特開 2022-79486 抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＴＳＰＡＮ８抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022079486

(43)【公開日】2022-05-26

(54)【発明の名称】抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＴＳＰＡＮ８抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220519BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220519BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220519BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220519BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220519BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220519BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220519BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220519BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20220519BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220519BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220519BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20220519BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P35/00

A61K39/395 T

A61K35/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】55

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022036009

(22)【出願日】2022-03-09

(62)【分割の表示】P 2022502914の分割

【原出願日】2021-11-15

(31)【優先権主張番号】P 2020189988

(32)【優先日】2020-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000006677

【氏名又は名称】アステラス製薬株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】510097747

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立がん研究センター

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100196243

【弁理士】

【氏名又は名称】運 敬太

(72)【発明者】

【氏名】天田 由幸

(72)【発明者】

【氏名】由利 正利

(72)【発明者】

【氏名】山宿 大介

(72)【発明者】

【氏名】堤 剛

(72)【発明者】

【氏名】楠▲崎▼ 佑子

(72)【発明者】

【氏名】佐々木 博己

(72)【発明者】

【氏名】千脇 史子

(72)【発明者】

【氏名】小松 将之

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA05

4B065AA91X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA05

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085DD61

4C085EE01

4C085GG01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA11

4H045BA10

4H045BA40

4H045CA10

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ヒトの治療又は予防に用いることができる抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＴＳＰＡＮ８抗体を提供する。
【解決手段】ＴＳＰＡＮ８及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体のＦａｂ領域、
（ｂ）抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域、並びに、
（ｃ）（ａ）のＦａｂ領域の重鎖フラグメントに連結される第一Ｆｃポリペプチド及び（ｂ）の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域に連結される第二ＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域、
を含む、二重特異性抗体を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＳＰＡＮ８及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体のＦａｂ領域、
（ｂ）抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域、並びに、
（ｃ）（ａ）のＦａｂ領域の重鎖フラグメントに連結される第一Ｆｃポリペプチド及び（ｂ）の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域に連結される第二ＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域、
を含む、二重特異性抗体。

【請求項2】

請求項１に記載の二重特異性抗体であって、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域が、配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む；又は、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域が、配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む、
二重特異性抗体。

【請求項3】

請求項１に記載の二重特異性抗体であって、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域が、配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなり、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる；又は、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域が、配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなり、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域が配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる、
二重特異性抗体。

【請求項4】

請求項１に記載の二重特異性抗体であって、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体のＦａｂ領域が、配列番号６のアミノ酸番号１から２１９までのアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる；又は、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体のＦａｂ領域が、配列番号１０のアミノ酸番号１から２１９までのアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる、
二重特異性抗体。

【請求項5】

抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域が、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域が配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなり、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域が配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項7】

抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域が配列番号１４のアミノ酸番号１から２５４までのアミノ酸配列からなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項8】

請求項１に記載の二重特異性抗体であって、
該二重特異性抗体は、配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む；又は、
該二重特異性抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む、
二重特異性抗体。

【請求項9】

請求項１に記載の二重特異性抗体であって、
該二重特異性抗体は、配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む；又は、
該二重特異性抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む、
二重特異性抗体。

【請求項10】

ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ここで、前記変異位置はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である））を含むＦｃ領域を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項11】

Ｎ２９７Ｇ変異（ここで、前記変異位置はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である）を含むＦｃ領域を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項12】

ノブズ・イントゥー・ホールズ（Ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）変異を含むＦｃ領域を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項13】

ＬＡＬＡ変異、Ｎ２９７Ｇ変異、及びノブズ・イントゥー・ホールズ変異を含むＦｃ領域を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項14】

ノブズ・イントゥー・ホールズ変異が、Ｆｃ領域を形成する１つのＦｃポリペプチドにおけるＴ３６６Ｗ変異、並びにＦｃ領域を形成するもう１つのＦｃポリペプチドにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異である（ここで、前記変異位置はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である）、請求項１２又は１３に記載の二重特異性抗体。

【請求項15】

第一Ｆｃポリペプチドが配列番号６の２３５から４５１までのアミノ酸配列からなり、第二Ｆｃポリペプチドが配列番号１４の２７０から４８６までのアミノ酸配列からなるＦｃ領域を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項16】

抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結され、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結されている、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項17】

請求項１に記載の二重特異性抗体であって、
配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、及び配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む、二重特異性抗体。

【請求項18】

翻訳後修飾された、請求項２～１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項19】

翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端リジン欠失である、請求項１８に記載の二重特異性抗体。

【請求項20】

下記（ａ）～（ｅ）からなる群より選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項21】

下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項22】

請求項２０又は２１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項23】

請求項２２に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。

【請求項24】

配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【請求項25】

配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【請求項26】

ＴＳＰＡＮ８及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体の生産方法であって、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、生産方法。

【請求項27】

請求項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項28】

がんの治療に使用するための、請求項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。

【請求項29】

がんの治療のための、請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項30】

請求項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の治療有効量を対象に投与する工程を含む、がんを治療する方法。

【請求項31】

がんの治療のための医薬組成物の製造における、請求項１～１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。

【請求項32】

ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に選択的に結合する抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項33】

配列番号２のアミノ酸番号１２６から１５５までヒトＴＳＰＡＮ８の領域に存在する少なくとも１個のアミノ酸に結合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項34】

請求項３３に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記ヒトＴＳＰＡＮ８の領域に存在する少なくとも配列番号２のアミノ酸番号１３１のアミノ酸に結合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項35】

下記（ａ）及び（ｂ）から選択される抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項36】

下記（ａ）及び（ｂ）から選択される、請求項３５に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項37】

下記（ａ）及び（ｂ）から選択される、請求項３５に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体。

【請求項38】

ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に対する結合に関して請求項３３～３７のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントと競合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項39】

Ｔ細胞又はＮＫ細胞の表面抗原に対する抗体又はその抗原結合フラグメントと連結された、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項40】

Ｔ細胞の表面抗原がＣＤ３である、請求項３９に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項41】

Ｔ細胞の表面抗原に対する抗原結合フラグメントが抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖである、請求項４０に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項42】

翻訳後修飾された、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項43】

翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端リジン欠失である、請求項４２に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【請求項44】

請求項３２～４３のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの融合体、又は複合体、或いは請求項３２～４３のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞。

【請求項45】

下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項46】

下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項47】

請求項４５又は４６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項48】

請求項４７に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。

【請求項49】

下記（ａ）又は（ｂ）より選択される、宿主細胞：
（ａ）請求項４５に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び請求項４５に記載の抗体の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、宿主細胞；
（ｂ）請求項４６に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び請求項４６に記載の抗体の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【請求項50】

抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの生産方法であって、請求項４８又は４９のいずれかの宿主細胞を培養する工程を含む、生産方法。

【請求項51】

がんの治療に使用するための、請求項３２～４３のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項４４に記載の融合体、複合体若しくは細胞。

【請求項52】

請求項３２～４３のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項４４に記載の融合体、複合体若しくは細胞を含み、さらに薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項53】

がんの治療のための、請求項５２に記載の医薬組成物。

【請求項54】

請求項３２～４３のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体若しくはその抗原結合フラグメントの治療有効量を対象に投与する工程、又は請求項４４に記載の融合体、複合体若しくは細胞の治療有効量を対象に投与する工程を含む、がんを治療する方法。

【請求項55】

がんの治療のための医薬組成物の製造における、請求項３２～４３のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体若しくはその抗原結合フラグメントの使用、又は請求項４４に記載の融合体、複合体若しくは細胞の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトの治療に用いる医薬組成物の有効成分として有用な抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＴＳＰＡＮ８抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

転移性胃がんとは、原発性胃がんが筋層より深く浸潤し、胃壁を包む漿膜を破り、リンパ節や腹腔、さらに血液やリンパ液を介して種々の臓器に転移した状態をいい、転移性胃がん患者の半数以上の患者で腹腔への播種が認められる。末期の患者では、腹膜播種によって引き起こされた腹水貯留を原因とする腹部の腫れ、継続的な膨満感、痛み、吐き気、呼吸困難、不眠症及び疲労等の症状が知られている（Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２０１６、Ｖｏｌ．２２、ｐ．６８２９－６８４０、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２０１０、Ｖｏｌ．１２７、ｐ．２２０９-２２２１）。しかしながら、胃がん腹膜播種患者の手術による完全な治癒は困難であり、胃がん腹膜播種の標準療法である化学療法も有効性が十分ではないため、これらの患者の５年生存率は約２％と非常に予後が悪く、胃がん腹膜播種に対する有効な治療法が望まれている。また、腹膜播種は、卵巣がん・大腸がん・すい臓がん等を原発とする多くのがん患者でも認められており（Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｄｖ．Ｒｅｓ．、２０１６、Ｖｏｌ．４、ｐ．７３５－７４８）、これらの患者に対する治療法も確立されていない。

