウイルスタンパク質への結合に必要となりうるコア配列（モチーフ）であるか、一部にコア配列を含むと予想される。
その結果、Ｐ３０－１０－ｈ１－３＿ｃｏｍｐｌ２及びＰ３０－１０－ｈ１－３＿ｄｅｌ１の結合阻害活性が低下した（図１２）。したがって、これらの変異させた領域がウイルスタンパク質への結合に重要であることが示唆された。つまり、配列番号６の５’末端から１２番目～２４番目で示される塩基配列及び配列番号６の５’末端から３９番目～６２番目で示される塩基配列は、ウイルスタンパク質への結合に必要となりうるコア配列（モチーフ）であるか、一部にコア配列を含むと予想される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】