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特開2022-74140疎水性物質の生産能が向上した組換え微生物及びその製造のための細胞膜エンジニアリング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022074140
(43)【公開日】2022-05-17
(54)【発明の名称】疎水性物質の生産能が向上した組換え微生物及びその製造のための細胞膜エンジニアリング方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20220510BHJP
C12P 1/04 20060101ALI20220510BHJP
C12P 23/00 20060101ALI20220510BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220510BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220510BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220510BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20220510BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20220510BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P1/04 Z
C12P23/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
C12N15/31
C12N15/52 Z
【審査請求】有
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021179218
(22)【出願日】2021-11-02
(31)【優先権主張番号】10-2020-0144521
(32)【優先日】2020-11-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(71)【出願人】
【識別番号】514291196
【氏名又は名称】コリア アドバンスト インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100090251
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】イ サンヨプ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン ドンス
(72)【発明者】
【氏名】パク ソンヨン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AH01
4B064CA19
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC03
4B065CA02
4B065CA41
4B065CA44
4B065CA60
(57)【要約】 （修正有）
【課題】疎水性物質の生産能が向上した組換え微生物及びその製造のための細胞膜エンジニアリング方法を提供する。
【解決手段】細胞形態関連遺伝子、及び細胞外膜小胞体関連遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子が抑制されており；及び／又は細胞内膜小胞体関連遺伝子が過発現又は導入されており、次のいずれか一つ以上の特徴を有するようにエンジニアリングされた組換え微生物を提供する：
ｉ）細胞膜面積の増加；ｉｉ）細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加；及びｉｉｉ）細胞内膜小胞体形成の増加。
【選択図】なし
【解決手段】細胞形態関連遺伝子、及び細胞外膜小胞体関連遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子が抑制されており；及び／又は細胞内膜小胞体関連遺伝子が過発現又は導入されており、次のいずれか一つ以上の特徴を有するようにエンジニアリングされた組換え微生物を提供する：
ｉ）細胞膜面積の増加；ｉｉ）細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加；及びｉｉｉ）細胞内膜小胞体形成の増加。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞形態関連遺伝子、及び細胞外膜小胞体関連遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子が抑制されており；及び／又は
細胞内膜小胞体関連遺伝子が過発現又は導入されており、
次のいずれか一つ以上の特徴を有するようにエンジニアリングされた組換え微生物：
ｉ）細胞膜面積の増加；
ｉｉ）細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加；及び
ｉｉｉ）細胞内膜小胞体形成の増加。
細胞内膜小胞体関連遺伝子が過発現又は導入されており、
次のいずれか一つ以上の特徴を有するようにエンジニアリングされた組換え微生物：
ｉ）細胞膜面積の増加；
ｉｉ）細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加；及び
ｉｉｉ）細胞内膜小胞体形成の増加。
【請求項2】
前記細胞形態関連遺伝子は、細胞分裂遺伝子、細胞壁合成遺伝子及び細胞壁維持遺伝子からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項3】
前記細胞形態関連遺伝子は、
ｒｏｄＺ（細胞骨格タンパク質）、ｆｔｓＡ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＢ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＩ（ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ）、ｆｔｓＬ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＱ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＷ（プロバブルペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ）、ｆｔｓＺ（細胞分裂タンパク質）、ｍｉｎＤ（セプタムサイト決定タンパク質）、ｍｒｄＡ（ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ）、ｍｒｄＢ（ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ）、ｍｒｅＢ（細胞形態決定タンパク質）、ｍｒｅＣ（細胞形態決定タンパク質）、ｚｉｐＡ（細胞分裂タンパク質）、ｍｕｒＥ（ＵＤＰ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ－２，６－ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ｌｉｇａｓｅ）、ｐｂｐＣ（ペニシリン結合タンパク質１Ｃ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
ｒｏｄＺ（細胞骨格タンパク質）、ｆｔｓＡ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＢ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＩ（ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ）、ｆｔｓＬ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＱ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＷ（プロバブルペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ）、ｆｔｓＺ（細胞分裂タンパク質）、ｍｉｎＤ（セプタムサイト決定タンパク質）、ｍｒｄＡ（ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ）、ｍｒｄＢ（ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ）、ｍｒｅＢ（細胞形態決定タンパク質）、ｍｒｅＣ（細胞形態決定タンパク質）、ｚｉｐＡ（細胞分裂タンパク質）、ｍｕｒＥ（ＵＤＰ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ－２，６－ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ｌｉｇａｓｅ）、ｐｂｐＣ（ペニシリン結合タンパク質１Ｃ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項4】
前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は、細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持関連遺伝子、細胞外膜タンパク質発現遺伝子、細胞膜代謝関連遺伝子からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項5】
前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は、
ｒｓｅＡ（Ａｎｔｉ－ｓｉｇｍａ－Ｅ ｆａｃｔｏｒ）、ｒｓｅＢ（Ｓｉｇｍａ－Ｅ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆｆＤ（ＵＤＰ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｒｆｆＣ（ｄＴＤＰ－ｆｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆｆＡ（ｄＴＤＰ－４－ａｍｉｎｏ－４，６－ｄｉｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ｏｍｐＲ（ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｕａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、ｇｍｈＢ（Ｄ－ｇｌｙｃｅｒｏ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｈｅｐｔｏｓｅ－１，７－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ７－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ｌｐｘＬ（Ｌｉｐｉｄ Ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｌａｕｒｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｌｐｘＭ（Ｌｉｐｉｄ Ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｙｒｉｓｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｏｍｐＡ（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｏｍｐＣ（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆａＢ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，６－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＣ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｈｅｐｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）、ｒｆａＤ（ＡＤＰ－Ｌ－ｇｌｙｃｅｒｏ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｈｅｐｔｏｓｅ－６－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）、ｒｆａＥ（Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨｌｄＥ）、ｒｆａＧ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆａＩ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＪ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＫ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＰ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｅ（Ｉ）ｋｉｎａｓｅ）、ｒｆａＱ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＹ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｅ（ＩＩ）ｋｉｎａｓｅ）、ｒｆｂＡ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）、ｒｆｆＨ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）、ｗｚｘＥ（ＥＣＡ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びｐｎｐ（Ｐｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｔｏｌＡ（ｃｏｌｉｃｉｎ ｉｍｐｏｒｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＢ（Ｔｏｌ－Ｐａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＣ（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＲ（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｎｌｐＩ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｎｌｐＤ（ｍｕｒｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ｏｍｐＦ（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐａｌ（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｄｅｇＳ（ｓｅｒｉｎｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、ｄｅｇＰ（ｓｅｒｉｎｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、ｔａｔＣ（ｓｅｃ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｌｐｐ（ｍｕｒｅｉｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
ｒｓｅＡ（Ａｎｔｉ－ｓｉｇｍａ－Ｅ ｆａｃｔｏｒ）、ｒｓｅＢ（Ｓｉｇｍａ－Ｅ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆｆＤ（ＵＤＰ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｒｆｆＣ（ｄＴＤＰ－ｆｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆｆＡ（ｄＴＤＰ－４－ａｍｉｎｏ－４，６－ｄｉｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ｏｍｐＲ（ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｕａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、ｇｍｈＢ（Ｄ－ｇｌｙｃｅｒｏ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｈｅｐｔｏｓｅ－１，７－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ７－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ｌｐｘＬ（Ｌｉｐｉｄ Ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｌａｕｒｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｌｐｘＭ（Ｌｉｐｉｄ Ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｙｒｉｓｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｏｍｐＡ（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｏｍｐＣ（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆａＢ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，６－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＣ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｈｅｐｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）、ｒｆａＤ（ＡＤＰ－Ｌ－ｇｌｙｃｅｒｏ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｈｅｐｔｏｓｅ－６－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）、ｒｆａＥ（Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨｌｄＥ）、ｒｆａＧ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆａＩ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＪ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＫ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＰ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｅ（Ｉ）ｋｉｎａｓｅ）、ｒｆａＱ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＹ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｅ（ＩＩ）ｋｉｎａｓｅ）、ｒｆｂＡ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）、ｒｆｆＨ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）、ｗｚｘＥ（ＥＣＡ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びｐｎｐ（Ｐｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｔｏｌＡ（ｃｏｌｉｃｉｎ ｉｍｐｏｒｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＢ（Ｔｏｌ－Ｐａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＣ（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＲ（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｎｌｐＩ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｎｌｐＤ（ｍｕｒｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ｏｍｐＦ（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐａｌ（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｄｅｇＳ（ｓｅｒｉｎｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、ｄｅｇＰ（ｓｅｒｉｎｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、ｔａｔＣ（ｓｅｃ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｌｐｐ（ｍｕｒｅｉｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項6】
前記細胞内膜小胞体関連遺伝子は、
ｃａｖ１（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ｃａｖ２（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－２）、ｃａｖ３（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－３）、ＥＰＮ１（Ｅｐｓｉｎ１）、ＣＬＩＮＴ１（ＥｐｓｉｎＲ）、ＣＬＴＣ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）、ＣＬＴＣＬ１（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ２）、ＣＬＴＡ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ａ）、ＣＬＴＢ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ｂ）、ＡＰ１８０、ＡＰ２、ａｌｍｇｓ（１，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ３－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ａｌｄｇｓ（１，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｇｌｕｃｏｓｅ（１－２）－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｄｉｇｌｕｃｏｓｙｌｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
ｃａｖ１（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ｃａｖ２（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－２）、ｃａｖ３（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－３）、ＥＰＮ１（Ｅｐｓｉｎ１）、ＣＬＩＮＴ１（ＥｐｓｉｎＲ）、ＣＬＴＣ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）、ＣＬＴＣＬ１（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ２）、ＣＬＴＡ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ａ）、ＣＬＴＢ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ｂ）、ＡＰ１８０、ＡＰ２、ａｌｍｇｓ（１，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ３－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ａｌｄｇｓ（１，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｇｌｕｃｏｓｅ（１－２）－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｄｉｇｌｕｃｏｓｙｌｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項7】
