(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022075614
(43)【公開日】2022-05-18
(54)【発明の名称】遊離ＡＩＭに特異的なモノクローナル抗体およびその利用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20220511BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20220511BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20220511BHJP
C07K 17/00 20060101ALI20220511BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
G01N33/531 A
C07K16/18 ZNA
C07K17/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021180177
(22)【出願日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】P 2020185995
(32)【優先日】2020-11-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】511288304
【氏名又は名称】宮崎 徹
(71)【出願人】
【識別番号】000120456
【氏名又は名称】栄研化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】特許業務法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】宮崎 徹
(72)【発明者】
【氏名】浅尾 麻由
(72)【発明者】
【氏名】稲森 彩香
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA60
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】 尿検体を含む様々な検体中の遊離ＡＩＭを特異的、高感度、かつ汎用的に検出しうるモノクローナル抗体を提供すること。
【解決手段】 ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインのＣ末端側の領域からＳＲＣＲ３ドメインのＮ末端側の領域を認識するモノクローナル抗体を用いることにより、尿検体を含む様々な検体中の遊離ＡＩＭを特異的、高感度、かつ汎用的に検出することが可能であることを見出だした。
【選択図】 なし
【解決手段】 ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインのＣ末端側の領域からＳＲＣＲ３ドメインのＮ末端側の領域を認識するモノクローナル抗体を用いることにより、尿検体を含む様々な検体中の遊離ＡＩＭを特異的、高感度、かつ汎用的に検出することが可能であることを見出だした。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遊離ＡＩＭに特異的なモノクローナル抗体であって、ＡＩＭの１～２２９位からなるポリペプチドには結合せず、ＡＩＭの１～２５９位からなるポリペプチドに結合する遊離ＡＩＭに特異的なモノクローナル抗体を用いて遊離ＡＩＭを免疫学的に分析する方法。
【請求項2】
分析が免疫凝集法、酵素免疫測定法、ＲＩＡ法、ＣＬＩＡ法およびイムノクロマトグラフィー法のいずれかにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項3】
分析がサンドイッチ法で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項4】
分析が免疫凝集法で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項5】
血清、血漿、全血および尿から成る群から選択される生体試料中の遊離ＡＩＭを免疫学的に分析する請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
生体試料が尿である請求項５に記載の方法。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載の方法を用いた腎疾患の検査方法。
【請求項8】
遊離ＡＩＭに特異的なモノクローナル抗体であって、ＡＩＭの１～２２９位からなるポリペプチドには結合せず、ＡＩＭの１～２５９位からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体。
【請求項9】
試料中の遊離ＡＩＭを検出するための組成物であって、請求項８に記載のモノクローナル抗体を含む組成物。
【請求項10】
試料中の遊離ＡＩＭを検出するための固相であって、請求項８に記載のモノクローナル抗体が結合した固相。
【請求項11】
不溶性担体粒子である請求項１０に記載の固相。
【請求項12】
試料中の遊離ＡＩＭを免疫学的に分析するためのキットであって、請求項９に記載の組成物または請求項１０に記載の固相を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遊離ＡＩＭに特異的なモノクローナル抗体、当該モノクローナル抗体を利用した遊離ＡＩＭの免疫学的分析法、当該モノクローナル抗体を含む組成物、および当該組成物を含むキットに関する。
【背景技術】
【0002】
ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＣＤ５Ｌ、ａｐｉ６、Ｓｐαとも称する）は、組織マクロファージが特異的に産生する約５０ｋＤａの分泌型タンパク質として知られ（非特許文献１）、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症などさまざまな疾患に対し抑制的な効果をもち、幅広い疾患に対する新規治療薬となる可能性が明らかにされている。
【0003】
ＡＩＭの構造は、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインがタンデムに３つつながれた構造をしており、それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。
【0004】
ＡＩＭは、様々な分子と相互作用することが報告されている。その結合パートナーとして様々な分子が報告されている。例えば、ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ（ＬＴＡ）やｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）などの細菌・菌類の病原体関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ：ＰＡＭＰｓ）と結合し、細菌を凝集させる能力を持つことが知られている（非特許文献２）。また、体内にはＡＩＭを細胞表面に結合する、あるいは細胞内に取り込む細胞も多く存在し、産生細胞であるマクロファージ自身への取り込みのほか、脂肪細胞ではスカベンジャー受容体ＣＤ３６を介してエンドサイトーシスにより取り込まれ、脂肪分解を誘導することが報告されている（非特許文献３）。
【0005】
また、ＡＩＭは、これまで、血液中ではＩｇＭに結合することが知られている。近年では、ＡＩＭが尿中へ排出されずに血液中で安定的に存在するためにＡＩＭとＩｇＭの結合が重要であること、血清検体中においてＡＩＭの多くはＩｇＭ結合型ＡＩＭとして存在しており、単量体で存在することがほとんどないことが報告されている（非特許文献４、５）。
【0006】
ＡＩＭは、５量体構造のＩｇＭと結合することによって尿中に排泄されなくなり、結果として約５μｇ／ｍＬという高い血中濃度を維持しているが、その機能は不活性化している。そして、ＡＩＭは疾患発症時にＩｇＭから解離、活性化して、疾患の治癒を促進することが明らかになっている（非特許文献４）。
【0007】
血中遊離ＡＩＭは特に、肝疾患や急性腎障害の診断に用いられることが報告されている（特許文献１および特許文献２）。
【0008】
血中でＩｇＭから解離した遊離ＡＩＭは、糸球体の濾過膜を通過し、近位尿細管へと移行する。遊離ＡＩＭは尿細管の中の死細胞塊に付着し、周囲の細胞の貪食を促進することで急性腎障害の治癒に貢献し、この時、遊離ＡＩＭは尿中に排出される。実際、急性腎障害患者では、血中遊離ＡＩＭおよび尿中ＡＩＭ濃度の顕著な増大が認められることが記載されている（非特許文献６）。
【0009】
