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特開2022-76870花粉の形成に関わるポリヌクレオチド、及びその利用、並びに本塩基配列を用いた雄性不稔性の判定方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022076870
(43)【公開日】2022-05-20
(54)【発明の名称】花粉の形成に関わるポリヌクレオチド、及びその利用、並びに本塩基配列を用いた雄性不稔性の判定方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/29 20060101AFI20220513BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20220513BHJP
A01H 6/56 20180101ALI20220513BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220513BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20220513BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220513BHJP
【ＦＩ】
C12N15/29
A01H1/00 A ZNA
A01H6/56
C12N15/63 Z
C12N15/55
C12N15/09 110
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020187502
(22)【出願日】2020-11-10
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構生物系特定産業技術研究支援センター「イノベーション創出強化研究推進事業（無花粉および葉枯病耐性テッポウユリ類の新品種育成）」、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】304027279
【氏名又は名称】国立大学法人 新潟大学
(71)【出願人】
【識別番号】591108178
【氏名又は名称】秋田県
(71)【出願人】
【識別番号】591155242
【氏名又は名称】鹿児島県
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100141139
【弁理士】
【氏名又は名称】及川 周
(72)【発明者】
【氏名】岡崎 桂一
(72)【発明者】
【氏名】森山 高広
(72)【発明者】
【氏名】シェア ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】横井 直人
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 隆明
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 孝夫
(72)【発明者】
【氏名】今給黎 征郎
(72)【発明者】
【氏名】吉水 竜次
(72)【発明者】
【氏名】熊本 修
(72)【発明者】
【氏名】長谷 健
【テーマコード（参考）】
2B030
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD20
2B030CA17
2B030CA24
2B030CB02
2B030CG01
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ユリ属植物において花粉の生産能を有さない雄性不稔を誘発させる新規の方法の提供。
【解決手段】ユリ属植物において花粉の生産能を有さない雄性不稔を誘発させる方法であって、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させることを含む、方法。（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；（Ｂ）前記特定の配列からなるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；（Ｃ）前記特定の配列からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【選択図】なし
【解決手段】ユリ属植物において花粉の生産能を有さない雄性不稔を誘発させる方法であって、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させることを含む、方法。（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；（Ｂ）前記特定の配列からなるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；（Ｃ）前記特定の配列からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ユリ属植物において花粉の生産能を有さない雄性不稔を誘発させる方法であって、
以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させることを含む、方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させることを含む、方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項2】
前記ユリ属植物がオリエンタルユリ、アジアンティックユリ、ロンギフローラムユリ及びこれらを掛け合わせた交配種からなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法であって、
以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる工程を含む、作出方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる工程を含む、作出方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項4】
前記欠損又は抑制させる工程において、ゲノム編集技術を用いて、前記ＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、請求項３に記載の作出方法。
【請求項5】
前記ゲノム編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、請求項４に記載の作出方法。
【請求項6】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、配列番号２で表される塩基配列に相補的な配列を含む核酸からなるガイドＲＮＡを用いる、請求項５に記載の作出方法。
【請求項7】
配列番号３で表される塩基配列を含む核酸からなる、ガイドＲＮＡ。
【請求項8】
Ｃａｓ９をコードする核酸と、配列番号２で表される塩基配列を含む核酸と、を含むベクター。
【請求項9】
Ｃａｓ９をコードする核酸を含む第１のベクターと、
配列番号２で表される塩基配列を含む核酸を含む第２のベクターと、
を備える、ベクターセット。
配列番号２で表される塩基配列を含む核酸を含む第２のベクターと、
を備える、ベクターセット。
【請求項10】
以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、花粉生産能を有さない、雄性不稔性のユリ属植物。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項11】
前記ユリ属植物がオリエンタルユリ、アジアンティックユリ、ロンギフローラムユリ及びこれらを掛け合わせた交配種からなる群より選択される１種以上である、請求項１０に記載のユリ属植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ユリ属植物において花粉の生産能を有さない雄性不稔を誘発させる方法、雄性不稔性のユリ属植物の作出方法、ベクター、ベクターセット、及び雄性不稔性のユリ属植物に関する。
【背景技術】
【0002】
テッポウユリは日本固有の花であり、清楚で優雅な花姿から国内外で儀式の際等に好んで使用されている。テッポウユリ等の切り花用途のユリは、花粉が花弁を汚し、著しく観賞性を損なう。そのため、花粉だけでなく、不稔花粉の殻（残渣）も残らない完全な雄性不稔性のユリ品種の開発が望まれている。
【0003】
一方、モデル植物のシロイヌナズナの花粉形成に関わるＴＤＦ１遺伝子が突然変異を起こすと、雄性不稔を起こすことが知られている（例えば、非特許文献１等参照）。また、特許文献１には、アスパラガス等の雌雄異株植物において、ＴＤＦ１遺伝子が雄蕊の形成の促進に関わる遺伝子として同定され、雄性植物においてＴＤＦ１遺伝子及びＧＤＳ（雌蕊発達抑制因子）遺伝子の両方を欠損させることで、雌性植物に変換できることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特表２０１８－５０１８２１号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Zhu J C et al., “Defective in tapetal development and function 1 is essential for anther development and tapetal function for microspore maturation in Arabidopsis.” Plant J., Vol. 55, pp.266-277, 2008.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、これまで花粉だけでなく、不稔花粉の殻（残渣）も残らない完全な雄性不稔性のユリ属植物は知られていない。
【0007】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ユリ属植物において花粉の生産能を有さない雄性不稔を誘発させる新規の方法を提供する。また、新規の雄性不稔性のユリ属植物及びその作出方法、並びに、前記雄性不稔性のユリ属植物を得るためのベクター、及びベクターセットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） ユリ属植物において花粉の生産能を有さない雄性不稔を誘発させる方法であって、
以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させることを含む、方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２） 前記ユリ属植物がオリエンタルユリ、アジアンティックユリ、ロンギフローラムユリ及びこれらを掛け合わせた交配種からなる群より選択される１種以上である、（１）に記載の方法。
（３） 花粉の生産能を有さない雄性不稔性の、ユリ属植物の作出方法であって、
以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる工程を含む、作出方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４） 前記欠損又は抑制させる工程において、ゲノム編集技術を用いて、前記ＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、（３）に記載の作出方法。
（５） 前記ゲノム編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、（４）に記載の作出方法。