【0003】

がん治療用抗体の開発において、がん細胞に選択的な発現を示す腫瘍関連抗原（Ｔｕｍｏｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＡＡ）を種々の方法により同定する試みがなされている。その方法の一つとして、がん細胞を動物に免疫して抗体を作製し、がん細胞に発現するＴＡＡに結合する抗体を取得する方法が報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１８、Ｖｏｌ．５０５、ｐ．１８１ｅ－１８６、ＦＥＢＳ Ｏｐｅｎ Ｂｉｏ、２０１７、Ｖｏｌ．７、ｐ．６２７－６３５）。

【0004】

テトラスパニン８（Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ－８；ＴＳＰＡＮ８）はテトラスパニンファミリーに属する４回膜貫通タンパク質であり、小細胞外ループ（ｓｍａｌｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ；ＳＥＬ）と大細胞外ループ（ｌａｒｇｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ；ＬＥＬ）という２つの細胞外ループ領域と３つの細胞質ドメインを有し、足場タンパク質として多種多様な膜貫通タンパク質及び細胞質タンパク質を有する分子クラスターを形成する。ＴＳＰＡＮ８は細胞接着、細胞運動性、細胞の活性化及び増殖等に対して関与することが知られており、胃がん、膵がん、大腸がん、肝臓がん等で高発現が認められ、ＴＳＰＡＮ８発現亢進とがんの進展又は転移との関連性等が報告されている（非特許文献１）。抗ＴＳＰＡＮ８抗体を用いたがんの診断や治療を目指した研究が行われている（特許文献１～２、及び非特許文献１～２）。

【0005】

分化抗原群３（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３；ＣＤ３）は、Ｔ細胞表面においてＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＣＲ）と複合体を形成することによりＴ細胞に活性化シグナルを伝達するタンパク質である。ＣＤ３は、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ゼータ（ζ）及びイータ（η）鎖の５種類のサブユニットからなる複合体であり、各サブユニットはεγ、εδ、ζζの３種類の二量体を形成する。ＣＤ３は正常Ｔ細胞及び腫瘍性Ｔ細胞のいずれにも発現していることからＴ細胞のマーカーとして使用されており、また、がん治療を目的とした各種抗ＴＡＡ抗体と抗ＣＤ３抗体を含む二重特性抗体の医薬品としての応用が種々報告されている（非特許文献３）。

【0006】

低い抗体濃度でがん細胞選択的な細胞傷害活性を得ることができる画期的な方法として、種々の抗体フォーマットからなる二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が報告されており、Ｔ細胞媒介性免疫療法に対するそれらの抗体の効果が検討されつつある（非特許文献４）。二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体は、がん細胞表面に発現するＴＡＡに対する抗体と、Ｔ細胞に結合する抗体を含む二重特異性抗体である。Ｔ細胞に結合する抗体としては、抗ＣＤ３抗体が多く用いられている。抗ＴＡＡと抗ＣＤ３抗体を含む分子の二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体は、標的がん細胞と細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）の物理的距離を近づけ、抗ＣＤ３抗体によってＣＴＬを活性化し、ＣＴＬの細胞傷害活性によってがん細胞を殺傷する（Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＲＴＣＣ）。抗ＣＤ３－抗上皮細胞接着分子（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ；ＥｐＣＡＭ）二重特異性抗体であるカツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）や抗ＣＤ３－抗ＣＤ１９（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １９）二重特異性抗体であるブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）は既に臨床における効果が確認されており（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２０１０、Ｖｏｌ．１２７、ｐ．２２０９－２２２１、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２０１７、Ｖｏｌ．３７６、ｐ．８３６－８４７）、現在も種々のＴＡＡに対する二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体の研究開発がなされている。しかしながら、現在までに、抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開２０１２/０１０６９６号

【特許文献2】国際公開２０１５/１３０１１５号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】バイオモレキュールズ（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、（スイス）、２０２０；１０（３）：ｐ．３８３

【非特許文献2】キャンサーズ（Ｃａｎｃｅｒｓ）、（スイス）、２０１９；１１（２）：ｐ．１７９

【非特許文献3】ファーマコロジー アンド セラピューティクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、（英国）、２０１８；１８２：ｐ．１６１－１７５

【非特許文献4】マブス（ｍＡｂｓ）、２０１７：９（２）：ｐ．１８２－２１２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の課題は、ヒトの治療に用いることができる抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体及び抗ＴＳＰＡＮ８抗体を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、がん細胞に選択的な治療薬の創成を目的として、患者から単離したがん腹膜播種細胞をヒ卜モノクローナル抗体産生マウスに免疫して抗体を取得する手法により抗ＴＳＰＡＮ８抗体である１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２を取得した（実施例１）。該抗体は、正常細胞に発現しているＴＳＰＡＮ８に比べてがん腹膜播種細胞に発現しているＴＳＰＡＮ８に強く結合した（実施例１～５）。１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２のエピトープ解析により、該抗体はヒトＴＳＰＡＮ８のアミノ酸番号１２６から１５５のアミノ酸配列からなる領域をエピトープとして認識すること、さらに、ヒトＴＳＰＡＮ８の１３１番目のトレオニンが該抗体との結合に必須であることが分かった（実施例４）。また、１６Ｂ１１のＦｃ領域をヒト配列にした完全ヒト抗体である１６Ｂ１１．１を作製し（実施例３）、該完全ヒト抗体が６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞に対して細胞傷害活性を示すことを見出した（実施例６）。
さらに、Ｔ細胞による抗原選択的な抗腫瘍活性を高めるために、配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域、並びに配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異的抗体を作製した（実施例７）。この二重特異性抗体は、ＴＳＰＡＮ８及びＣＤ３に結合し（実施例８）、細胞表面にＴＳＰＡＮ８を発現するがん細胞に対して細胞傷害活性を示し（実施例９、１０、１２－１、１２－２）、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてマウスの生存期間を延長し、抗腫瘍作用を発揮することを確認した（実施例１１及び１２－３）。

