特開2022-75622薬物送達キャリア及びそれを用いて多種類の治療剤を共同送達する医薬製剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022075622
(43)【公開日】2022-05-18
(54)【発明の名称】薬物送達キャリア及びそれを用いて多種類の治療剤を共同送達する医薬製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 9/127 20060101AFI20220511BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220511BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220511BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20220511BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20220511BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20220511BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20220511BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20220511BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220511BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220511BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220511BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20220511BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20220511BHJP
A61K 47/56 20170101ALI20220511BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20220511BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220511BHJP
A61K 31/175 20060101ALI20220511BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20220511BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20220511BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20220511BHJP
A61K 33/243 20190101ALI20220511BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20220511BHJP
C07K 7/08 20060101ALN20220511BHJP
C12N 15/88 20060101ALN20220511BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20220511BHJP
【ＦＩ】
A61K9/127
A61K45/00 ZNA
A61K48/00
A61K47/34
A61K47/42
A61K47/18
A61K47/24
A61K31/713
A61K31/7105
A61K31/7088
A61P43/00 121
A61K38/43
A61K47/28
A61K47/56
A61K47/64
A61P35/00
A61K31/175
A61K31/337
A61K31/7068
A61K31/506
A61K33/243
A61K31/704
C07K7/08
C12N15/88 Z
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021180366
(22)【出願日】2021-11-04
(31)【優先権主張番号】202011214492.6
(32)【優先日】2020-11-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】505294816
【氏名又は名称】▲復▼旦大学
【氏名又は名称原語表記】Ｆｕｎｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
(71)【出願人】
【識別番号】000004178
【氏名又は名称】ＪＳＲ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】魏 ▲剛▼
(72)【発明者】
【氏名】胡 ▲楊▼
(72)【発明者】
【氏名】江 ▲寛▼
(72)【発明者】
【氏名】王 勇
(72)【発明者】
【氏名】越仮 良樹
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4C206
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB25
4C076CC27
4C076CC41
4C076DD50
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE25
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA13
4C084AA20
4C084DC01
4C084MA02
4C084MA59
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA02
4C086BC42
4C086EA10
4C086EA16
4C086EA17
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA12
4C086HA12
4C086HA24
4C086HA26
4C086HA28
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA59
4C086NA05
4C086NA13
4C086ZB26
4C086ZC75
4C206HA28
4C206MA03
4C206MA05
4C206MA79
4C206NA05
4C206NA13
4C206ZB26
4C206ZC75
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA17
4H045BA50
4H045BA55
4H045BA57
4H045EA20
4H045FA20
(57)【要約】
【課題】新規な薬物送達キャリアを提供する。
【解決手段】細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームと、正に帯電したポリアミノ酸、ＰＥＩ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体、ＰＡＭＡＭから選択されるカチオン性材料とを含む薬物送達キャリアを提供する。また、前記薬物送達キャリアが１種又は多種類の治療剤を送達するための使用、前記薬物送達キャリアを用いて調製された、多種類の治療剤を共同送達するための医薬製剤、及び前記薬物送達キャリアを用いて多種類の治療剤を共同送達するための医薬製剤を調製する方法を提供する。医薬製剤は、粒径が５０ｎｍ～３００ｎｍであり、安定性がよく、多種類の治療剤を同一病変部位に同時に送達して、多種類の治療剤に相乗する治療効果を発揮させることができ、治療効果を格段に高めることができる。
【選択図】なし
【解決手段】細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームと、正に帯電したポリアミノ酸、ＰＥＩ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体、ＰＡＭＡＭから選択されるカチオン性材料とを含む薬物送達キャリアを提供する。また、前記薬物送達キャリアが１種又は多種類の治療剤を送達するための使用、前記薬物送達キャリアを用いて調製された、多種類の治療剤を共同送達するための医薬製剤、及び前記薬物送達キャリアを用いて多種類の治療剤を共同送達するための医薬製剤を調製する方法を提供する。医薬製剤は、粒径が５０ｎｍ～３００ｎｍであり、安定性がよく、多種類の治療剤を同一病変部位に同時に送達して、多種類の治療剤に相乗する治療効果を発揮させることができ、治療効果を格段に高めることができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多種類の治療剤を共同送達する医薬製剤であって、
多種類の治療剤と、薬物送達キャリアとを含み、
前記薬物送達キャリアは、細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームと、カチオン性材料と、を含み、
前記細胞透過性ペプチドは、ＲＸ１ＩＫＩＷＦＸ２Ｘ３ＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立して、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、α－アミノ酪酸、α－アミノペンタン酸、α－アミノヘキサン酸及びα－アミノヘプタン酸からなる群より選択されるアミノ酸である。）で表されるアミノ酸配列を有するｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はその誘導体であり、
前記カチオン性材料は、正に帯電したポリアミノ酸、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体及びポリアミド－アミン（ＰＡＭＡＭ）からなる群より選択される化合物であり、
前記多種類の治療剤は、少なくとも１種の非核酸治療剤と、少なくとも１種の核酸治療剤を含む、医薬製剤。
多種類の治療剤と、薬物送達キャリアとを含み、
前記薬物送達キャリアは、細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームと、カチオン性材料と、を含み、
前記細胞透過性ペプチドは、ＲＸ１ＩＫＩＷＦＸ２Ｘ３ＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立して、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、α－アミノ酪酸、α－アミノペンタン酸、α－アミノヘキサン酸及びα－アミノヘプタン酸からなる群より選択されるアミノ酸である。）で表されるアミノ酸配列を有するｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はその誘導体であり、
前記カチオン性材料は、正に帯電したポリアミノ酸、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体及びポリアミド－アミン（ＰＡＭＡＭ）からなる群より選択される化合物であり、
前記多種類の治療剤は、少なくとも１種の非核酸治療剤と、少なくとも１種の核酸治療剤を含む、医薬製剤。
【請求項2】
前記核酸治療剤が、プラスミドＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、センスＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ）及びリボザイムからなる群から選ばれる治療剤であり、
前記非核酸治療剤が、化学療法剤である、請求項１に記載の医薬製剤。
前記非核酸治療剤が、化学療法剤である、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項3】
前記カチオン性リポソームはカチオン性脂質を含み、
前記非核酸治療剤の前記カチオン性脂質に対するモル比が１：１５００～２０００：１であり、
前記カチオン性材料と前記核酸治療剤との電荷比が１：１～３０：１であり、
前記カチオン性リポソームと前記核酸治療剤との電荷比が１：１～３０：１である、請求項１又は２に記載の医薬製剤。
前記非核酸治療剤の前記カチオン性脂質に対するモル比が１：１５００～２０００：１であり、
前記カチオン性材料と前記核酸治療剤との電荷比が１：１～３０：１であり、
前記カチオン性リポソームと前記核酸治療剤との電荷比が１：１～３０：１である、請求項１又は２に記載の医薬製剤。
【請求項4】
前記カチオン性リポソームは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化リン脂質、及び、細胞透過性ペプチドと共役したポリエチレングリコールリン脂質を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項5】
前記カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）であり、前記非カチオン性脂質が、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデカノイル）－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）であり、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化リン脂質が、メトキシ－ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ）であり、前記細胞透過性ペプチドと共役したポリエチレングリコールリン脂質が、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ又はＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥである、請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項6】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、前記非カチオン性脂質がＤＯＰＥであり、前記ＰＥＧ化リン脂質がｍＰＥＧ－ＤＳＰＥであり、前記細胞透過性ペプチドと共役したポリエチレングリコールリン脂質が、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥであり、
（前記ＤＯＴＡＰ）：（前記ＤＯＰＥ）：（前記コレステロール）：（前記ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ及びＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥの合計）のモル比が約２８．５：２８．５：３８：５であり、
前記Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥの、前記ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ及びＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥの合計に対するモル比が６０％であり、
前記非核酸治療剤とＤＯＴＡＰのモル比が約１：１０００であり、
前記カチオン性材料と前記核酸治療剤の電荷比が約５：１であり、
前記カチオン性リポソームと前記核酸治療剤の電荷比が約４：１であり、
前記非核酸治療剤と前記核酸治療剤のモル濃度比が両者のＩＣ５０値の比である、
請求項４又は５に記載の医薬製剤。
（前記ＤＯＴＡＰ）：（前記ＤＯＰＥ）：（前記コレステロール）：（前記ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ及びＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥの合計）のモル比が約２８．５：２８．５：３８：５であり、
前記Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥの、前記ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ及びＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥの合計に対するモル比が６０％であり、
前記非核酸治療剤とＤＯＴＡＰのモル比が約１：１０００であり、
前記カチオン性材料と前記核酸治療剤の電荷比が約５：１であり、
前記カチオン性リポソームと前記核酸治療剤の電荷比が約４：１であり、
前記非核酸治療剤と前記核酸治療剤のモル濃度比が両者のＩＣ５０値の比である、
請求項４又は５に記載の医薬製剤。
【請求項7】
経鼻投与用である、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項8】
細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームと、カチオン性材料と、を含み、
前記細胞透過性ペプチドは、ＲＸ１ＩＫＩＷＦＸ２Ｘ３ＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立して、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、α－アミノ酪酸、α－アミノペンタン酸、α－アミノヘキサン酸及びα－アミノヘプタン酸からなる群より選択されるアミノ酸である。）で表されるアミノ酸配列を有するｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はその誘導体であり、
前記カチオン性材料は、正に帯電したポリアミノ酸、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体及びポリアミド－アミン（ＰＡＭＡＭ）からなる群より選択される化合物である、薬物送達キャリア。
前記細胞透過性ペプチドは、ＲＸ１ＩＫＩＷＦＸ２Ｘ３ＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立して、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、α－アミノ酪酸、α－アミノペンタン酸、α－アミノヘキサン酸及びα－アミノヘプタン酸からなる群より選択されるアミノ酸である。）で表されるアミノ酸配列を有するｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はその誘導体であり、
前記カチオン性材料は、正に帯電したポリアミノ酸、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体及びポリアミド－アミン（ＰＡＭＡＭ）からなる群より選択される化合物である、薬物送達キャリア。
【請求項9】
前記細胞透過性ペプチドが、ＲＷＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２４）、ＲＱＩＫＩＷＦＷＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２５）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＷＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２６）、ＲＷＩＫＩＷＦＷＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２７）、ＲＷＩＫＩＷＦＱＷＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２８）、ＲＱＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２９）又はＲＷＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３０）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記カチオン性リポソームは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール、ＰＥＧ化リン脂質、及び、前記細胞透過性ペプチドと共役したポリエチレングリコールリン脂質を含む、請求項８に記載の薬物送達キャリア。
前記カチオン性リポソームは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール、ＰＥＧ化リン脂質、及び、前記細胞透過性ペプチドと共役したポリエチレングリコールリン脂質を含む、請求項８に記載の薬物送達キャリア。
【請求項10】
多種類の治療剤を共同送達するための請求項８又は９に記載の薬物送達キャリア。
【請求項11】
請求項４～７のいずれか一項に記載の医薬製剤の製造方法であって、