（６） 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、配列番号２で表される塩基配列に相補的な配列を含む核酸からなるガイドＲＮＡを用いる、（５）に記載の作出方法。
（７） 配列番号３で表される塩基配列を含む核酸からなる、ガイドＲＮＡ。
（８） Ｃａｓ９をコードする核酸と、配列番号２で表される塩基配列を含む核酸と、を含むベクター。
（９） Ｃａｓ９をコードする核酸を含む第１のベクターと、
配列番号２で表される塩基配列を含む核酸を含む第２のベクターと、
を備える、ベクターセット。
（１０） 以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、花粉生産能を有さない、雄性不稔性のユリ属植物。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（１１） 前記ユリ属植物がオリエンタルユリ、アジアンティックユリ、ロンギフローラムユリ及びこれらを掛け合わせた交配種からなる群より選択される１種以上である、（１０）に記載のユリ属植物。
（１） ユリ属植物において花粉の生産能を有さない雄性不稔を誘発させる方法であって、
以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させることを含む、方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２） 前記ユリ属植物がオリエンタルユリ、アジアンティックユリ、ロンギフローラムユリ及びこれらを掛け合わせた交配種からなる群より選択される１種以上である、（１）に記載の方法。
（３） 花粉の生産能を有さない雄性不稔性の、ユリ属植物の作出方法であって、
以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる工程を含む、作出方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（４） 前記欠損又は抑制させる工程において、ゲノム編集技術を用いて、前記ＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる、（３）に記載の作出方法。
（５） 前記ゲノム編集技術がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである、（４）に記載の作出方法。
（６） 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、配列番号２で表される塩基配列に相補的な配列を含む核酸からなるガイドＲＮＡを用いる、（５）に記載の作出方法。
（７） 配列番号３で表される塩基配列を含む核酸からなる、ガイドＲＮＡ。
（８） Ｃａｓ９をコードする核酸と、配列番号２で表される塩基配列を含む核酸と、を含むベクター。
（９） Ｃａｓ９をコードする核酸を含む第１のベクターと、
配列番号２で表される塩基配列を含む核酸を含む第２のベクターと、
を備える、ベクターセット。
（１０） 以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、花粉生産能を有さない、雄性不稔性のユリ属植物。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
（１１） 前記ユリ属植物がオリエンタルユリ、アジアンティックユリ、ロンギフローラムユリ及びこれらを掛け合わせた交配種からなる群より選択される１種以上である、（１０）に記載のユリ属植物。
【発明の効果】
【0009】
上記態様の方法によれば、ユリ属植物において花粉の生産能を有さない雄性不稔を誘発させることができる。上記態様の作出方法、ベクター及びベクターセットによれば、花粉生産能を有さない、雄性不稔性のユリ属植物が得られる。上記態様のユリ属植物は、花粉生産能を有さない、雄性不稔性のユリ属植物である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】実施例１におけるＬｆＴＤＦ１遺伝子のｍＲＮＡとゲノムＤＮＡの構造を比較した図である。
【図2A】実施例１におけるシンテッポウユリ（品種：秋試１号）及びテッポウユリ（品種：ひのもと）のＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性を比較した図である。
【図2B】実施例１におけるシンテッポウユリ（品種：秋試１号）及びテッポウユリ（品種：ひのもと）のＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性を比較した図である。
【図2C】実施例１におけるシンテッポウユリ（品種：秋試１号）及びテッポウユリ（品種：ひのもと）のＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性を比較した図である。
【図3A】実施例１におけるシンテッポウユリ（品種：秋試１号）及びタカサゴユリのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性を比較した図である。
【図3B】実施例１におけるシンテッポウユリ（品種：秋試１号）及びタカサゴユリのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性を比較した図である。
【図3C】実施例１におけるシンテッポウユリ（品種：秋試１号）及びタカサゴユリのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性を比較した図である。
【図4A】実施例１におけるシンテッポウユリ（品種：秋試１号）及びオリエンタルハイブリッドユリ（品種：シベリア）のＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性を比較した図である。
【図4B】実施例１におけるシンテッポウユリ（品種：秋試１号）及びオリエンタルハイブリッドユリ（品種：シベリア）のＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性を比較した図である。
【図4C】実施例１におけるシンテッポウユリ（品種：秋試１号）及びオリエンタルハイブリッドユリ（品種：シベリア）のＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性を比較した図である。
【図5】実施例２における無花粉系統及び有花粉系統のＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現解析の結果を示す画像である。
【図6】実施例２における有花粉系統の器官別のＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現解析の結果を示す画像である。
【図7】実施例２における葯の生育ステージ別のＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現解析の結果を示す画像である。
【図8】実施例３におけるＬｆＴＤＦ１遺伝子のｃＤＮＡの構造と設計した２種のプライマーによるＰＣＲ産物の対応関係を示す図である。
【図9】実施例４における各系統の葯のパラフィン切片の染色像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
≪花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法≫
本発明の一実施形態に係る花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法（以下、「本実施形態の作出方法」と称する場合がある）は、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる工程を含む。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
本発明の一実施形態に係る花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法（以下、「本実施形態の作出方法」と称する場合がある）は、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる工程を含む。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【0012】
本実施形態の作出方法によれば、花粉生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物が得られる。すなわち、本実施形態の作出方法は、ユリ属植物において花粉の生産能を有さない雄性不稔を誘発させる方法ということもできる。
【0013】
なお、一般に、「雄性不稔」とは、植物個体が有する花器官のうち一部又は全部の雄ずいの稔性が失われた状態を意味する。雄ずいの不稔化は、植物体における雄ずいの形態観察により調べてもよく、正常個体の雌ずいと掛け合わせにより種子が形成されるかどうかによっても容易に調べることができる。
【0014】
本実施形態の作出方法により得られるユリ属植物は、雄ずいが正常に形成されず、花粉を生産できない、雄性完全不稔性となっている。後述する実施例に示すように、本実施形態の作出方法で得られるユリ属植物は、雄性配偶子が発達する際に、減数分裂期前半で花粉が退化することから、精細胞だけでなく、花粉壁も形成されず、不稔花粉の殻（残渣）も残らない。そのため、本実施形態の作出方法を用いてユリ属植物を雄性完全不稔性とすることで、花粉が花弁を汚し、著しく観賞性を損なうことを防ぐことができる。
【0015】
なお、本実施形態の作出方法を用いて得られる雄性不稔性のユリ属植物としては、植物体のみならず、植物体を作出した場合に不稔化されているものであれば、細胞を包含する意味で用いられる。細胞は、組織又は器官の状態であってもよい。本実施形態の作出方法を用いて得られる雄性不稔性のユリ属植物とは、それらの後代若しくはクローンの植物体又は細胞であってもよい。例えば、前記クローンの植物体としては鱗片挿し又はムカゴや木子を蒔く等により得られた植物体が挙げられる。
【0016】
本実施形態の作出方法の対象となるユリ属植物としては、ＴＤＦ１遺伝子がユリ属植物中において高度に保存されていることから、ユリ属植物であれば特に限定されない。中でも、切り花や鉢物として流通している品種であることが好ましい。
そのようなユリ属植物の品種としては、例えば、ヤマユリ、ササユリ、カノコユリ、オトメユリ等のオリエンタルユリ；エゾスカシユリ、ヒメユリ、オニユリ、リーガルリリー等のアジアンティックユリ；テッポウユリ、タカサゴユリ等のロンギフローラムユリ等が挙げられる。また、これら品種を掛け合わした交雑種であってもよく、例えば、シンテッポウユリ等のロンギフローラムハイブリッド（テッポウユリとタカサゴユリ（ロンギフローラムユリ同士）を掛け合わした交配品種群）；ランディーニ等のアジアティックハイブリッド（アジアンティックユリ同士の交配品種群）；マルコポーロ、イザベラ、シアラ、カサンドラ、カサブランカ、シベリア等のオリエンタルハイブリッド（日本固有種を元に作られた（オリエンタルユリ同士）を掛け合わした）交配品種群）；ロンギフローラムアジアンティック（ＬＡ）ハイブリッド（クーリエ等）、ロンギフローラムオリエンタル（ＬＯ）ハイブリッド（乙女の姿等）、オリエンタルトランペット（ＯＴ）ハイブリッド）（コンカドール、イエローウィン等）等の異なる系統の品種同士を掛け合わせた交配種等が挙げられる。