【0011】

すなわち、本発明は、以下の［１］～［５５］に関する。
［１］ ＴＳＰＡＮ８及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体のＦａｂ領域、
（ｂ）抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域、並びに、
（ｃ）（ａ）のＦａｂ領域の重鎖フラグメントに連結される第一Ｆｃポリペプチド及び（ｂ）の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域に連結される第二ＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域、
を含む、二重特異性抗体。
［２］ ［１］に記載の二重特異性抗体であって、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域が、配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む；又は、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域が、配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む、
二重特異性抗体。
［３］ ［１］に記載の二重特異性抗体であって、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域が、配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなり、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる；又は、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域が、配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなり、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域が配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる、
二重特異性抗体。
［４］ ［１］に記載の二重特異性抗体であって、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体のＦａｂ領域が、配列番号６のアミノ酸番号１から２１９までのアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる；又は、
抗ＴＳＰＡＮ８抗体のＦａｂ領域が、配列番号１０のアミノ酸番号１から２１９までのアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる、
二重特異性抗体。
［５］ 抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域が、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む、［１］～［４］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［６］ 抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域が配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなり、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域が配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる、［１］～［４］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［７］ 抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域が配列番号１４のアミノ酸番号１から２５４までのアミノ酸配列からなる、［１］～［４］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［８］ ［１］に記載の二重特異性抗体であって、
該二重特異性抗体は、配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む；又は、
該二重特異性抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む、
二重特異性抗体。
［９］ ［１］に記載の二重特異性抗体であって、
該二重特異性抗体は、配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む；又は、
該二重特異性抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む、
二重特異性抗体。
［１０］ ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ここで、前記変異位置はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である））を含むＦｃ領域を含む、［１］～［９］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［１１］ Ｎ２９７Ｇ変異（ここで、前記変異位置はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である）を含むＦｃ領域を含む、［１］～［１０］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［１２］ ノブズ・イントゥー・ホールズ（Ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）変異を含むＦｃ領域を含む、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［１３］ ＬＡＬＡ変異、Ｎ２９７Ｇ変異、及びノブズ・イントゥー・ホールズ変異を含むＦｃ領域を含む、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［１４］ ノブズ・イントゥー・ホールズ変異が、Ｆｃ領域を形成する１つのＦｃポリペプチドにおけるＴ３６６Ｗ変異、並びにＦｃ領域を形成するもう１つのＦｃポリペプチドにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異である（ここで、前記変異位置はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である）、［１２］又は［１３］に記載の二重特異性抗体。
［１５］ 第一Ｆｃポリペプチドが配列番号６の２３５から４５１までのアミノ酸配列からなり、第二Ｆｃポリペプチドが配列番号１４の２７０から４８６までのアミノ酸配列からなるＦｃ領域を含む、［１］～［１４］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［１６］ 抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結され、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結されている、［１］～［１５］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［１７］ ［１］に記載の二重特異性抗体であって、
配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、及び配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む、二重特異性抗体。
［１８］ 翻訳後修飾された、［２］～［１７］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［１９］ 翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端リジン欠失である、［１８］に記載の二重特異性抗体。
［２０］ 下記（ａ）～（ｅ）からなる群より選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［２１］ 下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［２２］ ［２０］又は［２１］に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［２３］ ［２２］に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
［２４］ 配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
［２５］ 配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
［２６］ ＴＳＰＡＮ８及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体の生産方法であって、［２３］～［２５］のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、生産方法。
［２７］ ［１］～［１９］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［２８］ がんの治療に使用するための、［１］～［１９］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［２９］ がんの治療のための、［２７］に記載の医薬組成物。
［３０］ ［１］～［１９］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の治療有効量を対象に投与する工程を含む、がんを治療する方法。
［３１］ がんの治療のための医薬組成物の製造における、［１］～［１９］のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
［３２］ ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に選択的に結合する抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３３］ 配列番号２のアミノ酸番号１２６から１５５までのヒトＴＳＰＡＮ８の領域に存在する少なくとも１個のアミノ酸に結合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３４］ ［３３］に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記ヒトＴＳＰＡＮ８の領域に存在する少なくとも配列番号２のアミノ酸番号１３１のアミノ酸に結合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３５］ 下記（ａ）及び（ｂ）から選択される抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３６］ 下記（ａ）及び（ｂ）から選択される、［３５］に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３７］ 下記（ａ）及び（ｂ）から選択される、［３５］に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体。
［３８］ ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に対する結合に関して［３３］～［３７］のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントと競合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３９］ Ｔ細胞又はＮＫ細胞の表面抗原に対する抗体又はその抗原結合フラグメントと連結された、［３２］～［３８］のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４０］ Ｔ細胞の表面抗原がＣＤ３である、［３９］に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４１］ Ｔ細胞の表面抗原に対する抗原結合フラグメントが抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖである、［４０］に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４２］ 翻訳後修飾された、［３２］～［４１］のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４３］ 翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端リジン欠失である、［４２］に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４４］［３２］～［４３］のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの融合体又は複合体、或いは［３２］～［４３］のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８又はその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞。
［４５］ 下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［４６］ 下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［４７］ ［４５］又は［４６］に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［４８］ ［４７］に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
［４９］ 下記（ａ）又は（ｂ）より選択される、宿主細胞：
（ａ）［４５］に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び［４５］に記載の抗体の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、宿主細胞；
（ｂ）［４６］に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び［４６］に記載の抗体の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
［５０］ 抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの生産方法であって、［４８］又は［４９］のいずれかの宿主細胞を培養する工程を含む、生産方法。
［５１］ がんの治療に使用するための、［３２］～［４３］のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は［４４］に記載の融合体、複合体若しくは細胞。
［５２］ ［３２］～［４３］のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は［４４］に記載の融合体、複合体若しくは細胞を含み、さらに薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［５３］ がんの治療のための、［５２］に記載の医薬組成物。
［５４］ ［３２］～［４３］のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体若しくはその抗原結合フラグメントの治療有効量を対象に投与する工程、又は［４４］に記載の融合体、複合体若しくは細胞の治療有効量を対象に投与する工程を含む、がんを治療する方法。
［５５］ がんの治療のための医薬組成物の製造における、［３２］～［４３］のいずれか一項に記載の抗ＴＳＰＡＮ８抗体若しくはその抗原結合フラグメントの使用、又は［４４］に記載の融合体、複合体若しくは細胞の使用。

【発明の効果】

【0012】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異的抗体は、がん抗原であるＴＳＰＡＮ８とＴ細胞表面分子であるＣＤ３の両方に結合し、がん細胞とＴ細胞の物理的な距離を近づけることにより、Ｔ細胞によるがん細胞殺傷作用を増強させるものである。また、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体は、ＴＳＰＡＮ８に結合することにより、がん細胞を殺傷する効果を有する。本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異的抗体及び抗ＴＳＰＡＮ８抗体、又は前記抗体を含む医薬組成物は、がんの治療のために使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1-1】図１－１は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、９Ｆ６、１８Ｃ１０）のＫＭ－２９１－Ａｓに対する結合性をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、９Ｆ６、１８Ｃ１０は抗体名を表す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の白抜きは陰性コントロール抗体の結合を表し、濃い灰色は抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を示す。

【図1-2】図１－２は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、９Ｆ６、１８Ｃ１０）のＫＭ－５５５－Ａｓに対する結合性をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の１６Ｂ１１、９Ｆ６、１８Ｃ１０は抗体名を表す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の白抜きは陰性コントロール抗体の結合を表し、濃い灰色は抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を示す。

【図1-3】図１－３は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、９Ｆ６、１８Ｃ１０）のＫＭ－５５６－Ａｓに対する結合性をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の１６Ｂ１１、９Ｆ６、１８Ｃ１０は抗体名を表す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の白抜きは陰性コントロール抗体の結合を表し、濃い灰色は抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を示す。

【図2-1】図２－１は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、９Ｆ６、５Ｂ７、１２Ｃ１２、１３Ａ９、１５Ｄ１、ＴＡＬ６９）の培養ヒト腹膜中皮細胞に対する結合性をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の白抜きは陰性コントロール抗体の結合を表し、濃い灰色は抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を示す。

【図2-2】図２－２は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１８Ｃ１０、１９Ｅ４、２１Ｆ７、ＴＡＬ６９）の培養ヒト腹膜中皮細胞に対する結合性をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の白抜きは陰性コントロール抗体の結合を表し、濃い灰色は抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を示す。

【図3-1】図３－１は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、９Ｆ６、１８Ｃ１０、ＴＡＬ６９）のＫＭ－５０１－Ａｓに対する結合性をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の白抜きは陰性コントロール抗体の結合を表し、濃い灰色は抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を示す。

【図3-2】図３－２は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、９Ｆ６、１８Ｃ１０、ＴＡＬ６９）のＫＭ－５０３－Ａｓに対する結合性をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の白抜きは陰性コントロール抗体の結合を表し、濃い灰色は抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を示す。

【図4】図４は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、９Ｆ６、５Ｂ７、１２Ｃ１２、１３Ａ９、１５Ｄ１、１８Ｃ１０、１９Ｅ４、２１Ｆ７、ＴＡＬ６９）のヒト臍帯血管内皮細胞 ドナー２に対する結合性をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の白抜きは陰性コントロール抗体の結合を表し、濃い灰色は抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を示す。

【図5-1】図５－１は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、ＴＡＬ６９）のヒトマウスＴＳＰＡＮ８－ＧＦＰキメラタンパク質又はヒトラットＴＳＰＡＮ８－ＧＦＰキメラタンパク質を発現したＣＨＯ－Ｋ１細胞（キメラタンパク発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞）に対する結合性をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の灰色は野生型ヒトＴＳＰＡＮ８発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞、黒色はキメラタンパク発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞、白抜きはモック細胞への抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を示す。実験はｄｕｐｌｉｃａｔｅで実施した。

【図5-2】図５－２はヒト、マウス、ラット及びカニクイザルの４種類のＴＳＰＡＮ８タンパク質のアミノ酸番号１２６～１５５からなる配列の相同性を示す。アスタリスクは完全一致のアミノ酸であることを示し、ドットは４種のうちの３種が同一のアミノ酸であることを示す。スペースは２種以上が異なるアミノ酸であることを示す。

【図5-3】図５－３は抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、ＴＡＬ６９）のヒトＴＳＰＡＮ８タンパク質のＴ１３１Ａ変異体又はＴ１３１Ｎ変異体に対する結合性をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の灰色は野生型ヒトＴＳＰＡＮ８発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞、黒色は変異体発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞、白抜きはモック細胞への抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を示す。実験はｄｕｐｌｉｃａｔｅで実施した。