細胞膜脂質合成酵素遺伝子の発現が向上したことをさらなる特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項8】
前記微生物は、
大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びシクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びシクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項9】
前記組換え微生物は、ｉ）ｍｒｄＢ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＤ及びｒｆａＩからなる群から選ばれるいずれか一つ以上の遺伝子が抑制されており；及び／又は
ｉｉ）ｃａｖ１遺伝子が導入又は過発現していることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
ｉｉ）ｃａｖ１遺伝子が導入又は過発現していることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項10】
前記組換え微生物は、疎水性物質生産用組換え微生物であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項11】
前記疎水性物質は、細胞膜に蓄積されることを特徴とする、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項12】
前記疎水性物質は、天然色素、抗酸化物質、抗生剤、化粧品添加物、抗癌剤、食品添加剤及び栄養補助剤からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項13】
前記疎水性物質は、アスタキサンチン、β－カロテン、ゼアキサンチン、プロビオラセイン、プロデオキシビオラセイン、デオキシビオラセイン及びビオラセインからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項14】
前記疎水性物質は、カロテノイド系色素であり、
前記組換え微生物は、ｒｆｆＤ及びｒｆａＤ遺伝子の発現が抑制されたことを特徴とする、請求項１０に記載の組換え微生物。
前記組換え微生物は、ｒｆｆＤ及びｒｆａＤ遺伝子の発現が抑制されたことを特徴とする、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項15】
前記疎水性物質は、ビオラセイン又はその類似体であり、
前記組換え微生物は、ｒｆａＩ遺伝子の発現が抑制されたことを特徴とする、請求項１０に記載の組換え微生物。
前記組換え微生物は、ｒｆａＩ遺伝子の発現が抑制されたことを特徴とする、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項16】
前記組換え微生物は、ｃａｖ１遺伝子が導入又は過発現していることを特徴とする、請求項１５に記載の組換え微生物。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換え微生物を培養して疎水性物質を生成させる段階；及び
前記生成された疎水性物質を取得する段階を含む、疎水性物質の製造方法。
前記生成された疎水性物質を取得する段階を含む、疎水性物質の製造方法。
【請求項18】
前記培養は、流加式培養であることを特徴とする、請求項１７に記載の疎水性物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、疎水性物質の生産能が向上した組換え微生物及びその製造のための細胞膜エンジニアリング方法に関し、より詳細には、細胞膜面積の増加；細胞外膜小胞体（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）形成及び分泌の増加；及び細胞内膜小胞体（ｉｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）形成の増加のいずれか一つ以上の特徴を有するように細胞膜がエンジニアリングされた疎水性物質生産用組換え微生物及びその製造のための細胞膜エンジニアリング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
全世界的な環境問題、限定された資源の枯渇、環境にやさしいエネルギ源に対する需要により、再生産可能な生物体ベースの細胞工場構築への関心が増加している。かかる細胞工場は、細胞内の代謝回路（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｎｅｔｗｏｒｋ）を目的代謝産物（バイオエネルギー、環境にやさしい化学物質、新薬製剤など）の生産に最適化して製造できるが、この技術過程には様々な分子生物学技術が要求されている。石油化学ベースで生産される様々な物質は、種々のカテゴリーに区分できるが、代表的な区分基準の一つが、親水性及び疎水性による区分である。疎水性物質の代表物質群には、疎水性色素（カロテノイド及びビオラセインなど）がある。色素は、食品添加剤、染料、化粧品、ペイントなどを含む産業で広範囲に使用され、我々の生活に深く関与している。摂取したり皮膚に塗ったりする形態の色素は、身体に直接的な影響を及ぼすが、健康への関心が高まりつつある現代社会において、問題の素地がある石油ベースの合成色素に比べて安全であるとされる天然色素への関心と需要が急増している。石油ベースで合成される色素は、繊維染色時に深刻な環境問題を招くとも知られている。自然に由来する天然色素は、色の他、抗癌、抗生、抗バクテリア、免疫抑制などの様々な薬学的特性も有する場合が多いので、日常生活でより有用に使用可能である。現在、石油化学に基づいて生産される色素が多く、天然色素の使用比重は低い。これは、健康問題及び環境問題などにつながっており、特に、子供のための製品に石油化学ベースの色素が広く活用されているという点で問題となっている。石油化学ベースの色素は、繊維染色過程でも深刻な水質汚染を引き起こしている。
【0003】
そのため、かかる天然色素を環境にやさしい方法で微生物細胞工場を通じて多量生産しようとする努力が続いてきており、代表として、細胞膜の面積を広めて、細胞膜上に蓄積される疎水性色素の生産量を増加させようとする試みが報告されており（Ｔ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ－Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ β－カロテン ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ４３，８５－９１（２０１７）。）、疎水性色素を細胞内の脂質に溶かして生産量を増加させようとする試みもあった（Ｔ．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｉｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｃｏｐｅｎｅ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ５２，１３４－１４２（２０１９）．）。
【0004】
このような背景技術下で、本発明者らは、疎水性物質生産用の微生物が有する固有の特性を、細胞膜エンジニアリングを通じて変形させることにより、疎水性物質の生産能を向上させようと鋭意努力した結果、天然色素であるカロテノイド及びビオラセイン類似体を生産する大腸菌における細胞形態関連遺伝子、細胞外膜小胞体関連遺伝子、又は細胞内膜小胞体関連遺伝子の抑制、導入又は過発現を通じて細胞膜をエンジニアリングする場合に、細胞膜面積の増加、細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加、及び内膜小胞体形成の増加により、親油性天然色素物質が蓄積され得る空間が拡張し、結果的に生産量が顕著に増加することを確認し、各要素のシナジー効果をテスト及び検証して本発明を完成するに至った。
【0005】
本背景技術の部分に記載された上記の情報は、単に本発明の背景に関する理解を向上させるためのものであり、よって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって既に知られた先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
【発明の概要】
【0006】
本発明の目的は、細胞膜がエンジニアリングされて疎水性物質の生産能が向上した組換え微生物及びその製造方法を提供することにある。
【0007】
本発明の他の目的は、前記組換え微生物を培養して疎水性物質を生産する方法を提供することにある。
【0008】
本発明のさらに他の目的は、細胞膜がエンジニアリングされた組換え微生物ライブラリーを用いて特定の疎水性物質の生産能に優れた組換え微生物のスクリーニング方法を提供することにある。
【0009】
前記目的を達成するために、本発明は、細胞膜面積の増加；細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加；及び、細胞内膜小胞体形成の増加のいずれか一つ以上の特徴を有するように細胞膜がエンジニアリングされた疎水性物質生産用組換え微生物を提供する。
【0010】
本発明は、また、疎水性物質生産用組換え微生物において細胞形態関連遺伝子、及び細胞外膜小胞体関連遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子の発現を抑制させる、及び／又は細胞内膜小胞体関連遺伝子を疎水性物質生産用組換え微生物に導入又は過発現させる段階を含む、疎水性物質生産用組換え微生物の製造方法を提供する。
【0011】
本発明は、また、前記細胞膜がエンジニアリングされた疎水性物質生産用組換え微生物を培養して疎水性物質を生産する段階；及び、生産された疎水性物質を取得する段階を含む疎水性物質の製造方法を提供する。
【0012】
本発明は、また、（ａ）疎水性物質生産用微生物に、細胞形態関連遺伝子の発現抑制；細胞外膜小胞体関連遺伝子の発現抑制；及び、細胞内膜小胞体関連遺伝子の導入又は過発現のいずれか一つ以上の手段を用いて細胞膜エンジニアリングを行って、疎水性物質生産用微生物のライブラリーを生成する段階；及び
（ｂ）前記疎水性物質生産用微生物を培養して、特定の疎水性物質の生産能に優れた組換え微生物を選別する段階を含む、特定の疎水性物質の生産能が増加した細胞膜エンジニアリングされた組換え微生物のスクリーニング方法を提供する。
（ｂ）前記疎水性物質生産用微生物を培養して、特定の疎水性物質の生産能に優れた組換え微生物を選別する段階を含む、特定の疎水性物質の生産能が増加した細胞膜エンジニアリングされた組換え微生物のスクリーニング方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】細胞膜空間拡張のための細胞膜エンジニアリング戦略と、カロテノイド及びビオラセイン類似体生合成経路の概要図である。細胞形態は、合成ｓＲＮＡシステムを用いた関連遺伝子発現抑制によって変形でき、細胞外膜小胞体も同一の方法で形成できる。一方、細胞内膜小胞体は、ｃａｖ１などの外来遺伝子発現によって形成できる。曲がった矢印とＴ形状はそれぞれ、プロモーターと転写終結子を意味し、実線と点線はそれぞれ、単一と多重反応を表す。略語は次の通りである：Ｇ３Ｐ，ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｅ４Ｐ，ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ４－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰＥＰ，ｐｈｏｓｐｈｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ；ＰＹＲ，ｐｙｒｕｖａｔｅ；ＤＸＰ，１－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｘｙｌｕｌｏｓｅ ５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＳＫＭ，ｓｈｉｋｉｍａｔｅ；ＦＰＰ，ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＧＧＰＰ，ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＴＲＰ，ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ；ＩＰＡ，ｉｎｄｏｌｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ；Ｓｐ．，ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ．
【0014】
【図2】カロテノイド生産菌株の構築、及び構築された菌株の培養結果を示す図である。（Ａ）は、ｐＬＹＣ、ｐＢＴＣ、ｐＺＥＡ、ｐＡＴＸライブラリーのプラスミド概要図である。曲がった矢印、半球、Ｔ形状はそれぞれ、プロモーター、５’ＵＴＲ、転写終結子を意味する。（Ｂ）は、ＬＹＣ菌株の初期スクリーニング結果を示す。目につく赤いコロニーを選別後にテストチューブで培養し、（Ｃ）優秀な菌株をさらにフラスコで培養した。（Ｄ）～（Ｆ）はそれぞれ、ＢＴＣ、ＺＥＡ、ＡＴＸ菌株のテストチューブ培養結果に該当する。（Ｇ）は、（Ｆ）における優秀菌株５０個のサンプルに対するＨＰＬＣ分析結果である。各サンプルに対してアスタキサンチン（ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）に該当するピークの面積値が、ｙ軸に示されている。（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｊ）はそれぞれ、テストチューブ培養から選択されたＢＴＣ、ＺＥＡ、ＡＴＸ菌株のフラスコ培養結果を示す。誤差棒は、平均±標準偏差（ｎ＝３）を意味し、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＮＳ（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）Ｐ≧０．０５は、両側スチューデントのｔ検定（ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）によって決定された。
【0015】
【図3】ビオラセイン類似体生産菌株の構築、及び構築された菌株の培養結果を示す図である。（Ａ）は、ビオラセイン類似体の生産のために構築したプラスミド概要図である。（Ｂ）は、グルコース及びグリセロールを単一炭素源として用いた時のビオラセイン生産量の比較結果であり、（Ｃ）は、グリセロールを用いたＰＤＶＩＯ及びＰＶＩＯ菌株のプロデオキシビオラセイン及びプロビオラセイン生産結果を、（Ｄ）は、グリセロールを用いたＤＶＩＯ及びＶＩＯ菌株のデオキシビオラセイン及びビオラセイン生産結果を示す。下は、大腸菌菌株から生産された（Ｅ）プロデオキシビオラセイン及び（Ｆ）プロビオラセインのＬＣ－ＭＳクロマトグラム及びスペクトルと、（Ｇ）波長帯範囲３５０～７５０ｎｍのカロテノイド及びビオラセイン類似体の吸収スペクトルである。（Ｇ）グラフにおけるそれぞれのデータポイントは、３個の個別サンプルから得た値の平均値であり、これらの点を繋いで曲線グラフを示した。
【0016】
【図4】細胞形態変形及び細胞内膜小胞体形成を用いたカロテノイド及びビオラセイン類似体の増産結果を示す図である。（Ａ）は、大腸菌の細胞形態変形を用いた細胞膜空間拡張の機序を示し、細胞形態変形関連遺伝子の発現を抑制するｓＲＮＡの導入を用いた（Ｂ）β－カロテンと（Ｃ）デオキシビオラセインの生産結果が示されている。（Ｄ）は、大腸菌における細胞内膜小胞体形成の機序を示し、それによる（Ｅ）β－カロテンと（Ｆ）デオキシビオラセインの生産結果が示されている。下は、（Ｇ）β－カロテン生産対照群であるＢＴＣ１菌株、（Ｈ）ｃａｖ１を発現させるβ－カロテン生産菌株、（Ｉ）デオキシビオラセイン生産対照群であるＤＶＩＯ菌株、（Ｊ）ｃａｖ１を発現させるデオキシビオラセイン生産菌株のＴＥＭ（上パネル）とＳＥＭ（下パネル）イメージである。生産グラフの誤差棒は、平均±標準偏差（ｎ＝３）を意味し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＮＳ（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）Ｐ≧０．０５は、両側スチューデントのｔ検定によって決定された。
【0017】
【図5】細胞形態を変形したＢＴＣ１及びＤＶＩＯ菌株の顕微鏡写真である。（Ａ）は、ＢＴＣ１菌株と、細胞形態変形に関連した遺伝子発現を抑制するｓＲＮＡが導入されたＢＴＣ１菌株の顕微鏡写真であり、（Ｂ）は、ＤＶＩＯ菌株と、細胞形態変形に関連した遺伝子発現を抑制するｓＲＮＡが導入されたＤＶＩＯ菌株の顕微鏡写真である。細胞形態変形関連遺伝子発現を抑制するｓＲＮＡが導入された菌株から、対照群よりも大きいか短い細胞形態が観察された。各顕微鏡写真ごとに、相応する発現抑制目標遺伝子が表記されている。
【0018】
【図6】細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加を用いたカロテノイド及びビオラセイン類似体増産結果を示す図である。（Ａ）は、大腸菌における細胞外膜小胞体形成の機序を示し、それによる（Ｂ）β－カロテン及び（Ｃ）デオキシビオラセインの生産結果が示されている。下は、（Ｄ）ｒｆｆＤ及びｒｆａＤ発現抑制ｓＲＮＡが導入されたＢＴＣ１菌株及び（Ｅ）ｒｆａＩ発現抑制ｓＲＮＡが導入されたＤＶＩＯ菌株のＴＥＭ（上パネル）及びＳＥＭ（下パネル）イメージと、（Ｆ）ｒｆｆＤ及びｒｆａＤ発現抑制ｓＲＮＡが導入されたＢＴＣ１菌株で形成された細胞外膜小胞体（上パネル）とｒｆａＩ発現抑制ｓＲＮＡが導入されたＤＶＩＯ菌株で形成された細胞外膜小胞体（下パネル）を精製して分析したＳＥＭイメージである。（Ｇ）は、細胞内膜及び外膜小胞体を同時に形成した時のβ－カロテン生産結果であり、（Ｈ）は、細胞形態の変形と細胞内膜及び外膜小胞体の生産とを組み合わせて適用した時のデオキシビオラセイン生産結果である。その下は、（Ｉ）ｒｆｆＤ及びｒｆａＤ発現抑制ｓＲＮＡとｃａｖ１－ｐｌｓＢＣが導入されたＢＴＣ１菌株と（Ｊ）ｒｆａＩ発現抑制ｓＲＮＡ及びｃａｖ１が導入されたＤＶＩＯ菌株のＴＥＭ（上パネル）とＳＥＭ（下パネル）イメージである。
【0019】
【図7】細胞外膜小胞体によって培地に分泌されたカロテノイド及びビオラセイン類似体の定量結果を示す図である。（Ａ）は、細胞外膜小胞体発現のためにｓＲＮＡが導入されたＢＴＣ１菌株培養液の上澄液から抽出したβ－カロテンを、（Ｂ）は、精製した細胞外膜小胞体から抽出したβ－カロテンを示す。ここで、ＯＭＶは、ｒｆｆＤ及びｒｆａＤの発現を抑制するｓＲＮＡが導入されたＢＴＣ１菌株を、ＩＭＶは、ｃａｖ１及びｐｌｓＢＣが導入されたＢＴＣ１菌株を意味する。（Ｃ）は、細胞外膜小胞体発現のためにｓＲＮＡが導入されたＤＶＩＯ菌株培養液の上澄液から抽出したデオキシビオラセインを、（Ｄ）は、精製した細胞外膜小胞体から抽出したデオキシビオラセインを示す。ここで、ＯＭＶは、ｒｆａＩ発現を抑制するｓＲＮＡが導入されたＤＶＩＯ菌株を、ＩＭＶは、ｃａｖ１が導入されたＤＶＩＯ菌株を意味する。（Ｅ）は、ｒｆａＩ発現抑制ｓＲＮＡが導入されたＤＶＩＯのフラスコ培養時に、水洗浄以降に残っているデオキシビオラセイン結晶体と、細胞及び細胞外膜小胞体からなる集合体の顕微鏡写真である。下は、細胞外膜小胞体を発現させる（Ｆ）β－カロテンと（Ｇ）デオキシビオラセイン生産菌株にｐｌｓＢＣ遺伝子を過発現させたフラスコ培養結果である。次に、細胞外膜又は内膜小胞体を発現した時に、（Ｈ）ゼアキサンチン、（Ｉ）アスタキサンチン、（Ｊ）プロデオキシビオラセイン（Ｋ）プロビオラセイン、（Ｌ）ビオラセインの合計生産量（Ｔｏｔと表記）と分泌生産量（Ｓｅｃと表記）がそれぞれ、相応するグラフに示されている。誤差棒は、平均±標準偏差（ｎ＝３）を意味し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＮＳ（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）Ｐ≧０．０５は、両側スチューデントのｔ検定によって決定された。
【0020】
【図8】本発明の組換え微生物を使用して流加式発酵を行う場合に、時間に従う各疎水性物質の生産量を示す図である：（ａ）アスタキサンチン、（ｂ）β－カロテン、（ｃ）ゼアキサンチン、（ｄ）プロビオラセイン、（ｅ）プロデオキシビオラセイン、（ｆ）ビオラセイン、（ｇ）デオキシビオラセイン。
【発明を実施するための形態】
【0021】
特に断らない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使われるものである。
【0022】
特に断りのない限り、核酸は、左側から右側に５’→配向で、アミノ酸は、左側から右側にＮ末端→Ｃ末端配向で記録される。明細書中に列挙された数値範囲は、範囲を定義する数字を含み、定義された範囲内のそれぞれの整数又は任意の非整数分画を含む。
【0023】
現在まで、微生物の代謝回路を操作して色を帯びる天然物質を増産しようとする試みが多くあったが、細胞内に蓄積される物質の特性のため、それは、ある程度の限界点をもつ。本発明では、細胞膜を多方面でエンジニアリングし、細胞膜の面積を広めたり、細胞内に構造体を作って細胞膜を拡張させたり、或いは該当の物質を小胞体に閉じ込めて細胞外に噴出させたりすることにより、疎水性色素の生産量を画期的に増産させた。
【0024】
本発明の一実施例では、天然色素であるカロテノイド及びビオラセイン類似体（ａｎａｌｏｇｓ）を大腸菌で生産した。カロテノイド及びビオラセイン類似体は親油性物質であって、大腸菌内で生産される時に細胞質に積もったり細胞外に形成されたりすることなく細胞膜に蓄積される。これに着眼し、細胞膜面積を増やして細胞内外に小包体が形成されるようにし、親油性天然色素物質が蓄積され得るような空間を拡張させた。まず、３種のカロテノイドと４種のビオラセイン類似体をそれぞれ生産する大腸菌菌株を構築した後に、細胞膜面積の増加及び小胞体形成の有無による生産量変化を観察した。また、全ての物質の生産において、本発明の各要素のシナジー効果をテスト及び検証した。本研究で用いた戦略は、天然色素の他にも、抗酸化物質、抗生剤、化粧品添加物、抗癌剤、食品添加剤及び栄養補助剤のような様々な個別の親油性物質を大腸菌で生産する研究に有用に適用され得る。
【0025】
本発明の一実施例では、産業上に最も多用される疎水性物質の一つである天然色素、カロテノイド（Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ）及びビオラセイン（Ｖｉｏｌａｃｅｉｎ）生産菌株を構築し、疎水性物質生産能の増大のために、前記疎水性物質生産菌株がｉ）細胞膜面積の増加、ｉｉ）細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加、又はｉｉｉ）細胞内膜小胞体形成の増加の特性を示すように細胞膜エンジニアリングを行った。生産菌株が上記の特性を有するように細胞膜をエンジニアリングするために、細胞形態関連遺伝子、及び細胞外膜小胞体関連遺伝子をスクリーニングし、該当の前記細胞形態関連遺伝子、又は細胞外膜小胞体関連遺伝子をターゲッティングするｓＲＮＡを処理して当該遺伝子の発現を抑制する場合に又は細胞内膜小胞体関連遺伝子を過発現させる場合に、生産菌株の天然色素の生産能が顕著に増加することを確認し、前記遺伝子の発現抑制又は過発現を組み合わせる場合に、シナジー効果を示すことを確認した。
【0026】
本発明の実施例では、大腸菌の細胞形態関連遺伝子の抑制を用いた細胞膜面積の増加、細胞外膜小胞体関連遺伝子の抑制を用いた細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加、及び細胞内膜小胞体関連遺伝子の過発現を用いた内膜小胞体形成の増加が、細胞膜に蓄積される代表的な疎水性物質である天然色素の顕著な生産能の向上につながることを確認した。一般に、疎水性物質は、疎水性を帯びる細胞膜又は小胞体の内膜及び外膜に蓄積されるので、天然色素の他、微生物を通じて生産され得る様々な疎水性物質においても、天然色素と同等レベルの生産能向上を示すことができることは明らかに理解されるであろう。
【0027】
したがって、本発明は、細胞膜面積の増加；細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加；及び、細胞内膜小胞体形成の増加のいずれか一つ以上の特徴を有するように細胞膜エンジニアリングされた疎水性物質生産用組換え微生物に関する。
【0028】
