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▶ ベイジン パーカンズ オンコロジー カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022078305
(43)【公開日】2022-05-24
(54)【発明の名称】腫瘍細胞懸濁培養及び関連方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/09 20100101AFI20220517BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220517BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220517BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20220517BHJP
【ＦＩ】
C12N5/09
C12Q1/02
G01N33/50 P
G01N33/68
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022040690
(22)【出願日】2022-03-15
(62)【分割の表示】P 2018538846の分割
【原出願日】2017-03-09
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2016/075947
(32)【優先日】2016-03-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518258685
【氏名又は名称】ベイジン パーカンズ オンコロジー カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】イヨウ チェン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン ジェン
(72)【発明者】
【氏名】イホン ジャン
(57)【要約】
【課題】患者からのヒト腫瘍細胞クラスターの適宜かつ効率的な増殖のための懸濁系細胞培養系及び培地、ならびに腫瘍細胞及び患者の１つ以上の治療薬に対する潜在的な応答性を評価する関連方法を提供する。
【解決手段】本開示の実施形態は、ヒト患者からのヒト腫瘍細胞クラスターの集団を含む培地懸濁液（または複数の培地懸濁液）に関し、この培地懸濁液は、約１４日以内に腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０％の増殖をもたらす。ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以にヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の増殖をもたらす。
【選択図】図４
【解決手段】本開示の実施形態は、ヒト患者からのヒト腫瘍細胞クラスターの集団を含む培地懸濁液（または複数の培地懸濁液）に関し、この培地懸濁液は、約１４日以内に腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０％の増殖をもたらす。ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以にヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の増殖をもたらす。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもと、参照によりその全体が組み込まれる、２０１６年３月９日出願のＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７５９４７に対する優先権を主張する。
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもと、参照によりその全体が組み込まれる、２０１６年３月９日出願のＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７５９４７に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【0002】
背景
本開示の実施形態は、患者からのヒト腫瘍細胞クラスターの適宜かつ効率的な増殖のための懸濁系細胞培養系及び培地、ならびに腫瘍細胞及び患者の１つ以上の治療薬に対する潜在的な応答性を評価する関連方法に関する。
本開示の実施形態は、患者からのヒト腫瘍細胞クラスターの適宜かつ効率的な増殖のための懸濁系細胞培養系及び培地、ならびに腫瘍細胞及び患者の１つ以上の治療薬に対する潜在的な応答性を評価する関連方法に関する。
【0003】
診断薬及び治療薬を改善する不断の努力にもかかわらず、癌は依然として世界的に主な死亡原因である。癌の多様性または不均一性は、新しい療法の開発の障害となり、可能性の高い応答体を特定することを困難にする。さらに、多くの癌療法は、さらなる点突然変異及び治療用試薬の標的をバイパスする代替的な経路を含む、初期及び獲得耐性の課題を抱えている。
【0004】
今後の療法の成功は、化学療法薬及び組み合わせの有効性を正確に評価するために容易に操作することができる関連モデルシステムの開発と共に、腫瘍進行及び転移プロセスの根底にある事象の総合的な分析に依存する可能性が高い。一例として、基質包埋３次元（３Ｄ）培養を使用する癌細胞の一次培養は、癌生物学を調査し、個々の患者の化学療法感受性を予測するためにますます使用されている。しかしながら、癌細胞のかかる基質包埋一次培養の条件は現在最適化されていない。さらに、かかる一次培養は、煩雑である場合があり、他の潜在的な問題の中でも、低い癌細胞生存の可能性、宿主細胞による汚染、及び再現することが困難である結果を含む。
【0005】
よって、一次癌細胞が細胞株と同様に実行可能かつ効率的に、及び適宜様式で３Ｄにおいて培養され得る方法及び組成物を開発することが必要である。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】腫瘍細胞クラスターが患者から外科的に除去される結腸／直腸腫瘍からの分離が成功し、合成成長培地中の懸濁液中で培養されたことを示す。
【図2】Ｅｄｕ組み込みにより測定されるとき、腫瘍細胞が短期懸濁培養期間中に増殖されたことを示す（試料１は図１Ａからのものであり、試料２は図１Ｂからのものであり、試料３は図１Ｃからのものであり、試料４は図１Ｄのものからである）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示の実施形態は、ヒト患者からのヒト腫瘍細胞クラスターの集団を含む培地懸濁液（または複数の培地懸濁液）に関し、この培地懸濁液は、約１４日以内に腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０％の増殖をもたらす。
【0008】
ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以にヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の増殖をもたらす。いくつかの実施形態では、培地懸濁液は、約７日以内にヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約２０～３０％の増殖をもたらす。ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、約７日以内にヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約６０％の増殖をもたらす。
【0009】
ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、合成培地を含む。いくつかの実施形態では、培地懸濁液は、無血清または実質的に無血清である。
【0010】
ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｗｎｔ３Ａ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノールから選択される１つ以上の構成成分を含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、培地懸濁液は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノールから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、６、７、８、または９つを含む。特定の実施形態では、培地懸濁液は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノールを含む。
【0011】
ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃから選択される１つ以上の構成成分を含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、培地懸濁液は、ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ１０、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、または６つを含む。特定の実施形態では、培地懸濁液は、ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ１０、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃを含む。
【0012】
ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ－２）、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインから選択される１つ以上の構成成分を含むか、またはさらに含む。ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、６、７、８、または９つを含む。特定の実施形態では、培地懸濁液は、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインを含む。
【0013】
ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ＦＧＦ１０、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃを含むか、またはさらに含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、培地懸濁液は、細胞外基質構成成分、例えば、マトリゲル、コラーゲン、ラミニン、またはフィブロネクチンを含まない。
【0015】
ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、ヒト腫瘍細胞クラスターが、ヒト患者からの肺癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、または乳癌細胞であるを含む。いくつかの実施形態では、培地懸濁液は、ヒト腫瘍細胞クラスターが、ヒト腫瘍細胞及び／またはヒト患者からの組織で異種移植された免疫不全動物から単離されるを含む。ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、ヒト腫瘍細胞クラスターが、ヒト患者から除去された腫瘍試料から直接単離され、任意選択で、外科試料、生検、胸水、及び腹水から選択されるを含む。
【0016】
また、試料からヒト腫瘍細胞の集団を得ることと、本明細書に記載される培地懸濁液中でヒト腫瘍細胞クラスターの集団を培養することとを含む、ヒト腫瘍細胞の増殖方法も含まれる。いくつかの方法は、約１４日以内の間、培地懸濁液中でヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む。いくつかの方法は、約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内の間、培地懸濁液中でヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む。特定の方法は、約７日以内の間、培地懸濁液中でヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む。
【0017】
ヒト患者の治療剤薬に対する応答性の試験方法であって、
ヒト患者から腫瘍細胞クラスターの集団を得るまたは受け取ることと、
先行請求項のいずれか１項に記載の培地懸濁液中で腫瘍細胞クラスターの集団を培養することと、
治療薬を培地懸濁液に与薬することと、
腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することと、を含み、
腫瘍細胞増殖の減少及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導が、ヒト患者の治療薬に対する応答性を示し、腫瘍細胞増殖の減少の欠如及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導の欠如が、ヒト患者の治療薬に対する耐性を示す方法も含まれる。
ヒト患者から腫瘍細胞クラスターの集団を得るまたは受け取ることと、
先行請求項のいずれか１項に記載の培地懸濁液中で腫瘍細胞クラスターの集団を培養することと、
治療薬を培地懸濁液に与薬することと、
腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することと、を含み、
腫瘍細胞増殖の減少及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導が、ヒト患者の治療薬に対する応答性を示し、腫瘍細胞増殖の減少の欠如及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導の欠如が、ヒト患者の治療薬に対する耐性を示す方法も含まれる。
【0018】
いくつかの方法は、治療薬を、培地懸濁液中で腫瘍細胞クラスターの集団を培養した日と同日に与薬することを含む。
【0019】
ある特定の方法は、治療薬を、培地懸濁液中で腫瘍細胞クラスターの集団を培養した少なくとも１日後に与薬することを含む。特定の方法は、治療薬を、培地懸濁液中で腫瘍細胞クラスターの集団を培養した約１、２、３、４、５、６、または７日後、またはそれ以内に与薬することを含む。
【0020】
いくつかの方法は、治療薬の与薬約１４日以内に、腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む。いくつかの方法は、治療薬の与薬約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に、腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む。特定の方法は、治療薬の与薬約７、６、または５日以内に、腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖の測定ステップは、細胞増殖マーカーを測定することを含む。いくつかの実施形態では、細胞増殖マーカーは、３Ｈ－チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５－エチニル－２’－デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ －６７、及び増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のうちの１つ以上から選択される。
【0022】