そのようなユリ属植物の品種としては、例えば、ヤマユリ、ササユリ、カノコユリ、オトメユリ等のオリエンタルユリ；エゾスカシユリ、ヒメユリ、オニユリ、リーガルリリー等のアジアンティックユリ；テッポウユリ、タカサゴユリ等のロンギフローラムユリ等が挙げられる。また、これら品種を掛け合わした交雑種であってもよく、例えば、シンテッポウユリ等のロンギフローラムハイブリッド（テッポウユリとタカサゴユリ（ロンギフローラムユリ同士）を掛け合わした交配品種群）；ランディーニ等のアジアティックハイブリッド（アジアンティックユリ同士の交配品種群）；マルコポーロ、イザベラ、シアラ、カサンドラ、カサブランカ、シベリア等のオリエンタルハイブリッド（日本固有種を元に作られた（オリエンタルユリ同士）を掛け合わした）交配品種群）；ロンギフローラムアジアンティック（ＬＡ）ハイブリッド（クーリエ等）、ロンギフローラムオリエンタル（ＬＯ）ハイブリッド（乙女の姿等）、オリエンタルトランペット（ＯＴ）ハイブリッド）（コンカドール、イエローウィン等）等の異なる系統の品種同士を掛け合わせた交配種等が挙げられる。
【0017】
＜ＴＤＦ１遺伝子＞
後述する実施例に示すように、発明者らは、シンテッポウユリの無花粉系統と、有花粉系統を用いて、ＲＮＡ次世代シークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）解析を行なうことで、花粉形成に関わる遺伝子としてＴＤＦ１遺伝子を同定した。シンテッポウユリのＴＤＦ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号４に、ＴＤＦ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
後述する実施例に示すように、発明者らは、シンテッポウユリの無花粉系統と、有花粉系統を用いて、ＲＮＡ次世代シークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）解析を行なうことで、花粉形成に関わる遺伝子としてＴＤＦ１遺伝子を同定した。シンテッポウユリのＴＤＦ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号４に、ＴＤＦ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【0018】
なお、シンテッポウユリのＴＤＦ１遺伝子／ＴＤＦ１タンパク質と、シンテッポウユリ以外のユリ属植物のＴＤＦ１遺伝子／ＴＤＦ１タンパク質との塩基配列同士又はアミノ酸配列同士の配列同一性は、（又は相同性）は、２つの塩基配列又はアミノ酸配列を、対応する塩基又はアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く、塩基配列全体又はアミノ酸配列全体に対する一致した塩基又はアミノ酸の割合として求められる。塩基配列又はアミノ酸配列どうしの配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができ、アミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
後述する実施例に示すように、シンテッポウユリと、テッポウユリ、タカサゴユリ又はシベリア（オリエンタルハイブリッド品種）とのＴＤＦ遺伝子の配列同一性はいずれも９５％以上であり、ＴＤＦ遺伝子は、ユリ属遺伝子で高度に保存されている。
後述する実施例に示すように、シンテッポウユリと、テッポウユリ、タカサゴユリ又はシベリア（オリエンタルハイブリッド品種）とのＴＤＦ遺伝子の配列同一性はいずれも９５％以上であり、ＴＤＦ遺伝子は、ユリ属遺伝子で高度に保存されている。
【0019】
本実施形態の作出方法において、標的となるＴＤＦ１遺伝子は、上述の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかの遺伝子である。
【0020】
一般に、何らかの生理機能を有するタンパク質は、本来の機能を損なうことなく、１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加可能なことが知られている。
上述の（Ｂ）の遺伝子がコードするタンパク質では、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、欠失、置換又は付加されていてもよいアミノ酸の数は、１個以上３０個以下が好ましく、１個以上２０個以下がより好ましく、１個以上１０個以下がさらに好ましく、１個以上５個以下が特に好ましく、１個以上３個以下が最も好ましい。
上述の（Ｂ）の遺伝子がコードするタンパク質では、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、欠失、置換又は付加されていてもよいアミノ酸の数は、１個以上３０個以下が好ましく、１個以上２０個以下がより好ましく、１個以上１０個以下がさらに好ましく、１個以上５個以下が特に好ましく、１個以上３個以下が最も好ましい。
【0021】
上述の（Ｃ）の遺伝子がコードするタンパク質では、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が、９０％以上１００％未満であることが好ましく、９５％以上１００％未満であることがより好ましく、９８％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９９％以上１００％未満であることが特に好ましい。
【0022】
なお、アミノ酸配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本実施形態の作出方法において、アミノ酸配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られた値を採用できる。本実施形態の作出方法において、アミノ酸配列同士の同一性は、市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ等により得られた値を採用できる。
【0023】
上述の（Ａ）～（Ｃ）の遺伝子がコードするタンパク質は、花粉形成能を有する。
なお、本明細書において、「花粉形成能」とは、稔性を有する花粉を形成する能力を意味する。タンパク質が花粉形成能を有しているかどうかは、植物体における雄ずいの形態観察により調べてもよく、正常個体の雌ずいと掛け合わせにより種子が形成されるかどうかによっても容易に調べることができる。
なお、本明細書において、「花粉形成能」とは、稔性を有する花粉を形成する能力を意味する。タンパク質が花粉形成能を有しているかどうかは、植物体における雄ずいの形態観察により調べてもよく、正常個体の雌ずいと掛け合わせにより種子が形成されるかどうかによっても容易に調べることができる。
【0024】
上述の（Ａ）の遺伝子において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、当該アミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもよく、花粉形成能を有する範囲において、当該アミノ酸配列からなるタンパク質に任意の配列が付加されていてもよい。
前記任意の配列とは、例えば、リンカー配列、タグ配列、タンパク質安定化のための修飾配列等が挙げられる。
前記任意の配列とは、例えば、リンカー配列、タグ配列、タンパク質安定化のための修飾配列等が挙げられる。
【0025】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、公知の手法により製造可能である。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを、発現ベクターに組み込み、これを発現させることで、合成することができる。或いは、ポリペプチド合成装置により、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を合成することもできる。
【0026】
本実施形態の作出方法において、標的となるＴＤＦ１遺伝子は、ＴＤＦ１タンパク質をコードするものであり、以下の（Ｉ）～（ＩＩＩ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（Ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、花粉形成能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ＩＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、花粉形成能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（Ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、花粉形成能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ＩＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、花粉形成能を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【0027】
上述の（Ｉ）～（ＩＩＩ）に示すポリヌクレオチドがコードするタンパク質としては、上述の（Ａ）～（Ｃ）の遺伝子がコードするタンパク質と同様である。
【0028】
上述の（Ｉ）に示すポリヌクレオチドの塩基配列として具体的には、以下に示すとおりである。
上述の（Ｉ）における配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４で表される塩基配列であってもよい。
上述の（Ｉ）における配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号４で表される塩基配列であってもよい。
【0029】
ＴＤＦ１遺伝子をコードするｃＤＮＡである、配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、公知の手法により製造可能である。ＴＤＦ１遺伝子をコードするｃＤＮＡは、例えば、ユリ属植物のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号４の塩基配列等に基づいて設計したプライマーにより、ＴＤＦ１遺伝子をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ等により増幅し、得ることができる。
【0030】
＜ＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる工程＞
本工程では、上述の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる。
本工程では、上述の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる。
【0031】
本明細書において、ＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させるとは、該遺伝子又はその発現を制御することで、該遺伝子産物の活性を欠損又は抑制させる、或いは、該遺伝子の発現が欠損又は抑制させることを指す。
【0032】
遺伝子の機能を欠損又は抑制させる方法としては、例えば、対象とする遺伝子のゲノムに人為的に改変又は変異を加えることにより、機能的な遺伝子産物の生成が欠損又は抑制された植物体を得ることができる。より具体的には、例えば、突然変異誘発剤の処理により、対象とする遺伝子の機能が欠損又は抑制された植物体をスクリーニングして得る方法が挙げられる。また例えば、遺伝子ターゲッティング法や、ゲノム編集技術、トランスジェニック等によって、対象とする遺伝子のゲノムに人為的に改変又は変異を加えることにより、機能的な遺伝子産物の生成が欠損又は抑制された植物体を得てもよい。対象とする遺伝子としては、ＴＤＦ１遺伝子である。
