特開 2022-75294 血中アンモニア濃度を低下させる剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022075294

(43)【公開日】2022-05-18

(54)【発明の名称】血中アンモニア濃度を低下させる剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/742 20150101AFI20220511BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20220511BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220511BHJP

   A61K 31/702 20060101ALI20220511BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220511BHJP

【ＦＩ】

A61K35/742

A61P7/00

A61P43/00 121

A61K31/702

A61P25/28

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020185985

(22)【出願日】2020-11-06

(71)【出願人】

【識別番号】000226415

【氏名又は名称】物産フードサイエンス株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】304027279

【氏名又は名称】国立大学法人 新潟大学

(71)【出願人】

【識別番号】000114282

【氏名又は名称】ミヤリサン製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100110766

【弁理士】

【氏名又は名称】佐川 慎悟

(74)【代理人】

【識別番号】100165515

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 清子

(74)【代理人】

【識別番号】100169340

【弁理士】

【氏名又は名称】川野 陽輔

(74)【代理人】

【識別番号】100195682

【弁理士】

【氏名又は名称】江部 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100206623

【弁理士】

【氏名又は名称】大窪 智行

(72)【発明者】

【氏名】門田 吉弘

(72)【発明者】

【氏名】栃尾 巧

(72)【発明者】

【氏名】寺井 崇二

(72)【発明者】

【氏名】土屋 淳紀

(72)【発明者】

【氏名】吉田 智彰

(72)【発明者】

【氏名】高橋 志達

(72)【発明者】

【氏名】岡 健太郎

【テーマコード（参考）】

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA01

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA15

4C086ZA51

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC69

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA15

4C087ZA51

4C087ZC75

(57)【要約】

【課題】 安全かつ効果的に血中アンモニア濃度を低下させる技術を提供する。
【解決手段】 クロストリジウム・ブチリカム、１－ケストース、またはクロストリジウム・ブチリカムおよび１－ケストースを有効成分とする、血中アンモニア濃度を低下させる剤。本発明によれば、安全かつ効果的に血中アンモニア濃度を低下させることができる。よって、高アンモニア血症や肝性脳症の予防または改善を図ることができる。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

クロストリジウム・ブチリカムを有効成分とする、血中アンモニア濃度を低下させる剤。

【請求項2】

１－ケストースを有効成分とする、血中アンモニア濃度を低下させる剤。

【請求項3】

クロストリジウム・ブチリカムおよび１－ケストースを有効成分とする、血中アンモニア濃度を低下させる剤。

【請求項4】

高アンモニア血症の予防または改善に用いられることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の剤。

【請求項5】

肝性脳症の予防または改善に用いられることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、クロストリジウム・ブチリカムおよび／または１－ケストースを有効成分とする、血中アンモニア濃度を低下させる剤に関する。

【背景技術】

【0002】

生体内では、食餌由来のタンパク質や体を構成するタンパク質および核酸の代謝の過程で、アンモニアが絶えず産生されている。アンモニアは有毒な物質であるため、生体には、下記（ｉ）～（ｉｖ）に示すような、アンモニアを除去する複数の系が存在する。
（ｉ）肝臓における尿素回路（オルニチン回路）。
（ｉｉ）全組織における酸アミド生成。
（ｉｉｉ）主として肝臓における、ケト酸との反応。
（ｉｖ）腎臓における尿への直接排泄。

【0003】

上記（ｉ）の尿素回路は、アンモニア除去系の中心である。尿素回路に取り込まれたアンモニアは、無毒な尿素に変換され、尿として体外に排泄される。（ｉｉ）の酸アミド生成では、アンモニアとグルタミン酸とから、グルタミナーゼの働きによりグルタミンが生成される。また、アンモニアとアスパラギン酸とから、アスパラギナーゼの働きによりアスパラギンが生成される。（ｉｉｉ）ケト酸との反応では、アンモニアとα－ケトグルタル酸とから、グルタミン酸脱水素酵素の働きによりグルタミン酸が生成される。（ｉｖ）の直接排泄では、腎臓でグルタミン酸からアンモニアが生成され尿中に直接排泄される（非特許文献１）。

【0004】

これら複数の系が働くことにより、たとえアンモニア除去系の一部に軽度な障害が生じたとしても、血中のアンモニアは低濃度（１０～７０μｇ／ｄＬ程度）に保たれるようになっている。一方、肝硬変や肝がん、劇症肝炎などの重篤な肝臓疾患や先天性の尿素回路酵素欠損症など、この系に重度な障害を生じた場合は、アンモニアの除去が不十分となり、血中のアンモニアが高濃度（高アンモニア血症）になる。高アンモニア血症が進めば、中枢神経系の機能を阻害して、意識障害を主とした精神神経症状を呈するほか、重篤な場合は昏睡や死に至る。