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞アポトーシスの測定ステップは、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む。いくつかの実施形態では、細胞アポトーシスマーカーは、カスパーゼの蛍光色素標識阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰ ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのうちの１つ以上から選択される。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本開示の実施形態は、患者に直接由来するか、または患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）に由来するかにかかわらず、一次ヒト腫瘍細胞クラスターの信頼できかつ適宜増殖を達成する合成培地及び関連懸濁細胞培養の発見に関する。懸濁液細胞培養は、とりわけ、患者腫瘍の、１つ以上の治療薬に対する潜在的応答性を評価するために、及び比較的短時間、例えば、培養時から１または２週間以内に患者に最適な治療選択肢を特定する利点を提供するために使用され得る。
【0024】
定義
別様に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、ある特定の好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。本明細書に引用される特許及び特許出願を含むが、これらに限定されない全ての刊行物及び参考文献は、各個別の刊行物または参考文献が具体的かつ個別に参照により組み込まれることを示すかのように、それらの全体が参照により組み込まれる。本発明の目的に関して、次の用語が以下に定義される。
別様に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、ある特定の好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。本明細書に引用される特許及び特許出願を含むが、これらに限定されない全ての刊行物及び参考文献は、各個別の刊行物または参考文献が具体的かつ個別に参照により組み込まれることを示すかのように、それらの全体が参照により組み込まれる。本発明の目的に関して、次の用語が以下に定義される。
【0025】
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、本明細書において、冠詞の文法上の目的語の１つ、または２つ以上（即ち、少なくとも１つ）を指すために使用される。一例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【0026】
「約」とは、参照分量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％ほど変動する分量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。
【0027】
本明細書全体を通して、文脈上他を意味しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記載されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を暗示するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を除外しないことを理解する。「からなる」とは、「からなる」という語句に続くもの全てを含み、それに限定されることを意味する。よって、「からなる」という語句は、列記される要素が必要であるか、または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、語句の後に列記される任意の要素を含み、列記される要素の開示において指定された活性または作用に干渉しない、または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。よって、「本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要であるか、または必須であることを示すが、他の要素は、任意選択であり、それらが列記された要素の活性または作用に実質的に影響を与えるかどうかに応じて、存在しても、しなくてもよいことを示す。
【0028】
「単離された」とは、その本来の状態においてそれに通常付随する構成成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。
【0029】
「調節」という用語は、典型的には、対照と比較したとき、統計学的に有意な、または生理学的に有意な量における「増加」または「増強」、ならびに「減少」または「低減」を含む。「増加」または「増強」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、組成物もしくは対照組成物、試料、または試験対象なしで生成された量の約もしくは少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００倍、または約もしくは少なくとも約５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％（全ての整数及びその間の範囲を含む）である増加を含み得る。「減少」または「低減」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、組成物もしくは対照組成物、試料、または試験対象なしで生成された量の約もしくは少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００倍、または約もしくは少なくとも約５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％（全ての整数及びその間の範囲を含む）である減少を含み得る。
【0030】
ある特定の実施形態では、培地または懸濁培養中の腫瘍細胞クラスターの「純度」が、具体的に定義され得る。例えば、ある特定の培地または懸濁培養は、他の細胞型、例えば、非癌性宿主細胞または動物細胞（例えば、異種移植片由来の腫瘍細胞クラスターに関して）に対して、約または少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％純粋（全ての整数及びその間の範囲を含む）である腫瘍細胞クラスターを含み得る。
【0031】
「統計学的に有意な」とは、その結果が偶然に起こった可能性が低いことを意味する。統計的有意性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって決定され得る。一般に使用された有意性の尺度としては、帰無仮説が真である場合に観察された事象が生じるであろう頻度または確率であるｐ値が挙げられる。得られたｐ値が有意性レベルよりも小さい場合、帰無仮説は否定される。単純な場合では、有意性レベルは、０．０５以下のｐ値で定義される。
【0032】
「実質的に」または「本質的に」は、ほぼ完全に、または完全に、例えば、９５％以上のある所与の分量を意味する。
【0033】
上述のように、ある特定の実施形態は、ヒト患者からの腫瘍細胞クラスターの集団を含む培地懸濁液に関し、この培地懸濁液は、約１４日以内に腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０％の増殖をもたらす。よって、これら及び関連実施形態では、腫瘍細胞クラスターは、懸濁培養において、例えば、接着培養ではなく、懸濁液中の凝集塊として成長する。
【0034】
いくつかの実施形態では、培地懸濁液は、約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％（全ての組み合わせ、整数、及びその間の範囲を含む）の増殖をもたらす。
【0035】
例えば、特定の培地懸濁液は、任意選択で、約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、もしくは５日以内に、または約５～１４、６～１４、７～１４、８～１４、９～１４、１０～１４、１１～１４、１２～１４、もしくは１３～１４日以内に、または約５～１３、６～１３、７～１３、８～１３、９～１３、１０～１３、１１～１３、もしくは１２～１３日以内に、または約５～１２、６～１２、７～１２、８～１２、９～１２、１０～１２、もしくは１１～１２日以内に、または約５～１１、６～１１、７～１１、８～１１、９～１１、もしくは１０～１１日以内に、または約５～１０、６～１０、７～１０、８～１０、もしくは９～１０日以内に、または約５～９、６～９、７～９、もしくは８～９日以内に、または約５～８、６～８、もしくは７～８日以内に、または約５～７もしくは６～７日以内に、または約５～６日以内に、腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１０～３５、１０～４０、１０～４５、１０～５０、１０～５５、１０～６０、１０～６５、１０～７０、１０～７５、１０～８０、１０～８５、１０～９０、１０～９５、または１０～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約１５～２０、１５～２５、１５～３０、１５～３５、１５～４０、１５～４５、１５～５０、１５～５５、１５～６０、１５～６５、１５～７０、１５～７５、１５～８０、１５～８５、１５～９０、１５～９５、または１５～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約２０～２５、２０～３０、２０～３５、２０～４０、２０～４５、２０～５０、２０～５５、２０～６０、２０～６５、２０～７０、２０～７５、２０～８０、２０～８５、２０～９０、２０～９５、または２０～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約２５～３０、２５～３５、２５～４０、２５～４５、２５～５０、２５～５５、２５～６０、２５～６５、２５～７０、２５～７５、２５～８０、２５～８５、２５～９０、２５～９５、または２５～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約３０～３５、３０～４０、３０～４５、３０～５０、３０～５５、３０～６０、３０～６５、３０～７０、３０～７５、３０～８０、３０～８５、３０～９０、３０～９５、または３０～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約３５～４０、３５～４５、３５～５０、３５～５５、３５～６０、３５～６５、３５～７０、３５～７５、３５～８０、３５～８５、３５～９０、３５～９５、または３５～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約４０～４５、４０～５０、４０～５５、４０～６０、４０～６５、４０～７０、４０～７５、４０～８０、４０～８５、４０～９０、４０～９５、または４０～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約４５～５０、４５～５５、４５～６０、４５～６５、４５～７０、４５～７５、４５～８０、４５～８５、４５～９０、４５～９５、または４５～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約５０～５５、５０～６０、５０～６５、５０～７０、５０～７５、５０～８０、５０～８５、５０～９０、５０～９５、または５０～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約５５～６０、５５～６５、５５～７０、５５～７５、５５～８０、５５～８５、５５～９０、５５～９５、または５５～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約６０～６５、６０～７０、６０～７５、６０～８０、６０～８５、６０～９０、６０～９５、または６０～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約６５～７０、６５～７５、６５～８０、６５～８５、６５～９０、６５～９５、または６５～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約７０～８０、７０～８５、７０～９０、７０～９５、または７０～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約７５～８０、７５～８５、７５～９０、７５～９５、または７５～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約８０～８５、８０～９０、８０～９５、または８０～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約８５～９０、８５～９５、または８５～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約９０～９５または９０～１００％の増殖、あるいは腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約９５～１００％の増殖（これらの全ての組み合わせを含む）をもたらす。特定の実施形態は、約７日以内に、腫瘍細胞クラスターの少なくとも約２０～３０％の増殖、または約７日以内に、腫瘍細胞クラスターの少なくとも約６０％の増殖をもたらす。
【0036】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞クラスターの培地懸濁液は「合成培地」を含む。ある特定の実施形態では、「合成培地」は、化学構成成分の全てが既知である、ヒトもしくは動物細胞のインビトロまたはエクスビボ細胞培養に好適な成長培地である。いくつかの実施形態では、合成培地は、「無血清」または「実質的に無血清」である、つまり、培地は、血清、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）の添加を欠くか、または実質的に欠くものである。
【0037】
いくつかの実施形態では、合成培地は、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、またはそれらの組み合わせ、例えば、追加の構成成分、例えば、成長因子、抗酸化剤、及び／またはエネルギー源で補充されるＤＭＥＭ／Ｆ１２などの基礎培地を含む。よって、特定の実施形態では、合成培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムの栄養混合物（Ｆ１２）、ＲＰＭＩ１６４０、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、例えば、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１。３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０の割合でＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む。
【0038】
ある特定の実施形態では、合成培地は、Ｗｎｔ３Ａ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノール（前述の全ての組み合わせを含む）から選択される１つ以上の構成成分、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８つの構成成分を含む。特定の実施形態は、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノールから選択される１つ以上の構成成分、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８つの構成成分と組み合わせてＤＭＥＭ／Ｆ－１２を含む。具体的な実施形態は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノールを含む。
【0039】