【図6-1】図６－１は、１６Ｂ１１のＮＳＣ－１５ＣＦへの結合に対する他の抗ＴＳＰＡＮ８抗体（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ（ＣＰＴＲ）：１６Ｂ１１、９Ｆ６、１８Ｃ１０、ＴＡＬ６９）による競合作用をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の灰色は陰性コントロール抗体存在下での蛍光標識１６Ｂ１１の結合を、黒色は各ＣＰＴＲ存在下での蛍光標識１６Ｂ１１の結合を示し、白抜きは蛍光標識１６Ｂ１１未染色のヒストグラムを示す。

【図6-2】図６－２は、蛍光標識抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、９Ｆ６、１８Ｃ１０）のＮＳＣ－１５ＣＦへの結合に対する１６Ｂ１２による競合作用をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の灰色は陰性コントロール抗体存在下での蛍光標識抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を、黒色は１６Ｂ１２存在下での蛍光標識抗ＴＳＰＡＮ８抗体の結合を示し、白抜きは蛍光標識抗体未染色のヒストグラムを示す。

【図6-3】図６－３は、１６Ｂ１２のＮＳＣ－１５ＣＦへの結合に対する他の抗ＴＳＰＡＮ８抗体（ＣＰＴＲ：１６Ｂ１２、１６Ｂ１１、９Ｆ６、１８Ｃ１０、ＴＡＬ６９）による競合作用をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の灰色は陰性コントロール抗体存在下での蛍光標識１６Ｂ１２の結合を、黒色は他の抗ＴＳＰＡＮ８抗体（ＣＰＴＲ）存在下での蛍光標識１６Ｂ１２の結合を示し、白抜きは蛍光標識抗体未染色のヒストグラムを示す。

【図7】図７は、６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とヒトＮＫ細胞の共培養系における、１６Ｂ１１．１の細胞傷害活性を示す。横軸は抗体濃度、縦軸は６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞から産生されるルシフェラーゼ活性から算出された細胞傷害活性を示す。●、▲はそれぞれ対照抗体、１６Ｂ１１．１の各濃度における細胞傷害活性の平均値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。

【図8】図８は、ＴＳＰＡＮ８のＬＥＬ領域ペプチド及びＣＤ３εδ複合タンパクに対する抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の結合活性を示す。横軸は抗体濃度、縦軸は抗体の結合量を示す。図８－１、図８－２はそれぞれ、ＴＳＰＡＮ８のＬＥＬ領域ペプチド、ＣＤ３εδ複合タンパクに対する抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の結合量の平均値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。

【図9】図９は、６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とヒト末梢血単核細胞の共培養系における抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の細胞傷害活性を示す。横軸は抗体濃度、縦軸は６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の抗体添加３日後の蛍光面積において抗体無添加を１００％とした時の細胞増殖（％）を示す。●は抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の各濃度における細胞増殖の平均値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。

【図10-1】図１０－１は、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体のヒト胃がん患者腹水細胞中の胃がん細胞に対する細胞傷害活性を示す。横軸は抗体濃度、縦軸は胃がん細胞の抗体添加３日後の生細胞数において抗体無添加を１００％とした時の生細胞数（％）を示す。●、■はそれぞれ対照抗体、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の各濃度における生細胞数（％）の平均値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。

【図10-2】図１０－２は、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体によるヒト胃がん患者腹水細胞中のＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化をＣＤ２５の発現誘導で示した図である。横軸は抗体濃度を示す。縦軸は、腹水中ＣＤ４陽性Ｔ細胞に抗体を添加した３日後のＣＤ２５発現量の倍率変化を示す。●、■はそれぞれ対照抗体、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の各濃度におけるＣＤ２５の発現量の倍率変化の平均値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。

【図10-3】図１０－３は、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体によるヒト胃がん患者腹水細胞中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化をＣＤ２５の発現誘導で示した図である。横軸は抗体濃度を示す。縦軸は、腹水中ＣＤ８陽性Ｔ細胞に抗体を添加した３日後のＣＤ２５発現量の倍率変化を示す。●、■はそれぞれ対照抗体、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の各濃度におけるＣＤ２５の発現量の倍率変化の平均値示す。エラーバーは標準偏差を示す。

【図11-1】図１１－１は胃がん腹膜播種モデルにおける抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍効果を示す。縦軸は腹腔中の６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞が発現するルシフェラーゼによるルシフェリンの発光量の平均値を示す。エラーバーは標準誤差を示す。横軸は抗体投与量を示す。有意確率Ｐ値は、ダネットの多重比較検定により対照群の発光量と抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体投与群の発光量を比較することにより求めた。図中の＊＊は、Ｐ値が有意水準０．０１より小さい群を示す。

【図11-2】図１１－２は胃がん腹膜播種モデルにおける抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体による生存日数に対する効果を示す。縦軸は生存率を示す。横軸はがん細胞移植後日数を示す。抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体及びＥｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎＴ細胞は▲で示される６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ移植後７、１０日後に投与された。

【図12】図１２は、１６Ｂ１１の様々ながん細胞株に対する結合性をフローサイトメトリー法により測定した結果を示す。図の横軸は蛍光強度を表し、縦軸はセルカウントを表す。図中の白抜きは陰性コントロール抗体の結合を表し、濃い灰色は１６Ｂ１１の結合を示す。

【図13-1】図１３－１は、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体によるヒト末梢血単核細胞共培養下での様々ながん細胞株に対する細胞傷害活性を示す。横軸は抗体濃度、縦軸は各がん細胞株の抗体添加３日後の生細胞数において抗体無添加を１００％とした時の生細胞数（％）を示す。各シンボルは抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の各濃度における各がん細胞株の生細胞数（％）の平均値（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）を示す。

【図13-2】図１３－２は、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体によるヒト末梢血単核細胞と様々ながん細胞株共培養中のＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化をＣＤ２５の発現誘導で示した図である。横軸は抗体濃度を示す。縦軸は抗体を添加した３日後のＣＤ４陽性Ｔ細胞のＣＤ２５発現量の倍率変化を示す。各シンボルは抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の各濃度におけるＣＤ２５の発現量の倍率変化の平均値（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）を示す。

【図13-3】図１３－３は、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体によるヒト末梢血単核細胞と様々ながん細胞株を共培養中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化をＣＤ２５の発現誘導で示した図である。横軸は抗体濃度を示す。縦軸は、抗体を添加した３日後のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＣＤ２５発現量の倍率変化を示す。各シンボルは抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の各濃度におけるＣＤ２５の発現量の倍率変化の平均値（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）を示す。

【図14】図１４はヒトＰＢＭＣ移入ＨＴ－２９細胞皮下担癌モデルにおける抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍効果を示す。図１４－１は抗体投与開始後の日数における腫瘍体積の平均値及びエラーバーは標準誤差を示す。図１４－２は投与開始１１日後の各個体の腫瘍体積の値及び横線は平均値と標準誤差を示し、横軸は抗体投与量を示す。有意確率Ｐ値は、ダネットの多重比較検定によりＰＢＳ投与群の腫瘍体積と抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体投与群の腫瘍体積を比較することにより求めた。図中の＊＊は、Ｐ値が有意水準０．０１より小さい群を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下に、本発明について詳述する。

【0015】

＜定義＞
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当該技術分野で当業者に一般に使用されている意味にて使用される。

【0016】

抗体（又は免疫グロブリン）とは、単一の配列を有する重鎖２本と、単一の配列を有する軽鎖２本からなる左右対称Ｙ字型の構造を有する４本鎖構造からなる糖タンパク質をいう。抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５つのクラスが存在する。抗体分子の基本構造は各クラス共通であり、分子量５万～７万の重鎖２本と２万～３万の軽鎖２本がジスルフィド結合及び非共有結合によって結合し、分子量１５万～１９万のＹ字型の４本鎖構造からなる抗体分子を形成する。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してそれぞれ、Ｉｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれる。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκという。前記２種の軽鎖は、いずれの種類の重鎖とも対をなすことができる。

【0017】

抗体分子の鎖内ジスルフィド結合は、重鎖には４つ（Ｉｇμ、Ｉｇεには５つ）、軽鎖には２つ存在し、アミノ酸１００～１１０残基ごとに１つのループを成している。それらの立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位又はドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは可変領域とよばれ、同種動物の同一クラス（又はサブクラス）から産生された抗体であっても多様なアミノ酸配列を有し、抗体と抗原との結合特異性結合に関与することが知られている。可変領域よりも下流のＣ末端側のドメインのアミノ酸配列は、各クラス又はサブクラスごとにほぼ一定で、定常領域とよばれている。重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を有する。ＣＨはさらにＮ末端側からＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインの３つのドメインに分けられる。軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を有す。