本発明の用語“細胞膜エンジニアリング”とは、従来細胞が有する細胞膜の特性を、遺伝子組換え技術などを用いて既存の特性を強化又は減少させるか、新しい特性を付与する技術を意味する。本発明において、細胞膜エンジニアリングは、遺伝子の抑制、過発現及び／又は導入を用いて行われており、細胞膜面積の増加、及び／又は細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加、及び内膜小胞体形成の増加の特性を付与しようとした。
【0029】
本発明の一実施例において、上記の特徴は、疎水性物質生産用組換え微生物に遺伝子発現の抑制、導入又は過発現を用いた細胞膜エンジニアリングを行って与えられた。
【0030】
したがって、本発明は、一観点において、細胞形態関連遺伝子、及び細胞外膜小胞体関連遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子が抑制され；及び／又は
細胞内膜小胞体関連遺伝子が過発現又は導入されたことを特徴とする疎水性物質生産用組換え微生物に関する。
細胞内膜小胞体関連遺伝子が過発現又は導入されたことを特徴とする疎水性物質生産用組換え微生物に関する。
【0031】
本発明において、前記組換え微生物は、細胞形態関連遺伝子、及び細胞外膜小胞体関連遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子が抑制されており；及び／又は
細胞内膜小胞体関連遺伝子が過発現又は導入されており、
次のいずれか一つ以上の特徴を有することを特徴とし得る：
ｉ）細胞膜面積の増加；
ｉｉ）細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加；及び
ｉｉｉ）細胞内膜小胞体形成の増加。
細胞内膜小胞体関連遺伝子が過発現又は導入されており、
次のいずれか一つ以上の特徴を有することを特徴とし得る：
ｉ）細胞膜面積の増加；
ｉｉ）細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加；及び
ｉｉｉ）細胞内膜小胞体形成の増加。
【0032】
本発明において、前記疎水性物質は、細胞膜に蓄積されることを特徴とし得る。例えば、前記疎水性物質は、天然色素、抗酸化物質、抗生剤、化粧品添加物、抗癌剤、食品添加剤及び栄養補助剤などであり得るが、これに制限されるものではない。
【0033】
本発明において、前記天然色素とは、人工的に合成せずに自然から得られる色素又はその類似体のことを意味し、例えば、カロテノイド、ビオラセインなどがあり、より具体的な例にリコペン、β－カロテン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、プロビオラセイン（ＰＶＩＯ）、プロデオキシビオラセイン（ＰＤＶＩＯ）、デオキシビオラセイン（ＤＶＩＯ）、ビオラセイン（ＶＩＯ）などがあるが、これに制限されるものではない。
【0034】
前記抗酸化物質は、例えば、ケルセチン、ジヒドロケルセチン、ケンペロール、ジヒドロケンペロール、アスタキサンチン、レスベラトロール、トコフェロール、トコトリエノール、コエンザイムＱ１０、アピゲニンなどがあるが、これに制限されるものではない。
【0035】
前記化粧品添加物は、例えば、アロエシン（ａｌｏｅｓｉｎ）、ビタミンＡ、セラミド、パントテネート（ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ）、パンテノール、ルペオール、スクアレン、ユーカリプトール、バレンセンなどがあるが、これに制限されるものではない。
前記食品添加剤は、例えば、カルミン酸、β－カロテン、リコペンなどがあるが、これに制限されるものではない。
前記食品添加剤は、例えば、カルミン酸、β－カロテン、リコペンなどがあるが、これに制限されるものではない。
【0036】
前記栄養補助剤は、例えば、シリマリン、ルテイン、ビタミン、コエンザイム－Ｑ１０、レスベラトロール、オメガ－３多価不飽和脂肪酸、ユビキノン、グルコサミン、ルテオリンなどがあるが、これに制限されるものではない。
【0037】
本発明において、好ましくは、前記疎水性物質は、アスタキサンチン、β－カロテン、ゼアキサンチン、プロビオラセイン、プロデオキシビオラセイン、デオキシビオラセイン及びビオラセインからなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【0038】
本発明において、“細胞形態関連遺伝子”とは、細胞の形態を維持するのに関与する遺伝子を意味し、本発明の一実施例では、フィラメント形の組換え細胞の形態がより不規則的に又は球形になるようにして、疎水性物質が蓄積される細胞膜の面積を増加させるために、前記細胞形態関連遺伝子の発現を抑制した。本発明において、前記細胞形態関連遺伝子は、発現抑制時に細胞の形態が変形されて細胞の面積が増加するいかなる遺伝子も含まれてよく、使用される組換え微生物に応じて通常の技術者によって容易に選択されてよく、好ましくは、前記組換え微生物が先天的に含む細胞形態を形成、維持又は変形するのに必要な遺伝子の中から選択されることが好ましいが、これに制限されるものではない。
【0039】
本発明において、前記細胞形態関連遺伝子は、例えば、細胞分裂に関与する遺伝子、又は細胞骨格／細胞壁の合成又は維持に関与する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0040】
本発明において、細胞分裂に関与する遺伝子は、例えば、細胞分裂タンパク質（ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、例えば、Ｆｔｓタンパク質など）と細胞分裂抑制タンパク質（ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、例えば、ＭｉｎＣ、ＭｉｎＤなど）などからなる原核生物由来の細胞分裂に関与する酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0041】
本発明において、細胞骨格／細胞壁の合成又は維持に関与する遺伝子は、例えば、ペニシリン結合タンパク質(ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＢＰ）、細胞形態決定タンパク質（ＭｒｅＢ、ＭｒｅＣなど）、ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ（ＭｒｄＡ、ＰｂｐＡなど）、ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｒｄＢなど）、細胞骨格タンパク質（ＲｏｄＺなど）などからなる原核生物由来酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0042】
本発明の一実施例において、天然色素を発現させるように組み替えられた大腸菌を製造した後、スクリーニングされた前記細胞形態関連遺伝子１６種の発現を抑制して、細胞膜エンジニアリングを行った（表４）。例えば、前記組換え微生物が大腸菌である場合に、前記細胞形態関連遺伝子は、ｒｏｄＺ（細胞骨格タンパク質）、ｆｔｓＡ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＢ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＩ（ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ）、ｆｔｓＬ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＱ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＷ（プロバブルペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ）、ｆｔｓＺ（細胞分裂タンパク質）、ｍｉｎＤ（セプタムサイト（Ｓｅｐｔｕｍ ｓｉｔｅ）決定タンパク質）、ｍｒｄＡ（ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ）、ｍｒｄＢ（ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ）、ｍｒｅＢ（細胞形態決定タンパク質）、ｍｒｅＣ（細胞形態決定タンパク質）、ｚｉｐＡ（細胞分裂タンパク質）、ｍｕｒＥ（ＵＤＰ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ－－２，６－ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ｌｉｇａｓｅ）、ｐｂｐＣ（ペニシリン結合タンパク質１Ｃ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれるものであり得るが、これに制限されない。
【0043】
より好ましくは、例えば、デオキシビオラセインを生産する組換え大腸菌は、前記細胞形態関連遺伝子であるｍｒｄＢ遺伝子の発現を抑制することを特徴とし得る。
【0044】
本発明において、細胞形態関連遺伝子は、使用される微生物、生産しようとする疎水性物質に応じて、本発明の実施例で抑制された大腸菌の細胞形態関連遺伝子に相応する遺伝子又は実質的に同じ機能を果たす遺伝子に適宜変更又は選択されてよい。
【0045】
本発明において、“細胞外膜小胞体関連遺伝子”とは、細胞外膜小胞体の形成又は分泌に関与する遺伝子を意味する。本発明において、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は、微生物の内因性遺伝子であることを特徴とし得る。本発明の一実施例では、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子である細胞のペプチドグリカン層又は細胞外膜と内膜の連結を維持させる役割を担う遺伝子の発現を抑制し、細胞外膜小胞体を通じて細胞内に蓄積される疎水性物質を噴出させた結果、疎水性物質の生産能が顕著に向上することを確認した。本発明において、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は、抑制時に、細胞の外膜小胞体の形成及び分泌を向上させ得る如何なる遺伝子も含まれてよく、使用される組換え微生物に応じて、一般的に容易に選択されてよく、好ましくは、細胞のペプチドグリカン層又は細胞外膜と内膜との連結保持に関与する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0046】
本発明において、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は、細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持関連遺伝子、細胞外膜タンパク質発現遺伝子、細胞膜代謝回路関連遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0047】
本発明において、細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持関連遺伝子は、例えば、 リポタンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｌｐｐ）、Ｔｏｌ－Ｐａｌシステムタンパク質（ＴｏｌＢ、Ｐａｌ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＲなど）、リポ多糖コア生合成タンパク質（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）、リポ多糖コアヘプトシルトランスフェラーゼ、脂質Ａ生合成ラウロイルトランスフェラーゼなどの細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持に寄与する原核生物由来酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0048】
本発明において、細胞外膜タンパク質発現遺伝子は、例えば、ＯｍｐＡ（ｏｕｔｅｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）、ＯｍｐＣ（ｏｕｔｅｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）、ＯｍｐＦ（ｏｕｔｅｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆ）、ＯｐｒＦ（ＯｍｐＡホモログ）、エンベロープタンパク質（ＲａｇＡ、ＲａｇＢなど）などの細胞外膜タンパク質発現に寄与する原核生物由来酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0049】
本発明において、細胞膜代謝回路関連遺伝子は、例えば、キノロン信号（ＰＱＳ）、抗シグマＥ因子、シグマ因子Ｈ（ＡｌｇＵ）、シャペロンプロテアーゼ（ＤｅｇＰ）などの原核生物由来細胞膜代謝回路酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0050】
本発明の一実施例において、天然色素を発現させるように組み替えられた大腸菌を製造した後に、スクリーニングされた前記細胞外膜小胞体関連遺伝子２６種の発現を抑制して細胞膜エンジニアリングを行った（表７）。例えば、前記組換え微生物が大腸菌である場合に、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は、ｒｓｅＡ（Ａｎｔｉ－ｓｉｇｍａ－Ｅ ｆａｃｔｏｒ）、ｒｓｅＢ（Ｓｉｇｍａ－Ｅ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆｆＤ（ＵＤＰ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｒｆｆＣ（ｄＴＤＰ－ｆｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆｆＡ（ｄＴＤＰ－４－ａｍｉｎｏ－４，６－ｄｉｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ｏｍｐＲ（ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｕａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、ｇｍｈＢ（Ｄ－ｇｌｙｃｅｒｏ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｈｅｐｔｏｓｅ－１，７－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ７－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ｌｐｘＬ（Ｌｉｐｉｄ Ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｌａｕｒｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｌｐｘＭ（Ｌｉｐｉｄ Ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｙｒｉｓｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｏｍｐＡ（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｏｍｐＣ（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆａＢ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，６－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＣ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｈｅｐｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）、ｒｆａＤ（ＡＤＰ－Ｌ－ｇｌｙｃｅｒｏ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｈｅｐｔｏｓｅ－６－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）、ｒｆａＥ（Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨｌｄＥ）、ｒｆａＧ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆａＩ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＪ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＫ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＰ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｅ（Ｉ）ｋｉｎａｓｅ）、ｒｆａＱ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＹ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｅ（ＩＩ）ｋｉｎａｓｅ）、ｒｆｂＡ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）、ｒｆｆＨ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）、ｗｚｘＥ（ＥＣＡ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びｐｎｐ（Ｐｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｔｏｌＡ（ｃｏｌｉｃｉｎ ｉｍｐｏｒｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＢ（Ｔｏｌ－Ｐａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＣ（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＲ（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｎｌｐＩ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｎｌｐＤ（ｍｕｒｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ｏｍｐＦ（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐａｌ（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｄｅｇＳ（ｓｅｒｉｎｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、ｄｅｇＰ（ｓｅｒｉｎｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、ｔａｔＣ（ｓｅｃ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｌｐｐ（ｍｕｒｅｉｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれるものであり得るが、これに制限されない。
【0051】
例えば、カロテノイド色素であるアスタキサンチン、β－カロテン、又はゼアキサンチンを生産する組換え大腸菌は、ｒｆａＤ、ｒｆｆＤ及びｒｆａＱから選択されるいずれか一つ以上の遺伝子の発現を抑制、より好ましくは、ｒｆｆＤ及びｒｆａＤ遺伝子の発現を抑制することを特徴とし得る。
【0052】
他の例として、ビオラセイン、プロデオキシビオラセイン、プロビオラセイン及びデオキシビオラセインなどのようなビオラセイン及びその類似体を生産する組換え大腸菌は、ｒｆａＩ又はｒｆａＱ遺伝子の発現を抑制、より好ましくは、ｒｆａＩ遺伝子の発現を抑制することを特徴とし得る。
【0053】
本発明において、細胞外膜小胞体関連遺伝子は、使用される微生物、生産しようとする疎水性物質に応じて、本発明の実施例で抑制された細胞外膜小胞体関連遺伝子に相応する遺伝子又は実質的に同一の機能を果たす遺伝子に適宜変更又は選択されてよい。
【0054】
本発明において、“細胞内膜小胞体関連遺伝子”とは、細胞内膜小胞体の形成に関与する遺伝子を意味し、本発明の一実施例では、内膜小胞体システムが存在しない原核生物である大腸菌を使用しているので、真核細胞由来の内膜小胞体システムのうち、ヒト由来カベオラ（ｃａｖｅｏｌａ）遺伝子を導入して、内膜細胞が形成され得るように細胞膜エンジニアリングを行った。本発明において、細胞内膜小胞体関連遺伝子は、細胞内膜小胞体の形成を向上させる遺伝子であれば制限なく選択されて使用されてよい。本発明において、前記疎水性物質生産用組換え微生物が、細胞内膜小胞体システムのない微生物である場合に、細胞内膜を形成する別の真核又は原核生物由来内膜小胞体システム遺伝子が導入されることを特徴とし得る。本発明において、前記疎水性物質生産用組換え細胞が先天的に細胞内膜小胞体システムを含む場合に、前記細胞自体の細胞内膜小胞体遺伝子が過発現するか、これに併せて別の真核又は原核生物由来内膜小胞体システム遺伝子が導入されたことを特徴とし得る。
【0055】
本発明において、前記細胞内膜小胞体関連遺伝子は、真核細胞由来のカベオラシステムの遺伝子又はクラスリン－エプシン（ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｅｐｓｉｎ）システムの遺伝子でよく、又は原核細胞由来のｍｇｓ－ｄｇｓシステムなどでよく、より具体的な例としては、ｃａｖ１（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ｃａｖ２（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－２）、ｃａｖ３（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－３）、ＥＰＮ１（Ｅｐｓｉｎ１）、ＣＬＩＮＴ１（ＥｐｓｉｎＲ）、ＣＬＴＣ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）、ＣＬＴＣＬ１（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ２）、ＣＬＴＡ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ａ）、ＣＬＴＢ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ｂ）、ＡＰ１８０、ＡＰ２、ａｌｍｇｓ（１，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ３－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ａｌｄｇｓ（１，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｇｌｕｃｏｓｅ（１－２）－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｄｉｇｌｕｃｏｓｙｌｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれるものであり得るが、これに制限されない。
【0056】
本発明において、アスタキサンチン、β－カロテン及びゼアキサンチンのようにカロテノイド色素を生産する組換え大腸菌では、ｃａｖ１遺伝子を導入又は過発現することを特徴とし得る。
【0057】
本発明において、ビオラセイン又はその類似体（プロビオラセイン、プロデオキシビオラセイン、デオキシビオラセイン）を生産する組換え大腸菌では、ｃａｖ１遺伝子を導入又は過発現させることを特徴とし得る。
【0058】
本発明において、細胞内膜小胞体関連遺伝子は、使用される微生物、生産しようとする疎水性物質に応じて適宜に変更又は選択されてよい。
【0059】
本発明の一実施例において、細胞形態関連遺伝子の発現抑制、細胞外膜小胞体関連遺伝子の発現抑制、及び細胞内膜遺伝子の導入を組み合わせる場合には、シナジー効果を示し、より顕著な生産量増加を示すことを確認した。
【0060】
本発明において、前記細胞膜面積の増加；細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加；及び細胞内膜小胞体形成の増加の特性は、組換え微生物の種類、生産しようとする疎水性物質の種類、量、発現条件などに基づいて組み合わせられて細胞膜エンジニアリングされることを特徴とし得る。
【0061】
本発明において、細胞形態関連遺伝子の発現抑制、細胞外膜小胞体関連遺伝子の発現抑制、及び細胞内膜小胞体関連遺伝子の導入又は過発現は、組換え微生物の種類、生産しようとする疎水性物質の種類、量、発現条件などに基づいて組み合わせられてよく、それぞれ関連遺伝子に属する遺伝子同士間に組み合わせられてよい。