ある特定の実施形態では、Ｗｎｔ３Ａの濃度は、約０．１～１０，０００もしくは１～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、１～１０００、１０～１０００、２０～１０００、３０～１０００、４０～１０００、５０～１０００、６０～１０００、７０～１０００、８０～１０００、９０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、８００～１０００、９００～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、１～５００、１０～５００、２０～５００、３０～５００、４０～５００、５０～５００、６０～５００、７０～５００、８０～５００、９０～５００、１００～５００、２００～５００、３００～５００、４００～５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～４００、１～４００、１０～４００、２０～４００、３０～４００、５０～４００、４０～４００、６０～４００、７０～４００、８０～４００、９０～４００、１００～４００、２００～４００、３００～４００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～３００、１～３００、１０～３００、２０～３００、３０～３００、４０～３００、５０～３００、６０～３００、７０～３００、８０～３００、９０～３００、１００～３００、２００～３００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～２００、１～２００、１０～２００、２０～２００、３０～２００、４０～２００、５０～２００、６０～２００、７０～２００、８０～２００、９０～２００、１００～２００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１５０、１～１５０、１０～１５０、２０～１５０、３０～１５０、４０～１５０、５０～１５０、６０～１５０、７０～１５０、８０～１５０、９０～１５０、１００～１５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１２０、１～１２０、１０～１２０、２０～１２０、３０～１２０、４０～１２０、５０～１２０、６０～１２０、７０～１２０、８０～１２０、９０～１２０、１００～１２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１００、１～１００、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、Ｗｎｔ３Ａは、ヒトまたはマウスＷｎｔ３Ａタンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスＷｎｔ３Ａタンパク質である。
【0040】
ある特定の実施形態では、ｂＦＧＦの濃度は、約０．１～１００もしくは１～１０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１００、０．２～１００、０．３～１００、０．４～１００、０．５～１００、０．６～１００、０．７～１００、０．８～１００、０．９～１００、１～１００、２～１００、３～１００、４～１００、５～１００、１０～１００、５０～１００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５０、０．２～５０、０．３～５０、０．４～５０、０．５～５０、０．６～５０、０．７～５０、０．８～５０、０．９～５０、１～５０、２～５０、３～５０、４～５０、５～５０、１０～５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０、０．２～１０、０．３～１０、０．４～１０、０．５～１０、０．６～１０、０．７～１０、０．８～１０、０．９～１０、１～１０、２～１０、３～１０、４～１０、５～１０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５、０．２～５、０．３～５、０．４～５、０．５～５、０．６～５、０．７～５、０．８～５、０．９～５、１～５、２～５、３～５、４～５ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、ｂＦＧＦは、ヒトまたはマウスｂＦＧＦタンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスｂＦＧＦタンパク質である。
【0041】
ある特定の実施形態では、インスリンの濃度は、約０．１～１０，０００もしくは１～１０００、もしくは１００～５００μｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、１～１０００、１０～１０００、２０～１０００、３０～１０００、４０～１０００、５０～１０００、６０～１０００、７０～１０００、８０～１０００、９０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、８００～１０００、９００～１０００μｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、１～５００、１０～５００、２０～５００、３０～５００、４０～５００、５０～５００、６０～５００、７０～５００、８０～５００、９０～５００、１００～５００、２００～５００、３００～５００、４００～５００μｇ／ｍｌ、または約０．１～４００、１～４００、１０～４００、２０～４００、３０～４００、５０～４００、４０～４００、６０～４００、７０～４００、８０～４００、９０～４００、１００～４００、２００～４００、３００～４００μｇ／ｍｌ、または約０．１～３００、１～３００、１０～３００、２０～３００、３０～３００、４０～３００、５０～３００、６０～３００、７０～３００、８０～３００、９０～３００、１００～３００、２００～３００μｇ／ｍｌ、または約０．１～２００、１～２００、１０～２００、２０～２００、３０～２００、４０～２００、５０～２００、６０～２００、７０～２００、８０～２００、９０～２００、１００～２００μｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、インスリンは、ヒトまたはマウスインスリンタンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスインスリンタンパク質である。いくつかの実施形態では、インスリンは、膵臓抽出物からの溶液または粉末、例えば、ウシ膵臓由来粉末または溶液である。
【0042】
ある特定の実施形態では、トランスフェリンの濃度は、約０．１～１０，０００もしくは１～１０００、もしくは１～１００μｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、１～１０００、１０～１０００、２０～１０００、３０～１０００、４０～１０００、５０～１０００、６０～１０００、７０～１０００、８０～１０００、９０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、８００～１０００、９００～１０００μｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、１～５００、１０～５００、２０～５００、３０～５００、４０～５００、５０～５００、６０～５００、７０～５００、８０～５００、９０～５００、１００～５００、２００～５００、３００～５００、４００～５００μｇ／ｍｌ、または約０．１～４００、１～４００、１０～４００、２０～４００、３０～４００、５０～４００、４０～４００、６０～４００、７０～４００、８０～４００、９０～４００、１００～４００、２００～４００、３００～４００μｇ／ｍｌ、または約０．１～３００、１～３００、１０～３００、２０～３００、３０～３００、４０～３００、５０～３００、６０～３００、７０～３００、８０～３００、９０～３００、１００～３００、２００～３００μｇ／ｍｌ、または約０．１～２００、１～２００、１０～２００、２０～２００、３０～２００、４０～２００、５０～２００、６０～２００、７０～２００、８０～２００、９０～２００、１００～２００μｇ／ｍｌ、または約０．１～１５０、１～１５０、１０～１５０、２０～１５０、３０～１５０、４０～１５０、５０～１５０、６０～１５０、７０～１５０、８０～１５０、９０～１５０、１００～１５０μｇ／ｍｌ、または約０．１～１２０、１～１２０、１０～１２０、２０～１２０、３０～１２０、４０～１２０、５０～１２０、６０～１２０、７０～１２０、８０～１２０、９０～１２０、１００～１２０μｇ／ｍｌ、または約０．１～１００、１～１００、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００μｇ／ｍｌの範囲である。
【0043】
ある特定の実施形態では、ＢＳＡの濃度は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％であるか、または約１～５０％、または約５～５０、１０～５０、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０％、または約５～４５、１０～４５、１５～４５、２０～４５、２５～４５、３０～４５、３５～４５、４０～４５％、または約５～４０、１０～４０、１５～４０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、３５～４０％、または約５～３５、１０～３５、１５～３５、２０～３５、２５～３５、３０～３５％、または約５～３０、１０～３０、１５～３０、２０～３０、２５～３０％、または約５～２５、１０～２５、１５～２５、２０～２５％、または約５～２０、１０～２０、１５～２０％、または約５～１５、１０～１５％、または約５～１０％の範囲である。
【0044】
ある特定の実施形態では、コレステロールの濃度は、任意選択で、５０倍、または１００倍、または２５０倍のストックに対して、約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０倍であるか、もしくは約約その範囲であるか、または０１～１０倍もしくは０．１～１０倍、または約０．１～１０、０．２～１０、０．３～１０、０．４～１０、０．５～１０、０．６～１０、０．７～１０、０．８～１０、０．９～１０、１～１０、２～１０、５～１０倍、または約０．１～５、０．２～５、０．３～５、０．４～５、０．５～５、０．６～５、０．７～５、０．８～５、０．９～５、１～５、２～５倍、または約０．１～４、０．２～４、０．３～４、０．４～４、０．５～４、０．６～４、０．７～４、０．８～４、０．９～４、１～４、２～４倍、または約０．１～３、０．２～３、０．３～３、０．４～３、０．５～３、０．６～３、０．７～３、０．８～３、０．９～３、１～３、２～３倍、または約０．１～２、０．２～２、０．３～２、０．４～２、０．５～２、０．６～２、０．７～２、０．８～２、０．９～２、１～２倍の範囲である。コレステロール（２５０Ｘ）は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。
【0045】
ある特定の実施形態では、ＢＡＦＦの濃度は、約０．１～１０，０００もしくは１～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、１～１０００、１０～１０００、２０～１０００、３０～１０００、４０～１０００、５０～１０００、６０～１０００、７０～１０００、８０～１０００、９０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、８００～１０００、９００～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、１～５００、１０～５００、２０～５００、３０～５００、４０～５００、５０～５００、６０～５００、７０～５００、８０～５００、９０～５００、１００～５００、２００～５００、３００～５００、４００～５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～４００、１～４００、１０～４００、２０～４００、３０～４００、５０～４００、４０～４００、６０～４００、７０～４００、８０～４００、９０～４００、１００～４００、２００～４００、３００～４００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～３００、１～３００、１０～３００、２０～３００、３０～３００、４０～３００、５０～３００、６０～３００、７０～３００、８０～３００、９０～３００、１００～３００、２００～３００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～２００、１～２００、１０～２００、２０～２００、３０～２００、４０～２００、５０～２００、６０～２００、７０～２００、８０～２００、９０～２００、１００～２００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１５０、１～１５０、１０～１５０、２０～１５０、３０～１５０、４０～１５０、５０～１５０、６０～１５０、７０～１５０、８０～１５０、９０～１５０、１００～１５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１２０、１～１２０、１０～１２０、２０～１２０、３０～１２０、４０～１２０、５０～１２０、６０～１２０、７０～１２０、８０～１２０、９０～１２０、１００～１２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１００、１～１００、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、ＢＡＦＦは、ヒトまたはマウスＢＡＦＦタンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスＢＡＦＦタンパク質である。
【0046】
ある特定の実施形態では、２－メルカプトエタノールの濃度は、約０．０１～１００もしくは０．１～１ｍＭ、または０．０１～１０、０．０２～１０、０．０３～１０、０．０４～１０、０．０５～１０、０．０６～１０、０．０７～１０、０．０８～１０、０．０９～１０、０．１～１０、０．５～１０、１～１０、もしくは５～１０ｍＭ、または約０．０１～５、０．０２～５、０．０３～５、０．０４～５、０．０５～５、０．０６～５、０．０７～５、０．０８～５、０．０９～５、０．１～５、０．５～５、１～５ｍＭ、または約０．０１～２、０．０２～２、０．０３～２、０．０４～２、０．０５～２、０．０６～２、０．０７～２、０．０８～２、０．０９～２、０．１～２、０．５～２、１～２ｍＭ、または約０．０１～１、０．０２～１、０．０３～１、０．０４～１、０．０５～１、０．０６～１、０．０７～１、０．０８～１、０．０９～１、０．１～１、０．５～１ｍＭ、または約０．０１～０．５、０．０２～０．５、０．０３～０．５、０．０４～０．５、０．０５～０．５、０．０６～０．５、０．０７～０．５、０．０８～０．５、０．０９～０．５、もしくは０．１～０．５ｍＭ、または約０．０１～０．４、０．０２～０．４、０．０３～０．４、０．０４～０．４、０．０５～０．４、０．０６～０．４、０．０７～０．４、０．０８～０．４、０．０９～０．４、もしくは０．１～０．４ｍＭ、または約０．０１～０．３、０．０２～０．３、０．０３～０．３、０．０４～０．３、０．０５～０．３、０．０６～０．３、０．０７～０．３、０．０８～０．３、０．０９～０．３、もしくは０．１～０．３ｍＭ、または約０．０１～０．２、０．０２～０．２、０．０３～０．２、０．０４～０．２、０．０５～０．２、０．０６～０．２、０．０７～０．２、０．０８～０．２、０．０９～０．２、もしくは０．１～０．２ｍＭの範囲である。
【0047】
ある特定の実施形態では、及び上記の構成成分に加えて、懸濁培地は、ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃ（前述の全ての組み合わせを含む）から選択される１つ以上の構成成分、例えば、１、２、３、４、５、または６つの構成成分を含む。いくつかの実施形態では、懸濁培地は、ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ１０、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃを含む。
【0048】