ところで、これまでの報告では、ＩｇＭ結合型ＡＩＭは糸球体の濾過膜を通過できないことから、尿中には遊離ＡＩＭのみが存在すると考えられていた。このため、尿中ではＩｇＭ結合型ＡＩＭ、遊離ＡＩＭのいずれにかかわらずＡＩＭを測定できればよく、ＩｇＭ結合型ＡＩＭにも交差反応を示す測定法（ＩｇＭ結合型ＡＩＭ、遊離ＡＩＭ両方に反応する測定法）で尿検体を測定しても、遊離ＡＩＭを定量できると考えられてきた。
【0010】
このため、遊離ＡＩＭを特異的に測定する方法や、遊離ＡＩＭに特異的な抗体の報告例はわずかである。例えば、特許文献３では、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインを認識するとされるモノクローナル抗体（Ｎｏ．１２抗体）が、ＳＲＣＲ３ドメインを認識するとされる特定のモノクローナル抗体との組合せで、ＮＡＳＨ－ＨＣＣ患者血清中の遊離ＡＩＭを特異的に検出できるとされている（図１Ｃ、Ｄ）。しかしながら、Ｎｏ．１２抗体が様々な抗体との組合せで汎用的に遊離ＡＩＭを特異的に認識できるか否かは不明であり、また、尿検体中で遊離ＡＩＭを特異的に検出できることは示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】国際公開第２０１７／０２２３１５号
【特許文献2】国際公開第２０１７／５３８５３３号
【特許文献3】国際公開第２０２０／１５８８５６号
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８９：４１３－４２２， １９９９
【非特許文献2】Ｓａｒｒｉａｓ ＭＲ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：３５３９１－３５３９８， ２００５
【非特許文献3】Ｋｕｒｏｋａｗａ Ｊ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ １１：４７９－４９２， ２０１０
【非特許文献4】宮崎ら, 日本臨牀７１巻９号（２０１３－９）， １６８１頁－１６８９頁
【非特許文献5】Ａｒａｉ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， ＳｃｉｅｎｃｅＤｉｒｅｃｔ ３（４）：１１８７－１１９８， ２０１３
【非特許文献6】北田研人ら， 日腎会誌 ５８（８）：１２３４－１２３７， ２０１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、尿検体を含む様々な検体中の遊離ＡＩＭを特異的、高感度、かつ汎用的に分析しうるモノクローナル抗体を提供することにある。本発明のさらなる目的は、当該モノクローナル抗体を用いた遊離ＡＩＭの免疫学的分析方法、並びに、当該モノクローナル抗体を含む組成物およびキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインのＣ末端側の領域からＳＲＣＲ３ドメインのＮ末端側の領域を認識するモノクローナル抗体が遊離ＡＩＭに特異的に結合することを見出した。当該モノクローナル抗体は、血清検体のみならず、尿検体中の遊離ＡＩＭを特異的に検出することができる。また、当該モノクローナル抗体は、免疫凝集法および酵素免疫測定法、特に、サンドイッチＥＬＩＳＡ法のみならず、ＢＬＥＩＡ（登録商標）法においても優れた検出感度と特異性を有し、幅広い免疫学的検出法に利用可能であった。さらに、これら免疫学的検出法においては、ＡＩＭを認識する様々な抗体（例えば、ポリクローナル抗体、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメインのＮ末端側の領域を認識する抗体など）との組合せが可能であった。以上から、本発明者らは、当該モノクローナル抗体を用いれば、尿検体を含む様々な検体中の遊離ＡＩＭを特異的、高感度、かつ汎用的に検出することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0015】
本発明は、より詳しくは、以下を提供するものである。
【0016】
［１］ 遊離ＡＩＭに特異的なモノクローナル抗体であって、ＡＩＭの１～２２９位からなるポリペプチドには結合せず、ＡＩＭの１～２５９位からなるポリペプチドに結合する遊離ＡＩＭに特異的なモノクローナル抗体を用いて遊離ＡＩＭを免疫学的に分析する方法。
【0017】
［２］ 分析が免疫凝集法、酵素免疫測定法、ＲＩＡ法、ＣＬＩＡ法およびイムノクロマトグラフィー法のいずれかにより行われる［１］に記載の方法。
【0018】
［３］ 分析がサンドイッチ法で行われる［１］に記載の方法。
【0019】
［４］ 分析が免疫凝集法で行われる［１］に記載の方法。
【0020】
［５］ 血清、血漿、全血および尿から成る群から選択される生体試料中の遊離ＡＩＭを免疫学的に分析する［１］～［４］のいずれか１に記載の方法。
【0021】
［６］ 生体試料が尿である［５］に記載の方法。
【0022】
［７］ ［１］～［６］のいずれか１に記載の方法を用いた腎疾患の検査方法。
【0023】
［８］ 遊離ＡＩＭに特異的なモノクローナル抗体であって、ＡＩＭの１～２２９位からなるポリペプチドには結合せず、ＡＩＭの１～２５９位からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体。
【0024】
［９］ 試料中の遊離ＡＩＭを検出するための組成物であって、［８］に記載のモノクローナル抗体を含む組成物。
【0025】
［１０］ 試料中の遊離ＡＩＭを検出するための固相であって、［８］に記載のモノクローナル抗体が結合した固相。
【0026】
［１１］ 試料中の遊離ＡＩＭを免疫学的に分析するためのキットであって、［９］に記載の組成物または［１０］に記載の固相を含むキット。
【発明の効果】
【0027】
本発明により、様々な検体における遊離ＡＩＭを特異的に分析することが可能となった。本発明によれば、例えば、腎疾患によって尿中に排出される遊離ＡＩＭを、従来法よりも正確に測定できる。本発明の抗体によって、初めて、尿中に、遊離ＡＩＭの他にＩｇＭ結合型ＡＩＭが存在することが見出されたが、このＩｇＭ結合型ＡＩＭは、腎障害以外の疾患（尿路からの出血等）に由来する可能性がある。従って、尿中の遊離ＡＩＭを特異的に認識可能な本発明のモノクローナル抗体を利用した免疫学的測定法により、腎障害以外の疾患（尿路からの出血等）と区別して、腎疾患（特に、急性腎障害）を正確に診断または診断を補助することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画したｒＡＩＭを特定のモノクローナル抗体の組み合わせ（試薬１）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により検出した結果を示す図である。
【図2】ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した血清中のＡＩＭを、様々な抗体の組み合わせ（試薬１～５）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により検出した結果を示す図である。
【図3A】抗体クローン（クローン２、クローン８、クローン９）のエピトープマッピングの結果を示す図である。
【図3B】抗体クローン（クローン２４）のエピトープマッピングの結果を示す図である。
【図4】尿検体中のＡＩＭを特定の抗体の組み合わせ（試薬１および２）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により検出した結果を示す図である。
【図5】血清検体中のＡＩＭを、特定の抗体の組み合わせ（試薬３、試薬７）を用いたＢＬＥＩＡ法、および特定の抗体の組み合わせ（試薬１）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により各々検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明は、遊離ＡＩＭに特異的なモノクローナル抗体を提供する。
【0030】
本発明における「ＡＩＭ」は、組織マクロファージにより産生される、約４０～５０ｋＤａの分泌型の血中タンパク質である。ヒト由来のＡＩＭの典型的なアミノ酸配列を配列番号：１に示す。ヒト由来のＡＩＭは、システインを多く含む３つのＳＲＣＲドメインを含んでおり、ＳＲＣＲ１ドメインは、配列番号：１の２４～１２４位に相当し、ＳＲＣＲ２ドメインは、配列番号：１の１３８～２３８位に相当し、ＳＲＣＲ３ドメインは、配列番号：１の２４４～３４６位に相当する。「遊離ＡＩＭ」とは、ＩｇＭと結合していない状態で存在するＡＩＭを意味し、本発明においては、ＩｇＭとの複合体の状態で存在する複合体ＡＩＭ（以下、ＩｇＭ結合型ＡＩＭともいう）との対比で用いられる。
【0031】
