特開 2022-77031 単一細胞収集方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022077031

(43)【公開日】2022-05-20

(54)【発明の名称】単一細胞収集方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/24 20060101AFI20220513BHJP

   C12M 1/26 20060101ALN20220513BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/24

C12M1/26

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021183321

(22)【出願日】2021-11-10

(31)【優先権主張番号】63/111,686

(32)【優先日】2020-11-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】512175133

【氏名又は名称】ナショナル ヘルス リサーチ インスティテューツ

【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ

(74)【代理人】

【識別番号】110003214

【氏名又は名称】特許業務法人服部国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100093779

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 雅紀

(72)【発明者】

【氏名】チア‐シェン スー

(72)【発明者】

【氏名】チュアン‐フォン イエ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA09

4B029BB11

4B029CC01

4B029GB05

4B029HA07

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ08

4B063QS10

4B063QS39

4B063QX10

(57)【要約】

【課題】本発明は、収集ウェルからの粒子／細胞収集のために特別に設計された収集ウェルおよび収集ピペットチップを使用する、高効率な単一細胞の収集方法を提供する。
【解決手段】収集ウェル１１および収集ピペットチップ１０の構造は、収集における流体のデッドボリュームを排除する。その結果、粒子／細胞の全て（または大部分）が、流れとともに収集ピペットチップ１０にもたらされ得る。細胞操作における本発明の利点は、高い細胞収集効率、低い細胞損傷、および、容易な操作手順を含む点にある。
【選択図】図１Ｅ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

高効率な単一細胞収集方法であって、
複数の単一細胞を含む液体を収集ウェルに導入し、複数の前記単一細胞を前記収集ウェルの底部に配置することと、
収集ピペットチップを前記収集ウェルに挿入することと、
複数の前記単一細胞を含む前記液体を、前記収集ピペットチップに引き込むように吸引力を与えることと、
を含み、
前記収集ピペットチップを前記収集ウェルに挿入する際に、前記収集ピペットチップのピン先と前記収集ウェルの底部との間にギャップ距離ｘが生成され、ｘは１０～５００μｍの範囲である、単一細胞収集方法。

【請求項2】

前記収集ピペットチップは、少なくとも３つの円弧状突起と、前記収集ピペットチップの前記ピン先の周りに配置された外壁との構造を有する、請求項１に記載の単一細胞収集方法。

【請求項3】

前記外壁と前記収集ピペットチップとの間に高さ方向のギャップがある、請求項２に記載の単一細胞収集方法。

【請求項4】

前記収集ウェルは、少なくとも３つの円弧状突起の構造を有する、請求項１に記載の単一細胞収集方法。

【請求項5】

前記収集ウェルの底部は前記収集ウェルの開口部よりも小さく、前記収集ウェルの壁は曲線を有する、請求項４に記載の単一細胞収集方法。

【請求項6】

前記収集ウェルおよび前記収集ピペットチップは、前記円弧状突起の数が同数である請求項４に記載の単一細胞収集方法。

【請求項7】

前記収集ウェルおよび前記収集ピペットチップは、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、または液体シリコーンゴム（ＬＳＲ）からなる、請求項１に記載の単一細胞収集方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は分子生物学の分野に関し、より具体的には、細胞形態に影響を及ぼすことなく、単一細胞を穏やかに捕捉するための単一細胞の高効率な収集方法に関する。

【背景技術】

【0002】

単一細胞分析は希少細胞から重要な手がかりを明らかにすることができ、これは、異種集団内の複雑な生体調節を理解するために不可欠である。最近、細胞の取り扱いおよび配列決定技術の進歩により、10Xゲノムシステム、CellsearchシステムおよびFluidigm C1を含む商業化されたシステムを使用し、単一細胞ゲノム／トランスクリプトームの分析が可能になった。このようなシステムは新しい生体機序を発見し、疾患を治療するための新しい治療戦略を開発するために、高スループットで単一細胞レベルのゲノム／トランスクリプトーム情報を提供することができる。基本的に、単一細胞分析は様々な生物学的分野で広く用いられており、例えば癌患者の末梢血から単離された循環腫瘍細胞を分析するなど、臨床診断に適用される機会を有している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