ゲノム編集技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムや、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡの塩基配列を改変可能なその他手法が挙げられる。
又は、対象とする遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が人為的に導入されることによって、遺伝子産物の生成が欠損又は抑制された植物体を得ることができる。
中でも、ゲノム編集技術を用いることが好ましく、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いることがより好ましい。
ゲノム編集技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムや、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＤＮＡの塩基配列を改変可能なその他手法が挙げられる。
又は、対象とする遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸が人為的に導入されることによって、遺伝子産物の生成が欠損又は抑制された植物体を得ることができる。
中でも、ゲノム編集技術を用いることが好ましく、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いることがより好ましい。
【0033】
なお、以下、本明細書における「核酸」には、ＲＮＡ、ＤＮＡに加えて、ＬＮＡ等の核酸アナログや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びそれらの混成物も包含する。
【0034】
また、本明細書において、「改変」とは、標的遺伝子の塩基配列が変化することを意味する。例えば、標的遺伝子の切断、切断後の外因性配列の挿入（物理的挿入又は相同指向修復を介する複製による挿入）による標的遺伝子の塩基配列の変化、切断後の非相同末端連結（ＮＨＥＪ：切断により生じたＤＮＡ末端どうしが再び結合すること）による標的遺伝子の塩基配列の変化（例えば、コーディング領域における１～全塩基の欠失、置換又は挿入等）等が挙げられる。本実施形態の作出方法によれば、ゲノム編集技術を用いることで、標的遺伝子（具体的には、上述のＴＤＦ１遺伝子）の改変により、標的遺伝子への変異の導入、又は、標的遺伝子の機能を欠損又は抑制することができる。
【0035】
本実施形態の作出方法では、ＴＤＦ１遺伝子に変異が導入され、又は、機能が欠損又は抑制されることで、花粉生産能を有さない雄性完全不稔性のユリ属植物を得ることができる。
【0036】
本実施形態において、ＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる対象となるユリ属植物は、植物個体のみのならず細胞を包含する。細胞は、組織又は器官の状態であってもよい。
本実施形態において、対象となるユリ属植物は、植物体、植物細胞、植物培養細胞、又はカルスであることが好ましい。
本実施形態において、対象となるユリ属植物は、植物体、植物細胞、植物培養細胞、又はカルスであることが好ましい。
【0037】
本実施形態の作出方法は、例えば、前記ＴＤＦ１遺伝子の機能を、前記ＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターを改変することによって、欠損又は抑制する方法等が挙げられる。より具体的には例えば、ユリ属植物に前記ＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターを改変するための核酸を導入することによって、前記ＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制する方法等が挙げられる。
【0038】
［ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いた方法］
遺伝子及び／又はそのプロモーターを改変する核酸としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに使用される核酸等が挙げられる。
遺伝子及び／又はそのプロモーターを改変する核酸としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに使用される核酸等が挙げられる。
【0039】
（ガイドＲＮＡ）
前記ＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターを改変するための核酸としては、例えば、以下の（ａ）の核酸等が挙げられる。
（ａ）前記ＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターの配列から選ばれた配列に相補的な塩基配列を含むガイドＲＮＡ
前記ＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターを改変するための核酸としては、例えば、以下の（ａ）の核酸等が挙げられる。
（ａ）前記ＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターの配列から選ばれた配列に相補的な塩基配列を含むガイドＲＮＡ
【0040】
ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｇＲＮＡ）」とは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに用いられるガイドＲＮＡであって、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成する、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ）と該ｃｒＲＮＡと一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを融合させたｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡキメラのヘアピン構造を模倣したものを意味する。本実施形態の作出方法で用いられるｇＲＮＡは、ガイド配列（具体的には、標的遺伝子である上述のＴＤＦ１遺伝子中の標的配列）を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが融合した状態で合成されたｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡキメラであってもよい。又は、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを別々に作製し、導入前にアニーリングしてｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡキメラとしたものであってもよい。又は、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分及びｃｒＲＮＡの融合によって作製される一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。ガイドＲＮＡの一部として連結される配列としては、例えば、ＰＡＭ配列の存在やＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの核酸の切断活性等を考慮して適宜設計することができる。具体的には、例えば、本実施形態の作出方法で用いられるｇＲＮＡは、標的遺伝子中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは１７塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２０塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的遺伝子と非相補的な塩基配列を含み、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
【0041】
なお、本明細書において、「ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列」とは、標的遺伝子（具体的には、上述のＴＤＦ１遺伝子）中に存在し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素により認識可能な配列を意味し、ＰＡＭ配列の長さや塩基配列はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の由来となる細菌種によって異なる。
例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは「ＮＧＧ」（Ｎは任意の塩基を表す）の３塩基を認識する。
また、例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは２つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」（Ｎは任意の塩基を表す）の５塩基以上６塩基以下をＰＡＭ配列として認識する。
例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは「ＮＧＧ」（Ｎは任意の塩基を表す）の３塩基を認識する。
また、例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは２つのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」（Ｎは任意の塩基を表す）の５塩基以上６塩基以下をＰＡＭ配列として認識する。
【0042】
前記（ａ）の核酸において、ガイドＲＮＡの一部として連結されるＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターの配列に相補的な塩基配列は、例えば、ＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターの配列に基づいて、１以上の配列を適宜設計することができ、１つの配列を単独で用いてもよく、２以上の配列を組み合わせて用いてもよい。当該配列は、例えば、配列番号４で表される塩基配列からなるＴＤＦ１遺伝子の配列中の連続する１７塩基以上２４塩基以下の配列と相補的な配列であってもよく、配列番号２で表される塩基配列と相補的な配列を含む核酸からなるガイドＲＮＡが好ましいものとして例示することができ、配列番号３で表される塩基配列を含む核酸からなるガイドＲＮＡがより好ましいものとして例示することができる。なお、ＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターを改変できるものとであれば、配列番号３で表される塩基配列に限らず、配列番号３で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠損、置換及び／又は付加された塩基配列からなるものも使用することができる。
【0043】
ここで、ガイドＲＮＡの一部として適宜設計される２つ以上の配列としては、遺伝子及びそのプロモーターあたり２つ以上４つ以下とすることができ、２つが好ましい。