本発明において「遊離ＡＩＭに特異的」とは、実質的にＩｇＭ結合型ＡＩＭと交差反応しない、すなわち遊離ＡＩＭに対する反応性に対し、ＩｇＭ結合型ＡＩＭに対する反応性が十分に低いことを意味する。十分に低い、とは、遊離ＡＩＭとの反応性に対するＩｇＭ結合型ＡＩＭとの反応性の比が２０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは６％以下、さらに好ましくは５％以下である。これらＡＩＭへの反応性は、例えば、評価対象となるモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により評価することができる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法において評価対象となるモノクローナル抗体と組み合わせる抗体としては、ＡＩＭを認識できる限り特に制限はなく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。組み合わせるモノクローナル抗体は、評価対象となるモノクローナル抗体とＡＩＭへの結合において競合しないこと（すなわち、異なるエピトープを認識すること）が好ましい。
【0032】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、例えば、実施例１に記載の方法に準じて行うことができる。具体的には、まず、評価対象となるモノクローナル抗体を固相化した固相化プレートを作製し、固相化プレートに、試料（遊離ＡＩＭを含む試料またはＩｇＭ結合型ＡＩＭを含む試料）を添加して反応させる。次いで、洗浄後ポリクローナル抗ＡＩＭ抗体を添加して反応、洗浄後、さらに、標識した二次抗体を添加して反応、洗浄後、最後に、標識のシグナル強度を測定する。標識として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いた場合、発色基質を添加後、マイクロプレートリーダーを用いて、シグナルを測定することができる。測定の結果、例えば、遊離ＡＩＭへの反応性が１００でＩｇＭ結合型ＡＩＭへの反応性が４の場合、評価対象となるモノクローナル抗体はＩｇＭ結合型ＡＩＭへの反応性が遊離ＡＩＭへの反応性の４％であるため、遊離ＡＩＭ特異的抗体と判定することができる。
【0033】
本発明のモノクローナル抗体の好ましい態様は、ＡＩＭの１～２２９位からなるポリペプチドには結合せず、ＡＩＭの１～２５９位からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体である。当該モノクローナル抗体の認識部位は、典型的には、ＡＩＭのＳＲＣＲ２ドメイン（１３８～２３８位）のＣ末端側の領域からＳＲＣＲ３ドメイン（２４４～３４６位）のＮ末端側の領域である。特に好ましいモノクローナル抗体は、ＡＩＭの２３０～２５９位の領域、より好ましくは２３０～２４４位の領域を認識するモノクローナル抗体であり、具体例としては、本願実施例に記載のクローン２、クローン２４が挙げられる。
【0034】
本発明のモノクローナル抗体の作製においては、一般的に知られている方法で行えばよい。例えば、本願実施例に記載のように、まず、組換えＡＩＭ（ｒＡＩＭ）を免疫原としてハイブリドーマを作製し、その中から、当該ＡＩＭに対して高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、さらに、選抜したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のエピトープ解析を行って、上記特徴を有するモノクローナル抗体を産生するクローンを同定すればよい。一方、免疫原として、ＡＩＭの特定の領域（例えば、ＳＲＣＲ２ドメインのＣ末端側の領域からＳＲＣＲ３ドメインのＮ末端側の領域）の部分ペプチドを用いてもよい。
【0035】
ハイブリドーマ法としては、代表的には、ケーラーおよびミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（標的タンパク質、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞など）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダ、アルパカ、ニワトリ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞およびミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、抗原に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。抗原に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【0036】
また、目的とするモノクローナル抗体をコードするＤＮＡが取得できれば、組換えＤＮＡ法によって作製することもできる。この方法は、上記抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞などからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９９７、ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ２０００， ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５， １９９０）。抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（国際公開第９４／１１５２３号参照）。組換え抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内または培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタなど）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【0037】
本発明のモノクローナル抗体は、完全な抗体のみならず、抗原を認識しうる限り、抗体断片であってもよい。抗体断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0038】
本発明は、また、試料中の遊離ＡＩＭを免疫学的に分析する方法であって、上記モノクローナル抗体を用いる方法を提供する。
【0039】
本発明の方法に用いられる「試料」としては、ＡＩＭ（遊離ＡＩＭ、ＩｇＭ結合型ＡＩＭ）が存在し得る試料である限り特に制限はない。組織または体液を用いてもよく、組織としては、卵巣、子宮、乳房、甲状腺、脳、食道、舌、肺、膵臓、胃、小腸、十二指腸、大腸、膀胱、腎臓、肝臓、前立腺、胆嚢、咽頭、筋肉、骨および皮膚などが挙げられるがこれらに限定されない。体液としては、血清、血漿または全血などの血液、リンパ液、組織液、体腔液、消化液、鼻汁、尿などが挙げられるが、遊離ＡＩＭに関連する疾患の診断の補助を目的とする場合においては、一般的には、採取の容易性から、診断対象（好ましくはヒト）から採取された、血清、血漿、または全血などの血液、尿などの体液試料が用いられる。
【0040】
本発明の方法における「分析」は、遊離ＡＩＭの定量、遊離ＡＩＭの存在の検出、遊離ＡＩＭの局在の解析など、遊離ＡＩＭを対象とした様々な分析が含まれる。
【0041】
遊離ＡＩＭを免疫学的に分析する方法は、試料中の遊離ＡＩＭと本発明の抗体を接触させ、抗原抗体反応を生じさせ、形成した免疫複合体に基づいて当該試料中の遊離ＡＩＭを検出または測定するものである。免疫学的に分析する方法としては、例えば、標識物質で標識された抗原または抗体を用いる標識イムノアッセイが挙げられ、免疫凝集法（ラテックス凝集法、金コロイド凝集法等）、標識として酵素を用いる酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、標識として放射性同位元素を用いるＲＩＡ法（放射免疫測定法）、標識として化学発光性化合物を用いるＣＬＩＡ法（化学発光免疫測定法）、電気化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法、及びイムノクロマトグラフィー法などのサンドイッチ法、ウェスタンブロット法、イムノブロット法などが挙げられるが、これらに制限されない。酵素免疫測定法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法）や生物発光酵素免疫測定法が挙げられ、生物発光酵素免疫測定法としては、例えば、ＢＬＥＩＡ法が挙げられる。免疫学的な測定は、非競合的測定法であっても、競合的測定法であってもよい。
【0042】
