特開 2022-79062 動物細胞の染色体上への外来遺伝子の挿入方法、動物細胞、外来遺伝子挿入用キット、ベクター、ガイドＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ発現ベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022079062

(43)【公開日】2022-05-26

(54)【発明の名称】動物細胞の染色体上への外来遺伝子の挿入方法、動物細胞、外来遺伝子挿入用キット、ベクター、ガイドＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ発現ベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20220519BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20220519BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220519BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/85 Z ZNA

C12N5/10

【審査請求】未請求

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020190015

(22)【出願日】2020-11-16

(71)【出願人】

【識別番号】899000057

【氏名又は名称】学校法人日本大学

(74)【代理人】

【識別番号】100161207

【弁理士】

【氏名又は名称】西澤 和純

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100126882

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 光永

(72)【発明者】

【氏名】石原 寿光

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4B065CA60

(57)【要約】

【課題】外来遺伝子の均一な発現を達成し得る、動物細胞の染色体上への外来遺伝子の挿入方法、動物細胞、及び外来遺伝子挿入用キットを提供する。
【解決手段】動物細胞の染色体上への外来遺伝子の挿入方法は、動物細胞のＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に外来遺伝子を挿入する工程を含む。動物細胞は、Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に、リコンビナーゼ認識配列が挿入されている。外来遺伝子挿入用キットは、前記動物細胞と、前記動物細胞の染色体に挿入されているリコンビナーゼ認識配列を認識するリコンビナーゼと、前記動物細胞の染色体に挿入されているリコンビナーゼ認識配列と同一のリコンビナーゼ認識配列を有するベクターと、を備える。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

動物細胞のＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に外来遺伝子を挿入する工程を含む、動物細胞の染色体上への外来遺伝子の挿入方法。

【請求項2】

前記Ｚｘｄｂ遺伝子の上流領域が、前記Ｚｘｄｂ遺伝子の転写開始点から１～５０ｋｂｐ上流の領域である、請求項１に記載の挿入方法。

【請求項3】

前記Ｚｘｄｂ遺伝子の上流領域が、前記Ｚｘｄｂ遺伝子の転写開始点から５～１５ｋｂｐ上流の領域である、請求項１又は２に記載の挿入方法。

【請求項4】

前記Ｚｘｄｂ遺伝子の上流領域が、前記Ｚｘｄｂ遺伝子の転写開始点から９～１１ｋｂｐ上流の領域である、請求項１～３のいずれ一項に記載の挿入方法。

【請求項5】

Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に、リコンビナーゼ認識配列が挿入されている、動物細胞。

【請求項6】

前記リコンビナーゼ認識配列がＦＲＴ配列又はｌｏｘＰ配列である、請求項５に記載の動物細胞。

【請求項7】

ヒト又はマウス由来の細胞である、請求項５又は６に記載の動物細胞。

【請求項8】

請求項５～７のいずれか一項に記載の動物細胞と、
前記動物細胞の染色体に挿入されているリコンビナーゼ認識配列を認識するリコンビナーゼと、
前記動物細胞の染色体に挿入されているリコンビナーゼ認識配列と同一のリコンビナーゼ認識配列を有するベクターと、
を備える、外来遺伝子挿入用キット。

【請求項9】

外来遺伝子と、
前記外来遺伝子の上流及び下流に結合した、標的動物細胞のＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域と相同な配列を有する核酸と、
を含む、ベクター。

【請求項10】

前記外来遺伝子の上流に、配列番号１で表される配列と相同な配列を有する核酸が結合しており、且つ、前記外来遺伝子の下流に、配列番号２で表される配列と相同な配列を有する核酸が結合している、請求項９に記載のベクター。

【請求項11】

配列番号３で表される塩基配列からなる核酸を含む、ガイドＲＮＡ。

【請求項12】

配列番号４で表される塩基配列からなる核酸を含む、ガイドＲＮＡ発現ベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、動物細胞の染色体上への外来遺伝子の挿入方法、動物細胞、外来遺伝子挿入用キット、ベクター、ガイドＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ発現ベクターに関する。

【背景技術】

【0002】

従来から、未解明の遺伝子の細胞における機能を解析するために、当該遺伝子のｃＤＮＡや当該遺伝子に対するｓｈＲＮＡを染色体に組込み、発現されることが行われてきた。これら核酸の染色体への組込みをランダムに行うと、組込み位置によっては発現しない、或いは、発現が弱くなることがあり、さらに、既存の遺伝子を破壊する虞がある。

【0003】

これに対し、これまでセーフハーバー遺伝子座と呼ばれる染色体座が探索されている。セーフハーバー遺伝子座は、外来遺伝子を挿入しても有害でない位置で、且つ、均一で一定レベルの遺伝子発現が起こる部位である。マウス細胞で発見されたＲｏｓａ２６等のセーフハーバー遺伝子座は、外来遺伝子を挿入する標的位置として一般的に用いられている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Beard C et al., “Efficient Method to Generate Single-Copy Transgenic Mice by Site-Specific Integration in Embryonic Stem Cells.”, Genesis, Vol. 44, pp. 23-28, 2006.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、近年、当該位置に入れた外来遺伝子の発現が均一に起こらない等の問題が指摘されている（例えば、参考文献１参照）。特に、テトラサイクリン依存性プロモーターにより発現させようとする外来遺伝子は、サイレンシングと呼ばれる現象が起きて、発現量が個々の細胞によってバラバラなモザイク状となり、均一な発現を達成できない。

【0006】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、外来遺伝子の均一な発現を達成し得る、動物細胞の染色体上への外来遺伝子の挿入方法を提供する。また、外来遺伝子の均一な発現を達成し得る動物細胞、外来遺伝子挿入用キット、ベクター、ガイドＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ発現ベクターを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、動物細胞のＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の転写開始点から１０．６ｋｂｐ程度上流の位置に外来遺伝子を挿入することで、当該外来遺伝子が均一に発現することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0008】

すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） 動物細胞のＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に外来遺伝子を挿入する工程を含む、動物細胞の染色体上への外来遺伝子の挿入方法。
（２） 前記Ｚｘｄｂ遺伝子の上流領域が、前記Ｚｘｄｂ遺伝子の転写開始点から１～５０ｋｂｐ上流の領域である、（１）に記載の挿入方法。
（３） 前記Ｚｘｄｂ遺伝子の上流領域が、前記Ｚｘｄｂ遺伝子の転写開始点から５～１５ｋｂｐ上流の領域である、（１）又は（２）に記載の挿入方法。
（４） 前記Ｚｘｄｂ遺伝子の上流領域が、前記Ｚｘｄｂ遺伝子の転写開始点から９～１１ｋｂｐ上流の領域である、（１）～（３）のいずれ一つに記載の挿入方法。
（５） Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に、リコンビナーゼ認識配列が挿入されている、動物細胞。
（６） 前記リコンビナーゼ認識配列がＦＲＴ配列又はｌｏｘＰ配列である、（５）に記載の動物細胞。
（７） ヒト又はマウス由来の細胞である、（５）又は（６）に記載の動物細胞。
（８） （５）～（７）のいずれか一つに記載の動物細胞と、
前記動物細胞の染色体に挿入されているリコンビナーゼ認識配列を認識するリコンビナーゼと、
前記動物細胞の染色体に挿入されているリコンビナーゼ認識配列と同一のリコンビナーゼ認識配列を有するベクターと、
を備える、外来遺伝子挿入用キット。
（９） 外来遺伝子と、
前記外来遺伝子の上流及び下流に結合した、標的動物細胞のＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域と相同な配列を有する核酸と、
を含む、ベクター。
（１０） 前記外来遺伝子の上流に、配列番号１で表される配列と相同な配列を有する核酸が結合しており、且つ、前記外来遺伝子の下流に、配列番号２で表される配列と相同な配列を有する核酸が結合している、（９）に記載のベクター。
（１１） 配列番号３で表される塩基配列からなる核酸を含む、ガイドＲＮＡ。
（１２） 配列番号４で表される塩基配列からなる核酸を含む、ガイドＲＮＡ発現ベクター。

【発明の効果】

【0009】

上記態様の挿入方法、動物細胞、外来遺伝子挿入用キット、ベクター、ガイドＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ発現ベクターによれば、外来遺伝子の均一な発現を達成することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】実施例１におけるゼオシン耐性獲得用プラスミドの構成図である。

【図2】実施例１におけるＧＦＰ発現プラスミドの構成図である。

【図3】実施例１におけるゲノムウォーキング法により同定されたＸ染色体上の発現ユニットの挿入位置を示す図である。

【図4】実施例２におけるＧＦＰ発現ユニットの染色体上の挿入位置が異なるＭＩＮ６細胞の明視野像（左）及び蛍光像（右）である。

【図5】実施例３におけるＤｓＲｅｄ２発現プラスミドの構成図である。

【図6】実施例４におけるグルコキナーゼ発現プラスミドの構成図である。

【図7】実施例４におけるグルコキナーゼ発現ユニットの染色体上の挿入位置が異なるＭＩＮ６細胞でのインスリン分泌量を示すグラフである。

【図8】実施例５におけるドナープラスミド（ゼオシン発現プラスミド）及びガイドＲＮＡ発現プラスミドの構成図である。

【図9】実施例５におけるドナープラスミドに由来するＤＮＡ断片（ゼオシンのｃＤＮＡを含む）の染色体上の挿入位置を確認するためのプライマーの標的配列を示す図である。

【図10】実施例５におけるＧＦＰ発現プラスミドの構成図である。

【図11】実施例５におけるＧＦＰ発現ユニットがＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に挿入されたＭＩＮ６細胞の明視野像（左）及び蛍光像（右）である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

≪用語の定義≫
本明細書において、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に互換的に使用され、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチドポリマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせから構成されてもよい。また、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、天然ヌクレオチドのポリマーであってもよく、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチド（天然ヌクレオチドの類似体、塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分が修飾されているヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）等）とのポリマーであってもよく、非天然ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コードで記載される。特に明示しない限り、塩基配列は、５’側から３’側に向かって記載する。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」を構成するヌクレオチド残基は、単に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、又はウラシル等、あるいはそれらの１文字コードで記載される場合がある。

【0012】

本明細書において、「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子は、エクソン及びイントロンの両方を含み得る。

【0013】

本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、相互に互換的に使用され、アミド結合によって結合したアミノ酸のポリマーを指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」は、天然アミノ酸のポリマーであってもよく、天然アミノ酸と非天然アミノ酸（天然アミノ酸の化学的類似体、修飾誘導体等）とのポリマーであってもよく、非天然アミノ酸のポリマーであってもよい。特に明示しない限り、アミノ酸配列は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって記載する。

【0014】

本明細書において、「ゲノム編集」という用語は、ゲノム上の所望の位置（標的領域）に変異を誘導することを指す。ゲノム編集は、標的領域のＤＮＡを切断するように操作されたヌクレアーゼの使用を含み得る。典型的には、部位特異的ヌクレアーゼの使用により、標的領域のＤＮＡに二本鎖切断（ＤＳＢ）が誘導され、その後、相同組み換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）及び非相同末端再結合（Ｎｏｎ－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｎｄ－Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｒｅｐａｉｒ：ＮＨＥＪ）のような、細胞の内因性プロセスによってゲノムが修復される。ＮＨＥＪは、修復用鋳型ＤＮＡを用いずに二本鎖切断された末端を連結する修復方法であり、修復の際に挿入及び／又は欠失（ｉｎｄｅｌ）が高頻度で誘導される。ＨＤＲは、修復用鋳型ＤＮＡを用いた修復機構であり、標的領域に所望の変異を導入することも可能である。

【0015】

本明細書において、「ドナーベクター」という用語は、修復用鋳型ＤＮＡとして用いられる外来性ＤＮＡを指す。ドナーベクターは、ホモロジーアームとして標的領域に隣接する塩基配列を含む。本明細書においては、標的領域の５’側に隣接する塩基配列からなるホモロジーアームを「５’アーム」、標的配列の３’側に隣接する塩基配列からなるホモロジーアームを「３’アーム」と記載する場合がある。ドナーベクターは、５’アームと３’アームとの間に、所望の塩基配列を含むことができる。各ホモロジーアームの長さは、通常０．１ｋｂｐ～１０ｋｂｐ程度である。５’アーム及び３’アームの長さは、同じであってもよく、異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。

【0016】

本明細書において、「Ｃａｓタンパク質」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質を指す。好ましい態様において、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、エンドヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を示す。Ｃａｓタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、及びＣ２ｃ３タンパク質等が挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと協働してエンドヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を示す限り、野生型Ｃａｓタンパク質及びそのホモログ（パラログ及びオーソログ）、並びにそれらの変異体を包含する。
好ましい態様において、Ｃａｓタンパク質は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するものであり、より好ましくはＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するものである。Ｃａｓタンパク質の好ましい例としては、Ｃａｓ９タンパク質が例示される。

【0017】

本明細書において、「Ｃａｓ９タンパク質」という用語は、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するＣａｓタンパク質を指す。Ｃａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、ガイドＲＮＡと協働して標的領域のＤＮＡを切断する活性を示す。Ｃａｓ９タンパク質は、前記の活性を有する限り、野生型Ｃａｓ９タンパク質及びそのホモログ（パラログ及びオーソログ）、並びにそれらの変異体を包含する。野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼドメインとしてＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインを有するが、本明細書におけるＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインのいずれか一方が不活性化されたものであってもよい。
Ｃａｓ９タンパク質が由来する生物種は特に限定されないが、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、又はトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属に属する細菌等が好ましく例示される。より具体的には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、又はＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ等に由来するＣａｓ９タンパク質が好ましく例示される。好ましい態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質である。