（ａ）前記カチオン性材料と前記核酸治療剤とを混合して、カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体を形成する工程と、
（ｂ）前記カチオン性脂質、前記非カチオン性脂質、前記コレステロール及び前記非核酸治療剤を材料として、少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを調製する工程と、
（ｃ）前記カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体と、前記少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームとを混合して、脂質複合体を調製する工程と、
（ｄ）前記脂質複合体を、前記ＰＥＧ化リン脂質と、前記細胞透過性ペプチドと共役したポリエチレングリコールリン脂質とによって修飾する工程と、を含むか、又は、
（ａ’）前記カチオン性材料と前記核酸治療剤とを混合して、カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体を形成する工程と、
（ｂ’）前記カチオン性脂質、前記非カチオン性脂質、前記コレステロール、前記ＰＥＧ化リン脂質、前記細胞透過性ペプチドと共役したポリエチレングリコールリン脂質、前記非核酸治療剤を材料として、少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを調製する工程と、
（ｃ’）前記カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体と、前記少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームとを混合して、前記医薬製剤を得る工程と、を含む、製造方法。
（ａ）前記カチオン性材料と前記核酸治療剤とを混合して、カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体を形成する工程と、
（ｂ）前記カチオン性脂質、前記非カチオン性脂質、前記コレステロール及び前記非核酸治療剤を材料として、少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを調製する工程と、
（ｃ）前記カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体と、前記少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームとを混合して、脂質複合体を調製する工程と、
（ｄ）前記脂質複合体を、前記ＰＥＧ化リン脂質と、前記細胞透過性ペプチドと共役したポリエチレングリコールリン脂質とによって修飾する工程と、を含むか、又は、
（ａ’）前記カチオン性材料と前記核酸治療剤とを混合して、カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体を形成する工程と、
（ｂ’）前記カチオン性脂質、前記非カチオン性脂質、前記コレステロール、前記ＰＥＧ化リン脂質、前記細胞透過性ペプチドと共役したポリエチレングリコールリン脂質、前記非核酸治療剤を材料として、少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを調製する工程と、
（ｃ’）前記カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体と、前記少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームとを混合して、前記医薬製剤を得る工程と、を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、薬物送達キャリア、前記薬物送達キャリアを用いて医薬製剤を調製する方法、及びこれによって調製された医薬製剤に関する。具体的に、本発明の薬物送達キャリアは、ポリエチレングリコールリン脂質と共役した細胞透過性ペプチドを含む細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームと、カチオン性材料とを含んでいる。本発明の薬物送達キャリアを用いて多種類の治療剤を共同送達する医薬製剤を調製することができ、前記医薬製剤は粒径が５０ｎｍ～３００ｎｍであり、安定性がよく、多種類の治療剤を同一病変部位に同時に送達して、多種類の治療剤に相乗する治療効果を発揮させることができ、治療効果が格段に高まった。
【背景技術】
【0002】
細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）は、生理学的条件で正に帯電した短いペプチドであり、遺伝子、ポリペプチド、タンパク質等の薬物分子と共役結合又は非共役結合させ、薬物分子を細胞内に送達するか、又は薬物分子を担持して生体膜バリアを透過させることができる。しかし、単一の細胞透過性ペプチドは、薬物分子を担持する能力が非常に有限的であり、これにより、細胞透過性ペプチドと薬物分子によって形成される複合体は、粒径が大きくて安定性が悪くなる。
【0003】
従来、薬物分子（例えば、遺伝子、ポリペプチドやタンパク質等の薬物分子）を送達するキャリア、例えば、リポソームは、生体膜バリアを透過しにくく、送達効率が低く、所望の治療効果が得られない等の問題がある。リポソームの研究分野では、より効率的に多種類の薬物分子を同一病変部位まで送達して、多種類の薬物による相乗作用を発揮して、疾病の治療効果を高めるように、どのように生体膜バリアへのリポソームの透過性を改善して、リポソームに多種類の異なる治療薬を同時に封入させるかということがまだ大きな挑戦である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】中国特許出願公開第１０８９７６２８８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、本分野では、多種類の治療剤を共同送達して、同一病変部位に同時に送達した後に多種類の治療剤が相乗する治療効果を発揮させることで治療効果を高めるために、細胞透過性ペプチドを利用する新規な薬物送達キャリアが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、鋭意研究によって、細胞透過性ペプチドを利用する新規な薬物送達キャリアを開発した。本発明の薬物送達キャリアは、ポリエチレングリコールリン脂質と共役した細胞透過性ペプチドを含む、細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームと、カチオン性材料とを含んでいる。前記カチオン性材料は、正に帯電したポリアミノ酸、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体、ポリアミド－アミン（ＰＡＭＡＭ）から選択される。
【0007】
一実施形態において、本発明の薬物送達キャリアにおける細胞透過性ペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの親油性誘導体である。
ＲＸ１ＩＫＩＷＦＸ２Ｘ３ＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１）
ＲＸ１ＩＫＩＷＦＸ２Ｘ３ＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１）
【0008】
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、独立して天然由来のアミノ酸グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ，Ａ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ，Ｌ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｐ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ，Ｆ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ，Ｗ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）及び非天然由来のアミノ酸、α－アミノ酪酸（α－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノペンタン酸（α－ａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノヘキサン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、α－アミノヘプタン酸（α－ａｍｉｎｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）から選択される。例えば、本発明の薬物送達キャリアにおけるいくつかの細胞透過性ペプチドは、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ第２位のグルタミン（Ｑ）及び／又は第８位のグルタミン（Ｑ）及び／又は第９位のアスパラギン（Ｎ）を疎水性アミノ酸に変異させたＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体である。
【0009】
一実施形態において、本発明の薬物送達キャリアにおける細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームは、次のような膜材料を含む。
【0010】
（ｉ）カチオン性脂質は、１，２－ジ－０－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウム－プロパン、１，２－ジアルコキシ－３－ジメチルアンモニウム－プロパン、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジミリストイルオキシプロピル－１，３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ－Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）及びそれらの組合せを含むが、これらに限らない。好ましくはＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＳＰＡである。最も好ましくはＤＯＴＡＰである；
（ｉｉ）非カチオン性脂質は、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデカノイル）－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセリル－３－リン酸－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限らない。好ましくはＤＯＰＥ及び／又はＤＯＰＣである。最も好ましくはＤＯＰＥである；
（ｉｉｉ）コレステロール；及び
（ｉｖ）ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）リン脂質及びＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質；前記リン脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンであり、好ましくは、前記ＰＥＧ化リン脂質は、例えば、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）及びその誘導体であるメトキシ－ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ）であり、ＣＰＰと共役した前記ポリエチレングリコールリン脂質は、例えば、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥである。
（ｉｉ）非カチオン性脂質は、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデカノイル）－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセリル－３－リン酸－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限らない。好ましくはＤＯＰＥ及び／又はＤＯＰＣである。最も好ましくはＤＯＰＥである；
（ｉｉｉ）コレステロール；及び
（ｉｖ）ポリエチレングリコール化（ＰＥＧ化）リン脂質及びＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質；前記リン脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンであり、好ましくは、前記ＰＥＧ化リン脂質は、例えば、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）及びその誘導体であるメトキシ－ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ）であり、ＣＰＰと共役した前記ポリエチレングリコールリン脂質は、例えば、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥである。
【0011】
本発明では、細胞透過性ペプチドで修飾していないカチオン性リポソームは、カチオン性リポソーム（略語：ＣＬＳ）と略称される場合があり、上記の膜材料（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）を含む。
【0012】
いくつかの実施形態において、膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比が約２０～４０：２０～４０：２０～４０：１～２０であり、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質は膜材料（ｉｖ）に対するモル比が約２０％～８０％である。いくつかの具体的な実施形態において、膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比が約２７．０～３１．６：２７．０～３１．６：３１．６～３９．６：１～１０であり、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質は膜材料（ｉｖ）に対するモル比が約２０％～８０％である。
【0013】
いくつかの具体的な実施形態において、本発明の薬物送達キャリアにおける細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームは、膜材料として、（ｉ）ＤＯＴＡＰ；（ｉｉ）ＤＯＰＥ；（ｉｉｉ）コレステロール；（ｉｖ）ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ及び８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥを含み、且つ膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比が約２０～４０：２０～４０：２０～４０：１～２０であり、膜材料（ｉｖ）に対する８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥのモル比が約２０％～８０％である。
【0014】
いくつかの実施形態において、膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比が約２７．０～３１．６：２７．０～３１．６：３１．６～３９．６：１～１０で、且つ膜材料（ｉｖ）に対する８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥのモル比が約２０％～８０％である。
【0015】
いくつかの実施形態において、本発明の薬物送達キャリアにおけるカチオン性リポソームは、膜材料として、（ｉ）ＤＯＴＡＰ；（ｉｉ）ＤＯＰＥ；（ｉｉｉ）コレステロール；（ｉｖ）ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥと８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥから構成され、膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比が約２８．５：２８．５：３８：５であり、膜材料（ｉｖ）に対する８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥのモル比が約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％である。
【0016】
別の態様では、本発明は、多種類の治療剤を共同送達する医薬製剤を提供し、前記多種類の治療剤は、少なくとも１種の非核酸治療剤と少なくとも１種の核酸治療剤を含み、本発明の薬物送達キャリアを用いて調製されたものである。
【0017】
一実施形態において、薬物送達キャリアに含まれるコンポーネントとしてのカチオン性材料と少なくとも１種の核酸治療剤を混合して、カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体を形成した。
【0018】
カチオン性リポソームの膜材料と少なくとも１種の非核酸治療剤を用いて、少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを調製した。
【0019】
前記カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体と、前記少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを混合して、脂質複合体を調製した。
【0020】
前記脂質複合体を細胞透過性ペプチドで修飾して前記医薬製剤を調製し、例えば、前記脂質複合体を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）リン脂質と、細胞透過性ペプチドと共役したポリエチレングリコールリン脂質と混合して、前記医薬製剤を調製した。
【0021】
一実施形態において、薬物送達キャリアに含まれるコンポーネントとしてのカチオン性材料と少なくとも１種の核酸治療剤を混合してカチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体を形成した。
【0022】
細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームの全ての膜材料と少なくとも１種の非核酸治療剤を用いて、少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを調製した。
【0023】
前記カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体と、前記少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを混合して、前記医薬製剤を調製した。
【0024】
送達しようとする少なくとも１種の非核酸治療剤としては、特に限定されず、化学療法剤、例えば、プラチナ類の薬物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）、タキサン類の薬物（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル（ＤＴＸ））、エトポシド、イリノテカン、ペメトレキサンド、ゲムシタビン、メルファラン、カルマチン（ＢＣＮＵ）、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、ボルテゾミブ、メトトレキセート、イマチニブ、ブレオマイシン、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン）を含むが、これらに限らない。
【0025】
送達しようとする少なくとも１種の核酸治療剤としては、特に限定されず、プラスミドＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のようなＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、センスＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ）、リボザイム等の核酸を含むが、これらに限らなく、例えば、前記核酸治療剤は、脳腫瘍（例えば、脳神経膠腫）の脳疾患に対するＲＮＡであり、例えば、ｃ－ｍｙｃに対するｓｉＲＮＡである。
【0026】