配列番号２で表される塩基配列における「１～数個」とは、１個以上３個以下とすることができ、１個以上２個以下とすることができ、１個とすることができる。
配列番号２で表される塩基配列における「１～数個」とは、１個以上３個以下とすることができ、１個以上２個以下とすることができ、１個とすることができる。
【0044】
ｇＲＮＡは、単離又は合成されたＲＮＡであってもよく、発現ベクター内に組み込まれたＲＮＡの形であってもよい。また、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードする核酸の形であってもよく、当該ｇＲＮＡをコードする核酸が発現ベクターにコードされている形であってもよい。なお、発現ベクターについては、後述する。
【0045】
（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素）
本実施形態の作出方法において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いる場合には、上記ｇＲＮＡに加えて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素を導入する。植物体内への導入方法としては、後述する。
本実施形態の作出方法において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いる場合には、上記ｇＲＮＡに加えて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素を導入する。植物体内への導入方法としては、後述する。
【0046】
一般に、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素」とは、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成するＣａｓタンパク質ファミリーのことを示し、外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断するエンドヌクレアーゼである。本明細書において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素は、ＲＮＡと複合体を形成し、ＤＮＡ切断活性を有するものを意味する。
本実施形態の作出方法において用いられるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９であること好ましく、その種類について特別な限定はなく、Ｃａｓ９のホモログ又は改変体であってもよい。
本実施形態の作出方法において用いられるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ９であること好ましく、その種類について特別な限定はなく、Ｃａｓ９のホモログ又は改変体であってもよい。
【0047】
Ｃａｓ９として具体的には、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＳｐＣａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来するＳａＣａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＳｔＣａｓ９等が挙げられ、これらに限定されない。
【0048】
また、Ｃａｓ９としては、Ｃａｓ９タンパク質であってもよく、Ｃａｓ９をコードする核酸であってもよい。Ｃａｓ９をコードする核酸を導入する場合、Ｃａｓ９をコードする核酸が発現ベクターにコードされている形であってもよい。上述のタンパク質をコードする核酸が発現ベクターにコードされている形で植物細胞又は植物体に導入する場合、導入後、植物細胞又は植物体内において発現させることができる。なお、発現ベクターについては、後述する。
【0049】
［ＴＤＦ１遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を用いる方法］
或いは、本実施形態の作出方法は、例えば、ユリ属植物に前記ＴＤＦ１遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を導入することによって、前記ＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる方法等が挙げられる。
或いは、本実施形態の作出方法は、例えば、ユリ属植物に前記ＴＤＦ１遺伝子の発現を欠損又は抑制させる核酸を導入することによって、前記ＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる方法等が挙げられる。
【0050】
遺伝子の発現を抑制される核酸としては、例えば、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、リボザイム等が挙げられる。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。
【0051】
アンチセンス核酸としては、例えば、抑制対象となる遺伝子のｍＲＮＡの配列であるセンス配列と相補的な塩基配列を有する核酸等が挙げられる。
配列番号４で表される塩基配列は、ＴＤＦ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列である、配列番号４で表される塩基配列のうち、１０３９番目から１３７０番目までの領域は３’ＵＴＲの領域である。
ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸は、当業者であれば、配列番号４で表される塩基配列に基づいて、適宜設計することができる。
配列番号４で表される塩基配列は、ＴＤＦ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列である、配列番号４で表される塩基配列のうち、１０３９番目から１３７０番目までの領域は３’ＵＴＲの領域である。
ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸は、当業者であれば、配列番号４で表される塩基配列に基づいて、適宜設計することができる。
【0052】
リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムは、標的となる核酸と反応する活性部位、及び標的となる核酸と結合する基質結合部位を有する。リボザイムとしては、例えば、基質結合部位として、抑制対象となる遺伝子のｍＲＮＡの配列と相補的な配列を有するリボザイム等が挙げられる。
ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制するリボザイムは、当業者であれば、配列番号４で表される塩基配列に基づいて、適宜設計することができる。
ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制するリボザイムは、当業者であれば、配列番号４で表される塩基配列に基づいて、適宜設計することができる。
【0053】
ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、それらの前駆体等が挙げられ、例えば、抑制対象となる遺伝子のｍＲＮＡの配列と同一の塩基配列又はその部分配列を有する二本鎖構造のＲＮＡ等が挙げられる。抑制対象となる遺伝子の発現を抑制可能な範囲において、ＲＮＡｉ誘導性核酸は、抑制対象となる遺伝子のｍＲＮＡの配列と同一の塩基配列又はその部分配列を有する二本鎖構造のＲＮＡであってもよい。
【0054】
ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えば、以下の（ｂ）～（ｄ）のいずれかの核酸等が挙げられる。
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンス鎖の一部と、該センス鎖の一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸；
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるセンス鎖の一部と、該センス鎖の一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖の一部と、該センス鎖の一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸。
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるセンス鎖の一部と、該センス鎖の一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸；
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるセンス鎖の一部と、該センス鎖の一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなるセンス鎖の一部と、該センス鎖の一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含み、ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制可能な核酸。
【0055】
配列番号４で表される塩基配列からなるセンス鎖の一部に対応するアンチセンス鎖が発現するだけでもアンチセンス核酸となり、ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制し得る。配列番号４で表される塩基配列からなるセンス鎖の一部と、該センス鎖の一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖と、を含む核酸が発現することで、２本鎖ＲＮＡが形成され、ｓｉＲＮＡの形成等により、植物体内でサイレンシングが効率よく引き起こされる。
【0056】
一般的に、何らかの生理機能を有する核酸は、本来の機能を損なうことなく、１～数個の塩基配列が欠失、置換及び／又は付加可能なことが知られている。
前記（ｃ）の核酸において、配列番号４で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加されていてもよい塩基の数は、１個以上３０個以下が好ましく、１個以上２０個以下がより好ましく、１個以上１０個以下がさらに好ましく、１個以上５個以下がさらに好ましく、１個以上３個以下が特に好ましい。
前記（ｃ）の核酸において、配列番号４で表される塩基配列において、１～数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加されていてもよい塩基の数は、１個以上３０個以下が好ましく、１個以上２０個以下がより好ましく、１個以上１０個以下がさらに好ましく、１個以上５個以下がさらに好ましく、１個以上３個以下が特に好ましい。
【0057】
前記（ｄ）の塩基において、配列番号４で表される塩基配列との同一性は、９０％以上１００％未満であり、９３％以上１００％未満であることが好ましく、９５％以上１００％未満であることがより好ましく、９８％以上１００％未満であることがさらに好ましい。
塩基配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明における塩基配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴにより得られた値を採用できる。本発明における塩基配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
