特開 2022-74791 生体微粒子収集装置及び生体微粒子収集方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022074791

(43)【公開日】2022-05-18

(54)【発明の名称】生体微粒子収集装置及び生体微粒子収集方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20220511BHJP

【ＦＩ】

G01N33/48 S

【審査請求】未請求

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020185145

(22)【出願日】2020-11-05

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(71)【出願人】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100211052

【弁理士】

【氏名又は名称】奥村 大輔

(72)【発明者】

【氏名】小椋 俊彦

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 徹二

(72)【発明者】

【氏名】岡田 知子

(72)【発明者】

【氏名】湯川 博

(72)【発明者】

【氏名】京谷 隆

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045BA20

2G045BB03

2G045DA80

2G045FA34

2G045JA07

(57)【要約】

【課題】試料溶液に戻すことが可能な態様で生体微粒子を収集する。
【解決手段】一態様に係る生体微粒子収集装置は、生体微粒子を含む試料溶液が供給される支持面を提供する第１の試料台であり、支持面に開口する第１の凹部が形成された、該第１の試料台と、第１の試料台に対して試料溶液中の生体微粒子の帯電極性と同極性又は逆極性の直流電圧を選択的に印加する電源部と、を備える。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体微粒子を含む試料溶液が供給される支持面を提供する第１の試料台であり、前記支持面に開口する第１の凹部が形成された、該第１の試料台と、
前記第１の試料台に対して前記試料溶液中の前記生体微粒子の帯電極性と同極性又は逆極性の直流電圧を選択的に印加する電源部と、
を備える、生体微粒子収集装置。

【請求項2】

前記第１の試料台に対して電気的に絶縁され、且つ、前記第１の試料台と共に前記支持面を提供する第２の試料台であり、前記支持面に開口する第２の凹部が形成された、該第２の試料台を更に備え、
前記支持面に開口する前記第２の凹部の開口幅は、前記支持面に開口する前記第１の凹部の開口幅よりも大きい、請求項１に記載の生体微粒子収集装置。

【請求項3】

前記電源部は、前記第１の試料台及び前記第２の試料台に対して印加される前記直流電圧の極性を個別に切り替え可能である、請求項２に記載の生体微粒子収集装置。

【請求項4】

前記試料溶液を前記支持面上に供給する供給口と、
前記支持面と共に前記試料溶液が流れる流路を画成する壁部と、
前記流路から前記試料溶液を回収する回収口と、
を更に備える、請求項１～３の何れか一項に記載の生体微粒子収集装置。

【請求項5】

前記第１の試料台と共に前記支持面を提供する第３の試料台であり、前記支持面に開口する第３の凹部が形成された、該第３の試料台を更に備え、
前記第１の凹部を画成する壁面が親水性を有し、前記第３の凹部を画成する壁面が疎水性を有する、請求項１～４の何れか一項に記載の生体微粒子収集装置。

【請求項6】

前記第１の試料台が、陽極酸化アルミナによって構成された基部と、該基部の表面を被覆する導電性の被膜とを有する、請求項１～５の何れか一項に記載の生体微粒子収集装置。

【請求項7】

前記被膜が、カーボン膜、有機導電性薄膜又は金属薄膜である、請求項６に記載の生体微粒子収集装置。

【請求項8】

前記金属薄膜が、金、タングステン又はオスミウムによって構成されている、請求項７に記載の生体微粒子収集装置。

【請求項9】

支持面を提供し、且つ、前記支持面に開口する第１の凹部が形成された第１の試料台を備える生体微粒子収集装置を用いて生体微粒子を収集する生体微粒子収集方法であって、
前記支持面上に前記生体微粒子を含む試料溶液を供給する工程と、
前記生体微粒子の帯電極性と逆極性の直流電圧を前記第１の試料台に印加する工程と、
を含む、生体微粒子収集方法。

【請求項10】

前記生体微粒子収集装置は、前記第１の試料台と共に前記支持面を提供し、前記第１の試料台に対して電気的に絶縁され、且つ、前記支持面に開口する第２の凹部が形成された第２の試料台を更に備え、
前記第１の試料台に対する前記直流電圧の印加を停止した後に、前記生体微粒子の帯電極性と逆極性の直流電圧を前記第２の試料台に印加する工程を更に含む、請求項９に記載の生体微粒子収集方法。

【請求項11】

前記第１の試料台及び前記第２の試料台に対して前記生体微粒子の帯電極性と同極性の直流電圧を印加する工程を更に含む、請求項１０に記載の生体微粒子収集方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、生体微粒子収集装置及び生体微粒子収集方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生体から採取された血液、尿及び便等の試料溶液には、エクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスといった生体微粒子が含まれている。例えば、エクソソームは、５０ｎｍ～２００ｎｍの径を有する微粒子であり、脂質二重膜、膜蛋白質、ＲＮＡ等から構成されている。エクソソームの表面は、負電荷を帯びている。このエクソソームを分析することによって疾病の発見や予防等が可能であると考えられている。試料溶液中の生体微粒子を直接分析することは困難であるため、生体微粒子を分析するためには、試料溶液から生体微粒子を分離して収集することが必要となる。

【0003】

このような生体微粒子の収集方法として、下記非特許文献１及び特許文献１に記載の方法が知られている。非特許文献１には、試料溶液を遠心分離機にかけることによって、試料溶液に含まれるエクソソームをサイズ毎に分離する方法が開示されている。特許文献１には、基板に形成された異なるサイズの凹部内に抗体を固定し、当該抗体にエクソソームの抗体を結合させることによって、エクソソームをサイズ毎に分離して収集する方法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１５－１２７６９０号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ankit Rana, Yuqian Zhang and Leyla Esfandiari, "Advancements inmicrofluidic technologies for isolation and early detection of circulatingcancer-related biomarkers", Analyst, Vol. 143, No. 13, p.2971-2991, 2018