一実施形態において、前記医薬製剤のうち、非核酸治療剤（例えば、化学療法薬）とカチオン性リポソーム中のカチオン脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ）のモル比が約１：１５００～２０００：１であり、例えば、約１：１２００、１：１０００、１：５００、１：２００、１：１００、１：５、５：１、１００：１、２００：１、５００：１、１０００：１、１２００：１、１４００：１、１６００：１、１８００：１であり、好ましくは約１：１０００～２０００：１であり、更に好ましくは約１：５００～５００：１である。
【0027】
一実施形態において、前記医薬製剤のうち、カチオン性材料（例えば、オリゴアルギニン、ＰＥＩ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体、ＰＡＭＡＭ）と、核酸治療剤との電荷比は１：１～３０：１であり、例えば、１：１、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１である。
【0028】
一実施形態において、前記医薬製剤のうち、カチオン性リポソームと核酸治療剤との電荷比は、１：１～３０：１であり、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、８：１、１０：１、１２：１である。
【0029】
一実施形態において、前記医薬製剤の非核酸治療剤（例えば、化学療法薬）に対する封入量は、医薬製剤に対して、非核酸治療剤（例えば、化学療法薬）が約０．０１％～４０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．０２％～２５％（ｗ／ｗ）である。一つの具体的な実施形態では、前記医薬製剤のドセタキセル（ＤＴＸ）に対する封入量は０．０４％ｗ／ｗである。
【0030】
一実施形態において、前記医薬製剤中のカチオン性材料（例えば、オリゴアルギニン、ＰＥＩ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体、ＰＡＭＡＭ）と、送達しようとする核酸治療剤との電荷比は、１：１～３０：１であり、好ましくは５：１であり、且つカチオン性リポソームと核酸治療剤との電荷比は、１：１～３０：１であり、好ましくは４：１である。
【0031】
一実施形態において、本発明の医薬製剤は、粒径が５０ｎｍ～３００ｎｍであり、好ましくは８０ｎｍ～１５０ｎｍであり、且つ安定性がよく、含まれている多種類の治療剤に対してよりよい保護を提供することができ、ｓｉＲＮＡと薬物を病変部位の深部組織に送達することにも有利である。
【0032】
更に別の態様では、本発明は、医薬製剤の調製方法であって、（ａ）本発明の薬物送達キャリアに含まれるコンポーネントとしてのカチオン性材料と少なくとも１種の核酸治療剤を混合してカチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体を形成すること、（ｂ）カチオン性リポソームの膜材料と少なくとも１種の非核酸治療剤を用いて、少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを調製すること、（ｃ）前記カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体と、前記少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを混合して、脂質複合体を調製すること、及び、（ｄ）前記脂質複合体をポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）リン脂質と、細胞透過性ペプチドと共役したポリエチレングリコールリン脂質とによって修飾することを含む医薬製剤の調製方法を提供する。
【0033】
別の態様として、本発明は、医薬製剤の調製方法であって、（ａ）本発明の薬物送達キャリアに含まれるコンポーネントとしてのカチオン性材料と少なくとも１種の核酸治療剤を混合してカチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体を形成すること、（ｂ）細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームの全ての膜材料と少なくとも１種の非核酸治療剤を用いて、少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを調製すること、及び、（ｃ）前記カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理複合体と、前記少なくとも１種の非核酸治療剤を封入したリポソームを混合して、前記医薬製剤を調製することを含む医薬製剤の調製方法を提供する。
【0034】
本発明の薬物送達キャリアを用いて調製された医薬製剤は、例えば、口腔、鼻腔、目、気道、消化道、生殖道、局所的なインプラント、注射、又は輸注（硬膜外、動脈内、関節内、嚢内、心臓内、脳室内、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼窩内、眼内、腹腔内、脊椎内、胸骨内、髄腔内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮膚下、気管、直腸、舌下等の経路）を介して投与し、疾患の治療及び／又は予防に用いることができる。
【0035】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照のために、引用によって本明細書に完全に組み込まれた。また、本明細書に記載の材料、方法、及び例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、本明細書及び図面、ならびに添付の特許請求の範囲から明らかなものである。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】図１は、カチオン性材料／ｓｉＲＮＡ複合体のアガロースゲル電気泳動結果を示すものである。左側はＲ８（８個アルギニンのポリマー）とｓｉＲＮＡの異なる電荷比（図中の数値は正電荷／負電荷の割合を示す）のアガロースゲル電気泳動写真であり、右側はＰｅｎｅｔｒａｔｉｎとｓｉＲＮＡの異なる電荷比（図中の数値は正電荷／負電荷の割合を示す）のアガロースゲル電気泳動写真である。
【図2】図２は、カチオン性材料／ｓｉＲＮＡ複合体のアガロースゲル電気泳動結果を示すものである。左側はＣＬＳとｓｉＲＮＡの異なる電荷比（図中の数値は正電荷／負電荷の割合を示す）のアガロースゲル電気泳動写真であり、右側はＰＥＩとｓｉＲＮＡの異なる電荷比（図中の数値は正電荷／負電荷の割合を示す）のアガロースゲル電気泳動写真である。
【図14】図１４は、ＣＬＳ／カチオン性材料／ｓｉＲＮＡ複合体の粒径を示すものである。第１グループ：ＣＬＳ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＣＬＳ／ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡリポソーム複合体、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体；第２グループ：ＣＬＳ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＣＬＳ／Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡリポソーム複合体、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ複合体；第３グループ：ＣＬＳ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＣＬＳ／ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡリポソーム複合体、ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡ複合体。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本発明は、細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームと、正に帯電したポリアミノ酸、ＰＥＩ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体、ＰＡＭＡＭから選択されるカチオン性材料とを含む、新規な薬物送達キャリアを提供する。
【0038】
前記薬物送達キャリアを利用して、少なくとも１種の非核酸治療薬及び少なくとも１種の核酸治療薬を含む医薬製剤を調製する過程において、薬物送達キャリアに含まれるカチオン性材料は、核酸治療薬を一度圧縮し（ｃｏｍｐａｃｔ）、薬物送達キャリアに含まれるカチオン性リポソームは、カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療薬からなる物理複合体に対して二次圧縮を行うことによって、カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療薬からなる物理複合体の粒径が顕著に減少し、安定性が顕著に向上し、リポソーム表面を修飾し且つ細胞透過性を有する細胞透過性ペプチドは、被験者体内の生体膜バリアへの医薬製剤の透過を助ける。
【0039】
本発明の薬物送達キャリアは、多種類の薬物の担持、多種類の薬物の送達、及び組織透過能力が強く、組織毒性が低く、様々な投与経路を介して多種類の薬物分子を被験者体内の標的部位に効率的に送達することができ、被験者の生体膜バリアにより多種類の薬物が標的部位に到達するのが困難であるという技術課題を克服することができ、疾病を治療するための多種類の薬物の併用の有効性を高め、良好な生物学的安全性を有する。したがって、本発明は、更に前記薬物送達キャリアを用いて調製された多種類の治療剤を共同送達するための医薬製剤を提供する。
【0040】
本発明の薬物送達キャリアの様々な特徴について以下に検討する。
【0041】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、指定された値の±１０％の調整を意味する。たとえば、「約５％」という用語は、４．５％～５．５％の範囲を含むことを意味する。
【0042】
本明細書で使用される場合、「含む」又は「含み」という用語は、記載された要素、整数、又はステップを含むことを意味するが、任意の他の要素、整数又はステップを除外するものではない。
【0043】
本明細書で使用される場合、「カチオン性材料」という用語は、正に帯電したポリアミノ酸、ＰＥＩ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体、ＰＡＭＡＭから選ばれるカチオン性材料を指すものである。
【0044】
＜Ｉ、表面に細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料＞
本明細書で使用される「リポソーム」という用語は、脂質二重層から構成される人工的に調製された小胞を指す。本発明において細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームのタイプは限定されず、脂質小胞を形成し、薬物を封入することができる任意のものであり得る。
本明細書で使用される「リポソーム」という用語は、脂質二重層から構成される人工的に調製された小胞を指す。本発明において細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームのタイプは限定されず、脂質小胞を形成し、薬物を封入することができる任意のものであり得る。
【0045】
本明細書で使用される「脂質」という用語は、疎水性又は両性の小分子を指し、例えば、脂肪酸、リン脂質、グリセリド、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、又はポリケチド（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）であるが、これらに限定されない。
【0046】
いくつかの実施形態において、本発明の表面に細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソームは、以下の膜材料を含む：
【0047】
［（ｉ）カチオン性脂質］
リポソームには、１つ又は複数のカチオン性脂質が含まれている。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、選択されたｐＨ（例えば、生理ｐＨ）で正味の正電荷を持つ脂質である。多くのカチオン性脂質は市販されているものである。リポソームに用いられるのに特に適切なカチオン性脂質には、国際特許公開ＷＯ２０１０／０５３５７２及びＷＯ２０１２／１７０９３０に記載されているカチオン性脂質が含まれ、前記２件の特許文献のいずれも、参照のために引用して本明細書に組み込まれた。
リポソームには、１つ又は複数のカチオン性脂質が含まれている。本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、選択されたｐＨ（例えば、生理ｐＨ）で正味の正電荷を持つ脂質である。多くのカチオン性脂質は市販されているものである。リポソームに用いられるのに特に適切なカチオン性脂質には、国際特許公開ＷＯ２０１０／０５３５７２及びＷＯ２０１２／１７０９３０に記載されているカチオン性脂質が含まれ、前記２件の特許文献のいずれも、参照のために引用して本明細書に組み込まれた。
【0048】
リポソームに含まれるカチオン性脂質について、選択されたｐＨ（例えば、生理ｐＨ）で正味の正電荷を持つリポソームである限り、特に制限はなく、１，２－ジ－０－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ） 、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウム－プロパン、１，２－ジアルコキシ－３－ジメチルアンモニウム－プロパン、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジミリストイルオキシプロピル－１，３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ－Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）及びそれらの組み合わせを使用することができるが、これらに限らない。好ましいカチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ及びＤＯＳＰＡである。最も好ましいカチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。
【0049】
［（ｉｉ）非カチオン性脂質］
リポソームには、１つ又は複数の非カチオン性脂質が含まれている。本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という用語は、任意の中性イオン、双性イオン又はアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という用語は、生理ｐＨ等の選択されたｐＨで正味の負電荷をもつ多くの脂質物質のいずれかを指す。
リポソームには、１つ又は複数の非カチオン性脂質が含まれている。本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という用語は、任意の中性イオン、双性イオン又はアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という用語は、生理ｐＨ等の選択されたｐＨで正味の負電荷をもつ多くの脂質物質のいずれかを指す。
【0050】
リポソームに含まれる非カチオン性脂質に特別な制限はなく、任意の中性イオン、両性イオン、又はアニオン性脂質を使用でき、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデカノイル）－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセリル－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセリル－３－リン酸－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）及びそれらの組み合わせを使用することができるが、これらに限られない。好ましい非カチオン性脂質は、ＤＯＰＥ及び／又はＤＯＰＣである。最も好ましい非カチオン性脂質は、ＤＯＰＥである。
【0051】
［（ｉｉｉ）コレステロール］
コレステロールは、哺乳類動物の細胞膜を構成する重要な組成成分であり、細胞膜脂質の２０％以上を占めている。「コレステロール」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、コレステロール誘導体をカバーしている。研究によると、コレステロールは、温度が高いときに細胞膜二重層の無秩序化を防ぐことができ、温度が低いときに細胞膜二重層の秩序化を妨げ、液晶の形成を阻止し、細胞膜二重層の流動性を維持することができる。
コレステロールは、哺乳類動物の細胞膜を構成する重要な組成成分であり、細胞膜脂質の２０％以上を占めている。「コレステロール」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、コレステロール誘導体をカバーしている。研究によると、コレステロールは、温度が高いときに細胞膜二重層の無秩序化を防ぐことができ、温度が低いときに細胞膜二重層の秩序化を妨げ、液晶の形成を阻止し、細胞膜二重層の流動性を維持することができる。
【0052】
リポソーム膜二重層におけるコレステロールの重要性を考慮すると、本発明のカチオン性リポソームはコレステロールも含む。
【0053】
［（ｉｖ）ＰＥＧ化リン脂質、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質］
リポソームはＰＥＧ化リン脂質と、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質とを含む。本明細書では、ＰＥＧ化リン脂質はＣＰＰが連結されたポリエチレングリコールリン脂質を含まない。
リポソームはＰＥＧ化リン脂質と、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質とを含む。本明細書では、ＰＥＧ化リン脂質はＣＰＰが連結されたポリエチレングリコールリン脂質を含まない。
【0054】
ＰＥＧ化リン脂質は、１つ又は複数のポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）にリン脂質を共役結合させることによって形成される。ＰＥＧ化リン脂質は、長さが１０ｋＤａまでのポリエチレングリコール鎖、例えば、１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ及びそれらの間の任意の値のポリエチレングリコール鎖を含むが、これらに限らず、リン脂質と共役結合する。前記リン脂質は、合成された、半合成された、又は天然のリン脂質とすることができ、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンである。いくつかの実施形態において、前記ＰＥＧ化リン脂質は、例えば、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）及びその誘導体のメトキシ－ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ）であり、そのうち、ＰＥＧの分子量は１ｋＤａ～１０ｋＤａの間の任意の値である。
【0055】
ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質は、ＣＰＰをポリエチレングリコールリン脂質に共役結合して形成される。
【0056】
本発明で使用されるＣＰＰは、野生型ポリペプチドｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（アミノ酸配列：ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２））だけでなく、例えばＰｅｎｅｔｒａｔｉｎの第２位のグルタミン（Ｑ）及び／又は第８位のグルタミン（Ｑ）及び／又は第９位のアスパラギン（Ｎ）を疎水性アミノ酸に突然変異させたＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体のような一連の親油性誘導体も含む。いくつかの実施形態において、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ親油性誘導体は、中国特許出願ＣＮ２０１７１０４１４３３４．７に開示されているような誘導体であり、前記誘導体は、結膜嚢内点眼投与後は、多くの目のバリア（角膜、結膜、強膜等）を透過して眼内への薬物の進入を促進することができ、ひいてはその担持している遺伝子、ポリペプチドやタンパク質等の生体大分子薬物を、目の後ろの網膜の部位に送達することができる。中国特許出願ＣＮ２０１７１０４１４３３４．７に開示されているＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ親油性誘導体のアミノ酸配列は、以下のように引用されている。
