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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022077521
(43)【公開日】2022-05-23
(54)【発明の名称】トラフグ属魚類の種又は雑種判別方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6827 20180101AFI20220516BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220516BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220516BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20220516BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6827 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12N15/11 Z
C12Q1/6888 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021183511
(22)【出願日】2021-11-10
(31)【優先権主張番号】P 2020187755
(32)【優先日】2020-11-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構、革新的技術開発・緊急展開事業（うち地域戦略プロジェクト）委託事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】501168814
【氏名又は名称】国立研究開発法人水産研究・教育機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼橋 洋
(72)【発明者】
【氏名】柿岡 諒
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】トラフグ属魚類の種又は雑種の判別方法の提供。
【解決手段】トラフグ属魚類の種又は雑種の判別方法であって、
試料由来の核ＤＮＡについて、トラフグ属魚類の種間で相違する少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出すること、及び
検出したＳＮＰの遺伝子型に基づいて前記試料が属するトラフグ属魚類の種又は雑種を判別すること、
を含む方法。
【選択図】なし
【解決手段】トラフグ属魚類の種又は雑種の判別方法であって、
試料由来の核ＤＮＡについて、トラフグ属魚類の種間で相違する少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出すること、及び
検出したＳＮＰの遺伝子型に基づいて前記試料が属するトラフグ属魚類の種又は雑種を判別すること、
を含む方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トラフグ属魚類の種又は雑種の判別方法であって、
試料由来の核ＤＮＡについて、トラフグ属魚類の種間で相違する少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出すること、及び
検出したＳＮＰの遺伝子型に基づいて前記試料が属するトラフグ属魚類の種又は雑種を判別すること、
を含む方法。
試料由来の核ＤＮＡについて、トラフグ属魚類の種間で相違する少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出すること、及び
検出したＳＮＰの遺伝子型に基づいて前記試料が属するトラフグ属魚類の種又は雑種を判別すること、
を含む方法。
【請求項2】
前記ＳＮＰが、配列番号１～３３及び１６６～１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰである、請求項１記載の判別方法。
【請求項3】
前記ＳＮＰが、配列番号１～３で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号４～６で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号７～９で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１０～１２で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１３～１５及び１６６で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１６～１８及び１６７で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１９～２１で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２２～２４で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２５～２７及び１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２８～３０で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、及び配列番号３１～３３で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰである、請求項１又は２記載の判別方法。
【請求項4】
前記検出したＳＮＰの遺伝子型が下記表１の（ｉｉ）である場合に該試料の種が下記表１の（ｉ）の種であると判別し、前記検出したＳＮＰの遺伝子型が下記表１の（ｉｉｉ）である場合に該試料の種が下記表１の（ｉ）以外のトラフグ属魚類の種であると判別し、前記検出したＳＮＰの遺伝子型が下記表１の（ｉｖ）である場合に該試料の種が下記表１の（ｉ）の種と（ｉ）以外のトラフグ属魚類の種との雑種であると判別するものである、請求項２又は３記載の判別方法。
【表1】
【請求項5】
前記トラフグ属魚類の種が、アカメフグ、ゴマフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クサフグ、マフグ、ムシフグ、ナシフグ、シマフグ、ショウサイフグ、及びトラフグ又はカラスからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～４のいずれか１項記載の判別方法。
【請求項6】
配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを検出することができる、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用プローブ。
【請求項7】
配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを含む領域を増幅することができる、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用プライマーセット。
【請求項8】
請求項６記載のプローブと請求項７記載のプライマーセットとを含む、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用キット。
【請求項9】
配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを含む１５～１００塩基長の部分塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖を含む、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用マーカーであって、
配列番号１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＧであり、
配列番号７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＴであり、
配列番号８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号１０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号１１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号１２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＣであり、
配列番号１３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号１６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号１７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号１８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＡであり、
配列番号１９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号２１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号２３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＡであり、
配列番号２４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号２５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴであり、
配列番号２７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号２８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＧであり、
配列番号２９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号３０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号３１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴであり、
配列番号３２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号３３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＡであり、
配列番号１６６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１６７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＴであり、
配列番号１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴである、
トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用マーカー。
配列番号１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＧであり、
配列番号７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＴであり、
配列番号８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号１０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号１１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号１２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＣであり、
配列番号１３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号１６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号１７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号１８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＡであり、
配列番号１９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号２１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号２３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＡであり、
配列番号２４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号２５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴであり、
配列番号２７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号２８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＧであり、
配列番号２９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号３０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号３１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴであり、
配列番号３２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号３３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＡであり、
配列番号１６６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１６７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＴであり、
配列番号１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴである、
トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トラフグ属魚類の種又は雑種判別方法に関する。
【背景技術】
【0002】
トラフグ属魚類は、食品衛生法に基づき、可食種及び可食部位が定められており、また種類不明フグは確実に排除することと定められている。しかしながら、トラフグ属魚類には、種内変異や種間の交雑により生じた雑種がしばしばみられ、それらは外見から種又は雑種を判別することが困難な場合が多い。さらに、フグの喫食を原因とする食中毒の原因種又は雑種を判別する場合には、外見に依らず、食べ残しや嘔吐物等から種又は雑種を判別する必要がある。
【0003】
トラフグ属魚類の種判別技術としては、これまでに、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の塩基配列情報を利用した種判別方法が報告されている（非特許文献１及び２）。しかしながら、ｍｔＤＮＡは母性遺伝し、雑種は母親種のｍｔＤＮＡしか持たないことから、雑種が判別できないという問題があった。さらに、トラフグ属魚類種間には、進化の過程で交雑を介したｍｔＤＮＡの異種間浸透現象が起きているため、ｍｔＤＮＡに基づく判別方法では一定の確率で誤判別が生じるという問題があった。
【0004】
また、両性遺伝する核ＤＮＡの多型情報を利用したトラフグ属魚類の種又は雑種判別方法も報告されている（非特許文献３及び４）。該方法は、増幅断片長多型（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＡＦＬＰ）法を利用した手法であるが、実験手順が煩雑で分析に時間がかかるという問題があった。また、ＡＦＬＰ法は、ゲノムＤＮＡを制限酵素で切断した断片に特定のアダプターを付加し、これらをＰＣＲ法により増幅するための鋳型とし、３'末端に任意の塩基を付加したプライマーを用いて増幅することで塩基配列の多型情報を得る方法であり、用いるゲノムＤＮＡが予め断片化していると実験の再現性が低くなるという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Hsieh, Y.W. et al. "Identification of toxin and fish species in cooked fish liver implicated in food poisoning" Journal of Food Science, 67(3), 948-952, 2002
【非特許文献2】吹屋貞子、數田行雄、「ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法およびＰＣＲ－ＳＳＣＰ法によるフグ種の鑑別」、山口県環境保健センター所報、第５３号、４９－５１、平成２２年
【非特許文献3】Takahashi, H. et al. "Asymmetric hybridization and introgression between sibling species of the pufferfish Takifugu that have undergone explosive speciation" Marine Biology, 164(4), 90, 2017
【非特許文献4】Tatsuno, R. et al. "Tetrodotoxin distribution in natural hybrids between the pufferfish species Takifugu rubripes and Takifugu porphyreus" Fisheries Science, 85(1), 247-245, 2019
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、トラフグ属魚類の種又は雑種を正確、簡便、かつ迅速に判別する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々検討した結果、トラフグ属魚類の核ＤＮＡ上に種特異的な一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）を複数見出した。また、本発明者らは、該ＳＮＰを指標として用いることで、トラフグ魚類の種又は雑種を高い精度で、簡便、迅速に判別できることを見出し、本発明を完成した。
【0008】
すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔９〕を提供するものである。
〔１〕トラフグ属魚類の種又は雑種の判別方法であって、
試料由来の核ＤＮＡについて、トラフグ属魚類の種間で相違する少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出すること、及び
検出したＳＮＰの遺伝子型に基づいて前記試料が属するトラフグ属魚類の種又は雑種を判別すること、
を含む方法。
〔２〕前記ＳＮＰが、配列番号１～３３及び１６６～１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰである、〔１〕の判別方法。
〔３〕前記ＳＮＰが、配列番号１～３で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号４～６で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号７～９で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１０～１２で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１３～１５及び１６６で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１６～１８及び１６７で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１９～２１で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２２～２４で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２５～２７及び１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２８～３０で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、及び配列番号３１～３３で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰである、〔１〕又は〔２〕の判別方法。
〔４〕前記検出したＳＮＰの遺伝子型が下記表１の（ｉｉ）である場合に該試料の種が下記表１の（ｉ）の種であると判別し、前記検出したＳＮＰの遺伝子型が下記表１の（ｉｉｉ）である場合に該試料の種が下記表１の（ｉ）以外のトラフグ属魚類の種であると判別し、前記検出したＳＮＰの遺伝子型が下記表１の（ｉｖ）である場合に該試料の種が下記表１の（ｉ）の種と（ｉ）以外のトラフグ属魚類の種との雑種であると判別するものである、〔２〕又は〔３〕の判別方法。
〔１〕トラフグ属魚類の種又は雑種の判別方法であって、
試料由来の核ＤＮＡについて、トラフグ属魚類の種間で相違する少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出すること、及び
検出したＳＮＰの遺伝子型に基づいて前記試料が属するトラフグ属魚類の種又は雑種を判別すること、
を含む方法。
〔２〕前記ＳＮＰが、配列番号１～３３及び１６６～１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰである、〔１〕の判別方法。