塩基配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明における塩基配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴにより得られた値を採用できる。本発明における塩基配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
【0058】
前記（ｂ）～（ｄ）に示される核酸において、センス鎖の一部と二重鎖を形成可能なアンチセンス鎖は、該センス鎖の一部と完全に相補する配列からなるものが好ましいが、植物内でセンス鎖の一部と二重鎖を形成可能で、抑制対象となる遺伝子の発現を抑制可能なものであれば、該センス鎖と部分的に相補する配列からなるものであってもよい。
【0059】
前記（ｂ）～（ｄ）に示される核酸において、配列番号４で表される塩基配列からなるセンス鎖の一部とは、配列番号４で表される塩基配列中の連続する１９個以上の塩基からなるものを例示できる。
前記（ｂ）～（ｄ）に示される核酸において、センス鎖の一部となる配列番号４で表される塩基配列中の連続する１９個以上の塩基長としては、抑制対象となる遺伝子によって適宜定めればよく、例えば、１９塩基以上４００塩基以下程度、２０塩基以上１００塩基以下程度、２１塩基以上５０塩基以下程度とすることができる。
前記（ｂ）～（ｄ）に示される核酸において、センス鎖の一部となる配列番号４で表される塩基配列中の連続する１９個以上の塩基は、配列番号４で表される塩基配列中の１０３９番目から１３７０番目までの塩基配列からなる領域の一部（連続する１９個以上の塩基）又は全部を含むものが好ましい。配列番号４で表される塩基配列中の１０３９番目から１３７０番目までの塩基配列からなる領域は、配列番号４で表される塩基配列のうちの３’ＵＴＲの領域に対応する。
前記（ｂ）～（ｄ）に示される核酸において、センス鎖の一部となる配列番号４で表される塩基配列中の連続する１９個以上の塩基長としては、抑制対象となる遺伝子によって適宜定めればよく、例えば、１９塩基以上４００塩基以下程度、２０塩基以上１００塩基以下程度、２１塩基以上５０塩基以下程度とすることができる。
前記（ｂ）～（ｄ）に示される核酸において、センス鎖の一部となる配列番号４で表される塩基配列中の連続する１９個以上の塩基は、配列番号４で表される塩基配列中の１０３９番目から１３７０番目までの塩基配列からなる領域の一部（連続する１９個以上の塩基）又は全部を含むものが好ましい。配列番号４で表される塩基配列中の１０３９番目から１３７０番目までの塩基配列からなる領域は、配列番号４で表される塩基配列のうちの３’ＵＴＲの領域に対応する。
【0060】
前記（ｂ）～（ｄ）の核酸は、ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制する活性を有する。（ｂ）～（ｄ）の核酸が、ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制する活性を有しているかどうかは、常法により調べることができる。例えば、（ｂ）～（ｄ）のいずれかの核酸が導入された植物と、（ｂ）～（ｄ）のいずれかの核酸が導入されていない植物とを比較し、（ｂ）～（ｄ）のいずれかの核酸が導入された植物で、ＴＤＦ１遺伝子の発現量が有意に減少している場合に、（ｂ）～（ｄ）のいずれかの核酸が、ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制する活性を有していると判断できる。
【0061】
前記（ｂ）～（ｄ）に示される核酸は、ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制可能なものであれば、前記各センス鎖の一部、及び前記各アンチセンス鎖又はその一部の他に、任意の核酸が付加されていてもよい。
【0062】
［導入方法］
本実施形態の作出方法において、上記ＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターを改変する核酸（及び、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素又は当該酵素をコードする核酸）、並びに、上記ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制する核酸を導入する方法としては、これら核酸を植物内で発現可能なベクターを植物内に導入する方法等が挙げられる。導入された核酸は、ゲノム上に導入されていてもよく、ゲノム上に導入されていなくてもよい。
本実施形態の作出方法において、上記ＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターを改変する核酸（及び、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素又は当該酵素をコードする核酸）、並びに、上記ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制する核酸を導入する方法としては、これら核酸を植物内で発現可能なベクターを植物内に導入する方法等が挙げられる。導入された核酸は、ゲノム上に導入されていてもよく、ゲノム上に導入されていなくてもよい。
【0063】
発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスベクター等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしてより具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系のベクター等が挙げられる。特に、植物細胞又植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウム法である場合には、ｐＢＩ系又はｐＰＺＰ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとして具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等が挙げられる。ｐＰＺＰ系のバイナリーベクターとして具体的には、例えば、ｐＰＺＰ１００、ｐＰＺＰ２００、ｐＰＺＰ５００、ｐＰＺＰ３４２５等が挙げられる。
【0064】
ベクターを用いて形質転換体を作出する方法は、特に限定されず、当技術分野で通常行われている方法により行うことが可能である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法が挙げられ、アグロバクテリウム法が好ましい。
アグロバクテリウム法を採用する場合には、予め宿主であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）へ使用する核酸（及び必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素又は当該酵素をコードする核酸）を組み込む必要がある。組み込む方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウィスカー法等の公知の方法が挙げられる。
アグロバクテリウム法を採用する場合には、予め宿主であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）へ使用する核酸（及び必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素又は当該酵素をコードする核酸）を組み込む必要がある。組み込む方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウィスカー法等の公知の方法が挙げられる。
【0065】
植物内に、上記ＴＤＦ１遺伝子及び／又はそのプロモーターを改変する核酸、又は、上記ＴＤＦ１遺伝子の発現を抑制する核酸を導入することによって、前記ＴＤＦ１遺伝子の機能を欠損又は抑制させる場合、これらの核酸（及び必要に応じて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素又は当該酵素をコードする核酸）は少なくとも花において発現されることが好ましい。
【0066】
当該核酸を花において発現させる場合、花において特異的に核酸を発現させる転写調節領域によって、核酸を発現させてもよく、花を含む植物体全体で核酸を発現させる恒常的プロモーター等の転写調節領域によって、核酸を発現させてもよい。
【0067】
恒常的プロモーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓ（カリフラワーモザイクウイルス35S）プロモーターが挙げられる。
【0068】
転写調節領域によって核酸を発現させる方法は公知であり、例えば、発現させるべき核酸をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに、転写調節領域を作動可能に連結されることが挙げられる。
【0069】
「作動可能に連結されている」とは、前記転写調節領域が核酸の発現を調節可能であることを意味する。
【0070】
「転写調節領域」としては、転写開始や転写効率を制御可能な配列であり、プロモーター、エンハンサー、応答配列が挙げられる。
【0071】
「花において転写調節可能な転写調節領域」とは、花を構成する細胞において核酸の転写を調節可能であることを意味する。より詳しくは、花において転写調節可能な転写調節領域とは、前記核酸が雄ずいの形成に作用可能なように転写調節可能な転写調節領域であり、花において特異的に遺伝子の発現をもたらし得る転写調節領域が好ましく、雄ずいにおいて特異的に核酸の発現をもたらし得る転写調節領域がより好ましい。
【0072】
本実施形態の作出方法を用いて得られるユリ属植物において、ＴＤＦ１遺伝子について、該遺伝子産物の活性の欠損又は抑制の程度、或いは、該遺伝子の発現の欠損又は抑制の程度は、植物体の完全不稔化が達成される程度であればよい。
本実施形態の作出方法を用いて得られるユリ属植物において、ＴＤＦ１遺伝子について、該遺伝子産物の活性の欠損又は抑制の生じる部位、或いは、該遺伝子の発現の欠損又は抑制の生じる部位は、植物体の完全不稔化が達成される程度であればよい。例えば、遺伝子産物の活性が花で特異的に欠損又は抑制することで、植物の完全不稔化が達成されてもよい。
本実施形態の作出方法を用いて得られるユリ属植物において、ＴＤＦ１遺伝子について、該遺伝子産物の活性の欠損又は抑制の生じる部位、或いは、該遺伝子の発現の欠損又は抑制の生じる部位は、植物体の完全不稔化が達成される程度であればよい。例えば、遺伝子産物の活性が花で特異的に欠損又は抑制することで、植物の完全不稔化が達成されてもよい。
【0073】
≪雄性不稔性のユリ属植物≫
本発明の一実施形態に係る雄性不稔性のユリ属植物（以下、「本実施形態のユリ属植物」と称する場合がある）は、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、花粉生産能を有さない。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
本発明の一実施形態に係る雄性不稔性のユリ属植物（以下、「本実施形態のユリ属植物」と称する場合がある）は、以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子の機能が欠損又は抑制されており、花粉生産能を有さない。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ花粉形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子