【0018】

各種Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列、及びそのコード配列の情報は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ等の各種データベース上で得ることができる。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２としてＵｎｉＰｒｏｔに登録されたもの等を用いることができる。

【0019】

本明細書において、「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、相互に互換的に使用され、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質を標的領域に誘導することができるＲＮＡを指す。好ましい態様において、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、ゲノム上の標的領域への結合に関与し、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質との結合に関与する。好ましい態様において、ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列とリピート配列とを含み、スペーサー配列が標的領域において標的配列の相補鎖と結合する。好ましい態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、アンチリピート配列と３’テイル配列とを含む。アンチリピート配列はｃｒＲＮＡのリピート配列と相補的な配列を有し、リピート配列と塩基対を形成し、３’テイル配列は通常３つのステムループを形成する。
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端にｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端を連結した単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよく、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを別々のＲＮＡ分子とし、リピート配列及びアンチリピート配列で塩基対を形成させたものであってもよい。

【0020】

本明細書において、「標的配列」という用語は、Ｃａｓタンパク質による切断の対象となるゲノム中のＤＮＡ配列を指す。Ｃａｓタンパク質としてＣａｓ９タンパク質を用いる場合、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’側に隣接する配列である必要がある。標的配列は、通常、ＰＡＭの５’側直前に隣接する１７～３０塩基（好ましくは１８～２５塩基、より好ましくは１９～２２塩基、さらに好ましくは２０塩基）の配列が選択される。標的配列の設計には、ＣＲＩＳＰＲ ＤＥＳＩＧＮ（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）等の公知のデザインツールを利用することができる。

【0021】

本明細書において、「プロトスペーサー隣接モチーフ」及び「ＰＡＭ」という用語は、相互に互換的に使用され、Ｃａｓタンパク質によるＤＮＡ切断の際に、Ｃａｓタンパク質に認識される配列を指す。ＰＡＭの配列及び位置は、Ｃａｓタンパク質の種類によって異なる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質の場合、ＰＡＭは標的配列の３’側直後に隣接する必要がある。Ｃａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭの配列は、Ｃａｓ９タンパク質が由来する細菌種によって異なっている。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＧＧ」であり、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＡＧＡＡ」であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＧＲＲＴ」又は「ＮＮＧＲＲ（Ｎ）」であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＮＮＧＡＴＴ」であり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａのＣａｓ９タンパク質に対応する「ＮＡＡＡＡＣ」である（「Ｒ」はＡ又はＧ；「Ｎ」は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）。

【0022】

本明細書において、「発現可能な状態」という用語は、ポリヌクレオチドが導入された細胞内で、該ポリヌクレオチドが転写され得る状態にあることを指す。
本明細書において、「発現ベクター」という用語は、対象ポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ベクターを導入した細胞内で、対象ポリヌクレオチドを発現可能な状態にするシステムを備えたベクターを指す。例えば、「Ｃａｓタンパク質の発現ベクター」とは、該ベクターを導入した細胞内で、Ｃａｓタンパク質を発現可能なベクターを意味する。また、例えば、「ガイドＲＮＡの発現ベクター」とは、該ベクターを導入した細胞内で、ガイドＲＮＡを発現可能なベクターを意味する。

【0023】

≪動物細胞の染色体上への外来遺伝子の挿入方法≫
本発明の一実施形態に係る動物細胞の染色体上への外来遺伝子の挿入方法（以下、単に「本実施形態の挿入方法」と称する場合がある）は、動物細胞のＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に外来遺伝子を挿入する工程を含む。

【0024】

発明者らは、マウス由来のインスリン分泌細胞株であるＭＩＮ６細胞を用いた実験系において、外来遺伝子が均一に発現することができる染色体上の挿入位置として、Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の転写開始点から１０．６ｋｂｐ程度上流の位置を同定し、本発明を完成するに至った。すなわち、発明者らによって同定されたＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域の挿入位置は、新規のセーフハーバー遺伝子座ということもできる。
本実施形態の挿入方法によれば、後述する実施例に示すように、インビトロ条件下で、染色体上に組み込まれた外来遺伝子を均一に発現することができる。
なお、ここでいう「外来遺伝子を均一に発現する」とは、外来遺伝子が染色体上に組み込まれた細胞において、細胞間での外来遺伝子の発現量にばらつきがなく、当該外来遺伝子を発現することを意味する。

【0025】

以下、本実施形態の挿入方法の各工程について詳細を説明する。

【0026】

＜挿入工程＞
挿入工程では、動物細胞のＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に外来遺伝子を挿入する。

【0027】

Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域とは、Ｚｘｄｂ遺伝子とその上流に存在するＧｓｐｔ２遺伝子の間の領域、具体的には、Ｚｘｄｂ遺伝子の転写開始点から１ｂｐ～８６ｋｂｐ上流の領域を意味する。中でも、外来遺伝子の挿入位置としては、Ｚｘｄｂ遺伝子の転写開始点から１～５０ｋｂｐ上流の領域であることが好ましく、Ｚｘｄｂ遺伝子の転写開始点から５～１５ｋｂｐ上流の領域であることがより好ましく、９～１１ｋｂｐ上流の領域であることがさらに好ましく、１０～１０．８ｋｂｐ上流の領域であることがよりさらに好ましく、１０．５～１０．７ｋｂｐ上流の領域であることが特に好ましく、１０．６ｋｂｐ上流の領域であることが最も好ましい。

【0028】

なお、Ｚｘｄｂ遺伝子の塩基配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ等の各種データベース上で得ることができる。例えば、マウスＺｘｄｂ遺伝子の塩基配列情報は、アクセッション番号ＮＣ＿００００８６．８としてＧｅｎＢａｎｋに登録されたもの等を用いることができる。マウスＺｘｄｂ遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列情報は、ＮＭ＿００１０８１４７３．１としてＧｅｎＢａｎｋに登録されたもの等を用いることができる。マウスＺｘｄｂ遺伝子の塩基配列情報と、マウスＺｘｄｂ遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列情報とを照らし合わせることで、転写開始点を確認し、当該転写開始点の上流領域を外来遺伝子の挿入位置として利用することができる。
また、ヒトＺｘｄｂ遺伝子の塩基配列情報は、アクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１としてＧｅｎＢａｎｋに登録されたもの等を用いることができる。ヒトＺｘｄｂ遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列情報は、ＮＭ＿００７１５７．４としてＧｅｎＢａｎｋに登録されたもの等を用いることができる。ヒトＺｘｄｂ遺伝子の塩基配列情報と、ヒトＺｘｄｂ遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列情報とを照らし合わせることで、転写開始点を確認し、当該転写開始点の上流領域を外来遺伝子の挿入位置として利用することができる。