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

非特許文献１に記載の方法では、エクソソームを分離する過程でエクソソームに強い遠心力が作用するので、エクソソームが破損することがある。一方、特許文献１に記載の方法では、一旦抗体に結合されたエクソソームを分離することができないので、分析済みのエクソソームを試料溶液に戻すことが困難となる。

【0007】

したがって、試料溶液に戻すことが可能な態様で生体微粒子を収集することが求められている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

一態様に係る生体微粒子収集装置は、生体微粒子を含む試料溶液が供給される支持面を提供する第１の試料台であり、支持面に開口する第１の凹部が形成された、該第１の試料台と、第１の試料台に対して試料溶液中の生体微粒子の帯電極性と同極性又は逆極性の直流電圧を選択的に印加する電源部と、を備える。

【0009】

一般的に、生体微粒子は試料溶液中に帯電した状態で存在している。このため、生体微粒子の帯電極性と逆極性の電圧を第１の試料台に印加すると、第１の試料台と生体微粒子との間に引力が働き、第１の試料台の第１の凹部内に試料溶液中の生体微粒子が収集される。このとき、第１の凹部内に収集される生体微粒子のサイズは第１の凹部の開口幅に制限されるので、第１の凹部の開口幅に応じたサイズの生体微粒子を選択的に収集することができる。一方、第１の試料台に対して生体微粒子と同極性の電圧が印加されると、第１の試料台と生体微粒子との間に斥力が働き、第１の凹部内に収集された生体微粒子を試料液体中が戻される。したがって、上記態様に係る装置では、溶液中に戻すことが可能な態様で生体微粒子を収集することができる。

【0010】

一実施形態では、第１の試料台に対して電気的に絶縁され、且つ、第１の試料台と共に支持面を提供する第２の試料台であり、支持面に開口する第２の凹部が形成された、該第２の試料台を更に備え、支持面に開口する第２の凹部の開口幅は、支持面に開口する第１の凹部の開口幅よりも大きくてもよい。なお、電源部は、第１の試料台及び第２の試料台に対して印加される直流電圧の極性を個別に切り替え可能であってもよい。

【0011】

この実施形態では、第２の凹部の開口幅が第１の凹部の開口幅よりも大きいので、例えば第１の試料台及び第２の試料台に生体微粒子の帯電極性と逆極性の直流電圧を印加したときに、第１の凹部の開口幅に対応したサイズの生体微粒子を第１の凹部に収集し、第１の凹部に収集された生体微粒子よりも大きなサイズの生体微粒子を第２の凹部に収集することが可能となる。したがって、生体微粒子をサイズ毎に分離して収集することができる。

【0012】

一実施形態では、試料溶液を支持面上に供給する供給口と、支持面と共に試料溶液が流れる流路を画成する壁部と、流路から試料溶液を回収する回収口と、を更に備えていてもよい。この実施形態では、生体微粒子の帯電極性と逆極性の直流電圧を印加することで、流路を流れる試料溶液から生体微粒子を収集することが可能となる。

【0013】

一実施形態では、第１の試料台と共に支持面を提供する第３の試料台であり、支持面に開口する第３の凹部が形成された、該第３の試料台を更に備え、第１の凹部を画成する壁面が親水性を有し、第３の凹部を画成する壁面が疎水性を有していてもよい。親水性の壁面を有する第１の凹部内には水との親和性の高い生体微粒子が集まりやすくなり、疎水性の壁面を有する他の第１の凹部内には水との親和性の低い生体微粒子が集まりやすくなる。したがって、この実施形態では、親水性の異なる生体微粒子を分離して収集することができる。

【0014】

一実施形態では、第１の試料台が、陽極酸化アルミナによって構成された基部と、該基部の表面を被覆する導電性の被膜とを有していてもよい。

【0015】

一実施形態では、被膜が、カーボン膜、有機導電性薄膜又は金属薄膜であってもよい。なお、金属薄膜が、金、タングステン又はオスミウムによって構成されていてもよい。

【0016】

一態様では、支持面を提供し、且つ、支持面に開口する第１の凹部が形成された第１の試料台を備える生体微粒子収集装置を用いて生体微粒子を収集する生体微粒子収集方法が提供される。この生体微粒子収集方法は、支持面上に生体微粒子を含む試料溶液を供給する工程と、生体微粒子の帯電極性と逆極性の直流電圧を第１の試料台に印加する工程と、を含む。

【0017】

上記態様に係る方法では、生体微粒子の帯電極性と逆極性の電圧を第１の試料台に印加することによって、第１の試料台と生体微粒子との間に引力が働き、第１の試料台の第１の凹部内に試料溶液中の生体微粒子を収集することができる。このとき、第１の凹部内に収集される生体微粒子のサイズは、第１の凹部の開口幅に制限されるので、第１の凹部の開口幅に応じた生体微粒子を選択的に収集することができる。

【0018】

一実施形態では、生体微粒子収集装置は、第１の試料台と共に支持面を提供し、第１の試料台に対して電気的に絶縁され、且つ、支持面に開口する第２の凹部が形成された第２の試料台を更に備え、第１の試料台に対する直流電圧の印加を停止した後に、生体微粒子の帯電極性と逆極性の直流電圧を第２の試料台に印加する工程を更に含んでもよい。

【0019】

この実施形態では、第１の試料台に生体微粒子の帯電極性と逆極性の直流電圧を印加して第１の凹部内に生体微粒子を収集した後に、第２の試料台に生体微粒子の帯電極性と逆極性の直流電圧を印加することで、第１の凹部に収集された生体微粒子よりも大きなサイズの生体微粒子を第２の凹部に収集することができる。したがって、生体微粒子をサイズ毎に分離して収集することができる。