【0005】

そこで、血中のアンモニアが高濃度となる事態を避けるべく、血中アンモニア濃度を低下させる技術が研究開発されており、例えば、特許文献１には、コラーゲンペプチドを含有する、血中アンモニア濃度を低下させる飲食物または経口投与用医薬組成物が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００９－１４９５４１号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｓ．Ｔｅｒａｄａ、福岡大学理学部機能生物化学研究室、講義資料、代謝マップ、アミノ酸の代謝、尿素回路、最終更新日 2006/6/3、[online]、［令和２年６月１２日検索］、インターネット<URL: http://133.100.212.50/~bc1/Biochem/ureacycl.htm>

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、未だに、安全で、かつ効果的に血中アンモニア濃度を低下させる技術は十分に供給されている状況とはいえない。本発明は、係る課題を解決するためになされたものであって、安全かつ効果的に、血中アンモニア濃度を低下させる技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、鋭意研究の結果、クロストリジウム・ブチリカムおよび１－ケストースが、血中アンモニア濃度を低下させることを見出した。そこで、係る知見に基づいて、下記の各発明を完成した。

【0010】

（１）本発明に係る血中アンモニア濃度を低下させる剤（以下、「血中アンモニア濃度の低下剤」あるいは「本剤」という場合がある。）の第１の態様は、クロストリジウム・ブチリカムを有効成分とする。

【0011】

（２）本発明に係る血中アンモニア濃度の低下剤の第２の態様は、１－ケストースを有効成分とする。

【0012】

（３）本発明に係る血中アンモニア濃度の低下剤の第３の態様は、クロストリジウム・ブチリカムおよび１－ケストースを有効成分とする。

【0013】

（４）本発明に係る血中アンモニア濃度の低下剤は、高アンモニア血症の予防または改善に用いることができる。

【0014】

（５）本発明に係る血中アンモニア濃度の低下剤は、肝性脳症の予防または改善に用いることができる。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、血中アンモニア濃度を低下させることができる。

【0016】

クロストリジウム・ブチリカムは、嫌気性のグラム陽性桿菌であり、芽胞を形成する。整腸剤や飼料添加物として広く市販されており、人や家畜などの哺乳動物に長期間にわたって摂取されてきた経験があることから、安全性は高い。よって、本発明によれば、安全に、血中アンモニア濃度を低下させることができる。

【0017】

また、クロストリジウム・ブチリカムは、芽胞の状態では、熱や酸など様々な外的環境に対して高い抵抗性を有する。また、乾燥させて粉末の形態に加工することができ、強いにおいや味を呈さない。これらのことから、クロストリジウム・ブチリカムは、そのまま、あるいは様々な食品や医薬品、飼料等に容易に配合して、日常的に簡便に摂取することができる。したがって、本発明によれば、安全性が高く、そのまま、あるいは様々な食品や医薬品、飼料等に容易に配合して日常的に簡便に摂取することができる、血中アンモニア濃度の低下剤を得ることができる。

【0018】

１－ケストースは、１分子のグルコースと２分子のフルクトースからなる三糖類のオリゴ糖である。１－ケストースは、タマネギやニンニク、大麦、ライ麦などの野菜や穀物にも含まれていて、古来より食経験を有することや、変異原性試験、急性毒性試験、亜慢性毒性試験および慢性毒性試験のいずれにおいても毒性が認められていないことから、安全性は高い。よって、本発明によれば、安全に、血中アンモニア濃度を低下させることができる。

【0019】

また、１－ケストースは、砂糖と同等の高い溶解性や耐熱性を有し、甘味度は砂糖の３分の１程度で、砂糖に似た良好な甘味を呈する。このことから、そのまま、あるいは甘味料等の調味料として、日常的に簡便に摂取することができるほか、様々な食品や医薬品、飼料等に容易に配合することができる。したがって、本発明によれば、安全性が高く、そのまま、あるいは様々な食品や医薬品、飼料等に容易に配合して日常的に簡便に摂取することができる、血中アンモニア濃度の低下剤を得ることができる。

【0020】

高アンモニア血症は、アンモニアの血中濃度が基準値（１５～７０μｇ／ｄＬ）を逸脱して高値となった状態をいう。高アンモニア血症は、肝障害や薬物、感染症などによりアンモニア除去系に重度な障害が生じた場合に起こり、進行すれば、様々な意識障害を呈し最悪の場合は死に至ることもある。本発明によれば、血中アンモニア濃度を低下させることにより、高アンモニア血症の予防または改善に寄与することができる。