【0062】
本発明において、前記組換え微生物は、
ｉ）ｍｒｄＢ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＤ及びｒｆａＩからなる群から選ばれるいずれか一つ以上の遺伝子が抑制又はノックダウンされており；及び／又は
ｉｉ）ｃａｖ１遺伝子が導入又は過発現していることを特徴とし得る。
ｉ）ｍｒｄＢ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＤ及びｒｆａＩからなる群から選ばれるいずれか一つ以上の遺伝子が抑制又はノックダウンされており；及び／又は
ｉｉ）ｃａｖ１遺伝子が導入又は過発現していることを特徴とし得る。
【0063】
本発明の一実施例で確認したそれぞれの疎水性物質生産用組換え微生物において最も優れた生産量を示した遺伝子の抑制及び導入／過発現の組合せは、次の通りである：
アスタキサンチン：ｒｆｆＤ及びｒｆａＤノックダウン（ＯＭＶ）
β－カロテン：ｒｆｆＤ及びｒｆａＤノックダウン（ＯＭＶ）
ゼアキサンチン：ｒｆｆＤ及びｒｆａＤノックダウン（ＯＭＶ）
プロビオラセイン：ｒｆａＩノックダウン及びｃａｖ１過発現（ＯＭＶ及びＩＭＶ）
プロデオキシビオラセイン：ｒｆａＩノックダウン（ＯＭＶ）
ビオラセイン：ｒｆａＩノックダウン及びｃａｖ１過発現（ＯＭＶ及びＩＭＶ）
デオキシビオラセイン：ｒｆａＩノックダウン及びｃａｖ１過発現（ＯＭＶ及びＩＭＶ）。
アスタキサンチン：ｒｆｆＤ及びｒｆａＤノックダウン（ＯＭＶ）
β－カロテン：ｒｆｆＤ及びｒｆａＤノックダウン（ＯＭＶ）
ゼアキサンチン：ｒｆｆＤ及びｒｆａＤノックダウン（ＯＭＶ）
プロビオラセイン：ｒｆａＩノックダウン及びｃａｖ１過発現（ＯＭＶ及びＩＭＶ）
プロデオキシビオラセイン：ｒｆａＩノックダウン（ＯＭＶ）
ビオラセイン：ｒｆａＩノックダウン及びｃａｖ１過発現（ＯＭＶ及びＩＭＶ）
デオキシビオラセイン：ｒｆａＩノックダウン及びｃａｖ１過発現（ＯＭＶ及びＩＭＶ）。
【0064】
したがって、本発明において、カロテノイド系色素群を生産する組換え微生物は、ｒｆａＤ及びｒｆｆＤを同時に発現抑制することが最も好ましいが、これに制限されるものではない。
【0065】
本発明において、ビオラセイン及びその類似体を生産する組換え微生物は、ｒｆａＩの発現を抑制し、同時にｃａｖ１遺伝子を導入又は過発現を誘導することが最も好ましいが、これに制限されるものではない。
【0066】
本発明の疎水性物質生産用組換え菌株は、細胞膜面積の増加；細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加；及び細胞内膜小胞体形成の増加のいずれか一つ以上の特徴を有することを特徴とし得る。
【0067】
本発明の一実施例では、前記細胞膜面積の増加、細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加、及び細胞内膜小胞体形成の増加によって、脂質の供給を円滑にさせるために、脂質合成酵素遺伝子であるｐｌｓＢＣ遺伝子の発現を増幅させたが、このとき、特にカロテノイド色素の生産能向上に顕著な上昇が確認された。
【0068】
本発明において、前記疎水性物質生産用組換え微生物は、脂質合成酵素遺伝子を過発現させることを更なる特徴とし得る。
【0069】
例えば、前記微生物が大腸菌である場合に、脂質合成酵素遺伝子の過発現は、ｐｌｓＢＣ遺伝子の過発現であることを特徴とし得る。
【0070】
本発明で使われる用語“遺伝子発現抑制”とは、抑制対象遺伝子の転写又は翻訳を抑制又は調節してコードするタンパク質の発現を減少又は遮断するか、タンパク質が正しく機能しないようにし、当該遺伝子の機能を失わせることを意味する。本発明において、前記抑制は、ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）と同じ意味で使われてもよい。本発明において、細胞膜面積の増加のために細胞形態関連遺伝子の発現が抑制されてよく、細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加のために、細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持関連遺伝子、細胞外膜タンパク質発現遺伝子、細胞膜代謝回路関連遺伝子の発現が抑制されてよい。本発明において、前記遺伝子発現の抑制は、従来公知の様々な方法によって行われてよい。例えば、制限酵素、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどを用いた遺伝子編集；アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．１１（２）：１２５－４０．）；リボザイム（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．７（１０）：１６４９－１６５３）；ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどを用いたＲＮＡ干渉技術、合成調節ｓＲＮＡ（Ｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３，３１（２）：１７０－１７４）などによって遺伝子の発現が抑制されてよいが、これに制限されるものではない。
【0071】
本発明で使われる用語、“遺伝子導入”は、目的とする遺伝子又はこれを含むベクターを標的細胞又は微生物に新しく流入させることを意味する。本発明の一実施例において、前記遺伝子導入は、天然色素生産菌株を構築するために、プラスミドベクターを用いて天然色素コーディング遺伝子を大腸菌に導入しており、内膜小胞体形成の増進のために、細胞内膜小胞体関連遺伝子をプラスミドベクターを用いて組換え微生物に導入させている。本発明において、前記遺伝子は、従来公知の様々な方法によって組換え微生物に導入されてよい。本発明において、前記導入は、ベクターを用いて微生物に導入されることが好ましいが、これに制限されるものではない。本発明において、遺伝子が宿主細胞のゲノムに直接導入され、染色体上因子として存在し得る。本発明の属する技術分野における当業者にとって、前記遺伝子を宿主細胞のゲノム染色体に挿入しても、組換えベクターを宿主細胞に導入した場合と同じ効果を有することは明らかであろう。
【0072】
本発明の用語、遺伝子の“過発現”は、遺伝子の発現が非変形微生物と比較して増加し、非変形微生物と比較してリボ核酸、タンパク質又は酵素の細胞内濃度の増加につながることを意味する。通常の技術者は、遺伝子の過発現のために、従来公知の様々な方法を制限がなく選択して行うことができる。
【0073】
過発現のための従来公知の技術は、例えば、
－ 微生物において遺伝子のコピー数を増加させる；遺伝子は染色体に又は染色体外にコードされる。遺伝子が染色体上に位置する場合に、遺伝子の複数のコピーは、関連技術分野の専門家に公知された組換え方法（遺伝子代替を含む）によって染色体上に導入されてよい。遺伝子が染色体外に位置する場合に、それは細胞において複製起点及びそれによってコピー数が異なる個別の類型のプラスミドによって保有されてよい。それらのプラスミドは、プラスミドの性質によって、１～５コピー、又は約２０コピー、又は最大で５００コピーで微生物に存在する：緻密複製を有する低コピー数プラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数プラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）又は高コピー数プラスミド（ｐＳＫ ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）。
－ 遺伝子の高いレベルの発現につながるプロモーターを使用する；例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｌａｃ、又はラムダプロモーターＰＲ及びＰＬが幅広く使用されてよいが、これに制限されるものではない。これらのプロモーターは、特定の化合物によって又は温度又は光のような特定の外部条件によって“誘導性”であり得る。これらのプロモーターは、相同又は異種であってよい。
－ 遺伝子の特異的又は非特異的な転写リプレッサーの活性又は発現を減衰させる；
－ 相応するメッセンジャーＲＮＡを安定化させる要素（Ｃａｒｒｉｅｒ ａｎｄ Ｋｅａｓｌｉｎｇ，１９９９）又はタンパク質を安定化させる要素（例えば、ＧＳＴタグ、ジーイーヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用する；
－ ５’末端非解釈部位の（５’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ；５’ＵＴＲ）配列を変更させる、などがあるが、これに制限されるものではない。
－ 微生物において遺伝子のコピー数を増加させる；遺伝子は染色体に又は染色体外にコードされる。遺伝子が染色体上に位置する場合に、遺伝子の複数のコピーは、関連技術分野の専門家に公知された組換え方法（遺伝子代替を含む）によって染色体上に導入されてよい。遺伝子が染色体外に位置する場合に、それは細胞において複製起点及びそれによってコピー数が異なる個別の類型のプラスミドによって保有されてよい。それらのプラスミドは、プラスミドの性質によって、１～５コピー、又は約２０コピー、又は最大で５００コピーで微生物に存在する：緻密複製を有する低コピー数プラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数プラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）又は高コピー数プラスミド（ｐＳＫ ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ）。
－ 遺伝子の高いレベルの発現につながるプロモーターを使用する；例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｌａｃ、又はラムダプロモーターＰＲ及びＰＬが幅広く使用されてよいが、これに制限されるものではない。これらのプロモーターは、特定の化合物によって又は温度又は光のような特定の外部条件によって“誘導性”であり得る。これらのプロモーターは、相同又は異種であってよい。
－ 遺伝子の特異的又は非特異的な転写リプレッサーの活性又は発現を減衰させる；
－ 相応するメッセンジャーＲＮＡを安定化させる要素（Ｃａｒｒｉｅｒ ａｎｄ Ｋｅａｓｌｉｎｇ，１９９９）又はタンパク質を安定化させる要素（例えば、ＧＳＴタグ、ジーイーヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用する；
－ ５’末端非解釈部位の（５’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ；５’ＵＴＲ）配列を変更させる、などがあるが、これに制限されるものではない。
【0074】
本発明において用語“ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）”は、適宜の宿主内で遺伝子を発現させることができる適切な発現調節配列に作動可能に連結された核酸配列を含有する核酸製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は簡単に潜在的ゲノム挿入物であってよい。適当な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムに関係なく複製し機能できるか、又は、一部の場合に、ゲノム自体に統合され得る。現在、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられる形態であるので、本発明の明細書において“プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）”及び“ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）”は、時には同じ意味で使われる。ただし、本発明は、当業界に知られた又は知られるようになるのと同等な機能を有するベクターの他の形態を含む。大腸菌において使用されるタンパク質発現ベクターとしては、Ｎｏｖａｇｅｎ（米国）社のｐＥＴ系列、ｐＣＤＦ系列、ｐＲＳＦ系列、ｐＡＣＹＣ系列及びｐＣＯＬＡ系列；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国）のｐＢＡＤ系列；Ｔａｋａｒａ（日本）のｐＨＣＥやｐＣＯＬＤ；ジェノフォーカス（大韓民国）のｐＡＣＥ系列；カイスト（大韓民国）のｐＴａｃ１５Ｋ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴａｃＣＤＦＳ、ｐＴｒｃＣＤＦＳ系列；広い菌株範囲で利用可能なｐＢＢＲ１ＭＣＳ系列などを使用することができる。枯草菌ではゲノムの特定部分に目的遺伝子を挿入してタンパク質発現を具現するか、ＭｏＢｉＴｅｃｈ（ドイツ）のｐＨＴ系列のベクター、などを使用することができる。かびや酵母においてもゲノム挿入や自家複製ベクターを用いてタンパク質発現が可能である。グロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）やアグロバクテリウムリゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）などのＴ－ＤＮＡシステムを用いて植物用タンパク質発現ベクターを使用することができる。哺乳動物細胞培養物発現のための典型的な発現ベクターは、例えば、ｐＲＫ５（ＥＰ ３０７，２４７号）、ｐＳＶ１６Ｂ（ＷＯ９１／０８２９１号）及びｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に基づく。
【0075】
“発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”という表現は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必須なＤＮＡ配列を意味する。このような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、当該転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適合な調節配列は、プロモーター、任意にオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーがそれに含まれる。プラスミドにおいて遺伝子の発現量に最も影響を及ぼす因子はプロモーターである。高発現用のプロモーターとしてＳＲαプロモーターとサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）由来プロモーターなどが好適に使用される。
【0076】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に様々な発現調節配列のいずれもベクターに使用可能である。有用な発現調節配列の例には、前述したプロモーターの他にも、例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣ又はＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３－ホスホグリセレートキナーゼ又は他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、前記ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母アルファ－交配システムのプロモーター及び原核細胞又は真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を調節するものと知られた構成と誘導のその他の配列及びそれらの種々の組合せが含まれる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターΦは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてタンパク質を発現させるのに有用に用いられ得る。
【0077】
勿論、あらゆるベクターと発現調節配列が本発明のＤＮＡ配列を発現させるのにいずれも同等に機能を発揮するわけではないということは理解すべきである。同様に、あらゆる宿主が同一発現システムに対して同一に機能を発揮するわけではない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担無しで、本発明の範囲を逸脱しないままで種々のベクター、発現調節配列及び宿主の中から適宜選択することができる。例えば、ベクターを選択するには宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその中で複製される必要があるためである。ベクターの複製数、複製数を調節できる能力及び当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮しなければならない。発現調節配列を選定するにあっても、種々の因子を考慮しなければならない。例えば、配列の相対的強度、調節可能性及び本発明のＤＮＡ配列との互換性など、特に、可能性のある二次構造と関連して考慮しなければならない。単細胞宿主は、選定れたベクター、本発明のＤＮＡ配列によってコードされる産物の毒性、分泌特性、タンパク質を正確にフォールディングさせ得る能力、培養及び発酵要件、本発明ＤＮＡ配列によってコードされる産物を宿主から精製することの容易性などの因子を考慮して選定される必要がある。これらの変数の範囲内で、当業者は、本発明のＤＮＡ配列を発酵又は大規模動物培養で発現させ得る各種ベクター／発現調節配列／宿主組合せを選定することができる。発現クローニングによってｃＤＮＡをクローニングしようとする時のスクリーニング法として、バインディング法（ｂｉｎｄｉｎｇ法）、パニング法（ｐａｎｎｉｎｇ法）、フィルムエマルジョン法（ｆｉｌｍ ｅｍｕｌｓｉｏｎ法）などが適用されてよい。
【0078】
前記ベクターにおいて、核酸は他の核酸配列と機能的関係で配置される時に“作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）は、調節配列に結合する時に遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であってよい。例えば、前配列（ｐｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現する場合に、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは配列の転写に影響をおよぼす場合にコーディング配列に作動可能に連結され；又は、リボソーム結合部位は配列の転写に影響を及ぼす場合にコーディング配列に作動可能に連結され；又は、リボソーム結合部位は翻訳を容易にするように配置される場合にコーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合は接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は接触する必要がない。これら配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲイション（連結）によって行われる。そのような部位が存在しない場合には、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用する。
【0079】
前記組換えベクターは、形質転換又は形質感染などの方法で宿主細胞に導入されてよい。本願明細書に使われる用語“形質転換”は、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外因子として又は染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。本願明細書に使われる用語“形質感染”は、任意のコーディング配列が実際に発現しようがしないが、発現ベクターが宿主細胞によって受容されることを意味する。
【0080】
当業界に周知であるように、組換え細胞において形質感染遺伝子の発現レベルを高めるためには、当該遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結される必要がある。好ましくは、発現調節配列及び当該遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）を共に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞である場合には、発現ベクターは真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含むことができる。
【0081】
本発明において、疎水性物質の生産のための微生物は、短時間で高濃度菌体培養が可能であり、遺伝子操作が容易であり、遺伝学的、生理的特徴が明らかになっている大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）などのような原核細胞が広く使用されてきた。上記の原核細胞だけでなく、タンパク質の翻訳後修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、分泌過程及び活性型の３次元構造、タンパク質の活性状態の問題点を解決するために、近年、単細胞真核細胞である酵母系列（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなど）、糸状性真菌類（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）、昆虫細胞（ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ）、植物細胞、哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）などの高等生物に至るまで、組換えタンパク質生産の宿主細胞として用いられているので、実施例で例示された大腸菌又は組換え微生物の他に、別の宿主細胞も利用することは、当業界における通常の知識を有する者にとって容易に適用可能である。例えば、ＣＨＯ細胞株、ＨＥＫ細胞株などが発現のための宿主細胞として使用されてよいが、これに制限されるものではない。
【0082】
本発明において、非常に様々な微生物／宿主細胞及びベクター組合せが利用されてよい。真核宿主に適する発現ベクターには、例えば、Ｖ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス及びレトロウイルスから由来した発現調節配列を含む。細菌宿主に使用可能な発現ベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体のようにＥ．ｃｏｌｉから得られるもので例示できる細菌性プラスミド、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ及びそれらの誘導体のような広域宿主（ｂｒｏａｄ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ）細菌性プラスミド、ｐＥＴ、ｐＣＤＦ、ｐＲＳＦ、ｐＡＣＹＣ、ｐＣＯＬＡ、ｐＢＡＤ、ｐＨＣＥ、ｐＣＯＬＤ、ｐＡＣＥ、ｐＴａｃ１５Ｋ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴａｃＣＤＦＳ、ｐＴｒｃＣＤＦＳ及びそれらの誘導体のような細菌性プラスミド、ＲＰ４のように、より広い宿主範囲を有するプラスミド、λとλＮＭ９８９のような非常に様々なファージラムダ（ｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ）誘導体で例示できるファージＤＮＡ、及びＭ１３とフィラメント性一本鎖のＤＮＡファージのようなその他ＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターは、２μプラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクターは、ｐＶＬ９４１である。
【0083】
本発明において、前記疎水性物質生産用組換え微生物とは、疎水性物質をコードする内因性又は外因性遺伝子を含み、疎水性物質の発現能力を有する微生物を意味する。疎水性物質をコードする遺伝子が外因性遺伝子である場合に、発現微生物又は発現細胞に導入されて生産能を有するように組み替えられた発現微生物が細胞膜エンジニアリングされたものであり得る。微生物に外因性遺伝子を導入する方法は、非制限的な例として“形質転換”、“形質導入”などの方法が様々に従来公知されており、通常の技術者によって適切な方法が選択され、疎水性物質の生産微生物を製造することができる。
【0084】
本発明において、前記組換え微生物は、好ましくは、大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びシクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【0085】