【0074】
本実施形態のユリ属植物は、花粉生産能を有さない、雄性完全不稔性のユリ属植物である。
【0075】
本実施形態のユリ属植物は、例えば、上述した「花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法」に記載の方法により得られる。また、上記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのＴＤＦ１遺伝子については、上述した「花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法」において説明されたものと同様である。
【0076】
本実施形態のユリ属植物としては、中でも、切り花として流通している品種であることが好ましい。このようなユリ属植物としては、上述した「花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法」において説明されたものと同様である。
【0077】
≪ベクター≫
本発明の一実施形態に係るベクター（以下、「本実施形態のベクター」と称する場合がある）は、Ｃａｓ９をコードする核酸と、配列番号２で表される塩基配列を含む核酸と、を含む。
本発明の一実施形態に係るベクター（以下、「本実施形態のベクター」と称する場合がある）は、Ｃａｓ９をコードする核酸と、配列番号２で表される塩基配列を含む核酸と、を含む。
【0078】
本実施形態のベクターによれば、花粉生産能を有さない、雄性完全不稔性のユリ属植物を製造することができる。
【0079】
Ｃａｓ９をコードする核酸としては、上述の「花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法」において例示されたものと同様である。
【0080】
上記配列番号２で表される塩基配列を含む核酸は、ＴＤＦ１遺伝子中の標的配列を含む核酸、すなわちＴＤＦ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸である。
【0081】
よって、本実施形態のベクターを植物内に導入することで、Ｃａｓ９、及び、ＴＤＦ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが発現する。そのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより、ＴＤＦ１遺伝子が改変されて、雄性完全不稔性のユリ属植物を作出することができる。
【0082】
ベクターとしては、発現ベクターであることが好ましい。
植物へのベクターの導入方法や発現ベクターの種類及び構成等は、上述の「花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法」において例示されたものと同様である。
植物へのベクターの導入方法や発現ベクターの種類及び構成等は、上述の「花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法」において例示されたものと同様である。
【0083】
また、本実施形態のベクターは、例えば、プロモーター配列を有する核酸、Ｃａｓ９をコードする核酸、プロモーター配列を有する核酸、上記配列番号２で表される塩基配列を含む核酸、及びターミネーター配列を有する核酸を含むベクターが挙げられ、これらが上流から順に連結されてなる核酸を含むベクターが好ましい。
【0084】
また、本実施形態のベクターは、Ｃａｓ９をコードする核酸、及び、配列番号２で表される塩基配列を含む核酸の他に、薬剤耐性配列等の配列を有していてもよい。
【0085】
本実施形態のベクターは、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、Ｃａｓ９をコードする核酸、及び、配列番号２で表される塩基配列を含む核酸を、ベクターに組み込むことで製造可能である。当該核酸を組み込む際には、市販の発現用ベクター作製キットを用いてもよい。
【0086】
≪ベクターセット≫
本発明の一実施形態に係るベクターセット（以下、「本実施形態のベクターセット」と称する場合がある）は、Ｃａｓ９をコードする核酸を含む第１のベクターと、配列番号２で表される塩基配列を含む核酸を含む第２のベクターと、を備える。
本発明の一実施形態に係るベクターセット（以下、「本実施形態のベクターセット」と称する場合がある）は、Ｃａｓ９をコードする核酸を含む第１のベクターと、配列番号２で表される塩基配列を含む核酸を含む第２のベクターと、を備える。
【0087】
本実施形態のベクターセットによれば、花粉生産能を有さない、雄性完全不稔性のユリ属植物を製造することができる。
【0088】
Ｃａｓ９をコードする核酸としては、上述の「花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法」において例示されたものと同様である。
【0089】
上記配列番号２で表される塩基配列を含む核酸は、ＴＤＦ１遺伝子中の標的配列を含む核酸、すなわちＴＤＦ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸である。
【0090】
よって、上記第１のベクター及び上記第２のベクターを植物内に導入することで、Ｃａｓ９、及び、ＴＤＦ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡが発現する。そのため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより、ＴＤＦ１遺伝子が改変されて、雄性完全不稔性のユリ属植物を作出することができる。
【0091】
上記第１のベクター及び上記第２のベクターとしては、発現ベクターであることが好ましい。
植物へのベクターの導入方法や発現ベクターの種類及び構成等は、上述の「花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法」において例示されたものと同様である。
植物へのベクターの導入方法や発現ベクターの種類及び構成等は、上述の「花粉の生産能を有さない雄性不稔性のユリ属植物の作出方法」において例示されたものと同様である。
【0092】
本実施形態のベクターセットにおいて、第１のベクターは、例えば、プロモーター配列を有する核酸、Ｃａｓ９をコードする核酸、及びターミネーター配列を有する核酸を含むベクターが挙げられ、これらが上流から順に連結されてなる核酸を含むベクターが好ましい。
【0093】
また、本実施形態のベクターセットにおいて、第２のベクターは、例えば、プロモーター配列を有する核酸、上記配列番号２で表される塩基配列を含む核酸、及びターミネーター配列を有する核酸を含むベクターが挙げられ、これらが上流から順に連結されてなる核酸を含むベクターが好ましい。
【0094】
また、本実施形態のベクターセットにおいて、第１のベクター及び第２のベクターは、それぞれＣａｓ９をコードする核酸、及び、上記配列番号２で表される塩基配列を含む核酸の他に、薬剤耐性配列等の配列を有していてもよい。
【0095】
本実施形態のベクターセットにおいて、第１のベクター及び第２のベクターは、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、それぞれＣａｓ９をコードする核酸、及び配列番号２で表される塩基配列を含む核酸をそれぞれ、ベクターに組み込むことで製造可能である。当該核酸を組み込む際には、市販の発現用ベクター作製キットを用いてもよい。
【実施例0096】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0097】
［実施例１］
（シンテッポウユリにおける雄性完全不稔が生じる原因遺伝子の特定）
秋田県農業試験場におけるシンテッポウユリの交配育種の過程で無花粉個体を分離し、近親系統との交配により、シンテッポウユリの無花粉系統（秋試１号）を得た。
（シンテッポウユリにおける雄性完全不稔が生じる原因遺伝子の特定）
秋田県農業試験場におけるシンテッポウユリの交配育種の過程で無花粉個体を分離し、近親系統との交配により、シンテッポウユリの無花粉系統（秋試１号）を得た。
【0098】
次いで、雄性完全不稔が生じる原因遺伝子を特定するために、シンテッポウユリの有花粉系統と、無花粉系統（秋試１号）について、ＲＮＡ次世代シークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）解析を行なった。具体的には、シンテッポウユリの有花粉系統及び無花粉系統（秋試１号）において、蕾長１０ｍｍ以上１４ｍｍ以下程度の葯から、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてＲＮＡを抽出した。シンテッポウユリの有花粉系統及び無花粉系統それぞれ３個体のＲＮＡを均等に混合（バルク化）して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉ－ｓｅｑ ＨｉＳｅｑ２５００を用いてＲＮＡ次世代シークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）解析を行なった。ｆａｓｔｑｃを用いて得られたデータを精製後、ＴＲＩＮＩＴＹを用いて、ｄｅ ｎｏｖｏアセンブル解析を行なった。さらに、解析されたデータにおいて発現量が有花粉系統及び無花粉系統（秋試１号）間で１０倍異なるものをＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅ（ＤＥＧ）として抽出した。抽出された遺伝子について、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅ内を検索し、Ｅ－ｖａｌｕｅ：１０－１０を基準としてホモログである遺伝子を検索した（ＢＬＡＳＴｘ解析）。次いで、ホモログとされた遺伝子についてアノテーションを行った（ＧＯ解析）。同定された遺伝子の一覧を以下の表１及び表２に示す。
【0099】
【表1】
【0100】
【表2】
【0101】
花粉－タペータム組織の発達に関連する遺伝子及びアノテーションされたＤＥＧの内、有花粉系統のみで転写が確認されたＤＥＧを検出した結果、当該遺伝子は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＴＤＦ１（ＭＹＢ３５）とホモログであることが示された。よって、当該遺伝子を「ＬｆＴＤＦ１遺伝子」と名付けた。
【0102】
また、図１に示すように、ゲノムとｃＤＮＡとを用いて、ＤＮＡの塩基配列を決定した。なお、ＬｆＴＤＦ１遺伝子のｃＤＮＡを配列番号４に示す。
【0103】
さらに、シンテッポウユリは、タカサゴユリとテッポウユリとを掛け合わせた品種であることから、シンテッポウユリとタカサゴユリ又はテッポウユリでのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性を確認した。結果を図２Ａ～図２Ｃ（シンテッポウユリとタカサゴユリでのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性比較）及び図３Ａ～図３Ｃ（シンテッポウユリとテッポウユリでのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性比較）に示す。また、図２Ａ～図２Ｃ及び図３Ａ～図３ＣにおけるシンテッポウユリのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列を配列番号５に、図２Ａ～図２ＣにおけるタカサゴユリのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列を配列番号６に、図３Ａ～図３ＣにおけるテッポウユリのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列を配列番号７に示す。
