知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022075615
(43)【公開日】2022-05-18
(54)【発明の名称】ウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/04 20060101AFI20220511BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220511BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220511BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220511BHJP
C07K 14/165 20060101ALN20220511BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20220511BHJP
【ＦＩ】
C07K16/04
A61K39/395 D ZNA
A61P31/14
G01N33/53 D
C07K14/165
C12N15/50
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021180214
(22)【出願日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】P 2020184432
(32)【優先日】2020-11-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500452385
【氏名又は名称】株式会社ハイマート
(71)【出願人】
【識別番号】506190267
【氏名又は名称】高橋 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】特許業務法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】高橋 雅夫
(72)【発明者】
【氏名】切替 照雄
(72)【発明者】
【氏名】大城 聡
(72)【発明者】
【氏名】多田 達哉
(72)【発明者】
【氏名】水谷 苗子
(72)【発明者】
【氏名】中村 孝人
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085BB36
4C085CC16
4C085EE01
4H045AA11
4H045CA01
4H045CA43
4H045DA75
4H045DA86
4H045EA20
4H045EA50
4H045EA53
4H045FA71
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を提供する。
【解決手段】牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体、および前記抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和剤、および診断剤を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体、および前記抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和剤、および診断剤を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質抗体。
【請求項2】
請求項１に記載の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和剤。
【請求項3】
牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質抗体が、ウシホエイＩｇＧ濃縮画分である、請求項２に記載の中和剤。
【請求項4】
請求項１に記載の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の診断剤。
【請求項5】
牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質抗体が、ウシホエイＩｇＧ濃縮画分である、請求項４に記載の診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
牛乳製品には、消化管感染症を引き起こすロタウイルスおよびいくつかのヒト細菌病原体に対するＩｇＧが含まれている（非特許文献１）。ウシＩｇＧはヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびインフルエンザウイルスにも結合した（非特許文献２）。いくつかのヒト消化管感染症の抗原で免疫された牛から得られた牛の初乳製剤を「高免疫ミルク」（非特許文献３）と呼んだ。これは特定の病原体に対する高い抗体活性によって特徴付けられる。臨床試験では免疫牛初乳が胃腸管感染症の感染時間を短縮することが実証された（非特許文献１）。
【0003】
第二世代の乳製品は、健康な非免疫グラスフェドウシ由来の初乳であった。初乳は仔ウシにおけるサルモネラ感染に対する免疫を有していた（非特許文献４、５）。非免疫ウシからの免疫グロブリン製剤には大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のベロトキシンに対する高レベルの抗体および中和活性が含まれていた（非特許文献６）。いくつかのレポートはウシＩｇＧが細菌抗原に対する様々な抗体を有しヒト免疫系を活性化してレビューされた病原体から保護することを示している（非特許文献１）。しかし、ウシＩｇＧがロタウイルス、ＲＳＶ、インフルエンザウイルスを除くヒトウイルス病原体を認識しているかどうかは不明である。
【0004】
新規なコロナウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は２０１９年（ＷＨＯ．，２０２０）以来コロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）のパンデミックを引き起こしている。配列データ解析では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むヒトコロナウイルスは、動物起源、特にコウモリ由来を有すると思われた（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ulfman LH., Leusen JHW., Savelkoul HFJ., Warner JO., van Neerven RJJ., 2018. Effects of Bovine Immunoglobulins on Immune Function, Allergy, and Infection. Front Nutr. 5:52.
【非特許文献2】Hartog. GD., Jacobino S., Bont L., Cox L., Ulfman LH., Leusen JHW., et al. 2014. Specificity and effector functions of human RSV-Specific IgG from bovine milk. PLoS One. 9:11:e112047.
【非特許文献3】Golay A., Ferrara JM., Felber JP., Schneider H., 1990. Cholesterol-lowering effect of skim milk from immunized cows in hypercholesterolemic patients. Am J Clin Nutr 52: 6: 1014-1019.
【非特許文献4】Griffiths OV., 1969. Colostral immunity against salmonella infection in calves. N Z Vet J 17: 3: 50.