本発明で使われる用語“内因性遺伝子”は、遺伝子が任意の遺伝子変形前に微生物に存在しているということを意味する。内因性遺伝子は、内因性調節要素に追加として又はその代替として異種配列を導入することにより、又は染色体又はプラスミド内に遺伝子の１種以上の相補的コピーを導入することにより、過剰発現し得る。内因性遺伝子は、また、それの相応するコードされたタンパク質の発現及び活性を調整するように変形されてよい。例えば、遺伝子産物を変形させるために、コーディング配列内に突然変異が導入されてもよく、又は内因性調節要素に追加として又はその代替として異種配列が導入されてもよい。内因性遺伝子の調整は、遺伝子産物の活性の上向き調節及び／又は増進を誘発してもよく、又は、代案として、内因性遺伝子産物の活性を下向き調節及び／又は低下させてもよい。
【0086】
発現を調整するさらに他の方式は、内因性遺伝子の発現を上向き又は下向き調節するために、遺伝子の内因性プロモーター（例えば、野生型プロモーター）をより強い又はより弱いプロモーターに交換することである。これらのプロモーターは、相同又は異種であってよい。適切なプロモーターを選択することは、十分に関連技術分野における通常の技術者の能力内にある。
【0087】
逆に、“外因性遺伝子”は、関連技術分野における通常の技術者に広く公知された手段によって遺伝子が微生物内に導入され、当該遺伝子が微生物から自然発生しないということを意味する。外因性遺伝子は、宿主染色体内に統合されてもよく、又は、プラスミド或いはベクターによって染色体外に発現してもよい。細胞において複製起点及びコピー数が異なる様々なプラスミドが、関連技術分野に広く公知されている。これらの遺伝子は、相同であってよい。
【0088】
本発明において、用語“相同遺伝子”は、理論上、共通の遺伝的先祖を有する遺伝子を示すものに制限されないが、遺伝的に非関連してもよいにもかかわらず、類似の機能を果たし、及び／又は類似の構造を有するタンパク質をコードするように進化した遺伝子を含む。したがって、本発明の目的上、用語“機能的相同体”は、特定の酵素的活性が定義されたアミノ酸配列の特定タンパク質のみならず、他の（非）関連した微生物からの類似な配列のタンパク質によっても提供され得るという事実に関するものである。
【0089】
公知の遺伝子に対してジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）に与えられた参照を用いて、関連技術分野における通常の技術者は、他の有機体、バクテリア菌株、酵母、真菌、哺乳動物、植物などで同等な遺伝子を決定できる。このような定常作業は、他の微生物から由来した遺伝子との配列整列を行い、さらに他の有機体から相応する遺伝子をクローニングするための縮重性プローブを設計することによって決定される得るコンセンサス配列を使用して有利に行われる。分子生物学のこれらの定常方法は、関連技術分野における通常の技術者に広く公知されている。
【0090】
本発明は、さらに他の観点において、細胞形態関連遺伝子、及び細胞外膜小胞体関連遺伝子のいずれか一つ以上の遺伝子の抑制；及び細胞内膜小胞体関連遺伝子の過発現又は導入のいずれか一つ以上の細胞膜エンジニアリングを行う段階を含む疎水性物質生産用組換え微生物の製造方法に関する。
【0091】
本発明において、前記細胞膜エンジニアリング段階は、脂質合成酵素遺伝子の発現を増加させることを追加の特徴とし得る。
【0092】
例えば、前記微生物が大腸菌である場合に、脂質合成酵素遺伝子の発現増加は、ｐｌｓＢＣ遺伝子を追加過発現させることであり得る。
【0093】
本発明において、前記方法で製造された組換え微生物は、細胞表面面積の増加；細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加；及び細胞内膜小胞体形成の増加のいずれか一つ以上の特徴を有することを特徴とし得る。
【0094】
本発明の方法で製造された組換え微生物は、細胞表面面積の増加；細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加；及び細胞内膜小胞体形成の増加のいずれか一つ以上の特徴を有することにより、組換え微生物の細胞膜に蓄積される特徴を有する疎水性物質の生産能を顕著に向上させることができる。
【0095】
本発明において、前記細胞形態関連遺伝子は、例えば、細胞分裂に関与する遺伝子、又は細胞骨格／細胞壁の合成又は維持に関与する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0096】
本発明において、細胞分裂に関与する遺伝子は、例えば、細胞分裂タンパク質（細胞分裂タンパク質、例えば、Ｆｔｓタンパク質など）と細胞分裂抑制タンパク質（ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、例えば、ＭｉｎＣ、ＭｉｎＤなど）などからなる原核生物由来の細胞分裂に関与する酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0097】
本発明において、細胞骨格／細胞壁の合成又は維持に関与する遺伝子は、例えば、ペニシリン結合タンパク質(ＰＢＰ）、細胞形態決定タンパク質（ＭｒｅＢ、ＭｒｅＣなど）、ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ（ＭｒｄＡ、ＰｂｐＡなど）、ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｒｄＢなど）、細胞骨格タンパク質（ＲｏｄＺなど）などからなる原核生物由来酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0098】
例えば、前記組換え微生物が大腸菌である場合に、前記細胞形態関連遺伝子は、ｒｏｄＺ（細胞骨格タンパク質）、ｆｔｓＡ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＢ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＩ（ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ）、ｆｔｓＬ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＱ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＷ（プロバブルペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ）、ｆｔｓＺ（細胞分裂タンパク質）、ｍｉｎＤ（セプタムサイト決定タンパク質）、ｍｒｄＡ（ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ）、ｍｒｄＢ（ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ）、ｍｒｅＢ（細胞形態決定タンパク質）、ｍｒｅＣ（細胞形態決定タンパク質）、ｚｉｐＡ（細胞分裂タンパク質）、ｍｕｒＥ（ＵＤＰ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ－－２，６－ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ｌｉｇａｓｅ）、ｐｂｐＣ（ペニシリン結合タンパク質１Ｃ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれるものであり得るが、これに制限されない。本発明において、デオキシビオラセインを生産する場合に、ｍｒｄＢ遺伝子の発現を抑制することが最も好ましい。
【0099】
本発明において、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は、抑制時に、細胞の外膜小胞体の形成及び分泌を向上させ得るいかなる遺伝子も含まれてよく、使用される組換え微生物に応じて一般的に容易に選択されてよい。
【0100】
本発明において、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持関連遺伝子、細胞外膜タンパク質発現遺伝子、細胞膜代謝回路関連遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0101】
本発明において、細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持関連遺伝子は、例えば、リポタンパク質（Ｌｐｐ）、Ｔｏｌ－Ｐａｌシステムタンパク質（ＴｏｌＢ、Ｐａｌ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＲなど）、リポ多糖コア生合成タンパク質、リポ多糖コアヘプトシルトランスフェラーゼ、脂質Ａ生合成ラウロイルトランスフェラーゼなどの細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持に寄与する原核生物由来酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0102】
本発明において、細胞外膜タンパク質発現遺伝子は、例えば、ＯｍｐＡ（ｏｕｔｅｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）、ＯｍｐＣ（ｏｕｔｅｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）、ＯｍｐＦ（ｏｕｔｅｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆ）、ＯｐｒＦ（ＯｍｐＡホモログ）、エンベロープタンパク質（ＲａｇＡ、ＲａｇＢなど）などの細胞外膜タンパク質発現に寄与する原核生物由来酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0103】
本発明において、細胞膜代謝回路関連遺伝子は、例えば、キノロン信号（ＰＱＳ）、抗シグマＥ因子、シグマ因子Ｈ（ＡｌｇＵ）、シャペロンプロテアーゼ（ＤｅｇＰ）などの原核生物由来細胞膜代謝回路酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0104】
本発明の一実施例において、天然色素を発現させるように組み替えられた大腸菌を製造した後に、スクリーニングされた前記外膜小胞体関連遺伝子２６種の発現を抑制して細胞膜エンジニアリングを行った（表７）。本発明において、前記組換え微生物が大腸菌である場合に、前記外膜小胞体関連遺伝子は、ｒｓｅＡ（Ａｎｔｉ－ｓｉｇｍａ－Ｅ ｆａｃｔｏｒ）、ｒｓｅＢ（Ｓｉｇｍａ－Ｅ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆｆＤ（ＵＤＰ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｒｆｆＣ（ｄＴＤＰ－ｆｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆｆＡ（ｄＴＤＰ－４－ａｍｉｎｏ－４，６－ｄｉｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ｏｍｐＲ（ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｕａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、ｇｍｈＢ（Ｄ－ｇｌｙｃｅｒｏ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｈｅｐｔｏｓｅ－１，７－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ７－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ｌｐｘＬ（Ｌｉｐｉｄ Ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｌａｕｒｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｌｐｘＭ（Ｌｉｐｉｄ Ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｙｒｉｓｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｏｍｐＡ（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｏｍｐＣ（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆａＢ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，６－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＣ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｈｅｐｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）、ｒｆａＤ（ＡＤＰ－Ｌ－ｇｌｙｃｅｒｏ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｈｅｐｔｏｓｅ－６－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）、ｒｆａＥ（Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨｌｄＥ）、ｒｆａＧ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆａＩ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＪ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＫ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＰ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｅ（Ｉ）ｋｉｎａｓｅ）、ｒｆａＱ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＹ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｅ（ＩＩ）ｋｉｎａｓｅ）、ｒｆｂＡ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）、ｒｆｆＨ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）、ｗｚｘＥ（ＥＣＡ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びｐｎｐ（Ｐｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｔｏｌＡ（ｃｏｌｉｃｉｎ ｉｍｐｏｒｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＢ（Ｔｏｌ－Ｐａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＣ（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＲ（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｎｌｐＩ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｎｌｐＤ（ｍｕｒｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ｏｍｐＦ（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐａｌ（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｄｅｇＳ（ｓｅｒｉｎｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、ｄｅｇＰ（ｓｅｒｉｎｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、ｔａｔＣ（ｓｅｃ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｌｐｐ（ｍｕｒｅｉｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれるものであり得るが、これに制限されない。
【0105】
本発明において、前記疎水性物質生産用組換え微生物が、細胞内膜小胞体システムのない微生物である場合に、細胞内膜を形成する他の真核又は原核生物由来内膜小胞体システム遺伝子が導入されることを特徴とし得る。本発明において、前記疎水性物質生産用組換え細胞が先天的に細胞内膜小胞体システムを含む場合に、前記細胞自体の細胞内膜小胞体遺伝子を過発現させるか、これに併せて他の真核又は原核生物由来内膜小胞体システム遺伝子を導入させることを特徴とし得る。本発明において、前記細胞内膜小胞体関連遺伝子は、真核細胞由来のカベオラシステムの遺伝子又はクラスリン－エプシンシステムの遺伝子でよく、又は原核細胞由来のｍｇｓ－ｄｇｓシステムなどでよく、より具体的な例としてはｃａｖ１（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ｃａｖ２（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－２）、ｃａｖ３（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－３）、ＥＰＮ１（Ｅｐｓｉｎ１）、ＣＬＩＮＴ１（ＥｐｓｉｎＲ）、ＣＬＴＣ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）、ＣＬＴＣＬ１（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ２）、ＣＬＴＡ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ａ）、ＣＬＴＢ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ｂ）、ＡＰ１８０、ＡＰ２、ａｌｍｇｓ（１，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ３－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ａｌｄｇｓ（１，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｇｌｕｃｏｓｅ（１－２）－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｄｉｇｌｕｃｏｓｙｌｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれるものであり得るが、これに制限されない。
【0106】
本発明において前記組換え微生物は、大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びシクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【0107】
本発明は、さらに他の観点において、本発明の疎水性物質生産用組換え微生物又は前記方法で製造された疎水性物質生産用組換え微生物を培養して疎水性物質を生産する段階、及び生産された疎水性物質を取得する段階を含む疎水性物質の製造方法に関する。
【0108】
本発明において、疎水性物質生産用組換え微生物を培養して疎水性物質を生産する段階は、従来公知の様々な微生物培養方法で制限なく行われてよく、菌株、生産しようとする物質などに応じて、培養培地、培養条件（温度、時間、物理的条件）などが適宜選択されて行われてよい。
【0109】
本発明の用語“培養”は、微生物を培養して、目的とする効能を導き出すことを意味し、本発明で目的とする効能は、疎水性物質の生産を意味する。前記培養は、使用される微生物に適合化し、少なくとも１種の単純炭素供給源及び必要な場合に共同基質を含有する適切な培養培地を有する培養器で一般的に行われてよい。
【0110】
本発明において、前記“培養”は、微生物培養を用いた疎水性物質の生産を意味し、“発酵”と同じ意味で使われてもよい。
【0111】
本発明において、前記組換え微生物を培養して疎水性物質を生産する段階は、流加式発酵を通じて行われることを特徴とし得る。
【0112】
本発明の用語“流加式培養”又は“流加式発酵”とは、培地を間欠的に追加供給して培養液の濃度を制御して培養／発酵させることを意味する。
【0113】
“適切な培養培地”は、炭素供給源又は炭素基質、窒素供給源、例えば、ペプトン、ブドウ糖、グリセロール、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、ウレア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム；リン供給源、例えばリン酸一カリウム又はリン酸二カリウム；微量元素（例えば、金属塩）、例えばマグネシウム塩、コバルト塩及び／又はマンガン塩；の他に、成長因子、例えばアミノ酸及びビタミンのように、細胞の維持及び／又は成長に必須又は有益な栄養素；酵母抽出物、抗生剤なども含むことができる。本発明において、前記培養は、疎水性物質を生産するために適切な範囲の温度で培養されることを特徴とし、例えば３０～４０℃、好ましくは３５～３８℃で培養されることを特徴とし得るが、これに制限されず、宿主微生物の種、発現しようとする物質など応じて、異なる条件で培養されてもよい。
【0114】
本発明の目的は、細胞膜に蓄積される疎水性物質を、細胞膜エンジニアリングを行って細胞膜面積の増加、細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加、又は内膜小胞体形成の増加を通じて生産能を増大させることにある。本発明の実施例では、大腸菌の細胞形態関連遺伝子の抑制を用いた細胞膜面積の増加、細胞外膜小胞体関連遺伝子の抑制を用いた細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加、及び細胞内膜小胞体関連遺伝子の過発現を用いた内膜小胞体形成の増加が、細胞膜に蓄積される代表的な疎水性物質である天然色素の顕著な生産能向上につながることを確認した。一般に、疎水性物質は、疎水性を帯びる細胞膜又は小胞体の内膜及び外膜に蓄積されるので、天然色素の他にも、微生物を通じて生産され得る様々な疎水性物質の生産能向上を示すことができることは明らかであろう。
【0115】
したがって、本発明の組換え微生物が生産する疎水性物質は、細胞膜に蓄積されることを特徴とし得る。例えば、前記疎水性物質は、天然色素、抗酸化物質、抗生剤、化粧品添加物、抗癌剤、食品添加剤及び栄養補助剤などであり得るが、これに制限されるものではない。
【0116】
本発明において、前記天然色素は、人工的に合成せずに自然から得られる色素又はその類似体を意味し、例えば、カロテノイド、ビオラセインなどがあり、より具体的な例にリコペン、β－カロテン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、プロビオラセイン（ＰＶＩＯ）、プロデオキシビオラセイン（ＰＤＶＩＯ）、デオキシビオラセイン（ＤＶＩＯ）、ビオラセイン（ＶＩＯ）などがあるが、これに制限されるものではない。
【0117】
前記抗酸化物質は、例えば、ケルセチン、ジヒドロケルセチン、ケンペロール、ジヒドロケンペロール、アスタキサンチン、レスベラトロール、トコフェロール、トコトリエノール、コエンザイムＱ１０、アピゲニンなどがあるが、これに制限されるものではない。
【0118】
前記化粧品添加物は、例えば、アロエシン、ビタミンＡ、セラミド、パントテネート、パンテノール、ルペオール、スクアレン、ユーカリプトール、バレンセンなどがあるが、これに制限されるものではない。
【0119】
前記食品添加剤は、例えば、カルミン酸、β－カロテン、リコペンなどがあるが、これに制限されるものではない。
【0120】
前記栄養補助剤は、例えば、シリマリン、ルテイン、ビタミン、コエンザイム－Ｑ１０、レスベラトロール、オメガ－３多価不飽和脂肪酸、ユビキノン、グルコサミン、ルテオリンなどがあるが、これに制限されるものではない。
【0121】
本発明の一実施例において、上述のように、様々な遺伝子の抑制、導入又は過発現を行って、本発明の疎水性物質生産用組換え微生物を製造し、全体的に疎水性物質の生産能が維持又は顕著に向上することを確認したが、生産しようとする疎水性物質にしたがって、最も顕著な生産能の増進効果を示す遺伝子組合せの細胞膜エンジニアリングが異なることを確認した。
【0122】
疎水性物質は、同一の疎水性を示す細胞膜に蓄積される現象を示すので、細胞膜面積の向上、細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加、内膜小胞体形成の増加のための本発明の細胞膜がエンジニアリングされた組換え微生物法は、疎水性物質の生産能の向上を示すことができる。
