特開 2022-76148 ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法及び製造用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022076148

(43)【公開日】2022-05-19

(54)【発明の名称】ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法及び製造用組成物

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/42 20060101AFI20220512BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20220512BHJP

【ＦＩ】

C12P7/42

C12N1/20 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020186432

(22)【出願日】2020-11-09

(71)【出願人】

【識別番号】504143441

【氏名又は名称】国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学

(71)【出願人】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】吉田 昭介

(72)【発明者】

【氏名】福居 俊昭

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AC02

4B064AD02

4B064CA02

4B064CC03

4B064CC30

4B064CD09

4B064CD16

4B064CE08

4B064DA16

4B064DA20

4B065AA01X

4B065AC20

4B065BA21

4B065BB08

4B065BB14

4B065BC01

4B065CA55

4B065CA60

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法及び製造用組成物の提供。
【解決手段】イデオネラ・サカイエンシスを、炭素源を含む試料に作用させることを含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

イデオネラ・サカイエンシスを、炭素源を含む試料に作用させることを含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

【請求項2】

前記炭素源が、ポリエチレンテレフタル酸及び糖類からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシブタン酸を構成単位とする、請求項１又は２に記載の製造方法。

【請求項4】

イデオネラ・サカイエンシスを含む、ポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物。

【請求項5】

さらに、炭素源を含む、請求項４に記載のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物。

【請求項6】

前記炭素源が、ポリエチレンテレフタル酸及び糖類からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４又は５に記載のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物。

【請求項7】

前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシブタン酸を構成単位とする、請求項４～６のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法及びポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物等に関する。

【背景技術】

【0002】

プラスチックは、そのほとんどが石油を原料として製造されている。また、使用済みのプラスチックは、埋め立て、又は焼却などにより処理されたり、環境放出されたりするものが多く、リサイクルされる割合が少ないことが問題となっている。

【0003】

そこで、近年、微生物等により分解されるポリヒドロキシアルカン酸（ＰｏｌｙＨｙｄｒｏｘｙＡｌｋａｎｏａｔｅｓ：ＰＨＡ）などの生分解性プラスチックの開発が盛んに行われている。

【0004】

一方、プラスチックの１種である、ポリエチレンテレフタル酸（ＰｏｌｙＥｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ：ＰＥＴ）を分解する、イデオネラ・サカイエンシスが発見され（非特許文献１）、その応用が期待されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００８－１９９９５７号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Yoshida et al., Science 351 (6278), 1196-1199, 2016

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本開示は、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、イデオネラ・サカイエンシスがＰＥＴを分解すること、及びポリヒドロキシアルカン酸を産生することを見出し、さらに改良を重ねた。

【0009】

本開示は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
イデオネラ・サカイエンシスを、炭素源を含む試料に作用させることを含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
項２．
前記イデオネラ・サカイエンシスが、イデオネラ・サカイエンシス ＮＢＲＣ １１０６８６である、項１に記載の製造方法。
項３．
前記炭素源が、ポリエチレンテレフタル酸及び糖類からなる群より選択される少なくとも１種である、項１又は２に記載の製造方法。
項４．
前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシブタン酸を構成単位とする、項１～３のいずれかに記載の製造方法。
項５．
イデオネラ・サカイエンシスを含む、ポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物。
項６．
前記イデオネラ・サカイエンシスが、イデオネラ・サカイエンシス ＮＢＲＣ １１０６８６である、項５に記載のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物。
項７．
さらに、炭素源を含む、項５又は６に記載のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物。
項８．
前記炭素源が、ポリエチレンテレフタル酸及び糖類からなる群より選択される少なくとも１種である、項５～７のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物。
項９．
前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシブタン酸を構成単位とする、項５～８のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物。

【発明の効果】

【0010】

イデオネラ・サカイエンシスを用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法が提供される。また、イデオネラ・サカイエンシスを含む、ポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】イデオネラ・サカイエンシスの電子顕微鏡写真を示す。

【図2】炭素源として滅菌Ａ－ＰＥＴ顆粒を含む培地にイデオネラ・サカイエンシスを作用させた時の、菌体内のポリヒドロキシアルカン酸分解物の分析結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。

【0013】

本開示は、イデオネラ・サカイエンシスを含む、ポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物を包含する。本明細書において、当該組成物を「本開示のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物」と表記することがある。

【0014】

本開示に用いられるイデオネラ・サカイエンシスとしては、イデオネラ・サカイエンシス ＮＢＲＣ １１０６８６が例示される（上記非特許文献１参照）。イデオネラ・サカイエンシス ＮＢＲＣ １１０６８６は、イデオネラ・サカイエンシス ２０１－Ｆ６、又はイデオネラ・サカイエンシス ＴＩＳＴＲ ２２８８とも称される。