【0020】

一実施形態では、第１の試料台及び第２の試料台に対して生体微粒子の帯電極性と同極性の直流電圧を印加する工程を更に含んでいてもよい。この実施形態では、試料台に対して生体微粒子と同極性の直流電圧を印加することによって、第１の試料台及び第２の試料台と生体微粒子との間に斥力が働き、第１の凹部内に収集された生体微粒子を試料溶液中に戻すことが可能となる。

【発明の効果】

【0021】

本発明の一態様及び種々の実施形態によれば、試料溶液に戻すことが可能な態様で生体微粒子を収集することができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】第１実施形態に係る生体微粒子収集装置を概略的に示す斜視図である。

【図2】試料台を概略的に示す断面図である。

【図3】第１の試料台の断面図である。

【図4】一実施形態の生体微粒子収集方法を示すフローチャートである。

【図5】生体微粒子の動きを示す図である。

【図6】生体微粒子の動きを示す図である。

【図7】赤外線分析装置の例を示す図である。

【図8】電子顕微鏡の例を示す図である。

【図9】生体微粒子の動きを示す図である。

【図10】第２実施形態に係る生体微粒子収集装置を概略的に示す斜視図である。

【図11】生体微粒子の動きを示す図である。

【図12】第３実施形態に係る生体微粒子収集装置を概略的に示す斜視図である。

【図13】密封容器に格納された試料台を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、図面を参照して、本開示の実施形態について説明する。なお、以下の説明において、同一又は相当要素には同一符号を付し、重複する説明は繰り返さない。図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。

【0024】

（第１実施形態）
図１は、第１実施形態に係る生体微粒子収集装置１を概略的に示す斜視図である。図１に示す生体微粒子収集装置１は、試料溶液４０から生体微粒子４２を分離して収集するように構成されている。試料溶液４０とは、血液、尿、便又はこれらの混濁物といった人間又は動物から採取された液状の試料、或いは、樹液や維管束液といった植物から採取された液状の試料である。生体微粒子４２とは、試料溶液４０中に含まれる生物由来の微小粒子であり、例えばエクソソーム、マイクロベシクル、ウイルスが挙げられる。生体微粒子４２は、例えば１μｍ以下の直径を有している。

【0025】

図１に示すように、生体微粒子収集装置１は、試料台１０及び電源部３０を備えている。試料台１０は、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３を含んでいる。第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３の各々は、略直方体形状を有し、例えば２００ｎｍ以下の厚さを有している。後述するように、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３は、その上に供給された生体微粒子４２を含む試料溶液４０を支持する。

【0026】

図１に示すように、第１の試料台１１は、上面１１ｔ及び下面１１ｂを有している。第２の試料台１２は、上面１２ｔ及び下面１２ｂを有している。第３の試料台１３は、上面１３ｔ及び下面１３ｂを有している。第１の試料台１１の上面１１ｔ、第２の試料台１２の上面１２ｔ及び第３の試料台１３の上面１３ｔは、同一平面上に配置され、生体微粒子４２を含む試料溶液４０を支持する支持面１０ａを構成している。すなわち、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３は、支持面１０ａを提供している。

【0027】

第１の試料台１１には、複数の第１の凹部１１ａが形成されている。なお、本明細書において、「複数」とは２つ以上であることを意味している。これら複数の第１の凹部１１ａは、第１の試料台１１の厚さ方向に延在し、上面１１ｔ（支持面１０ａ）に開口している。第２の試料台１２には、複数の第２の凹部１２ａが形成されている。これら複数の第２の凹部１２ａは、第２の試料台１２の厚さ方向に延在し、上面１２ｔ（支持面１０ａ）に開口している。第３の試料台１３には、複数の第３の凹部１３ａが形成されている。これら複数の第３の凹部１３ａは、第３の試料台１３の厚さ方向に延在し、上面１３ｔ（支持面１０ａ）に開口している。

【0028】

第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａは、円形状又は正多角形状の平面形状を有し、互いに異なる開口幅を有している。ここで、第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａの開口幅とは、各凹部によって支持面１０ａに形成された開口部の幅を表している。例えば、当該開口部が円形である場合には、その直径が各凹部の開口幅として定義され、当該開口部が正多角形状である場合には、正多角形状の開口部に内接する円の直径が、各凹部の開口幅として定義される。これら第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａは、延在方向において略一定の開口幅を有している。例えば、第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａの平面形状が円形である場合、各凹部によって支持面１０ａに形成された開口部の径は、各凹部の底部の径と略一致する。

【0029】

図２に示す例では、第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａは、直径ｒ１、直径ｒ２及び直径ｒ３の開口幅をそれぞれ有している。直径ｒ２は、直径ｒ１よりも大きく、直径ｒ３よりも小さい。すなわち、第２の凹部１２ａは、第１の凹部１１ａの開口幅よりも大きな開口幅を有しており、第３の凹部１３ａは、第２の凹部１２ａの開口幅よりも大きな開口幅を有している。直径ｒ１，ｒ２，ｒ３は、収集対象の生体微粒子４２のサイズに応じた大きさに設定される。収集対象の生体微粒子４２がエクソソームである場合には、例えば、直径ｒ１は５０ｎｍに設定され、直径ｒ２は１００ｎｍに設定され、直径ｒ３は１５０ｎｍに設定される。

【0030】

これら第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３は、は、導電性を有する材料によって構成されており、絶縁材によって互いに電気的に絶縁されている。一実施形態では、図３に示すように、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３の各々は、基部１８及び導電膜１９を有していてもよい。