【0029】

また、Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域の塩基配列の動物種間での配列同一性（又は相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く、塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。また、上記方法を用いて、マウスにおけるＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の転写開始点から１０．６ｋｂｐ程度上流の位置に相当する、他の動物種における位置を特定することができる。

【0030】

［動物細胞］
動物細胞の由来となる動物種としては、Ｘ染色体上にＺｘｄｂ遺伝子を有する動物種であればよいが、中でも、哺乳類動物が好ましい。哺乳類動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、マーモセット、ニワトリ、ヒツジ、ヤギ等が挙げられる。中でも、哺乳類動物としては、ヒト又はマウスが好ましい。すなわち、本実施形態の挿入方法で使用する動物細胞としては、ヒト又はマウスに由来する細胞であることが好ましい。

【0031】

細胞の種類としては、特に限定されないが、各種組織由来又は各種性質の細胞、具体的には、例えば、血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（卵子）、受精卵、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、組織幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、がん細胞等が挙げられる。また、例えば、１型又は２型糖尿病患者由来のβ細胞等、各種疾患を有する細胞等が挙げられる。

【0032】

［外来遺伝子］
外来遺伝子としては、特に限定されず、細胞の染色体上に組み込んで発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。
例えば、後述する実施例に示すように、グルコキナーゼ遺伝子（グルコキナーゼのｃＤＮＡ）をマウス由来のインスリン分泌細胞株であるＭＩＮ６細胞に挿入することで、インスリン分泌能が増強された細胞を得ることができる。

【0033】

外来遺伝子の大きさとしては、挿入効率及び挿入された外来遺伝子の確認しやすさの観点から、０．１ｋｂｐ以上１０ｋｂｐ以下が、０．１ｋｂｐ以上１０ｋｂｐ以下がより好ましく、０．１ｋｂｐ以上８ｋｂｐ以下がさらに好ましく、０．１ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下が特に好ましい。

【0034】

外来遺伝子は、機能的遺伝子配列からなるものであるが、さらに、プロモーター配列、転写終結配列、マーカー遺伝子、タグ配列、及びリコンビナーゼ認識配列からなる群より選ばれる１種以上が付加されていてもよい。

【0035】

プロモーター配列としては、特に限定されず、例えば、ｐｏｌ ＩＩ系プロモーターを各種使用することができる。ｐｏｌ ＩＩ系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、βアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢｈプロモーター等が挙げられる。

【0036】

「マーカー遺伝子」とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子を指す。マーカー遺伝子の具体例としては、例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ヒスティディノール耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等が挙げられる。蛍光タンパク質遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子等が挙げられる。発光酵素遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。発色酵素遺伝子としては、例えば、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が挙げられる。

【0037】

タグ配列としては、例えば、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。

【0038】

外来遺伝子はベクターの形で用いてもよい。
ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。

【0039】

ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクター等が挙げられる。

【0040】

プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＤｒｉｖｅ、ｐＸ４５９、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0041】

中でも、プラスミドベクターであることが好ましい。

【0042】

また、外来遺伝子はその上流及び下流に、Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域と相同な配列を有する任意の長さの核酸（ホモロジーアーム）が結合したドナーベクターの形態であることが好ましい。すなわち、外来遺伝子と、前記外来遺伝子の上流及び下流に結合した、標的動物細胞のＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域と相同な配列を有する核酸（ホモロジーアーム）と、を含むベクターであることが好ましい。

【0043】

外来遺伝子の上流に結合する５’アームとしては、配列番号１で表される配列と相同な配列を有する核酸であることが好ましい。
外来遺伝子の上流に結合する３’アームとしては、配列番号２で表される配列と相同な配列を有する核酸であることが好ましい。

【0044】

ドナーベクターは、環状ＤＮＡベクター（例えばプラスミドベクター）であってもよく、線状ＤＮＡベクターであってもよい。

【0045】

［挿入方法］
外来遺伝子は、公知のゲノム編集技術を用いて挿入することができる。

【0046】

公知のゲノム編集技術としては、ＨＤＲを誘発するゲノム編集技術であればよく、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステムが使用できる。このうちＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いることが好ましい。

【0047】

（ＴＡＬＥＮシステム）
ＴＡＬＥＮシステムは、Transcription activator-like effector nuclease（ＴＡＬＥＮ）を用いるシステムであり、ＴＡＬＥＮはカスタム化された結合ドメインと非特異的なＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとを融合させたものである。ＤＮＡ結合ドメインは、キサントモナスのプロテオバクテリアが分泌し宿主植物の遺伝子転写を変えさせる蛋白であるtranscription activator-like effectors（ＴＡＬＥ）由来の保存されたリピートからなっている。ＴＡＬＥＮシステムにより、外来遺伝子をゲノムの目的部位に挿入するには、ゲノム中の挿入部位に対するＴＡＬＥＮを作製し、外来遺伝子を有し、且つ、挿入部位周辺に相同性をもつドナーベクターを作製する。ＴＡＬＥＮ及びドナーベクターを共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したＨＤＲにより、目的外来ＤＮＡが導入される。外来遺伝子に薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択により外来遺伝子導入が起きた細胞を効率よく選択できる。

【0048】

（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム）
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、細菌や古細菌が有する、外部から侵入した核酸（ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ）に対する一種の獲得免疫として機能する座位を利用したシステムである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムにより、外来遺伝子をゲノムの目的部位に挿入するには、目的部位にＣａｓ９を誘導するガイドＲＮＡ又はその発現ベクター及びＣａｓ９又はその発現ベクターが必要である。

【0049】

ガイドＲＮＡとしては、Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域の配列から適宜標的配列を設定して、当該標的配列に相補的な配列を含む核酸として公知の方法を用いて設計することができる。中でも、ガイドＲＮＡとしては、配列番号３で表される塩基配列からなる核酸を含むものであることが好ましい。配列番号３で表される塩基配列は、Ｚｘｄｂ遺伝子の転写開始点から１０，６０４～１０，６２３ｂｐ上流の領域を標的配列として、当該標的配列に相補的な配列である。

【0050】

ガイドＲＮＡが発現ベクターの形態である場合には、当該発現ベクターは、ガイドＲＮＡをコードする配列と、前記ガイドＲＮＡをコードする配列の発現を制御するプロモーターを含んでいることが好ましい。発現ベクターにおいて、ガイドＲＮＡコード配列は、プロモーターに機能的に連結している。

【0051】

プロモーターは、特に限定されず、例えば、ｐｏｌ ＩＩ系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いＲＮＡの転写をより正確に行わせるという観点から、ｐｏｌ ＩＩＩ系プロモーターが好ましい。ｐｏｌ ＩＩＩ系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばマウス及びヒトのＵ６－ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトＨ１－ＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡプロモーター、ヒトバリン－ｔＲＮＡプロモーター等が挙げられる。Ｕ６プロモーターを用いる場合、転写開始のためにガイドＲＮＡの５’末端が「Ｇ」であることが好ましい。