【0018】

ＶＨ及びＶＬに存在する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列は変化が非常に大きく、可変領域の可変性に寄与している。ＣＤＲは、重鎖と軽鎖のＮ末端それぞれにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順番で存在するおよそ５～１０アミノ酸残基からなる領域であって、抗原結合部位を形成する。一方、可変領域のＣＤＲ以外の部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、ＦＲ１～４からなり、アミノ酸配列の変化は比較的少ない。

【0019】

抗体をタンパク質分解酵素のパパインで処理すると、３つの抗体断片が得られる。Ｎ末端側の２つの断片はＦａｂ（抗原結合断片、Ｆｒａｇｍｅｎｔ，ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）領域と呼ばれている。本明細書において、「Ｆａｂ領域」とは、重鎖のＶＨとＣＨ１ドメイン及び軽鎖（ＶＬとＣＬ）からなる領域を指し、当該Ｆａｂ領域が構成する先端部分の抗原結合部位で抗原と結合する。本明細書において、「重鎖フラグメント」とは、Ｆａｂ領域を構成する重鎖のＶＨとＣＨ１ドメインからなるフラグメントを指す。
また、Ｃ末端側の断片をＦｃ（結晶化可能断片、Ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域とよぶ。本明細書において、「Ｆｃポリペプチド」は、重鎖のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインからなるポリペプチドをいい、「Ｆｃ領域」は２つのＦｃポリペプチドからなる複合体を指す。
重鎖フラグメントとＦｃポリペプチドはヒンジ領域とよばれる部分で繋がっている。また、抗体の２本の重鎖はヒンジ領域でジスルフィド結合している。

【0020】

本明細書において「抗原」とは、一般的に用いられている意味で用いられ、特に、抗体、抗原結合フラグメント等の抗原結合タンパク質が特異的に結合し得る分子又は分子の一部を表す用語として用いられる。抗原はタンパク質、核酸等の分子であり得る。１つの抗原は、異なる抗体等と相互作用することができる１つ又はそれ以上のエピトープを有する場合もある。

【0021】

本明細書において「エピトープ」又は「抗原決定基」とは、抗原結合タンパク質が認識して結合する抗原の特定の構造単位を意味し、抗体又はＴ細胞受容体等の抗原結合タンパク質によって結合され得るあらゆる決定基を含む。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基又はスルホニル基等の分子の化学的に活性な表面基を含むことができ、特異的な三次元構造の特徴及び／又は特異的な電荷的特長を有することができる。抗原がタンパク質である場合、抗体等に直接接触する特定のアミノ酸を含む。一般に、特定の標的抗原に対して特異的な抗体は、タンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物中において、標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。エピトープは、表面に接触可能なアミノ酸残基及び／又は糖側鎖からなる場合が多く、通常は６～１０個のアミノ酸や５～８個の単糖の配列から成る。エピトープは、特有の３次元構造特性と、特有の電荷特性を有することがある。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基と、結合に直接的には関与しないその他のアミノ酸残基を含んでよい。抗原結合タンパク質が結合するエピトープの同定は、例えば、質量分析法（例えば、水素－重水素交換質量分析（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｅＸｃｈａｎｇｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＨＤＸ－ＭＳ）、アラニンスキャニング変異誘発法、結晶解析法、ペプチド競合法等の当業者に周知の方法を用いて同定することができる。

【0022】

本明細書において「競合」又は「競合する」とは、２種類以上の抗体を同時に又は連続的に反応液に添加した場合に、一方の抗体が他方の抗体の抗原への結合を妨げることにより、他方の抗体の抗原に対する結合能が低下することをいう。

【0023】

本明細書において「抗原結合フラグメント」とは、抗体に由来する抗原結合活性を有する少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子である。代表的な抗原結合フラグメントとしては、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントが挙げられる。ｓｃＦｖは、リンカーで連結されたＶＨとＶＬから構成される、一価の抗原結合フラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖のＶＨ、ＣＨ１ドメインを含むフラグメントから構成される、一価の抗原結合フラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖と、重鎖のＶＨ、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含むフラグメントから構成される、一価の抗原結合フラグメントであり、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ－Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントがジスルフィド結合で繋がっている二価の分子である。一価とは、抗原結合部位を１つ含むことを、二価とは、抗原結合部位を２つ含むことを意味する。
本明細書において「ｓｃＦｖ領域」とは、リンカーで連結されたＶＨとＶＬを含む、一価の抗原結合フラグメントを含む領域を指す。

【0024】

片腕（Ｏｎｅ－ａｒｍｅｄ）抗体も抗原結合フラグメントの一種であり、１つのＦａｂ領域及び１つのＦｃ領域を含み、該Ｆａｂ領域の重鎖フラグメントが、該Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドのうちの１つに連結された構造を有する。１つの実施形態において、片腕抗体は、１つの重鎖（ＶＨ、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、Ｆｃポリペプチド（ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン））、１つの軽鎖（ＶＬ及びＣＬ）、及びＦｃポリペプチドを含む。

【0025】

本明細書において「多重特異性抗体」とは、２以上の異なる抗原に特異的に結合することができる抗体をいい、結合する抗原の数により、例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体と呼ばれる。多重特異性抗体には、それぞれ異なる抗原に結合することができる２以上の抗体及び／又は抗原結合フラグメントの複合体が含まれ、本明細書中で使用される「抗体」は、文脈上特に制限されない限り、多重特異性抗体を含む。

【0026】

本明細書において「二重特異性抗体」とは、２つの異なる抗原に特異的に結合することができる抗体をいう。「抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体」とは、ＴＳＰＡＮ８に対する結合活性及びＣＤ３に対する結合活性を有する二重特異性抗体を意味する。

【0027】

本明細書において「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有する抗体を表す。本明細書において「ヒト化抗体」は、ＣＤＲ以外のアミノ酸残基の一部、大部分、又は全部が、ヒト免疫グロブリン分子に由来するアミノ酸残基で置換された抗体を表す。ヒト化の方法としては、特に制限されないが、例えば、米国特許第５２２５５３９号、米国特許第６１８０３７０号等を参照してヒト化抗体を作製することができる。

【0028】

本明細書中で使用される抗体のアミノ酸残基番号はＫａｂａｔナンバリング又はＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ，１９９１，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）を指定することで、それらのナンバリングシステムに従って規定することができる。

【0029】

本明細書において、「第一」又は「第二」という用語は、部分の各種類が２つ以上存在する場合、便宜上区別するために使用される。このような用語の使用は、明瞭に述べているのでない限り、特定の順序や意味を付与することを意図しているのではない。

【0030】

本明細書において、「連結」又は「連結された」とは、複数の成分（例えば、Ｆａｂ領域及びＦｃポリペプチド）が、直接又は一つ若しくは複数の仲介物（例えば、ペプチドリンカー）を介して結合していることを意味する。本明細書において「ペプチドリンカー」とは、可変領域間を連結するための、遺伝子工学により導入し得る１以上の任意のアミノ酸残基を意味する。本発明で使用されるペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。

【0031】

本明細書において、「同一性」とは、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０１５、Ｖｏｌ．４３、ｐＷ５８０－Ｗ５８４）を用いて、デフォルトで用意されているパラメータによって得られたＩｄｅｎｔｉｔｙの値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ Ｏｐｅｎ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２
Ｅｎｄ Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ｆａｌｓｅ

【0032】

本明細書において、「対象」とは、その予防又は治療を必要とするヒト又はその他の動物を意味する。ある態様では、その予防又は治療を必要とするヒトである。

【0033】

＜本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体＞
本発明は、以下に示すＴＳＰＡＮ８及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体（「抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体」とも称する）を提供する：
ＴＳＰＡＮ８及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体のＦａｂ領域、
（ｂ）抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域、並びに
（ｃ）（ａ）のＦａｂ領域の重鎖フラグメントに連結される第一Ｆｃポリペプチド及び（ｂ）の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域に連結される第二ＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域、
を含む、二重特異性抗体。

【0034】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、第一の抗体の１つのＦａｂ領域、第二の抗体のｓｃＦｖ領域、及び１つのＦｃ領域を含む構造を有する。このような構造の抗体は、「栓抜き（Ｂｏｔｔｌｅ－ｏｐｅｎｅｒ）型抗体」とも呼ばれている（国際公開２０１４／１１０６０１号）。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。

【0035】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆａｂ領域として、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる、抗ＴＳＰＡＮ８抗体Ｆａｂ領域を含む。