しかしながら、単一細胞のサイズは１０～２０μｍに過ぎず、これは単一細胞の操作を非常に困難にする。本発明はまた、単一細胞を収集するための特別な方法または装置の必要性を強調する。マイクロマニピュレーター、フローサイトメータ、単一細胞ピペット、およびフィルターを使用するような現在の単一細胞の操作方法は、低効率、高剪断応力、高コスト、および他の問題によって依然として制限される。例えば、単一細胞を収集するためにフィルターを使用することによって、細胞は、構造的な圧搾力および流体剪断力を受けやすい。一方、フローサイトメータは単一細胞を収集する際に非常に効率的であるが、細胞はまた、レーザーおよび流体の剪断力によって損傷される危険性があり、そしてそれはより高いコストを有する。単一細胞の遺伝子型分析および表現型分析のために、高効率の単一細胞収集方法が緊急に必要とされている。

【0004】

したがって、本発明は、収集ウェル内の流体に対する境界効果の影響を低減するための新しい構造を備えた収集ウェルおよび収集ピペットチップを使用して、それによって収集ウェル内の粒子／細胞のすべて（または大部分）が流体によって駆動され、収集ピペットチップ内に収集されることを可能にする、高効率な単一細胞の収集方法を提供する。これらの手段により、低剪断応力、高速かつ効果的な収集という目的を達成することができる。さらに、本発明は一般的なピペットを用いて手動で操作することができ、機器の購入および保守のコストを低減する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

一態様では、本発明は高効率な単一細胞収集方法を提供する。単一細胞の収集方法は、複数の単一細胞を含有する液体を収集ウェルに導入し、複数の単一細胞を収集ウェルの底部に配置することと、収集ピペットチップを収集ウェルに挿入することと、複数の単一細胞を含む液体を収集ピペットチップに引き込むように吸引力を与えることと、を含む。収集ピペットチップを収集ウェルに挿入する際に収集ピペットチップのピン先と収集ウェルの底部との間にギャップ距離ｘが生成され、ｘは１０～５００μｍの範囲である。

【0006】

本開示で提示される方法は、単一細胞または少数の細胞を迅速かつ効率的な方法で捕捉または収集するための新しい手段を提供する。高効率であることに加えて、この方法はまた、高性能および低コストという利点を有する。これは、細胞損傷を低く抑え、一般的な光学顕微鏡と共に使用して、多方向性単一細胞分析のためのハイコンテント細胞画像を得ることができる。また、本発明は、一般的なピペットを用いて手動で操作することができるので、高い設備コストを必要としない。

【0007】

一実施形態では、収集ピペットチップおよび収集ウェルは、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、または液体シリコーンゴム（ＬＳＲ）からなる。

【0008】

一実施形態では、収集ピペットチップは少なくとも３つの円弧状突起の構造を有するピペットチップであり、収集ピペットチップはピン先の周りに配置された外壁をさらに備える。

【0009】

一実施形態では、外壁と収集ピペットチップとの間に高さ方向のギャップがある。

【0010】

一実施形態では、収集ウェルは少なくとも３つの円弧状突起の構造を有するウェルである。

【0011】

別の好ましい実施形態では収集ウェルの底部が収集ウェルの開口部よりも小さく、収集ウェルの壁は曲線を有する。

【0012】

一実施形態では、収集ウェルおよび収集ピペットチップは、同じ数の円弧状突起を有する。

【0013】

一実施形態では、収集ウェルおよび収集ピペットチップは、花形構造、４つの円弧状突起を有する。

【0014】

一実施形態では、吸引は一般的なピペットによって行われる。

【0015】

単一細胞分析とは、集団全体における個々の細胞間の相違を同定し、集団の不均一性と挙動を理解するのに役立てることである。細胞集団の分析は平均的な属性のみを考慮するが、サンプルの個々の細胞間の小さな重要な変化を同定することはできない。これらの理由は、どのようにして単一細胞を単離し、得るかの重要性を強調し、また、容易に操作され、そして携帯可能である本発明の価値を強調する。