標識物質としては、抗体に結合させて検出できるものであれば特に制限はないが、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、βガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）、ホタルルシフェラーゼなどの酵素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光色素、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）やフィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）などの蛍光蛋白質、１２５Ｉなどの放射性同位元素、ラテックス粒子、金コロイド粒子、アビジン、ビオチンなどが挙げられる。
【0043】
標識物質として酵素を用いた場合には、基質として、過酸化物および／または発色基質（例えば、過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼによる酸化触媒反応により発色する３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））、蛍光基質、あるいは化学発光基質などを添加することにより、基質に応じて種々の検出を行うことができる。
【0044】
標識物質を結合させた本発明のモノクローナル抗体を用いて遊離ＡＩＭを直接的に検出する方法以外に、本発明のモノクローナル抗体には標識物質を結合せず、標識物質が結合した二次抗体などを利用して間接的に検出する方法を利用することもできる。また、後述するサンドイッチ法においては、捕捉用抗体として本発明のモノクローナル抗体を用い、検出用抗体として他の抗体を用いる場合には、当該他の抗体を標識して用いることができる。当該他の抗体を標識しない場合には、同様に、標識された二次抗体などを利用することができる。ここで「二次抗体」とは、抗原に直接結合する抗体（一次抗体）に対して反応性を示す抗体である。例えば、一次抗体をマウス抗体とした場合には、二次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体を使用することができる。ウサギ、ヤギ、マウスなどの様々な生物種に由来する抗体に対して、使用可能な標識二次抗体が市販されており、一次抗体の由来する生物種に応じて、適切な二次抗体を選択して使用することができる。二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡなどを用いることも可能である。
【0045】
抗体と標識物質との結合には、ビオチン－アビジン系を利用することもできる。この方法においては、例えば、抗体をビオチン化し、これに、アビジン化した標識物質を作用させ、ビオチンとアビジンの相互作用を利用して、抗体に標識物質を結合させる。
【0046】
本発明の方法における遊離ＡＩＭの検出原理としては、高感度な検出システムを構築することができる点で、サンドイッチ法が好適である。サンドイッチ法においては、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法のように、固相化した捕捉用抗体で検出対象物質を捕捉し、それを標識物質が結合した検出用抗体に認識させ、B／F分離（洗浄）後、標識物質の種類に応じた検出を行う。また、イムノクロマトグラフィー法のように、標識物質が結合した検出用抗体で検出対象物質を認識させ、B／F分離を行いつつ、固相化した捕捉用抗体で検出対象物質を捕捉し、標識物質の種類に応じた検出を行うようにしてもよい。固相としては、例えば、プラスチックプレートなどのプレート、ニトロセルロースなどの繊維状物質、磁性粒子やラテックス粒子などの粒子を用いることができる。
【0047】
捕捉用抗体は固相に直接固定してもよいが、間接的に固定してもよい。例えば、捕捉用抗体に結合する物質を固相に固定し、当該物質に捕捉用抗体を結合させることにより、補足用抗体を固相に間接的に固定することができる。捕捉用抗体に結合する物質としては、例えば、上記の二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡなどが挙げられるが、これらに制限されない。また、捕捉用抗体がビオチン化されている場合には、アビジン化した固相を利用することができる。
【0048】
サンドイッチ法においては、抗原捕捉用抗体および検出用抗体の少なくとも一方に、本発明のモノクローナル抗体を用いる。他の一方の抗体は、ＡＩＭに結合し得る抗体（抗ＡＩＭ抗体）であればよく、本発明のモノクローナル抗体以外の抗体を用いることもできる。他の一方の抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明のモノクローナル抗体と組み合わせるモノクローナル抗体は、ＡＩＭとの結合において競合しないこと（すなわち、異なるエピトープを認識すること）が好ましい。実際、本願実施例においては、本発明のモノクローナル抗体（クローン２、クローン２４）とＡＩＭ上の他の領域を認識するモノクローナル抗体（クローン８、クローン９）との組み合わせでも、本発明のモノクローナル抗体（クローン２、クローン２４）とポリクローナル抗体との組み合わせでも、遊離ＡＩＭを特異的かつ高感度で検出することに成功している。
【0049】
得られた測定値からの遊離ＡＩＭの定量は、一般的に、標準検体による測定値との比較により行うことができる。この場合、例えば、標準検体による測定値に基づいて作成された標準曲線上のどの位置に、実際の測定値が位置づけられるかを調べることにより、試料中の遊離ＡＩＭ量を求めることができる。
【0050】
本発明の方法における遊離ＡＩＭの分析方法としては、遊離ＡＩＭの検出前にB／F分離の工程が不要であり、簡便かつ迅速に遊離ＡＩＭの検出が可能である点で、免疫比ろう法、免疫比濁法等による免疫凝集法（例えば、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法等）が好適である。免疫凝集法は、液相中で、抗原に特異的な抗体が固定（結合）された不溶性担体粒子（固相）を用いる。当該不溶性担体粒子と抗原との免疫複合体の形成により不溶性担体粒子が凝集する性質を利用して、濁度の測定や目視、吸光度の測定により、不溶性担体粒子の凝集を検出する。不溶性担体粒子としては、金属や磁性粒子等を用いることができるが、ラテックス粒子が好ましく、一般に、ポリスチレンラテックスが用いられる。抗体は、固相の表面に公知の技術、例えば物理吸着または化学結合によって固定化することができる。
【0051】
免疫凝集法に用いられる、捕捉用抗体が固定された不溶性担体粒子としては、少なくとも２種以上の抗体を含むことが好ましく、１種の不溶性担体粒子には１種または２種以上のモノクローナル抗体が結合されていてもよい。本発明のモノクローナル抗体が固定されたラテックス粒子と、本発明のモノクローナル抗体以外のモノクローナル抗体が固定されたラテックス粒子との組み合わせが挙げられる。本発明のモノクローナル抗体と組み合わせるモノクローナル抗体は、ＡＩＭへの結合において競合しないこと（すなわち、異なるエピトープを認識すること）が好ましい。実際、本願実施例においては、本発明のモノクローナル抗体（クローン２）とＡＩＭ上の他の領域を認識するモノクローナル抗体（クローン８）との組み合わせで、遊離ＡＩＭを、サンドイッチＥＬＩＳＡ法と同程度に特異的かつ高感度で検出することに成功している。ラテックス粒子の凝集により遊離ＡＩＭを定量する場合には、例えば、光学装置による液相の吸光度を測定して、その変化（増加）を指標とすることができる。
【0052】
本発明の方法は、遊離ＡＩＭに関連する疾患の診断（罹患やそのリスクの評価）に利用することができる。「遊離ＡＩＭに関連する疾患」としては、遊離ＡＩＭをマーカーとしうる疾患であれば制限はない。好適な診断対象疾患としては、例えば、腎疾患（特に、急性腎障害）、感染症、炎症、動脈硬化、肥満関連炎症性疾患、COPD、癌、肝疾患、喘息、肺結核、変形性関節症、関節リウマチ、敗血症などが挙げられるが、これに制限されない。
【0053】
また、本発明は、試料中の遊離ＡＩＭを検出するための組成物であって、本発明のモノクローナル抗体を含む組成物を提供する。本発明の組成物に含まれるモノクローナル抗体は、上記の通り、標識物質が結合したものであってもよい。本発明の組成物においては、抗体成分の他、必要に応じて、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、保存剤など、他の成分を含むことができる。
【0054】
また、本発明は、試料中の遊離ＡＩＭを検出するための固相であって、本発明のモノクローナル抗体が結合した固相を提供する。本発明のモノクローナル抗体が結合した固相としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などのサンドイッチ法を検出原理とする場合には、本発明のモノクローナル抗体が結合したプレート、繊維状物質、粒子などが挙げられる。イムノクロマトグラフィーを検出原理とする場合には、本発明のモノクローナル抗体が標識試薬ゾーン（検出用抗体の場合）または検出ゾーン（捕捉用抗体の場合）に結合したイムノクロマトデバイスが挙げられる。また、免疫凝集法を検出原理とする場合には、本発明のモノクローナル抗体が結合した不溶性担体粒子、例えばラテックス粒子が挙げられる。