【0015】

本開示に用いられるイデオネラ・サカイエンシスは、ＰＥＴａｓｅ（ＥＣ３．１．１．１０１）をコードする塩基配列を有することが好ましい。本開示に用いられるイデオネラ・サカイエンシスは、ＰＥＴａｓｅにより、ＰＥＴを、モノヒドロキシエチルテレフタル酸に分解することができる。なお、イデオネラ・サカイエンシス ＮＢＲＣ １１０６８６のＰＥＴａｓｅのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＡＰ３８３７３．１である。

【0016】

本開示に用いられるイデオネラ・サカイエンシスは、ＭＨＥＴａｓｅ（ＥＣ３．１．１．１０２）をコードする塩基配列を有することが好ましい。本開示に用いられるイデオネラ・サカイエンシスは、ＭＨＥＴａｓｅにより、モノヒドロキシエチルテレフタル酸を、エチレングリコール及びテレフタル酸に分解することができる。なお、イデオネラ・サカイエンシス ＮＢＲＣ １１０６８６のＰＥＴａｓｅのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＡＰ３８９１１．１である。

【0017】

ポリヒドロキシアルカン酸は、微生物等によって産生されるポリエステルである。本開示により得られるポリヒドロキシアルカン酸は、１種のモノマーからなる単独重合体（ホモポリマー）であってもよく、少なくとも２種以上のモノマーからなる共重合体（コポリマー）であってもよい。構成するモノマーとしては、例えば、３－ヒドロキシブタン酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、3-ヒドロキシペンタン酸、3-ヒドロキシヘキサン酸、3-ヒドロキシオクタン酸等の3-ヒドロキシアルカン酸、4-ヒドロキシブタン酸等の4-ヒドロキシアルカン酸、乳酸や2-ヒドロキシブタン酸等の2-ヒドロキシアルカン酸が挙げられる。本開示により得られるポリヒドロキシアルカン酸は、３－ヒドロキシブタン酸を構成単位とすることが好ましい。本開示により得られるポリヒドロキシアルカン酸としては、例えば、3-ヒドロキシブタン酸モノマーの単独重合体であるポリ（3-ヒドロキシブタン酸）等が挙げられる。

【0018】

ポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物中、イデオネラ・サカイエンシスの含有量は、適宜設定することができ、例えば、０．００００１～１００質量％とすることができる。より具体的には、０．００００１～９０質量％であってもよい。

【0019】

ポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物は、さらに炭素源を含んでいても良い。
本開示に用いられる炭素源としては、例えば、微生物の培養に一般的に用いられる炭素源が挙げられる。より具体的には、単糖類、オリゴ糖類、多糖類等の糖類；有機酸等が例示される。
単糖類としては、例えば、アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、エリトロース、トレオース、グリセルアルデヒド等のアルドース；プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、リブロース、キシルロース、エリトルロース、ジヒドロキシアセトン等のケトース；Ｎ－アセチルグルコサミン等が挙げられる。中でも、Ｎ－アセチルグルコサミンが好ましい。オリゴ糖類としては、例えば、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類等が挙げられる。中でも、マルトースが好ましい。多糖類としては、例えば、澱粉、セルロース、グリコーゲン、デキストラン、グルコマンナン、キシラン等が挙げられる。また、糖類としては、糖蜜、蜂蜜、果糖ブドウ糖液糖、澱粉加水分解物、水飴などの糖類の混合物であってもよい。有機酸としては、例えば、グルコン酸、アジピン酸、リンゴ酸、クエン酸等が挙げられる。
また、本開示に用いられる炭素源としては、例えばＰＥＴを用いることもできる。ＰＥＴはジカルボン酸成分であるテレフタル酸、及びジオール成分であるエチレングリコールの重縮合体である。ＰＥＴとしては、結晶性ＰＥＴ（Ｃ－ＰＥＴとも称される）であってもよく、非晶性ＰＥＴ（アモルファスＰＥＴ、又はＡ－ＰＥＴとも称される）であってもよい。中でも、非晶性ＰＥＴを好適に用いることができる。また、本開示に用いられる炭素源としては、例えばイソフタル酸共重合体ＰＥＴを用いることもできる。また、本開示に用いられる炭素源としては、例えばＰＥＴの構成成分である、テレフタル酸又はエチレングリコールを用いることもできる。また、本開示に用いられる炭素源としては、モノヒドロキシエチルテレフタル酸（ＭＨＥＴ）、ビスヒドロキシエチルテレフタル酸（ＢＨＥＴ）等のＰＥＴの加水分解物を用いることもできる。
ＰＥＴの形態は特に限定されず、例えば、顆粒状、繊維状、フィルム状、塊状、ボトル状、粒状、フレーク状、ペレット状、これらの混合体等が挙げられる。
これらの炭素源は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
ポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物中、例えば、炭素源は、ＰＥＴのみであってもよい。換言すれば、ポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物は、ＰＥＴ以外に、単糖類、オリゴ糖類、多糖類等の糖類；有機酸等を含んでいなくても良い。