【非特許文献5】Royal WA., Robinson RA., Duganzich DM., 1986. Colostral immunity against salmonella infection in calves. N Z Vet J 16: 8-9: 141-145.
【非特許文献6】Lissner R., Schmidit H., Karch H., 1996. A standard immunoglobulin preparation produced from bovine colostra shows antibody reactivity and neutralization activity against Shiga-like toxins and EHEC-hemolysin of Escherichia coli O157:H7. Infection 24: 5: 378-383.
【非特許文献7】Cui J., Li F., Shi Z., 2019. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nat rev Microbiol. 17(3):181-192.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
発明者らは、ＮＺの健康な非免疫グラスフェド牛から調製された牛ホエイＩｇＧ濃縮分画のなかにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓ）に対するＩｇＧ抗体が存在することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］ 牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質抗体。
［２］ ［１］に記載の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和剤、
［３］ 牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質抗体が、ウシホエイＩｇＧ濃縮画分である、［２］に記載の中和剤。
［４］ ［１］に記載の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の診断剤。
［５］ 牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質抗体が、ウシホエイＩｇＧ濃縮画分である、［４］に記載の診断剤。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］ 牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質抗体。
［２］ ［１］に記載の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和剤、
［３］ 牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質抗体が、ウシホエイＩｇＧ濃縮画分である、［２］に記載の中和剤。
［４］ ［１］に記載の抗体を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の診断剤。
［５］ 牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質抗体が、ウシホエイＩｇＧ濃縮画分である、［４］に記載の診断剤。
【0008】
牛乳は、市販の健康なウシ由来のものを使用することができる。好ましくは、牛乳は、非免牧草牛由来の牛乳であり、より好ましくは、非免牧草牛由来の初乳である。
【0009】
ウシホエイのＩｇＧ濃縮画分は、従来公知の任意の方法によって得ることができる。たとえば、遠心分離によって脂肪を除去し、免疫グロブリンを凝縮することによって得ることができる。
【0010】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２のことであり、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となる、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ）に属するコロナウイルスである。ヒトへの感染にＡＣＥ２受容体を利用する点はＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）と共通しており、ＤＰＰ－４受容体を利用するＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）や、アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）を利用するヒトコロナウイルス２２９Ｅとは異なる。ウイルスゲノムは２９，９０３塩基で、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。
【0011】
ウイルス粒子（ビリオン）は、５０～２００ｎｍ（ナノメートル）ほどの大きさである。一般的なコロナウイルスと同様に、Ｓ（スパイク）タンパク質、Ｎ（ヌクレオカプシド）タンパク質、Ｍ（膜）タンパク質、Ｅ（エンベロープ）タンパク質として知られる４つのたんぱく質と、ＲＮＡにより構成されている。このうち、Ｎタンパク質がＲＮＡと結合してヌクレオカプシドを形成し、脂質と結合したＳ、ＥおよびＭタンパク質がその周りを取り囲んでエンベロープを形成する。エンベロープの最も外側に位置するＳタンパク質は、細胞表面のＡＣＥ２受容体に結合して細胞への感染を可能とする。
【0012】
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和剤又は診断剤は、各種の物質、例えば、賦形剤、希釈剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等を補助剤として含むことができる。具体的には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、ゼラチン、澱粉、セルロース及びその誘導体、動物及び植物油、ポリエチレングリコール、グリセロールを挙げることができる。
【発明の効果】
【0013】
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することができる。また、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２診断剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓ）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）および組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＮの領域のトポロジーである。ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、および組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの５つの領域の全トポロジー。ＮＴＤ、Ｎ末端ドメイン；ＲＢＤ、受容体結合ドメイン；ＲＤＭ、受容体結合モチーフ；ＳＤ１、サブドメイン１；ＳＤ２、サブドメイン２；ＦＰ、融合ペプチド；ＨＲ１、ヘプタドリピート１；ＨＲ２、ヘプタドリピート２；ＴＭ、膜貫通領域；ＩＣ、細胞内ドメイン。ｂ） ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎと組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎの領域の全トポロジー。ＮＴＤ、Ｎ末端ドメイン；ＣＴＤ、Ｃ末端ドメイン。