図２Ａ～図２Ｃ及び図３Ａ～図３Ｃに示すように、シンテッポウユリとタカサゴユリでのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性は９９．９％、シンテッポウユリとテッポウユリ（品種：ひのもと）のＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性は９８．６％であり、これらユリ品種間でＴＤＦ１遺伝子が高度に保存されていることが確かめられた。
図２Ａ～図２Ｃ及び図３Ａ～図３Ｃに示すように、シンテッポウユリとタカサゴユリでのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性は９９．９％、シンテッポウユリとテッポウユリ（品種：ひのもと）のＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性は９８．６％であり、これらユリ品種間でＴＤＦ１遺伝子が高度に保存されていることが確かめられた。
【0104】
さらに、シンテッポウユリとオリエンタルハイブリッド品種であるシベリアでのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性を確認した。結果を図４Ａ～図４Ｃに示す。図４Ａ～図４ＣにおけるシンテッポウユリのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列を配列番号５に、シベリアのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列を配列番号８に示す。
図４Ａ～図４Ｃに示すように、シンテッポウユリとシベリアでのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性は９５．７％であり、ユリ属植物に属する品種間においてもＴＤＦ１遺伝子が高度に保存されていることが確かめられた。
図４Ａ～図４Ｃに示すように、シンテッポウユリとシベリアでのＴＤＦ１遺伝子の塩基配列の相同性は９５．７％であり、ユリ属植物に属する品種間においてもＴＤＦ１遺伝子が高度に保存されていることが確かめられた。
【0105】
［実施例２］
（ユリＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現解析）
シンテッポウユリの有花粉系統及び無花粉系統（秋試１号）において、蕾の発達段階別にクラス分けし、抽出したＲＮＡを用いて、定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を実施した。なお、ｑＲＴ－ＰＣＲは各クラス内で３反復行った。用いたプライマーの配列を以下の表３に示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果を図５に示す。図５において、「ｆ２ｒ２」はＬｆＴＤＦ１遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ産物を示し、「ＬｆＡｃｔｉｎ」は内在性コントロールとして、Ａｃｔｉｎ遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ産物を示す。
（ユリＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現解析）
シンテッポウユリの有花粉系統及び無花粉系統（秋試１号）において、蕾の発達段階別にクラス分けし、抽出したＲＮＡを用いて、定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を実施した。なお、ｑＲＴ－ＰＣＲは各クラス内で３反復行った。用いたプライマーの配列を以下の表３に示す。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果を図５に示す。図５において、「ｆ２ｒ２」はＬｆＴＤＦ１遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ産物を示し、「ＬｆＡｃｔｉｎ」は内在性コントロールとして、Ａｃｔｉｎ遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲ産物を示す。
【0106】
【表3】
【0107】
図５に示すように、有花粉系統では、ＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現が認められたのに対して、無花粉系統（秋試１号）では、ＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現が認められなかった。
【0108】
また、有花粉系統の葯、雌ずい、花被及び葉から抽出されたＲＮＡについて、ＬｆＴＤＦ１遺伝子特異的プライマー及び内在性コントロールとして、Ａｃｔｉｎ遺伝子特異的プライマーを用いて、定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を実施した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果を図６に示す。図６において＃は個体番号を示す。
図６に示すように、ＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現は葯においてのみ認められた。
図６に示すように、ＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現は葯においてのみ認められた。
【0109】
さらに、有花粉系統の葯の生育ステージ別でのＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現の変化を図７（得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した結果）に示す。
図７に示すように、有花粉系統では、ＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現がＰＭＣ増殖前半以降において認められることが明らかとなった。また、無花粉系統の形態観察から、蕾長が１９ｍｍ以上２２．９ｍｍ程度の減数分裂期前半のステージにあたる時期において、花粉の退化が起こることが明らかとなった。
図７に示すように、有花粉系統では、ＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現がＰＭＣ増殖前半以降において認められることが明らかとなった。また、無花粉系統の形態観察から、蕾長が１９ｍｍ以上２２．９ｍｍ程度の減数分裂期前半のステージにあたる時期において、花粉の退化が起こることが明らかとなった。
【0110】
［実施例３］
（有花粉系統及び無花粉系統における表現型調査及びＬｆＴＤＦ１遺伝子のジェノタイピング）
次いで、無花粉系統同士、無花粉系統及び有花粉系統、並びに、有花粉系統同士を掛け合わせた個体について表現型を調査した。また、各個体におけるＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現有無について、各個体から抽出されたＲＮＡを試料として、以下の表４に示す２種類のプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲを行うことで確認した。ＬｆＴＤＦ１遺伝子のｃＤＮＡとプライマーにより増幅されるＰＣＲ産物の対応を図８に示す。表現型調査及びＬｆＴＤ１遺伝子のジェノタイピングの結果を表５に示す。
（有花粉系統及び無花粉系統における表現型調査及びＬｆＴＤＦ１遺伝子のジェノタイピング）
次いで、無花粉系統同士、無花粉系統及び有花粉系統、並びに、有花粉系統同士を掛け合わせた個体について表現型を調査した。また、各個体におけるＬｆＴＤＦ１遺伝子の発現有無について、各個体から抽出されたＲＮＡを試料として、以下の表４に示す２種類のプライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲを行うことで確認した。ＬｆＴＤＦ１遺伝子のｃＤＮＡとプライマーにより増幅されるＰＣＲ産物の対応を図８に示す。表現型調査及びＬｆＴＤ１遺伝子のジェノタイピングの結果を表５に示す。
【0111】
【表4】
【0112】
【表5】
【0113】
表５に示すように、有花粉ヘテロ個体×有花粉ヘテロ個体から得られた分離集団において、ＬｆＴＤＦ１遺伝子は一遺伝子性の優性（顕性）遺伝子であることが確かめられた。また、表５の中段及び下段に示した予備選抜集団（無花粉の個体を選抜したが、有花粉も散在する）においては、表現型とＰＣＲでのＬｆＴＤＦ１遺伝子の遺伝子型判定が例外なく一致した。
【0114】
［実施例４］
（突然変異系統での葯の生育ステージ別の形態観察）
無花粉系統、有花粉系統、並びに、γ線照射により突然変異を誘発させた２系統（＃７２及び＃３１８）について、蕾の発達各段階に葯を採取した。なお、＃７２及び＃３１８の２系統は、花粉の形成が見られるものの、稔性を有さない雄性不稔化個体である。次いで、採取した葯をＦｏｒｍａｌｉｎ－Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ－Ａｌｃｏｈｏｌ（ＦＡＡ）固定液で固定後、パラフィン包埋し、ミクロトームにより薄切りを作製した。次いで、０．０５ｖ／ｗ％トルイジンブルー溶液（ｐＨ４．１、富士フィルム和光純薬製）を用いて染色し、顕微鏡で観察した。結果を図９に示す。図９において、各画像の左下に記載の数値は、蕾長を示し、右下のスケールバーは１００μｍである。
（突然変異系統での葯の生育ステージ別の形態観察）
無花粉系統、有花粉系統、並びに、γ線照射により突然変異を誘発させた２系統（＃７２及び＃３１８）について、蕾の発達各段階に葯を採取した。なお、＃７２及び＃３１８の２系統は、花粉の形成が見られるものの、稔性を有さない雄性不稔化個体である。次いで、採取した葯をＦｏｒｍａｌｉｎ－Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ－Ａｌｃｏｈｏｌ（ＦＡＡ）固定液で固定後、パラフィン包埋し、ミクロトームにより薄切りを作製した。次いで、０．０５ｖ／ｗ％トルイジンブルー溶液（ｐＨ４．１、富士フィルム和光純薬製）を用いて染色し、顕微鏡で観察した。結果を図９に示す。図９において、各画像の左下に記載の数値は、蕾長を示し、右下のスケールバーは１００μｍである。
【0115】
図９に示すように、有花粉系統及びγ線照射により突然変異を誘発させた２系統（＃７２及び＃３１８）では、蕾の発達に応じて、葯内で配偶子の発達が進行していた。一方で、無花粉系統（秋試１号）では、蕾長が１９ｍｍ以上２２．９ｍｍ程度の減数分裂期前半のステージにあたる時期において、花粉の退化が起こり、花粉だけでなく、不稔花粉の殻（残渣）も形成されないことが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【0116】
本実施形態の方法によれば、ユリ属植物において花粉の生産能を有さない雄性不稔を誘発させることができる。本実施形態の作出方法、ベクター及びベクターセットによれば、花粉生産能を有さない、雄性完全不稔性のユリ属植物が得られる。本実施形態のユリ属植物は、花粉生産能を有さない、雄性完全不稔性のユリ属植物である。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】