【0036】

１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域は、配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む。

【0037】

１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む。

【0038】

１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域は、配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなり、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる。

【0039】

１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなり、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域が配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる。

【0040】

抗ＴＳＰＡＮ８抗体Ｆａｂ領域の重鎖フラグメントのＣＨ１ドメインが由来する重鎖定常領域としては、Ｉｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ又はＩｇεのいずれの定常領域も選択可能である。Ｉｇγとしては、例えば、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４から選択することが可能である。１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体Ｆａｂ領域の重鎖フラグメントは、ヒトＩｇγ１定常領域に由来するＣＨ１ドメインを含む。

【0041】

抗ＴＳＰＡＮ８抗体Ｆａｂ領域の軽鎖のＣＬとしては、Ｉｇλ又はＩｇκのいずれの定常領域も選択可能である。１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体Ｆａｂ領域は、Ｉｇκ定常領域であるＣＬを含む。１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体Ｆａｂ領域の軽鎖は、ヒトＩｇκ定常領域であるＣＬを含む。

【0042】

１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体Ｆａｂ領域は、配列番号６のアミノ酸番号１から２１９までのアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる。１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体Ｆａｂ領域は、配列番号１０のアミノ酸番号１から２１９までのアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる。

【0043】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ｓｃＦｖ領域として、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域を含む。本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体において、当該分野で公知の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域又は当該分野で公知の抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて作製した抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖ領域を使用してもよい。公知の抗ＣＤ３抗体としては、ＯＫＴ３、ＵＴＣＨ１、Ｌ２Ｋ、ＴＲ６６等のクローンが知られており、それらの配列は二重特異性抗体として使用されている（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１８、Ｖｏｌ．１８２、ｐ．１６１－１７５）。

【0044】

１つの実施形態において、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含み、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む。

【0045】

１つの実施形態において、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなり、抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる。

【0046】

抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域において、抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結するペプチドリンカーの種類及び長さは特に限定されず、当業者が適宜選択することが可能であるが、好ましい長さは５アミノ酸以上（上限は特に限定されないが、通常、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下）であり、特に好ましくは１５アミノ酸である。ペプチドリンカーとして、例えば、グリシン－セリンリンカー（ＧＳリンカー）や、グリシン－リジン－プロリン－グリシン－セリンリンカー（ＧＫＰＧＳリンカー）を使用することができる。このようなリンカーとしては、例えば、以下が挙げられる。
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ－Ｓｅｒ
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号１５）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号１６）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号１７）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号１８）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号１９）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号２０）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号２１）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号２２）
（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ
（Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）ｎ
Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号２３）
（Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ
上記のｎは１以上の整数を示す。ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。

【0047】

１つの実施形態において、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域は、配列番号１４のアミノ酸番号１から２５４までのアミノ酸配列からなる。

【0048】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む。

【0049】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む。

【0050】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体において、Ｆｃ領域を構成する第一Ｆｃポリペプチド及び第二Ｆｃポリペプチドが由来する重鎖定常領域としては、Ｉｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ又はＩｇεのいずれの定常領域も選択可能である。Ｉｇγとしては、例えば、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４から選択することが可能である。１つの実施形態において、第一Ｆｃポリペプチド及び第二Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇγ１定常領域に由来するＦｃポリペプチドである。

【0051】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体におけるＦｃ領域は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）や補体依存性傷害活性（ＣＤＣ）を低下させる変異を含んでもよい。Ｌ２３４Ａとは、ヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸２３４位のロイシンのアラニンへの置換である。Ｌ２３５Ａとは、ヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸２３５位のロイシンのアラニンへの置換である。ヒトＩｇγ１定常領域Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異を「ＬＡＬＡ変異」という。当該変異は、抗体の抗体依存性細胞傷害活性や補体依存性傷害活性を低下させることが知られている（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９２、Ｖｏｌ．２９、ｐ．６３３－６３９；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、Ｖｏｌ．１６４、ｐ．４１７８－４１８４）。

【0052】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体におけるＦｃ領域は、さらに他の公知技術に基づく変異を含んでもよい。例えば、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７Ｇ変異（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｅｌｌ、２０１８、Ｖｏｌ．９ 、ｐ．６３－７３）又はノブズ・イントゥー・ホールズ（Ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）技術に基づく変異（以下、「ノブズ・イントゥー・ホールズ変異」とも称する）を含んでもよい。ノブズ・イントゥー・ホールズ技術は、一方の重鎖のＣＨ３領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（ｋｎｏｂ；突起）に置換し、もう一方の重鎖のＣＨ３領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（ｈｏｌｅ；空隙）に置換することにより、突起が空隙内に配置されるようにして、重鎖のヘテロ二量体化を促進し、目的のヘテロ二量体化抗体分子を効率的に取得できる技術である（Ｎａｔｕｒｅ、１９９４、Ｖｏｌ．３７２、ｐ．３７９－３８３；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９８、Ｖｏｌ．１６、ｐ．６７７－６８１；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９７、Ｖｏｌ．２７０、ｐ．２６－３５；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０１３、Ｖｏｌ．１１０、ｐ．Ｅ２９８７－Ｅ２９９６）。

【0053】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異（ＬＡＬＡ変異）を含むＦｃ領域を含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｎ２９７Ｇ変異を含むＦｃ領域を含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ノブズ・イントゥー・ホールズ変異を含むＦｃ領域を含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異（ＬＡＬＡ変異）、Ｎ２９７Ｇ変異、及びノブズ・イントゥー・ホールズ変異のうちの１つ以上の変異を含むＦｃ領域を含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異（ＬＡＬＡ変異）、Ｎ２９７Ｇ変異、及びノブズ・イントゥー・ホールズ変異を含むＦｃ領域を含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体に含まれるノブズ・イントゥー・ホールズ変異は、そのＦｃ領域を形成する１つのＦｃポリペプチドにおけるＴ３６６Ｗ変異、並びにそのＦｃ領域を形成するもう１つのＦｃポリペプチドにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異（国際公開１９９８／０５０４３１号を参照）である。

【0054】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６のアミノ酸番号２３５から４５１までのアミノ酸配列からなる第一Ｆｃポリペプチド及び配列番号１４のアミノ酸番号２７０から４８６までのアミノ酸配列からなる第二ＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域を含む。

【0055】

なお、本明細書において、ＬＡＬＡ変異、Ｎ２９７Ｇ変異、ノブズ・イントゥー・ホールズ変異等のアミノ酸変異の記載は、ヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置に基づくものである。例えば、前述の通り、Ｌ２３４Ａとは、ヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸２３４位のロイシンのアラニンへの置換である。

【0056】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントとＦｃポリペプチド（第一Ｆｃポリペプチド）は、ヒンジ領域を介して連結され、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖を構成してもよい。
また、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体において、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域とＦｃポリペプチド（第二Ｆｃポリペプチド）は、ヒンジ領域を介して連結されても良い。

【0057】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖を含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結されたポリペプチドを含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、及び抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結されたポリペプチドを含む。

【0058】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結されたポリペプチドを含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結されたポリペプチドを含む。

【0059】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結されたポリペプチドを含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結されたポリペプチドを含む。

【0060】

１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖は、配列番号６又は１０のアミノ酸配列からなる。１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖は、配列番号６のアミノ酸配列からなる。１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖は、配列番号８又は１２のアミノ酸配列からなる。１つの実施形態において、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖は、配列番号８のアミノ酸配列からなる。１つの実施形態において、抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドがヒンジ領域を介して連結されたポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６又は１０のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメント、配列番号８又は１２のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖及び第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、並びに配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメント、配列番号８又は１２のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖及び第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、並びに配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む。

【0061】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、及び配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む、二重特異性抗体である。

【0062】

本明細書において「翻訳後修飾」とは、抗体を細胞内で発現させた場合に抗体が翻訳後に修飾を受けることをいう。翻訳後修飾の例として、重鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等の修飾や、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断によるリジン欠失が挙げられる。種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、２００８、Ｖｏｌ．９７、ｐ．２４２６－２４４７）。

【0063】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、翻訳後修飾されていてもよい。１つの実施形態において、翻訳後修飾は重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端リジン欠失である。Ｎ末端のピログルタミル化又はＣ末端リジン欠失による翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６、Ｖｏｌ．３４８、ｐ．２４－３９）。