【0055】
また、本発明は、試料中の遊離ＡＩＭを免疫学的に分析するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明のモノクローナル抗体を含む組成物または本発明のモノクローナル抗体が結合した固相を含む。必要に応じて、さらに、標準試薬（各濃度の遊離ＡＩＭを含む試薬）、対照試薬、試料の希釈液、希釈用カートリッジ、洗浄液などを組み合わせることができる。検出に酵素標識を利用する場合には、標識の検出に必要な基質や反応停止液などを含めることができる。間接的に遊離ＡＩＭを検出する場合においては、一次抗体に結合する物質（二次抗体、プロテインＡなど）を標識したものを含めることができる。また、本発明のモノクローナル抗体をビオチン化している場合には、アビジン化した標識を含めることができる。本発明のキットには、さらに、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【0056】
本発明の組成物、固相、およびキットは、例えば、体外診断用医薬品として、上記遊離ＡＩＭに関連する疾患の診断の基礎となる遊離ＡＩＭ濃度の測定などに利用することができる。
【実施例0057】
［参考例１］ 抗ＡＩＭ抗体の作製
＜動物感作＞
抗原としてヒトｒＡＩＭ（２ｍｇ／ｍＬ）を等量のＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（Ｇ－１フナコシ）と混合し、エマルジョンを作製した。免疫動物にはＪｃｌ：Ｗｉｓｔａｒラット（日本クレア（株））６週齢のメス２匹を用い、後ろ足底部へ５０μＬを投与した。２週間後に同様の投与を行い、さらに２週間以上をおいて抗原溶液５０μｇを足底部へ投与し３日後の細胞融合に備えた。
＜動物感作＞
抗原としてヒトｒＡＩＭ（２ｍｇ／ｍＬ）を等量のＴｉｔｅｒＭａｘＧｏｌｄ（Ｇ－１フナコシ）と混合し、エマルジョンを作製した。免疫動物にはＪｃｌ：Ｗｉｓｔａｒラット（日本クレア（株））６週齢のメス２匹を用い、後ろ足底部へ５０μＬを投与した。２週間後に同様の投与を行い、さらに２週間以上をおいて抗原溶液５０μｇを足底部へ投与し３日後の細胞融合に備えた。
【0058】
＜ミエローマ細胞＞
ミエローマ細胞にはマウスＰ３Ｕ１を用い、増殖培養には、ＲＰＭＩ１６４０（１１８７５－１１９ ＧＩＢＣＯ）にグルタミンとピルビン酸を加えＦＢＳ（Ｓ１５６０ ＢＷＴ社）を１０％になるように添加した培地を用いた。抗生物質としてはペニシリン、ストレプトマイシンを適量加えた。
ミエローマ細胞にはマウスＰ３Ｕ１を用い、増殖培養には、ＲＰＭＩ１６４０（１１８７５－１１９ ＧＩＢＣＯ）にグルタミンとピルビン酸を加えＦＢＳ（Ｓ１５６０ ＢＷＴ社）を１０％になるように添加した培地を用いた。抗生物質としてはペニシリン、ストレプトマイシンを適量加えた。
【0059】
＜細胞融合＞
麻酔下にて心臓採血を行ったラットから無菌的に膝窩リンパ節を摘出し、＃２００メッシュ付ビーカーにのせ、シリコン棒で押しながら細胞浮遊液を調製した。細胞はＲＰＭＩ１６４０にて２回の遠心洗浄を行った後、細胞数をカウントした。対数増殖期の状態のミエローマ細胞を遠心により集め洗浄後、リンパ細胞に対して５対１となるように調整し、混合遠心を行った。
麻酔下にて心臓採血を行ったラットから無菌的に膝窩リンパ節を摘出し、＃２００メッシュ付ビーカーにのせ、シリコン棒で押しながら細胞浮遊液を調製した。細胞はＲＰＭＩ１６４０にて２回の遠心洗浄を行った後、細胞数をカウントした。対数増殖期の状態のミエローマ細胞を遠心により集め洗浄後、リンパ細胞に対して５対１となるように調整し、混合遠心を行った。
【0060】
細胞融合はＰＥＧ１５００（７８３６４１ ロシュ）を用いて行った。すなわち細胞ペレットへ１ｍＬのＰＥＧ液を３分間かけて反応させ、その後段階的に希釈を行い、遠心にて洗浄した後、培地を加え９６ウェルプレート１５枚へ２００μＬずつ入れ、１週間の培養を行った。培地には、ミエローマ細胞用培地にＨＡＴサプリメント（２１０６０－０１７ ＧＩＢＣＯ）を加え、ＦＢＳ濃度を１５％にしたものを用いた。
【0061】
＜マウス腹水採取＞
凍結保存された細胞を解凍し、増殖培養を行った後、１週間以上前に０．５ｍＬのプリスタン（４２－００２ コスモバイオ）を腹腔内投与したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕ 日本クレア）の腹腔へ１×１０７乗個を投与し、およそ２週間後に４～１２ｍＬの腹水を得た。遠心処理にて固形物を除去した後、凍結保存を行った。
凍結保存された細胞を解凍し、増殖培養を行った後、１週間以上前に０．５ｍＬのプリスタン（４２－００２ コスモバイオ）を腹腔内投与したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕ 日本クレア）の腹腔へ１×１０７乗個を投与し、およそ２週間後に４～１２ｍＬの腹水を得た。遠心処理にて固形物を除去した後、凍結保存を行った。
【0062】
＜電気泳動解析＞
解凍し５μｍのフィルターにて腹水を処理した後、セルロースアセテート膜電気泳動にて腹水中に含まれるモノクローナル抗体のバンドの確認を行った。
解凍し５μｍのフィルターにて腹水を処理した後、セルロースアセテート膜電気泳動にて腹水中に含まれるモノクローナル抗体のバンドの確認を行った。
【0063】
電気泳動条件は、０．０５ＭＢａｒｂｉｔａｌ Ｎａ Ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．６（０２０－１３４１５ 和光純薬）、ＳＥＬＥＣＡ－Ｖ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）、１ｍＡ／ｃｍ、２５分で行い、固定、染色には０．１％ニグロシン（２％酢酸）を用いた。
【0064】
各細胞（クローン名：クローン２，クローン８，クローン９，クローン２４）からヒトｒＡＩＭ抗原と反応を示す各抗体（以下、クローン２，クローン８，クローン９，クローン２４と称する）を得た。
【0065】
［参考例２］ ｒＡＩＭの作製
ｒＡＩＭは、文献（生化学第８４巻第７号，機能的なｒＡＩＭタンパク質の精製，５８８－５９１頁，２０１２）に記載の方法で作製した。
ｒＡＩＭは、文献（生化学第８４巻第７号，機能的なｒＡＩＭタンパク質の精製，５８８－５９１頁，２０１２）に記載の方法で作製した。
【0066】
［実施例１］
ウサギにｒＡＩＭを免疫して通常の方法で得たウサギポリクローナル抗ＡＩＭ抗体および参考例１で得た各モノクローナル抗体を用いて、以下の方法で得た遊離ＡＩＭまたはＩｇＭ結合型ＡＩＭとの反応性を測定した。
ウサギにｒＡＩＭを免疫して通常の方法で得たウサギポリクローナル抗ＡＩＭ抗体および参考例１で得た各モノクローナル抗体を用いて、以下の方法で得た遊離ＡＩＭまたはＩｇＭ結合型ＡＩＭとの反応性を測定した。
【0067】
測定試料は、血清検体を緩衝液（０．０５Ｍ リン酸緩衝液：ｐＨ７．０，塩化ナトリウム：０．３Ｍ）に溶解し、カラムに添加して、以下の条件にてゲルろ過クロマトグラフィーによる分画を行い得た。
【0068】
ゲルろ過クロマトグラフィー条件
使用機器：ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＳＰＤ－２０ＡＶ
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳＥＣ－３０００
移動相：０．０５Ｍ リン酸緩衝液，０．３Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
分画：０．５ｍＬ／ｆｒａｃｔｉｏｎ
溶出時間１０－１７分（溶出液量５－８．５ｍＬ）のフラクションを、ＡＩＭ測定用キット（ＩＢＬ社製）によって定量、調製し、ＩｇＭ結合型ＡＩＭ２０ｎｇ／ｍＬの試料、同様に、溶出時間１９－２３分（溶出液量９．５－１１．５ｍＬ）のフラクションを遊離ＡＩＭ２０ｎｇ／ｍＬに調製して試料をそれぞれ得た。
使用機器：ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＳＰＤ－２０ＡＶ
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳＥＣ－３０００
移動相：０．０５Ｍ リン酸緩衝液，０．３Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
分画：０．５ｍＬ／ｆｒａｃｔｉｏｎ