【0123】
したがって、本発明の細胞膜エンジニアリングを用いた疎水性物質生産用微生物は、様々な遺伝子組合せの抑制、導入、又は過発現を通じてライブラリーとして構築されてよく、前記ライブラリーを用いて特定の疎水性物質に対する優れた生産能を示す菌株をスクリーニングすることは、疎水性物質の生産能が向上した組換え菌株の選別及び開発に、費用、手続、時間の面で有用に用いられ得る。
【0124】
したがって、本発明は、さらに他の観点において、疎水性物質生産用微生物に、細胞形態関連遺伝子の発現抑制；細胞外膜小胞体関連遺伝子の発現抑制；及び細胞内膜小胞体関連遺伝子の導入又は過発現のいずれか一つ以上の手段を用いて細胞膜エンジニアリングを行って得た、疎水性物質生産用微生物のライブラリーに関する。
【0125】
本発明は、さらに他の観点において、
（ａ）疎水性物質生産用微生物に、細胞形態関連遺伝子の発現抑制；細胞外膜小胞体関連遺伝子の発現抑制；及び細胞内膜小胞体関連遺伝子の導入又は過発現のいずれか一つ以上の手段を用いて細胞膜エンジニアリングを行って、疎水性物質生産用微生物のライブラリーを生成する段階；及び
（ｂ）前記疎水性物質生産用微生物を培養して、特定の疎水性物質の生産能に優れた組換え微生物を選別する段階を含む、特定の疎水性物質の生産能が増加した細胞膜エンジニアリングされた組換え微生物のスクリーニング方法に関する。
（ａ）疎水性物質生産用微生物に、細胞形態関連遺伝子の発現抑制；細胞外膜小胞体関連遺伝子の発現抑制；及び細胞内膜小胞体関連遺伝子の導入又は過発現のいずれか一つ以上の手段を用いて細胞膜エンジニアリングを行って、疎水性物質生産用微生物のライブラリーを生成する段階；及び
（ｂ）前記疎水性物質生産用微生物を培養して、特定の疎水性物質の生産能に優れた組換え微生物を選別する段階を含む、特定の疎水性物質の生産能が増加した細胞膜エンジニアリングされた組換え微生物のスクリーニング方法に関する。
【0126】
本発明は、疎水性物質が細胞膜に蓄積される性質を用いて、関連遺伝子群の抑制又は過発現による細胞膜エンジニアリングを通じて細胞膜面積の増加、細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加、及び／又は細胞内膜小胞体形成の増加の特性を有する疎水性物質生産用ライブラリーを生産でき、これに基づき、特定の疎水性物質の生産能が向上した組換え菌株をスクリーニングできることに特徴がある。
【0127】
本発明において、前記“疎水性物質生産用微生物のライブラリー”とは、細胞形態関連遺伝子の発現抑制；細胞外膜小胞体関連遺伝子の発現抑制、及び細胞内膜小胞体関連遺伝子の導入又は過発現が単独又は任意に組み合わせられてなされたものであり得る。
【0128】
本発明において、前記（ａ）段階の細胞膜エンジニアリングは、疎水性物質生産用微生物ライブラリーは脂質合成酵素遺伝子の発現を増加させることを追加の特徴とし得る。
【0129】
本発明において、前記ライブラリーは、前記細胞形態関連遺伝子単独、細胞形態関連遺伝子間の任意の組合せが抑制された組換え微生物をいずれも含むことができる。
【0130】
本発明において、前記細胞形態関連遺伝子は、細胞の形態を維持するのに関与する遺伝子であればいずれも含まれてよい。
【0131】
本発明において、前記細胞形態関連遺伝子は、発現抑制時に細胞の形態が変形されて細胞の面積が増加するいかなる遺伝子も含まれてよく、使用される組換え微生物に応じて、通常の技術者によって容易に選択されてよい。
【0132】
本発明において、前記細胞形態関連遺伝子は、例えば、細胞分裂に関与する遺伝子、又は細胞骨格／細胞壁の合成又は維持に関与する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0133】
本発明において、細胞分裂に関与する遺伝子は、例えば、細胞分裂タンパク質（細胞分裂タンパク質、例えばＦｔｓタンパク質など）と細胞分裂抑制タンパク質（ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、例えば、ＭｉｎＣ、ＭｉｎＤなど）などの原核生物由来の酵素群を暗号化する内因性遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0134】
本発明において、細胞骨格／細胞壁の合成又は維持に関与する遺伝子は、例えば、ペニシリン結合タンパク質(ＰＢＰ）、細胞形態決定タンパク質（ＭｒｅＢ、ＭｒｅＣなど）、ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ（ＭｒｄＡ、ＰｂｐＡなど）、ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ（ＭｒｄＢなど）、細胞骨格タンパク質（ＲｏｄＺなど）などの原核生物由来酵素群を暗号化する内因性遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0135】
本発明において、例えば、前記ライブラリーを製造するために使用される組換え微生物が大腸菌である場合に、前記細胞形態関連遺伝子は、ｒｏｄＺ（細胞骨格タンパク質）、ｆｔｓＡ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＢ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＩ（ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ）、ｆｔｓＬ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＱ（細胞分裂タンパク質）、ｆｔｓＷ（プロバブルペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ）、ｆｔｓＺ（細胞分裂タンパク質）、ｍｉｎＤ（セプタムサイト決定タンパク質）、ｍｒｄＡ（ペプチドグリカンＤ，Ｄ－トランスペプチダーゼ）、ｍｒｄＢ（ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼ）、ｍｒｅＢ（細胞形態決定タンパク質）、ｍｒｅＣ（細胞形態決定タンパク質）、ｚｉｐＡ（細胞分裂タンパク質）、ｍｕｒＥ（ＵＤＰ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌ－Ｌ－ａｌａｎｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ－－２，６－ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ ｌｉｇａｓｅ）、ｐｂｐＣ（ペニシリン結合タンパク質１Ｃ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれるものであり得るが、これに制限されない。
【0136】
本発明において、前記ライブラリーは、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子単独、細胞外膜小胞体関連遺伝子間の任意の組合せが抑制された組換え微生物をいずれも含むことができる。
【0137】
本発明において、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は、細胞外膜小胞体の形成又は分泌に関与する遺伝子であればいずれも含むことができる。
【0138】
本発明において、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は、細胞のペプチドグリカン層又は細胞外膜と内膜の連結を維持させる役割を担う遺伝子であることを特徴とし得る。
【0139】
本発明において、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は、細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持関連遺伝子、細胞外膜タンパク質発現遺伝子、細胞膜代謝回路関連遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0140】
本発明において、細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持関連遺伝子は、例えば、リポタンパク質（Ｌｐｐ）、Ｔｏｌ－Ｐａｌシステムタンパク質（ＴｏｌＢ、Ｐａｌ、ＴｏｌＡ、ＴｏｌＲなど）、リポ多糖コア生合成タンパク質、リポ多糖コアヘプトシルトランスフェラーゼ、脂質Ａ生合成ラウロイルトランスフェラーゼなどの細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持に寄与する原核生物由来酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0141】
本発明において、細胞外膜タンパク質発現遺伝子は、例えば、ＯｍｐＡ（ｏｕｔｅｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）、ＯｍｐＣ（ｏｕｔｅｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）、ＯｍｐＦ（ｏｕｔｅｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆ）、ＯｐｒＦ（ＯｍｐＡホモログ）、エンベロープタンパク質（ＲａｇＡ、ＲａｇＢなど）などの細胞外膜タンパク質発現に寄与する原核生物由来酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0142】
本発明において、細胞膜代謝回路関連遺伝子は、例えば、キノロン信号（ＰＱＳ）、抗シグマＥ因子、シグマ因子Ｈ（ＡｌｇＵ）、シャペロンプロテアーゼ（ＤｅｇＰ）などの原核生物由来細胞膜代謝回路酵素群を暗号化する遺伝子であり得るが、これに制限されるものではない。
【0143】
本発明において、例えば、前記組換え微生物が大腸菌である場合に、前記細胞外膜小胞体関連遺伝子は、ｒｓｅＡ（Ａｎｔｉ－ｓｉｇｍａ－Ｅ ｆａｃｔｏｒ）、ｒｓｅＢ（Ｓｉｇｍａ－Ｅ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆｆＤ（ＵＤＰ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｒｆｆＣ（ｄＴＤＰ－ｆｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆｆＡ（ｄＴＤＰ－４－ａｍｉｎｏ－４，６－ｄｉｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ｏｍｐＲ（ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｕａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、ｇｍｈＢ（Ｄ－ｇｌｙｃｅｒｏ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｈｅｐｔｏｓｅ－１，７－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ７－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ｌｐｘＬ（Ｌｉｐｉｄ Ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｌａｕｒｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｌｐｘＭ（Ｌｉｐｉｄ Ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｙｒｉｓｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｏｍｐＡ（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｏｍｐＣ（Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆａＢ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，６－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＣ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｈｅｐｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）、ｒｆａＤ（ＡＤＰ－Ｌ－ｇｌｙｃｅｒｏ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｈｅｐｔｏｓｅ－６－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）、ｒｆａＥ（Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨｌｄＥ）、ｒｆａＧ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｒｆａＩ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＪ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＫ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １，２－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＰ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｅ（Ｉ）ｋｉｎａｓｅ）、ｒｆａＱ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｒｆａＹ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｒｅ ｈｅｐｔｏｓｅ（ＩＩ）ｋｉｎａｓｅ）、ｒｆｂＡ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）、ｒｆｆＨ（Ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｈｙｍｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）、ｗｚｘＥ（ＥＣＡ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びｐｎｐ（Ｐｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ｔｏｌＡ（ｃｏｌｉｃｉｎ ｉｍｐｏｒｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＢ（Ｔｏｌ－Ｐａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＣ（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｔｏｌＲ（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｎｌｐＩ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｎｌｐＤ（ｍｕｒｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ｏｍｐＦ（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐａｌ（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｄｅｇＳ（ｓｅｒｉｎｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、ｄｅｇＰ（ｓｅｒｉｎｅ ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、ｔａｔＣ（ｓｅｃ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｌｐｐ（ｍｕｒｅｉｎ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれるものであり得るが、これに制限されない。
【0144】
本発明において、前記ライブラリーは、前記細胞内膜小胞体関連遺伝子単独、細胞内膜小胞体関連遺伝子間の任意の組合せが抑制された組換え微生物をいずれも含むことができる。
【0145】
本発明において、“細胞内膜小胞体関連遺伝子”は、細胞内膜小胞体の形成に関与する遺伝子であればいずれも含むことができる。
【0146】
本発明において、細胞内膜小胞体関連遺伝子は、細胞内膜小胞体の形成を向上させる遺伝子であれば制限なく選択されて使用されてよい。本発明において、前記疎水性物質生産用組換え微生物が、細胞内膜小胞体システムのない微生物である場合に、細胞内膜を形成する他の真核又は原核生物由来内膜小胞体システム遺伝子が導入されてライブラリーを製造することを特徴とし得る。
【0147】
本発明において、前記疎水性物質生産用組換え微生物が先天的に細胞内膜小胞体システムを含む場合に、前記細胞内膜小胞体の関連遺伝子を過発現させるか、これに併せて他の真核又は原核生物由来内膜小胞体システム遺伝子を導入させることを特徴とし得る。
【0148】
本発明において、前記細胞内膜小胞体関連遺伝子は、真核細胞由来のカベオラシステムの遺伝子又はクラスリン－エプシンシステムの遺伝子でよく、又は原核細胞由来のｍｇｓ－ｄｇｓシステムなどでよく、より具体的な例としてはｃａｖ１（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１）、ｃａｖ２（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－２）、ｃａｖ３（Ｃａｖｅｏｌｉｎ－３）、ＥＰＮ１（Ｅｐｓｉｎ１）、ＣＬＩＮＴ１（ＥｐｓｉｎＲ）、ＣＬＴＣ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １）、ＣＬＴＣＬ１（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ２）、ＣＬＴＡ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ａ）、ＣＬＴＢ（ｃｌａｔｈｒｉｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ Ｂ）、ＡＰ１８０、ＡＰ２、ａｌｍｇｓ（１，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ３－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ａｌｄｇｓ（１，２－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ－３－ｇｌｕｃｏｓｅ（１－２）－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｄｉｇｌｕｃｏｓｙｌｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれるものであり得るが、これに制限されない。
【0149】
本発明において、前記疎水性生産用微生物のライブラリーは、細胞形態関連遺伝子、細胞外膜小胞体関連遺伝子及び細胞内膜小胞体関連遺伝子からなる群から選ばれるいずれか一つの遺伝子又はそれら遺伝子の任意の組合せが抑制、導入、又は過発現している組換え微生物を含むことを特徴とし得る。
【0150】
本発明において、前記疎水性生産用微生物のライブラリーは、単一属又は単一種の微生物を含むことができ、異なる属又は種の微生物が混合して含まれてもよい。
【0151】
本発明において、前記疎水性生産用微生物のライブラリーは、大腸菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、マンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びこれらの組合せからなる群から選ばれる微生物を含むことを特徴とし得る。
【0152】
本発明において、疎水性物質生産用微生物のライブラリーは、細胞膜面積の増加；細胞外膜小胞体形成及び分泌の増加；及び細胞内膜小胞体形成の増加のいずれか一つ以上の特徴を有することを特徴とし得る。
【実施例0153】
以下、本発明を、具体的な実施例を用いてより詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例によって限定されるものではなく、本発明のアイディア及び範囲内で様々な変形又は修正が可能であることは通常の技術者には明らかであろう。
【0154】
実施例１：天然色素生産菌株の構築
実施例１－１：カロテノイド生産菌株の構築
カロテノイドは、にじスペクトルにおいて赤色、橙色、黄色の光を担当するが、様々なカロテノイドの中でβ－カロテン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンが代表的であり、それぞれ、橙色、黄色、赤色の光を帯びる。この３種のカロテノイドを生産する大腸菌の構築に先立ち、それらの前駆体となるリコペン生産菌株をまず構築した。大腸菌は、元来、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－ホスフェート生産経路を通じてファルネシルジホスフェートを生産できるので、カロテノイド合成経路において最先頭に位置するリコペン生産のためには、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩの３種の遺伝子の導入が必要である（図１）。不要な前駆体が蓄積されることを防止し、代謝流れのバランスを取るために、それぞれの遺伝子の発現レベルを様々に組み合わせてスクリーニングした。発現レベルは、５’末端非解釈部位（５’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ；５’ＵＴＲ）の配列を変更することによって調節した（図２Ａ）。５’ＵＴＲ配列ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）は、それぞれの遺伝子に対してＵＴＲライブラリーデザイナープログラムを用いて構築し、合計１６個の５’ＵＴＲ配列で構成した。１６個の異なる５’ＵＴＲ配列が融合されたそれぞれの遺伝子を組み合わせてｐＴａｃ１５Ｋプラスミドに導入し、ｐＬＹＣライブラリーを構築した。ｐＬＹＣライブラリーを構築するために、まず、ｐＴａｃ１５Ｋプラスミドを［配列番号１］及び［配列番号２］のプライマーを用いてＰＣＲ増幅で線形化した。次に、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ遺伝子を、ｐＣａｒ１８４（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１０，７６（１０）：３０９７－３１０５）プラスミドにおいて、それぞれ［配列番号３］及び［配列番号４］、［配列番号５］及び［配列番号６］、［配列番号７］及び［配列番号８］プライマーでそれぞれＰＣＲ増幅した後、線形化されたｐＴａｃ１５ｋプラスミドにギブソンアセンブリーでクローニングした。
実施例１－１：カロテノイド生産菌株の構築
カロテノイドは、にじスペクトルにおいて赤色、橙色、黄色の光を担当するが、様々なカロテノイドの中でβ－カロテン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンが代表的であり、それぞれ、橙色、黄色、赤色の光を帯びる。この３種のカロテノイドを生産する大腸菌の構築に先立ち、それらの前駆体となるリコペン生産菌株をまず構築した。大腸菌は、元来、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－ホスフェート生産経路を通じてファルネシルジホスフェートを生産できるので、カロテノイド合成経路において最先頭に位置するリコペン生産のためには、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩの３種の遺伝子の導入が必要である（図１）。不要な前駆体が蓄積されることを防止し、代謝流れのバランスを取るために、それぞれの遺伝子の発現レベルを様々に組み合わせてスクリーニングした。発現レベルは、５’末端非解釈部位（５’ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ；５’ＵＴＲ）の配列を変更することによって調節した（図２Ａ）。５’ＵＴＲ配列ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）は、それぞれの遺伝子に対してＵＴＲライブラリーデザイナープログラムを用いて構築し、合計１６個の５’ＵＴＲ配列で構成した。１６個の異なる５’ＵＴＲ配列が融合されたそれぞれの遺伝子を組み合わせてｐＴａｃ１５Ｋプラスミドに導入し、ｐＬＹＣライブラリーを構築した。ｐＬＹＣライブラリーを構築するために、まず、ｐＴａｃ１５Ｋプラスミドを［配列番号１］及び［配列番号２］のプライマーを用いてＰＣＲ増幅で線形化した。次に、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ遺伝子を、ｐＣａｒ１８４（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１０，７６（１０）：３０９７－３１０５）プラスミドにおいて、それぞれ［配列番号３］及び［配列番号４］、［配列番号５］及び［配列番号６］、［配列番号７］及び［配列番号８］プライマーでそれぞれＰＣＲ増幅した後、線形化されたｐＴａｃ１５ｋプラスミドにギブソンアセンブリーでクローニングした。