【0052】

発現ベクターは、ガイドＲＮＡのコード配列及びプロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子等を含んでいてもよい。

【0053】

発現ベクターの種類は、特に限定されず、公知の発現ベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、及びウイルスベクター等が挙げられる。プラスミドベクター、及びウイルスベクターとしては、上記「外来遺伝子」において例示されたものと同様のものが挙げられる。

【0054】

好ましい発現ベクターとしては、配列番号４で表される塩基配列からなる核酸を含む、ガイドＲＮＡ発現ベクター等が挙げられる。配列番号４で表される塩基配列は、Ｚｘｄｂ遺伝子の転写開始点から１０，６０４～１０，６２３ｂｐ上流の領域の配列である。

【0055】

Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いられるものであれば、特に限定されない。例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、ガイドＲＮＡにより標的領域に誘導されて、標的領域のＤＮＡを２本鎖切断できるものを各種使用することができる。

【0056】

Ｃａｓタンパク質に代えて、Ｃａｓタンパク質の発現ベクターを用いてもよい。
Ｃａｓタンパク質の発現ベクターは、Ｃａｓタンパク質のコード配列と、前記Ｃａｓタンパク質コード配列の発現を制御するプロモーターを含んでいることが好ましい。発現ベクターにおいて、Ｃａｓタンパク質コード配列は、プロモーターに機能的に連結している。
プロモーターとしては、上記「外来遺伝子」において例示されたものと同様のものが挙げられる。

【0057】

発現ベクターは、Ｃａｓタンパク質コード配列及びプロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子等を含んでいてもよい。

【0058】

発現ベクターの種類は、特に限定されず、公知の発現ベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、及びウイルスベクター等が挙げられる。プラスミドベクター、及びウイルスベクターとしては、上記「外来遺伝子」において例示されたものと同様のものが挙げられる。

【0059】

発現ベクターに含まれるＣａｓタンパク質コード配列は、当該発現ベクターを導入する細胞が由来する生物種に応じて、コドン最適化されていてもよい。一般に、コドン最適化とは、元のアミノ酸配列を維持しつつ、元の塩基配列の少なくとも１つのコドンを、対象の生物種においてより頻繁に使用されるコドンで置き換えることを指す。コドン使用頻度表は、例えば、公益財団法人かずさＤＮＡ研究所が提供する「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）において容易に入手可能であり、これらの表を用いて、コドンを最適化することができる。特定の動物種における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムについても、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ社；Ｊａｃｏｂｕｓ、ＰＡ）等において入手可能である。

【0060】

ガイドＲＮＡの発現ベクターと、Ｃａｓタンパク質の発現ベクターとは、同一の発現ベクターであってもよい。すなわち、本実施形態の挿入方法では、ガイドＲＮＡコード配列と、Ｃａｓタンパク質コード配列とを、それぞれ発現可能な状態で含む発現ベクターを用いることができる。当該発現ベクターにおいて、ガイドＲＮＡコード配列と、Ｃａｓタンパク質コード配列とは、それぞれ異なるプロモーターに機能的に連結されていることが好ましい。

【0061】

外来遺伝子を有し、且つ、挿入部位周辺に相同性をもつドナーベクターを、上記ガイドＲＮＡ又はその発現ベクター及び上記Ｃａｓ９又はその発現ベクターと共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したＨＤＲにより、目的外来遺伝子が導入される。外来遺伝子に薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択により外来遺伝子導入が起きた細胞を効率よく選択できる。

【0062】

なお、上記外来遺伝子を有するドナーベクターと、上記ガイドＲＮＡ又はその発現ベクター及び上記Ｃａｓ９又はその発現ベクターと、を外来遺伝子挿入用キットとすることができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記外来遺伝子を有するドナーベクターと、上記ガイドＲＮＡ又はその発現ベクターと、上記Ｃａｓ９又はその発現ベクターと、を備える外来遺伝子挿入用キットを提供する。

【0063】

（Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム）
Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムは、ＺｎフィンガードメインとＤＮＡ切断ドメインからなる人工制限酵素を用いたゲノム編集である。一つのＺｎフィンガードメインは３塩基を認識するが、３～５つのＺｎフィンガードメインを連結させることで、特定の９～１５塩基配列を認識するＤＮＡ結合タンパク質を設計できる。このＤＮＡ結合タンパク質に、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを融合させることで、目的部位を切断する人工ヌクレアーゼＺＦＮを設計する。ＺＦＮシステムにより、前記プラスミドをゲノムの目的部位に挿入するには、ゲノム中の挿入部位に対するＺＦＮを作製し、挿入部位周辺に相同性をもつドナーベクターを作製する。これらベクターを共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したＨＤＲにより、目的外来ＤＮＡが導入される。外来ＤＮＡに薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択により外来ＤＮＡ導入が起きた細胞を効率よく選択できる。

【0064】

外来遺伝子や、上述した公知のゲノム編集技術のツールを細胞内に導入する方法としては、対象細胞、材料の種類（核酸であるのか、タンパク質であるのか等）に応じて、適宜選択することができる。

【0065】

ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。ベクターがウイルスベクターである場合に、ウイルスベクターを細胞に感染させる方法としては、例えば、ポリブレン法が挙げられる。

【0066】

ＲＮＡを細胞に導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、ＲＮＡは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等の、市販のＲＮＡトランスフェクション試薬等を用いることができる。

【0067】

タンパク質を細胞に導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。

【0068】

外来遺伝子や、上述した公知のゲノム編集技術のツールは、同時に細胞に導入してもよく、逐次的に導入してもよく、又は一定期間を空けて別々に導入してもよい。中でも、これら全てを同時に細胞に導入することが好ましい。

【0069】

＜任意の工程＞
［培養工程］
本実施形態の挿入方法は、挿入工程の後、具体的には、外来遺伝子、及び上述した公知のゲノム編集技術のツールを細胞に導入後に、細胞を培養する培養工程を更に含んでもよい。

【0070】

細胞の培養は、細胞の種類に応じて、適切な培養条件下で行えばよい。外来遺伝子が、薬剤耐性マーカーを含むベクターである場合には、培養は、当該薬剤の存在下で行ってもよい。当該薬剤の存在下で培養を行うことにより、ゲノム編集された細胞を効率よく選択することができる。また、細胞培養液の希釈又はプレーティング等により、細胞のクローン化を行ってもよい。

【0071】

［解析工程］
本実施形態の挿入方法は、挿入工程の後、具体的には、外来遺伝子、及び上述した公知のゲノム編集技術のツールを細胞に導入後に、細胞のＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に外来遺伝子が挿入されていることを解析する解析工程を更に含んでもよい。