ある特定の実施形態では、ニコチンアミドの濃度は、約０．１～１０００、０．５～１０００、１～１０００、５～１０００、１０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、５００～１０００ｍＭ、または約０．１～５００、０．５～５００、１～５００、５～５００、１０～５００、５０～５００、１００～５００ｍＭ、または約０．１～１００、０．５～１００、１～１００、５～１００、１０～１００、５０～１００ｍＭ、または約０．１～５０、０．５～５０、１～５０、５～５０、１０～５０ｍＭ、または約０．１～４０、０．５～４０、１～４０、５～４０、１０～４０ｍＭ、または約０．１～３０、０．５～３０、１～３０、５～３０、１０～３０ｍＭ、または約０．１～２０、０．５～２０、１～２０、５～２０、１０～２０ｍＭ、または約０．１～１０、０．５～１０、１～１０、５～１０ｍＭ、または約０．１～５、０．５～５、１～５ｍＭ、または約０．１～１もしくは０．５～１ｍＭの範囲である。
【0049】
ある特定の実施形態では、ノギンの濃度は、約０．１～１０，０００もしくは１～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、１～１０００、１０～１０００、２０～１０００、３０～１０００、４０～１０００、５０～１０００、６０～１０００、７０～１０００、８０～１０００、９０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、８００～１０００、９００～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、１～５００、１０～５００、２０～５００、３０～５００、４０～５００、５０～５００、６０～５００、７０～５００、８０～５００、９０～５００、１００～５００、２００～５００、３００～５００、４００～５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～４００、１～４００、１０～４００、２０～４００、３０～４００、５０～４００、４０～４００、６０～４００、７０～４００、８０～４００、９０～４００、１００～４００、２００～４００、３００～４００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～３００、１～３００、１０～３００、２０～３００、３０～３００、４０～３００、５０～３００、６０～３００、７０～３００、８０～３００、９０～３００、１００～３００、２００～３００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～２００、１～２００、１０～２００、２０～２００、３０～２００、４０～２００、５０～２００、６０～２００、７０～２００、８０～２００、９０～２００、１００～２００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１５０、１～１５０、１０～１５０、２０～１５０、３０～１５０、４０～１５０、５０～１５０、６０～１５０、７０～１５０、８０～１５０、９０～１５０、１００～１５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１２０、１～１２０、１０～１２０、２０～１２０、３０～１２０、４０～１２０、５０～１２０、６０～１２０、７０～１２０、８０～１２０、９０～１２０、１００～１２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１００、１～１００、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、ノギンは、ヒトまたはマウスノギンタンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスノギンタンパク質である。
【0050】
ある特定の実施形態では、Ｒ－スポンジン－１の濃度は、約０．１～１０，０００もしくは１～１０００、もしくは１００～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０，０００、１～１０，０００、１０～１０，０００、２０～１０，０００、３０～１０，０００、４０～１０，０００、５０～１０，０００、６０～１０，０００、７０～１０，０００、８０～１０，０００、９０～１０，０００、１００～１０，０００、２００～１０，０００、３００～１０，０００、４００～１０，０００、５００～１０，０００、１０００～１０，０００、５０００～１０，０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５０００、１～５０００、１０～５０００、２０～５０００、３０～１０，０００、４０～５０００、５０～５０００、６０～５０００、７０～５０００、８０～５０００、９０～５０００、１００～５０００、２００～５０００、３００～５０００、４００～５０００、５００～５０００、１０００～５０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、１～１０００、１０～１０００、２０～１０００、３０～１０００、４０～１０００、５０～１０００、６０～１０００、７０～１０００、８０～１０００、９０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、８００～１０００、９００～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～８００、１～８００、１０～８００、２０～８００、３０～８００、４０～８００、５０～８００、６０～８００、７０～８００、８０～８００、９０～８００、１００～８００、２００～８００、３００～８００、４００～８００、５００～８００、６００～８００、７００～８００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～７００、１～７００、１０～７００、２０～７００、３０～７００、４０～７００、５０～７００、６０～７００、７０～７００、８０～７００、９０～７００、１００～７００、２００～７００、３００～７００、４００～７００、５００～７００、６００～７００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～６００、１～６００、１０～６００、２０～６００、３０～６００、４０～６００、５０～６００、６０～６００、７０～６００、８０～６００、９０～６００、１００～６００、２００～６００、３００～６００、４００～６００、５００～６００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、１～５００、１０～５００、２０～５００、３０～５００、４０～５００、５０～５００、６０～５００、７０～５００、８０～５００、９０～５００、１００～５００、２００～５００、３００～５００、４００～５００ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、Ｒ－スポンジン－１は、ヒトまたはマウスＲ－スポンジン－１タンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスＲ－スポンジン－１タンパク質である。
【0051】
ある特定の実施形態では、Ｙ２７６３２の濃度は、約０．１～１０００、０．５～１０００、１～１０００、５～１０００、１０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、５００～１０００μＭ、または約０．１～５００、０．５～５００、１～５００、５～５００、１０～５００、５０～５００、１００～５００μＭ、または約０．１～１００、０．５～１００、１～１００、５～１００、１０～１００、５０～１００μＭ、または約０．１～５０、０．５～５０、１～５０、５～５０、１０～５０μＭ、または約０．１～４０、０．５～４０、１～４０、５～４０、１０～４０μＭ、または約０．１～３０、０．５～３０、１～３０、５～３０、１０～３０μＭ、または約０．１～２０、０．５～２０、１～２０、５～２０、１０～２０μＭ、または約０．１～１０、０．５～１０、１～１０、５～１０μＭ、または約０．１～５、０．５～５、１～５μＭ、または約０．１～１もしくは０．５～１μＭの範囲である。
【0052】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦ１０の濃度は、約０．１～１０，０００もしくは１～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、１～１０００、１０～１０００、２０～１０００、３０～１０００、４０～１０００、５０～１０００、６０～１０００、７０～１０００、８０～１０００、９０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、８００～１０００、９００～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、１～５００、１０～５００、２０～５００、３０～５００、４０～５００、５０～５００、６０～５００、７０～５００、８０～５００、９０～５００、１００～５００、２００～５００、３００～５００、４００～５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～４００、１～４００、１０～４００、２０～４００、３０～４００、５０～４００、４０～４００、６０～４００、７０～４００、８０～４００、９０～４００、１００～４００、２００～４００、３００～４００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～３００、１～３００、１０～３００、２０～３００、３０～３００、４０～３００、５０～３００、６０～３００、７０～３００、８０～３００、９０～３００、１００～３００、２００～３００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～２００、１～２００、１０～２００、２０～２００、３０～２００、４０～２００、５０～２００、６０～２００、７０～２００、８０～２００、９０～２００、１００～２００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１５０、１～１５０、１０～１５０、２０～１５０、３０～１５０、４０～１５０、５０～１５０、６０～１５０、７０～１５０、８０～１５０、９０～１５０、１００～１５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１２０、１～１２０、１０～１２０、２０～１２０、３０～１２０、４０～１２０、５０～１２０、６０～１２０、７０～１２０、８０～１２０、９０～１２０、１００～１２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１００、１～１００、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、ＦＧＦ１０は、ヒトまたはマウスＦＧＦ１０タンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスＦＧＦ１０タンパク質である。
【0053】
ある特定の実施形態では、ＶＯ－ＯＨｐｉｃの濃度は、約０．０１～１００もしくは０．１～１μＭ、または０．０１～１０、０．０２～１０、０．０３～１０、０．０４～１０、０．０５～１０、０．０６～１０、０．０７～１０、０．０８～１０、０．０９～１０、０．１～１０、０．５～１０、１～１０、もしくは５～１０μＭ、または約０．０１～５、０．０２～５、０．０３～５、０．０４～５、０．０５～５、０．０６～５、０．０７～５、０．０８～５、０．０９～５、０．１～５、０．５～５、１～５μＭ、または約０．０１～２、０．０２～２、０．０３～２、０．０４～２、０．０５～２、０．０６～２、０．０７～２、０．０８～２、０．０９～２、０．１～２、０．５～２、１～２μＭ、または約０．０１～１、０．０２～１、０．０３～１、０．０４～１、０．０５～１、０．０６～１、０．０７～１、０．０８～１、０．０９～１、０．１～１、０．５～１μＭ、または約０．０１～０．５、０．０２～０．５、０．０３～０．５、０．０４～０．５、０．０５～０．５、０．０６～０．５、０．０７～０．５、０．０８～０．５、０．０９～０．５、もしくは０．１～０．５μＭ、または約０．０１～０．４、０．０２～０．４、０．０３～０．４、０．０４～０．４、０．０５～０．４、０．０６～０．４、０．０７～０．４、０．０８～０．４、０．０９～０．４、もしくは０．１～０．４μＭ、または約０．０１～０．３、０．０２～０．３、０．０３～０．３、０．０４～０．３、０．０５～０．３、０．０６～０．３、０．０７～０．３、０．０８～０．３、０．０９～０．３、もしくは０．１～０．３μＭ、または約０．０１～０．２、０．０２～０．２、０．０３～０．２、０．０４～０．２、０．０５～０．２、０．０６～０．２、０．０７～０．２、０．０８～０．２、０．０９～０．２、もしくは０．１～０．２μＭの範囲である。市販のＶＯ－ＯＨｐｉｃの特定の例としては、ＶＯ－ＯＨｐｉｃ三水和物を含む。
【0054】
ある特定の実施形態では、及び上記の構成成分に加えて、懸濁液培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ－２）、及びＮ－アセチル－Ｌ－システイン（前述の全ての組み合わせを含む）から選択される１つ以上の構成成分、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つの構成成分を含む。特定の実施形態では、及び上記の構成成分に加えて、懸濁液培地は、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインを含む。
【0055】
ある特定の実施形態では、ＥＧＦの濃度は、約０．１～１０００もしくは１～１００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、０．５～１０００、１～１０００、５～１０００、１０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、５００～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、０．５～５００、１～５００、５～５００、１０～５００、５０～５００、１００～５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１００、０．５～１００、１～１００、５～１００、１０～１００、５０～１００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５０、０．５～５０、１～５０、５～５０、１０～５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～４０、０．５～４０、１～４０、５～４０、１０～４０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～３０、０．５～３０、１～３０、５～３０、１０～３０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～２０、０．５～２０、１～２０、５～２０、１０～２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０、０．５～１０、１～１０、５～１０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５、０．５～５、１～５ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１もしくは０．５～１ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、ＥＧＦは、ヒトまたはマウスＥＧＦタンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスＥＧＦタンパク質である。
【0056】