【0057】
【表1】
【0058】
本発明によれば、ＣＰＰは、ポリエチレングリコールリン脂質との共役結合によりリポソームの脂質二重層の一部に結合している化合物である。本明細書において、「リポソームの脂質二重層の一部」という用語は、ＣＰＰ－ＰＥＧ－リン脂質におけるリン脂質が脂質二重層に組み込まれているという事実を表すものである。前記リン脂質は、合成された、半合成された又は天然のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンであり得る。
【0059】
ＣＰＰ－ＰＥＧ－リン脂質におけるポリエチレングリコール鎖は、長さが１０ｋＤａまでのポリエチレングリコール鎖、例えば、１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、１０ｋＤａ及びそれらの間の任意の値のポリエチレングリコール鎖を含むが、これらに限らなく、両端がそれぞれリン脂質、ＣＰＰと共役結合する。いくつかの実施形態において、前記ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質は、例えば、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導物－ＰＥＧ－ＤＳＰＥであり、そのうち、ＰＥＧの分子量は１ｋＤａ～１０ｋＤａの間の任意の値である。
【0060】
本発明では、カチオン性リポソームの表面にＣＰＰで修飾することは、薬物送達キャリアの組織内透過能力を高めることによって、多種類の薬物分子を担持しているリポソームが標的部位に到達して、疾患の治療及び／又は予防の効果を奏するのを助けることを意図する。
【0061】
いくつかの実施形態において、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料（ｉｖ）において、ＰＥＧ化リン脂質及びＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質におけるポリエチレングリコールは、鎖長が同じではなく、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質におけるポリエチレングリコールの鎖は、ＰＥＧ化リン脂質におけるポリエチレングリコールの鎖より長く、例えば、０．５ｋＤａ～５ｋＤａでより長く、好ましくは０．７５ｋＤａ～４ｋＤａでより長く、更に好ましくは１ｋＤａ～２ｋＤａの間の任意の値でより長い。
【0062】
一実施形態において、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料（ｉｖ）中のＰＥＧ化リン脂質のポリエチレングリコール鎖長は、それぞれ１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａであり、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質のポリエチレングリコール鎖長は、それぞれ約２．５ｋＤａ、３．５ｋＤａ、４．５ｋＤａである。
【0063】
いくつかの実施形態において、本発明の表面に細胞透過性ペプチドで修飾したカチオン性リポソーム膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比は、約２０～４０：２０～４０：２０～４０：１～２０であり、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質は、膜材料（ｉｖ）に対するモル比が約２０％～８０％であり、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料の全体に対する約２％～８％のモル比に対応する。
【0064】
いくつかの実施形態において、膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比は、約２７．０～３１．６：２７．０～３１．６：３１．６～３９．６：１～１０であり、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質は、膜材料（ｉｖ）に対するモル比が約２０％～８０％であり、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料の全体に対する約２％～８％のモル比に対応する。
【0065】
いくつかの具体的な実施形態において、本発明の薬物送達キャリアにおけるカチオン性リポソームは、膜材料として、（ｉ）ＤＯＴＡＰ、（ｉｉ）ＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、（ｉｖ） ＰＥＧ－ＤＳＰＥ （例えば、ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ）及びＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ／Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ（例えば、８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥ）を含み、且つ膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比は、約２０～４０：２０～４０：２０～４０：１～２０であり、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ（例えば、８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥ）は、膜材料（ｉｖ）に対するモル比が約２０％～８０％である。
【0066】
いくつかの実施形態において、膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比は、約２７．０～３１．６：２７．０～３１．６：３１．６～３９．６：１～１０であり、且つＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ／Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体－ＰＥＧ－ＤＳＰＥ（例えば、８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥ）は、膜材料（ｉｖ）に対するモル比が約２０％～８０％である。
【0067】
いくつかの実施形態において、本発明の薬物送達キャリアにおけるカチオン性リポソームは、膜材料として、（ｉ）ＤＯＴＡＰ、（ｉｉ）ＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、（ｉｖ）ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥと８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥから構成され、膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比は、約２８．５：２８．５：３８：５であり、８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥは、膜材料（ｉｖ）に対するモル比が約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％である。
【0068】
＜ＩＩ．カチオン性材料＞
本発明の薬物送達キャリアに含まれるコンポーネントとしてのカチオン性材料は、核酸治療剤を圧縮するために使用される。前記カチオン性材料は、正に帯電したポリアミノ酸、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体、ポリアミド－アミン（ＰＡＭＡＭ）から選択される。
本発明の薬物送達キャリアに含まれるコンポーネントとしてのカチオン性材料は、核酸治療剤を圧縮するために使用される。前記カチオン性材料は、正に帯電したポリアミノ酸、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体、ポリアミド－アミン（ＰＡＭＡＭ）から選択される。
【0069】
いくつかの実施形態において、前記カチオン性材料は正に帯電したポリアミノ酸であり、選択されたｐＨ（例えば、生理ｐＨ）で正味の正電荷を持つポリアミノ酸である。ポリアミノ酸におけるアミノ酸残基の重合度に特別な制限はなく、例えば、重合度が２～５０の正に帯電したポリアミノ酸（すなわち、正に帯電したポリアミノ酸は２～５０個のアミノ酸残基を有する）、例えば、重合度が６～１２のアルギニン及び／又はリジンのポリアミノ酸であり、前記重合度が２～５０である正に帯電したポリアミノ酸の中には、１～２０個（例えば、１～６個）の生理条件での非荷電アミノ酸残基が介在していてもよい。正に帯電したポリアミノ酸は線状又は環状であり得、且つアミノ酸残基のコンフィギュレーションはＬ型又はＤ型である。好ましくは、前記正に帯電したポリアミノ酸は、重合度が６～１２のポリアルギニンであり、前記ポリアルギニンの空間構造は線状及び環状を含み、ポリアルギニンのコンフィギュレーションはＬ型又はＤ型である。
【0070】
いくつかの実施形態において、正に帯電したポリアミノ酸は、オリゴアルギニン（ｏｌｉｇｏ－ａｒｇｉｎｉｎｅ）であり、６ポリアルギニン（アミノ酸配列はＲＲＲＲＲＲ，Ｒ６（配列番号８５））、８ポリアルギニン（アミノ酸配列はＲＲＲＲＲＲＲＲ，Ｒ８（配列番号８６））、１０ポリアルギニン（アミノ酸配列はＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ，Ｒ１０（配列番号８７））、１２ポリアルギニン（アミノ酸配列はＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ，Ｒ１２（配列番号８８））のような線状ポリペプチドと、環化６－ポリアルギニン（ｃ－Ｒ６）、環化８ポリアルギニン（ｃ－Ｒ８）、環化１０ポリアルギニン（ｃ－Ｒ１０）、環化１２ポリアルギニン（ｃ－Ｒ１２）のような環化ポリペプチド、Ｌ型オリゴアルギニンや６－ポリＤ－アルギニン（アミノ酸配列はｒｒｒｒｒｒ、Ｄ－Ｒ６）、８－ポリＤ－アルギニン（アミノ酸配列はｒｒｒｒｒｒｒｒ、Ｄ－Ｒ８）、１０－ポリＤ－アルギニン（アミノ酸配列はｒｒｒｒｒｒｒｒｒｒ）、Ｄ－Ｒ１０）、１２ポリ－Ｄ－アルギニン（アミノ酸配列はｒｒｒｒｒｒｒｒｒｒｒｒ、Ｄ－Ｒ１２）のようなＤ型オリゴアルギニンのような異なる構成のポリペプチドと、を含む。
【0071】
以下に、本発明の薬物送達キャリアを用いて多種類の治療剤を共同送達する医薬製剤を調製する方法を説明し、医薬製剤の特徴を説明する。
【0072】
本発明の薬物送達キャリアを使用することにより、カチオン性リポソームの表面にＣＰＰで修飾し、組織への強い透過能力を有し、多種類の治療剤を共同送達する医薬製剤を調製することができる。
【0073】
一実施形態において、本発明の医薬製剤の調製方法は以下の通りである。
（１）上記の本発明のリポソーム膜材料と、少なくとも１種の非核酸治療剤とを秤量し、ここで、膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）モル比が、約２０～４０：２０～４０：２０～４０：１～２０であり、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質は、膜材料（ｉｖ）に対するモル比が約２０％～８０％であり、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料の全体に対する約２％～８％のモル比に対応する。
（１）上記の本発明のリポソーム膜材料と、少なくとも１種の非核酸治療剤とを秤量し、ここで、膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）モル比が、約２０～４０：２０～４０：２０～４０：１～２０であり、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質は、膜材料（ｉｖ）に対するモル比が約２０％～８０％であり、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料の全体に対する約２％～８％のモル比に対応する。
【0074】
（２）膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）及び少なくとも１種の非核酸治療剤を有機溶媒に加えて溶解し、蒸発させて有機溶媒を除去し、均一な乾燥脂質膜を得る。
【0075】
（３）得られた乾燥脂質膜を水含有溶液で完全に水和した後、リポソームをミニ押出機を使用して押し出す（核孔膜の順序は、順に２００ｎｍ、１００ｎｍ及び５０ｎｍである）。
【0076】
（４）カチオン性材料（例えば、正に帯電したポリアミノ酸、ＰＥＩ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体、ＰＡＭＡＭ）と少なくとも１種の核酸治療剤とを適切な溶液中で混合及びインキュベートして、カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理的複合体を得る。
【0077】
（５）上記（３）で得られたリポソームと上記（４）で得られたカチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理的複合体を一定のモル比又は電荷比で混合し、リポソーム複合体の形態の、少なくとも１種の非核酸治療剤と少なくとも１種の核酸治療剤とを含む医薬製剤を得る。
【0078】
一実施形態において、本発明の医薬製剤の調製方法は、以下の通りである。
（１）上記の本発明のリポソーム膜材料を秤量し、ここで、膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比が、約２０～４０：２０～４０：２０～４０：１～２０であり、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質は、膜材料（ｉｖ）に対するモル比が約２０％～８０％であり、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料の全体に対する約２％～８％のモル比に対応する。
（１）上記の本発明のリポソーム膜材料を秤量し、ここで、膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）：（ｉｖ）のモル比が、約２０～４０：２０～４０：２０～４０：１～２０であり、ＣＰＰと共役したポリエチレングリコールリン脂質は、膜材料（ｉｖ）に対するモル比が約２０％～８０％であり、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料の全体に対する約２％～８％のモル比に対応する。
【0079】
（２）膜材料（ｉ）：（ｉｉ）：（ｉｉｉ）と少なくとも１種の非核酸治療剤を有機溶媒に加えて溶解し、蒸発させて有機溶媒を除去し、均一な乾燥脂質膜を得る。
【0080】
（３）得られた乾燥脂質膜を水含有溶液で完全に水和した後、リポソームをミニ押出機を使用して押し出す（核孔膜の順序は、順に２００ｎｍ、１００ｎｍ及び５０ｎｍである）。
【0081】
（４）カチオン性材料（例えば、正に帯電したポリアミノ酸、ＰＥＩ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体、ＰＡＭＡＭ）と少なくとも１種の核酸治療剤とを適切な溶液中で混合及びインキュベートして、カチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理的複合体を得る。
【0082】
（５）上記（３）で得られたリポソームと上記（４）で得られたカチオン性材料－少なくとも１種の核酸治療剤からなる物理的複合体を一定のモル比又は電荷比で混合し、そして膜材料（ｉｖ）と混合し、インキュベートして、本発明の医薬製剤を得る。
【0083】
送達しようとする少なくとも１種の非核酸治療剤は特に限定されない。前記非核酸治療剤は、受験者に送達される広範囲なタイプの化合物を含み、以下のものを含むが、これらに限らない：抗生物質及び抗ウイルス薬等の抗感染薬；鎮痛剤及び鎮痛剤の組み合わせ；食欲抑制剤；駆虫薬；抗関節炎薬；抗喘息薬；抗けいれん薬；抗うつ薬；抗糖尿病薬；下痢止め；抗ヒスタミン薬；抗炎症薬；抗片頭痛薬；悪心薬；抗腫瘍薬；抗振戦麻痺薬；抗掻痒薬；抗精神病薬；抗発熱薬；抗痙攣薬；抗コリン作動薬；交感神経刺激薬；キサンチン誘導体；カリウムチャネル遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、β－遮断薬、α－遮断薬及び抗不整脈剤を含む心血管薬；抗高血圧薬；利尿薬及び抗利尿薬；全身神経、心神経、周囲神経と脳神経、中枢神経系のアゴニスト、血管抑制薬を含む血管拡張薬；充血除去薬を含む咳及び風邪製剤；コルチコステロイドを含むエストラジオール及び他のステロイド等のホルモン；催眠薬；免疫抑制薬；筋弛緩薬；副交感神経遮断薬；精神刺激薬；鎮静剤及び安定剤。本発明の薬物送達キャリアは、イオン化、非イオン化、遊離塩基、酸付加塩等のすべての形態の薬物を送達することができ、高分子量又は低分子量の薬物を送達することができる。
【0084】
送達しようとする少なくとも１種の核酸治療剤についても特に限定されず、プラスミドＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のようなＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、センスＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ）、リボザイム等の核酸を含む。例えば、前記核酸治療剤は、脳腫瘍（例えば、脳神経膠腫）の脳疾患に対するＲＮＡであり、例えば、ｃ－ｍｙｃに対するｓｉＲＮＡである。
【0085】
本発明の医薬製剤は、口腔、鼻腔、目、気道、消化道、生殖道、局所的なインプラント、注射又は輸注（硬膜外、動脈内、関節内、嚢内、心臓内、脳室内、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼窩内、眼内、腹腔内、脊椎内、胸骨内、髄腔内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮膚下、気管、直腸、舌下及び他の経路を経由して）投与することができる。
【0086】
当技術分野で知られている医療機器を使用して、本発明の医薬製剤を投与することができる。例えば、一実施形態において、無針頭皮皮下注射装置、例えば、米国特許第５，３９９，１６３号に開示されている機器を用いて本発明の医薬製剤を投与することができる。
【0087】
一実施形態において、本発明の薬物送達キャリアを用いて化学療法薬と核酸薬物ｓｉＲＮＡを共同送達するための医薬製剤を調製することにより、相乗的に癌を治療する作用を発揮することができる。
【0088】
化学療法は今でも最も一般的に使用されている癌治療法の１つである。しかし、化学療法薬は、分裂細胞（癌細胞の特徴の１つ）を能動的に標的するが、血液細胞等の健康な分裂細胞や、腸、口、髪における細胞も影響を受けるため、強い副作用を生じる。科学者たちは、これらの副作用を最小限になるために、化学療法薬の投与と組み合わせを改善するために取り組んできた。
【0089】
更に、核酸治療剤は、疾患（例えば、癌）の治療における使用において大きな注目を集めている。核酸治療薬は癌治療に潜在効力を有するが、環境中に遍在する酵素によって攻撃されて容易に分解される可能性があり、また、核酸はそれ自体では細胞に侵入できず、既存の送達システムは低い送達効率低いだけを有する。
【0090】
本発明の薬物送達キャリアの使用によって、化学療法薬の副作用を最小限になり、核酸治療剤が細胞に効率的に侵入することを可能にし、核酸治療剤が環境中に遍在する酵素によって容易に攻撃されない。
【0091】
一実施形態において、本発明の化学療法薬及び核酸薬物ｓｉＲＮＡを共同送達するための医薬製剤は、経鼻投与され、化学療法薬及び核酸薬物ｓｉＲＮＡを鼻脳経路を介して脳に効率的に送達する。前記化学療法薬及び核酸薬物ｓｉＲＮＡが脳腫瘍細胞に摂取された後、細胞透過性ペプチド及びカチオン性リポソームの表面正電荷の助けを借りてエンドソームを脱出し、化学療法薬及び核酸薬物ｓｉＲＮＡを細胞質に放出して、脳腫瘍（例えば、神経膠腫）の化学的死滅及び遺伝子治療の役割を果たす。
【0092】