【図2a】図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩｇＧを含むウシＩｇＧ濃縮画分である。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの部分長（ａａ １７７－５１２、２８８－５１２、３４８－５７８、３８７－５１６および４０８－６６４）、完全組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ（ａａ １－４１９）および組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎの部分長（ａａ １－１２０、１１１－２２０、１－２２０および２１０－４１９）（図１）をコーティング抗原として使用した直接酵素結合免疫吸着アッセイを実施した。２０１９年および２０１８年に調製したウシＩｇＧ濃縮画分の２つの異なるロットを使用した（それぞれ２ａおよび２ｂ）。代表的なＥＬＩＳＡ結果の写真を２ｃに示した。
【図2b】図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩｇＧを含むウシＩｇＧ濃縮画分である。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの部分長（ａａ １７７－５１２、２８８－５１２、３４８－５７８、３８７－５１６および４０８－６６４）、完全組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ（ａａ １－４１９）および組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎの部分長（ａａ １－１２０、１１１－２２０、１－２２０および２１０－４１９）（図１）をコーティング抗原として使用した直接酵素結合免疫吸着アッセイを実施した。２０１９年および２０１８年に調製したウシＩｇＧ濃縮画分の２つの異なるロットを使用した（それぞれ２ａおよび２ｂ）。代表的なＥＬＩＳＡ結果の写真を２ｃに示した。
【図2c】図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩｇＧを含むウシＩｇＧ濃縮画分である。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの部分長（ａａ １７７－５１２、２８８－５１２、３４８－５７８、３８７－５１６および４０８－６６４）、完全組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ（ａａ １－４１９）および組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎの部分長（ａａ １－１２０、１１１－２２０、１－２２０および２１０－４１９）（図１）をコーティング抗原として使用した直接酵素結合免疫吸着アッセイを実施した。２０１９年および２０１８年に調製したウシＩｇＧ濃縮画分の２つの異なるロットを使用した（それぞれ２ａおよび２ｂ）。代表的なＥＬＩＳＡ結果の写真を２ｃに示した。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明する。
【実施例0016】
組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓ）およびヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）の構造および精製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ遺伝子の部分長（２，０５５ｂｐ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ遺伝子の全長（１，２６０ｂｐ）はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離２０１９－ｎＣｏＶ ＷＨＵ０１に基づいて完全なゲノムを合成した。（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＭＮ９８８６６８）。アミノ酸（ａａ）１７７－５１２、２８８－５１２、３４８－５７８、３８７－５１６、４０８－６６４に対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の５つの配列（５２９－１，５３６ｂｐ、８６２－１，５３６ｂｐ、１，０４２－１，７３４ｂｐ、１，１５９－１，５４８ｂｐ、１，２２２－１，９９２ｂｐ）、そしてアミノ酸（ａａ）１－１２０，１１１－２２０，１－２２０，２１０－４１９、１－４１９に対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ遺伝子の５つの配列（１－３６０ｂｐ、３３０－６６０ｂｐ、１－６６０ｂｐ，６２８－１，２６０ｂｐ、１－１，２６０ｂｐ）を 配列表に記載のプライマー（配列番号１～１５）を使用してｐＥＴ２８ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）でクローニングした。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ遺伝子の部分長（２，０５５ｂｐ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ遺伝子の全長（１，２６０ｂｐ）はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離２０１９－ｎＣｏＶ ＷＨＵ０１に基づいて完全なゲノムを合成した。（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＭＮ９８８６６８）。アミノ酸（ａａ）１７７－５１２、２８８－５１２、３４８－５７８、３８７－５１６、４０８－６６４に対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の５つの配列（５２９－１，５３６ｂｐ、８６２－１，５３６ｂｐ、１，０４２－１，７３４ｂｐ、１，１５９－１，５４８ｂｐ、１，２２２－１，９９２ｂｐ）、そしてアミノ酸（ａａ）１－１２０，１１１－２２０，１－２２０，２１０－４１９、１－４１９に対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ遺伝子の５つの配列（１－３６０ｂｐ、３３０－６６０ｂｐ、１－６６０ｂｐ，６２８－１，２６０ｂｐ、１－１，２６０ｂｐ）を 配列表に記載のプライマー（配列番号１～１５）を使用してｐＥＴ２８ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）でクローニングした。