【0021】

肝性脳症は、重度の肝機能障害に伴って、精神神経症状（睡眠覚醒リズムの障害、記銘力や見当識の障害、異常言動、うつ状態、傾眠、興奮・せん妄状態、昏睡、てんかん発作、羽ばたき振戦）、ミオクローヌス、筋固縮など）を呈する状態をいう。肝性脳症の主な原因として、肝臓の機能低下により上述の（ｉ）や（ｉｉｉ）といったアンモニア除去系が機能不全に陥り、高濃度のアンモニアが脳に達して脳機能を低下させることが挙げられる。本発明によれば、血中アンモニア濃度を低下させることにより、肝性脳症の予防または改善に寄与することができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】クロストリジウム・ブチリカムおよび／または１－ケストースを摂取させたマウスにおける、血清アンモニア濃度を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、本発明について詳細に説明する。本発明に係る血中アンモニア濃度の低下剤には、以下１～３の態様がある；
第１の態様：クロストリジウム・ブチリカムを有効成分とする。
第２の態様：１－ケストースを有効成分とする。
第３の態様：クロストリジウム・ブチリカムおよび１－ケストースを有効成分とする。

【0024】

「血中アンモニア濃度」とは、血液中のアンモニアの濃度をいう。血中アンモニア濃度は公知の測定方法（直接比色法、ドライケミストリー法、酵素法（ＧＩＤＨ－ＵＶ法）、酵素法（ＮＡＤＳ－ＵＶ法）、酵素サイクリング法など）に従って測定することができる。測定にあたっては、被験者から血液を採取し、測定方法に応じて、全血のまま、あるいは血漿または血清を調製して検体とする。簡便には、上記測定方法の原理に基づく市販の測定キットや測定試薬を用いて測定することができる。

【0025】

クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）は、市販のものを用いてもよく、カルチャーコレクションに寄託されたものを用いてもよい。市販のものとしては、例えば、ミヤリサン製薬（株）から市販されている生菌剤（商品名：ミヤＢＭ（登録商標）細粒、ミヤＢＭ（登録商標）錠、新ミヤリサンアイジ（登録商標）整腸薬、ミヤリサン（登録商標）錠、強ミヤリサン（登録商標）錠）を例示することができる。

【0026】

また、カルチャーコレクションに寄託されたものとしては、例えば、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ５８８（ＦＥＲＭ ＢＰ－２７８９）、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ５８５（ＦＥＲＭ ＢＰ－６８１５）、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ５９５（ＦＥＲＭ ＢＰ－６８１６）、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ６３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－６８１７）、クロストリジウム・ブチリカム・ＮＩＰ１０２０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５７９４）、クロストリジウム・ブチリカム・ＮＩＰ１０２１（ＦＥＲＭ ＢＰ－５７９５）、クロストリジウム・ブチリカム（ＦＥＲＭ Ｐ－１１８６８）、クロストリジウム・ブチリカム（ＦＥＲＭ Ｐ－１１８６９）、クロストリジウム・ブチリカム（ＦＥＲＭ Ｐ－１１８７０）、クロストリジウム・ブチリカム（ＡＴＣＣ８５９）、クロストリジウム・ブチリカム（ＮＢＲＣ３３１５）、クロストリジウム・ブチリカム（ＡＴＣＣ８６０）、クロストリジウム・ブチリカム（ＡＴＣＣ１９３９８）を例示することができる。

【0027】

本発明において、クロストリジウム・ブチリカムは、１種のみが単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。また、クロストリジウム・ブチリカムは、これを培養した培養液、当該培養液を遠心分離して得られるクロストリジウム・ブチリカムを含む残渣、あるいはこれらの乾燥物の形態で用いてもよい。