溶出時間１０－１７分（溶出液量５－８．５ｍＬ）のフラクションを、ＡＩＭ測定用キット（ＩＢＬ社製）によって定量、調製し、ＩｇＭ結合型ＡＩＭ２０ｎｇ／ｍＬの試料、同様に、溶出時間１９－２３分（溶出液量９．５－１１．５ｍＬ）のフラクションを遊離ＡＩＭ２０ｎｇ／ｍＬに調製して試料をそれぞれ得た。
【0069】
測定方法は、まず、固相用抗体を９６穴マイクロプレートの各ウェルに分注した後、洗浄し、各固相用抗体５０μＬを固相化して固相化プレートを作製した。洗浄後、１％ＢＳＡを含む溶液を加えて室温で２時間静置した。固相化プレートに試料５０μＬを加えて室温にて１時間反応させた。続いてウェル内の溶液を吸引除去、洗浄後、ウサギポリクローナル抗ＡＩＭ抗体５０μＬを加えて室温にて１時間反応させた。さらにウェル内の溶液を吸引除去、洗浄後、ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ－ＨＲＰ５０μＬを添加し、室温にて１時間反応させた。さらにウェル内の溶液を吸引除去、洗浄後、発色基質としてｏ－フェニレンジアミン含有基質溶解液５０μＬを添加し反応させた後、２Ｎ硫酸５０μＬを反応停止液として添加した。マイクロプレートリーダーを用いて測定波長４９２／６５０ｎｍにて測定した。
【0070】
測定の結果、各抗体において、遊離ＡＩＭの測定値を基準（１００）として、遊離ＡＩＭの反応性に対するＩｇＭ結合型ＡＩＭの反応性の比を、表１に示す。抗体クローン２、抗体クローン２４は、遊離ＡＩＭ特異的であることが示された。
【0071】
【表1】
【0072】
表においては、遊離ＡＩＭの測定値を基準（１００）とし、遊離ＡＩＭに対するＩｇＭ結合型ＡＩＭの測定値の比を示した（単位は、％）。
【0073】
なお、本実施例で用いたポリクローナル抗体は、ＡＩＭの２０－１２８位、１２４－２４０位、２３６－３３７位の各ペプチドと反応することをサンドイッチＥＬＩＳＡ法で確認している。
【0074】
［実施例２］ サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるｒＡＩＭの測定
参考例２で得たｒＡＩＭをゲル濾過クロマトグラフィーによって溶出時間（溶出液量）ごとに分画し、反応性を測定した。
参考例２で得たｒＡＩＭをゲル濾過クロマトグラフィーによって溶出時間（溶出液量）ごとに分画し、反応性を測定した。
【0075】
＜試料の調製＞
ｒＡＩＭを、実施例１と同様の方法でゲルろ過クロマトグラフィーによる分画を行い、溶出時間８分から２８分（溶出液量４－１４ｍＬ）の０．５ｍＬ毎の分画を試料とした。
ｒＡＩＭを、実施例１と同様の方法でゲルろ過クロマトグラフィーによる分画を行い、溶出時間８分から２８分（溶出液量４－１４ｍＬ）の０．５ｍＬ毎の分画を試料とした。
【0076】
＜測定方法＞
得られた試料について、国際公開第２０１１／１４５７２５号および国際公開第２０１７／０２２３１５号に記載された抗ＡＩＭ抗体である、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されたクローンＡＩＭ－ＣＬ－６（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－１０９２）(以下、ＣＬ－６、クローン６ともいう)およびＡＩＭ－ＣＬ－７（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－１０９３）(以下、ＣＬ－７、クローン７ともいう)から得られた抗体を表２に記載の通り組み合わせて、以下のサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。
得られた試料について、国際公開第２０１１／１４５７２５号および国際公開第２０１７／０２２３１５号に記載された抗ＡＩＭ抗体である、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されたクローンＡＩＭ－ＣＬ－６（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－１０９２）(以下、ＣＬ－６、クローン６ともいう)およびＡＩＭ－ＣＬ－７（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－１０９３）(以下、ＣＬ－７、クローン７ともいう)から得られた抗体を表２に記載の通り組み合わせて、以下のサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。
【0077】
まず、固相用抗体５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウェルに分注した後、洗浄し、各固相用抗体を固相化した。洗浄後、１％ＢＳＡ溶液を加え、固相化プレートを作製した。また、ビオチン標識試薬Ｂｉｏｔｉｎ（ＡＣ５）２Ｓｌｕｆｏ－ｏｓｕ（同仁化学研究所）を用いて、各標識用抗体をビオチン化標識した。
【0078】
固相化プレートに標準液または試料５０μＬを加えて室温にて１時間反応させた。続いてウェル内の溶液を吸引除去、洗浄後、ビオチン標識抗体５０μＬを加えて室温にて１時間反応させた。さらにウェル内の溶液を吸引除去、洗浄後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ５０μＬを添加し、室温にて１時間反応させた。さらにウェル内の溶液を吸引除去、洗浄後、発色基質としてｏ－フェニレンジアミン含有基質溶解液５０μＬを添加し反応させた後、２Ｎ硫酸５０μＬを反応停止液として添加した後、マイクロプレートリーダーを用いて測定波長４９２／６５０ｎｍにて測定した。
【0079】
測定結果を図１に示す。試薬１において２０分（１０ｍＬ）付近の分画試料にメインピークが認められた。
【0080】
［実施例３］ サンドイッチＥＬＩＳＡ法による血清検体の測定
ｒＡＩＭの代わりに血清検体の分画試料を用いた点を除いて、参考例１で得た各モノクローナル抗体を表２に記載の通り組み合わせて、実施例２と同様に測定を行った。
ｒＡＩＭの代わりに血清検体の分画試料を用いた点を除いて、参考例１で得た各モノクローナル抗体を表２に記載の通り組み合わせて、実施例２と同様に測定を行った。
【0081】
【表2】
【0082】
測定結果を図２に示す。試薬１では溶出時間（流量）が２０分（１０ｍＬ）付近のピークに加えて、１２分（６ｍＬ）付近のピークが認められた。抗体クローン２を用いた試薬２～４では、すべて２０分（１０ｍＬ）付近の分画試料のピークのみが確認され、遊離ＡＩＭ特異的であることが示された。試薬５では１２分（６ｍＬ）付近のみにピークが見られた。
【0083】
［実施例４］抗ＡＩＭ抗体のエピトープマッピング
試薬２～５で用いた抗体クローン２、クローン８およびクローン９、ならびに後述の実施例１２の試薬７で用いた抗体クローン２４についてエピトープの解析を行った。
試薬２～５で用いた抗体クローン２、クローン８およびクローン９、ならびに後述の実施例１２の試薬７で用いた抗体クローン２４についてエピトープの解析を行った。
【0084】
＜ＡＩＭ欠損変異体の調製＞
配列番号１のＡＩＭの全長タンパク質または各欠損変異体の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．３）を作製し（表３）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。
配列番号１のＡＩＭの全長タンパク質または各欠損変異体の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．３）を作製し（表３）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。
【0085】
【表3】
【0086】
トランスフェクションから２日後に細胞を回収し、タンパク質抽出バッファーを添加した。２５℃で１０分間振盪し、４℃、１００００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を回収した。
【0087】
＜ドットブロット＞
回収した上清を、ニトロセルロース膜に５μＬずつスポットした。ＮＣ（陰性対照）として、ベクターを導入していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞のタンパク抽出液を同様にスポットした。これを５％スキムミルク／ＰＢＳ中で２５℃、１時間振盪した。続いて、ＰＢＳ－Ｔを用いて４回洗浄後、抗体クローン２を４℃で１晩反応させた。さらに、ＰＢＳ－Ｔを用いて４回洗浄後、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液中で２５℃、１時間反応させた。最後に、ＰＢＳ－Ｔを用いて４回洗浄後、化学発光検出試薬を用いて１分間反応させ、ＣＣＤカメラで化学発光を検出した。