【0031】

基部１８は、多孔性の酸化皮膜を有する陽極酸化アルミナである。基部１８は、例えばアルミニウム製の基材を酸性電解溶液中で陽極酸化処理することによって形成される。アルミニウム製の基材に対して陽極酸化処理を行うと、酸及び電場の溶解作用によって基材の表面に複数の凹部（細穴）が規則的に形成される。基部１８に形成される凹部は、例えば５ｎｍ～４５０ｎｍ程度の開口幅を有し得る。凹部の開口幅は、陽極酸化条件を調節することによって制御することが可能である。例えば、Hideki Masuda and Kenji Fukuda, “OrderedMetal Nanohole Arrays Made by a Two-Step Replication of Honeycomb Structures ofAnodic Alumina”, SCIENCE, Vol. 268, pp.1466-1468, 9JUNE 1995、及び、Hideki MASUDA, Kouichi YADA and AtsushiOSAKA, “Self-Ordering of Cell Configuration of AnodicPorous Alumina with Large-Size Pores in Phosphoric Acid Solution”, Jpn. J. Appl. Phys., Vol. 37, 1340-1342, 1 November 1998には、金属表面に多孔質構造を有する陽極酸化アルミナを作製する方法が記載されている。当業者であれば、これらの公知技術に基づいて、例えば５ｎｍ～４５０ｎｍの開口幅を有する凹部を基部１８に形成することが可能である。

【0032】

導電膜１９は、例えば導電性を有する被膜であり、基部１８の表面を被覆している。導電膜１９としては、例えばカーボン膜、有機導電性薄膜又は金属薄膜が用いられる。この金属薄膜の材料としては、金、タングステン又はオスミウムが例示される。導電膜１９は、例えばＣＶＤ法を用いて処理ガスに由来する薄膜を基部１８上に成膜することによって形成される。導電膜１９としてカーボン膜を用いる場合には、例えば処理ガスとしてメタンが利用される。基部１８の凹部に形成された導電膜１９は、例えば１ｎｍ～３ｎｍの膜厚を有し得る。このように形成された導電膜１９は、第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａを画成する壁面を構成する。

【0033】

図１に示すように、生体微粒子収集装置１は、電極２１，２２，２３を更に有している。電極２１，２２，２３は、第１の試料台１１の下面１１ｂ、第２の試料台１２の下面１２ｂ及び第３の試料台１３の下面１３ｂにそれぞれ取り付けられている。電極２１，２２，２３は、例えばアルミニウム製の金属板であり、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３の導電膜１９に電気的に接続されている。

【0034】

電源部３０は、電圧制御部２０、直流電源３１、直流電源３２及び直流電源３３を含んでいる。直流電源３１，３２，３３は、出力電圧を調整可能な可変電源である。直流電源３１，３２，３３は、電極２１，２２，２３に対してそれぞれ電気的に接続されている。後述するように、直流電源３１，３２，３３は、電圧制御部２０からの制御信号に応じて、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３のそれぞれに対して生体微粒子４２の帯電極性と同極性又は逆極性の直流電圧を選択的に印加する。

【0035】

電圧制御部２０は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭを含むコンピュータを主体として構成されており、所定の機能を実現するためのコンピュータプログラムがＲＯＭなどに記憶されている。そして、ＣＰＵやＲＡＭ上に上記のコンピュータプログラムを読み込ませ、ＣＰＵの制御の下で動作させることで、各種機能が実現される。なお、一実施形態においては、電圧制御部２０の各機能が集積回路によって実現されてもよい。電圧制御部２０は、直流電源３１，３２，３３に制御信号を送出することによって、電源部３０から第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３に印加される直流電圧の極性を、生体微粒子４２の帯電極性と同極性又は逆極性に個別に切り替え可能に構成されている。

【0036】

以下、図４を参照して、電圧制御部２０の機能について詳細に説明する共に、一実施形態の生体微粒子収集方法について説明する。図４は、その表面が負に帯電した生体微粒子４２を収集する生体微粒子収集方法ＭＴを示すフローチャートである。

【0037】

方法ＭＴでは、まず第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３に負の電圧が印加されるように、電圧制御部２０が直流電源３１，３２，３３を制御する（工程ＳＴ１）。

【0038】

次いで、図５（ａ）に示すように、支持面１０ａ上に試料溶液４０が滴下される（工程ＳＴ２）。滴下される試料溶液４０には、多数の生体微粒子４２が含まれている。これらの生体微粒子４２は、その特性に応じた極性に帯電した状態で試料溶液４０中に分散されている。本実施形態では、生体微粒子４２が、試料溶液４０中で負に帯電しているものとして説明する。工程ＳＴ２では、生体微粒子４２が負に帯電しているので、各試料台１１，１２，１３と生体微粒子４２との間には斥力が作用する。よって、試料溶液４０の滴下時に試料溶液４０中の生体微粒子４２が第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａの内部に入り込むことが防止される。

【0039】

次いで、第１の試料台１１に正の電圧、すなわち生体微粒子４２の帯電極性と逆極性の直流電圧が印加されるように、電圧制御部２０が直流電源３１を制御する（工程ＳＴ３）。図５（ｂ）に示すように、第１の試料台１１に正の電圧が印加されることにより、第１の試料台１１と試料溶液４０中の生体微粒子４２との間に静電引力が作用し、試料溶液４０中の生体微粒子４２が第１の試料台１１に引き寄せられる。引き寄せられた生体微粒子４２のうち直径ｒ１よりも小さなサイズの生体微粒子４２は第１の試料台１１に形成された複数の第１の凹部１１ａ内に入り込み、捕捉される。