【0017】
構築されたプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１－コドンプラス（ＤＥ３）－ＲＩＰ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）をトランスフォームした。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質を、製造元の指示（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）に従ってＮｉ－ＮＴＡアガロースを使用して精製し、直接酵素結合免疫吸着アッセイにおけるコーティング抗原として使用した。
【0018】
牛ホエイＩｇＧ濃縮画分
ＩｇＧ濃縮ホエイ分画（ＩｇＧ３０＋；アオテアロア、東京）は、ＮＺ酪農グループによる健全で非免疫のグラスフェドニュージーランド牛のミルクから、遠心分離によって脂肪を除去し免疫グロブリンを凝縮する事で調製した。ＩｇＧ濃縮画分の２ロットが使用され、それらは２０１８年１１月と２０１９年８月に作成された。牛は殺虫剤にさらされることも抗生物質や成長ホルモンを投与されることも決してなかった。初乳の粉末の組成は以下のとおりであった。タンパク質８４．７％（ｗ／ｗ），脂肪８．４％以下，ラクトフェリン７．０ｍｇ／ｇ、免疫グロブリン３２７．７ｍｇ／ｇ．
ＩｇＧ濃縮ホエイ分画（ＩｇＧ３０＋；アオテアロア、東京）は、ＮＺ酪農グループによる健全で非免疫のグラスフェドニュージーランド牛のミルクから、遠心分離によって脂肪を除去し免疫グロブリンを凝縮する事で調製した。ＩｇＧ濃縮画分の２ロットが使用され、それらは２０１８年１１月と２０１９年８月に作成された。牛は殺虫剤にさらされることも抗生物質や成長ホルモンを投与されることも決してなかった。初乳の粉末の組成は以下のとおりであった。タンパク質８４．７％（ｗ／ｗ），脂肪８．４％以下，ラクトフェリン７．０ｍｇ／ｇ、免疫グロブリン３２７．７ｍｇ／ｇ．
【0019】
直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＩｇＧ濃縮画分がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳおよびＮに対して交差反応性を有するＩｇＧ抗体を有するかどうかを調べるために、コーティング抗原として組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの部分長、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎの全長、及び組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎの部分長を用いて直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。 ０．０５Ｍカーボネートバッファー（ｐＨ９．０）中に各組換えＳまたはＮを含むトリプリケート１００ μｌアリコートを９６プレートのウェルに添加した。
ＩｇＧ濃縮画分がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳおよびＮに対して交差反応性を有するＩｇＧ抗体を有するかどうかを調べるために、コーティング抗原として組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの部分長、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎの全長、及び組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎの部分長を用いて直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。 ０．０５Ｍカーボネートバッファー（ｐＨ９．０）中に各組換えＳまたはＮを含むトリプリケート１００ μｌアリコートを９６プレートのウェルに添加した。
【0020】
プレートを室温で１時間培養した、そして以下の各段階毎にＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回の洗浄を行った：ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．， ＵＳＡ） （１５０ μｌ／ｗｅｌｌ）にＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキングバッファでウェルを３０分室温でブロッキングした：室温で１時間、牛ＩｇＧ 濃縮分画のＩｇＧ（ＰＢＳ－０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０中０．００３． ０．０３ ０．３ ３および３０ μｇ／ｍｌ）の１００ μｌ／ｗｅｌｌ添加。：室温で３０分間、ペルオキシダーゼ共役抗牛ＩｇＧ（全分子）（１：１０，０００希釈） （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）１００ μｌ／ｗｅｌｌ添加。：５０ｍｌＴＭＢペルオキシダーゼＥＬＡ基質キット（ＢＩＯ－ＲＡＤ， ＵＳＡ）１０分間添加。１０分間の培養後、ペルオキシダーゼ反応を停止させるために５０μｌ１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加した。照合の為４５０ｎｍおよび６２０ｎｍの吸光度をインフィネイトＦ５０マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した。
【0021】
組換え ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＮ
合計１０個の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳとＮ（Ｓ５個とＮ５個）を大腸菌ＢＬ２１－コドンプラス（ＤＥ３）－ＲＩＰを用いた発現システムにより作成した。図１に示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＮの全体的な構造によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳはＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、サブドメイン（ＳＤ）、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタド反復（ＨＲｓ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞間ドメイン（ＩＣ）（Ｌａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎには、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、（ＳＲ）リッチリンカーおよびＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）が含まれている。（Ｋａｎｇ Ｓ．， ｅｔ ａｌ）。