【0016】

したがって、別の態様では、本発明はポータブルチップ設計、単一細胞操作、免疫学、癌および幹細胞研究、疾患診断および薬物開発などの様々な用途に拡張することができる。例えば、１）幹細胞／癌細胞不均一性分析、２）単一細胞系列の確立、３）モノクローナル抗体薬物開発、４）単一細胞関連研究（核酸配列決定、タンパク質分析および単一細胞培養）、５）細胞サンプル／生体粒子の濃度、６）非常に少数の細胞（循環腫瘍細胞など）の分析および実験。

【0017】

この特許又は出願書類は、カラーで作成された少なくとも１の図面を含む。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】収集ピペットチップの側面図である。

【図1B】収集ピペットチップの構造を示す平面図である。

【図1C】収集ピペットチップのピン先の接近側面図である。

【図1D】収集ウェルの構造を示す斜視図である。

【図1E】収集ピペットチップを収集ウェルに挿入した状態の側面図である。

【図2】単一細胞単離のフローチャートを示す。

【図3A】花形ウェルにおける、底部とチップエッジとの間の距離１００μｍの粒子移動トレースを示す。

【図3B】花形ウェルにおける、底部とエッジとの間の距離２００μｍの粒子移動トレースを示す。

【図3C】一般的なマイクロウェルにおける、底部とエッジとの間の距離１００μｍの粒子移動トレースを示す。

【図4A】一般的なマイクロウェルを使用することによる収集結果を示す。

【図4B】花形ウェルを用いた収集結果を示す。

【図4C】一般的なマイクロウェルと花形ウェルとの収集効率の比較を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例においてさらに例示および記載される。これらは、例示のみを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。

【0020】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

【0021】

本明細書で使用されるように、本開示における「花形」という用語は、４つの円弧状突起の構造を説明するために使用される。

【0022】

（実施例）
本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例においてさらに例示され、記載される。本明細書に記載される実施例は例示のために使用されるものであり、本発明を限定するために使用されるものではない。

【0023】

本発明の実施は、細胞生物学および細胞培養の従来技術を含む技術を使用し、これらは当技術分野の通常の技術の範囲内である。このような技術は、文献に十分に説明されている。

【0024】

（実施例１。収集ピペットチップと収集ウェルの構造設計）
図１Ａ－１Ｄに示されるように、収集ピペットチップ１０は、４つの円弧状突起の構造と、ピン先１０２の周りの外壁１０１とを有するピペットチップである。そして、収集ウェル１１は、４つの円弧状突起の構造を有するウェルである。

【0025】

図１Ｃに示すように、収集ピペットチップ１０は、収集ピペットチップ１０のピン先１０２の周りに外壁１０１を有し、外壁１０１と収集ピペットチップ１０との間に高さ方向のギャップ１０３がある。一方、図１Ｄを参照すると、収集ウェル１１の底部１１１は、収集ウェル１１の開口部１１２よりも小さい。図１Ｅに示すように、収集ピペットチップ１０が収集ウェル１１に挿入されると、収集ピペットチップ１０は、収集ウェル１１の壁が湾曲しているため、収集ウェル１１の底部１１１に接触しない。その結果、収集ピペットチップ１０が収集ウェル１１の底部１１１に接触するのを防止するために、それらの間にギャップ距離１０４があり、ギャップ距離は１０～５００μｍの範囲である。

【0026】

したがって、収集ウェル１１内の粒子／細胞を含む液体が収集ピペットチップ１０によって吸引されるとき、収集ピペットチップ１０のピン先１０２は収集ウェル１１の底部１１１から一定の距離を有し、液体中の粒子／細胞は、構造によって、収集ピペットチップ１０のピン先１０２の突起の下にある収集ウェル１１の底部１１１にガイドされる。

【0027】

収集ウェル１１および収集ピペットチップ１０のこれらの三次元構造設計によって、収集ウェル１１内の流体に対する境界効果の影響が低減される。それによって、収集ウェル１１内の粒子／細胞のすべて（または大部分）が、流体によって駆動され、収集ピペットチップ１０内に収集されることを可能にする。流体吸引によって引き起こされる剪断応力が低減され、これはまた、単一細胞の形態を損傷する可能性を低下させる。