【0040】

次いで、第１の試料台１１への直流電圧の印加を停止し、第１の試料台１１の電位が接地電位に設定されるように、電圧制御部２０が直流電源３１を制御する（工程ＳＴ４）。第１の凹部１１ａは非常に狭い空間であるため、第１の凹部１１ａ内に捕捉された生体微粒子４２はブラウン運動が抑制され、第１の凹部１１ａ内で安定化する。したがって、第１の試料台１１が接地電位に設定された場合であっても、生体微粒子４２は第１の凹部１１ａの外部に移動せずに第１の凹部１１ａ内に留められる。

【0041】

次いで、第２の試料台１２に正の直流電圧が印加されるように電圧制御部２０が直流電源３２を制御する（工程ＳＴ５）。図６（ａ）に示すように、第２の試料台１２に正の電圧が印加されることにより、第２の試料台１２と試料溶液４０中の生体微粒子４２との間に静電引力が作用し、試料溶液４０中の生体微粒子４２が第２の試料台１２に引き寄せられる。引き寄せられた生体微粒子４２のうち直径ｒ１よりも大きく直径ｒ２よりも小さなサイズの生体微粒子４２は第２の試料台１２に形成された複数の第２の凹部１２ａ内に入り込み、捕捉される。

【0042】

次いで、第２の試料台１２の電位が接地電位に設定されるように、電圧制御部２０が直流電源３２を制御する（工程ＳＴ６）。これにより、第２の凹部１２ａ内に捕捉された生体微粒子４２が第２の凹部１２ａ内で安定化する。

【0043】

次いで、第３の試料台１３に正の電位が印加されるように電圧制御部２０が直流電源３３を制御する（工程ＳＴ７）。図６（ｂ）に示すように、第３の試料台１３に正の電圧が印加されることにより、第３の試料台１３と試料溶液４０中の生体微粒子４２との間に静電引力が作用し、試料溶液４０中の生体微粒子４２が第３の試料台１３に引き寄せられる。引き寄せられた生体微粒子４２のうち直径ｒ２よりも大きく直径ｒ３よりも小さなサイズの生体微粒子４２は第３の試料台１３に形成された複数の第３の凹部１３ａ内に入り込み、捕捉される。

【0044】

次いで、第３の試料台１３の電位が接地電位に設定されるように電圧制御部２０が直流電源３３を制御する（工程ＳＴ８）。これにより、第３の凹部１３ａ内に捕捉された生体微粒子４２が第３の凹部１３ａ内で安定化する。このようにして、試料溶液４０中の生体微粒子４２が、サイズ毎に分離して収集される。

【0045】

次いで、試料溶液４０を交換するか否かが判定される（工程ＳＴ９）。例えば、複数の試料溶液を分析する場合には、生体微粒子４２が収集された試料溶液４０が支持面１０ａから除去された後に、支持面１０ａ上に分析対象となる他の試料溶液が滴下され（工程ＳＴ２）、工程ＳＴ３～工程ＳＴ８の処理が再び行われる。これにより、他の試料溶液に含まれる生体微粒子が第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａ内に収集される。一方、試料溶液４０を交換しない場合には、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３に収集された生体微粒子４２が分析される（工程ＳＴ１０）。このとき、収集された生体微粒子４２は、サイズ毎に分類して分析される。生体微粒子４２の分析は、例えば、図７に示す赤外線分析装置５０を用いて行われてもよい。図７に示す赤外線分析装置５０は、赤外線の反射光強度に基づいて生体微粒子４２を検出する装置である。赤外線分析装置５０は、発光素子５１ａ，５１ｂ，５１ｃ、検出器５２ａ，５２ｂ，５２ｃ、赤外線コントローラ５３、増幅器５４、ＡＤ変換器５５及びコンピュータ５６を有している。

【0046】

発光素子５１ａ，５１ｂ，５１ｃは、赤外線コントローラ５３からの制御信号に応じて作動して第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａに向けて赤外線をそれぞれ照射する。検出器５２ａ，５２ｂ，５２ｃは、第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａの生体微粒子４２によって反射された赤外線を受光する。検出器５２ａ，５２ｂ，５２ｃで受光された赤外線の反射光強度を示す信号は、増幅器５４によって増幅される。増幅された信号は、ＡＤ変換器５５を介してコンピュータ５６に出力される。コンピュータ５６は、出力された反射光強度を示す信号に基づいて、第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａ内の生体微粒子４２の格納状況を取得する。

【0047】

また、一実施形態では、図８に示す電子顕微鏡６０を用いて、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３に収集された生体微粒子４２を観察してもよい。この電子顕微鏡６０は、電子線を照射して生体微粒子４２の像を取得する顕微鏡である。図８に示すように、電子顕微鏡６０は、電子銃６１、試料ホルダ６２、測定端子６３、増幅器６４及びコネクタ６５を有している。

【0048】

試料ホルダ６２は、導電性薄膜６６、耐圧性薄膜６７及び絶縁性薄膜６８を含んでいる。耐圧性薄膜６７及び絶縁性薄膜６８は、絶縁性の材料から構成されており、互いに対向するように配置されている。耐圧性薄膜６７と絶縁性薄膜６８との間には、収集された生体微粒子４２を含む第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３が保持されている。耐圧性薄膜６７上には、金属製の導電性薄膜６６が設けられている。これら導電性薄膜６６、耐圧性薄膜６７及び絶縁性薄膜６８は、密封された状態で枠体６９内に収容されている。なお、絶縁性薄膜６８と枠体６９との間には、Ｏリングが設けられていてもよい。