【0064】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＴＳＰＡＮ８（遺伝子番号：ＮＭ＿００４６１６．２）及びヒトＣＤ３εδ複合タンパク（ＣＤ３ε遺伝子番号：ＮＭ＿０００７３３．３、ＣＤ３δ遺伝子番号：ＮＭ＿０００７３２．４又はＮＭ＿００１０４０６５１．１）に結合する。ヒトＴＳＰＡＮ８及びヒトＣＤ３εδ複合タンパクに結合するか否かは、公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。結合活性を測定する方法としては、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法、フローサイトメトリー法等の方法が挙げられる。ＥＬＩＳＡ法を用いる場合は、例えば実施例８に記載される方法を用いることができ、フローサイトメトリー法を用いる場合には、例えば実施例１に記載される方法を用いることができる。

【0065】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、本明細書に開示される、抗ＴＳＰＡＮ８抗体及び抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報等に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者であれば作製し得る。また、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体の抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域は、公知の抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報等に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者であれば作製し得る。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体である。ヒト化抗体の作製にあたっては、当業者に周知の方法を用いて、適宜バックミューテーションを導入してもよい（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１５、Ｖｏｌ．３１、ｐ．４３４－４３５）。本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、特に限定されるものではないが、例えば、後述の＜本発明の二重特異性抗体を生産する方法及び該方法により生産される本発明の二重特異性抗体＞に記載の方法に従い製造することができる。

【0066】

＜本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチド＞
本発明はまた、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体を生産するために使用されうる、以下のポリヌクレオチド（「本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチド」とも称する）を提供する。
（１）抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドを含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（３）抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0067】

上記（１）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0068】

上記（１）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号の６アミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0069】

上記（１）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

【0070】

上記（２）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0071】

上記（２）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号の８アミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0072】

上記（２）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

【0073】

上記（３）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、以下のポリヌクレオチドである：
配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、並びに配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0074】

上記（３）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、以下のポリヌクレオチドである：
配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0075】

上記（３）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

【0076】

本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者であれば作製し得る。例えば、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、国際公開番号９０／０７８６１号に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。

【0077】

＜本発明の二重特異性抗体の発現ベクター＞
本発明はまた、以下の（１）～（３）に記載の本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（「本発明の二重特異性抗体の発現ベクター」とも称する）を提供する。これらのポリヌクレオチドは、それぞれが別々のベクターに含まれていてもよく、又は複数のポリヌクレオチドが１つのベクターに含まれていてもよい。
（１）抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（３）抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0078】

上記（１）のポリヌクレオチドを含む本発明の二重特異性抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0079】

上記（１）のポリヌクレオチドを含む本発明の二重特異性抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号の６アミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0080】

上記（１）のポリヌクレオチドを含む本発明の二重特異性抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。

【0081】

上記（２）のポリヌクレオチドを含む本発明の二重特異性抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0082】

上記（２）のポリヌクレオチドを含む本発明の二重特異性抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号の８アミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0083】

上記（２）のポリヌクレオチドを含む本発明の二重特異性抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。

【0084】

上記（３）のポリヌクレオチドを含む本発明の二重特異性抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下のポリヌクレオチドを含む：
配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、並びに配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0085】

上記（３）のポリヌクレオチドを含む本発明の二重特異性抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下のポリヌクレオチドを含む：
配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0086】

上記（３）のポリヌクレオチドを含む本発明の二重特異性抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。

【0087】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、以下の（ａ）～（ｅ）より選択される１以上の数のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、並びに配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0088】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、以下の（ａ）～（ｅ）より選択される１以上の数のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである：
（ａ）配列番号の６アミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号の８アミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0089】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、以下の（ａ）～（ｃ）より選択される１以上の数のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである：
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0090】

本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）等の各種宿主細胞中において本発明のポリヌクレオチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）－ＭＡＸ（プロメガ）、ｐＨＥＫ２９３ Ｕｌｔｒａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社）、ｐＥＥ６．４又はｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）等を使用することができる。ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスを使用することができる。例えば、細胞へ本発明のポリヌクレオチドを導入するためにレンチウイルスを使用する場合、当該レンチウイルスは、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ／ＥＦ１αベクター（タカラバイオ社）、ｐＬｅｎｔｉベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターに使用されるベクターは、ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．４－ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）である。

【0091】

本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドに動作可能なように連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母で本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。

【0092】

宿主細胞として、動物細胞、昆虫細胞又は酵母を用いる場合、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、エンハンサー配列、本発明の抗体又はその重鎖若しくは軽鎖をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位などを含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる薬剤選択マーカー遺伝子（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。

【0093】

＜本発明の形質転換された宿主細胞＞
本発明はまた、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞（「本発明の形質転換された宿主細胞」とも称する）を提供する。本発明の形質転換された宿主細胞は、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターによる形質転換によって、以下の（１）～（３）の本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドの１つ又は複数のポリヌクレオチドを含んでよく、１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（１）～（３）のポリヌクレオチドを全て含む：
（１）抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（２）抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（３）抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドを含むポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0094】

形質転換される宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、抗体又は融合体を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。形質転換される宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される従来細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（登録商標）細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ０細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、細菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の宿主細胞はＣＨＯ－Ｋ１細胞、又はＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞である。

【0095】

宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、又はリポフェクション方等の当業者に一般的に用いられる方法を使用することができる。

【0096】

形質転換された宿主細胞の選別は、当業者に一般に使用されている方法にて行うことができる。選別方法には、例えば、薬剤選択マーカー遺伝子とテトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシン又はハイグロマイシン等の薬剤を用いた薬剤選択法や、限外希釈法、シングルセルソーティング法、又はコロニーピックアップ法等の細胞単離法を用いることができる。

【0097】

上記（１）のポリヌクレオチドを含む本発明の形質転換された宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0098】

上記（１）のポリヌクレオチドを含む本発明の形質転換された宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号の６アミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0099】

上記（１）のポリヌクレオチドを含む本発明の形質転換された宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。

【0100】

上記（２）のポリヌクレオチドを含む本発明の形質転換された宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0101】

上記（２）のポリヌクレオチドを含む本発明の形質転換された宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号の８アミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0102】

上記（２）のポリヌクレオチドを含む本発明の形質転換された宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。

【0103】

上記（３）のポリヌクレオチドを含む本発明の形質転換された宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下のポリヌクレオチドを含む：
配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、並びに配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0104】

上記（３）のポリヌクレオチドを含む本発明の形質転換された宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下のポリヌクレオチドを含む：
配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0105】

上記（３）のポリヌクレオチドを含む本発明の形質転換された宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖと第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。

【0106】

１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）～（ｅ）より選択される１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞である：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、並びに配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0107】

１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）～（ｅ）より選択される１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞である：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖと第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0108】

１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）～（ｃ）から選択されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞である：
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖと第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0109】

１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、配列番号１４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。

【0110】

＜本発明の二重特異性抗体を生産する方法＞
本発明はまた、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体を生産する方法（「本発明の生産方法」とも称する）を提供する。本発明の生産方法には、＜本発明の形質転換された宿主細胞＞に記載の形質転換された宿主細胞を培養し、該細胞又は該培養上清中に該抗体を発現させる工程、該抗体を回収、単離、精製する方法等が含まれうるが、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体が生産される限りにおいて、これらの方法に限定されるものではない。

【0111】

本発明の形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、当業者により適宜選択されうる。宿主細胞が動物細胞の場合、培地としては、例えば、約５～２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９５９、Ｖｏｌ．１３０、ｐ．４３２－４３７）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌ．、１９５９、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、１９６７、Ｖｏｌ．１９９、ｐ．５１９）、１９９培地（Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１９５０、Ｖｏｌ．７３、ｐ．１－８）等を用いることができる。培地のｐＨは、例えば、約６～８であり、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約３０～４０℃で約１５～３３６時間行われる。宿主細胞が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９８５、Ｖｏｌ．８２、ｐ．８４０４）等を用いることができる。培地のｐＨは、例えば、約５～８であり、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０～４０℃で約１５～１００時間行われる。宿主細胞が大腸菌又は酵母である場合、培地としては、例えば、栄養源を含有する液体培地が適当である。栄養培地は、例えば、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源、又は有機窒素源を含んでいる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖等が、無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等が挙げられる。所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン）等を含んでいてもよい。培地のｐＨは、例えば、約５～８である。宿主細胞が大腸菌の場合、培地としては、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｖｏｌ．３、Ａ２．２）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約１４～４３℃で約３～２４時間行われる。宿主細胞が酵母の場合、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９８０、Ｖｏｌ．７７、ｐ．４５０５）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０～３５℃で約１４～１４４時間行われる。上述のような培養により、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体を発現させることができる。