【0072】

解析方法は特に限定されないが、上記挿入工程後、例えば、適宜、培養工程を行った後、細胞培養液のプレーティングを行い、生じたコロニーからＤＮＡを抽出してＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域の配列解析を行う方法等が挙げられる。

【0073】

≪動物細胞≫
本実施形態の動物細胞は、Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に、リコンビナーゼ認識配列が挿入されている。

【0074】

リコンビナーゼ認識配列の挿入位置としては、上記実施形態の挿入方法において外来遺伝子の挿入位置として例示された位置と同様の位置である。

【0075】

動物細胞の由来となる動物種及び細胞の種類としては、上記実施形態の挿入方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。

【0076】

本実施形態の動物細胞は、上記実施形態の挿入方法において外来遺伝子をリコンビナーゼ認識配列に置き換えることで、上記実施形態の挿入方法を用いて作製することができる。

【0077】

また、本実施形態の動物細胞は、Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域において、リコンビナーゼ認識配列に挟まれた外来遺伝子が挿入されていてもよい。外来遺伝子としては、上記実施形態の挿入方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。

【0078】

＜リコンビナーゼ認識配列＞
本明細書において、「リコンビナーゼ認識配列」とは、特定のリコンビナーゼがリコンビナーゼ認識配列を認識し、その部分でＤＮＡの組換えを起こす現象を利用した、いわゆるリコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列システムにおけるリコンビナーゼ認識配列を意味する。また、本明細書において、用語「塩基配列」は、当該塩基配列からなる核酸を意味する場合がある。

【0079】

リコンビナーゼ／リコンビナーゼ認識配列システムとしては、例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビナーゼと、Ｃｒｅリコンビナーゼが認識する３４塩基対のｌｏｘＰ配列を利用したＣｒｅ／ｌｏｘＰシステム、酵母由来のＦＬＰリコンビナーゼと、ＦＬＰリコンビナーゼが認識するＦＲＴ配列を利用したＦＬＰ／ＦＲＴシステム、ジゴサッカロマイセス・ロキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）由来のＲリコンビナーゼと、Ｒリコンビナーゼが認識するＲＳ配列を利用したＲ／ＲＳシステム等が挙げられる。したがって、本実施形態の製造方法で用いるリコンビナーゼ認識配列としては、ＦＲＴ配列、ｌｏｘＰ配列、ＲＳ配列等が挙げられる。中でも、リコンビナーゼ認識配列としては、ＦＲＴ配列、又はｌｏｘＰ配列が好ましい。

【0080】

ＦＲＴ配列としては、例えば、５’－ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＧＡＡＡＧ
ＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ－３’（配列番号５）等の塩基配列を使用することができる。

【0081】

ｌｏｘＰ配列としては、５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３’（配列番号６）で表される塩基配列のほか、例えば、Siegel R. W., et al., Using an in vivo phagemid system to identify non-compatible loxP sequences, FEBS Lett., 505, 467-473, 2001.に記載された、５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＴＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３’（ｌｏｘ５１１、配列番号７）、５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＧＡＴＡＣＴＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３’（ｌｏｘ２２７２、配列番号８）、５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３’（ｌｏｘＦＡＳ、配列番号９）等の変異ｌｏｘ
Ｐ配列等を使用することができる。

【0082】

ＲＳ配列としては、例えば、５’－ＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＡ－３’（配列番号１０）等の塩基配列を使用することができる。

【0083】

ゲノム上にリコンビナーゼ認識配列が存在しても、特定のリコンビナーゼが存在しない限り組換えは起きない。したがって、リコンビナーゼを時期特異的又は組織特異的に発現させることで、リコンビナーゼによる組換えを時期特異的又は組織特異的に生じさせることができる。

【0084】

≪外来遺伝子挿入用キット≫
本実施形態の外来遺伝子挿入用キット（以下、単に「本実施形態のキット」と称する場合がある）は、以下を備える。
上記実施形態の動物細胞；
前記動物細胞の染色体に挿入されているリコンビナーゼ認識配列を認識するリコンビナーゼ；
前記動物細胞の染色体に挿入されているリコンビナーゼ認識配列と同一のリコンビナーゼ認識配列を有するベクター。

【0085】

本実施形態のキットにおいて、リコンビナーゼとリコンビナーゼ認識配列の組み合わせは、上記実施形態の動物細胞において例示された組み合わせと同様のものが挙げられる。

【0086】

リコンビナーゼは、発現ベクターに組み込まれた形態であってもよい。発現ベクターとしては、上記実施形態の挿入方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。

【0087】

前記動物細胞の染色体に挿入されているリコンビナーゼ認識配列と同一のリコンビナーゼ認識配列を有するベクターは、リコンビナーゼ認識配列に挟まれた外来遺伝子が挿入されていてもよい。外来遺伝子としては、上記実施形態の挿入方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。

【0088】

本実施形態のキットによれば、後述する実施例に示すように、リコンビナーゼ媒介カセット交換（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ）法により、所望の外来遺伝子を動物細胞のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に容易に挿入し得るシステムを提供することができる。

【実施例0089】

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0090】

［材料及び方法］
（ＭＩＮ６細胞の培養）
マウス由来インスリン分泌細胞株であるＭＩＮ６細胞は１５ｗ／ｖ％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社製)を用いて、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。

【0091】

（プラスミドの構築）
制限酵素、Ｑｕｉｃｋ Ｂｌｕｎｔｉｎｇキット、Ｏｎｅ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｊａｐａｎ社、Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｄｅｐｈｏｓ＆Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔは、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｊａｐａｎ社、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９は、東洋紡社より購入した。

【0092】

染色体に組込まれ、任意の発現ユニットを受け取るアクセプターを構築するために、野生型ＦＲＴ配列（ＦＲＴｗ）及び変異型ＦＲＴ配列（ＦＲＴｍ）をもつ２つのオリゴヌクレオチド（ＦＲＴｍＦＲＴｗ－ＦとＦＲＴｍＦＲＴｗ－Ｒ）を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ社に合成委託し、ＰＣＲを行った。

【0093】

ＦＲＴｍＦＲＴｗ－Ｆ：
5’-GAGCTCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTTCAAATAGTATAGGAACTTCAAGCTTCCGAATTCAACTGCA-3’（配列番号１１）
ＦＲＴｍＦＲＴｗ－Ｒ：
5’-GGTACCGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCTGCAGTTGAATTCGGAAGCT-3’（配列番号１２）