【0020】

ポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物中、炭素源の含有量は、適宜設定することができ、例えば、１～９９．９９９９質量％とすることができる。

【0021】

ポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物中、イデオネラ・サカイエンシス及び炭素源の含有割合は、適宜設定することができ、例えば、０．０００１：９９．９９９９～９０：１０とすることができる。

【0022】

ポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物は、上述した成分の他、さらに他の成分を含有することができる。

【0023】

他の成分としては、例えば、溶媒、分散媒（例えば、グリセロール、ＤＭＳＯ、スキムミルク等）、保存剤、賦形剤、活性剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、培地成分（例えば、寒天；アンモニウム塩、硝酸塩、酵母エキス、ペプトン等の窒素源；炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の無機塩；ビタミン源；微量元素；抗生物質等）などが挙げられる。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。また、本開示のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物は、イデオネラ・サカイエンシスと、炭素源又は他の成分とを混合することによって用時調製されるものであってもよい。

【0024】

本開示のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物は、固体状（例えば、粉末状、顆粒状、ゲル状、ペースト状など）であってもよく、液体状（例えば、溶液状、懸濁液状）等であってもよい。

【0025】

本開示のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物は、イデオネラ・サカイエンシスと、必要に応じて炭素源又は他の成分とを組み合わせて常法により調製することができる。

【0026】

本開示のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物は、ポリヒドロキシアルカン酸を製造するための組成物として好適に用いることができる。

【0027】

本開示は、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法をも包含する。本明細書において、当該方法を「本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法」と表記することがある。

【0028】

本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法は、イデオネラ・サカイエンシスを、炭素源を含む試料に作用させることを含むことを特徴とする。より具体的には、本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法は、イデオネラ・サカイエンシスを、炭素源を含む試料を用いて培養することを含むことを特徴とする。また、本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法は、本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造用組成物を用いるものであってもよい。

【0029】

炭素源を含む試料としては、本開示に用いられる炭素源を含む限り、特に限定されない。本開示に用いられる炭素源としては、上述した記載を援用することができる。
また、本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法において、例えば、炭素源は、ＰＥＴのみであってもよい。換言すれば、本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法において、炭素源として、ＰＥＴ以外に、単糖類、オリゴ糖類、多糖類等の糖類；有機酸等が含まれていなくても良い。
本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法が、本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造用組成物を用いるものである場合、本開示のポリヒドロキシアルカン酸製造用組成物に含まれる炭素源の有無に関わらず、別途炭素源を作用させることもできる。

【0030】

炭素源を含む試料は、固体状（例えば、粉末状、顆粒状、ゲル状、ペースト状など）であってもよく、液体状（例えば、溶液状、懸濁液状）等であってもよい。

【0031】

イデオネラ・サカイエンシスを、炭素源を含む試料に作用させる方法（より具体的には、イデオネラ・サカイエンシスを、炭素源を含む試料を用いて培養する方法）としては、慣用の方法および条件を採用することができ、例えば、イデオネラ・サカイエンシスを培養する際に用いられる方法および条件を採用することができる。例えば、イデオネラ・サカイエンシスを、炭素源を含む試料に作用させる際には、必要に応じて攪拌、振盪、通気などを行うことができる。
また、イデオネラ・サカイエンシスを、炭素源を含む試料に作用させる際には、イデオネラ・サカイエンシス及び炭素源を含む試料の他、さらに他の成分を混合してもよい。他の成分としては、例えば、微生物の培養に一般的に用いられる成分等が挙げられる。より具体的には、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩、酵母エキス、ペプトン等の窒素源；炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の無機塩；ビタミン源；微量元素；抗生物質等が挙げられる。これらは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。また、当該他の成分は、炭素源を含む試料中に含まれていてもよい。

【0032】

イデオネラ・サカイエンシスを、炭素源を含む試料に作用させる温度としては、イデオネラ・サカイエンシスが生存する限り、特に限定されず、例えば、１５～４２℃とすることができる。当該範囲の上限若しくは下限は、例えば、２０、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、又は４１℃であってもよい。より具体的には、例えば、２５～３９℃であってもよい。