回収した上清を、ニトロセルロース膜に５μＬずつスポットした。ＮＣ（陰性対照）として、ベクターを導入していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞のタンパク抽出液を同様にスポットした。これを５％スキムミルク／ＰＢＳ中で２５℃、１時間振盪した。続いて、ＰＢＳ－Ｔを用いて４回洗浄後、抗体クローン２を４℃で１晩反応させた。さらに、ＰＢＳ－Ｔを用いて４回洗浄後、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液中で２５℃、１時間反応させた。最後に、ＰＢＳ－Ｔを用いて４回洗浄後、化学発光検出試薬を用いて１分間反応させ、ＣＣＤカメラで化学発光を検出した。
【0088】
その結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。抗体クローン２および抗体クローン２４は各々、ＡＩＭ１～ＡＩＭ８に反応せず、ＡＩＭ９と反応し、ＡＩＭ１０とより強く反応した。この事から、抗体クローン２、抗体クローン２４は、ＡＩＭにおけるＳＲＣＲ２ドメインのＣ末端側の領域からＳＲＣＲ３ドメインのＮ末端側の領域（２３０～２５９位）と反応することが確認された。一方、抗体クローン８、クローン９は、ＡＩＭ４と反応することが確認されたことから、ＡＩＭにおけるＳＲＣＲ２ドメインのＮ末端側の領域（１５５～１６９位）と反応することが確認された。
【0089】
［実施例５］ サンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿検体の測定
試料として、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で５倍希釈した尿検体（１７例）を用いた点を除いて、実施例３の試薬１または試薬２を使用して測定を行った。
試料として、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で５倍希釈した尿検体（１７例）を用いた点を除いて、実施例３の試薬１または試薬２を使用して測定を行った。
【0090】
測定結果を図４に示す。試薬１と、試薬２で良好な相関を示したが、２例の検体（検体番号＃７４、＃７７）で試薬１が高値を示した。２例の検体が、試薬１と、試薬２で乖離した理由として、実施例５から、乖離検体には、本来は尿中には存在しないと考えられてきたＩｇＭ結合型ＡＩＭが含まれているために、試薬１は高値を示した可能性が考えられた。
【0091】
［実施例６］ サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＩｇＭ濃度の測定
実施例５の尿検体＃７４と、尿検体（６検体）の計７検体をそれぞれリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で５倍希釈し、実施例５と同様に測定を行った。測定結果を表４に示す。
実施例５の尿検体＃７４と、尿検体（６検体）の計７検体をそれぞれリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で５倍希釈し、実施例５と同様に測定を行った。測定結果を表４に示す。
【0092】
【表4】
【0093】
各検体のＩｇＭ濃度は、２０倍希釈した各検体を試料として、Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ（Ｂｅｔｙｌ，Ｅ８０－１００）を用いて、キットの用法に従って測定した。ＩｇＭ濃度が高い検体では、試薬１と試薬２で測定したＡＩＭ濃度の乖離度が大きくなり、ＩｇＭ濃度が低い検体では試薬１と試薬２の測定値は乖離せず良好な相関性を示した。この結果より、尿中ＩｇＭの存在が確認され、尿中にＩｇＭ結合型ＡＩＭが存在する可能性が示唆された。
【0094】
［実施例７］ サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＩｇＭ結合型ＡＩＭの測定
ＣＬ－６は、実施例１の結果からＩｇＭ結合型ＡＩＭおよび遊離ＡＩＭと結合すると考えられたことから、固相用抗体としてＣＬ－６を、標識用抗体として実施例６の抗ＩｇＭ抗体（Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ（Ｂｅｔｙｌ，Ｅ８０－１００））を用いた点、実施例６の検体をそれぞれリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２０倍希釈したものとを用いた点を除いて、実施例２と同様の方法で、ＩｇＭ結合型ＡＩＭを測定した。測定結果を表５に示す。
ＣＬ－６は、実施例１の結果からＩｇＭ結合型ＡＩＭおよび遊離ＡＩＭと結合すると考えられたことから、固相用抗体としてＣＬ－６を、標識用抗体として実施例６の抗ＩｇＭ抗体（Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ（Ｂｅｔｙｌ，Ｅ８０－１００））を用いた点、実施例６の検体をそれぞれリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で２０倍希釈したものとを用いた点を除いて、実施例２と同様の方法で、ＩｇＭ結合型ＡＩＭを測定した。測定結果を表５に示す。
【0095】
【表5】
【0096】
実施例６に示されているＩｇＭ濃度が高い検体（試薬１と試薬２で測定したＡＩＭ濃度の乖離度が大きい乖離検体）では吸光度が高く、ＩｇＭ濃度が低い検体（試薬１と試薬２で測定したＡＩＭ濃度が乖離していない相関良好検体）では吸光度が低かったことから、乖離の原因は尿中ＩｇＭ結合型ＡＩＭであることが確認された。これにより、これまで尿中には存在しないと考えられてきたＩｇＭ結合型ＡＩＭが尿中に含まれることが示された。尿検体においても、試薬１がＩｇＭ結合型ＡＩＭおよび遊離ＡＩＭを測定しているのに対し、試薬２は遊離ＡＩＭを特異的に測定していることが判明した。
【0097】
［実施例８］ サンドイッチＥＬＩＳＡ法による血清検体の測定
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した血清検体を試料とした点を除いて、実施例３と同様の方法で、試薬１～３を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した血清検体を試料とした点を除いて、実施例３と同様の方法で、試薬１～３を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。
【0098】
結果を表６に示す。
【0099】
【表6】
【0100】
血清検体中においてＡＩＭの多くはＩｇＭ結合型ＡＩＭとして存在することから、ＩｇＭ結合型ＡＩＭおよび遊離ＡＩＭの両方を測定する試薬１の測定値と、遊離ＡＩＭのみを測定する試薬２および３の測定値は大きく異なった。
【0101】
本発明の一実施形態である、試薬２、３によれば、血中に遊離ＡＩＭが存在する場合であっても、正確に測定できることが示された。
【0102】
［実施例９］ サンドイッチＥＬＩＳＡ法による尿検体の測定
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で５倍希釈した尿検体を試料とした点を除いて、実施例３と同様の方法で、試薬１、２を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で尿検体を測定した。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で５倍希釈した尿検体を試料とした点を除いて、実施例３と同様の方法で、試薬１、２を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で尿検体を測定した。
【0103】
結果を表７に示す。
【0104】
【表7】
【0105】
尿検体中においてＡＩＭの多くは遊離ＡＩＭとして存在することから、ＩｇＭ結合型ＡＩＭおよび遊離ＡＩＭの両方を測定する試薬１の測定値はやや高くなったものの、試薬１と試薬２は良好な相関を示した。
【0106】
［実施例１０］ ラテックス凝集法による血清検体の測定
試薬３の抗体の組み合わせ（クローン８、クローン２）を用いて、ラテックス凝集法で血清検体（６検体）を測定した。
試薬３の抗体の組み合わせ（クローン８、クローン２）を用いて、ラテックス凝集法で血清検体（６検体）を測定した。
【0107】
＜ラテックス試薬の作製＞
各々の抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体とカルボキシ基を有するラテックス粒子を混合して、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＷＳＣと称する（同仁化学社製））を用いる化学結合法による公知の方法で、ラテックス粒子の表面に抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体を固定化し、各モノクローナル抗体を担持するラテックスを得た。そして、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を含む各モノクローナル抗体担持ラテックス溶液（第１試薬）を調製した。