【0155】
【表1】
【0156】
構築したｐＬＹＣライブラリーを、本研究陣の先行研究で開発した大腸菌ＷＬＧＢ－ＲＰＰ菌株に導入した後、ｐＬＹＣライブラリーサイズの１０倍に達するコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）の中から、特に濃い色を帯びるコロニー２００個を選別し、テストチューブ培養を行った後、生産されたリコペンを抽出し、４７４ｎｍにおける吸光度を比較した。そのうち、上位１０個菌株に対してフラスコ培養をさらに行った。ＬＹＣ７９菌株において、最も多い２３．９０ｍｇ／Ｌのリコペンが生産された。
【0157】
選別したＬＹＣ７９菌株に基づいてβ－カロテン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン生産菌株も同様の方法で構築した。まず、リコペンでβ－カロテンを生産するにはｃｒｔＹ遺伝子が、β－カロテンからゼアキサンチンを生産するにはｃｒｔＺが、ゼアキサンチンからアスタキサンチンを生産するにはＢＫＴがさらに必要である。これらの各遺伝子に対して、それぞれ異なる１６個の５’ＵＴＲ配列で構成された５’ＵＴＲライブラリーを構築し、遺伝子の５’末端に融合した。
【0158】
ｐＢＴＣライブラリーを構築するために、まず、ｐＴｒｃＣＤＦＳプラスミドを［配列番号９］及び［配列番号１０］プライマーを用いてＰＣＲ増幅で線形化した。ｐＣａｒ１８４プラスミドから［配列番号１１］及び［配列番号１２］プライマーを用いてＰＣＲ増幅したｃｒｔＹは、線形化されたｐＴｒｃＣＤＦＳにギブソンアセンブリーでクローニングした。ｐＺＥＡライブラリー構築のためには、ｐＣａｒ１８４からそれぞれ［配列番号１１］及び［配列番号１３］、［配列番号１４］及び［配列番号１５］プライマーを用いてＰＣＲ増幅したｃｒｔＹとｃｒｔＺを、線形化されたｐＴｒｃＣＤＦＳにギブソンアセンブリーでクローニングした。ｐＡＴＸライブラリー構築のためには、ｐＡＸ１（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ ２０１８，４９：１０５－１１５）プラスミドから［配列番号１６］及び［配列番号１７］プライマーを用いてＰＣＲ増幅したｔｒＣｒＢＫＴを、ｐＺＥＡのＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した。
【0159】
【表2】
【0160】
構築されたｐＢＴＣ、ｐＺＥＡ、ｐＡＴＸライブラリーをＬＹＣ７９菌株に導入し、それぞれ２０、４０、２００個のコロニーを肉眼で選別後にテストチューブ培養した。生産されたβ－カロテン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンはそれぞれアセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）抽出し、４７３、４５２、４７５ｎｍ波長における吸光度を測定して生産濃度を比較した。このとき、アスタキサンチンは、前駆体であるカンタキサンチンとは肉眼及び吸光度測定ではその色が区分できず、吸光度測定の結果における上位５０個菌株に対しては、ＨＰＬＣ分析をさらに行った。テストチューブ培養においてβ－カロテン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンを最も多く生産する３個、５個、１０個の菌株に対してフラスコ培養を行った。ＢＴＣ１、ＺＥＡ２０、ＡＴＸ６８菌株がそれぞれ、１８．６５ｍｇ／Ｌ β－カロテン、１２．６７ｍｇ／Ｌゼアキサンチン、１４．４９ｍｇ／Ｌアスタキサンチンと、最も多い生産量を示し、最終菌株として選別された（図２）。
【0161】
１－２．ビオラセイン類似体生産菌株構築
カロテノイドに続いて、じスペクトルを完成するために、本研究陣はビオラセイン類似体を生産しようとした。ビオラセイン類似体は、ビスインドール色素に分類され、クロモバクテリウムビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）とヤンシノバクテリウムリビダム（Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｖｉｄｕｍ）などのようなバクテリアから生産され、抗癌効果のように様々な薬理的効能を有することが知られている。そこで、本研究陣は、４種のビオラセイン類似体であるプロデオキシビオラセイン、プロビオラセイン、デオキシビオラセイン、ビオラセインを生産できるように生合成経路を構築し（図１、図３Ａ）、これより生産された物質の色を観察した（図３Ｇ）。本研究陣が既存の研究でビオラセイン類似体の共通の前駆体であるトリプトファン過生産菌株を既に構築したので（ＩＮＤ５ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＴａｃＧＥＬ）、当該菌株にｐＴａｃＣＤＦＳベクターベースのビオラセイン類似体生合成経路を導入したプラスミドを形質転換させ、ビオラセイン類似体生産基本菌株を作製した。
カロテノイドに続いて、じスペクトルを完成するために、本研究陣はビオラセイン類似体を生産しようとした。ビオラセイン類似体は、ビスインドール色素に分類され、クロモバクテリウムビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）とヤンシノバクテリウムリビダム（Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｖｉｄｕｍ）などのようなバクテリアから生産され、抗癌効果のように様々な薬理的効能を有することが知られている。そこで、本研究陣は、４種のビオラセイン類似体であるプロデオキシビオラセイン、プロビオラセイン、デオキシビオラセイン、ビオラセインを生産できるように生合成経路を構築し（図１、図３Ａ）、これより生産された物質の色を観察した（図３Ｇ）。本研究陣が既存の研究でビオラセイン類似体の共通の前駆体であるトリプトファン過生産菌株を既に構築したので（ＩＮＤ５ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＴａｃＧＥＬ）、当該菌株にｐＴａｃＣＤＦＳベクターベースのビオラセイン類似体生合成経路を導入したプラスミドを形質転換させ、ビオラセイン類似体生産基本菌株を作製した。
【0162】
まず、ｐＴａｃＣＤＦＳプラスミドを基本ベクターとし、［配列番号１８］及び［配列番号１９］プライマーを用いて逆ＰＣＲ反応を行ってプラスミドを線形化した。その後、ｖｉｏＡＢ遺伝子を２つの遺伝子片に分けて増幅したが、一番目の片は［配列番号２０］及び［配列番号２１］で、二番目の片は［配列番号２２］及び［配列番号２３］で増幅した。当該２つのＤＮＡ片は、先に線形化されたプラスミドとギブソンアセンブリーでクローニングされ、ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＡＢプラスミドが作製された。同一の方法を用いてｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＣ、ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＤ、ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＣＤ、ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＥプラスミドを構築した。遺伝子ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、ｖｉｏＣＤ及びｖｉｏＥはそれぞれ、プライマー対［配列番号２４］及び［配列番号２５］、［配列番号２６］及び［配列番号２７］、［配列番号２４］及び［配列番号２７］、そして［配列番号２８］及び［配列番号２９］を用いてＰＣＲ増幅された。プロデオキシビオラセイン（ＰＤＶＩＯ）生産のためのプラスミドｐＰＤＶＩＯ（ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＡＢＥ）は、次の通りに構築された。ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＥプラスミドをテンプレートとし、［配列番号３０］及び［配列番号３１］プライマーを用いてｖｉｏＥ遺伝子片を増幅し、これをｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＡＢプラスミドのＳａｃＩサイトに挿入した。プロビオラセイン（ＰＶＩＯ）、デオキシビオラセイン（ＤＶＩＯ）、ビオラセイン（ＶＩＯ）をそれぞれ生産するためのｐＰＶＩＯ（ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＡＢＤＥ）、ｐＤＶＩＯ（ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＡＢＣＥ）、ｐＶＩＯ（ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＡＢＣＤＥ）プラスミドは、次の通りに構築された。各プラスミドｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＣ、ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＤ、ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＣＤをテンプレートとし、［配列番号３２］及び［配列番号３１］を共通のプライマーとして用いて各遺伝子片ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、ｖｉｏＣＤを増幅した。増幅された遺伝子は、ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＡＢＥプラスミドのＳａｃＩサイトに挿入され、ｐＤＶＩＯ（ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＡＢＣＥ）、ｐＰＶＩＯ（ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＡＢＤＥ）、ｐＶＩＯ（ｐＴａｃＣＤＦＳ－ｖｉｏＡＢＣＤＥ）プラスミドを完成した。
【0163】
【表3】
【0164】
ビオラセイン生産菌株を、ブドウ糖及びグリセロールをそれぞれ炭素源として用いてフラスコ培養を行ったとき、図３Ｂに示すように、グリセロールを炭素源とした場合においてより高い濃度のビオラセインが生産された。これにより、全てのビオラセイン類似体はグリセロールを炭素源として用いた。上のように構築された菌株からは、ｖｉｏＡＢＣＥ生合成経路（ＢＧＣ）を導入したときに、１．０９ｇ／Ｌのデオキシビオラセインが生産され、ｖｉｏＡＢＣＤＥ ＢＧＣを導入したときに、１．３６ｇ／Ｌのビオラセイン、０．１３ｇ／Ｌのデオキシビオラセインが生産された（図３Ｄ）。ｖｉｏＡＢＥ ＢＧＣを導入したときにはプロデオキシビオラセインが、ｖｉｏＡＢＤＥ ＢＧＣを導入したときにはプロビオラセインが生産されたが、標準物質の不在により定量が不可能であり、ビオラセインのＨＰＬＣ矯正テーブル（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｔａｂｌｅ）に基づいて計算された（図３Ｃ）。
【0165】
フラスコ培養条件は、次の通りである。カロテノイド生産菌株の場合、コロニーを適切な濃度の抗生剤が添加された３ｍＬのＴＢ（ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ；リットルにつき、２０ｇトリプトン、２４ｇ酵母抽出物、４ｍＬグリセロール、０．０１７Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、及び０．０７２Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４）培地に接種し、３０℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１～２になった時に、１ｍＬの培養液を、２０ｍＬのＴＢ培地が入っている２５０ｍＬ丸底フラスコで継代培養し、同様に、ＯＤ６００が１～２になるまで培養を進行した。ビオラセイン類似体の場合、コロニーを、適切な濃度の抗生剤が添加された１０ｍＬ ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。その後、用意したカロテノイド及びビオラセイン類似体培養液を、３ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌグリセロール（ビオラセイン類似体の場合、さらに３ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４）が添加された５０ｍＬのＲ／２培地が入っている２５０ｍＬバッフルフラスコに継代した後、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。Ｒ／２培地（ｐＨ６．８）組成は、次の通りである（リットルにつき）：２ｇ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、６．７５ｇ ＫＨ２ＰＯ４、０．８５ｇクエン酸、０．７ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び５ｍｌ ＴＭＳ（ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）［５Ｍ ＨＣｌのリットルにつき、１０ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２３ｇ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、２ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及び０．１ｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４］。培養液のＯＤ６００が０．６～０．８になった時、１ｍＭイソプロピルβ（ＩＰＴＧ）を添加して外来遺伝子発現を誘導した。誘導後、カロテノイドの場合は３６時間、ビオラセイン類似体の場合は４８時間培養した。
【0166】
培養後、次のような条件で生産量分析を行った。カロテノイドの場合、１ｍＬの培養液を遠心分離機を用いて細胞を集めた後、上澄液を除去し、１ｍＬのアセトンを添加して５５℃、１，５００ｒｐｍで激しく渦動を与えて細胞内部の物質を抽出した。遠心分離機を用いて抽出液中の細胞滓を濾別し、上澄液のカロテノイド抽出液を得ることができた。ビオラセイン類似体の場合、５０μＬ培養液（推測される濃度範囲に応じて適切に、添加する培養液の体積を調節可能；合計体積が１ｍＬになるように添加するＤＭＳＯの量を調節）を９５０μＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と混ぜた後、４０℃、１，５００ｒｐｍで激しく渦動を与えて細胞内外部の物質を抽出した。その後、前記と同様に、遠心分離機を用いて抽出液中の細胞滓を濾別し、上澄液のビオラセイン類似体抽出液を得ることができた。各抽出液の定量分析は、ＨＰＬＣを用いて行った。標準物質のないビオラセイン類似体の場合、ＬＣ－ＭＳを用いて真偽を判別した（図３Ｅ～図３Ｆ）。
【0167】
実施例２．細胞形態エンジニアリングを用いたにじ色素の増産
カロテノイドは長い炭素鎖を有し、ビオラセイン類似体は疎水性の炭素輪を有するので、疎水性の特性を示す。このような特性から、カロテノイド及びビオラセイン類似体は、大腸菌内で生産されたときに、細胞外に出るよりは、細胞中に、特に細胞膜に挟まれた状態で蓄積される。したがって、細胞膜面積を拡張することによって受容限度を上げ、当該物質をより過量で生産しようとした。そのために、細胞膜関連代謝回路を担当する遺伝子の発現を抑制させようとした。標的遺伝子の発現抑制のためには、合成調節ｓＲＮＡ道具（Ｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３，３１（２）：１７０－１７４）を用いた。発現抑制標的としては、細胞分裂と細胞形態維持に関与する１６種の遺伝子を選別した（表４）。発現抑制標的遺伝子は、２つの基準によって選別されたが、第一の基準は、細胞分裂と関連した遺伝子である（ｆｔｓＡＢＩＬＱＷＺ、ｍｉｎＤ、ｚｉｐＡ）。細胞分裂を抑制すれば細胞の長さが変わると予想される（図４Ａ）。第二の基準は、細胞壁合成又は維持と関連した遺伝子である（ｒｏｄＺ、ｍｒｄＡＢ、ｍｒｅＢＣＥ、ｍｕｒＥ）が、細胞壁が大腸菌の棒形の形態を決定するので、細胞壁と関連した遺伝子を発現抑制すれば細胞の形態がより球形且つ不規則的に変わると予想される（図４Ａ）。本実施例では、上の２つの基準に基づき、最も効果が良いと予想される遺伝子標的を選別したが、必ずしも当該発明の範囲がこれに限定されるものではなく、上の２つの基準に該当する他の遺伝子も標的として用いられてよい。
カロテノイドは長い炭素鎖を有し、ビオラセイン類似体は疎水性の炭素輪を有するので、疎水性の特性を示す。このような特性から、カロテノイド及びビオラセイン類似体は、大腸菌内で生産されたときに、細胞外に出るよりは、細胞中に、特に細胞膜に挟まれた状態で蓄積される。したがって、細胞膜面積を拡張することによって受容限度を上げ、当該物質をより過量で生産しようとした。そのために、細胞膜関連代謝回路を担当する遺伝子の発現を抑制させようとした。標的遺伝子の発現抑制のためには、合成調節ｓＲＮＡ道具（Ｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３，３１（２）：１７０－１７４）を用いた。発現抑制標的としては、細胞分裂と細胞形態維持に関与する１６種の遺伝子を選別した（表４）。発現抑制標的遺伝子は、２つの基準によって選別されたが、第一の基準は、細胞分裂と関連した遺伝子である（ｆｔｓＡＢＩＬＱＷＺ、ｍｉｎＤ、ｚｉｐＡ）。細胞分裂を抑制すれば細胞の長さが変わると予想される（図４Ａ）。第二の基準は、細胞壁合成又は維持と関連した遺伝子である（ｒｏｄＺ、ｍｒｄＡＢ、ｍｒｅＢＣＥ、ｍｕｒＥ）が、細胞壁が大腸菌の棒形の形態を決定するので、細胞壁と関連した遺伝子を発現抑制すれば細胞の形態がより球形且つ不規則的に変わると予想される（図４Ａ）。本実施例では、上の２つの基準に基づき、最も効果が良いと予想される遺伝子標的を選別したが、必ずしも当該発明の範囲がこれに限定されるものではなく、上の２つの基準に該当する他の遺伝子も標的として用いられてよい。
【0168】
【表4】
【0169】
大部分の標的遺伝子は必須遺伝子であったが、これは、ｓＲＮＡ技術の活用の必要性をよく示している。当該実験では、代表的にβ生産菌株とデオキシビオラセイン生産菌株を用いてテストし、その結果は図４Ｂ及び図４Ｃに示した。
【0170】
図４及び図５から確認できるように、β生産菌株では、細胞膜関連遺伝子を発現抑制した時に、細胞形態の変化は観察されたが、生産量は却って減少した。これに対し、デオキシビオラセイン生産菌株では、ｍｒｄＢ遺伝子を発現抑制させた時に、生産量が大きく増加し、１．３７ｇ／Ｌに達した（２５％増産）。ｍｒｄＢを発現抑制させた場合に、予想通りに細胞の長さが短くなり、より球形の形態を示し、細胞膜面積が却って減少することが分かる。
【0171】
実施例３．細胞内膜小胞体形成を用いたにじ色素の増産
にじ色素の生産量をより増加させるために、本研究陣は、真核細胞システムに存在する細胞内膜小胞体を導入しようとした。これにより、細胞自体の体積はそのままにしながら同時に細胞内部の膜面積を広めることによって、膜に蓄積される物質の生産量も増加させようとした（図４Ｄ）。導入した細胞内膜小胞体遺伝子は、真核生物の細胞内膜小胞体システムのうち特にカベオラを借用したが、カベオラは、ゴルジ体又は小胞体のシワの寄った形態を担当している。まず、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドにｃａｖ１、ｃａｖ２、ｃａｖ３遺伝子を導入した後、それぞれβとデオキシビオラセイン生産菌株に導入してフラスコ培養を行った。本実施例では、真核生物のカベオラシステムを借用したが、細胞内膜を形成する他の真核又は原核生物由来システム（真核生物のクラスリン－エプシンシステム、原核生物のｍｇｓ－ｄｇｓシステムなど）も、本発明と同じ範囲に該当する。
にじ色素の生産量をより増加させるために、本研究陣は、真核細胞システムに存在する細胞内膜小胞体を導入しようとした。これにより、細胞自体の体積はそのままにしながら同時に細胞内部の膜面積を広めることによって、膜に蓄積される物質の生産量も増加させようとした（図４Ｄ）。導入した細胞内膜小胞体遺伝子は、真核生物の細胞内膜小胞体システムのうち特にカベオラを借用したが、カベオラは、ゴルジ体又は小胞体のシワの寄った形態を担当している。まず、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミドにｃａｖ１、ｃａｖ２、ｃａｖ３遺伝子を導入した後、それぞれβとデオキシビオラセイン生産菌株に導入してフラスコ培養を行った。本実施例では、真核生物のカベオラシステムを借用したが、細胞内膜を形成する他の真核又は原核生物由来システム（真核生物のクラスリン－エプシンシステム、原核生物のｍｇｓ－ｄｇｓシステムなど）も、本発明と同じ範囲に該当する。
【0172】
各ｃａｖ１［配列番号３６］、ｃａｖ２［配列番号３７］及びｃａｖ３［配列番号３８］遺伝子は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来遺伝子配列を大腸菌コドン最適化後に用いた。ｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ１プラスミド構築のために、ｃａｖ１遺伝子は、ｐＴｒｃ９９ＡプラスミドのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩサイトに挿入された。ｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ２及びｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ３の構築のために、ｃａｖ２及びｃａｖ３遺伝子はそれぞれ、ｐＴｒｃ９９ＡプラスミドのＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩサイトに挿入された。ｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ１２プラスミド（ｃａｖ１，ｃａｖ２の両方を保有）の構築のために、ｃａｖ２遺伝子を［配列番号３３］及び［配列番号３４］プライマーを用いて増幅後に、ｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ１プラスミドのＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩサイトに挿入した。ｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ２３及びｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ１３の構築のために、ｃａｖ３遺伝子を［配列番号３５］及び［配列番号３４］プライマーを用いて増幅後に、それぞれｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ２及びｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ１プラスミドのＰｓｔＩサイトに挿入した。ｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ１２３プラスミドの構築のために、前記増幅されたｃａｖ３遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ１２プラスミドのＰｓｔＩサイトに挿入した。
【0173】
【表5】
【0174】