【0049】

この電子顕微鏡６０では、電子銃６１を水平方向に走査しながら導電性薄膜６６の上方から電子線が照射される。照射された電子線は、拡散領域７０において拡散して、拡散領域７０が負に帯電する。この拡散領域７０の影響により、観察対象である試料溶液４０に誘電分極が発生し、この誘電分極によって生じた電位が絶縁性薄膜６８の下方に支持された測定端子６３によって測定される。測定端子６３によって測定された測定信号は、増幅器６４で増幅されると共に、コネクタ６５から出力される。

【0050】

ここで、生体微粒子４２の誘電率は、試料溶液４０の誘電率よりも低いので、拡散領域７０と測定端子６３との間に生体微粒子４２が存在する場合には、測定端子６３によって検出される信号が小さくなる。電子顕微鏡６０は、このような性質を利用して、試料溶液４０の誘電率と生体微粒子４２の誘電率との差異に基づいて、生体微粒子４２の像を得る。

【0051】

生体微粒子４２の分析が完了すると、直流電源３１から第１の試料台１１に負の直流電圧、すなわち生体微粒子４２の帯電極性と同極性の直流電圧が印加される（工程ＳＴ１１）。これにより、図９に示すように、第１の試料台１１と生体微粒子４２との間に斥力が働き、第１の凹部１１ａから生体微粒子４２が排出されて試料溶液４０中に戻される。同様に、第２の試料台１２及び第３の試料台１３にも負の直流電圧が印加され、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａ内の生体微粒子４２が試料溶液４０中に戻される。

【0052】

上述した実施形態に係る生体微粒子収集装置１においては、生体微粒子４２の帯電極性と逆極性である正の直流電圧を第１の試料台１１に印加することによって、第１の試料台１１と生体微粒子４２との間に引力を作用させ、第１の試料台１１に形成された第１の凹部１１ａ内に生体微粒子４２を収集することができる。このとき、第１の凹部１１ａ内に収集される生体微粒子４２のサイズは、第１の凹部１１ａの直径ｒ１に制限される。したがって、直径ｒ１よりも小さな生体微粒子４２を試料溶液４０から選択的に分離して収集することができる。また、第１の試料台１１に対して生体微粒子４２の帯電極性と同極性である負の電圧を印加した場合には、第１の試料台１１と生体微粒子４２との間に斥力が作用するので、第１の凹部１１ａ内の生体微粒子４２を試料溶液４０中に分散させることが可能となる。したがって、生体微粒子収集装置１では、試料溶液４０中に戻すことが可能な態様で特定のサイズの生体微粒子４２を収集することができる。

【0053】

また、この生体微粒子収集装置１では、生体微粒子４２の帯電極性と逆極性である正の直流電圧を第１の試料台１１及び第２の試料台１２の順に印加することによって、第１の凹部１１ａの直径ｒ１よりも小さなサイズの生体微粒子４２を第１の凹部１１ａに選択的に収集することができると共に、直径ｒ１よりも大きく第２の凹部の直径ｒ２よりも小さなサイズの生体微粒子４２を第２の凹部１２ａ内に選択的に収集することができる。したがって、試料溶液４０中の生体微粒子４２をサイズ毎に分離して収集することができる。

【0054】

（第２実施形態）
次いで、第２実施形態に係る生体微粒子収集装置について説明する。試料溶液中の生体微粒子には、水に対する親和性の違いから親水性を有する生体微粒子と、疎水性を有する生体微粒子とが存在する。第２実施形態に係る生体微粒子収集装置は、親水性を有する生体微粒子と疎水性を有する生体微粒子とを分離して収集する。

【0055】

図１０は、第２実施形態に係る生体微粒子収集装置１Ａを概略的に示す斜視図である。図１０に示すように、生体微粒子収集装置１Ａは、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３に加えて、第４の試料台１４、第５の試料台１５及び第６の試料台１６を更に含んでいる点で生体微粒子収集装置１と相違している。以下では、第１実施形態に係る生体微粒子収集装置１との相違点について主に説明し、重複する説明は省略する。

【0056】

第４の試料台１４、第５の試料台１５及び第６の試料台１６の各々は、略直方体形状を有し、例えば２００ｎｍ以下の厚さを有している。第４の試料台１４、第５の試料台１５及び第６の試料台１６は、互いに電気的に絶縁されている。また、第４の試料台１４、第５の試料台１５及び第６の試料台１６は、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３にそれぞれ電気的に接続されている。

【0057】

第４の試料台１４、第５の試料台１５及び第６の試料台１６は、上面１４ｔ、上面１５ｔ及び上面１６ｔをそれぞれ有している。第４の試料台１４の上面１４ｔ、第５の試料台１５の上面１５ｔ及び第６の試料台１６の上面１６ｔは、第１の試料台１１の上面１１ｔ、第２の試料台１２の上面１２ｔ及び第３の試料台１３の上面１３ｔと同一平面上に配置され、上面１１ｔ，１２ｔ，１３ｔと共に支持面１０ａを構成している。

【0058】

また、第４の試料台１４には、複数の第４の凹部１４ａが形成されている。これら複数の第４の凹部１４ａは、第４の試料台１４の厚さ方向に延在し、上面１４ｔ（支持面１０ａ）に開口している。第５の試料台１５には、複数の第５の凹部１５ａが形成されている。これら複数の第５の凹部１５ａは、第５の試料台１５の厚さ方向に延在し、上面１５ｔ（支持面１０ａ）に開口している。第６の試料台１６には、複数の第６の凹部１６ａが形成されている。これら複数の第６の凹部１６ａは、第６の試料台１６の厚さ方向に延在し、上面１６ｔ（支持面１０ａ）に開口している。