〔３〕前記ＳＮＰが、配列番号１～３で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号４～６で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号７～９で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１０～１２で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１３～１５及び１６６で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１６～１８及び１６７で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１９～２１で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２２～２４で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２５～２７及び１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２８～３０で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、及び配列番号３１～３３で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰである、〔１〕又は〔２〕の判別方法。
〔４〕前記検出したＳＮＰの遺伝子型が下記表１の（ｉｉ）である場合に該試料の種が下記表１の（ｉ）の種であると判別し、前記検出したＳＮＰの遺伝子型が下記表１の（ｉｉｉ）である場合に該試料の種が下記表１の（ｉ）以外のトラフグ属魚類の種であると判別し、前記検出したＳＮＰの遺伝子型が下記表１の（ｉｖ）である場合に該試料の種が下記表１の（ｉ）の種と（ｉ）以外のトラフグ属魚類の種との雑種であると判別するものである、〔２〕又は〔３〕の判別方法。
【0009】
【表1】
【0010】
〔５〕前記トラフグ属魚類の種が、アカメフグ、ゴマフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クサフグ、マフグ、ムシフグ、ナシフグ、シマフグ、ショウサイフグ、及びトラフグ又はカラスからなる群より選択される少なくとも１種である、〔１〕～〔４〕のいずれかの判別方法。
〔６〕配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを検出することができる、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用プローブ。
〔７〕配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを含む領域を増幅することができる、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用プライマーセット。
〔８〕〔６〕のプローブと〔７〕のプライマーセットとを含む、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用キット。
〔９〕配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを含む１５～１００塩基長の部分塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖を含む、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用マーカーであって、
配列番号１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＧであり、
配列番号７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＴであり、
配列番号８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号１０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号１１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号１２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＣであり、
配列番号１３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号１６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号１７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号１８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＡであり、
配列番号１９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号２１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号２３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＡであり、
配列番号２４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号２５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴであり、
配列番号２７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号２８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＧであり、
配列番号２９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号３０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号３１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴであり、
配列番号３２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号３３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＡであり、
配列番号１６６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１６７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＴであり、
配列番号１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴである、
トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用マーカー。
〔６〕配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを検出することができる、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用プローブ。
〔７〕配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを含む領域を増幅することができる、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用プライマーセット。
〔８〕〔６〕のプローブと〔７〕のプライマーセットとを含む、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用キット。
〔９〕配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを含む１５～１００塩基長の部分塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖を含む、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用マーカーであって、
配列番号１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＧであり、
配列番号７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＴであり、
配列番号８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号１０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号１１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号１２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＣであり、
配列番号１３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号１６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号１７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号１８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＡであり、
配列番号１９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号２１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号２３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＡであり、
配列番号２４で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＣであり、
配列番号２５で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号２６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴであり、
配列番号２７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号２８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＧであり、
配列番号２９で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＧであり、
配列番号３０で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＴ又はＣであり、
配列番号３１で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴであり、
配列番号３２で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＧであり、
配列番号３３で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＡであり、
配列番号１６６で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＣ又はＴであり、
配列番号１６７で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＧ又はＴであり、
配列番号１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基がＡ又はＴである、
トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用マーカー。
【発明の効果】
【0011】
本発明の方法によれば、トラフグ属魚類の種又は雑種を、外見に依らず、高い精度で、簡便、迅速に判別することができる。かかる判別に利用するＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種を判別するための指標として有用である。また、本発明は、該ＳＮＰを検出してトラフグ属魚類の種又は雑種を判別するためのプローブ、プライマーセット及びキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ゴマフグ、ショウサイフグ、及びそれらの間の雑種より採取した試料由来の核ＤＮＡについて、配列番号４で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型を検出した結果を示す図である。
【図2】ゴマフグ、ショウサイフグ、及びそれらの間の雑種より採取した試料由来の核ＤＮＡについて、配列番号５で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型を検出した結果を示す図である。
【図3】ゴマフグ、ショウサイフグ、及びそれらの間の雑種より採取した試料由来の核ＤＮＡについて、配列番号６で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型を検出した結果を示す図である。
【図4】ゴマフグ、ショウサイフグ、及びそれらの間の雑種より採取した試料由来の核ＤＮＡについて、配列番号２８で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型を検出した結果を示す図である。
【図5】ゴマフグ、ショウサイフグ、及びそれらの間の雑種より採取した試料由来の核ＤＮＡについて、配列番号２９で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型を検出した結果を示す図である。
【図6】ゴマフグ、ショウサイフグ、及びそれらの間の雑種より採取した試料由来の核ＤＮＡについて、配列番号３０で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型を検出した結果を示す図である。
【図7】トラフグ属魚類１１種より採取した試料由来の核ＤＮＡについて、配列番号１で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型を検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ規定（IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138:9-37, 1984）、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）などの、当該分野で慣用される記号で記載されている。本明細書において「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する。
【0014】
本明細書において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含むものとする。当該ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また当該ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。また、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。
【0015】
本明細書において、塩基配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１～３３及び１６６～１６８で示される塩基配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。塩基配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
【0016】
本明細書において「一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）」とは、個体間でゲノムＤＮＡ塩基配列上の特定部位の塩基配列が異なり、その頻度が集団の１％以上であるＤＮＡ多型のうち、特に、１個の塩基が他の塩基に置換されたことによる多型を意味する。以下、ＳＮＰの遺伝子型を対立遺伝子１、対立遺伝子２の順に表すことがある。例えば、ＡＡのように両対立遺伝子が同じ場合、遺伝子型はホモ接合型であり、ＡＴのように両対立遺伝子が異なる場合、遺伝子型はヘテロ接合型である。本明細書において「ＳＮＰ」は、対立遺伝子１、対立遺伝子２及びそれらの相補鎖のいずれをも含むものである。
【0017】
本明細書において「トラフグ属魚類」は、フグ目フグ科トラフグ属（Ｔａｋｉｆｕｇｕ）に属する魚類をさす。「トラフグ属魚類に属する種」としては、特に限定されないが、好ましくは、標準和名アカメフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｃｈｒｙｓｏｐｓ）、ゴマフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｓｔｉｃｔｏｎｏｔｕｓ）、ヒガンフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｐａｒｄａｌｉｓ）、コモンフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｆｌａｖｉｐｔｅｒｕｓ）、クサフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ａｌｂｏｐｌｕｍｂｅｕｓ）、マフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｐｏｒｐｈｙｒｅｕｓ）、ムシフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｅｘａｓｃｕｒｕｓ）、ナシフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、シマフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒｕｓ）、ショウサイフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｓｎｙｄｅｒｉ）、トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）、カラス（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）等が挙げられる。このうち、トラフグとカラスは遺伝的な区別が難しい非常に近縁な種とされており、本発明においては両者を区別しない。
本明細書において「雑種」とは、ある種と別のある種の交雑の結果生じた個体を意味する。ここで、種とは、上記のトラフグ属魚類に属する種をさす。
本明細書において「雑種」とは、ある種と別のある種の交雑の結果生じた個体を意味する。ここで、種とは、上記のトラフグ属魚類に属する種をさす。
【0018】
本発明のトラフグ属魚類の種又は雑種の判別方法は、試料由来の核ＤＮＡについて、トラフグ属魚類の種間で相違する少なくとも１つのＳＮＰを検出すること、及び検出したＳＮＰの遺伝子型に基づいて該試料が属するトラフグ属魚類の種又は雑種を判別すること、を含む。
【0019】
本発明で用いる試料としては、例えば、鰭（尾鰭、背鰭、胸鰭、腹鰭、尻鰭）、血液、筋肉、内臓（胃、心臓、腎臓、肝臓、卵巣、精巣等）等のトラフグ属魚類より採取された生体試料が挙げられる。試料の別の例としては、トラフグ属魚類を用いた食品、食品残渣、嘔吐物等のトラフグ属魚類の一部が含まれている可能性のある試料が挙げられる。試料からの核ＤＮＡの抽出は、公知の方法を用いて行うことができる。核ＤＮＡの抽出法としては、例えば、フェノール法、ＣＴＡＢ法、アルカリＳＤＳ法等が挙げられる。核ＤＮＡは、粗抽出物をそのまま使用してもよいし、必要に応じて、公知の方法により精製してもよい。核ＤＮＡ抽出のための試薬やキットは市販されており、これを用いてもよい。
【0020】
本発明において、「ＳＮＰの検出」とは、ＳＮＰ部位の遺伝子型を検出すること、いわゆるＳＮＰタイピングを意味する。本発明のトラフグ属魚類の種間で相違する少なくとも１つのＳＮＰは、好ましくは、配列番号１～３３及び１６６～１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置における計３６個のＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰである。ここで、配列番号１～３３及び１６６～１６８で示される塩基配列は、それぞれ、ＮＣＢＩデータベースのトラフグゲノムアセンブリ（ＦＵＧＵ５、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000180615.1/）における部分塩基配列である。よって、各ＳＮＰは、トラフグでは、後述する染色体番号又はスキャフォルド番号の所定の塩基の位置に存在し、トラフグ以外のトラフグ属魚類の種又は雑種では、該染色体番号又はスキャフォルド番号の所定の塩基の位置又はそれに相当する塩基の位置に存在する。なお、「スキャフォルド」とは、ゲノム解析により得られた多数の断片的な配列を用いてゲノム配列を構築した結果まとめられた配列のことをさす。
【0021】
配列番号１で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の２番染色体の７，００７，９８５～７，００８，２８５位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（７，００８，１３５位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、アカメフグではＴＴであり、アカメフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＣＣであり、アカメフグとアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＴＣである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＴＴの場合に試料がアカメフグ由来の試料であり、遺伝子型がＣＣの場合に試料がアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＴＣの場合に試料がアカメフグとアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0022】