【0094】

この２つのオリゴヌクレオチドは、各々の３’側が相補的になっており、互いにアニールしてＰＣＲで増幅することにより、ＳａｃＩ－ＦＲＴｍ－ＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩ－ＰｓｔＩ－ｒｅｖｅｒｓｅｄ ＦＲＴｗ－ＫｐｎＩ（ＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ等は、それぞれＳａｃＩ制限酵素認識配列、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列を表す)という構成をもつ１３０ｂｐｓの２本鎖ＤＮＡとなるように設計した。５１℃にてＰＣＲを行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。さらに、ウサギβ－グロブリンスプライスアクセプターサイト（ＳＡ）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのポリＡシグナル領域はｐＣＡＧＧＳ、ゼオシン耐性遺伝子はｐＦｌｉｐ－ｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製)から使用した。これらにより作製されたＤＮＡ（以下、「発現ユニット」と称する場合がある）をｐＺＤｍＲ２６プラスミドのＲｏｓａ２６遺伝子座の左右ホモロジーアームの間に組込み、プラスミドを構築した。発現ユニットが染色体に組込まれ、ＳＡでいずれかのプロモーターにより転写されているｍＲＮＡを受け取るとゼオシン耐性を獲得する。

【0095】

リコンビナーゼ媒介カセット交換のためのドナープラスミドも同様に作製した。ゼオシンの代わりにブラストサイジンのｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ６（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製)から取り出し、用いた。さらに、ＴＲＥ３Ｇプロモーターの下流にＧＦＰを発現するユニットを接続した。ＴＲＥ３Ｇプロモーターは、ｐＴＲＥ３Ｇベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ウサギβ－グロブリンポリＡ領域は、ｐＣＡＧＧＳから取り出して、ＧＦＰ発現プラスミドを構築した。ＧＦＰはＳａｌＩ－ＥｃｏＲＩで切り出し、任意のｃＤＮＡと置き換えることができる。
さらにもう一種類のドナープラスミドを同様に作製し、ＤｓＲｅｄ２発現プラスミドと名付けた。このドナープラスミドにより、ＤＮＡが正しく挿入されると、ハイグロマイシン耐性となり、またドキシサイクリン添加でＤｓＲｅｄ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）により細胞が赤く光る。
さらにもう一種類のドナープラスミドを同様に作製し、グルコキナーゼ発現プラスミドと名付けた。このドナープラスミドにより、ＤＮＡが正しく挿入されると、ブラストサイジン耐性となり、またドキシサイクリン添加でβ細胞型グルコキナーゼ（ＭＩＮ６ｃ４細胞のｍＲＮＡからクローニング）のｍＲＮＡが発現する。

【0096】

（エレクトロポレーション法による遺伝子導入）
ＭＩＮ６細胞をトリプシンＥＤＴＡではがし、細胞数を算定した後、２×１０^６を遠心にて集めた。Ｎｕｃｒｅｏｆｅｃｔｏｒ(Ｌｏｎｚａ Ｊａｐａｎ社製）に供給されているｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖを１００μＬとり、細胞を浮遊させ、１０μｇのプラスミドやｍＲＮＡの混合物を加え、キュベットに注入した。Ｎｕｃｒｅｏｆｅｃｔｏｒの設定Ｇ－０１６でＤＮＡを導入した。細胞をＤＭＥＭに浮遊させ、５日目から抗生物質にて選別した。

【0097】

（インスリン分泌試験）
２×１０^５のＭＩＮ６細胞を２４ウェルプレートの１ウェルごとに播き、４８時間後にドキシサイクリンを最終濃度１μｇ／ｍＬになるように加え、さらに４８時間後にインスリン分泌実験を行った。Ｋｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＫＲＢ：Ｎａ^＋ １４４ｍＭ、ＨＣＯ_３ ^－ ２５ｍＭ、Ｃａ^２＋ １．５ｍＭ、ｐＨ７．４）に０．１ｗ／ｖ％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を加えて、分泌実験溶液とし、１Ｍ グルコース溶液を適当量加えて、５ｍＭ及び１２．５ｍＭグルコース溶液を作製した。各ウェルから培養液を吸引し、ＫＲＢ ｂｕｆｆｅｒで一度洗浄後、５ｍＭグルコース溶液にて３０分間、３７℃で培養後、１２．５ｍＭグルコース溶液に置換し、６０分間、３７℃で培養した。インスリン濃度は、マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｓｈｉｂａｙａｇｉ社製）で測定した。

【0098】

［実施例１］
（染色体上の挿入位置の解析）
効率的に遺伝子導入インスリン分泌細胞株を作製する方法の開発することを目的として、導入したい遺伝子が染色体上の特定の位置に挿入されるように、マウス由来のインスリン分泌細胞株であるＭＩＮ６細胞の染色体に、アクセプター配列を設置した。アクセプター配列には、ＦＲＴ配列が含まれ、Ｆｌｉｐ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｆｌｉｐ）の存在下で、同様のＦＲＴ配列をもつドナープラスミドとＤＮＡ交換が可能である。
まず、染色体のＲｏｓａ２６遺伝子座を挿入位置に選択し、アクセプター配列を挿入し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むプラスミドとＦｌｉｐを発現するプラスミドを導入して交換反応を起こさせた。交換反応は成功したと考えられたが、ＧＦＰの発現が細胞ごとに異なるモザイク状で、平均的発現レベルも高くないと推定された。そこで、染色体の任意の位置に挿入し、転写活性の高い染色体の位置に挿入され、交換反応後のＧＦＰの発現が高くなったクローンを選択してくる方法を検討した。具体的な方法を以下に示す。

【0099】

図１に示すプラスミドベクターにおいて、アクセプター配列に挟まれており、プロモーターをもたない発現ユニットを制限酵素を用いて切り出し、５μｇの発現ユニットのＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法によりＭＩＮ６細胞に導入し、ランダムにゲノム上に挿入した。

【0100】

細胞導入から４日目にゼオシン２００μｇ／ｍＬまあは４００μｇ／ｍＬで選別を開始した。ゼオシン耐性となったクローンには、発現ユニットが１コピー挿入されているものもあれば、数コピー又は数十コピー導入されているものもあると考えられる。この場合、複数コピー挿入されている場合でも多くの場合、染色体の同一箇所に縦にならんで挿入されることが多く、異なる染色体上の位置に挿入されることは少ない。そこで、これらのゼオシン耐性クローンとなった、すなわち発現ユニットが挿入された細胞に、ブラストサイジン耐性遺伝子を含む発現ユニットとリコンビナーゼ媒介カセット交換を起こさせる場合、うまく交換が起こった細胞では、１コピー或いは一か所に数コピーのみで、それらが交換したと考えられると仮定し、ゼオシン耐性クローンのプールに対し、ＧＦＰ発現プラスミド（図２参照）及びｐＣＡＧ－Ｆｌｐｅプラスミドをエレクトロポレーション法によりＭＩＮ６細胞に導入した。細胞導入から３週間、ブラストサイジン２．５μｇ／ｍＬで選別した。

【0101】

その結果、ブラストサイジン耐性となった３４個のクローンが得られた。そのうち２９クローンは、ゼオシン感受性であり、またドキシサイクリン添加による誘導でＧＦＰの発現が認められた。また、５クローンはゼオシンにも耐性で、うち３クローンはＧＦＰの発現が認められ、２クローンでは認められなかった。