本分野の技術者が周知しているように、脳の特別な生理学的構造及び機能的複雑さ、特に血液脳関門の存在及びある薬物自体の物理的及び化学的特性によって、治療薬物が通常、脳組織に到達しにくい。しかし、経鼻的に脳に投与する経路は、脳疾患の治療に実行可能なアイデアを提供し、薬物を経鼻的に脳に投与するための直接的な経路が２つあり、１つは、嗅神経経路であり、鼻腔を通って脳に入るために血液脳関門をバイパスする最も直接的な方法であり、薬物が鼻粘膜によって吸収され、嗅神経によって摂取された後、軸索を介して嗅球に運ばれ、更に嗅脳に到達する過程である。もう１つは、鼻粘膜上皮経路であり、薬物が基底膜を通過して固有層に入り、更に末梢嗅神経に到達して、中枢神経系に送達され、最終的に脳への蓄積を実現する。経鼻的に脳に投与することは、無傷性を有するため、患者のコンプライアンスは良好である（Agrawal M et al., Nose-to-brain drug delivery: An update on clinical challenges and progress towards approval of anti-Alzheimer drugs, Journal of Controlled Release, 2018, 281:139-177）。
【0093】
一方、神経膠腫等の脳腫瘍は、発生率が高く生存率が低い中枢神経系の悪性腫瘍であり、ヒト健康への被害は極めて大きくて、臨床予後は楽観的ではなく、主に、手術の再発、化学療法の薬剤耐性等に現われ、それに、血液脳関門、血液脳腫瘍関門の存在により、全身投与後の薬物の脳内到着量は非常に少なく、そのため、従来から、人々は効果的な薬物治療方式を見つけるために努力している。
【0094】
本発明の化学療法薬及び核酸薬物ｓｉＲＮＡを共同送達するための医薬製剤は、経鼻投与後、化学療法薬及び核酸薬物ｓｉＲＮＡを同時に脳に薬物を送達し、相乗的に脳腫瘍に対する治療作用を発揮することができる。また、本発明の医薬製剤は、経鼻投与により脳内投与が可能であるため、患者のコンプライアンスを改善するのに有益である。
【実施例0095】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために記載される。実施例は、本発明の保護範囲を制限するものとして決して解釈されるべきではない。
【0096】
［実施例１］
（カチオン性リポソームの調製）
膜材料を、２８．５：２８．５：３８：５のモル比で、すなわち、３．５ｍｇのＤＯＴＡＰ（上海艾韋特医薬科技有限公司、１３２１７２－６１－３）、３．７２ｍｇのＤＯＰＥ（上海艾韋特医薬科技有限公司、４００４－０５－１）、２．５９ｍｇのコレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ８６６７）及び２．４６ｍｇのｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ（上海艾韋特医薬科技有限公司、１４７８６７－６５－０）を秤量した。
（カチオン性リポソームの調製）
膜材料を、２８．５：２８．５：３８：５のモル比で、すなわち、３．５ｍｇのＤＯＴＡＰ（上海艾韋特医薬科技有限公司、１３２１７２－６１－３）、３．７２ｍｇのＤＯＰＥ（上海艾韋特医薬科技有限公司、４００４－０５－１）、２．５９ｍｇのコレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ８６６７）及び２．４６ｍｇのｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ（上海艾韋特医薬科技有限公司、１４７８６７－６５－０）を秤量した。
【0097】
上記の量のＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロールを５０ｍＬの丸底フラスコに入れ、１ｍＬのクロロホルムを加え、脂質膜材料としての前記ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロールを溶解し、すなわち、１６．６７μｍｏｌのＣＬＳは５μｍｏｌのＤＯＴＡＰ、５μｍｏｌのＤＯＰＥ及び６．６７μｍｏｌのコレステロールを含む。得られた溶液をロータリーエバポレーター（上海申生科技有限公司、Ｒ２０１Ｌ）によって、クロロホルムを除去し、均一な乾燥脂質膜を得た。
【0098】
得られた乾燥脂質膜を、３７℃の水浴中で１ｍＬの５％グルコース水溶液で約１０分間超音波で水和した。脂質膜が完全に水和した後、ミニ押出機（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，８１３２０）を使用してリポソームを押し出し（核孔膜の順序は、順に２００ｎｍ、１００ｎｍ及び５０ｎｍである）、細胞透過性ペプチドで修飾していないカチオン性リポソーム（本明細書ではＣＬＳともいう）を得た。
【0099】
調製したカチオン性リポソームを２．４６ｍｇのｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ（水に溶ける）と混合した上で、５５℃で３０分間インキュベートして、ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを含むカチオン性リポソームを得た。
【0100】
［実施例２］
（カチオン性材料による遺伝子薬物の圧縮作用）
アガロースゲル電気泳動実験は、薬物送達キャリアに含まれるカチオン性材料が核酸等の薬物に対する封入能力を測定するためによく使用される。本実施例では、Ｒ８／ｓｉＲＮＡ複合体、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＣＬＳ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡ複合体を調製し、アガロースゲル電気泳動実験によって、Ｒ８、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ＣＬＳ、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｌｍｌｎｅ，ＰＥＩ，分子量：２５０００）と３世代ポリアミド‐アミン（ＰＡＭＡＭ）が核酸に対する封入能力を測定した。
（カチオン性材料による遺伝子薬物の圧縮作用）
アガロースゲル電気泳動実験は、薬物送達キャリアに含まれるカチオン性材料が核酸等の薬物に対する封入能力を測定するためによく使用される。本実施例では、Ｒ８／ｓｉＲＮＡ複合体、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＣＬＳ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡ複合体を調製し、アガロースゲル電気泳動実験によって、Ｒ８、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ＣＬＳ、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｌｍｌｎｅ，ＰＥＩ，分子量：２５０００）と３世代ポリアミド‐アミン（ＰＡＭＡＭ）が核酸に対する封入能力を測定した。
【0101】
３３μｇのｓｉＲＮＡ（この実施例では、ｃ－ｍｙｃに対する低分子干渉ＲＮＡが使用され、以下、ｓｉＲＮＡとも略称され、そのセンス鎖（５’－３’）は、ＡＡＣＧＵＵＡＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＣＡｄＴｄＴ（配列番号７９）であり、アンチセンス鎖（５’－３’）はＵＧＵＵＧＧＵＧＡＡＧＣＵＡＡＣＧＵＵｄＴｄＴ（配列番号８０））であり、１２５μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解して、２０μＭのｓｉＲＮＡ溶液を調製した。
【0102】
オリゴアルギニンＲ８（上海▲忻▼浩生物科技有限公司）、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（上海▲忻▼浩生物科技有限公司）、実施例１で調製したＣＬＳ、ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（上海））、ＰＡＭＡＭ（威海晨源分子新材料有限公司）をそれぞれ純水に溶解し、特定の電荷比でｓｉＲＮＡと混合し、３０秒間ボルテックスし、３７℃で３０分間インキュベートして、Ｒ８／ｓｉＲＮＡ複合体、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＣＬＳ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体及びＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡ複合体を得た。
【0103】
製造したＲ８／ｓｉＲＮＡ複合体、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＣＬＳ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡ複合体をそれぞれアガロースゲルローディングホールにそっと添加し、遊離ｓｉＲＮＡ対照グループを設定して、電気泳動を行った。電気泳動終了後、暗所でＧｅｌＲｅｄワーキング液（Ｂｉｏｔｉｕｍ Ｉｎｃ．）で３０分間染色し、ＵＶ３０２ｎｍ条件でゲルを画像化した。結果を図１～図３に示す。
【0104】
製造したＲ８／ｓｉＲＮＡ複合体、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＣＬＳ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡ複合体に対してそれぞれ粒径測定とζ電位測定を行った。動的光散乱技術を用いて粒径を直接に測定した。ζ電位分析器を採用して、２３℃で５Ｖ／ｃｍの電界強度、０．４ｃｍの電極間隔で水中でζ電位を測定した。結果を図４～図１３に示す。
【0105】
Ｒ８の１つのアミノ窒素は１つの正電荷を持ち、ｓｉＲＮＡの１つのリン酸基は１つの負電荷を持っているので、１μＭのＲ８は８μＭのアミノ窒素を含み、すなわち、１μＭのＲ８は８μＭの正電荷を含み、１μＭのｓｉＲＮＡは４２μＭのリン酸基を含み、すなわち、１μＭのｓｉＲＮＡは４２μＭの負電荷を含み、Ｒ８とｓｉＲＮＡの電荷比は、（Ｒ８のμＭ値×８）／（ｓｉＲＮＡのμＭ値×４２）＝０．１９×Ｒ８（μＭ）／ｓｉＲＮＡ（μＭ）である。
【0106】
Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの１つのアミノ窒素は１つの正電荷を持ち、ｓｉＲＮＡの１つのリン酸基は１つの負電荷を持っているので、１μＭのＰｅｎｅｔｒａｔｉｎは７μＭのアミノ窒素を含み、すなわち、１μＭのＰｅｎｅｔｒａｔｉｎは７μＭの正電荷を含み、１μＭのｓｉＲＮＡは４２μＭのリン酸基を含み、すなわち、１μＭのｓｉＲＮＡは４２μＭの負電荷を含み、ＰｅｎｅｔｒａｔｉｎとｓｉＲＮＡの電荷比は（ＰｅｎｅｔｒａｔｉｎのμＭ値×７）／（ｓｉＲＮＡのμＭ値×４２）＝０．１７×Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（μＭ）／ｓｉＲＮＡ（μＭ）である。
【0107】
ＤＯＴＡＰの１つのアミノ窒素は１つの正電荷を持ち、ｓｉＲＮＡの１つのリン酸基は１つの負電荷を持っているので、１６．６７μＭのＣＬＳは５μＭのＤＯＴＡＰを含み、すなわち、１μＭのＣＬＳは０．３μＭの正電荷を含み、１μＭのｓｉＲＮＡは４２μＭの負電荷を含み、ＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比は、（ＣＬＳのμＭ値×０．３）／（ｓｉＲＮＡのμＭ値×４２）＝０．００７×ＣＬＳ（μＭ）／ｓｉＲＮＡ（μＭ）である。
【0108】
ＰＥＩの１つのアミノ窒素は１つの正電荷を持つため、その繰り返し構造モノマーのうち、２つの炭素原子ごとに、窒素原子を含む１級及び２級アミンが付着された。つまり、ＰＥＩでは４３分子量当たり１個のＮ原子に対応し、ｓｉＲＮＡの１つのリン酸基は１つの負電荷を持ち、ｓｉＲＮＡの平均分子量が１３３００であり、１ＭのｓｉＲＮＡは４２Ｍのリン酸基を含み、すなわち、ｓｉＲＮＡでは、３１７分子量あたり１個のリン酸基に対応し、ＰＥＩとｓｉＲＮＡの電荷比は、（ＰＥＩの質量ｍｇ）／（ｓｉＲＮＡの質量ｍｇ）×（３１７／４３）＝７．３７×ＰＥＩ（ｍｇ）／ｓｉＲＮＡ（ｍｇ）である。
【0109】
ＰＡＭＡＭの１つのアミノ窒素は１つの正電荷を持ち、ｓｉＲＮＡの１つのリン酸基は１つの負電荷を持っているので、文献中の式によれば、ＰＡＭＡＭとｓｉＲＮＡの電荷比＝１．５３×ＰＡＭＡＭ（ｍｇ）／ｓｉＲＮＡ（ｍｇ）である。
【0110】
［実施例３］
（カチオン性リポソームを用いて二回圧縮した後の粒径と電位特徴）
実施例２で調製されたＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡ複合体を使用して、それぞれ、ＣＬＳとリポソーム複合体を調製した。具体的には、８μＬのＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡ複合体を、それぞれ２．６７μＬの実施例１で調製した１６．６７μＭカチオン性リポソームＣＬＳと混合し、３０秒間ボルテックスし、３７℃で３０分間インキュベートして、リポソーム複合体ＣＬＳ／Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ、ＣＬＳ／ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ、ＣＬＳ／ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡを得た。
（カチオン性リポソームを用いて二回圧縮した後の粒径と電位特徴）
実施例２で調製されたＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡ複合体を使用して、それぞれ、ＣＬＳとリポソーム複合体を調製した。具体的には、８μＬのＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ複合体、ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡ複合体を、それぞれ２．６７μＬの実施例１で調製した１６．６７μＭカチオン性リポソームＣＬＳと混合し、３０秒間ボルテックスし、３７℃で３０分間インキュベートして、リポソーム複合体ＣＬＳ／Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ、ＣＬＳ／ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ、ＣＬＳ／ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡを得た。
【0111】
リポソーム複合体ＣＬＳ／Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ、ＣＬＳ／ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ、ＣＬＳ／ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡにおいて、ｓｉＲＮＡの電荷数に基づいて、カチオン性リポソームＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比を４に固定した（ＤＯＴＡＰの１つのアミノ窒素は１つの正電荷を持ち、ｓｉＲＮＡの１つのリン酸基は１つの負電荷を持っているため、１６．６７μＭのＣＬＳは５μＭのＤＯＴＡＰを含み、すなわち、１μＭのＣＬＳは０．３μＭの正電荷を含み、１μＭのｓｉＲＮＡは４２μＭの負電荷を含み、ＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比は、（ＣＬＳのμＭ値×０．３）／（ｓｉＲＮＡのμＭ値×４２）＝０．００７×ＣＬＳ（μＭ）／ｓｉＲＮＡ（μＭ）である。
【0112】
調製したリポソーム複合体ＣＬＳ／Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ／ｓｉＲＮＡ、ＣＬＳ／ＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ、ＣＬＳ／ＰＡＭＡＭ／ｓｉＲＮＡに対してそれぞれ粒径測定を行い、リポソーム複合体の放置過程における粒径変化を観察した。結果を図１４と図１５に示す。
【0113】
結果は、ＣＬＳ／カチオン性材料／ｓｉＲＮＡリポソーム複合体を調製する過程で、ＣＬＳの二回圧縮を経て、ＣＬＳ／ｓｉＲＮＡ複合体のみ、カチオン性材料／ｓｉＲＮＡ複合体のみと比較して、粒径が顕著に減少することを示している。したがって、ＣＬＳ／カチオン性材料／ｓｉＲＮＡリポソーム複合体は、ＣＬＳ／ｓｉＲＮＡ複合体のみ、カチオン性材料／ｓｉＲＮＡ複合体のみよりも安定しており、ｓｉＲＮＡ及び薬物に対してよい保護を提供することができ、ｓｉＲＮＡ及び薬物を病変部位の深部組織に送達することに有利である。
【0114】
［実施例４］
（カチオン性リポソーム及びカチオン性材料が遺伝子薬物を封入した医薬製剤の調製）
正に帯電したポリアミノ酸、すなわち、オリゴアルギニンＲ８（上海▲忻▼浩生物科技有限公司）４ｍｇをカチオン性材料として、ＤＥＰＣ処理水（大連美侖生物技術有限公司、ＭＡ００１８）に溶解して、４ｍｇ／ｍＬのオリゴアルギニンＲ８溶液を調製した。
（カチオン性リポソーム及びカチオン性材料が遺伝子薬物を封入した医薬製剤の調製）
正に帯電したポリアミノ酸、すなわち、オリゴアルギニンＲ８（上海▲忻▼浩生物科技有限公司）４ｍｇをカチオン性材料として、ＤＥＰＣ処理水（大連美侖生物技術有限公司、ＭＡ００１８）に溶解して、４ｍｇ／ｍＬのオリゴアルギニンＲ８溶液を調製した。
【0115】
３３μｇのｓｉＲＮＡ（この実施例では、ｃ－ｍｙｃに対する低分子干渉ＲＮＡが使用され、以下、ｓｉＲＮＡとも略称され、そのセンス鎖（５’－３’）は、ＡＡＣＧＵＵＡＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＣＡｄＴｄＴ（配列番号７９）であり、アンチセンス鎖（５’－３’）はＵＧＵＵＧＧＵＧＡＡＧＣＵＡＡＣＧＵＵｄＴｄＴ（配列番号８０）である）を１２５μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解して、２０μＭのｓｉＲＮＡ溶液を調製した。
【0116】
オリゴアルギニンＲ８溶液とｓｉＲＮＡ溶液を電荷比が５であるように等体積混合し（Ｒ８の１つのアミノ窒素は１つの正電荷を持ち、ｓｉＲＮＡの１つのリン酸基は１つの負電荷を持っているので、１μＭのＲ８は８μＭのアミノ窒素を含み、すなわち、１μＭのＲ８は８μＭの正電荷を含み、１μＭのｓｉＲＮＡは４２μＭのリン酸基を含み、すなわち、１μＭのｓｉＲＮＡは４２μＭの負電荷を含み、Ｒ８とｓｉＲＮＡの電荷比は、（Ｒ８のμＭ値×８）／（ｓｉＲＮＡのμＭ値×４２）＝０．１９×Ｒ８（μＭ）／ｓｉＲＮＡ（μＭ）である）、３０秒間ボルテックスし、３７℃で３０分間インキュベートして、Ｒ８／ｓｉＲＮＡ複合体を得た。
【0117】
調製したＲ８／ｓｉＲＮＡ複合体とＣＬＳを混合してＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ脂質複合体を調製した。具体的には、８μＬのＲ８／ｓｉＲＮＡ複合体（すなわち、４μＬのｓｉＲＮＡ溶液と４μＬのＲ８溶液で調製したもの）を取って、２．６７μＬの実施例１で調製した１６．６７μＭカチオン性リポソームＣＬＳと混合し、３０秒間ボルテックスし、３７℃でインキュベートして、脂質複合体ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡを得た。前記脂質複合体ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡでは、ｓｉＲＮＡの電荷数に基づいて、カチオン性リポソームＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比は４に固定された（ＤＯＴＡＰの１つのアミノ窒素が１つの正電荷を持ち、ｓｉＲＮＡの１つのリン酸基が１つの負電荷を持っているので、１６．６７μＭのＣＬＳは５μＭのＤＯＴＡＰを含み、すなわち、１μＭのＣＬＳは０．３μＭの正電荷を含み、１μＭのｓｉＲＮＡは４２μＭの負電荷を含み、ＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比は、（ＣＬＳのμＭ値×０．３）／（ｓｉＲＮＡのμＭ値×４２）＝０．００７×ＣＬＳ（μＭ）／ｓｉＲＮＡ（μＭ）である）。類似するように、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’でＦＡＭが修飾したＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ溶液及びＣＬＳ／Ｒ８／ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ複合体を調製した。
【0118】
［実施例５］
（表面が修飾されたリポソーム医薬製剤の調製）
リポソーム医薬製剤に対して細胞透過性ペプチドを用いて表面修飾を行って、表面が修飾された医薬製剤を得た。
（表面が修飾されたリポソーム医薬製剤の調製）
リポソーム医薬製剤に対して細胞透過性ペプチドを用いて表面修飾を行って、表面が修飾された医薬製剤を得た。
【0119】
《ｉ．細胞透過性ペプチド－ＰＥＧ－リン脂質の調製》