配列番号２で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１７番染色体の９，２９５，０３２～９，２９５，３３２位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（９，２９５，１８２位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、アカメフグではＣＣであり、アカメフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＴＴであり、アカメフグとアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＣＴである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＣＣの場合に試料がアカメフグ由来の試料であり、遺伝子型がＴＴの場合に試料がアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＣＴの場合に試料がアカメフグとアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号２で示される塩基配列の１３２番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号２で示される塩基配列の１３２番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0023】
配列番号３で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５のスキャフォルド２６９番の９５，３０５～９５，６０５位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（９５，４５５位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、アカメフグではＡＡであり、アカメフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、アカメフグとアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がアカメフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＧの場合に試料がアカメフグとアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0024】
配列番号４で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の２番染色体の５，５８０，４９４～５、５８０、７９４位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（５，５８０，６４４位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ゴマフグではＡＡであり、ゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、ゴマフグとゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がゴマフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＧの場合に試料がゴマフグとゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0025】
配列番号５で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の７番染色体の４，６５１，８１７～４，６５２，１１７位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（４，６５１，９６７位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ゴマフグではＴＴであり、ゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＣＣであり、ゴマフグとゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＴＣである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＴＴの場合に試料がゴマフグ由来の試料であり、遺伝子型がＣＣの場合に試料がゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＴＣの場合に試料がゴマフグとゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0026】
配列番号６で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５のスキャフォルド３０５番の１４５，３２８～１４５，６２８位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１４５，４７８位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ゴマフグではＴＴであり、ゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、ゴマフグとゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＴＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＴＴの場合に試料がゴマフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＴＧの場合に試料がゴマフグとゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0027】
配列番号７で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の８番染色体の１，５３２，７１７～１，５３３，０１７位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１，５３２，８６７位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ヒガンフグではＧＧであり、ヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＴＴであり、ヒガンフグとヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＧＴである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＧＧの場合に試料がヒガンフグ由来の試料であり、遺伝子型がＴＴの場合に試料がヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＧＴの場合に試料がヒガンフグとヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0028】
配列番号８で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１４番染色体の６，０６７，３５６～６，０６７，６５６位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（６，０６７，５０６位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ヒガンフグではＡＡであり、ヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、ヒガンフグとヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がヒガンフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＧの場合に試料がヒガンフグとヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0029】
配列番号９で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の２０番染色体の３，３６５，１５５～３，３６５，４５５位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（３，３６５，３０５位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ヒガンフグではＴＴであり、ヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＣＣであり、ヒガンフグとヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＴＣである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＴＴの場合に試料がヒガンフグ由来の試料であり、遺伝子型がＣＣの場合に試料がヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＴＣの場合に試料がヒガンフグとヒガンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0030】
配列番号１０で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の７番染色体の３，２６３，７７７～３，２６４，０７７位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（３，２６３，９２７位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、コモンフグではＡＡであり、コモンフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、コモンフグとコモンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がコモンフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がコモンフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＧの場合に試料がコモンフグとコモンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号１０で示される塩基配列の１１０、１７１、及び２０３番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号１０で示される塩基配列の１１０、１７１、及び２０３番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0031】
配列番号１１で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１０番染色体の１，９４０，９５１～１，９４１，２５１位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１，９４１，１０１位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、コモンフグではＧＧであり、コモンフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＣＣであり、コモンフグとコモンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＧＣである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＧＧの場合に試料がコモンフグ由来の試料であり、遺伝子型がＣＣの場合に試料がコモンフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＧＣの場合に試料がコモンフグとコモンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号１１で示される塩基配列の１３６及び１８２番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号１１で示される塩基配列の１３６及び１８２番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0032】
配列番号１２で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５のスキャフォルド３３４番の１１５，９２２～１１６，２２２位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１１６，０７２位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、コモンフグではＡＡであり、コモンフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＣＣであり、コモンフグとコモンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＣである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がコモンフグ由来の試料であり、遺伝子型がＣＣの場合に試料がコモンフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＣの場合に試料がコモンフグとコモンフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号１２で示される塩基配列の１１７及び１３６番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号１２で示される塩基配列の１１７及び１３６番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0033】
配列番号１３で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の３番染色体の６，０７４，９９５～６，０７５，２９５位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（６，０７５，１４５位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、クサフグではＣＣであり、クサフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＴＴであり、クサフグとクサフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＣＴである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＣＣの場合に試料がクサフグ由来の試料であり、遺伝子型がＴＴの場合に試料がクサフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＣＴの場合に試料がクサフグとクサフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号１３で示される塩基配列の１６９番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号１３で示される塩基配列の１６９番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0034】
配列番号１４で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１０番染色体の５，４４７，０１０～５，４４７，３１０位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（５，４４７，１６０位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、クサフグではＣＣであり、クサフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＴＴであり、クサフグとクサフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＣＴである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＣＣの場合に試料がクサフグ由来の試料であり、遺伝子型がＴＴの場合に試料がクサフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＣＴの場合に試料がクサフグとクサフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0035】
配列番号１５で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の２０番染色体の５，１４６，４４３～５，１４６，７４３位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（５，１４６，５９３位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、クサフグではＡＡであり、クサフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、クサフグとクサフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がクサフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がクサフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＧの場合に試料がクサフグとクサフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号１５で示される塩基配列の１３４番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号１５で示される塩基配列の１３４番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0036】
配列番号１６で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の９番染色体の６，１９９，４４０～６，１９９，７４０位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（６，１９９，５９０位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、マフグではＧＧであり、マフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＣＣであり、マフグとマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＧＣである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＧＧの場合に試料がマフグ由来の試料であり、遺伝子型がＣＣの場合に試料がマフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＧＣの場合に試料がマフグとマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号１６で示される塩基配列の１６０及び１８４番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号１６で示される塩基配列の１６０及び１８４番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0037】
配列番号１７で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１８番染色体の２２９，７６０～２３０，０６０位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（２２９，９１０位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、マフグではＴＴであり、マフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＣＣであり、マフグとマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＴＣである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＴＴの場合に試料がマフグ由来の試料であり、遺伝子型がＣＣの場合に試料がマフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＴＣの場合に試料がマフグとマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0038】
配列番号１８で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の２１番染色体の９，６３３，３２５～９，６３３，６２５位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（９，６３３，４７５位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、マフグではＧＧであり、マフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＡＡであり、マフグとマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＧＡである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＧＧの場合に試料がマフグ由来の試料であり、遺伝子型がＡＡの場合に試料がマフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＧＡの場合に試料がマフグとマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号１８で示される塩基配列の１２８番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号１８で示される塩基配列の１２８番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0039】