【0059】

第４の凹部１４ａ、第５の凹部１５ａ及び第６の凹部１６ａは、第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａと同じ形状を有している。すなわち、第４の凹部１４ａ、第５の凹部１５ａ及び第６の凹部１６ａは、それぞれ直径ｒ１、直径ｒ２及び直径ｒ３の開口幅を有している。

【0060】

生体微粒子収集装置１Ａでは、第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａを画成する壁面が、親水性を有するように改質されている。例えば、第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａの側面及び底面を構成する導電膜１９は、プラズマ処理又は化学的処理等の表面処理によって親水化される。例えば、入山裕，“プラズマ処理効果の持続性”，表面科学，Vol. 28，No. 8，pp.459-466，2007には、プラズマ処理を用いた親水化処理手法が記載されている。また、特許第６２２７８７２号公報には親水化処理剤を用いた親水化処理手法が記載されている。当業者であれば、これらの公知技術に基づいて導電膜１９に親水化処理を施すことが可能である。

【0061】

一方、第４の凹部１４ａ、第５の凹部１５ａ及び第６の凹部１６ａを画成する壁面は、疎水性を有するように改質されている。例えば、第４の凹部１４ａ、第５の凹部１５ａ及び第６の凹部１６ａの側面及び底面を構成する導電膜１９は、プラズマ処理又は化学的処理等の表面処理によって疎水化される。例えば、小駒益弘，“低温プラズマ処理による表面の疎水化”，表面技術，Vol. 47，No. 7，pp.566-570，1996には、ＣＦ_４のプラズマを用いた疎水化処理手法が記載されている。当業者であれば、これらの公知技術に基づいて導電膜１９に疎水化処理を施すことが可能である。上述した表面処理によって、第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａを画成する壁面は、第４の凹部１４ａ、第５の凹部１５ａ及び第６の凹部１６ａを画成する壁面よりも高い親水性（濡れ性）を有している。

【0062】

図１１（ａ）及び（ｂ）を参照して、生体微粒子収集装置１Ａの作用について説明する。図１１（ａ）に示すように、本実施形態では、試料溶液４０に親水性の生体微粒子４２Ａ及び疎水性の生体微粒子４２Ｂが含まれている。親水性の生体微粒子４２Ａとしては、例えばポリオウイルス、ノロウイルスが挙げられる。疎水性の生体微粒子４２Ｂとしては、例えばインフルエンザウイルス、コロナウイルス、アデノウイルスが挙げられる。以下の説明では、これら生体微粒子４２Ａ及び生体微粒子４２Ｂは、試料溶液４０中で負に帯電しているものとする。

【0063】

この生体微粒子収集装置１Ａでは、第１の試料台１１及び第４の試料台１４に正の直流電圧、すなわち生体微粒子４２の帯電極性と逆極性の直流電圧が印加されるように電圧制御部２０によって直流電源３１が制御される。図１１（ｂ）に示すように、第１の試料台１１及び第４の試料台１４に正の電圧が印加されることにより、第１の試料台１１及び第４の試料台１４と生体微粒子４２Ａ，４２Ｂとの間に静電引力が作用し、試料溶液４０中の生体微粒子４２Ａ，４２Ｂが第１の試料台１１及び第４の試料台１４に引き寄せられる。このとき、水との親和性が高い生体微粒子４２Ａは、親水化処理された第１の凹部１１ａの内部に集まりやすく、水との親和性が低い生体微粒子４２Ｂは、疎水化処理された第４の凹部１４ａの内部に集まりやすい。したがって、生体微粒子４２Ａのうち直径ｒ１よりも小さなサイズの生体微粒子４２Ａは複数の第１の凹部１１ａ内に捕捉され、生体微粒子４２Ｂのうち直径ｒ１よりも小さなサイズの生体微粒子４２Ｂは複数の第４の凹部１４ａ内に捕捉される。すなわち、生体微粒子４２Ａ,４２Ｂは、第１の凹部１１ａ及び第４の凹部１４ａ内に分離して収集される。

【0064】

さらに、生体微粒子収集装置１Ａでは、第２の試料台１２及び第５の試料台１５に正の直流電圧が印加される。これにより、直径ｒ１よりも大きく直径ｒ２よりも小さなサイズを有する生体微粒子４２Ａが複数の第２の凹部１２ａ内に捕捉され、直径ｒ１よりも大きく直径ｒ２よりも小さなサイズを有する生体微粒子４２Ｂが第５の凹部１５ａ内に捕捉される。その後、第３の試料台１３及び第６の試料台１６に正の直流電圧が印加される。これにより、直径ｒ２よりも大きく直径ｒ３よりも小さなサイズを有する生体微粒子４２Ａが複数の第３の凹部１３ａ内に捕捉され、直径ｒ２よりも大きく直径ｒ３よりも小さなサイズを有する生体微粒子４２Ｂが第６の凹部１６ａ内に捕捉される。このように、生体微粒子収集装置１Ａでは、親水性の異なる生体微粒子４２Ａ，４２Ｂを分離して収集することができる。

【0065】

一般的に、親水性のウイルスはアルコール等の消毒剤に強く、疎水性のウイルスはアルコール等の消毒剤に弱い性質を有している。生体微粒子収集装置１Ａでは、例えば親水性の異なるウイルスを分離して収集することが可能であるので、消毒方法の選定を容易に行うことができる。なお、生体微粒子４２Ａ，４２Ｂは、エクソソーム又は小胞であってもよい。親水性の違いは、エクソソーム又は小胞の膜タンパク質の性質によって引き起こされるものである。親水性の異なるエクソソーム等を分離して収集することで、その性質に応じてエクソソーム等を分離することが可能である。