合計１０個の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳとＮ（Ｓ５個とＮ５個）を大腸菌ＢＬ２１－コドンプラス（ＤＥ３）－ＲＩＰを用いた発現システムにより作成した。図１に示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＮの全体的な構造によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳはＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、サブドメイン（ＳＤ）、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタド反復（ＨＲｓ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および細胞間ドメイン（ＩＣ）（Ｌａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）を含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎには、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、（ＳＲ）リッチリンカーおよびＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）が含まれている。（Ｋａｎｇ Ｓ．， ｅｔ ａｌ）。
【0022】
組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの領域（ａａ１７７－５１２，２８８－５１２，３４８－５７８，３８７－５１６，４０８－６６４）は細胞受容体ＡＣＥ（図１ａ）と相互作用すると報告された受容体結合モチーフ（ＲＢＭ、ａａ４３８－５０６）を含むＲＢＤ（ａａ３３３－５２６）の周りから選択した（Ｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）（図１ａ）。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ（ａａ１－１２０、１１１－２２０、１－２２０、２１０－４１９、１－４１９）の全長および部分長を調製した（図１ｂ）（Ｋａｎｇ Ｓ．， ｅｔ ａｌ）。
【0023】
ＩｇＧ濃縮画分には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体が含まれている。
直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、コーティング抗原としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＮ由来の１０個の組換えタンパク質を使用して行い、ＩｇＧ濃縮画分がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳおよびＮに対して交差反応性を有するＩｇＧ抗体を有するかどうかを調べた。２つの異なるＩｇＧ濃縮画分のロットをＥＬＩＳＡで分析した。ＥＬＩＳＡの結果、ＩｇＧ濃縮画分には、実験した全ての組換えタンパク質に結合するＩｇＧが含まれていることが明らかになった（図２）。
直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、コーティング抗原としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＮ由来の１０個の組換えタンパク質を使用して行い、ＩｇＧ濃縮画分がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳおよびＮに対して交差反応性を有するＩｇＧ抗体を有するかどうかを調べた。２つの異なるＩｇＧ濃縮画分のロットをＥＬＩＳＡで分析した。ＥＬＩＳＡの結果、ＩｇＧ濃縮画分には、実験した全ての組換えタンパク質に結合するＩｇＧが含まれていることが明らかになった（図２）。
【0024】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓに対するＩｇＧの反応性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎの反応性よりも高かった（図２）。ウシＩｇＧ濃縮画分は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの他の領域と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの２８８－５１２領域を強く認識した（図２）。画分はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎの全長（ａａ１－４１９）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎの他の部分長より強く認識した（図２）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳとＮからの組換えタンパク質に対する反応性に実験に使用した二つのロット間では相違はなかった。まとめるとＥＬＩＳＡのこれらの結果は、ウシＩｇＧ濃縮分画がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳおよびＮに対するＩｇＧ抗体を含むことを示している。
【0025】
ウシＩｇＧ濃縮画分についての考察
グラスフェドの健全なニュージーランドのウシがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されたり自然に免疫化されている可能性は低いと思われる。ＩｇＧ濃縮画分の２ロットは２０１９年１２月に中国でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が登場する前に、それぞれ２０１８年１１月と２０１９年８月に作成されていた。しかしながら、ウシがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫原性を共有する未知のコロナウイルスにさらされたことを排除することはできない。
グラスフェドの健全なニュージーランドのウシがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されたり自然に免疫化されている可能性は低いと思われる。ＩｇＧ濃縮画分の２ロットは２０１９年１２月に中国でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が登場する前に、それぞれ２０１８年１１月と２０１９年８月に作成されていた。しかしながら、ウシがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の免疫原性を共有する未知のコロナウイルスにさらされたことを排除することはできない。
【0026】