配列番号１９で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の４番染色体の４，１０８，９３７～４，１０９，２３７位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（４，１０９，０８７位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ムシフグではＡＡであり、ムシフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、ムシフグとムシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がムシフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がムシフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＧの場合に試料がムシフグとムシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0040】
配列番号２０で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１０番染色体の３，２７１，３７１～３，２７１，６７１位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（３，２７１，５２１位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ムシフグではＣＣであり、ムシフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、ムシフグとムシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＣＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＣＣの場合に試料がムシフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がムシフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＣＧの場合に試料がムシフグとムシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号２０で示される塩基配列の１２１、１３１、１３３、１７２及び１７６番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号２０で示される塩基配列の１２１、１３１、１３３、１７２及び１７６番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0041】
配列番号２１で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５のスキャフォルド３０５番の１４５，５３４～１４５，８３４位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１４５，６８４位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ムシフグではＡＡであり、ムシフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、ムシフグとムシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がムシフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がムシフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＧの場合に試料がムシフグとムシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号２１で示される塩基配列の１２７、１４３及び１９１番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号２１で示される塩基配列の１２７、１４３及び１９１番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0042】
配列番号２２で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１２番染色体の１４３，９４８～１４４，２４８位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１４４，０９８位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ナシフグではＴＴであり、ナシフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＣＣであり、ナシフグとナシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＴＣである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＴＴの場合に試料がナシフグ由来の試料であり、遺伝子型がＣＣの場合に試料がナシフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＴＣの場合に試料がナシフグとナシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号２２で示される塩基配列の１４５、１６３及び１７６番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号２２で示される塩基配列の１４５、１６３及び１７６番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0043】
配列番号２３で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１３番染色体の１４，８６０，６９５～１４，８６０，９９５位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１４，８６０，８４５位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ナシフグではＣＣであり、ナシフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＡＡであり、ナシフグとナシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＣＡである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＣＣの場合に試料がナシフグ由来の試料であり、遺伝子型がＡＡの場合に試料がナシフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＣＡの場合に試料がナシフグとナシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号２３で示される塩基配列の１７５番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号２３で示される塩基配列の１７５番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0044】
配列番号２４で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１８番染色体の１，３９０，６７８～１，３９０，９７８位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１，３９０，８２８位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ナシフグではＧＧであり、ナシフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＣＣであり、ナシフグとナシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＧＣである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＧＧの場合に試料がナシフグ由来の試料であり、遺伝子型がＣＣの場合に試料がナシフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＧＣの場合に試料がナシフグとナシフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号２４で示される塩基配列の１５８、１６０、１６２、１６９及び１７２番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号２４で示される塩基配列の１５８、１６０、１６２、１６９及び１７２番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0045】
配列番号２５で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１番染色体の１１，３６１，３４３～１１，３６１，６４３位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１１，３６１，４９３位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、シマフグではＡＡであり、シマフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、シマフグとシマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がシマフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がシマフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＧの場合に試料がシマフグとシマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号２５で示される塩基配列の１４６番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号２５で示される塩基配列の１４６番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0046】
配列番号２６で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の２番染色体の７，０７４，９８９～７，０７５，２８９位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（７，０７５，１３９位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、シマフグではＡＡであり、シマフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＴＴであり、シマフグとシマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＴである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がシマフグ由来の試料であり、遺伝子型がＴＴの場合に試料がシマフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＴの場合に試料がシマフグとシマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号２６で示される塩基配列の１６０及び１６８番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号２６で示される塩基配列の１６０及び１６８番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0047】
配列番号２７で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１９番染色体の１１，４５１，６６５～１１，４５１，９６５位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１１，４５１，８１５位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、シマフグではＣＣであり、シマフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、シマフグとシマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＣＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＣＣの場合に試料がシマフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がシマフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＣＧの場合に試料がシマフグとシマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0048】
配列番号２８で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の４番染色体の２，００６，３２１～２，００６，６２１位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（２，００６，４７１位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ショウサイフグではＴＴであり、ショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、ショウサイフグとショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＴＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＴＴの場合に試料がショウサイフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＴＧの場合に試料がショウサイフグとショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号２８で示される塩基配列の１６４番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号２８で示される塩基配列の１６４番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0049】
配列番号２９で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の６番染色体の４１，１５６～４１，４５６位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（４１，３０６位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ショウサイフグではＣＣであり、ショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、ショウサイフグとショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＣＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＣＣの場合に試料がショウサイフグ由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＣＧの場合に試料がショウサイフグとショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0050】
配列番号３０で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１１番染色体の６８３，６２９～６８３，９２９位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（６８３，７７９位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、ショウサイフグではＴＴであり、ショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＣＣであり、ショウサイフグとショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＴＣである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＴＴの場合に試料がショウサイフグ由来の試料であり、遺伝子型がＣＣの場合に試料がショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＴＣの場合に試料がショウサイフグとショウサイフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号３０で示される塩基配列の１３４番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号３０で示される塩基配列の１３４番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0051】
配列番号３１で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の８番染色体の５，６２１，４５８～５，６２１，７５８位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（５，６２１，６０８位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、トラフグ又はカラスではＡＡであり、トラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種ではＴＴであり、トラフグ又はカラスとトラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＴである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がトラフグ又はカラス由来の試料であり、遺伝子型がＴＴの場合に試料がトラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＴの場合に試料がトラフグ又はカラスとトラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0052】
配列番号３２で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１４番染色体の７，１８５，１７７～７，１８５，４７７位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（７，１８５，３２７位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、トラフグ又はカラスではＡＡであり、トラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種ではＧＧであり、トラフグ又はカラスとトラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＧである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がトラフグ又はカラス由来の試料であり、遺伝子型がＧＧの場合に試料がトラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＧの場合に試料がトラフグ又はカラスとトラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
【0053】
配列番号３３で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１９番染色体の１１，０４３，１４３～１１，０４３，４４３位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１１，０４３，２９３位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、トラフグ又はカラスではＧＧであり、トラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種ではＡＡであり、トラフグ又はカラスとトラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＧＡである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＧＧの場合に試料がトラフグ又はカラス由来の試料であり、遺伝子型がＡＡの場合に試料がトラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＧＡの場合に試料がトラフグ又はカラスとトラフグ及びカラス以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号３３で示される塩基配列の１７４番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号３３で示される塩基配列の１７４番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0054】