ＤＳＰＥ－ポリエチレングリコールマレイミド（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－マレイミド）（Ｌａｙｓａｎ Ｂｉｏ、１４６－１２３）と末端にシステインで修飾されたｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体（８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－Ｃｙｓ）とは、１つのステップで反応して、細胞透過性ペプチド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥを得た。
ＤＳＰＥ－ポリエチレングリコールマレイミド（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－マレイミド）（Ｌａｙｓａｎ Ｂｉｏ、１４６－１２３）と末端にシステインで修飾されたｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体（８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－Ｃｙｓ）とは、１つのステップで反応して、細胞透過性ペプチド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥを得た。
【0120】
具体的には、２０ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ３４００－マレイミドを１ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶かし、１０ｍＬリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．２）溶媒に溶解した１８ｍｇの８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－Ｃｙｓを撹拌状態で加え、２５℃の条件で反応を完了するために一晩攪拌し続けた。反応が終わった後、得られた混合物を氷浴の条件で純水中に置いて２日間透析し、冷凍乾燥して、白い凝集物である８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥを得た。
【0121】
ここで、前記ポリペプチド８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎは、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの誘導体であり、具体的なアミノ酸配列はＲＱＩＫＩＷＦＷＷＲＲＭＫＷＫＫ（本明細書では、８９Ｗは、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ第８位のグルタミン及び第９位のアスパラギンに対してトリプトファンの変異を行った産物を示す）である。細胞透過性ペプチド－ＰＥＧ－ＤＳＰＥにおける細胞透過性ペプチドは、他のｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体を使用してもよく、具体的に中国特許出願ＣＮ２０１７１０４１４３３４．７を参照すればよい。
【0122】
ポリエチレングリコール末端基との反応を容易にするために、細胞透過性ペプチド８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ又は他のｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ誘導体のＮ－端又はＣ－端に１つのシステイン残基（ｃｙｓｔｅｉｎｅ，Ｃ）を追加してもよい。
【0123】
《ｉｉ．表面が修飾されたリポソーム医薬製剤の調製》
細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの全体に対するモル比が５％であるｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥと８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥについて、それぞれ、ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥと８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥに対するモル比が０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％である８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥの混合物を調製した。すなわち、８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥは、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの全体に対するモル比が、それぞれ０％、１％、２％、３％、４％、５％であった。
細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの全体に対するモル比が５％であるｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥと８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥについて、それぞれ、ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥと８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥに対するモル比が０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％である８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥの混合物を調製した。すなわち、８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥは、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの全体に対するモル比が、それぞれ０％、１％、２％、３％、４％、５％であった。
【0124】
実施例４で得られたＣＬＳ／Ｒ８／ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ複合体を、それぞれ、ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥと８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥに対するモル比が０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％である８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥの混合物と混合した後、５５℃で３０分間インキュベートした後に、表面に細胞透過性ペプチドが０％、１％、３％、４％、５％の割合で修飾したリポソーム医薬製剤、すなわち、８９Ｗ－ＣＬＳ／Ｒ８／ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡを得た。
【0125】
［実施例６］
（表面に細胞透過性ペプチドが異なる割合で修飾した医薬製剤に対する細胞摂取の定量的評価）
Ｕ８７細胞（ヒト神経膠腫細胞、ＡＴＣＣより購入）をＤＭＥＭ完全培地（ＦＢＳ １０％とペニシリン－ストレプトマイシン１％が添加されたＤＭＥＭ培地）で培養した。成長状態のよいＵ８７細胞を取って、ＤＭＥＭ完全培地に再懸濁し、５×１０５個の細胞／ウェル、ウェルごとに１ｍＬで６ウェルプレートに播種し、播種後、毎日新鮮な培養液を１回変えて、２～３日培養した後に実験を行った。
（表面に細胞透過性ペプチドが異なる割合で修飾した医薬製剤に対する細胞摂取の定量的評価）
Ｕ８７細胞（ヒト神経膠腫細胞、ＡＴＣＣより購入）をＤＭＥＭ完全培地（ＦＢＳ １０％とペニシリン－ストレプトマイシン１％が添加されたＤＭＥＭ培地）で培養した。成長状態のよいＵ８７細胞を取って、ＤＭＥＭ完全培地に再懸濁し、５×１０５個の細胞／ウェル、ウェルごとに１ｍＬで６ウェルプレートに播種し、播種後、毎日新鮮な培養液を１回変えて、２～３日培養した後に実験を行った。
【0126】
培養液を捨てた後、無菌ＰＢＳでＵ８７細胞を３回洗浄し、実施例５で調製した、表面に細胞透過性ペプチドが異なる割合で修飾したリポソーム医薬製剤１ｍＬ（ＦＡＭでラベルされたｓｉＲＮＡを封入した）の無血清ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％、ＣＯ２の条件で４時間インキュベートした。
【0127】
続いて、培養液を捨て、０．０２ｍｇ／ｍＬヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ緩衝溶液で、ウェルや細胞表面に吸着した正電性物質を洗い流した。トリプシンで細胞を処理し、２００μＬの無菌ＰＢＳ緩衝溶液で再懸濁し、均一に吹き付けた後に試料ごとに細胞を数え、１０４個の細胞を取ってフローサイトメトリー検出を行った。無血清ＤＭＥＭ培地でインキュベートした細胞を陰性対照グループとする。すべての実験は三重に実施し、結果を図１６に示した（平均値±ＳＤ，ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊は２つのグループの間で統計学的に著しい違いがあることを示している。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊と＊＊＊は２つのグループの間に統計学的に非常に著しい違いがあることを示している）。
【0128】
図１６中、横軸における「０％、１％、２％、３％、４％、５％」は、表面に細胞透過性ペプチドがそれぞれ０％、１％、２％、３％、４％、５％の割合で修飾したリポソーム医薬製剤、すなわち８９Ｗ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡを表す。
【0129】
図１６から分かるように、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料全体に対する、８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥのモル比が２％、３％、４％である場合、表面に細胞透過性ペプチドが前記割合で修飾した医薬製剤に対する細胞の摂取効果は、市販されている遺伝子トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏ ２０００より優れていた。
【0130】
［実施例７］
（細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料を異なる配合比で用いて調製された医薬製剤に対する細胞摂取の定量的評価）
Ｕ８７細胞（ヒト神経膠腫細胞、ＡＴＣＣより購入）をＤＭＥＭ完全培地（ＦＢＳ １０％とペニシリン－ストレプトマイシン１％が添加されたＤＭＥＭ培地）で培養した。成長状態のよいＵ８７細胞を取って、ＤＭＥＭ完全培地に再懸濁し、５×１０５個の細胞／ウェル、ウェルごとに１ｍＬで６ウェルプレートに播種し、播種後、毎日新鮮な培養液を１回変えて、２～３日培養した後に実験を行った。
（細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料を異なる配合比で用いて調製された医薬製剤に対する細胞摂取の定量的評価）
Ｕ８７細胞（ヒト神経膠腫細胞、ＡＴＣＣより購入）をＤＭＥＭ完全培地（ＦＢＳ １０％とペニシリン－ストレプトマイシン１％が添加されたＤＭＥＭ培地）で培養した。成長状態のよいＵ８７細胞を取って、ＤＭＥＭ完全培地に再懸濁し、５×１０５個の細胞／ウェル、ウェルごとに１ｍＬで６ウェルプレートに播種し、播種後、毎日新鮮な培養液を１回変えて、２～３日培養した後に実験を行った。
【0131】
実施例５に記載の方法にしたがって、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料の配合比が表２に示すような医薬製剤（ＦＡＭでラベルされたｓｉＲＮＡを封入した）を調製した。
【0132】
【表2】
【0133】
Ｕ８７細胞の培養液を捨てた後、無菌ＰＢＳで３回洗った。各ウェルにはそれぞれフォーミュラ１、フォーミュラ２、フォーミュラ３によって調製されたリポソーム医薬製剤を含む１ｍＬの無血清ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％、ＣＯ２条件で４時間インキュベートした。
【0134】
続いて、培養液を捨て、０．０２ｍｇ／ｍＬヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ緩衝溶液でウェルや細胞表面に吸着した正電性物質を洗い流した。トリプシンで細胞を処理して、２００μＬ無菌ＰＢＳ緩衝溶液に再懸濁し、均一に吹き付けて試料ごとに細胞を数え、１０４個の細胞を取ってフローサイトメトリー検出を行った。無血清ＤＭＥＭ培地でインキュベートした細胞を用いて陰性対照グループとした。すべての実験は三重に実施し、結果を図１７に示した（平均値±ＳＤ，ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊は２つのグループの間で統計学的に著しい違いがあることを示している。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊と＊＊＊は２つのグループの間に統計学的に非常に著しい違いがあることを示している）。
【0135】
図１７から分かるように、フォーミュラ１、フォーミュラ２、フォーミュラ３によって調製されたリポソーム医薬製剤はいずれも細胞によって摂取でき、対照グループと比較して著しい差異があり、更に、フォーミュラ２によって調製されたリポソーム医薬製剤に対する細胞の摂取効果が最適であった。
【0136】
［実施例８］
（成分（ｉｖ）が異なる配合比である細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料を用いて調製された医薬製剤の粒径）
実施例５に記載の方法にしたがって、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料の成分（ｉ）：成分（ｉｉ）：成分（ｉｉｉ）のモル比が３：３：４ｓであり、成分（ｉｖ）の配合比が表３に示すようなリポソーム医薬製剤（ＦＡＭでラベルされたｓｉＲＮＡを封入した）を調製した。
（成分（ｉｖ）が異なる配合比である細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料を用いて調製された医薬製剤の粒径）
実施例５に記載の方法にしたがって、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料の成分（ｉ）：成分（ｉｉ）：成分（ｉｉｉ）のモル比が３：３：４ｓであり、成分（ｉｖ）の配合比が表３に示すようなリポソーム医薬製剤（ＦＡＭでラベルされたｓｉＲＮＡを封入した）を調製した。
【0137】
【表3】
【0138】
細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料に対する成分（ｉｖ）のモル比が１％、５％、８％、１０％リポソーム医薬製剤を得た。前記リポソーム医薬製剤について粒径測定を行った。
【0139】
粒径測定結果を図１８に示す。図１８中、横軸における「１％、５％、８％、１０％」は、それぞれ細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料に対する成分（ｉｖ）のモル比が１％、５％、８％、１０％であるリポソーム医薬製剤を示す。
【0140】
図１８から分かるように、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料に対する成分（ｉｖ）のモル比が１％～１０％である場合、医薬製剤の粒径は１００ｎｍ～２００ｎｍにある。更に、細胞透過性ペプチドで修飾したリポソームの膜材料に対する成分（ｉｖ）のモル比が増加するにつれて、粒径が増大する傾向を示した。
【0141】
［実施例９］
（カチオン性リポソーム／ｓｉＲＮＡが異なる電荷比で調製された医薬製剤に対する細胞摂取の定量的評価）
Ｕ８７細胞（ヒト神経膠腫細胞、ＡＴＣＣより購入）をＤＭＥＭ完全培地（ＦＢＳ １０％とペニシリン－ストレプトマイシン１％が添加されたＤＭＥＭ培地）で培養した。成長状態のよいＵ８７細胞を取って、ＤＭＥＭ完全培地に再懸濁し、５×１０５個の細胞／ウェル、ウェルごとに１ｍＬで６ウェルプレートに播種し、播種後、毎日新鮮な培養液を１回変えて、２～３日培養した後に実験を行った。
（カチオン性リポソーム／ｓｉＲＮＡが異なる電荷比で調製された医薬製剤に対する細胞摂取の定量的評価）
Ｕ８７細胞（ヒト神経膠腫細胞、ＡＴＣＣより購入）をＤＭＥＭ完全培地（ＦＢＳ １０％とペニシリン－ストレプトマイシン１％が添加されたＤＭＥＭ培地）で培養した。成長状態のよいＵ８７細胞を取って、ＤＭＥＭ完全培地に再懸濁し、５×１０５個の細胞／ウェル、ウェルごとに１ｍＬで６ウェルプレートに播種し、播種後、毎日新鮮な培養液を１回変えて、２～３日培養した後に実験を行った。
【0142】
実施例５に記載の方法にしたがって、オリゴアルギニンＲ８溶液と２０μＭのＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ溶液を電荷比が５である割合で等体積で混合し、３０秒間ボルテックスし、３７℃の条件で３０分間インキュベートして、複合体Ｒ８／ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡを得た。
【0143】
８μＬのＲ８／ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ複合体を取って、調製されたカチオン性リポソームＣＬＳと、リポソームとＦＡＭ－ｓｉＲＮＡの電荷比が２、４、６、８、１０、１２の割合で混合し、３０秒間ボルテックスし、カチオン性リポソーム／ｓｉＲＮＡが異なる電荷比のＣＬＳ／Ｒ８／ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ複合体を得た。
【0144】
更に、実施例５に記載の方法にしたがって、表面に３％の細胞透過性ペプチドで修飾した医薬製剤、すなわち８９Ｗ－ＣＬＳ／Ｒ８／ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ複合体を得た。
【0145】
Ｕ８７細胞の培養液を捨てた後、無菌ＰＢＳで３回洗った。ウェルごとにカチオン性リポソーム／ｓｉＲＮＡの電荷比が２、４、６、８、１０、１２である医薬製剤を含む１ｍＬ無血清ＤＭＥＭ培地をそれぞれ添加し、３７℃、５％、ＣＯ２条件で４時間インキュベートした。
【0146】
続いて、培養液を捨て、０．０２ｍｇ／ｍＬヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ緩衝溶液でウェルや細胞表面に吸着した正電性物質を洗い流した。トリプシンで細胞を処理して、２００μＬ無菌ＰＢＳ緩衝溶液に再懸濁し、均一に吹き付けて試料ごとに細胞を数え、１０４個の細胞を取ってフローサイトメトリー検出を行った。無血清ＤＭＥＭ培地でインキュベートした細胞を用いて陰性対照グループとした。すべての実験は三重に実施し、結果を図１９に示した（平均値±ＳＤ，ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊は２つのグループの間で統計学的に著しい違いがあることを示している。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊と＊＊＊は２つのグループの間に統計学的に非常に著しい違いがあることを示している）。
【0147】
図１９に示すように、カチオン性リポソーム／ｓｉＲＮＡの電荷比が２、４、６、８、１０、１２であるように調製された医薬製剤はいずれも細胞に摂取され、対照グループと比較して、著しい違いがあり、そのうち、カチオン性リポソーム／ｓｉＲＮＡの電荷比が４である場合に調製されたリポソーム医薬製剤に対する細胞の摂取効果が最適であった。
【0148】
［実施例１０］
（異なる構造タイプのカチオン性材料を含む医薬製剤によるＬＵＣ－Ｕ８７細胞へのトランスフェクション効果の定性と定量的な評価）
Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１２、ｃ－Ｒ８、ｃ－Ｒ１０、ｃ－Ｒ１２等のオリゴアルギニンを異なる構造タイプの正に帯電したポリアミノ酸として使用し、前記オリゴアルギニンとｓｉＲＮＡとの電荷比を５、ＣＬＳとＬＵＣ－ｓｉＲＮＡの電荷比を４とし、実施例５にしたがって、異なるオリゴアルギニンを含み、表面に細胞透過性ペプチドを３％の割合で修飾したリポソーム医薬製剤を調製した。使用したＬＵＣ－ｓｉＲＮＡは、センス鎖（５’－３’）がＧＣＵＧＣＡＣＵＣＵＧＧＣＧＡＣＡＵＵＴＴ（配列番号８３）であり、アンチセンス鎖（５’－３’）がＡＡＵＧＵＣＧＣＣＡＧＡＧＵＧＣＡＧＣＴＴ（配列番号８４）であった。