【0066】

（第３実施形態）
次いで、第３実施形態に係る生体微粒子収集装置について説明する。図１２は、第３実施形態に係る生体微粒子収集装置１Ｂを概略的に示す斜視図である。この生体微粒子収集装置１Ｂは、支持面１０ａ上に試料溶液４０を供給する供給機構８０を備えている点で、第１実施形態に係る生体微粒子収集装置１と相違している。以下では、第１実施形態に係る生体微粒子収集装置１との相違点について主に説明し、重複する説明は省略する。

【0067】

図１２に示すように、生体微粒子収集装置１Ｂの供給機構８０は、供給口８１、回収口８２及び壁部８３を有している。供給口８１は、生体微粒子４２を含む試料溶液４０を支持面１０ａ上に供給する。回収口８２は、支持面１０ａ上の試料溶液４０を回収する。壁部８３は、支持面１０ａの縁に沿って設けられており、供給口８１から供給された試料溶液４０を回収口８２に導く流路８６を支持面１０ａと共に形成している。第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３は、流路８６の上流側からその順に配置されている。

【0068】

図１２に示すように、供給口８１から支持面１０ａ上に供給された試料溶液４０は、流路８６に沿って第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３の上面を順に流れる。このとき、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３には、直流電源３１、直流電源３２及び直流電源３３から正の直流電圧が印加されている。したがって、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３を試料溶液が通過する過程で、試料溶液４０中の生体微粒子４２のうち直径ｒ１よりも小さなサイズの生体微粒子４２が複数の第１の凹部１１ａに収集され、直径ｒ１よりも大きく直径ｒ２よりも小さなサイズの生体微粒子４２が複数の第２の凹部１２ａに収集され、直径ｒ２よりも大きく直径ｒ３よりも小さなサイズの生体微粒子４２が複数の第３の凹部１３ａに収集される。したがって、試料溶液４０中の生体微粒子４２がサイズ毎に分離して収集される。

【0069】

第３の試料台１３に到達した試料溶液４０は、回収口８２によって回収され、生体微粒子収集装置１Ｂの外部に排出される。この生体微粒子収集装置１Ｂによれば、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３の電位を順に制御することなく、生体微粒子４２をサイズ毎に分離して収集することができる。

【0070】

以上、種々の実施形態に係る生体微粒子収集装置について説明してきたが、上述した実施形態に限定されることなく発明の要旨を変更しない範囲で種々の変形態様を構成可能である。

【0071】

例えば、図４に示す生体微粒子収集方法ＭＴでは、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３に負の電圧を印加して、収集した生体微粒子４２を試料溶液４０中に戻しているが、生体微粒子４２を試料溶液４０中に戻すことなく、収集された生体微粒子４２を保存してもよい。生体微粒子４２を保存する場合には、図１３に示すように、内部が減圧された密閉容器７２内に生体微粒子４２を第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３ごと格納することで、生体微粒子４２を保存してもよい。

【0072】

また、図４に示す生体微粒子収集方法ＭＴでは、生体微粒子４２が、試料溶液４０中で負に帯電しているものとして説明したが、生体微粒子４２が正に帯電している場合であっても上述の方法を適用可能である。すなわち、生体微粒子４２に正に帯電している場合には、電圧制御部２０によって第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３に順に負の直流電圧を印加することにより、第１の凹部１１ａ、第２の凹部１２ａ及び第３の凹部１３ａ内に生体微粒子４２をサイズ毎に収集することが可能である。また、収集した生体微粒子４２を分析した後に、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３に正の直流電圧を印加することによって、収集された生体微粒子４２を試料溶液４０に戻すことが可能である。

【0073】

また、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３に形成される凹部の開口幅は、収集対象の生体微粒子４２のサイズに応じて任意に設定することができる。例えば、収集する生体微粒子４２がエクソソームである場合には、凹部の開口幅を１０ｎｍ～５００ｎｍの範囲に設定することができる。さらに、上記実施形態では、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３が基部１８及び導電膜１９によって構成されているが、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３は導電性のある他の材料から構成されていてもよい。

【0074】

なお、試料台１０は、少なくとも第１の試料台１１を有していればよい。これにより、第１の試料台１１に形成された第１の凹部１１ａの開口幅に応じたサイズの生体微粒子を選択的に収集することができる。上述した実施形態では、第１の試料台１１、第２の試料台１２、第３の試料台１３、第４の試料台１４、第５の試料台１５及び第６の試料台１６には、複数の凹部が形成されているが、少なくとも１つの凹部が形成されていればよい。

【0075】

図１に示す生体微粒子収集装置１は、第１の試料台１１、第２の試料台１２及び第３の試料台１３を備えているが、一実施形態では、生体微粒子収集装置１が４つ以上の試料台を備えていてもよい。これら４つ以上の試料台には、互いに異なる開口幅を有する凹部がそれぞれ形成され、各試料台の凹部に互いに異なるサイズの生体微粒子が分離して収集されてもよい。なお、上述した種々の実施形態は、矛盾のない範囲で組み合わせることが可能である。

【符号の説明】

【0076】

１，１Ａ，１Ｂ…生体微粒子収集装置、１０ａ…支持面、１１…第１の試料台、１２…第２の試料台、１３…第３の試料台、１４…第４の試料台、１５…第５の試料台、１６…第６の試料台、１１ａ…第１の凹部、１２ａ…第２の凹部、１３ａ…第３の凹部、１４ａ…第４の凹部、１５ａ…第５の凹部、１６ａ…第６の凹部、１８…基部、１９…導電膜、３０…電源部、４０…試料溶液、４２，４２Ａ，４２Ｂ…生体微粒子、８１…供給口、８２…回収口、８３…壁部、８６…流路。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】