細胞内膜構造体を形成することから不足になり得る細胞膜脂質をさらに供給するために、大腸菌のｐｌｓＢＣ遺伝子を増幅したが、そのために、まず、ｐＴｒｃ９９Ａ－ｐｌｓＢＣプラスミドを構築した。したがって、ｐｌｓＢ及びｐｌｓＣ遺伝子を大腸菌のゲノムＤＮＡから、［配列番号３９］及び［配列番号４０］プライマーと、［配列番号４１］及び［配列番号４２］プライマー対をそれぞれ用いて増幅後に、ｐＴｒｃ９９ＡプラスミドのＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイトにギブソンアセンブリーを用いて挿入した。その後、構築されたプラスミドをＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素を用いて切った後、ｐｌｓＢＣ遺伝子片を分離してｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ１プラスミドのＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ１－ｐｌｓＢＣプラスミドを構築した。
【0175】
【表6】
【0176】
その結果、βとデオキシビオラセイン生産菌株の両方ともｃａｖ１遺伝子を発現した場合に、生産量がそれぞれ２１．８９ｍｇ／Ｌ及び１．２８ｇ／Ｌと最も大きく増加した。特に、デオキシビオラセイン生産菌株の場合、ｃａｖ１、ｃａｖ２、ｃａｖ３を組合せで２個又は３個ずつ発現させた時には却って生産量が急に減少していることが分かる（図４Ｅ及び図４Ｆ）。ＴＥＭ（各図の上段）及びＳＥＭ（各図の下段）から、対照群（図４Ｇ及び図４Ｉ）及びｃａｖ１過発現菌株（図４Ｈ及び図４Ｊ）で内膜小胞体の形成が誘導されたかどうか確認した結果、ｃａｖ１過発現菌株において、細胞の形態には対照群と大差を示さないながらも内膜小包体が成功的に形成されることを確認した。
【0177】
実施例４．細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加を用いたにじ色素の増産
にじ色素の生産量をより増加させるために、本研究陣は、微生物本然の細胞外膜小胞体形成遺伝子の発現を増加させることにより、小胞体を通じて、細胞内に蓄積されるにじ色素を外に噴出させようとした（図６Ａ）。細胞外膜小胞体の発現のためには、特定遺伝子を発現させるのではなく、細胞のペプチドグリカン層又は細胞外膜と内膜の連結を維持させる役割を担う遺伝子の発現を抑制させることが重要であると報告されている。そこで、本研究陣は、同様にｓＲＮＡベース標的遺伝子発現抑制システムを用いて、合計２６種の標的遺伝子の発現強度を抑制させようとした。選別された２６種の発現抑制遺伝子標的は、次の通りである：ｒｓｅＡ、ｒｓｅＢ、ｒｆｆＤ、ｒｆｆＣ、ｒｆｆＡ、ｏｍｐＲ、ｇｍｈＢ、ｌｐｘＬ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＣ、ｒｆａＢ、ｒｆａＣ、ｒｆａＤ、ｒｆａＥ、ｒｆａＧ、ｒｆａＩ、ｒｆａＪ、ｒｆａＫ、ｒｆａＰ、ｒｆａＱ、ｒｆａＹ、ｒｆｂＡ、ｒｆｆＨ、ｗｚｘＥ、ｐｎｐ（表７）。このとき、（１）細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持関連遺伝子ターゲットはｒｆａＧ、ｒｆｆＡ、ｒｆｆＣ、ｒｆｆＤ、ｒｆｆＨなどであり、（２）細胞外膜タンパク質発現に該当する遺伝子ターゲットはｏｍｐＲ、ｏｍｐＣなどであり、（３）細胞膜代謝回路の抗シグマ因子（ａｎｔｉ－ｓｉｇｍａ ｆａｃｔｏｒ）発現に関係する遺伝子ターゲットはｒｓｅＡ、ｒｓｅＢなどである。本実施例では、上の３つの基準に基づき、最も効果が良いと予想される遺伝子標的を選別したが、必ずしも当該発明の範囲がこれに限定されるものではなく、上の３つの基準に該当する他の遺伝子も標的として用いられてよい。当該遺伝子標的を発現抑制させた時のβとデオキシビオラセイン生産量は、図６Ｂ及び図６Ｃの通りである。βの場合、ｒｆａＤ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＱをそれぞれ発現抑制した時に、生産量がそれぞれ２６．４３、２４．２１、２０．２９ｍｇ／Ｌと有効に増加した。デオキシビオラセインの場合、特にｒｆａＩとｒｆａＱを発現抑制させた場合に生産量が大きく増加したが、ｒｆａＩを発現抑制させた菌株では１．７４ｇ／Ｌが生産された。
にじ色素の生産量をより増加させるために、本研究陣は、微生物本然の細胞外膜小胞体形成遺伝子の発現を増加させることにより、小胞体を通じて、細胞内に蓄積されるにじ色素を外に噴出させようとした（図６Ａ）。細胞外膜小胞体の発現のためには、特定遺伝子を発現させるのではなく、細胞のペプチドグリカン層又は細胞外膜と内膜の連結を維持させる役割を担う遺伝子の発現を抑制させることが重要であると報告されている。そこで、本研究陣は、同様にｓＲＮＡベース標的遺伝子発現抑制システムを用いて、合計２６種の標的遺伝子の発現強度を抑制させようとした。選別された２６種の発現抑制遺伝子標的は、次の通りである：ｒｓｅＡ、ｒｓｅＢ、ｒｆｆＤ、ｒｆｆＣ、ｒｆｆＡ、ｏｍｐＲ、ｇｍｈＢ、ｌｐｘＬ、ｏｍｐＡ、ｏｍｐＣ、ｒｆａＢ、ｒｆａＣ、ｒｆａＤ、ｒｆａＥ、ｒｆａＧ、ｒｆａＩ、ｒｆａＪ、ｒｆａＫ、ｒｆａＰ、ｒｆａＱ、ｒｆａＹ、ｒｆｂＡ、ｒｆｆＨ、ｗｚｘＥ、ｐｎｐ（表７）。このとき、（１）細胞外膜／ペプチドグリカン構造維持関連遺伝子ターゲットはｒｆａＧ、ｒｆｆＡ、ｒｆｆＣ、ｒｆｆＤ、ｒｆｆＨなどであり、（２）細胞外膜タンパク質発現に該当する遺伝子ターゲットはｏｍｐＲ、ｏｍｐＣなどであり、（３）細胞膜代謝回路の抗シグマ因子（ａｎｔｉ－ｓｉｇｍａ ｆａｃｔｏｒ）発現に関係する遺伝子ターゲットはｒｓｅＡ、ｒｓｅＢなどである。本実施例では、上の３つの基準に基づき、最も効果が良いと予想される遺伝子標的を選別したが、必ずしも当該発明の範囲がこれに限定されるものではなく、上の３つの基準に該当する他の遺伝子も標的として用いられてよい。当該遺伝子標的を発現抑制させた時のβとデオキシビオラセイン生産量は、図６Ｂ及び図６Ｃの通りである。βの場合、ｒｆａＤ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＱをそれぞれ発現抑制した時に、生産量がそれぞれ２６．４３、２４．２１、２０．２９ｍｇ／Ｌと有効に増加した。デオキシビオラセインの場合、特にｒｆａＩとｒｆａＱを発現抑制させた場合に生産量が大きく増加したが、ｒｆａＩを発現抑制させた菌株では１．７４ｇ／Ｌが生産された。
【0178】
ｒｆｆＤ及びｒｆａＤ発現抑制ｓＲＮＡが導入されたＢＴＣ１菌株及びｒｆａＩ発現抑制ｓＲＮＡが導入されたＤＶＩＯ菌株を、ＳＥＭ及びＴＥＭから観察した結果、細胞外膜小胞体の形成及び分泌が顕著に増加していることを確認した（図６Ｄ～図６Ｆ）。特に、ｒｆａＩ発現抑制ｓＲＮＡが導入されたＤＶＩＯ菌株を培養したとき、フラスコ壁面に細胞外膜小胞体、デオキシビオラセイン及び細胞滓などが固まっていることを発見したが、これを顕微鏡で観察した写真は、図７Ｅの通りである。
【0179】
【表7】
【0180】
実施例５．細胞形態変形と小胞体形成のシナジー効果確認
現在まで得られた結果に基づき、各カテゴリー別に最も効果が良かった遺伝子操作標的の組合せによりシナジー効果をテストしようとした。
現在まで得られた結果に基づき、各カテゴリー別に最も効果が良かった遺伝子操作標的の組合せによりシナジー効果をテストしようとした。
【0181】
同時多重標的遺伝子ノックダウンのためのｓＲＮＡプラスミドクローニングは、次の通りに行われた。一番目のｓＲＮＡ片は、［配列番号４３］及び［配列番号４４］プライマーを用いてＰＣＲ増幅され、二番目のｓＲＮＡ片を含んでいるプラスミドは、［配列番号４５］及び［配列番号４６］プライマーを用いて逆ＰＣＲにより線形化された。このように生成された２のｓＲＮＡ含有片を、ギブソンアセンブリーを用いて合わせ、二重ノックダウンのためのｓＲＮＡプラスミドを完成した。ｓＲＮＡを含んでいるプラスミドに大腸菌ｐｌｓＢＣを挿入するために、ｐＴｒｃ９９Ａ－ｐｌｓＢＣプラスミドをテンプレートとし、［配列番号４７］及び［配列番号４８］プライマーを用いてｐｌｓＢＣ遺伝子をＰＣＲ増幅し、これをｓＲＮＡ含むプラスミドのＳｐｈＩサイトに挿入した。ｓＲＮＡを含んでいるプラスミドにｃａｖ１遺伝子を挿入するために、ｐＴｒｃ９９Ａ－ｃａｖ１プラスミドをテンプレートとし、［配列番号４７］及び［配列番号４９］プライマーを用いて、ｓＲＮＡを含んでいるプラスミドのＳｐｈＩサイトに挿入した。
【0182】
【表8】
【0183】
まず、β生産菌株の場合、実施例２の細胞膜代謝回路関連遺伝子を発現抑制した時には生産量増加が確認されなかったので、実施例３の細胞内膜小胞体発現遺伝子（ｃａｖ１）過発現と、実施例４の細胞外膜小胞体発現標的遺伝子（ｒｆａＤ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＤ）の発現抑制とを組み合わせて適用した。まず、細胞外膜小胞体発現標的遺伝子３個をそれぞれ異なるように組み合わせて発現抑制したが、ｒｆａＤとｒｆｆＤを同時に発現抑制した時に、β生産量が３４．２ｍｇ／Ｌと大きく増加した（図６Ｂ）。当該菌株にさらに細胞内膜小胞体形成のためにｃａｖ１遺伝子を過発現させたが、生産量がむしろ減少した（図６Ｇ）。
【0184】
デオキシビオラセイン生産菌株では、実施例２の細胞膜代謝回路標的遺伝子（ｍｒｄＢ）、実施例３の細胞内膜小胞体発現遺伝子（ｃａｖ１）、そして実施例４の細胞外膜小胞体発現標的遺伝子（ｒｆａＩ）を２個ずつ或いは３個ずつ組み合わせて発現させ、デオキシビオラセイン生産量をテストした。その結果、ｒｆａＩ発現抑制ｃａｖ１過発現菌株において１．９ｇ／Ｌデオキシビオラセイン生産量を示し、最も多く増産した結果を示した（図６Ｈ）。
【0185】
ｒｆｆＤ及びｒｆａＤ発現抑制ｓＲＮＡ及びｃａｖ１－ｐｌｓＢＣが導入されたＢＴＣ１菌株と、ｒｆａＩ発現抑制ｓＲＮＡ及びｃａｖ１が導入されたＤＶＩＯ菌株を、ＳＥＭとＴＥＭで観察した結果、細胞外膜小胞体の形成及び分泌の増加と内膜小胞体形成の増加が同時に発現することを確認した（図６Ｉ及び図６Ｊ）。
【0186】
実施例６．他のにじ色素生産に対する細胞膜拡張戦略の適用
先の実施例で適用した戦略を、他の疎水性色素にも適用し、本発明の汎用性を示そうとした。そこで、カロテノイド代表化合物であるβ－カロテンとビオラセイン類似体代表化合物であるデオキシビオラセインの増産に最も効果的であった細胞膜エンジニアリング戦略を、それぞれのカテゴリーの残りのじ色素に適用した。β－カロテンを増産する上で、ｃａｖ１及びｐｌｓＢＣ遺伝子の同時過発現を用いた細胞内膜小胞体形成と、ｒｆｆＤ及びｒｆａＤ遺伝子の発現抑制を用いた細胞外膜小胞体形成がそれぞれ効果的であったので、それらの戦略を、ゼアキサンチン及びアスタキサンチン生産菌株であるＺＥＡ２０及びＡＴＸ６８に適用し、テストした。その結果、細胞内膜小胞体形成は、ゼアキサンチン生産をむしろ減少させ、アスタキサンチン生産は少量増加させた。一方、細胞外膜小胞体形成は、ゼアキサンチン及びアスタキサンチン生産を全て増加させた（それぞれ、１８．３８ｍｇ／Ｌ；図７Ｈ、２２．６９ｍｇ／Ｌ；図７Ｉ）。ビオラセイン類似体の場合、細胞内膜小胞体と外膜小胞体の同時発現が最も高いデオキシビオラセイン生産量につながったので、細胞内膜小胞体と外膜小胞体を個別に又は同時に発現させることによってその効果を調べようとした。そのために、（１）細胞外膜小胞体の過発現のためのｒｆａＩノックダウン、（２）細胞内膜小胞体の過発現のためのｃａｖ１の過発現及び、（３）ｒｆａＩノックダウン及びｃａｖ１過発現、の３つの戦略をテストした。プロビオラセインとビオラセインの場合、細胞内膜小胞体と外膜小胞体を同時発現させた時に、最も高い生産量を得ることができた（それぞれ、４０２ｍｇ／Ｌ；図７Ｋ、２．８４ｇ／Ｌ；図７Ｌ）。これに対し、プロデオキシビオラセインの場合には、細胞外膜小胞体のみ発現させた時に最も高い生産量を得ることができた（３４１ｍｇ／Ｌ；図７Ｊ）。このとき、プロビオラセインとプロデオキシビオラセインの場合は、商業的に販売されている試薬が得られず、ＨＰＬＣと連結されたフラクションコレクター（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）を用いて当該物質を精製後に定量した。
先の実施例で適用した戦略を、他の疎水性色素にも適用し、本発明の汎用性を示そうとした。そこで、カロテノイド代表化合物であるβ－カロテンとビオラセイン類似体代表化合物であるデオキシビオラセインの増産に最も効果的であった細胞膜エンジニアリング戦略を、それぞれのカテゴリーの残りのじ色素に適用した。β－カロテンを増産する上で、ｃａｖ１及びｐｌｓＢＣ遺伝子の同時過発現を用いた細胞内膜小胞体形成と、ｒｆｆＤ及びｒｆａＤ遺伝子の発現抑制を用いた細胞外膜小胞体形成がそれぞれ効果的であったので、それらの戦略を、ゼアキサンチン及びアスタキサンチン生産菌株であるＺＥＡ２０及びＡＴＸ６８に適用し、テストした。その結果、細胞内膜小胞体形成は、ゼアキサンチン生産をむしろ減少させ、アスタキサンチン生産は少量増加させた。一方、細胞外膜小胞体形成は、ゼアキサンチン及びアスタキサンチン生産を全て増加させた（それぞれ、１８．３８ｍｇ／Ｌ；図７Ｈ、２２．６９ｍｇ／Ｌ；図７Ｉ）。ビオラセイン類似体の場合、細胞内膜小胞体と外膜小胞体の同時発現が最も高いデオキシビオラセイン生産量につながったので、細胞内膜小胞体と外膜小胞体を個別に又は同時に発現させることによってその効果を調べようとした。そのために、（１）細胞外膜小胞体の過発現のためのｒｆａＩノックダウン、（２）細胞内膜小胞体の過発現のためのｃａｖ１の過発現及び、（３）ｒｆａＩノックダウン及びｃａｖ１過発現、の３つの戦略をテストした。プロビオラセインとビオラセインの場合、細胞内膜小胞体と外膜小胞体を同時発現させた時に、最も高い生産量を得ることができた（それぞれ、４０２ｍｇ／Ｌ；図７Ｋ、２．８４ｇ／Ｌ；図７Ｌ）。これに対し、プロデオキシビオラセインの場合には、細胞外膜小胞体のみ発現させた時に最も高い生産量を得ることができた（３４１ｍｇ／Ｌ；図７Ｊ）。このとき、プロビオラセインとプロデオキシビオラセインの場合は、商業的に販売されている試薬が得られず、ＨＰＬＣと連結されたフラクションコレクター（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）を用いて当該物質を精製後に定量した。
【0187】
実施例７．にじ色素高効率生産のための流加式発酵工程開発
先の実施例で構築された組換え大腸菌菌株を用いて、６．６Ｌ発酵器で流加式発酵を行おうとした。流加式発酵は、次のような条件で行われた。カロテノイド生産菌株の場合、３０ｇ／Ｌブドウ糖又はグリセロール、３ｇ／Ｌ酵母抽出物及び抗生剤が含まれた１．６Ｌ Ｒ／２培地（ｐＨ６．９５）を添加した６．６Ｌ発酵器（ＢｉｏＦｌｏ ３２０，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で培養された。ビオラセイン誘導体生産菌株の場合、２０ｇ／Ｌブドウ糖又はグリセロール、３ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４及び抗生剤が含まれた１．９５Ｌ Ｒ／２培地（ｐＨ６．８）を添加した６．６Ｌ発酵器（ＢｉｏＦｌｏ ３２０，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で培養された。カロテノイド生産菌株の場合、コロニーを、適切な濃度の抗生剤が添加された３ｍＬのＴＢ培地に接種し、３０℃で培養した。ビオラセイン類似体の場合、コロニーを、適切な濃度の抗生剤が添加された１０ｍＬ ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。その後、用意したカロテノイド及びビオラセイン類似体培養液を、３ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌグリセロール又はブドウ糖（ビオラセイン類似体の場合、さらに３ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４）が添加された５０ｍＬのＲ／２培地が入っている２５０ｍＬバッフルフラスコに継代した後、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００が３～４になるまで培養を進行した後、発酵器に接種した。ｐＨは２８％（ｖ／ｖ）アンモニア水溶液を用いて６．８に維持し、温度は、３０℃を維持した。溶存酸素度（ＤＯ）値は、２Ｌ／ｍｉｎの空気、自動で１，０００ｒ．ｐ．ｍ．まで調節可能な撹拌速度、そして増加する酸素流量によって４０％に維持された。栄養供給は、ｐＨ－ｓｔａｔ戦略で進行されたが、ｐＨ値が、カロテノイドの場合に７、ビオラセイン誘導体の場合に６．８５を超えた時に自動でフィードが流入するように設定された。カロテノイド生産のためのフィード溶液は、１Ｌにつき次の成分を有する：８００ｇグルコース又は８１７ｇグリセロール、６ｍＬ ＴＭＳ及び１２ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。ビオラセイン誘導体生産のためのフィード溶液は、１Ｌにつき次の成分を有する：６５０ｇグルコース又は８００ｇグリセロール、６ｍＬ ＴＭＳ、８５ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４及び８ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。接種後ＯＤ６００値が２０～３０に達した時に、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて外来タンパク質の発現が誘導された。
先の実施例で構築された組換え大腸菌菌株を用いて、６．６Ｌ発酵器で流加式発酵を行おうとした。流加式発酵は、次のような条件で行われた。カロテノイド生産菌株の場合、３０ｇ／Ｌブドウ糖又はグリセロール、３ｇ／Ｌ酵母抽出物及び抗生剤が含まれた１．６Ｌ Ｒ／２培地（ｐＨ６．９５）を添加した６．６Ｌ発酵器（ＢｉｏＦｌｏ ３２０，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で培養された。ビオラセイン誘導体生産菌株の場合、２０ｇ／Ｌブドウ糖又はグリセロール、３ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４及び抗生剤が含まれた１．９５Ｌ Ｒ／２培地（ｐＨ６．８）を添加した６．６Ｌ発酵器（ＢｉｏＦｌｏ ３２０，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で培養された。カロテノイド生産菌株の場合、コロニーを、適切な濃度の抗生剤が添加された３ｍＬのＴＢ培地に接種し、３０℃で培養した。ビオラセイン類似体の場合、コロニーを、適切な濃度の抗生剤が添加された１０ｍＬ ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。その後、用意したカロテノイド及びビオラセイン類似体培養液を、３ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌグリセロール又はブドウ糖（ビオラセイン類似体の場合、さらに３ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４）が添加された５０ｍＬのＲ／２培地が入っている２５０ｍＬバッフルフラスコに継代した後、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。ＯＤ６００が３～４になるまで培養を進行した後、発酵器に接種した。ｐＨは２８％（ｖ／ｖ）アンモニア水溶液を用いて６．８に維持し、温度は、３０℃を維持した。溶存酸素度（ＤＯ）値は、２Ｌ／ｍｉｎの空気、自動で１，０００ｒ．ｐ．ｍ．まで調節可能な撹拌速度、そして増加する酸素流量によって４０％に維持された。栄養供給は、ｐＨ－ｓｔａｔ戦略で進行されたが、ｐＨ値が、カロテノイドの場合に７、ビオラセイン誘導体の場合に６．８５を超えた時に自動でフィードが流入するように設定された。カロテノイド生産のためのフィード溶液は、１Ｌにつき次の成分を有する：８００ｇグルコース又は８１７ｇグリセロール、６ｍＬ ＴＭＳ及び１２ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。ビオラセイン誘導体生産のためのフィード溶液は、１Ｌにつき次の成分を有する：６５０ｇグルコース又は８００ｇグリセロール、６ｍＬ ＴＭＳ、８５ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４及び８ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。接種後ＯＤ６００値が２０～３０に達した時に、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて外来タンパク質の発現が誘導された。
【0188】
各色素に関して最も優れた生産能を示した組換え大腸菌を流加式培養して得た各色素の濃度は、次の通りである：
ｉ）アスタキサンチン生産組換え微生物ＡＴＸ６８（ｐＷＡＳ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＤ発現抑制）：３２２ｍｇ／Ｌ（図８Ａ）；
ｉｉ）β－カロテン生産組換え微生物ＢＴＣ１（ｐＷＡＳ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＤ発現抑制）：３４３ｍｇ／Ｌ（図８Ｂ）；
ｉｉｉ）ゼアキサンチン生産組換え微生物ＺＥＡ２０（ｐＷＡＳ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＤ発現抑制）：２１８ｍｇ／Ｌ（図８Ｃ）；
ｉｖ）プロビオラセイン生産組換え微生物ＰＶＩＯ（ｐＷＡＳ、ｒｆａＩ発現抑制及びｃａｖ１過発現）：１．３ｇ／Ｌ（図８Ｄ）；
ｖ）プロデオキシビオラセイン生産組換え微生物ＰＤＶＩＯ（ｐＷＡＳ、ｒｆａＩ発現抑制）：０．８５５ｇ／Ｌ（図８Ｅ）；
ｖｉ）ビオラセイン生産組換え微生物ＶＩＯ（ｐＷＡＳ、ｒｆａＩ発現抑制及びｃａｖ１過発現）：６．６９ｇ／Ｌのビオラセイン生産（１．３９ｇ／Ｌのデオキシビオラセインも共に生産）（図８Ｆ）；
ｖｉｉ）デオキシビオラセイン生産組換え微生物ＤＶＩＯ（ｐＷＡＳ、ｒｆａＩ発現抑制及びｃａｖ１過発現）：１１．３ｇ／Ｌ（図８Ｇ）。
ｉ）アスタキサンチン生産組換え微生物ＡＴＸ６８（ｐＷＡＳ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＤ発現抑制）：３２２ｍｇ／Ｌ（図８Ａ）；
ｉｉ）β－カロテン生産組換え微生物ＢＴＣ１（ｐＷＡＳ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＤ発現抑制）：３４３ｍｇ／Ｌ（図８Ｂ）；
ｉｉｉ）ゼアキサンチン生産組換え微生物ＺＥＡ２０（ｐＷＡＳ、ｒｆｆＤ、ｒｆａＤ発現抑制）：２１８ｍｇ／Ｌ（図８Ｃ）；
ｉｖ）プロビオラセイン生産組換え微生物ＰＶＩＯ（ｐＷＡＳ、ｒｆａＩ発現抑制及びｃａｖ１過発現）：１．３ｇ／Ｌ（図８Ｄ）；
ｖ）プロデオキシビオラセイン生産組換え微生物ＰＤＶＩＯ（ｐＷＡＳ、ｒｆａＩ発現抑制）：０．８５５ｇ／Ｌ（図８Ｅ）；
ｖｉ）ビオラセイン生産組換え微生物ＶＩＯ（ｐＷＡＳ、ｒｆａＩ発現抑制及びｃａｖ１過発現）：６．６９ｇ／Ｌのビオラセイン生産（１．３９ｇ／Ｌのデオキシビオラセインも共に生産）（図８Ｆ）；
ｖｉｉ）デオキシビオラセイン生産組換え微生物ＤＶＩＯ（ｐＷＡＳ、ｒｆａＩ発現抑制及びｃａｖ１過発現）：１１．３ｇ／Ｌ（図８Ｇ）。
【0189】
このように、本発明で開発した大腸菌菌株を用いて７種の疎水性色素をいずれも高濃度で生産できたという点は、本発明が疎水性物質の高効率生産全般に効果的であることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【0190】
本発明の細胞膜エンジニアリング方法は、大きく、３つの要素で構成されるが、その第一は、細胞分裂関連遺伝子の発現抑制によって細胞の形態を変形させることであり、その第二は、細胞内膜小胞体を発現させる遺伝子を導入又は過発現して細胞内膜構造を拡張させることであり、その第三は、細胞外膜小胞体を発現させるために、細胞膜代謝と関連した標的遺伝子の発現抑制によって細胞外膜小胞体を過生産することである。
【0191】
これら３つの方法は、単独で使用する場合又は組み合わせる場合にシナジー効果を示し、疎水性不溶性物質を高効率で生産するのに有用である。本発明に係る疎水性物質生産能に優れた組換え微生物のスクリーニング方法によって開発されたカロテノイド又はビオラセイン類似体の高効率生産用組換え微生物は、天然色素作製微生物として有用である。また、本発明で開発した天然色素生産技術は、画期的な生産能の増加を遂げた。したがって、本発明は、産業的、医学的に有用な様々な代謝産物の効率的生産のための組換え菌株の作製及び効率的製造方法の確立に用いることができ、有用である。
【0192】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、上記の具体的記述は単に好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【図4J】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図6J】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図7H】
【図7I】
【図7J】
【図7K】
【図7L】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【配列表】
【外国語明細書】