（異なる構造タイプのカチオン性材料を含む医薬製剤によるＬＵＣ－Ｕ８７細胞へのトランスフェクション効果の定性と定量的な評価）
Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１２、ｃ－Ｒ８、ｃ－Ｒ１０、ｃ－Ｒ１２等のオリゴアルギニンを異なる構造タイプの正に帯電したポリアミノ酸として使用し、前記オリゴアルギニンとｓｉＲＮＡとの電荷比を５、ＣＬＳとＬＵＣ－ｓｉＲＮＡの電荷比を４とし、実施例５にしたがって、異なるオリゴアルギニンを含み、表面に細胞透過性ペプチドを３％の割合で修飾したリポソーム医薬製剤を調製した。使用したＬＵＣ－ｓｉＲＮＡは、センス鎖（５’－３’）がＧＣＵＧＣＡＣＵＣＵＧＧＣＧＡＣＡＵＵＴＴ（配列番号８３）であり、アンチセンス鎖（５’－３’）がＡＡＵＧＵＣＧＣＣＡＧＡＧＵＧＣＡＧＣＴＴ（配列番号８４）であった。
【0149】
成長状態のよいＵ８７細胞（ＡＴＣＣより購入）を取って、５×１０４個の細胞／ウェルでそれぞれ４８ウェルプレートに播種し、播種後、毎日培養液を１回変えて、２～３日培養した後に実験を行った。ＤＭＥＭ完全培地を捨てた後、無菌ＰＢＳで３回洗って、それぞれ４００ｎＭ ＬＵＣ－ｓｉＲＮＡを封入したリポソーム医薬製剤を含む無血清ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％、ＣＯ２条件で４時間インキュベートした。続いて、薬液を捨てて、ＤＭＥＭ完全培地を加えて引き続き２４時間インキュベートし（本明細書ではＬＵＣ－Ｕ８７細胞ともいう）、０．０２ｍｇ／ｍＬヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ緩衝溶液で正電性吸着物質を洗い流して、ホタルルシフェラーゼ基質を加え、小動物生体蛍光／生物発光イメージングシステム（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）で蛍光強度を測定した。
【0150】
【0151】
この実施例は、異なる構造タイプの正に帯電したポリアミノ酸の遺伝子ノックダウンに対する効果を探究するためであり、図２０Ａ及び図２０Ｂから、リポソーム医薬製剤におけるオリゴアルギニンの重合度と構造を変更することが遺伝子のノックダウン作用に顕著な影響を及ぼさないことがわかった。
【0152】
［実施例１１］
（ｓｉＲＮＡを封入した送達キャリアによるｂＥｎｄ．３細胞とＵ８７細胞のアポトーシス促進能力の評価）
ＤＭＥＭ培地における対数周期の成長状態が良好なｂＥｎｄ．３細胞とＵ８７細胞（いずれもＡＴＣＣより購入）を取って、５×１０４／ウェルの濃度で、それぞれ１２ウェルプレートに播種し、３７℃、５％、ＣＯ２条件で、細胞の単層がウェル底を覆うまで培養した。
（ｓｉＲＮＡを封入した送達キャリアによるｂＥｎｄ．３細胞とＵ８７細胞のアポトーシス促進能力の評価）
ＤＭＥＭ培地における対数周期の成長状態が良好なｂＥｎｄ．３細胞とＵ８７細胞（いずれもＡＴＣＣより購入）を取って、５×１０４／ウェルの濃度で、それぞれ１２ウェルプレートに播種し、３７℃、５％、ＣＯ２条件で、細胞の単層がウェル底を覆うまで培養した。
【0153】
培養液を捨て、無菌ＰＢＳ緩衝溶液で３回洗った後、４００ｎｍｏｌ／Ｌ ｓｉＲＮＡを含む、実施例５で調製した医薬製剤（８９Ｗ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ）（当該医薬製剤には、オリゴアルギニンとｓｉＲＮＡの電荷比が５であり、ＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比が４であり、表面に８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥを３％の割合で修飾した）４００μＬを加え、インキュベーター中で６時間インキュベートした。続いて、薬液を捨て、無菌ＰＢＳ緩衝溶液で３回洗った後、完全培地１ｍＬを入れて引き続き１８時間培養した。続いて、細胞を集め、ＰＢＳで洗浄し、ＥＤＴＡ不含トリプシンで１分間処理し、ＤＭＥＭ培養液で処理を終了した。
【0154】
続いて細胞を遠心管に集め、細胞アポトーシス検査キット（南京凱基生物科学技術発展有限公司、ＫＧＡ１０８）を用いて細胞を二重染色し、フローサイトメトリーを用いて検出した。無血清ＤＭＥＭ培地でインキュベートした細胞を陰性対照グループとした。すべての実験は三重に実施し、結果を図２１Ａ～Ｄに示した（平均値±ＳＤ，ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊は２つのグループの間で統計学的に著しい違いがあることを示している。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊と＊＊＊は２つのグループの間に統計学的に非常に著しい違いがあることを示す）。
【0155】
その結果、本発明の設計した送達キャリアは、腫瘍細胞Ｕ８７のアポトーシスを特異的に促進することができ、正常細胞ｂＥｎｄ．３細胞の成長に大きな影響を及ぼさないことが明らかとなった。
【0156】
［実施例１２］
（各化学療法薬及び遺伝子薬物の半分最大阻害濃度ＩＣ５０値の測定）
化学療法薬の半分最大阻害濃度ＩＣ５０値を測定した。すなわち、密度が３×１０４細胞／ｍＬのＵ８７単細胞懸濁液を調製し、ウェルごとに１００μＬで９６ウェルプレートに播種し、エッジのウェルを滅菌ＰＢＳ緩衝液で充填し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度）に移して２４時間インキュベートした。
（各化学療法薬及び遺伝子薬物の半分最大阻害濃度ＩＣ５０値の測定）
化学療法薬の半分最大阻害濃度ＩＣ５０値を測定した。すなわち、密度が３×１０４細胞／ｍＬのＵ８７単細胞懸濁液を調製し、ウェルごとに１００μＬで９６ウェルプレートに播種し、エッジのウェルを滅菌ＰＢＳ緩衝液で充填し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度）に移して２４時間インキュベートした。
【0157】
続いて、培地を廃棄し、化学療法薬として、カルムスチン（ＢＣＮＵ、大連美侖生物技術有限公司、ＭＢ１３０）と、ドセタキセル（ＤＴＸ、大連美侖生物技術有限公司、ＭＢ１０８１）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、大連美侖生物技術有限公司、ＭＢ５３８６）、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ、大連美侖生物技術有限公司、ＭＢ２０３１）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、大連美侖生物技術有限公司、ＭＢ１０５５）、ドキソルビシン（ＤＯＸ、大連美侖生物技術有限公司、ＭＢ１０８７）を含み、又は化学療法剤を含まない培地２００μＬに取り替えて、細胞培養した。
【0158】
４８時間後、ｃｃｋ－８溶液（上海碧云天生物技術有限公司、Ｃ００４２）１０μＬを各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートを続け、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＸＳ）の４９０ｎｍ波長で各ウェルのＯＤ値を測定した。
【0159】
遺伝子薬物の半分最大阻害濃度ＩＣ５０値を測定した。すなわち、密度が１×１０５細胞／ｍＬのＵ８７単細胞懸濁液を調製し、ウェルごとに５００μＬで２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度）に移し、２４時間培養した。
【0160】
続いて培地を廃棄し、ｓｉＲＮＡを含む、実施例５で調製したリポソーム製剤（８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ）４００μＬを添加した。そのリポソーム製剤は、オリゴアルギニンとｓｉＲＮＡの電荷比が５であり、ＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比が４であり、表面に８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥを３％の割合で修飾したリポソーム医薬製剤であった。
【0161】
６時間後に薬液を廃棄し、細胞を再度処理し、９６ウェルプレートに３０００個細胞／ウェルの濃度で播種し、新鮮なＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地）を加えて培養を続けた。４８時間後、各ウェルにｃｃｋ－８溶液１０μＬを加え、３７℃で２時間インキュベートした後に、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＸＳ）の４９０ｎｍ波長で各ウェルのＯＤ値を測定した。
【0162】
細胞生存率（％）＝（ＯＤｓ－ＯＤｂｌａｎｋ）／（ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ－ＯＤｂｌａｎｋ）×１００％
［式中、ＯＤｓは薬物グループの吸光度、ＯＤｃｏｎｔｒｏｌはブランク対照グループの吸光度（ウェルには細胞、ＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）、ＯＤｂｌａｎｋはブランクウェルの吸光度である（ウェルにはＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）。］
［式中、ＯＤｓは薬物グループの吸光度、ＯＤｃｏｎｔｒｏｌはブランク対照グループの吸光度（ウェルには細胞、ＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）、ＯＤｂｌａｎｋはブランクウェルの吸光度である（ウェルにはＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）。］
【0163】
すべての実験は三重に実施され、実験結果をＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアによって分析した。結果を図２２に示す。
【0164】
結果は、化学療法薬ＢＣＮＵ、ＤＴＸ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＤＯＸの半分最大阻害濃度ＩＣ５０値は、それぞれ９２．０４μＭ、１５．５２ｎＭ、０．１１μＭ、４１．５９μＭ、５．６２μＭ、０．１７μＭであることを示した。遺伝子薬物ｓｉＲＮＡの半分最大阻害濃度ＩＣ５０値は９０．９９ｎＭであった。
【0165】
［実施例１３］
（遺伝子薬物と異なる化学療法薬とを併用することによるインビトロ抗腫瘍薬力学的評価）
密度が１×１０５細胞／ｍＬのＵ８７単細胞懸濁液を調製し、ウェルごとに５００μＬで２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度）に移した。２４時間培養し、培地を廃棄し、ｓｉＲＮＡを含む、実施例５で調製したリポソーム製剤（８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ）４００μＬを添加した。
（遺伝子薬物と異なる化学療法薬とを併用することによるインビトロ抗腫瘍薬力学的評価）
密度が１×１０５細胞／ｍＬのＵ８７単細胞懸濁液を調製し、ウェルごとに５００μＬで２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度）に移した。２４時間培養し、培地を廃棄し、ｓｉＲＮＡを含む、実施例５で調製したリポソーム製剤（８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ）４００μＬを添加した。
【0166】
リポソーム製剤は、オリゴアルギニンとｓｉＲＮＡの電荷比が５であり、ＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比が４であり、表面に８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥを３％の割合で修飾したリポソーム医薬製剤であった。
【0167】
６時間後に薬液を廃棄し、細胞を再度処理し、９６ウェルプレートに３０００細胞／ウェルの濃度で播種し、新鮮なＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地）を加えて引き続き１２時間培養した。続いて、培地を異なる化学療法薬（ＢＣＮＵ、ＤＴＸ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＤＯＸ）を含有する完全培地に取り替えて引き続き培養した（遺伝子薬物と化学療法薬のモル濃度比は、両者の半分最大阻害濃度ＩＣ５０値の比である）。４８時間後、各ウェルにｃｃｋ－８溶液１０μＬを加え、３７℃で２時間インキュベートした後に、マイクロプレートリーダーの４９０ｎｍ波長で各ウェルのＯＤ値を測定した。
【0168】
細胞生存率（％）＝（ＯＤｓ－ＯＤｂｌａｎｋ）／（ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ－ＯＤｂｌａｎｋ）×１００％
［式中、ＯＤｓは薬物グループの吸光度、ＯＤｃｏｎｔｒｏｌはブランク対照グループの吸光度（ウェルには細胞、ＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）、ＯＤｂｌａｎｋはブランクウェルの吸光度である（ウェルにはＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）。］
［式中、ＯＤｓは薬物グループの吸光度、ＯＤｃｏｎｔｒｏｌはブランク対照グループの吸光度（ウェルには細胞、ＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）、ＯＤｂｌａｎｋはブランクウェルの吸光度である（ウェルにはＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）。］
【0169】
すべての実験は三重に実施した。結果を図２３に示す。結果は、遺伝子薬物と異なる化学療法薬を併用するコンビネーションインデックスと用量低減指数を取得することを目的として、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェアで更に分析した。
【0170】
計算結果を図２４Ａ及び図２４Ｂに示す。図２４Ａ及び図２４Ｂに示すように、異なる化学療法薬であるＢＣＮＵ、ＤＴＸ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＤＯＸが、それぞれ遺伝子薬物ｓｉＲＮＡと相乗的に細胞の生存率を低下させる役割を果たしていた。特に、化学療法薬ＤＴＸ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＤＯＸと遺伝子薬物のコンビネーションインデックスは１未満であり、用量低減指数は１より大きく、相乗効果を発揮する好ましい併用治療効果を有することを示す。
【0171】
また、化学療法薬ＢＣＮＵ、Ｉｍａｔｉｎｉｂと遺伝子薬物とのコンビネーションインデックスは１より大きく、用量低減指数は１未満であり、相乗効果を発揮する役割を果たすが、併用療法で使用される用量減少は化学療法薬ＤＴＸ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＤＯＸほどではなかった。よって、化学療法薬ＤＴＸ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＤＯＸは、特定の総薬物用量で遺伝子薬物と併用する最適な化学療法薬をスクリーニングするためのさらなる実験に用いた。
【0172】
［実施例１４］
（遺伝子薬物と異なる化学療法薬とを併用することによるインビトロ抗腫瘍薬力学的スクリーニング）
密度が１×１０５細胞／ｍＬのＵ８７単細胞懸濁液を調製し、ウェルごとに５００μＬで２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度）に移し、２４時間培養し、元の培地を廃棄し、ｓｉＲＮＡを含む、実施例５で調製したリポソーム製剤（８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ）４００μＬを添加した。
（遺伝子薬物と異なる化学療法薬とを併用することによるインビトロ抗腫瘍薬力学的スクリーニング）
密度が１×１０５細胞／ｍＬのＵ８７単細胞懸濁液を調製し、ウェルごとに５００μＬで２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度）に移し、２４時間培養し、元の培地を廃棄し、ｓｉＲＮＡを含む、実施例５で調製したリポソーム製剤（８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ）４００μＬを添加した。
【0173】
リポソーム製剤は、オリゴアルギニンとｓｉＲＮＡの電荷比が５であり、ＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比が４であり、表面に８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥを３％の割合で修飾したリポソーム医薬製剤であった。
【0174】
６時間後に薬液を廃棄し、細胞を再度処理し、９６ウェルプレートに３０００個細胞／ウェルの濃度で播種し、新鮮なＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地）を加えて引き続き１２時間培養した。続いて、培地を異なる化学療法薬（ＤＴＸ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ＤＯＸ）を含むＤＭＥＭ完全培地に取り替えて培養を継続した（遺伝子薬物と化学療法薬の濃度比は、両者の半分最大阻害濃度ＩＣ５０値の比であり、遺伝子薬物と化学療法薬物の濃度の合計は２００ｎＭである）。
【0175】
４８時間後、各ウェルにｃｃｋ－８溶液１０μＬを加え、３７℃で２時間インキュベートした後に、マイクロプレートリーダーの４９０ｎｍ波長で各ウェルのＯＤ値を測定した。
【0176】
細胞生存率（％）＝（ＯＤｓ－ＯＤｂｌａｎｋ）／（ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ－ＯＤｂｌａｎｋ）×１００％
［式中、ＯＤｓは薬物グループの吸光度、ＯＤｃｏｎｔｒｏｌはブランク対照グループの吸光度（ウェルには細胞、ＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）、ＯＤｂｌａｎｋはブランクウェルの吸光度である（ウェルにはＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）。］
［式中、ＯＤｓは薬物グループの吸光度、ＯＤｃｏｎｔｒｏｌはブランク対照グループの吸光度（ウェルには細胞、ＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）、ＯＤｂｌａｎｋはブランクウェルの吸光度である（ウェルにはＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）。］
【0177】
すべての実験は三重に実施し、実験結果をＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアによって分析した。結果を図２５に示す（平均値±ＳＤ，ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊は２つのグループの間で統計学的に著しい違いがあることを示している。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊は２つのグループの間に統計学的に非常に著しい違いがあることを示している。ｎｓは２つのグループの間に統計学的に著しい違いがないことを示している）。
【0178】
結果は、遺伝子薬物と化学療法薬の濃度比が両者の半分最大阻害濃度ＩＣ５０値の比であり、遺伝子薬物と化学療法薬の濃度の合計が２００ｎＭである場合、遺伝子薬物及び化学療法薬ＤＴＸの併用は細胞生存率に対して最大の抑制作用を有することを示し、最適なインビトロ抗腫瘍効果を有することを示している。この結果に基づいて、特定の総薬物量で、遺伝子薬物と化学療法薬ＤＴＸを併用して後の実験研究に用いた。
【0179】
［実施例１５］
（カチオン性リポソーム及び正に帯電したポリアミノ酸が遺伝子薬物及び化学療法薬を封入した医薬製剤の調製）
実施例１に記載されているように、膜材料、すなわち、３．５ｍｇのＤＯＴＡＰ、３．７２ｍｇのＤＯＰＥ、２．５９ｍｇのコレステロールを秤量し、４μｇのＤＴＸ薬物物質（大連美侖生物技術有限公司、ＭＡ１０８１）を加え、共にクロロホルムに溶解した。
（カチオン性リポソーム及び正に帯電したポリアミノ酸が遺伝子薬物及び化学療法薬を封入した医薬製剤の調製）