ある特定の実施形態では、ＨＧＦの濃度は、約０．１～１０００もしくは１～１００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、０．５～１０００、１～１０００、５～１０００、１０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、５００～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、０．５～５００、１～５００、５～５００、１０～５００、５０～５００、１００～５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１００、０．５～１００、１～１００、５～１００、１０～１００、５０～１００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５０、０．５～５０、１～５０、５～５０、１０～５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～４０、０．５～４０、１～４０、５～４０、１０～４０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～３０、０．５～３０、１～３０、５～３０、１０～３０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～２０、０．５～２０、１～２０、５～２０、１０～２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０、０．５～１０、１～１０、５～１０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５、０．５～５、１～５ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１もしくは０．５～１ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、ＨＧＦは、ヒトまたはマウスＨＧＦタンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスＨＧＦタンパク質である。
【0057】
ある特定の実施形態では、ＩＧＦの濃度は、約０．１～１０００もしくは１～１００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、０．５～１０００、１～１０００、５～１０００、１０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、５００～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、０．５～５００、１～５００、５～５００、１０～５００、５０～５００、１００～５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１００、０．５～１００、１～１００、５～１００、１０～１００、５０～１００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５０、０．５～５０、１～５０、５～５０、１０～５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～４０、０．５～４０、１～４０、５～４０、１０～４０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～３０、０．５～３０、１～３０、５～３０、１０～３０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～２０、０．５～２０、１～２０、５～２０、１０～２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０、０．５～１０、１～１０、５～１０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５、０．５～５、１～５ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１もしくは０．５～１ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、ＩＧＦは、ヒトまたはマウスＩＧＦタンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスＩＧＦタンパク質である。
【0058】
ある特定の実施形態では、ＶＥＧＦの濃度は、約０．１～１０００もしくは１～１００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、０．５～１０００、１～１０００、５～１０００、１０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、５００～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、０．５～５００、１～５００、５～５００、１０～５００、５０～５００、１００～５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１００、０．５～１００、１～１００、５～１００、１０～１００、５０～１００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５０、０．５～５０、１～５０、５～５０、１０～５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～４０、０．５～４０、１～４０、５～４０、１０～４０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～３０、０．５～３０、１～３０、５～３０、１０～３０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～２０、０．５～２０、１～２０、５～２０、１０～２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０、０．５～１０、１～１０、５～１０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５、０．５～５、１～５ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１もしくは０．５～１ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、ＶＥＧＦは、ヒトまたはマウスＶＥＧＦタンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスＶＥＧＦタンパク質である。
【0059】
ある特定の実施形態では、ＰＤＧＦの濃度は、約０．１～１０００もしくは１～１００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０００、０．５～１０００、１～１０００、５～１０００、１０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、５００～１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５００、０．５～５００、１～５００、５～５００、１０～５００、５０～５００、１００～５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１００、０．５～１００、１～１００、５～１００、１０～１００、５０～１００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５０、０．５～５０、１～５０、５～５０、１０～５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～４０、０．５～４０、１～４０、５～４０、１０～４０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～３０、０．５～３０、１～３０、５～３０、１０～３０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～２０、０．５～２０、１～２０、５～２０、１０～２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１０、０．５～１０、１～１０、５～１０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～５、０．５～５、１～５ｎｇ／ｍｌ、または約０．１～１もしくは０．５～１ｎｇ／ｍｌの範囲である。特定の実施形態では、ＰＤＧＦは、ヒトまたはマウスＰＤＧＦタンパク質、例えば、組み換えヒトまたはマウスＰＤＧＦタンパク質である。
【0060】
ある特定の実施形態では、Ｎ２の濃度は、任意選択で、５０倍または１００倍のストックに対して、約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０倍であるか、または０１～１０倍もしくは０．１～１０倍、または約０．１～１０、０．２～１０、０．３～１０、０．４～１０、０．５～１０、０．６～１０、０．７～１０、０．８～１０、０．９～１０、１～１０、２～１０、５～１０倍、または約０．１～５、０．２～５、０．３～５、０．４～５、０．５～５、０．６～５、０．７～５、０．８～５、０．９～５、１～５、２～５倍、または約０．１～４、０．２～４、０．３～４、０．４～４、０．５～４、０．６～４、０．７～４、０．８～４、０．９～４、１～４、２～４倍、または約０．１～３、０．２～３、０．３～３、０．４～３、０．５～３、０．６～３、０．７～３、０．８～３、０．９～３、１～３、２～３倍、または約０．１～２、０．２～２、０．３～２、０．４～２、０．５～２、０．６～２、０．７～２、０．８～２、０．９～２、１～２倍の範囲である。Ｎ２サプリメント（１００Ｘ）は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ及びＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。
【0061】
ある特定の実施形態では、Ｂ２７の濃度は、任意選択で、５０倍または１００倍のストックに対して、約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０倍であるか、または０１～１０倍もしくは０．１～１０倍、または約０．１～１０、０．２～１０、０．３～１０、０．４～１０、０．５～１０、０．６～１０、０．７～１０、０．８～１０、０．９～１０、１～１０、２～１０、５～１０倍、または約０．１～５、０．２～５、０．３～５、０．４～５、０．５～５、０．６～５、０．７～５、０．８～５、０．９～５、１～５、２～５倍、または約０．１～４、０．２～４、０．３～４、０．４～４、０．５～４、０．６～４、０．７～４、０．８～４、０．９～４、１～４、２～４倍、または約０．１～３、０．２～３、０．３～３、０．４～３、０．５～３、０．６～３、０．７～３、０．８～３、０．９～３、１～３、２～３倍、または約０．１～２、０．２～２、０．３～２、０．４～２、０．５～２、０．６～２、０．７～２、０．８～２、０．９～２、１～２倍の範囲である。Ｂ２７（登録商標）サプリメント（５０倍）は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。
【0062】
ある特定の実施形態では、ＰＧＥ－２の濃度は、約０．１～１０００、０．５～１０００、１～１０００、５～１０００、１０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、５００～１０００ｎＭ、または約０．１～５００、０．５～５００、１～５００、５～５００、１０～５００、５０～５００、１００～５００ｎＭ、または約０．１～１００、０．５～１００、１～１００、５～１００、１０～１００、５０～１００ｎＭ、または約０．１～５０、０．５～５０、１～５０、５～５０、１０～５０ｎＭ、または約０．１～４０、０．５～４０、１～４０、５～４０、１０～４０ｎＭ、または約０．１～３０、０．５～３０、１～３０、５～３０、１０～３０ｎＭ、または約０．１～２０、０．５～２０、１～２０、５～２０、１０～２０ｎＭ、または約０．１～１０、０．５～１０、１～１０、５～１０ｎＭ、または約０．１～５、０．５～５、１～５ｎＭ、または約０．１～１もしくは０．５～１ｎＭであるか、またはこれらの範囲である。
【0063】
ある特定の実施形態では、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの濃度は、約０．１～１００もしくは０．１～１０もしくは０．５～１０ｍＭ、または約０．１～１００、０．２～１００、０．３～１００、０．４～１００、０．５～１００、０．６～１００、０．７～１００、０．８～１００、０．９～１００、１～１００、２～１００、３～１００、４～１００、５～１００、１０～１００、５０～１００ｍＭ、または約０．１～５０、０．２～５０、０．３～５０、０．４～５０、０．５～５０、０．６～５０、０．７～５０、０．８～５０、０．９～５０、１～５０、２～５０、３～５０、４～５０、５～５０、１０～５０ｍＭ、または約０．１～１０、０．２～１０、０．３～１０、０．４～１０、０．５～１０、０．６～１０、０．７～１０、０．８～１０、０．９～１０、１～１０、２～１０、３～１０、４～１０、５～１０ｍＭ、または約０．１～５、０．２～５、０．３～５、０．４～５、０．５～５、０．６～５、０．７～５、０．８～５、０．９～５、１～５、２～５、３～５、４～５ｍＭ、または約０．１～２、０．２～２、０．３～２、０．４～２、０．５～２、０．６～２、０．７～２、０．８～２、０．９～２、１～２ｍＭの範囲である。
【0064】
特定の実施形態では、懸濁液培地は、ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ＦＧＦ１０、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃを含む。
【0065】
ある特定の実施形態では、培地懸濁液は、細胞外基質（ＥＣＭ）構成成分が省かれるか、またはさもなければそれを含まない。単に例示として、培地懸濁液は、コラーゲン、マトリゲル、ラミニン、及び／またはフィブロネクチンを含まない。
【0066】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞クラスターは、ヒト患者、例えば、ヒト患者に直接由来する一次腫瘍細胞から得られる。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞クラスターは、腫瘍細胞で異種移植された免疫不全動物から単離される、つまり、腫瘍細胞は、患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）である。直接患者から、またはＰＤＸを介して間接的に単離された腫瘍細胞クラスターの特定の例には、肺癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、及び乳癌細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞クラスターは、ヒト患者から除去された腫瘍試料から直接単離され、その例としては、外科試料、生検、胸水、及び腹水液が挙げられる。腫瘍細胞は、患者から直接、または例えば、患者の医療及び癌治療において役割を果たす医師もしくは他の医療提供者から得ることができる。
【0067】
また、試料（例えば、本明細書に記載される）からヒト腫瘍細胞クラスターの集団を得ることと、本明細書に記載される培地懸濁液中でヒト腫瘍細胞クラスターの集団を培養することとを含む、ヒト腫瘍細胞の増殖方法も含まれる。いくつかの実施形態では、ヒト腫瘍細胞クラスターは、約１４日以内、または約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内の間、または約５～１４、６～１４、７～１４、８～１４、９～１４、１０～１４、１１～１４、１２～１４、もしくは１３～１４日以内の間、または約５～１３、６～１３、７～１３、８～１３、９～１３、１０～１３、１１～１３、もしくは１２～１３日以内の間、または約５～１２、６～１２、７～１２、８～１２、９～１２、１０～１２、もしくは１１～１２日以内の間、または約５～１１、６～１１、７～１１、８～１１、９～１１、もしくは１０～１１日以内の間、または約５～１０、６～１０、７～１０、８～１０、もしくは９～１０日以内の間、または約５～９、６～９、７～９、もしくは８～９日以内の間、または約５～８、６～８、もしくは７～８日以内の間、または約５～７もしくは６～７日以内の間、培養懸濁液中で培養される。