配列番号１６６で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１７番染色体の５，８２３，１３０～５，８２３，４３０位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（５，８２３，２８１位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、クサフグではＣＣであり、クサフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＴＴであり、クサフグとクサフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＣＴである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＣＣの場合に試料がクサフグ由来の試料であり、遺伝子型がＴＴの場合に試料がクサフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＣＴの場合に試料がクサフグとクサフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号１６６で示される塩基配列の１３７番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号１６６で示される塩基配列の１３７番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0055】
配列番号１６７で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の１番染色体の１８，６８１，３７７～１８，６８１，６７７位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（１８，６８１，５２８位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、マフグではＧＧであり、マフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＴＴであり、マフグとマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＧＴである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＧＧの場合に試料がマフグ由来の試料であり、遺伝子型がＴＴの場合に試料がマフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＧＴの場合に試料がマフグとマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号１６７で示される塩基配列の１６８、１７４、１８８及び１９３番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号１６７で示される塩基配列の１６８、１７４、１８８及び１９３番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0056】
配列番号１６８で示される塩基配列は、ＦＵＧＵ５の２番染色体の４８６，７９０～４８７，０９０位の塩基配列である。該塩基配列の１５１番目（４８６，９４１位）の塩基の位置におけるＳＮＰの遺伝子型は、シマフグではＡＡであり、シマフグ以外のトラフグ属魚類の種ではＴＴであり、シマフグとシマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種ではＡＴである。よって、該ＳＮＰは、遺伝子型がＡＡの場合に試料がシマフグ由来の試料であり、遺伝子型がＴＴの場合に試料がシマフグ以外のトラフグ属魚類の種由来の試料であり、遺伝子型がＡＴの場合に試料がシマフグとシマフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種由来の試料であると判断できる指標となる。
なお、配列番号１６８で示される塩基配列の１３３、１３５及び１４１番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
なお、配列番号１６８で示される塩基配列の１３３、１３５及び１４１番目の塩基の位置には、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型が存在する。
【0057】
各ＳＮＰの遺伝子型とトラフグ属魚類の種又は雑種との関係を下記表２に示す。本発明の方法においては、検出したＳＮＰの遺伝子型が表２の（ｉｉ）である場合に、試料が由来する種は表２の（ｉ）の種であると判別でき、検出したＳＮＰの遺伝子型が表２の（ｉｉｉ）である場合に、試料が由来する種は表２の（ｉ）以外のトラフグ属魚類の種であると判別でき、検出したＳＮＰの遺伝子型が表２の（ｉｖ）である場合に、試料が由来する種は表２の（ｉ）の種と（ｉ）以外のトラフグ属魚類の種との雑種であると判別することができる。
【0058】
【表2】
【0059】
本発明の方法においては、上記のＳＮＰのうち、１つのＳＮＰのみを種又は雑種の判別の指標として用いてもよく、２以上のＳＮＰを組み合わせて種又は雑種の判別の指標として用いてもよいが、判別精度の観点から、２以上のＳＮＰを組み合わせて指標として用いることが好ましい。なかでも、アカメフグ、ゴマフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クサフグ、マフグ、ムシフグ、ナシフグ、シマフグ、ショウサイフグ、及びトラフグ又はカラス、並びにこれらの間の雑種をまとめて判別できることから、配列番号１～３で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号４～６で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号７～９で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１０～１２で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１３～１５及び１６６で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１６～１８及び１６７で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号１９～２１で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２２～２４で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２５～２７及び１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、配列番号２８～３０で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰ、及び配列番号３１～３３で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰを組み合わせて指標として用いることがより好ましく、配列番号１～３３及び１６６～１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置における計３６個のＳＮＰの全てを指標として用いることがさらに好ましい。
【0060】
ＳＮＰの検出は、公知の方法を用いて行うことができる。ＳＮＰの検出法としては、特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ、ＰＣＲ－ＳＳＯ、ＰＣＲ－ＡＳＰ、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、サイクリングプローブ法、スマートアンプ法、モレキュラービーコン法、インベーダー法、ＬＡＭＰ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、ダイレクトシークエンス法、Ｓｎｉｐｅｒ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法、マイクロアレイ法、ＤＯＬ法、ＴＤＩ法等が挙げられる。
【0061】
本発明においては、ＳＮＰの検出法としてＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いるのが、検出時間及び検出精度の点から好ましい。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法に用いられる試薬やキットは市販されており、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ
Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてもよい。
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によるＳＮＰの検出は、以下のように実施できる。鋳型ＤＮＡ上の目的のＳＮＰが位置する塩基を含む塩基配列と特異的にハイブリダイズするプローブであって、該ＳＮＰ位置に対応する塩基が、該ＳＮＰの対立遺伝子１と相補的な塩基であり、かつ５’末端が蛍光物質で、３’末端がクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されたプローブ（第１のプローブ）と、該ＳＮＰ位置に対応する塩基が、該ＳＮＰの対立遺伝子２と相補的な塩基であり、かつ５’末端が第１のプローブとは異なる蛍光物質で、３’末端がクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されたプローブ（第２のプローブ）と、鋳型ＤＮＡ上の該プローブが特異的にハイブリダイズする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットと、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ試薬を用いてＰＣＲ反応を行う。鋳型ＤＮＡが対立遺伝子１のみを有する場合、第１のプローブはアニーリングステップで鋳型ＤＮＡにハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。伸長反応ステップのときに、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により鋳型ＤＮＡにハイブリダイズした第１のプローブが分解されると、蛍光物質は遊離し、クエンチャー物質による抑制が解除されて蛍光を発する。一方、第２のプローブはＳＮＰ位置にミスマッチを含み、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズできず、プローブの分解も生じないため、蛍光の発生は抑制される。よって、第１のプローブの蛍光のみが検出され、第２のプローブの蛍光は検出されない。逆に、鋳型ＤＮＡが対立遺伝子２のみを有する場合、第１のプローブの蛍光は検出されず、第２のプローブの蛍光のみが検出される。また、鋳型ＤＮＡが対立遺伝子１及び２を有する場合、第１のプローブ及び第２のプローブの両方の蛍光が検出される。斯くして、検出された蛍光の種類及び強度に基づいて、ＳＮＰの遺伝子型を決定することができる。
Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてもよい。
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によるＳＮＰの検出は、以下のように実施できる。鋳型ＤＮＡ上の目的のＳＮＰが位置する塩基を含む塩基配列と特異的にハイブリダイズするプローブであって、該ＳＮＰ位置に対応する塩基が、該ＳＮＰの対立遺伝子１と相補的な塩基であり、かつ５’末端が蛍光物質で、３’末端がクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されたプローブ（第１のプローブ）と、該ＳＮＰ位置に対応する塩基が、該ＳＮＰの対立遺伝子２と相補的な塩基であり、かつ５’末端が第１のプローブとは異なる蛍光物質で、３’末端がクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されたプローブ（第２のプローブ）と、鋳型ＤＮＡ上の該プローブが特異的にハイブリダイズする塩基配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットと、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ試薬を用いてＰＣＲ反応を行う。鋳型ＤＮＡが対立遺伝子１のみを有する場合、第１のプローブはアニーリングステップで鋳型ＤＮＡにハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。伸長反応ステップのときに、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により鋳型ＤＮＡにハイブリダイズした第１のプローブが分解されると、蛍光物質は遊離し、クエンチャー物質による抑制が解除されて蛍光を発する。一方、第２のプローブはＳＮＰ位置にミスマッチを含み、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズできず、プローブの分解も生じないため、蛍光の発生は抑制される。よって、第１のプローブの蛍光のみが検出され、第２のプローブの蛍光は検出されない。逆に、鋳型ＤＮＡが対立遺伝子２のみを有する場合、第１のプローブの蛍光は検出されず、第２のプローブの蛍光のみが検出される。また、鋳型ＤＮＡが対立遺伝子１及び２を有する場合、第１のプローブ及び第２のプローブの両方の蛍光が検出される。斯くして、検出された蛍光の種類及び強度に基づいて、ＳＮＰの遺伝子型を決定することができる。
【0062】
ＰＣＲの条件は、特に限定されず、増幅サイズ、プローブ及び／又はプライマーの塩基長、ＧＣ含有率、Ｔｍ値等を考慮して最適条件を定めればよいが、例えば、以下の条件が挙げられる。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：通常９３～９５℃程度で、通常３秒間～１分間程度加熱する。
２）アニーリング：通常５０～６０℃程度で、通常１０秒間～１分間程度加熱する。
３）ＤＮＡ伸長反応：通常６０～７４℃程度で、通常１０秒間～５分間程度加熱する。
ここで、アニーリングとＤＮＡ伸長反応は分けずに同時に行うことも可能である。
上記１）～３）の反応を、通常３０～５０サイクル程度行うことにより、プローブ由来の蛍光を検出することができる。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：通常９３～９５℃程度で、通常３秒間～１分間程度加熱する。
２）アニーリング：通常５０～６０℃程度で、通常１０秒間～１分間程度加熱する。
３）ＤＮＡ伸長反応：通常６０～７４℃程度で、通常１０秒間～５分間程度加熱する。
ここで、アニーリングとＤＮＡ伸長反応は分けずに同時に行うことも可能である。
上記１）～３）の反応を、通常３０～５０サイクル程度行うことにより、プローブ由来の蛍光を検出することができる。
【0063】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ装置、例えば、ＳｔｅｐＯｎｅ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行うことが、迅速かつ簡便にＳＮＰを検出できるため好ましい。
【0064】
本発明において、プローブは、配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを検出することができるプローブであればよい。プローブは、好ましくは、配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基（ＳＮＰが位置する塩基）を含む塩基配列に特異的にハイブリダイズし、該ＳＮＰ位置に対応する塩基が該ＳＮＰの対立遺伝子１又は２と相補的な塩基である塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、配列番号１～３３及び１６６～１６８で示される塩基配列に基づいて適宜設計され得る。プローブの塩基長は、通常約１０～５０塩基であり、好ましくは約１０～３５塩基であり、より好ましくは約１２～３０塩基である。プローブは、５’末端がＦＩＴＣ、ＶＩＣ等の蛍光物質で、３’末端がＴＡＭＲＡ、ＭＧＢ等のクエンチャーでそれぞれ標識されているのが好ましく、該標識を有するプローブは、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるＳＮＰ検出に好適に用いられる。なお、「標的部位（配列）に対して特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 Vol. Set), Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001に記載の条件）において、他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。好適には、プローブは、検出すべきＳＮＰ部位の塩基を含む領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましいが、かかる特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。
【0065】
かかるプローブの例としては、配列番号３４～９９及び１６９～１７４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、該塩基配列の相補的配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号３４～９９及び１６９～１７４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は該塩基配列の相補的配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて１若しくは２個の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列からなり、配列番号３４～９９及び１６９～１７４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は該塩基配列の相補的配列からなるオリゴヌクレオチドとプローブとして同等の機能を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。なかでも、配列番号３４～９９及び１６９～１７４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。
下記表３に配列番号３４～９９及び１６９～１７４で示される塩基配列からなるプローブとそれらが検出するＳＮＰとの関係を示す。
下記表３に配列番号３４～９９及び１６９～１７４で示される塩基配列からなるプローブとそれらが検出するＳＮＰとの関係を示す。
【0066】
【表3】
【0067】
本発明において、プライマーは、配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを含む領域を増幅することができるプライマーであればよい。プライマーは、好ましくは、配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の上記プローブがハイブリダイズする塩基配列を含む領域の増幅反応において、該領域の上流又は下流に特異的にハイブリダイズし、フォワードプライマー又はリバースプライマーとして使用できるオリゴヌクレオチドであり、配列番号１～３３及び１６６～１６８で示される塩基配列に基づいて適宜設計され得る。プライマーの塩基長は、通常約１５～５０塩基であり、好ましくは約１５～４５塩基である。なお、あるＳＮＰを含む領域を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーをまとめて、プライマーセットと称する。プライマーセットにより増幅される領域の塩基長は、通常５０～３００ｂｐであり、好ましくは７０～１５０ｂｐである。ここで、「標的部位（配列）に対して特異的にハイブリダイズする」とは、プローブの場合と同様に、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。
【0068】
かかるプライマーの例としては、配列番号１００～１６５及び１７５～１８０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、該塩基配列の相補的配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号１００～１６５及び１７５～１８０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は該塩基配列の相補的配列からなるオリゴヌクレオチドにおいて１若しくは２個の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列からなり、配列番号１００～１６５及び１７５～１８０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は該塩基配列の相補的配列からなるオリゴヌクレオチドとプライマーとして同等の機能を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。なかでも、配列番号１００～１６５及び１７５～１８０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。
下記表４に配列番号１００～１６５及び１７５～１８０で示される塩基配列からなるプライマーとそれらが増幅する領域中のＳＮＰとの関係を示す。表４中、同列の２種のプライマーがプライマーセットを構成する。
下記表４に配列番号１００～１６５及び１７５～１８０で示される塩基配列からなるプライマーとそれらが増幅する領域中のＳＮＰとの関係を示す。表４中、同列の２種のプライマーがプライマーセットを構成する。
【0069】
【表4】
【0070】
プローブ及びプライマーは、それぞれ、通常のホスホルアミダイト法、リン酸トリエステル法などの化学合成法によって合成してもよいし、また市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置などを使用して合成してもよい。