【0028】

クロストリジウム・ブチリカムの培養は、公知の培養、例えば、特願平０８－２５２０８８号に開示された方法により行うことができる。培養条件は、用いる微生物株に応じて適宜設定することができるが、例えば、クロストリジウム・ブチリカムを培地（１．０（ｗ／ｖ）％ペプトン、１．０（ｗ／ｖ）％ 酵母エキス、１．０（ｗ／ｖ）％ コーンスターチおよび０．２（ｗ／ｖ）％ 沈降炭酸カルシウム、ｐＨ６．５～７．５)に１０^５～１０^６個／ｍＬになるように接種し、３７℃にて４８時間静置培養すればよい。なお、クロストリジウム・ブチリカムは偏性嫌気性であるため、通気しない、または窒素もしくは炭酸ガスを通気しながら、または培地中に還元剤を加えることにより酸化還元電位を下げるなどによって嫌気的条件下培養されることが好ましい。これにより得られた培養液を遠心分離して沈殿物を回収すれば、クロストリジウム・ブチリカムを含む培養液残渣が得られる。また、この残渣を風乾または減圧乾燥により処理すれば、乾燥物を得ることができる。風乾の条件としては、０～８０℃、好ましくは１０～２０℃で、１～２４時間、好ましくは５～１８時間を例示することができる。減圧乾燥の条件としては、０～８０℃、好ましくは１０～２０℃、０．０５～５００Ｔｏｒｒ、好ましくは１～１００Ｔｏｒｒで、１～２４時間、好ましくは２～１５時間を例示することができる。

【0029】

１－ケストースは、スクロースを基質として、特開昭５８－２０１９８０号公報に開示されているような酵素による酵素反応を行うことにより作ることができる。具体的には、まず、β－フルクトフラノシダーゼをスクロース溶液に添加し、３７℃～５０℃で２０時間程度静置することにより酵素反応を行って、１－ケストースを生成させる。生成した１－ケストースを含有する酵素反応液を、特開２０００－２３２８７８号公報で開示されているようなクロマト分離法に供することにより、１－ケストースと他の糖（ブドウ糖、果糖、ショ糖、４糖以上のオリゴ糖）とを分離して精製する。これにより得られた、高純度で１－ケストースを含有する溶液を濃縮した後、特公平６－７００７５号公報に開示されているような結晶化法で結晶化することにより、１－ケストースの結晶、あるいは、純度９８質量％以上で１－ケストースを含有する組成物を得ることができる。

【0030】

また、１－ケストースは市販のフラクトオリゴ糖に含まれているため、これをそのまま、あるいは、フラクトオリゴ糖から上述の方法により１－ケストースを分離精製して用いてもよい。すなわち、本発明の１－ケストースとして、１－ケストースを含有するオリゴ糖などの１－ケストース含有組成物を用いてもよい。１－ケストース含有組成物を用いる場合、１－ケストースの純度は８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。なお、本発明において、１－ケストースの「純度」とは、糖の総質量を１００とした場合の、１－ケストースの質量％をいう。

【0031】

本発明の剤は、ヒトまたは動物に経口摂取させることにより使用することができるほか、有効成分を経腸栄養剤に添加して、これを、胃や小腸などの消化管に挿入したチューブを経由して経腸栄養法により投与する方法で使用してもよい。

【0032】

本発明の剤は、有効成分であるクロストリジウム・ブチリカムおよび／または１－ケストースのみからなるもののほか、医薬品や医薬部外品、食品添加剤、サプリメント、食品組成物（飲料、調味料、パン、菓子、惣菜、健康食品、乳幼児食品、その他加工食品など）、飼料、飼料添加物などの形態で用いることができる。

【0033】

本発明の剤を医薬品や食品添加剤、サプリメントの形態とする場合、その剤型としては、例えば、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、顆粒剤、ドライシロップ剤、液剤、シロップ剤、ドロップ剤、ドリンク剤等の固形または液状の剤型を挙げることができる。各剤型は、当業者に公知の方法で製造することができ、例えば、散剤（第２の態様）であれば、１－ケストース８００ｇおよび乳糖２００ｇをよく混合した後、９０％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させる。続いて、湿潤粉末を造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥し、その後、整粒して、適当な細かさの散剤１０００ｇ（１－ケストース含有量８００ｍｇ／１ｇ）を得ることができる。また、錠剤であれば、１－ケストース３００ｇ、粉末還元水飴３８０ｇ、コメデンプン１８０ｇおよびデキストリン１００ｇをよく混合した後、９０（ｖ／ｖ）％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させ、湿潤粉末を得る。この湿潤粉末を押し出し造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥して顆粒を得る。この顆粒を８５０μｍの篩を用いて整粒した後、顆粒４７０ｇに対してショ糖脂肪酸エステル５０ｇを添加して混合する。これを、ロータリー打錠機（６Ｂ－２、菊水製作所）に供して打錠することにより、直径８ｍｍ、重量２００ｍｇの錠剤５０００錠（１－ケストース含有量６０ｍｇ／１錠）を得ることができる。