【0068】
いくつかの実施形態では、本方法は、培地懸濁液は、約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に腫瘍細胞クラスターの約もしくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％（全ての組み合わせ、整数、及びその間の範囲を含む）の増殖をもたらす。例えば、ある特定の方法は、任意選択で、約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に、または５～１４、６～１４、７～１４、８～１４、９～１４、１０～１４、１１～１４、１２～１４、もしくは１３～１４日以内に、または約５～１３、６～１３、７～１３、８～１３、９～１３、１０～１３、１１～１３、もしくは１２～１３日以内に、または約５～１２、６～１２、７～１２、８～１２、９～１２、１０～１２、もしくは１１～１２日以内に、または約５～１１、６～１１、７～１１、８～１１、９～１１、もしくは１０～１１日以内に、または約５～１０、６～１０、７～１０、８～１０、もしくは９～１０日以内に、または約５～９、６～９、７～９、もしくは８～９日以内に、または約５～８、６～８、もしくは７～８日以内に、または約５～７もしくは６～７日以内に、または約５～６日以内に、腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１０～３５、１０～４０、１０～４５、１０～５０、１０～５５、１０～６０、１０～６５、１０～７０、１０～７５、１０～８０、１０～８５、１０～９０、１０～９５、もしくは１０～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約１５～２０、１５～２５、１５～３０、１５～３５、１５～４０、１５～４５、１５～５０、１５～５５、１５～６０、１５～６５、１５～７０、１５～７５、１５～８０、１５～８５、１５～９０、１５～９５、もしくは１５～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約２０～２５、２０～３０、２０～３５、２０～４０、２０～４５、２０～５０、２０～５５、２０～６０、２０～６５、２０～７０、２０～７５、２０～８０、２０～８５、２０～９０、２０～９５、もしくは２０～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約２５～３０、２５～３５、２５～４０、２５～４５、２５～５０、２５～５５、２５～６０、２５～６５、２５～７０、２５～７５、２５～８０、２５～８５、２５～９０、２５～９５、もしくは２５～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約３０～３５、３０～４０、３０～４５、３０～５０、３０～５５、３０～６０、３０～６５、３０～７０、３０～７５、３０～８０、３０～８５、３０～９０、３０～９５、もしくは３０～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約３５～４０、３５～４５、３５～５０、３５～５５、３５～６０、３５～６５、３５～７０、３５～７５、３５～８０、３５～８５、３５～９０、３５～９５、もしくは３５～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約４０～４５、４０～５０、４０～５５、４０～６０、４０～６５、４０～７０、４０～７５、４０～８０、４０～８５、４０～９０、４０～９５、もしくは４０～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約４５～５０、４５～５５、４５～６０、４５～６５、４５～７０、４５～７５、４５～８０、４５～８５、４５～９０、４５～９５、もしくは４５～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約５０～５５、５０～６０、５０～６５、５０～７０、５０～７５、５０～８０、５０～８５、５０～９０、５０～９５、もしくは５０～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約５５～６０、５５～６５、５５～７０、５５～７５、５５～８０、５５～８５、５５～９０、５５～９５、もしくは，５５～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約６０～６５、６０～７０、６０～７５、６０～８０、６０～８５、６０～９０、６０～９５、もしくは６０～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約６５～７０、６５～７５、６５～８０、６５～８５、６５～９０、６５～９５、もしくは６５～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約７０～８０、７０～８５、７０～９０、７０～９５、もしくは７０～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約７５～８０、７５～８５、７５～９０、７５～９５、もしくは７５～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約８０～８５、８０～９０、８０～９５、もしくは８０～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約８５～９０、８５～９５、もしくは８５～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約９０～９５もしくは９０～１００％の増殖、または腫瘍細胞クラスターの約または少なくとも約９５～１００％の増殖をもたらす。特定の方法は、約７日以内に腫瘍細胞クラスターの少なくとも約２０～３０％の増殖、または約７日以内に腫瘍細胞クラスターの少なくとも約６０％の増殖をもたらす。
【0069】
上述のように、本明細書に記載される懸濁液培地及び方法は、とりわけ、患者腫瘍の、１つ以上の治療薬に対する潜在的応答性を評価するために、及び比較的短時間、例えば、１または２週間以内に患者に最適な治療選択肢を特定する利点を提供するために使用され得る。よって、特定の実施形態は、ヒト患者から腫瘍細胞クラスターの集団を得ることと、先行請求項のいずれか１項に記載の培地懸濁液中で腫瘍細胞クラスターの集団を培養することと、治療薬または薬物を培地懸濁液に与薬することと、腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することとを含む、ヒト患者の治療薬（例えば、薬物または候補薬物）に対する応答性の試験方法を含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖の減少（例えば、統計的に有意な減少）は、ヒト患者（即ち、ヒト患者の腫瘍）の治療薬に対する応答性を示し、いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖の減少の欠如（例えば、統計的に有意な減少の欠如）は、ヒト患者（即ち、ヒト患者の腫瘍）の治療薬に対する耐性及び非応答性の可能性を示す。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞アポトーシスの誘導（例えば、統計的に有意な増加）は、ヒト患者（即ち、ヒト患者の腫瘍）の治療薬に対する応答性を示す。特定の実施形態では、腫瘍細胞増殖の増加の欠如（例えば、統計的に有意な増加の欠如）は、ヒト患者（即ち、ヒト患者の腫瘍）の治療薬に対する耐性及び非応答性の可能性を示す。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞増殖の減少及び腫瘍細胞アポトーシスの誘導は、ヒト患者の治療薬に対する応答性を示し、腫瘍細胞増殖の減少の欠如は、ヒト患者の治療薬に対する耐性及び非応答性の可能性を示す。
【0071】
いくつかの実施形態では、応答性の試験方法は、培地懸濁液中で腫瘍細胞クラスターの集団を培養した日と同日に（例えば、同時にまたは実質的に同時に）治療薬を与薬することを含む。ある特定の実施形態は、培地懸濁液中で腫瘍細胞クラスターの集団を培養した約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間以内に治療薬を与薬することを含む。培地懸濁液中で腫瘍細胞クラスターの集団を培養した約１、２、３、４、５、６、または７日後に、またはそれ以内に治療薬を与薬することを含む方法も含まれ、培地懸濁液中で腫瘍細胞クラスターの集団を培養した約１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、もしくは２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、または３～７、３～６、３～５、３～４、または４～７、４～６、４～５、または５～７、５～６、または６～７日後に、またはそれ以内に治療薬を与薬する方法も含む。
【0072】
ある特定の実施形態は、治療薬の与薬約１４日以内に、例えば、治療薬の与薬約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に、腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定するステップを含む。特定の実施形態は、治療薬の与薬約５～１４、６～１４、７～１４、８～１４、９～１４、１０～１４、１１～１４、１２～１４、もしくは１３～１４日以内に、または約５～１３、６～１３、７～１３、８～１３、９～１３、１０～１３、１１～１３、もしくは１２～１３日以内に、または約５～１２、６～１２、７～１２、８～１２、９～１２、１０～１２、もしくは１１～１２日以内に、または約５～１１、６～１１、７～１１、８～１１、９～１１、もしくは１０～１１日以内に、または約５～１０、６～１０、７～１０、８～１０、もしくは９～１０日以内に、または約５～９、６～９、７～９、もしくは８～９日以内に、または約５～８、６～８、もしくは７～８日以内に、または約５～７もしくは６～７日以内に、または約５～６日以内に腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定するステップを含む。
【0073】
ある特定の実施形態では、試験のための治療薬または薬物は小分子である。例示的な小分子としては、細胞傷害性薬、化学療法薬、及び抗血管新生薬、例えば、様々な癌の治療に有用であると考えられているものが挙げられる。小分子の特定のクラスとしては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、白金、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤、ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、及びタキサンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0074】
小分子の特定の例としては、クロラムブルシル、シクロホスファミド、シレンジチド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メルファラン、プロカルバジン、チオテパ、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、エンザスタウリン、ブスルファン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、エルロチニブ イダルビシン、テモゾロミド、エピルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、テムシロリムス、エベロリムス、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ＣＴ５２９２３、及びパクリタキセル、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。小分子のさらなる例としては、イマチニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、スニチニブ、バタラニブ、ゲフチニブ、エルロチニブ、ＡＥＥ－７８８、ジコロアセテート、タモキシフェン、ファスジル、ＳＢ－６８１３２３、及びセマキサニブ（ＳＵ５４１６）（Ｃｈｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．８：８２９－９０９，２００９を参照されたい）が挙げられる。
【0075】
小分子のさらなる例としては、チオテプパ、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパなどのアジリジン、エチレンイミン及びメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎薬；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【0076】
例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ １１７０１８、オンプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体などの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。
【0077】
いくつかの実施形態では、治療薬は、抗体またはその抗原結合断片である。ある特定の実施形態では、抗体もしくはその抗原結合断片または他のポリペプチドは、癌関連抗原または癌抗原、例えば、試験される腫瘍細胞クラスターによって発現される癌抗原に特異的に結合する。例示的な癌抗原としては、細胞表面受容体などの細胞表面タンパク質が挙げられる。かかる細胞表面タンパク質または受容体に結合するリガンドも癌関連抗原として含まれる。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、細胞内癌抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、癌抗原と関連する癌は、乳癌、転移性脳癌、前立腺癌、胃腸癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、頭頸部癌、胃癌、膀胱癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、扁平上皮細胞癌、ＣＮＳもしくは脳癌、黒色腫、非黒色腫癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、上皮性腫瘍、骨癌、または造血癌のうちの１つ以上である。
【0078】
特定の実施形態では、抗体もしくは抗原結合断片または他のポリペプチドは、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ）ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＴＬＡ－４、ＮＰＣ－１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、α－フェトタンパク質、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸受容体１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ－７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ－１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ－ＬＵ－１３抗原、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎性癌抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来成長因子受容体、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７－１Ａ）、プログラム死－１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝３のホスファターゼ（ＰＲＬ－３）、前立腺酸性ホスファターゼ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉起源の腫瘍に発現されるジシアロガングリオシド）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、及び／もしくはメソテリンなどの少なくとも１つの癌関連抗原または癌抗原に特異的に結合する。