【0071】
本発明のトラフグ属魚類の種又は雑種の判別方法は、キットを利用することによって、より簡便に実施することができる。該キットには、配列番号１～３３及び１６６～１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰからなる群より選択される少なくとも１つのＳＮＰを検出するためのプローブ及びプライマーセットを含む。プローブ及びプライマーセットを構成するプライマーの詳細は、上述したプローブ及びプライマーと同様である。
本発明のキットは、好ましくは、下記（１）～（３６）：
（１）配列番号３４及び３５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１００及び１０１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２）配列番号３６及び３７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１０２及び１０３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３）配列番号３８及び３９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１０４及び１０５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（４）配列番号４０及び４１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１０６及び１０７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（５）配列番号４２及び４３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１０８及び１０９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（６）配列番号４４及び４５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１１０及び１１１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（７）配列番号４６及び４７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１１２及び１１３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（８）配列番号４８及び４９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１１４及び１１５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（９）配列番号５０及び５１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１１６及び１１７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１０）配列番号５２及び５３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１１８及び１１９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１１）配列番号５４及び５５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１２０及び１２１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１２）配列番号５６及び５７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１２２及び１２３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１３）配列番号５８及び５９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１２４及び１２５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１４）配列番号６０及び６１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１２６及び１２７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１５）配列番号６２及び６３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１２８及び１２９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１６）配列番号６４及び６５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１３０及び１３１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１７）配列番号６６及び６７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１３２及び１３３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１８）配列番号６８及び６９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１３４及び１３５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１９）配列番号７０及び７１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１３６及び１３７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２０）配列番号７２及び７３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１３８及び１３９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２１）配列番号７４及び７５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１４０及び１４１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２２）配列番号７６及び７７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１４２及び１４３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２３）配列番号７８及び７９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１４４及び１４５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２４）配列番号８０及び８１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１４６及び１４７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２５）配列番号８２及び８３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１４８及び１４９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２６）配列番号８４及び８５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１５０及び１５１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２７）配列番号８６及び８７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１５２及び１５３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２８）配列番号８８及び８９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１５４及び１５５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２９）配列番号９０及び９１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１５６及び１５７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３０）配列番号９２及び９３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１５８及び１５９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３１）配列番号９４及び９５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１６０及び１６１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３２）配列番号９６及び９７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１６２及び１６３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３３）配列番号９８及び９９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１６４及び１６５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３４）配列番号１６９及び１７０で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１７５及び１７６で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３５）配列番号１７１及び１７２で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１７７及び１７８で示される塩基配列からなる２種のプライマー；並びに
（３６）配列番号１７３及び１７４で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１７９及び１８０で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
からなる群より選択される少なくとも１つを含み、より好ましくは、（１）～（３）からなる群より選択される少なくとも１つ、（４）～（６）からなる群より選択される少なくとも１つ、（７）～（９）からなる群より選択される少なくとも１つ、（１０）～（１２）からなる群より選択される少なくとも１つ、（１３）～（１５）及び（３４）からなる群より選択される少なくとも１つ、（１６）～（１８）及び（３５）からなる群より選択される少なくとも１つ、（１９）～（２１）からなる群より選択される少なくとも１つ、（２２）～（２４）からなる群より選択される少なくとも１つ、（２５）～（２７）及び（３６）からなる群より選択される少なくとも１つ、（２８）～（３０）からなる群より選択される少なくとも１つ、及び（３１）～（３３）からなる群より選択される少なくとも１つを含み、さらに好ましくは、（１）～（３６）の全てを含む。
本発明のキットは、好ましくは、下記（１）～（３６）：
（１）配列番号３４及び３５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１００及び１０１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２）配列番号３６及び３７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１０２及び１０３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３）配列番号３８及び３９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１０４及び１０５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（４）配列番号４０及び４１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１０６及び１０７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（５）配列番号４２及び４３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１０８及び１０９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（６）配列番号４４及び４５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１１０及び１１１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（７）配列番号４６及び４７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１１２及び１１３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（８）配列番号４８及び４９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１１４及び１１５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（９）配列番号５０及び５１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１１６及び１１７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１０）配列番号５２及び５３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１１８及び１１９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１１）配列番号５４及び５５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１２０及び１２１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１２）配列番号５６及び５７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１２２及び１２３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１３）配列番号５８及び５９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１２４及び１２５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１４）配列番号６０及び６１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１２６及び１２７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１５）配列番号６２及び６３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１２８及び１２９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１６）配列番号６４及び６５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１３０及び１３１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１７）配列番号６６及び６７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１３２及び１３３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１８）配列番号６８及び６９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１３４及び１３５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（１９）配列番号７０及び７１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１３６及び１３７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２０）配列番号７２及び７３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１３８及び１３９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２１）配列番号７４及び７５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１４０及び１４１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２２）配列番号７６及び７７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１４２及び１４３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２３）配列番号７８及び７９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１４４及び１４５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２４）配列番号８０及び８１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１４６及び１４７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２５）配列番号８２及び８３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１４８及び１４９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２６）配列番号８４及び８５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１５０及び１５１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２７）配列番号８６及び８７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１５２及び１５３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２８）配列番号８８及び８９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１５４及び１５５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（２９）配列番号９０及び９１で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１５６及び１５７で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３０）配列番号９２及び９３で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１５８及び１５９で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３１）配列番号９４及び９５で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１６０及び１６１で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３２）配列番号９６及び９７で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１６２及び１６３で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３３）配列番号９８及び９９で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１６４及び１６５で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３４）配列番号１６９及び１７０で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１７５及び１７６で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
（３５）配列番号１７１及び１７２で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１７７及び１７８で示される塩基配列からなる２種のプライマー；並びに
（３６）配列番号１７３及び１７４で示される塩基配列からなる２種のプローブ及び配列番号１７９及び１８０で示される塩基配列からなる２種のプライマー；
からなる群より選択される少なくとも１つを含み、より好ましくは、（１）～（３）からなる群より選択される少なくとも１つ、（４）～（６）からなる群より選択される少なくとも１つ、（７）～（９）からなる群より選択される少なくとも１つ、（１０）～（１２）からなる群より選択される少なくとも１つ、（１３）～（１５）及び（３４）からなる群より選択される少なくとも１つ、（１６）～（１８）及び（３５）からなる群より選択される少なくとも１つ、（１９）～（２１）からなる群より選択される少なくとも１つ、（２２）～（２４）からなる群より選択される少なくとも１つ、（２５）～（２７）及び（３６）からなる群より選択される少なくとも１つ、（２８）～（３０）からなる群より選択される少なくとも１つ、及び（３１）～（３３）からなる群より選択される少なくとも１つを含み、さらに好ましくは、（１）～（３６）の全てを含む。