【0028】

（実施例２。単一細胞単離方法論。）
図２に示すように、本発明の単一細胞の収集方法は単純だが効率的である。まず、複数の所望の単一細胞または単一粒子を含む液体を収集ウェルに導入する。第２に、収集ピペットチップを一般的なピペットに装着し、収集ピペットチップを収集ウェルに挿入する。収集ウェルの特別に設計された構造では、収集ピペットチップのピン先が収集ウェルの底部からのギャップ距離を有する。これは収集ピペットチップが収集ウェルの底部に接触せず、吸引中に液体の流量が変化することを可能にする空間を有することを意味する。第３に、液体を収集ピペットチップ内に引き込むために、ピペットによって提供される吸引力を与える。これらの構造およびギャップ距離のために、吸引動作中の収集ウェルまたは収集ピペットチップ内の液体の流量が増加する。そして、吸引の間、流体の方向は外壁側から底部を通って収集ピペットチップに向かう。その結果、収集ウェル中の粒子／細胞の全て（または大部分）は、収集ピペットチップにもたらされ、効率的な収集を達成する。

【0029】

（実施例３。収集ウェルおよび花形ピン先を有する収集ピペットチップの効率）
本発明の収集ウェルおよび収集ピペットチップが、液体を吸い上げる間にウェル内の粒子／細胞の移動トレースにどのように影響を及ぼすかを深く理解するために、ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ（登録商標）モデリングソフトウェアを使用する粒子シミュレーションのためのモデルが構築された。マイクロチップのエッジと花形ウェルのウェルの底部との間のギャップ距離である、１００μｍおよび２００μｍの距離の粒子移動トレースを比較する。図３Ａに示すように、花形ウェルにおける１００μｍのギャップは、全ての粒子が０．１５秒以内にマイクロチップ内に移動することを可能にする。ギャップ距離を２００μｍに増加させると、数個の粒子が０．６秒までウェル底部に残留する（図３Ｂ）。従って、チップとウェル底部の間のギャップ距離は、粒子移動速度に影響する重要なパラメータです。マイクロウェルの一般的な丸い形状の垂直側壁における、１００μｍのギャップ距離での粒子移動トレースもシミュレートした。その結果、デッドボリュームが粒子の移動速度に影響するため、ウェルの側壁円周りの底部にいくつかの粒子が残ることが実証された（図３Ｃ）。

【0030】

これらの結果から、円弧状突起を有するウェルは、一般的な丸形ウェルよりも単一細胞収集の効率が良いことが示唆された。

【0031】

（実施例４。一般的なマイクロウェルと本発明の収集ウェルとの間の収集効率の比較）
一般的なマイクロウェルは側壁および底部の近くにデッドボリュームがあり、これは、流量を減少させる境界効果によって影響され、当該エリアは、液体を吸収する間に粒子を押し出すことができず、ウェルに粒子が残ってしまう。花形状と側壁の湾曲を有する設計された収集ウェルは、これにより、液体吸収中にウェル内の流れの流線をガイドして、デッドボリュームを排除することができる。概略図は、図４Ａでは、粒子残留物を保持するマイクロウェルの側面図を示すが、図４Ｂでは、液体吸収中にウェル内の流れの流線をガイドしてデッドボリュームを排除することを可能にする花形ウェルの側面図を示す。花形ウェルの粒子収集効率は１００％に達しており、これはマイクロウェルの４５％よりも著しく高い（図４Ｃ）。

【0032】

上記の比較は、ウェルの底部付近に一定の曲線を有する花形ウェルは、粒子を含む液体の流線を、ピペットチップによって十分に吸収されるようガイドし、ウェル内部に残る残留物を減少させることができることを示す。

【符号の説明】

【0033】

１０ 収集ピペットチップ
１０１ 外壁
１０２ ピン先
１０３ 高さ方向のギャップ
１０４ ギャップ距離
１１ 収集ウェル
１１１ 底部

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【外国語明細書】