【0079】
ある特定の実施形態では、抗体は、３Ｆ８、８Ｈ９、アバゴモマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アラシズマブ（ペゴール）、アマツキシマブ、アポリズマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ（メルタンシン）、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブ（メルタンシン）、カンツズマブ（ラブタンシン）、カプロモマブ（ペンデチド）、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ（ボガトクス）、シクスツムマブ、クリバツズマブ（テトラキセタン）、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デツモマブ、ドロジツマブ、エクロメキシマブ、エドレコロマブ、エロツズマブ、エナバツズマブ、エンシツキシマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、ＦＢＴＡ０５、フィギツムマブ、フランボツマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ（オゾガマイシン）、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ（ベドチン）、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、インダツキシマブラブタンシン、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ＭＤＸ－１０１）、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ（メルタンシン）、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モキセツモマブ（シュードトクス）、ナコロマブ（タフェナトックス）、ナプツモマブ（エスタフェナトックス）、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、Ｎｅｕｒａｄｉａｂ（登録商標）（放射性ヨウ素を伴うか、または伴わない）、ＮＲ－ＬＵ－１０、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ（モナトックス）、オレゴボマブ、パニツムマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サマリズマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、タバルマブ、タプリツモマブ（パプトックス）、テナツモマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、トレメリムマブ、ティガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トシツモマブ、ＴＲＢＳ０７、トラスツズマブ、ツコツズマブ（セルモロイキン）、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、及びザルツムマブなどの抗体を含む抗癌治療用抗体などの治療用抗体である。これらの抗体の断片、変異型、及び誘導体も含まれる。
【0080】
ある特定の実施形態は、２つ以上の治療薬の組み合わせに対する応答性を試験することを含む。よって、ある特定の方法は、前述の例示的な治療薬のいずれか２つ以上の組み合わせを含む、培地懸濁液に２つ以上の治療薬を与薬することを含む。
【0081】
当該技術分野で既知の任意の様々な方法は、腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定するために使用され得る。例えば、腫瘍細胞増殖を測定するある特定の方法は、１つ以上の細胞増殖マーカーを測定することを含む。例示的な細胞増殖マーカーは、３Ｈ－チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５－エチニル－２’－デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ－６７、及び増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を含む。よって、ある特定の実施形態では、腫瘍細胞増殖の測定ステップは、任意選択で、３Ｈ－チミジン、ＢｒｄＵ、Ｅｄｕ、Ｋｉ－６７、及びＰＣＮＡ（これらの組み合わせを含む）のうちの１つ以上から選択される、細胞増殖マーカーを測定することを含む。
【0082】
同様に、当技術分野で既知の任意の様々な方法は、腫瘍細胞アポトーシスを測定するために使用され得る。「アポトーシス」は一般に、細胞の特徴的な変化（例えば、形態）及び細胞死をもたらす生化学的事象を含む、多細胞生物で生じるプログラムされた細胞死のプロセスを指す。例示的な変化としては、小疱形成、細胞萎縮、核断片化、クロマチン凝集、染色体ＤＮＡ断片化、及び全体的なｍＲＮＡ崩壊が挙げられる。腫瘍細胞アポトーシスを測定するある特定の方法は、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む。例示的な細胞アポトーシスマーカーとしては、カスパーゼの蛍光色素標識阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイが挙げられる。よって、ある特定の実施形態では、腫瘍細胞アポトーシスの測定ステップは、任意選択で、ＦＬＩＣＡ、ＰＡＲＰ、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、及びＴＵＮＥＬアッセイ（これらの組み合わせを含む）のうちの１つ以上から選択される、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む。
【0083】
ある特定の態様では、これらの応答性試験または方法は、診断研究所で行われ、その後、結果を患者に提供するか、または患者の医療及び癌治療において役割を担う医師または他の医療提供者に提供される。よって、特定の実施形態は、腫瘍細胞クラスター応答性試験の結果を患者、または医師もしくは他の医療提供者に提供するための方法に含む。これらの結果またはデータは、ハードコピーもしくは紙コピーの形態、またはコンピュータ可読媒体などの電子形態であってもよい。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒト患者からのヒト腫瘍細胞クラスターの集団を含む培地懸濁液であって、約１４日以内に前記腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０％の増殖をもたらす、培地懸濁液。
（項目２）
約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の増殖をもたらす、項目１に記載の培地懸濁液。
（項目３）
約７日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約２０～３０％の増殖をもたらす、項目１または２に記載の培地懸濁液。
（項目４）
約７日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約６０％の増殖をもたらす、項目１～３のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目５）
合成培地を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目６）
無血清である、項目１～５のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目７）
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｗｎｔ３Ａ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノールから選択される１つ以上の構成成分を含む、項目５または６に記載の培地懸濁液。
（項目８）
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノールから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、６、７、８、または９つを含む、項目７に記載の培地懸濁液。
（項目９）
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノールを含む、項目８に記載の培地懸濁液。
（項目１０）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃから選択される１つ以上の構成成分を含む、項目５～９のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１１）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ１０、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、または６つを含む、項目１０に記載の培地懸濁液。
（項目１２）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ１０、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃを含む、項目１１に記載の培地懸濁液。
（項目１３）
上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ－２）、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインから選択される１つ以上の構成成分を含む、項目７～１２のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１４）
ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、６、７、８、または９つを含む、項目１３に記載の培地懸濁液。
（項目１５）
ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインを含む、項目１４に記載の培地懸濁液。
（項目１６）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ＦＧＦ１０、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃを含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１７）
細胞外基質構成成分、任意選択でマトリゲル、コラーゲン、ラミニン、またはフィブロネクチンを含まない、項目１～１６のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１８）
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、ヒト患者からの肺癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、または乳癌細胞である、項目１～１７のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１９）
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、ヒト腫瘍細胞及び／またはヒト患者からの組織で異種移植された免疫不全動物から単離される、項目１～１８のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目２０）
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、任意選択で、外科試料、生検、胸水、及び腹水から選択される、ヒト患者から除去された腫瘍試料から直接単離される、項目１～１８のいずれか１項に記載の培養懸濁液。
（項目２１）
ヒト腫瘍細胞の増殖方法であって、試料からヒト腫瘍細胞の集団を得ることと、項目１～２０のいずれか１項に記載の培地懸濁液中でヒト腫瘍細胞クラスターの集団を培養することと、を含む、方法。
（項目２２）
約１４日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
約７日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
ヒト患者の治療薬に対する応答性の試験方法であって、
前記ヒト患者から腫瘍細胞クラスターの集団を得るまたは受け取ることと、
項目１～２４のいずれか１項に記載の培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養することと、
前記治療薬を前記培地懸濁液に与薬することと、
前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することと、を含み、
腫瘍細胞増殖の減少及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導が、ヒト患者の治療薬に対する応答性を示し、腫瘍細胞増殖の減少の欠如及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導の欠如が、ヒト患者の治療薬に対する耐性を示す方法も含まれる。
（項目２６）
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した日と同日に与薬することを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した少なくとも１日後に与薬することを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した約１、２、３、４、５、６、または７日後、またはそれ以内に与薬することを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記治療薬の与薬約１４日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目１～２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記治療薬の与薬約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記治療薬の与薬約７、６、または５日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