【0072】
キットは、任意成分として、ＳＮＰ検出に用いる試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等）を含んでいてもよい。さらにキットには、実施の便益のために、適当な反応希釈液、緩衝液、検出された遺伝子型に基づいて種又は雑種を判別するための情報（例えば、遺伝子型と判別される種又は雑種の一覧表）等が含まれていてもよい。
【0073】
斯くして、本発明の方法によれば、トラフグ属魚類の種又は雑種を高い精度で、簡便、迅速に判別できる。
本発明の方法で利用される計３６個のＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種に特異的であり、種又は雑種の判別に有用である。特に、配列番号１～３のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、アカメフグの判別に有用であり、配列番号４～６のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、ゴマフグの判別に有用であり、配列番号７～９のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、ヒガンフグの判別に有用であり、配列番号１０～１２のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、コモンフグの判別に有用であり、配列番号１３～１５及び１６６のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、クサフグの判別に有用であり、配列番号１６～１８及び１６７のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、マフグの判別に有用であり、配列番号１９～２１のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、ムシフグの判別に有用であり、配列番号２２～２４のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、ナシフグの判別に有用であり、配列番号２５～２７及び１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、シマフグの判別に有用であり、配列番号２８～３０のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、ショウサイフグの判別に有用であり、配列番号３１～３３のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、トラフグ又はカラスの判別に有用である。
よって、配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを含む部分塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖は、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用マーカーとして用いることができる。ここで、該ＳＮＰの塩基は、該ＳＮＰの対立遺伝子１又は２の塩基である。すなわち、マーカーの塩基配列中、配列番号１で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号２で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＴであり、配列番号３で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号４で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号５で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号６で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＧであり、配列番号７で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＴであり、配列番号８で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号９で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号１０で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号１１で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＣであり、配列番号１２で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＣであり、配列番号１３で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＴであり、配列番号１４で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＴであり、配列番号１５で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号１６で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＣであり、配列番号１７で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号１８で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＡであり、配列番号１９で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号２０で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＧであり、配列番号２１で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号２２で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号２３で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＡであり、配列番号２４で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＣであり、配列番号２５で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号２６で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＴであり、配列番号２７で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＧであり、配列番号２８で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＧであり、配列番号２９で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＧであり、配列番号３０で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号３１で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＴであり、配列番号３２で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号３３で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＡであり、配列番号１６６で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＴであり、配列番号１６７で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＴであり、配列番号１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＴである。かかるポリヌクレオチド又はその相補鎖の塩基長は、各トラフグ属魚類の種のゲノム上で特異的に認識される長さであればよく、例えば、１５～１００塩基が好ましく、２０～５０塩基がより好ましい。
本発明の方法で利用される計３６個のＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種に特異的であり、種又は雑種の判別に有用である。特に、配列番号１～３のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、アカメフグの判別に有用であり、配列番号４～６のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、ゴマフグの判別に有用であり、配列番号７～９のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、ヒガンフグの判別に有用であり、配列番号１０～１２のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、コモンフグの判別に有用であり、配列番号１３～１５及び１６６のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、クサフグの判別に有用であり、配列番号１６～１８及び１６７のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、マフグの判別に有用であり、配列番号１９～２１のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、ムシフグの判別に有用であり、配列番号２２～２４のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、ナシフグの判別に有用であり、配列番号２５～２７及び１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、シマフグの判別に有用であり、配列番号２８～３０のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、ショウサイフグの判別に有用であり、配列番号３１～３３のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基におけるＳＮＰは、トラフグ又はカラスの判別に有用である。
よって、配列番号１～３３及び１６６～１６８のいずれかで示される塩基配列の１５１番目の塩基の位置におけるＳＮＰを含む部分塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補鎖は、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別用マーカーとして用いることができる。ここで、該ＳＮＰの塩基は、該ＳＮＰの対立遺伝子１又は２の塩基である。すなわち、マーカーの塩基配列中、配列番号１で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号２で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＴであり、配列番号３で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号４で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号５で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号６で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＧであり、配列番号７で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＴであり、配列番号８で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号９で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号１０で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号１１で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＣであり、配列番号１２で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＣであり、配列番号１３で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＴであり、配列番号１４で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＴであり、配列番号１５で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号１６で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＣであり、配列番号１７で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号１８で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＡであり、配列番号１９で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号２０で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＧであり、配列番号２１で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号２２で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号２３で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＡであり、配列番号２４で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＣであり、配列番号２５で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号２６で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＴであり、配列番号２７で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＧであり、配列番号２８で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＧであり、配列番号２９で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＧであり、配列番号３０で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＴ又はＣであり、配列番号３１で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＴであり、配列番号３２で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＧであり、配列番号３３で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＡであり、配列番号１６６で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＣ又はＴであり、配列番号１６７で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＧ又はＴであり、配列番号１６８で示される塩基配列の１５１番目の塩基はＡ又はＴである。かかるポリヌクレオチド又はその相補鎖の塩基長は、各トラフグ属魚類の種のゲノム上で特異的に認識される長さであればよく、例えば、１５～１００塩基が好ましく、２０～５０塩基がより好ましい。
【実施例0074】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【0075】
実施例１ トラフグ属魚類の種又は雑種判別用ＳＮＰの同定
日本産トラフグ属魚類１２種（アカメフグ、ゴマフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クサフグ、マフグ、ムシフグ、ナシフグ、シマフグ、ショウサイフグ、トラフグ、及びカラス）並びに海外産トラフグ属魚類３種（メフグ、メガネフグ、及びタキフグ）について、二重消化制限サイト周辺配列シーケンス（ｄｄＲＡＤ－ｓｅｑ）法によりゲノム全体からＳＮＰｓを検出した。具体的には、各種８個体～１６個体からＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、約１０ｎｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで消化し、アダプターをライゲーションした後、各個体に固有のバーコード配列を加えたプライマーで増幅しライブラリを作成した。ライブラリを次世代シーケンサー（ＨｉＳｅｑ ２０００あるいはＨｉＳｅｑ ２５００、イルミナ社）で、５０ｂｐシングルエンドでランした。得られたｄｄＲＡＤ－ｓｅｑリードから、アダプター配列と低クオリティのリードを除いた後、トラフグのゲノムシーケンス（ＦＵＧＵ５）に対してマップした。マップされたリードの中から、ＳＮＰを含む座位を抽出し、その中から種特異的なＳＮＰｓ（１２３２座位）を特定した。各種特異的ＳＮＰについて、上流１５０ｂｐ及び下流１５０ｂｐの配列をＦＵＧＵ５から取得した。ＦＵＧＵ５から得られた配列とリード配列とを比較し、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型を検出した。各ＳＮＰの近傍に非種特異的な多型が含まれず、かつ周辺配列に繰り返し配列や非種特異的な多型が多く含まれないＳＮＰタイピングに適した座位を、各種３座位以上候補として選択した。これらの候補についてＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙを設計し、Ａｓｓａｙが設計可能でかつＡＦＬＰ法で種又は雑種が判別された試料において偽陽性及び偽陰性が検出されなかった座位を各種３又は４座位に達するまで実証実験を行い、最終的に種又は雑種判別用ＳＮＰｓを決定した。各ＳＮＰと対応する種及び遺伝子型を表５に、用いたプローブ及びプライマーを表６に示す。
日本産トラフグ属魚類１２種（アカメフグ、ゴマフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クサフグ、マフグ、ムシフグ、ナシフグ、シマフグ、ショウサイフグ、トラフグ、及びカラス）並びに海外産トラフグ属魚類３種（メフグ、メガネフグ、及びタキフグ）について、二重消化制限サイト周辺配列シーケンス（ｄｄＲＡＤ－ｓｅｑ）法によりゲノム全体からＳＮＰｓを検出した。具体的には、各種８個体～１６個体からＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、約１０ｎｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで消化し、アダプターをライゲーションした後、各個体に固有のバーコード配列を加えたプライマーで増幅しライブラリを作成した。ライブラリを次世代シーケンサー（ＨｉＳｅｑ ２０００あるいはＨｉＳｅｑ ２５００、イルミナ社）で、５０ｂｐシングルエンドでランした。得られたｄｄＲＡＤ－ｓｅｑリードから、アダプター配列と低クオリティのリードを除いた後、トラフグのゲノムシーケンス（ＦＵＧＵ５）に対してマップした。マップされたリードの中から、ＳＮＰを含む座位を抽出し、その中から種特異的なＳＮＰｓ（１２３２座位）を特定した。各種特異的ＳＮＰについて、上流１５０ｂｐ及び下流１５０ｂｐの配列をＦＵＧＵ５から取得した。ＦＵＧＵ５から得られた配列とリード配列とを比較し、ＦＵＧＵ５に対してトラフグ又はトラフグ以外のトラフグ属魚類の種で種特異的ではない多型を検出した。各ＳＮＰの近傍に非種特異的な多型が含まれず、かつ周辺配列に繰り返し配列や非種特異的な多型が多く含まれないＳＮＰタイピングに適した座位を、各種３座位以上候補として選択した。これらの候補についてＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙを設計し、Ａｓｓａｙが設計可能でかつＡＦＬＰ法で種又は雑種が判別された試料において偽陽性及び偽陰性が検出されなかった座位を各種３又は４座位に達するまで実証実験を行い、最終的に種又は雑種判別用ＳＮＰｓを決定した。各ＳＮＰと対応する種及び遺伝子型を表５に、用いたプローブ及びプライマーを表６に示す。
【0076】
【表5】
【0077】
【表6】
【0078】
上記ＳＮＰ（１）の遺伝子型は、アカメフグでＴＴ、アカメフグ以外のトラフグ属魚類ではＣＣであり、ＳＮＰ（１）には種特異性が認められた。かかる結果より、アカメフグとアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種との雑種では、ＳＮＰ（１）の遺伝子型はＴＣであることが示唆された。上記ＳＮＰ（２）～（３６）についても上記表５に基づいて同様のことがいえる。よって、ＳＮＰ（１）～（３６）は、トラフグ属魚類の種又は雑種の判別に有用である。
【0079】
実施例２ トラフグ属魚類の種又は雑種の判別１
ＡＦＬＰ法によって予め種又は雑種が判別されたトラフグ属魚類のゴマフグ７個体、ショウサイフグ７個体、及びそれらの間の雑種５個体の鰭の一部から、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社）を用いて、キットのマニュアルに従ってゲノムＤＮＡを抽出し、核酸試料とした。得られた核酸試料をテンプレートとし、上記表６に記載のプローブ及びプライマー、並びにＴａｑＭａｎ（商標） ＧＴＸｐｒｅｓｓ（商標） Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を使用し、ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたリアルタイム定量ＰＣＲによって、上記表５のＳＮＰ（４）～（６）及び（２８）～（３０）の遺伝子型をタイピング法により決定した。なお、テンプレートなしをネガティブコントロールとした。ＰＣＲは、熱変性９５℃３秒とアニーリング及び伸長反応６０℃２０秒を１サイクルとしてこれを４０サイクル行った。