実施例１に記載されているように、膜材料、すなわち、３．５ｍｇのＤＯＴＡＰ、３．７２ｍｇのＤＯＰＥ、２．５９ｍｇのコレステロールを秤量し、４μｇのＤＴＸ薬物物質（大連美侖生物技術有限公司、ＭＡ１０８１）を加え、共にクロロホルムに溶解した。
【0180】
得られた溶液をロータリーエバポレーター（上海申生科技有限公司、Ｒ２０１Ｌ）によってクロロホルムを除去し、得られた乾燥脂質フィルムを３７℃の水浴中で１ｍＬの５％グルコース水溶液で約１０分間超音波で水和した。脂質膜が完全に水和した後、ミニ押出機（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ８１３２０）を使用してリポソームを押し出し（核孔膜の順序は、順に２００ｎｍ、１００ｎｍ及び５０ｎｍであった）、ＤＴＸを封入したＣＬＳを得た（ＣＬＳ／ＤＴＸ）。
【0181】
実施例４と類似するように、調製されたＲ８／ｓｉＲＮＡ複合体とＣＬＳ／ＤＴＸとを使用して、リポソーム複合体ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡを調製した。
【0182】
実施例５と類似するように、調製されたＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ複合体と、ｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥと８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥの全体に対するモル比が６０％である８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥの混合物とを５５℃で３０分間インキュベートして、表面に細胞透過性ペプチドを％の割合で修飾したリポソーム医薬製剤、すなわち８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡを得た。リポソーム医薬製剤は、遺伝子薬物ｓｉＲＮＡと化学療法薬ＤＴＸのモル濃度比が、両者のＩＣ５０値の比（すなわち、約６）であり、且つ遺伝子薬物ｓｉＲＮＡのモル濃度が約６．２０μＭであり、化学療法薬ＤＴＸのモル濃度が１．０３μＭであった。
【0183】
［実施例１６］
（遺伝子薬物とドセタキセル（ＤＴＸ）とを併用することによるインビトロ抗腫瘍薬力学的評価）
密度が５×１０４個／ｍＬのＵ８７単細胞懸濁液を調製し、ウェルごとに５００μＬで２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度）に移して２４時間インキュベートした。続いて、培地を廃棄し、それぞれｓｉＲＮＡを含む実施例１５で調製されたリポソーム製剤８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ又はＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ ４００μＬを加え、又は、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ＋ＤＴＸ４００μＬを加えた。
（遺伝子薬物とドセタキセル（ＤＴＸ）とを併用することによるインビトロ抗腫瘍薬力学的評価）
密度が５×１０４個／ｍＬのＵ８７単細胞懸濁液を調製し、ウェルごとに５００μＬで２４ウェルプレートに播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、飽和湿度）に移して２４時間インキュベートした。続いて、培地を廃棄し、それぞれｓｉＲＮＡを含む実施例１５で調製されたリポソーム製剤８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ又はＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ ４００μＬを加え、又は、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ＋ＤＴＸ４００μＬを加えた。
【0184】
リポソーム製剤は、オリゴアルギニンとｓｉＲＮＡの電荷比が５であり、ＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比が４であり、表面に８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥを３％の割合で修飾したリポソーム医薬製剤であった。前記８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ＋ＤＴＸは、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡとＤＴＸを物理的に混合して得たものである。遺伝子薬物ｓｉＲＮＡと化学療法薬ＤＴＸのモル濃度比は、いずれも両者のＩＣ５０値の比であった。
【0185】
６時間後に薬液を廃棄し、細胞を再度処理し、９６ウェルプレートに３０００個細胞／ウェルの濃度で播種し、新鮮なＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地）を加えて培養を継続した。４８時間後、各ウェルにｃｃｋ－８溶液１０μＬを加え、３７℃で２時間インキュベートした後に、マイクロプレートリーダーの４９０ｎｍ波長で各ウェルのＯＤ値を測定した。
【0186】
細胞生存率（％）＝（ＯＤｓ－ＯＤｂｌａｎｋ）／（ＯＤｃｏｎｔｒｏｌ－ＯＤｂｌａｎｋ）×１００％
［式中、ＯＤｓは薬物グループの吸光度、ＯＤｃｏｎｔｒｏｌはブランク対照グループの吸光度（ウェルには細胞、ＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）、ＯＤｂｌａｎｋはブランクウェルの吸光度である（ウェルにはＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）。］
［式中、ＯＤｓは薬物グループの吸光度、ＯＤｃｏｎｔｒｏｌはブランク対照グループの吸光度（ウェルには細胞、ＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）、ＯＤｂｌａｎｋはブランクウェルの吸光度である（ウェルにはＤＭＥＭ完全培地及びｃｃｋ－８のみが添加された）。］
【0187】
すべての実験は三重に実施され、実験結果をＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアによって分析した。結果を図２６に示す（平均値±ＳＤ，ｎ＝３、ｎｓは２つのグループの間に統計学的に著しい違いがないことを示している）。
【0188】
結果は、図２６に示すように、リポソーム製剤８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡでは、ＤＴＸの半分最大阻害濃度ＩＣ５０値は８．９ｎＭであり、リポソーム製剤ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡでは、ＤＴＸの半分最大阻害濃度ＩＣ５０値は２４．７ｎＭであり、リポソーム製剤８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡがＤＴＸと併用した場合、ＤＴＸの半分最大阻害濃度ＩＣ５０値は１０．３ｎＭであった。上記から分かるように、ＤＴＸが６時間しか機能しない場合、ｓｉＲＮＡとＤＴＸの本発明のリポソーム製剤への併用によって、ＤＴＸの半分最大阻害濃度を顕著に低下させることができ、より効果的な腫瘍阻害効果を有していた。
【0189】
［実施例１７］
（ＤｉＤ細胞膜蛍光プローブでラベルされたキャリアがＦＡＭ－ｓｉＲＮＡを封入した後に細胞によって摂取された状況に対する探究）
実施例１と類似するように、膜材料を秤量し、キットの説明に記載されているようにＤｉＤ細胞膜蛍光プローブ（大連美侖生物技術有限公司、ＭＢ６１９０）を添加して、ＤｉＤ細胞膜蛍光プローブでラベルされたＣＬＳ、すなわち、ＣＬＳ／ＤｉＤを調製した。
（ＤｉＤ細胞膜蛍光プローブでラベルされたキャリアがＦＡＭ－ｓｉＲＮＡを封入した後に細胞によって摂取された状況に対する探究）
実施例１と類似するように、膜材料を秤量し、キットの説明に記載されているようにＤｉＤ細胞膜蛍光プローブ（大連美侖生物技術有限公司、ＭＢ６１９０）を添加して、ＤｉＤ細胞膜蛍光プローブでラベルされたＣＬＳ、すなわち、ＣＬＳ／ＤｉＤを調製した。
【0190】
３３μｇのＦＡＭでラベルされたｓｉＲＮＡ（この実施例では、ｃ－ｍｙｃに対するｓｉＲＮＡが使用され、そのセンス鎖（５’－３’）は、ＦＡＭ－ＡＡＣＧＵＵＡＧＣＵＵＣＡＣＣＡＡＣＡｄＴｄＴであり、すなわち、５’はＦＡＭで修飾し、アンチセンス鎖（５’－３’）はＵＧＵＵＧＧＵＧＡＡＧＣＵＡＡＣＧＵＵｄＴｄＴである）を１２５μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解して、２０μＭのＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ溶液を調製し、ＤｉＤ及び／又はＦＡＭ蛍光でラベルされた各医薬製剤を調製した。
【0191】
Ｕ８７細胞（ヒト神経膠腫細胞、ＡＴＣＣより購入）又はＣａｌｕ－３細胞（ヒト肺腺癌細胞、ＡＴＣＣより購入）をＤＭＥＭ完全培地（ＦＢＳ １０％とペニシリン－ストレプトマイシン１％が添加されたＤＭＥＭ培地）で培養した。成長状態のよいＵ８７細胞又はＣａｌｕ－３細胞を取って、ＤＭＥＭ完全培地に再懸濁し、５×１０５個の細胞／ウェル、ウェルごとに１ｍＬで６ウェルプレートに播種し、播種後、毎日新鮮な培養液を１回変えて、２～３日培養した後に実験を行った。
【0192】
Ｕ８７細胞又はＣａｌｕ－３細胞の培養液を捨てた後、無菌ＰＢＳで３回洗浄した。各ウェルにそれぞれｓｉＲＮＡが異なる蛍光でラベルされた医薬製剤１μＭを含有する、１ｍＬ無血清ＤＭＥＭ培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で４時間インキュベートした。
【0193】
続いて、培養液を捨てて、０．０２ｍｇ／ｍＬヘパリンナトリウムを含むＰＢＳ緩衝溶液でウェルや細胞表面に吸着した正電性物質を洗い流した。トリプシンで細胞を処理して、２００μＬの無菌ＰＢＳ緩衝溶液で再懸濁し、均一に吹き付けた後に試料ごとに細胞を数え、１０４個の細胞を取ってフローサイトメトリー検出を行った。
【0194】
実験では、ブランクの無血清ＤＭＥＭ培地でインキュベートした細胞を陰性対照グループとして設定した。更に、２つの陽性対照グループ、すなわち、ＦＡＭのみを含む８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡと、ＤｉＤのみを含む８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤｉＤを設定した。更に、以下の製剤グループ：８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤｉＤ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループ、ＣＬＳ／ＤｉＤ／Ｒ８／ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡグループ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤｉＤ／Ｒ８／ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡグループを設定した。
【0195】
すべての実験は三重に実施した。すべての製剤の用量は１ｍＬであり、そのうち、ｓｉＲＮＡの濃度は約１μＭであり、ＤＴＸの濃度は約０．１６６７μＭ（ＤＴＸとｓｉＲＮＡのモル濃度比はＩＣ５０値の比、すなわち６である）、オリゴアルギニンとｓｉＲＮＡの電荷比が５であり、ＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比が４であり、表面に３％の割合で８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥを修飾した。
【0196】
結果を図２７に示す（平均値±ＳＤ，ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊は２つのグループの間に統計学的に非常に著しい違いがあることを示している）。
【0197】
図２７の結果から、Ｕ８７細胞及びＣａｌｕ－３細胞における８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤｉＤ／Ｒ８／ＦＡＭ－ｓｉＲＮＡ医薬製剤の摂取は、より強いＤｉＤ及びＦＡＭ二重蛍光陽性の結果を示したため、リポソーム膜に嵌入された蛍光プローブＤｉＤとリポソームに封入されたｓｉＲＮＡは、遊離の形で摂取されるのではなく、脂質複合体の形で共同で入胞することが分かった。化学療法薬ＤＴＸと蛍光プローブＤｉＤの物理的及び化学的特性が類似しているため、遺伝子薬物と化学療法薬を共同封入した医薬製剤８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡが細胞によって摂取されるにあたって、遺伝子薬物ｓｉＲＮＡと化学療法薬ＤＴＸも脂質複合体の形で共同で摂取されて入胞すると推測された。
【0198】
［実施例１８］
（遺伝子薬物とＤＴＸ化学療法薬とを併用することによるＵ８７細胞のアポトーシス促進能力の評価）
ＤＭＥＭ培地における対数周期の成長状態が良好なＵ８７細胞（ＡＴＣＣより購入）を取って、５×１０４／ウェルの濃度で、それぞれ１２ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件で、細胞の単層がウェル底を覆うまで培養した。
（遺伝子薬物とＤＴＸ化学療法薬とを併用することによるＵ８７細胞のアポトーシス促進能力の評価）
ＤＭＥＭ培地における対数周期の成長状態が良好なＵ８７細胞（ＡＴＣＣより購入）を取って、５×１０４／ウェルの濃度で、それぞれ１２ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件で、細胞の単層がウェル底を覆うまで培養した。
【0199】
培養液を捨て、無菌ＰＢＳ緩衝溶液で３回洗った後、１５０ｎｍｏｌ／Ｌ ｓｉＲＮＡを含む、実施例１５で調製したリポソーム製剤８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ、ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ、実施例５で調製した８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡとＤＴＸとの物理的混合物４００μＬを添加した。すなわち、各製剤の用量は４００μＬであった。ｓｉＲＮＡの濃度は１５０ｎｍｏｌ／Ｌに希釈された。
【0200】
リポソーム製剤は、オリゴアルギニンとｓｉＲＮＡの電荷比が５であり、ＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比が４であり、表面に３％の割合で８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥを修飾し、ＤＴＸとｓｉＲＮＡのモル濃度比は、ＩＣ５０値の比であり、すなわち、６であった。
【0201】
インキュベーター中で６時間インキュベートした後、薬液を捨て、無菌ＰＢＳ緩衝溶液で３回洗った後、完全培地の１ｍＬを入れて引き続き１８時間培養した。その後、細胞を集め、ＰＢＳで洗浄し、ＥＤＴＡ不含トリプシンで１分間処理し、ＤＭＥＭ培養液で処理を終了した。続いて、細胞を遠心管に集め、細胞アポトーシス検査キット（南京凱基生物科学技術発展有限公司、ＫＧＡ１０８）を用いて細胞を二重染色し、フローサイトメトリーを用いて検出した。
【0202】
無血清ＤＭＥＭ培地でインキュベートした細胞を陰性対照グループとした。すべての実験は三重に実施し、結果を図２８に示す（平均値±ＳＤ，ｎ＝３、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊と＊＊＊は２つのグループの間に統計学的に非常に著しい違いがあることを示している）。
【0203】
結果は、本発明で設計された遺伝子薬物及び化学療法薬を共同送達する医薬製剤は、腫瘍細胞Ｕ８７のアポトーシス率を顕著に向上させ、より効率的な腫瘍抑制効果を有することを示した。
【0204】
［実施例１９］
（遺伝子薬物とＤＴＸ化学療法薬とを併用することによる抗Ｕ８７原位置脳腫瘍の薬力学的評価）
対数成長期のＵ８７細胞を取って、数え、ＰＢＳ緩衝溶液で細胞を再懸濁した。各ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（上海西普爾－必凱試験動物有限公司、中国）に６×１０５個のＵ８７細胞（５μＬのＰＢＳ緩衝溶液に分散している）を接種した。ヌードマウスを７％含水クロラールで麻酔し、脳立体定位器で固定し、細胞を線条体部位（ブレグマ前０．６ｍｍ、右１．８ｍｍ、奥３ｍｍ）にマイクロシリンジで接種し、Ｕ８７原位置脳腫瘍モデルを構築した。
（遺伝子薬物とＤＴＸ化学療法薬とを併用することによる抗Ｕ８７原位置脳腫瘍の薬力学的評価）
対数成長期のＵ８７細胞を取って、数え、ＰＢＳ緩衝溶液で細胞を再懸濁した。各ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（上海西普爾－必凱試験動物有限公司、中国）に６×１０５個のＵ８７細胞（５μＬのＰＢＳ緩衝溶液に分散している）を接種した。ヌードマウスを７％含水クロラールで麻酔し、脳立体定位器で固定し、細胞を線条体部位（ブレグマ前０．６ｍｍ、右１．８ｍｍ、奥３ｍｍ）にマイクロシリンジで接種し、Ｕ８７原位置脳腫瘍モデルを構築した。
【0205】
前述の実施例に記載の方法にしたがって、それぞれ、リポソーム医薬製剤、すなわち、ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ、及び８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ＋ＤＴＸの物理的混合物を調製した。
【0206】
Ｕ８７原位置脳腫瘍を接種した後、マウスをランダムに分け、６つのグループ（ｎ＝１０）、すなわち、生理食塩水グループ、ＤＴＸグループ、ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ＋ＤＴＸグループを設定した。
【0207】
Ｕ８７原位置脳腫瘍を接種した後５日目から経鼻投与した。投与量は、０．６６ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ（ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ＋ＤＴＸグループ）、６．６６μｇ／ｋｇ ＤＴＸ（ＤＴＸグループ、ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ＋ＤＴＸグループ）であった。
【0208】
全ての投与製剤において、オリゴアルギニンとｓｉＲＮＡの電荷比が５であり、ＣＬＳとｓｉＲＮＡの電荷比が４であり、表面に３％の割合で８９ＷＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ－ＰＥＧ３４００－ＤＳＰＥを修飾し、ＤＴＸとｓｉＲＮＡのモル濃度比は、ＩＣ５０値の比であり、すなわち、６であった。
【0209】
投与を１日１回行って、合計２２回投与し、マウスの体重と生存期間を記録し、体重変化曲線及び生存曲線を描いた。結果を図２９、図３０に示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊と＊＊＊は２つのグループの間に統計学的に非常に著しい違いがあることを示している）。
【0210】
その結果、生理食塩水グループ、ＤＴＸグループ、ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループ、８９ＷＰ－ＣＬＳ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡ＋ＤＴＸグループの生存期間中央値は、それぞれ２０日、２１日、２７日、２７日、２８．５日であった。
【0211】
８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡグループの生存期間中央値は、３３．５日まで延長に成功し、生存曲線は他のグループと交差せず、最も顕著な抗脳神経膠腫効果を達成した。これらのデータは、８９ＷＰ－ＣＬＳ／ＤＴＸ／Ｒ８／ｓｉＲＮＡが、脳腫瘍に薬物を送達して抗腫瘍効果を発揮することができ、その独特な送達利点がより高い治療効果に変換され得ることを実証した。
【0212】
本発明を例示する目的でいくつかの代表的な実施形態及び詳細を示したが、主題発明の範囲から逸脱することなく、それらに対して様々な変更及び修正を行うことができることは、当業者にとって自明である。この点において、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【配列表】