【0034】

また、本発明の剤を食品組成物の形態とする場合は、通常の飲食物の製造過程で、クロストリジウム・ブチリカムおよび／または１－ケストースを添加して製造すればよい。クロストリジウム・ブチリカムは芽胞形成性で、高い耐熱性や耐酸性を有する。また、乾燥させて粉末の形態に加工することができ、強いにおいや味を呈さない。１－ケストースも耐熱性が高く、砂糖に近い味質・物性・加工性を有する。このことから、クロストリジウム・ブチリカムおよび／または１－ケストースは、各種飲食物の製造過程において、砂糖などの調味料と同様に扱って各種飲食物を製造することができる。

【0035】

本剤をヒトや動物に対して用いる場合の有効成分の摂取量（投与量）としては、例えば、１－ケストースであれば、１日あたり０．０４ｇ／ｋｇ体重以上を挙げることができる。また、クロストリジウム・ブチリカムであれば、その培養液、培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣、あるいは残渣の乾燥物を、固形分換算で、１日あたり２０～３６０ｍｇ／成人１人、４０～２００ｍｇ／成人１人、または６０～１２０ｍｇ／成人１人を例示することができる。係る摂取量は、１日１回に限らず、複数回に分割して摂取してもよい。

【0036】

以下、本発明について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

【実施例0037】

本実施例においては、「１－ケストース」として、純度９８質量％以上で１－ケストースを含有する組成物（物産フードサイエンス社）を用いた。また、「クロストリジウム・ブチリカム」として、受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ－２７８９であるクロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ５８８を含有する粉末（菌数：１０^９～１０^１０／ｇ）を用いた。

【0038】

メラノコルチン４型受容体欠損マウス（MC4R-KOマウス）は、テキサス大学サウスウエスタン・メディカル・センター（米国テキサス州）のJoel K. Elmquist博士より譲渡された。MC4R-KOマウスは、C57BL/6Jマウスを遺伝的背景として、中枢性摂食調節に重要な役割を果たすメラノコルチン４型受容体（MC4R）を欠くマウスで、高脂肪食を摂取させると非アルコール性脂肪肝炎を発症する（M. Itoh et al., The American Journal of Pathology, Vol. 179, No. 5, 2454-2463, November 2011）。

【0039】

８週齢の雄のMC4R-KOマウスを８匹ずつＩ～ＩＶの４群に分けた。各群のマウスを１匹ずつ個別の檻に入れ、温度２２～２６℃、湿度４０～６０％、明期１２時間および暗期１２時間、自由飲水、ならびに自由摂食の環境下で１２週間飼育した。飼料は、下記のとおり、高脂肪食（D12492；524kcal/100g, 総エネルギーに占める脂肪の割合が６０％; Research Diets Inc., ニュージーランド）、もしくは、高脂肪食にクロストリジウム・ブチリカムおよび／または１－ケストースを添加したものを与えた。
Ｉ群：高脂肪食
ＩＩ群：高脂肪食にクロストリジウム・ブチリカムを添加したもの（クロストリジウム・ブチリカムの濃度 ２．０ｇ／飼料１００ｇ）
ＩＩＩ群：高脂肪食に１－ケストースを添加したもの（１－ケストースの濃度 ２．５ｇ／飼料１００ｇ）
ＩＶ群：高脂肪食にクロストリジウム・ブチリカムおよび１－ケストースを添加したもの（クロストリジウム・ブチリカムの濃度 ２．０ｇ／飼料１００ｇ、１－ケストースの濃度 ２．５ｇ／飼料１００ｇ）

【0040】

飼料の摂取量に基づき、１日のクロストリジウム・ブチリカムおよび１－ケストースの摂取量について、各群の平均値を算出した。また、飼育期間終了後、採血して血清を調製し、酵素サイクリング法に基づく血中アンモニア濃度測定キット「シカリキッドＮＨ_３」（関東化学）によりアンモニア濃度を測定した。測定したアンモニア濃度について、群毎に平均値および標準偏差を算出した。飼料摂取量、クロストリジウム・ブチリカム摂取量、１－ケストース摂取量、およびアンモニア濃度の平均値を表１に示す。また、アンモニア濃度の測定結果を表２に示す。また、アンモニア濃度の平均値の棒グラフを図１に示す。

【表1】

【0041】

【表2】

【0042】

表１、表２および図１に示すように、Ｉ群と比較して、ＩＩ群、ＩＩＩ群およびＩＶ群では血清アンモニア濃度が低かった。特に、ＩＶ群ではＩ群よりも顕著に血清アンモニア濃度が低かった。この結果から、クロストリジウム・ブチリカムおよび１－ケストースは、血中アンモニア濃度を低下させることが明らかになった。

【図1】