ＡＦＬＰ法によって予め種又は雑種が判別されたトラフグ属魚類のゴマフグ７個体、ショウサイフグ７個体、及びそれらの間の雑種５個体の鰭の一部から、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ社）を用いて、キットのマニュアルに従ってゲノムＤＮＡを抽出し、核酸試料とした。得られた核酸試料をテンプレートとし、上記表６に記載のプローブ及びプライマー、並びにＴａｑＭａｎ（商標） ＧＴＸｐｒｅｓｓ（商標） Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を使用し、ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたリアルタイム定量ＰＣＲによって、上記表５のＳＮＰ（４）～（６）及び（２８）～（３０）の遺伝子型をタイピング法により決定した。なお、テンプレートなしをネガティブコントロールとした。ＰＣＲは、熱変性９５℃３秒とアニーリング及び伸長反応６０℃２０秒を１サイクルとしてこれを４０サイクル行った。
【0080】
ＳＮＰ（４）～（６）のタイピング結果を、アレル識別プロットとして図１～３に示す。ＳＮＰ（４）の遺伝子型がＡＡの個体をゴマフグ、ＧＧの個体をショウサイフグ、ＡＧの個体をゴマフグとショウサイフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。また、ＳＮＰ（５）の遺伝子型がＴＴの個体をゴマフグ、ＣＣの個体をショウサイフグ、ＴＣの個体をゴマフグとショウサイフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。さらに、ＳＮＰ（６）の遺伝子型がＴＴの個体をゴマフグ、ＧＧの個体をショウサイフグ、ＴＧの個体をゴマフグとショウサイフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。
ＳＮＰ（２８）～（３０）のタイピング結果を、アレル識別プロットとして図４～６に示す。ＳＮＰ（２８）の遺伝子型がＴＴの個体をショウサイフグ、ＧＧの個体をゴマフグ、ＴＧの個体をショウサイフグとゴマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。また、ＳＮＰ（２９）の遺伝子型がＣＣの個体をショウサイフグ、ＧＧの個体をゴマフグ、ＣＧの個体をショウサイフグとゴマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。さらに、ＳＮＰ（３０）の遺伝子型がＴＴの個体をショウサイフグ、ＣＣの個体をゴマフグ、ＴＣの個体をショウサイフグとゴマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。
以上、６ＳＮＰのタイピング結果より、ゴマフグ、ショウサイフグ、及びそれらの間の雑種が正確に判別された。該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種を判別する指標として有用であることが示された。
ＳＮＰ（２８）～（３０）のタイピング結果を、アレル識別プロットとして図４～６に示す。ＳＮＰ（２８）の遺伝子型がＴＴの個体をショウサイフグ、ＧＧの個体をゴマフグ、ＴＧの個体をショウサイフグとゴマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。また、ＳＮＰ（２９）の遺伝子型がＣＣの個体をショウサイフグ、ＧＧの個体をゴマフグ、ＣＧの個体をショウサイフグとゴマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。さらに、ＳＮＰ（３０）の遺伝子型がＴＴの個体をショウサイフグ、ＣＣの個体をゴマフグ、ＴＣの個体をショウサイフグとゴマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。
以上、６ＳＮＰのタイピング結果より、ゴマフグ、ショウサイフグ、及びそれらの間の雑種が正確に判別された。該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種を判別する指標として有用であることが示された。
【0081】
実施例３ トラフグ属魚類の種又は雑種の判別２
マフグ７個体、トラフグ７個体、及びそれらの間の雑種５個体を用いた以外は実施例２と同様にして、上記表５のＳＮＰ（１６）～（１８）及び（３１）～（３３）の遺伝子型を決定した。
マフグ７個体、トラフグ７個体、及びそれらの間の雑種５個体を用いた以外は実施例２と同様にして、上記表５のＳＮＰ（１６）～（１８）及び（３１）～（３３）の遺伝子型を決定した。
【0082】
その結果、ＳＮＰ（１６）の遺伝子型がＧＧの個体をマフグ、ＣＣの個体をトラフグ、ＧＣの個体をマフグとトラフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。また、ＳＮＰ（１７）の遺伝子型がＴＴの個体をマフグ、ＣＣの個体をトラフグ、ＴＣの個体をマフグとトラフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。さらに、ＳＮＰ（１８）の遺伝子型がＧＧの個体をマフグ、ＡＡの個体をトラフグ、ＧＡの個体をマフグとトラフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。
また、ＳＮＰ（３１）の遺伝子型がＡＡの個体をトラフグ、ＴＴの個体をマフグ、ＡＴの個体をトラフグとマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。また、ＳＮＰ（３２）の遺伝子型がＡＡの個体をトラフグ、ＧＧの個体をマフグ、ＡＧの個体をトラフグとマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。さらに、ＳＮＰ（３３）の遺伝子型がＧＧの個体をトラフグ、ＡＡの個体をマフグ、ＧＡの個体をトラフグとマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。
以上、６ＳＮＰのタイピング結果より、マフグ、トラフグ、及びそれらの間の雑種が正確に判別された。該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種を判別する指標として有用であることが示された。
また、ＳＮＰ（３１）の遺伝子型がＡＡの個体をトラフグ、ＴＴの個体をマフグ、ＡＴの個体をトラフグとマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。また、ＳＮＰ（３２）の遺伝子型がＡＡの個体をトラフグ、ＧＧの個体をマフグ、ＡＧの個体をトラフグとマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。さらに、ＳＮＰ（３３）の遺伝子型がＧＧの個体をトラフグ、ＡＡの個体をマフグ、ＧＡの個体をトラフグとマフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。
以上、６ＳＮＰのタイピング結果より、マフグ、トラフグ、及びそれらの間の雑種が正確に判別された。該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種を判別する指標として有用であることが示された。
【0083】
実施例４ トラフグ属魚類の種又は雑種の判別３
コモンフグ７個体、ショウサイフグ７個体、及びそれらの間の雑種５個体を用いた以外は実施例２と同様にして、上記表５のＳＮＰ（１０）～（１２）及び（２８）～（３０）の遺伝子型を決定した。
コモンフグ７個体、ショウサイフグ７個体、及びそれらの間の雑種５個体を用いた以外は実施例２と同様にして、上記表５のＳＮＰ（１０）～（１２）及び（２８）～（３０）の遺伝子型を決定した。
【0084】
その結果、ＳＮＰ（１０）の遺伝子型がＡＡの個体をコモンフグ、ＧＧの個体をショウサイフグ、ＡＧの個体をコモンフグとショウサイフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。また、ＳＮＰ（１１）の遺伝子型がＧＧの個体をコモンフグ、ＣＣの個体をショウサイフグ、ＧＣの個体をコモンフグとショウサイフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。さらに、ＳＮＰ（１２）の遺伝子型がＡＡの個体をコモンフグ、ＣＣの個体をショウサイフグ、ＡＣの個体をコモンフグとショウサイフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。
また、ＳＮＰ（２８）の遺伝子型がＴＴの個体をショウサイフグ、ＧＧの個体をコモンフグ、ＴＧの個体をショウサイフグとコモンフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。また、ＳＮＰ（２９）の遺伝子型がＣＣの個体をショウサイフグ、ＧＧの個体をコモンフグ、ＣＧの個体をショウサイフグとコモンフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。さらに、ＳＮＰ（３０）の遺伝子型がＴＴの個体をショウサイフグ、ＣＣの個体をコモンフグ、ＴＣの個体をショウサイフグとコモンフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。
以上、６ＳＮＰのタイピング結果より、コモンフグ、ショウサイフグ、及びそれらの間の雑種が正確に判別された。該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種を判別する指標として有用であることが示された。
また、ＳＮＰ（２８）の遺伝子型がＴＴの個体をショウサイフグ、ＧＧの個体をコモンフグ、ＴＧの個体をショウサイフグとコモンフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。また、ＳＮＰ（２９）の遺伝子型がＣＣの個体をショウサイフグ、ＧＧの個体をコモンフグ、ＣＧの個体をショウサイフグとコモンフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。さらに、ＳＮＰ（３０）の遺伝子型がＴＴの個体をショウサイフグ、ＣＣの個体をコモンフグ、ＴＣの個体をショウサイフグとコモンフグとの雑種と判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。
以上、６ＳＮＰのタイピング結果より、コモンフグ、ショウサイフグ、及びそれらの間の雑種が正確に判別された。該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種を判別する指標として有用であることが示された。
【0085】
実施例５ トラフグ属魚類の種又は雑種の判別４
実施例２～４における種の組み合わせ間の雑種は自然下で比較的多く見られるため、雑種を含めた試料の入手及びＡＦＬＰ法による種又は雑種の判別が可能であった。一方、自然下で雑種がほとんど見られないか全く見られない種の組み合わせについては、トラフグ属魚類１１種類を用いて、上記表５のＳＮＰの遺伝子型を検出することによる種又は雑種判別の特異性を検証した。
アカメフグ、ゴマフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クサフグ、マフグ、ムシフグ、ナシフグ、シマフグ、ショウサイフグ、及びトラフグ各４個体、並びにヘテロ接合型のコントロールとしてアカメフグとトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物を用いた以外は実施例２と同様にして、上記表５のＳＮＰ（１）～（３）の遺伝子型を決定した。
実施例２～４における種の組み合わせ間の雑種は自然下で比較的多く見られるため、雑種を含めた試料の入手及びＡＦＬＰ法による種又は雑種の判別が可能であった。一方、自然下で雑種がほとんど見られないか全く見られない種の組み合わせについては、トラフグ属魚類１１種類を用いて、上記表５のＳＮＰの遺伝子型を検出することによる種又は雑種判別の特異性を検証した。
アカメフグ、ゴマフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クサフグ、マフグ、ムシフグ、ナシフグ、シマフグ、ショウサイフグ、及びトラフグ各４個体、並びにヘテロ接合型のコントロールとしてアカメフグとトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物を用いた以外は実施例２と同様にして、上記表５のＳＮＰ（１）～（３）の遺伝子型を決定した。
【0086】
ＳＮＰ（１）のタイピング結果を、アレル識別プロットとして図７に示す。ＳＮＰ（１）の遺伝子型がＴＴの個体をアカメフグ、ＣＣの個体をアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種、ＴＣのサンプルをアカメフグとトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物であるヘテロ接合型のコントロールと判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。また、ＳＮＰ（２）の遺伝子型がＣＣの個体をアカメフグ、ＴＴの個体をアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種、ＣＴのサンプルをアカメフグとトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物であるヘテロ接合型のコントロールと判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。さらに、ＳＮＰ（３）の遺伝子型がＡＡの個体をアカメフグ、ＧＧの個体をアカメフグ以外のトラフグ属魚類の種、ＡＧのサンプルをアカメフグとトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物であるヘテロ接合型のコントロールと判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。
以上、３ＳＮＰのタイピング結果より、アカメフグ、アカメフグ以外のトラフグ属魚類の種、及び想定されるそれらの間の雑種が正確に判別された。偽陰性及び偽陽性はみられず、該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種、特にアカメフグを判別する指標として有用であることが示された。
以上、３ＳＮＰのタイピング結果より、アカメフグ、アカメフグ以外のトラフグ属魚類の種、及び想定されるそれらの間の雑種が正確に判別された。偽陰性及び偽陽性はみられず、該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種、特にアカメフグを判別する指標として有用であることが示された。
【0087】
実施例６ トラフグ属魚類の種又は雑種の判別５
実施例５と同様にして、アカメフグ、ゴマフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クサフグ、マフグ、ムシフグ、ナシフグ、シマフグ、ショウサイフグ、及びトラフグ各４個体、並びにヘテロ接合型のコントロールとして各種とトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物を用いて、上記表５のＳＮＰ（４）～（３３）の遺伝子型を検出することによる種又は雑種判別の特異性を検証した。
実施例５と同様にして、アカメフグ、ゴマフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クサフグ、マフグ、ムシフグ、ナシフグ、シマフグ、ショウサイフグ、及びトラフグ各４個体、並びにヘテロ接合型のコントロールとして各種とトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物を用いて、上記表５のＳＮＰ（４）～（３３）の遺伝子型を検出することによる種又は雑種判別の特異性を検証した。
【0088】
ＳＮＰ（４）の遺伝子型がＡＡの個体をゴマフグ、ＧＧの個体をゴマフグ以外のトラフグ属魚類の種、ＡＧのサンプルをゴマフグとトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物であるヘテロ接合型のコントロールと判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。同様に、各個体若しくはサンプルの種又は雑種を、ＳＮＰ（５）～（３３）のそれぞれの遺伝子型に基づいて判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。
以上、３０ＳＮＰのタイピング結果より、トラフグ属魚類の種、及び想定されるそれらの間の雑種が正確に判別された。偽陰性及び偽陽性はみられず、該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種を判別する指標として有用であることが示された。
以上、３０ＳＮＰのタイピング結果より、トラフグ属魚類の種、及び想定されるそれらの間の雑種が正確に判別された。偽陰性及び偽陽性はみられず、該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種を判別する指標として有用であることが示された。
【0089】
実施例７ トラフグ属魚類の種又は雑種の判別６
実施例５と同様にして、アカメフグ、ゴマフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クサフグ、マフグ、ムシフグ、ナシフグ、シマフグ、ショウサイフグ、及びトラフグ各７個体、並びにヘテロ接合型のコントロールとして各種とトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物を用いて、上記表５のＳＮＰ（３４）～（３６）の遺伝子型を検出することによる種又は雑種判別の特異性を検証した。
実施例５と同様にして、アカメフグ、ゴマフグ、ヒガンフグ、コモンフグ、クサフグ、マフグ、ムシフグ、ナシフグ、シマフグ、ショウサイフグ、及びトラフグ各７個体、並びにヘテロ接合型のコントロールとして各種とトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物を用いて、上記表５のＳＮＰ（３４）～（３６）の遺伝子型を検出することによる種又は雑種判別の特異性を検証した。
【0090】
ＳＮＰ（３４）の遺伝子型がＣＣの個体をクサフグ、ＴＴの個体をクサフグ以外のトラフグ属魚類の種、ＣＴのサンプルをクサフグとトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物であるヘテロ接合型のコントロールと判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。該ＳＮＰのタイピング結果より、クサフグ、クサフグ以外のトラフグ属魚類の種、及び想定されるそれらの間の雑種が正確に判別された。偽陰性及び偽陽性はみられず、該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種、特にクサフグを判別する指標として有用であることが示された。
また、ＳＮＰ（３５）の遺伝子型がＧＧの個体をマフグ、ＴＴの個体をマフグ以外のトラフグ属魚類の種、ＧＴのサンプルをマフグとトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物であるヘテロ接合型のコントロールと判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。該ＳＮＰのタイピング結果より、マフグ、マフグ以外のトラフグ属魚類の種、及び想定されるそれらの間の雑種が正確に判別された。偽陰性及び偽陽性はみられず、該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種、特にマフグを判別する指標として有用であることが示された。
さらに、ＳＮＰ（３６）の遺伝子型がＡＡの個体をシマフグ、ＴＴの個体をシマフグ以外のトラフグ属魚類の種、ＡＴのサンプルをシマフグとトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物であるヘテロ接合型のコントロールと判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。該ＳＮＰのタイピング結果より、シマフグ、シマフグ以外のトラフグ属魚類の種、及び想定されるそれらの間の雑種が正確に判別された。偽陰性及び偽陽性はみられず、該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種、特にシマフグを判別する指標として有用であることが示された。
また、ＳＮＰ（３５）の遺伝子型がＧＧの個体をマフグ、ＴＴの個体をマフグ以外のトラフグ属魚類の種、ＧＴのサンプルをマフグとトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物であるヘテロ接合型のコントロールと判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。該ＳＮＰのタイピング結果より、マフグ、マフグ以外のトラフグ属魚類の種、及び想定されるそれらの間の雑種が正確に判別された。偽陰性及び偽陽性はみられず、該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種、特にマフグを判別する指標として有用であることが示された。
さらに、ＳＮＰ（３６）の遺伝子型がＡＡの個体をシマフグ、ＴＴの個体をシマフグ以外のトラフグ属魚類の種、ＡＴのサンプルをシマフグとトラフグのゲノムＤＮＡの等量混合物であるヘテロ接合型のコントロールと判別すると、ＡＦＬＰ法によって予め判別された種又は雑種と一致した。該ＳＮＰのタイピング結果より、シマフグ、シマフグ以外のトラフグ属魚類の種、及び想定されるそれらの間の雑種が正確に判別された。偽陰性及び偽陽性はみられず、該ＳＮＰは、トラフグ属魚類の種又は雑種、特にシマフグを判別する指標として有用であることが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】