腫瘍細胞増殖の測定ステップが、細胞増殖マーカーを測定することを含む、項目１～３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞増殖マーカーが、３Ｈ－チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５－エチニル－２’－デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ－６７、及び増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のうちの１つ以上から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記腫瘍細胞アポトーシスの測定ステップが、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む、項目１～３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞アポトーシスマーカーが、カスパーゼの蛍光色素標識阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのうちの１つ以上から選択される、項目３４に記載の方法。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒト患者からのヒト腫瘍細胞クラスターの集団を含む培地懸濁液であって、約１４日以内に前記腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０％の増殖をもたらす、培地懸濁液。
（項目２）
約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の増殖をもたらす、項目１に記載の培地懸濁液。
（項目３）
約７日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約２０～３０％の増殖をもたらす、項目１または２に記載の培地懸濁液。
（項目４）
約７日以内に前記ヒト腫瘍細胞クラスターの少なくとも約６０％の増殖をもたらす、項目１～３のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目５）
合成培地を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目６）
無血清である、項目１～５のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目７）
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｗｎｔ３Ａ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノールから選択される１つ以上の構成成分を含む、項目５または６に記載の培地懸濁液。
（項目８）
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノールから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、６、７、８、または９つを含む、項目７に記載の培地懸濁液。
（項目９）
ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｗｎｔ３Ａ、ｂＦＧＦ、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、コレステロール、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、及び２－メルカプトエタノールを含む、項目８に記載の培地懸濁液。
（項目１０）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃから選択される１つ以上の構成成分を含む、項目５～９のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１１）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ１０、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、または６つを含む、項目１０に記載の培地懸濁液。
（項目１２）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、ＦＧＦ１０、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃを含む、項目１１に記載の培地懸濁液。
（項目１３）
上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ－２）、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインから選択される１つ以上の構成成分を含む、項目７～１２のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１４）
ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインから選択される構成成分のうちの２、３、４、５、６、７、８、または９つを含む、項目１３に記載の培地懸濁液。
（項目１５）
ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインを含む、項目１４に記載の培地懸濁液。
（項目１６）
ニコチンアミド、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、Ｙ２７６３２、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｎ２、Ｂ２７、ＰＧＥ２、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、ＦＧＦ１０、及びＶＯ－ＯＨｐｉｃを含む、項目１０～１５のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１７）
細胞外基質構成成分、任意選択でマトリゲル、コラーゲン、ラミニン、またはフィブロネクチンを含まない、項目１～１６のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１８）
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、ヒト患者からの肺癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、または乳癌細胞である、項目１～１７のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目１９）
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、ヒト腫瘍細胞及び／またはヒト患者からの組織で異種移植された免疫不全動物から単離される、項目１～１８のいずれか１項に記載の培地懸濁液。
（項目２０）
前記ヒト腫瘍細胞クラスターが、任意選択で、外科試料、生検、胸水、及び腹水から選択される、ヒト患者から除去された腫瘍試料から直接単離される、項目１～１８のいずれか１項に記載の培養懸濁液。
（項目２１）
ヒト腫瘍細胞の増殖方法であって、試料からヒト腫瘍細胞の集団を得ることと、項目１～２０のいずれか１項に記載の培地懸濁液中でヒト腫瘍細胞クラスターの集団を培養することと、を含む、方法。
（項目２２）
約１４日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
約７日以内の間、前記培養懸濁液中で前記ヒト腫瘍細胞クラスターを培養することを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
ヒト患者の治療薬に対する応答性の試験方法であって、
前記ヒト患者から腫瘍細胞クラスターの集団を得るまたは受け取ることと、
項目１～２４のいずれか１項に記載の培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養することと、
前記治療薬を前記培地懸濁液に与薬することと、
前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することと、を含み、
腫瘍細胞増殖の減少及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導が、ヒト患者の治療薬に対する応答性を示し、腫瘍細胞増殖の減少の欠如及び／または腫瘍細胞アポトーシスの誘導の欠如が、ヒト患者の治療薬に対する耐性を示す方法も含まれる。
（項目２６）
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した日と同日に与薬することを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した少なくとも１日後に与薬することを含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記治療薬を、前記培地懸濁液中で前記腫瘍細胞クラスターの集団を培養した約１、２、３、４、５、６、または７日後、またはそれ以内に与薬することを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記治療薬の与薬約１４日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目１～２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記治療薬の与薬約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記治療薬の与薬約７、６、または５日以内に、前記腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖及び／または腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
腫瘍細胞増殖の測定ステップが、細胞増殖マーカーを測定することを含む、項目１～３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞増殖マーカーが、３Ｈ－チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５－エチニル－２’－デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ－６７、及び増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のうちの１つ以上から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記腫瘍細胞アポトーシスの測定ステップが、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む、項目１～３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記細胞アポトーシスマーカーが、カスパーゼの蛍光色素標識阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのうちの１つ以上から選択される、項目３４に記載の方法。
【実施例0084】
実施例１
腫瘍細胞クラスターの単離及び分析
患者のコンセンサスを受け取った後、結腸直腸癌患者からの外科検体をＢｅｉｊｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た。患者由来の異種移植片腫瘍検体は、患者からの外科腫瘍検体の接種を受けたＮｏｄ／ＳＣＩＤマウスから得た。
腫瘍細胞クラスターの単離及び分析
患者のコンセンサスを受け取った後、結腸直腸癌患者からの外科検体をＢｅｉｊｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た。患者由来の異種移植片腫瘍検体は、患者からの外科腫瘍検体の接種を受けたＮｏｄ／ＳＣＩＤマウスから得た。
【0085】
簡潔に、非腫瘍組織及び壊死画分を腫瘍検体から慎重に除去した。はさみを使用して腫瘍組織を直径１ｍｍ未満の小片に切断した。磁石撹拌棒を装填した滅菌１００ｍｌ三角形ガラスフラスコに刻んだ腫瘍画分を移した。０．２５Ｕ／ｍｌのリベラーゼＤＨを含有する１０～１５ｍｌの消化培地を刻んだ腫瘍組織に添加して、酵素消化を開始させた。穏やかに撹拌しながら酵素混合物を３７℃で１～２時間インキュベートした。部分的に消化された腫瘍細胞クラスターを、１００μｍの細胞保持装置を通して濾過した。濾液を、４０μｍの細胞拘束装置（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｒ）を通して再濾過した。４０μｍの細胞拘束装置上に保持された腫瘍細胞クラスターを収集し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、次いで、細胞成長因子及び小分子阻害剤で補充された合成成長培地中に再懸濁した。
【0086】
エクスビボ薬物感度アッセイに関して、腫瘍細胞クラスターを合成成長培地中で一晩回復させた。合成成長培地は、ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、ノギン、Ｒ－スポンジン－１、及びＹ２７６３２を含むＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭサプリメントであった。次いで、薬物を洗浄する前に２４時間、腫瘍細胞クラスターを薬物（例えば、２μＭ（Ｃｍａｘ）のドセタキセル）に曝露した。薬物による曝露後、腫瘍細胞クラスターを５－エチニル－２’－デオキシウリジン（Ｅｄｕ）で標識して、腫瘍細胞増殖速度を評価した。薬物曝露４８時間後に標識を開始し、９６時間継続した。対照群において、腫瘍細胞クラスターは培地交換に伴い薬物曝露を受けなかったが、同様にＥｄｕで標識された。標識された腫瘍細胞クラスターを単一細胞に解離し、固定した。固定した細胞を、４℃で一晩、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中で、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。組み込まれたＥｄｕは、固定した細胞を、暗所で、１倍のＣｌｉｃｋ－ｉＴ Ｅｄｕ反応緩衝液、ＣｕＳＯ４、及びアジド抱合型Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素を含有する反応混合物と共にインキュベートしたＣｌｉｃｋ－ｉＴ反応によって検出された。画像取得及び分析のために黒色壁プレートに分配する前に、染色した細胞をＰＢＳで洗浄した。
【0087】
画像取得及び分析に関して、染色した腫瘍細胞を高含有スクリーニング（ＨＣＳ）プラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＸＴｉ ＨＣＳリーダー）によって撮像した。１０倍の対物レンズを使用して画像を収集した。２５個のフィールドを各ウェルに関して撮像し、３０００個を超える細胞を分析用に捕捉した。画像から２つの蛍光シグナルがＨＣＳリーダーから得られた。青色蛍光シグナルは、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色された核シグナルを記録し、緑色蛍光シグナルは、新しく合成されたＤＮＡに組み込まれたＥｄｕを検出した。Ｅｄｕ陽性サブ集団細胞の百分率は、全細胞計数のパーセントとして計算された。このエクスビボアッセイにおける薬物耐性のカットオフポイントは、腫瘍細胞クラスターが２μＭドセタキセルに２４時間曝露されたときの、Ｅｄｕ組み込みの９０％未満の阻害と定義された。
【0088】
直接患者試料に関して、図１Ａ～１Ｄは、腫瘍細胞クラスターが患者から外科的に除去される結腸／直腸腫瘍からの分離が成功し、合成成長培地中の懸濁液中で培養されたことを示す。図２は、Ｅｄｕ組み込みにより測定されるとき、腫瘍細胞が短期懸濁培養期間中に増殖されたことを示す（試料１は図１Ａからのものであり、試料２は図１Ｂからのものであり、試料３は図１Ｃからのものであり、試料４は図１Ｄのものからである）。
【0089】
図３Ａ～３Ｂは、短期懸濁培養（約７日以内）が腫瘍細胞クラスターの最も高い細胞増殖マーカーを示すことを示す。図３Ａは４つの異なる患者試料の増殖マーカーを示し、図３Ｂは１週間にわたる１つの例示的な患者試料の増殖マーカーを示す。
【0090】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【外国語明細書】