【0033】

イデオネラ・サカイエンシスを、炭素源を含む試料に作用させる時間としては、特に限定されず、例えば１日～１ヶ月とすることができる。当該範囲の上限若しくは下限は、例えば、７、１４、２１、又は２８日であってもよい。より具体的には、例えば、７～１４日であってもよい。

【0034】

本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法における、イデオネラ・サカイエンシスと炭素源との割合は、適宜設定することができ、例えば、０．０００１：９９．９９９９～９０：１０とすることができる。

【0035】

本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法は、さらに、イデオネラ・サカイエンシスから、ポリヒドロキシアルカン酸を抽出することを含むことができる。抽出方法としては、慣用の方法および反応条件を採用することができる。

【0036】

本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法においては、炭素源としてＰＥＴを用いる場合に、ＰＥＴを分解するために、ＰＥＴを高温で処理しなくてもよい。例えば、ＰＥＴの融解温度、より具体的には２５５℃以上で処理しなくてもよい。

【0037】

本開示のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法においては、炭素源としてＰＥＴを用いる場合に、ＰＥＴを分解するために、ＰＥＴをイデオネラ・サカイエンシス由来のＰＥＴａｓｅ以外のＰＥＴ分解酵素で処理しなくてもよい。イデオネラ・サカイエンシス由来のＰＥＴａｓｅ以外のＰＥＴ分解酵素としては、例えば、ＰＥＴ分解活性を有するクチナーゼ等が挙げられる。

【0038】

本開示によれば、ポリヒドロキシアルカン酸を製造することができる。また、イデオネラ・サカイエンシスは、ＰＥＴを分解し、かつポリヒドロキシアルカン酸を産生することができることから、本開示によれば、ＰＥＴからポリヒドロキシアルカン酸を製造することができる。

【0039】

なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。

【0040】

また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。

【実施例0041】

本開示の内容を以下の実験例を用いて具体的に説明する。しかし、本開示はこれらに何ら限定されるものではない。下記において、特に言及する場合を除いて、実験は大気圧及び常温条件下で行っている。また特に言及する場合を除いて、「％」は「質量％」を意味する。

【0042】

アモルファスＰＥＴ（Ａ－ＰＥＴ）顆粒を７０％エタノールで滅菌し、クリーンベンチ内で６０分間風乾後、デシケーター（湿度０％)で２４時間乾燥した。その後、クリーンベンチ内でシャーレ（φ９０）に５０ｍＬの最少培地を分注し、炭素源として、それぞれに滅菌Ａ－ＰＥＴ顆粒１０ｇ、あるいは滅菌マルトース溶液を終濃度１％になるよう添加した。最少培地の組成は以下の通りである。
０．０１％酵母エキス、０．０２％炭酸水素ナトリウム、０．１％硫酸アンモニウム、０．０１％炭酸カルシウム、０．１％ビタミン混合物（０．２５％チアミン－塩酸塩、０．００５％ビオチン、及び０．０５％ビタミンＢ１２）、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した０．２％微量元素（０．５％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０５％ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０５％ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０５％ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ)

【0043】

栄養培地（１．０％ポリペプトン、０．２％酵母エキス、及び０．１％ＭｇＳＯ_４）で前培養したイデオネラ・サカイエンシス ＮＢＲＣ １１０６８６を初期ＯＤ_６６０＝０．００２となるように植菌し、３０℃、５０ｒｐｍで往復振盪を行った。２１６時間後に培養液を遠心（5000×ｇ、１０分間）し、菌体のみを回収した。その後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を計測した。

【0044】

得られた乾燥菌体１０～３０ｍｇに２ｍｌの硫酸－メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することにより、菌体内ポリヒドロキシアルカン酸分解物のメチルエステルを得た。これに１ｍｌの蒸留水を添加して激しく攪拌した。静置して二層に分離させた後、下層の有機層を取り出し、その組成をキャピラリーガラスクロマトグラフ装置により分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所製ＧＣ－２０１４、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＩｎｅｒｔＣａｐ－１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃から８℃／分の速度で昇温した。内部標準物質としてオクタン酸メチルを用い、ヒドロキシアルカン酸メチルエステルのピークエリアから菌体におけるポリヒドロキシアルカン酸含量を算出した。

【0045】

炭素源として、滅菌Ａ－ＰＥＴ顆粒を用いた場合の分析結果を図２に示す。なお、炭素源として、マルトースを用いた場合には、乾燥菌体重量あたりのＰＨＡ（より具体的にはＰＨＢ）含量が、２０．９重量％であったのに対して、ＰＥＴを用いた場合には、３３．８重量％であった。

【図1】

【図2】