各々の抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体とカルボキシ基を有するラテックス粒子を混合して、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＷＳＣと称する（同仁化学社製））を用いる化学結合法による公知の方法で、ラテックス粒子の表面に抗ヒトＡＩＭモノクローナル抗体を固定化し、各モノクローナル抗体を担持するラテックスを得た。そして、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を含む各モノクローナル抗体担持ラテックス溶液（第１試薬）を調製した。
【0108】
＜測定方法＞
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１００倍希釈した血清検体１６．０μＬに５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む緩衝液（ｐＨ７．３）１２０μＬ（第２試薬）を混合して試料とした。試料にモノクローナル抗体担持ラテックス溶液４０μＬを混合して３７℃で反応させ、ＴＢＡ１２０ＦＲ ｐｅａｒｌ（キヤノンメディカル社）を用いて波長６６０ｎｍでの吸光度変化を測定した。また、実施例３の試薬２，３を用いて、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した血清検体を実施例３と同様にサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。測定結果を表８に示す。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１００倍希釈した血清検体１６．０μＬに５０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む緩衝液（ｐＨ７．３）１２０μＬ（第２試薬）を混合して試料とした。試料にモノクローナル抗体担持ラテックス溶液４０μＬを混合して３７℃で反応させ、ＴＢＡ１２０ＦＲ ｐｅａｒｌ（キヤノンメディカル社）を用いて波長６６０ｎｍでの吸光度変化を測定した。また、実施例３の試薬２，３を用いて、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した血清検体を実施例３と同様にサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。測定結果を表８に示す。
【0109】
【表8】
【0110】
測定値に乖離はみられず、ラテックス凝集法によって血清検体の測定が可能であることが示された。
【0111】
［実施例１１］ ラテックス凝集法による尿検体の測定
尿検体（６例）を希釈せずに試料とした点を除いて、実施例１０で作製したラテックス試薬を用いて測定した。また、各尿検体をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で５倍希釈して試料とした点を除き、実施例３と同様の方法で、試薬２を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。測定結果を表９に示す。
尿検体（６例）を希釈せずに試料とした点を除いて、実施例１０で作製したラテックス試薬を用いて測定した。また、各尿検体をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で５倍希釈して試料とした点を除き、実施例３と同様の方法で、試薬２を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。測定結果を表９に示す。
【0112】
【表9】
【0113】
測定値に乖離はみられず、ラテックス凝集法によって尿検体の測定が可能であることが示された。
【0114】
［実施例１２］ 生物発光酵素免疫測定法（ＢＬＥＩＡ法）による血清検体の測定
実施例１に記載の方法で得た血清検体の分画試料を用いて、参考例１で得たクローン２、クローン８、クローン２４を以下の表１０に記載の通り組み合わせて、生物発光酵素免疫測定法（ＢＬＥＩＡ法）で測定を行った。
実施例１に記載の方法で得た血清検体の分画試料を用いて、参考例１で得たクローン２、クローン８、クローン２４を以下の表１０に記載の通り組み合わせて、生物発光酵素免疫測定法（ＢＬＥＩＡ法）で測定を行った。
【0115】
【表10】
【0116】
＜測定方法（ＢＬＥＩＡ法）＞
特開平１０－２３９３１４号公報（抗体と酵素の双方にビオチンを結合）に記載の方法で行った。詳細には、各種固相用抗体を磁性粒子に固相化した各種抗体固相化磁性粒子、各種標識用抗体とビオチン化試薬を混合して得られる各種ビオチン標識抗体、およびストレプトアビジン－ビオチン化ルシフェラーゼを作製した。そして、試薬３、７の組合せにおいて、それぞれ、ビオチン標識抗体溶液８０μＬと、試料１００μＬと、抗体固相化磁性粒子（１．５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを混合し、３７℃で１５分間反応させた。さらに、磁性粒子を含む反応溶液に、ＢＬ洗浄液（栄研化学）５００μＬを加え、ＢＬ洗浄液を除去した。続いて、ストレプトアビジン－ビオチン化ルシフェラーゼを８０μＬ加えて、３７℃で１５分間反応させた。磁性粒子を含む反応溶液にＢＬ洗浄液（栄研化学）５００μＬを加え、洗浄液を除去した。続いて、ＢＬ発光試薬セット（栄研化学）のＢＬ発光試薬１ ５０μＬとルシフェラーゼに対する基質液（ルシフェリン溶液）であるＢＬ発光基質液 ５０μＬを加え、発光強度を全自動生物化学発光免疫測定装置ＢＬＥＩＡ－１２００にて測定し試料中のＡＩＭ濃度を算出した。また、試薬１（比較例）を用いて、実施例２と同様の方法（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）で測定を行った。
特開平１０－２３９３１４号公報（抗体と酵素の双方にビオチンを結合）に記載の方法で行った。詳細には、各種固相用抗体を磁性粒子に固相化した各種抗体固相化磁性粒子、各種標識用抗体とビオチン化試薬を混合して得られる各種ビオチン標識抗体、およびストレプトアビジン－ビオチン化ルシフェラーゼを作製した。そして、試薬３、７の組合せにおいて、それぞれ、ビオチン標識抗体溶液８０μＬと、試料１００μＬと、抗体固相化磁性粒子（１．５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを混合し、３７℃で１５分間反応させた。さらに、磁性粒子を含む反応溶液に、ＢＬ洗浄液（栄研化学）５００μＬを加え、ＢＬ洗浄液を除去した。続いて、ストレプトアビジン－ビオチン化ルシフェラーゼを８０μＬ加えて、３７℃で１５分間反応させた。磁性粒子を含む反応溶液にＢＬ洗浄液（栄研化学）５００μＬを加え、洗浄液を除去した。続いて、ＢＬ発光試薬セット（栄研化学）のＢＬ発光試薬１ ５０μＬとルシフェラーゼに対する基質液（ルシフェリン溶液）であるＢＬ発光基質液 ５０μＬを加え、発光強度を全自動生物化学発光免疫測定装置ＢＬＥＩＡ－１２００にて測定し試料中のＡＩＭ濃度を算出した。また、試薬１（比較例）を用いて、実施例２と同様の方法（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）で測定を行った。
【0117】
測定結果を図５に示す。試薬３、試薬７のいずれにおいても、溶出時間（流量）が２０分（１０ｍＬ）付近の分画試料のピークのみが確認され、遊離ＡＩＭ特異的であることが示された。すなわち、抗体クローン２同様に、抗体クローン２４も検体中の遊離ＡＩＭを特異的に検出できることが示された。そして、これら抗体クローンにおけるエピトープの共通性から、ＡＩＭの１～２２９位からなるポリペプチドには結合せず、ＡＩＭの１～２５９位からなるポリペプチドに結合する抗体であれば、遊離ＡＩＭを特異的に検出できることが確認された。また、ＢＬＥＩＡ法によっても検体の測定が可能であることも確認された。
【産業上の利用可能性】
【0118】
以上説明したように、本発明によれば、遊離ＡＩＭを、特異的、高感度、かつ汎用的に検出することが可能となる。尿中の遊離ＡＩＭは急性腎障害などのマーカーとなることから、本発明は、研究上の利用にとどまらず、ＡＩＭが関係する疾患の診断においても大きく貢献し得るものである。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【配列表】