ＩｇＧ濃縮画分は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓはホモトリマーを形成し、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を利用して細胞に入る（Ｗａｌｌｓ ＡＣ．， ２０２０）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓマウスポリクローナル抗体は、細胞内へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２媒介の侵入を強力に阻害し、保存されたＳエピトープを標的とする交差中和抗体がワクチン接種時に誘導され得ることを示唆している。（Ｗａｌｌｓ ＡＣ．， ２０２０）。ヒトモノクローナル抗体は、スパイクＲＢＤの保存エピトープと結合しＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和した（Ｗａｎｇ Ｃ． ２０２０）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎは、ウイルスＲＮＡの転写および複製のための多機能ＲＮＡ結合タンパク質を有する細胞間タンパク質である（Ｌａｎ ｅｔａｌ．， ２０２０， Ｋａｎｇ Ｓ．， 他）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎは、牛に対して比較的低い抗原性を有すると思われる。その結果、ＩｇＧ濃縮分画はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓと比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎに対する活性は少ないのかもしれない。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎは、ウイルスＲＮＡの転写および複製のための多機能ＲＮＡ結合タンパク質を有する細胞間タンパク質である（Ｌａｎ ｅｔａｌ．， ２０２０， Ｋａｎｇ Ｓ．， 他）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎは、牛に対して比較的低い抗原性を有すると思われる。その結果、ＩｇＧ濃縮分画はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓと比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎに対する活性は少ないのかもしれない。
【0027】
参考文献
Kang S., Yang M., Hong Z., Zhang L., Huang Z., Chen X., et al. 2020. Crystal structure of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein RNA binding domain potential unique drug targeting sites. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10(7):1228-1238.
Lan J., Ge J., Yu J., Shan S., Zhou H., Fan S., et al., 2020. Structure if the SARS-CoV-S spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581(7807):215-220
Wall AC., Xiong X., Park YJ., Tortorici MA., Snijder J., Quispe J., Unexpected receptor functional mimicry elucidates activation of coronavirus fusion. Cell. 176:1026-1039.
Wang C., Li W., Drabek D., Okba NMA., Haperen RV., Osterhaus ADM., 2020. A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2 infection. Nature Communications. 11:2251.
WHO. Coronavirus disease 2019 (COVID-19) Situation Report. https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports
Kang S., Yang M., Hong Z., Zhang L., Huang Z., Chen X., et al. 2020. Crystal structure of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein RNA binding domain potential unique drug targeting sites. Acta Pharmaceutica Sinica B. 10(7):1228-1238.
Lan J., Ge J., Yu J., Shan S., Zhou H., Fan S., et al., 2020. Structure if the SARS-CoV-S spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581(7807):215-220
Wall AC., Xiong X., Park YJ., Tortorici MA., Snijder J., Quispe J., Unexpected receptor functional mimicry elucidates activation of coronavirus fusion. Cell. 176:1026-1039.
Wang C., Li W., Drabek D., Okba NMA., Haperen RV., Osterhaus ADM., 2020. A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2 infection. Nature Communications. 11:2251.
WHO. Coronavirus disease 2019 (COVID-19) Situation Report. https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports
【産業上の利用可能性】
【0028】
本発明の牛乳に由来するウシ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和剤ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和剤及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の診断剤に用いることができる。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【配列表】