【0102】

２９クローンのうち、発現レベルが均一でまた、発現強度が高い上位４クローンについてゲノムウォーキングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ ６３６４０５、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ^ＴＭ ２．０）を用いて、発現ユニットの挿入位置を同定した。

【0103】

その結果、３クローンについては遺伝子の途中に発現ユニットが挿入されていた。一方、１クローンは、Ｘ染色体上の９４，７１３，９４７番目の位置、すなわち、Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の転写開始点から１０，６２２ｂｐ（約１０．６ｋｂｐ）上流の位置であることが明らかとなった（図３参照）。

【0104】

［実施例２］
（挿入位置の違いによるＧＦＰ発現の比較）
実施例１で得られたＧＦＰ遺伝子を含む発現ユニットがＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の転写開始点から約１０ｋｂｐ上流の位置に挿入されたＭＩＮ６細胞と、ＧＦＰ遺伝子を含む発現ユニットがＲｏｓａ２６遺伝子座に挿入されたＭＩＮ６細胞を顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｄｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－Ｘ７１０、拡大倍率：１００倍）で観察し、比較した。結果を図４に示す。

【0105】

図４に示すように、Ｘ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域にＧＦＰ遺伝子を含む発現ユニットが挿入されたＭＩＮ６細胞では、Ｒｏｓａ２６遺伝子座に挿入されたＭＩＮ６細胞よりも、ＧＦＰの発現レベルが均一であり、且つ、発現強度が高いことが確認された。

【0106】

［実施例３］
（リコンビナーゼ媒介カセット交換法による発現ユニットの交換）
実施例１で得られたＧＦＰ遺伝子を含む発現ユニットがＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に挿入されたＭＩＮ６細胞に、ＤｓＲｅｄ２発現プラスミド（図５参照）及びｐＣＡＧ－Ｆｌｐｅプラスミドをエレクトロポレーション法により導入し、リコンビナーゼ媒介カセット交換を起こさせた。細胞導入から３週間、ハイグロマイシン２００μｇ／ｍＬで選別した。

【0107】

その結果、ハイグロマイシン耐性となったクローンが得られた。これらクローンについて、ドキシサイクリン添加による誘導でＤｓＲｅｄ２の発現が認められた（図示せず）。

【0108】

［実施例４］
（インスリン高分泌細胞の構築）
実施例２で得られたＤｓＲｅｄ２遺伝子を含む発現ユニットがＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に挿入されたＭＩＮ６細胞に、グルコキナーゼ発現プラスミド（図６参照）及びｐＣＡＧ－Ｆｌｐｅプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、♯１３７８７）をエレクトロポレーション法により導入し、リコンビナーゼ媒介カセット交換を起こさせた。細胞導入から３週間、ブラストサイジン２．５μｇ／ｍＬで選別した。

【0109】

その結果、ブラストサイジン耐性となったクローンが得られた。これらクローンについて、ドキシサイクリン添加による誘導でグルコキナーゼの発現を誘導し、インスリン分泌試験を行った。結果を図７に示す。

【0110】

図７に示すように、グルコキナーゼ遺伝子を含む発現ユニットがＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に挿入されたＭＩＮ６細胞では、グルコキナーゼ遺伝子が導入されていないＭＩＮ６細胞及びグルコキナーゼ遺伝子を含む発現ユニットがＲｏｓａ２６遺伝子座に挿入されたＭＩＮ６細胞よりも、インスリンの分泌量が有意に多かった。

【0111】

［実施例５］
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた染色体への挿入）
Ｃａｓ９発現プラスミド４．０μｇ、ドナープラスミド（図８参照）３．５μｇ及びガイドＲＮＡ発現プラスミド（図８参照）２．５μｇを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ社製）を用いてエレクトロポレーション法によりＭＩＮ６細胞に導入し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、ドナープラスミドに由来するＤＮＡ断片（ゼオシンのｃＤＮＡを含む領域）をＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に挿入した。なお、ドナープラスミドの全長塩基配列を配列番号１３に、ドナープラスミド中のＬｅｆｔ ａｒｍ及びＲｉｇｈｔ ａｒｍの塩基配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。また、ガイドＲＮＡ発現プラスミドの全長塩基配列を配列番号１４に、ガイドＲＮＡ発現プラスミド中のＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域の標的配列を配列番号４に示す。ガイドＲＮＡ発現プラスミド中において、Ｕ６プロモーターの転写効率を考慮して、標的配列の前にＧ（グアニン）を１つ付加した配列とした。

【0112】

次いで、ゼオシン存在下で、２１日間培養し、形成されたコロニーをクローニングシリンダーでピックアップし、２４ウェルプレートに播種した。細胞数が増加したところで、半分を植え継ぎに使用し、残りの半分をｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ抽出に用いた。

【0113】

抽出したｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡに対し、ＰＣＲを行い、ドナープラスミドに由来するＤＮＡ断片（ゼオシンのｃＤＮＡを含む領域）が挿入されていることを確認した。使用したプライマーの配列を以下に示す。また、設計したプライマーの染色体上の標的位置を図９に示す。
ｏｐ１２２２：５’－ＧＴＧＴＣＴＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＣＡＴＴＣＣＣＧ－３’（配列番号１５）
ｏｐ１２７２：５’－ＧＧＧＡＡＡＣＴＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣ－３’（配列番号１６）
ｏｐ１２５１：５’－ＧＡＡＣＧＧＣＡＣＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＧＧ－３’（配列番号１７）
ｏｐ１２５２：５’－ＧＣＡＡＣＴＧＣＧＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＧ－３’（配列番号１８）

【0114】

次いで、ドナープラスミドに由来するＤＮＡ断片が確認されたコロニーに対して、ＧＦＰ発現プラスミド（図１０参照）及びｐＣＡＧ－Ｆｌｐｅプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、♯１３７８７）を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ社製）を用いてエレクトロポレーション法により導入し、リコンビナーゼ媒介カセット交換を起こさせた。細胞導入から３週間、ブラストサイジン２．５μｇ／ｍＬで選別した。

【0115】

その結果、ブラストサイジン耐性となったクローンが得られた。これらクローンについて、ドキシサイクリン添加による誘導でＧＦＰの発現を誘導した。図１１は、ＧＦＰ遺伝子を含む発現ユニットがＸ染色体のＺｘｄｂ遺伝子の上流領域に挿入されたＭＩＮ６細胞の顕微鏡像（顕微鏡：ＫＥＹＥＮＣＥ Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｄｒｏｓｃｏｐｅ ＢＺ－Ｘ７１０、拡大倍率：１００倍、左：明視野像、右：蛍光像）である。

【0116】

図１１に示すように、ＧＦＰがほぼ均一に発現することが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0117】

本実施形態の挿入方法によれば、外来遺伝子の均一な発現を達成することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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