【0112】

本発明の生産方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体を発現させる工程に加えて、さらには、該形質転換された宿主細胞から抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体を回収、単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。１つの実施形態において、培養上清中に分泌された抗体は、各種クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。

【0113】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体には、本発明の生産方法によって生産され抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体も含まれる。

【0114】

＜本発明の二重特異性抗体の医薬組成物等＞
本発明の医薬組成物には、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。

【0115】

本発明の医薬組成物には、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体の翻訳後修飾体を含み得る。例えば、Ｃ末端リジンの欠失やＮ末端のピログルタミル化の両方又は一方を受けた抗体等を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。

【0116】

１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下（ａ）及び（ｂ）から選択される本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体を含有する医薬組成物である：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む、二重特異性抗体；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域、及び配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む、二重特異性抗体。

【0117】

１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下（ａ）及び（ｂ）から選択される本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体を含有する医薬組成物である：
（ａ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む、二重特異性抗体；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む、二重特異性抗体。

【0118】

１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号６のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖フラグメントと第一Ｆｃポリペプチドが連結された抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖、及び配列番号１４のアミノ酸配列からなる抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドを含む抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体を含有する医薬組成物である。

【0119】

製剤化における本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＴＳＰＡＮ８抗体の添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。

【0120】

＜本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体の医薬用途＞
本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体、及びそれらを含有する医薬組成物は、がんの治療のために用いることができる。また、本発明には、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体の治療有効量を対象に投与する工程を包含する、がんを治療する方法が含まれる。また、本発明には、がんの治療に使用するための、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む。また、本発明には、がんの治療用医薬組成物の製造における、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体の使用が含まれる。本発明による治療の対象となるがんは、特に限定されないが、例えば、種々の腹膜播種がん、胃がん、肺がん、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、ノンホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫等の血液がん、骨髄異形成症候群、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、中皮腫、皮膚がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、胆のうがん、胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、結腸がん、大腸がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、精巣がん、卵巣がん、脳腫瘍等の固形がん、並びに骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんの他、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫や、膠芽腫、多形性膠芽腫、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫等が挙げられる。

【0121】

＜本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体＞
本発明はまた、以下に説明する、ヒトＴＳＰＡＮ８に対する新規な抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその結合フラグメントを提供する。本発明により提供される抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントを纏めて「本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント」とも称する。

【0122】

本発明は、ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に選択的に結合する抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその結合フラグメントを提供する。

【0123】

本明細書において、「ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に選択的に結合する」とは、ある抗ＴＳＰＡＮ８抗体を、 市販抗ＴＳＰＡＮ８抗体（ＴＡＬ６９、ＲＥＡ４４３等）又は市販抗ＴＳＰＡＮ８抗体と同様の結合プロファイルを示す抗ＴＳＰＡＮ８抗体（例えば９Ｆ６、１８Ｃ１０等）と結合活性の比較をした場合に、市販抗体等に比べてヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に発現するＴＳＰＡＮ８への結合強度が、３倍以上、好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上であり、且つ、正常細胞に発現するＴＳＰＡＮ８への結合強度が１／３以下、好ましくは１／５以下、さらに好ましくは１／１０以下であることを指す。抗体の細胞への結合強度は、例えば実施例１に示すフローサイトメトリー法で得られたＭＦＩ（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）値、又は各抗体のＭＦＩより各Ｉｓｏｔｙｐｅ ＭＦＩを引いて算出したΔＭＦＩ値を用いて算出することができる。また、抗体の細胞への結合強度は、がん細胞と正常細胞を用いたＥＬＩＳＡ法等、当業者が通常使用しうる方法によっても測定及び算出することができる。
ここで、ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞とは、がん患者より単離したヒトＴＳＰＡＮ８発現するがん細胞をいい、実施例１－１に記載した患者由来のがん腹膜播種細胞の他に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等の細胞バンク等より入手可能ながん細胞株を用いることができる。がん細胞株としては、例えば、実施例１－１に記載した方法にて患者腹水から樹立された細胞株の他に、ＡＧＳ、ＫＡＴＯIII、ＳＮＵ５、ＳＮＵ１６、ＳＮＵ５２０、ＡＮＵ７１９、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＨＴ－２９、ＬｏＶｏ、ＧＰ２ｄ、ＡｓＰＣ－１、ＯＥ１９、Ｌｉ－７Ｈｓ７４６、ＮＵＧＣ－４、ＯＣＵＭ１、ＭＮＫ４５等のＴＳＰＡＮ８を発現する細胞株を使用することができる。また、正常細胞とは、正常組織由来の細胞をいい、実施例１－５で用いた患者由来腹膜中皮細胞の他に、実施例１－３で用いたヒト末梢血単核細胞、実施例１－３で用いた培養腹膜中皮細胞等の市販の初代培養細胞又は細胞株を使用することができる。１つの実施形態において、正常細胞はＴＳＰＡＮ８を発現している。１つの実施形態において、ＴＳＰＡＮ８を発現している正常細胞は患者由来腹膜中皮細胞及び実施例１－３で用いた培養腹膜中皮細胞である。１つの実施形態において、正常細胞はＴＳＰＡＮ８を発現していない細胞である。１つの実施形態において、ＴＳＰＡＮ８を発現していない正常細胞は実施例１－３で用いたヒト末梢血単核細胞である。

【0124】

本発明はまた、ＴＳＰＡＮ８タンパク質の一部をエピトープとして認識する抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。１つの実施形態において、当該エピトープはＴＳＰＡＮ８のＬＥＬ領域に含まれるアミノ酸配列からなる構造単位である。１つの実施形態において、当該エピトープは配列番号２の１２６から１５５までのアミノ酸配列で示されるＴＳＰＡＮ８タンパク質の一部の領域からなる構造単位である。１つの実施形態において、当該エピトープは配列番号２の１２６から１５５までのアミノ酸配列で示されるＴＳＰＡＮ８タンパク質の一部の領域に含まれる１又は２以上のアミノ酸配列からなる構造単位である。１つの実施形態において、当該エピトープは少なくとも配列番号２のアミノ酸番号１３１を含む構造単位である。

【0125】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸番号１２６から１５５までのヒトＴＳＰＡＮ８の領域に存在する少なくとも１個のアミノ酸に結合する。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸番号１２６から１５５までのヒトＴＳＰＡＮ８の領域に存在する少なくとも１個のアミノ酸に結合し、かつ、ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に選択的に結合する。

【0126】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸番号１２６から１５５までのヒトＴＳＰＡＮ８の領域に存在する少なくとも配列番号２のアミノ酸番号１３１のアミノ酸に結合する。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸番号１２６から１５５までのヒトＴＳＰＡＮ８の領域に存在する少なくとも配列番号２のアミノ酸番号１３１のアミノ酸に結合し、かつ、ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に選択的に結合する。

【0127】

抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号２のアミノ酸番号１２６から１５５までのヒトＴＳＰＡＮ８の領域に存在するアミノ酸（例えば、配列番号２のアミノ酸番号１３１のアミノ酸）に結合するか否かは、本願実施例４－１及び４－２に記載のエピトープ同定方法を使用して確認することができる。

【0128】

本発明はまた、以下の（ａ）及び（ｂ）に示す、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【0129】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択される、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントである：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント又はその抗原結合フラグメント。

【0130】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖定常領域としては、Ｉｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ又はＩｇεのいずれの定常領域も選択可能である。Ｉｇγとしては、例えば、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４から選択することが可能である。１つの実施形態において、重鎖定常領域はＩｇγ１定常領域であり、例えば、ヒトＩｇγ１定常領域である。また、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖定常領域は、ＡＤＣＣやＣＤＣを低下させるためにＬＡＬＡ変異等のアミノ酸変異を含んでもよい。本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖定常領域としては、Ｉｇλ又はＩｇκのいずれの定常領域も選択可能であり得る。１つの実施形態において、軽鎖定常領域はＩｇκ定常領域であり、例えば、ヒトＩｇκ定常領域である。

【0131】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又は片腕抗体である。

【0132】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体は、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択される、抗ＴＳＰＡＮ８抗体である：
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体。

【0133】

本発明はまた、以下の（ａ）～（ｄ）に示す、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント（これらを纏めて特に「本発明の競合抗ＴＳＰＡＮ８抗体」とも称する）を提供する：
（ａ）ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に対する結合に関して配列番号４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体と競合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント；
（ｂ）ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に対する結合に関して配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体と競合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント；
（ｃ）ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に対する結合に関して配列番号３４のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体と競合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント；
（ｄ）ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に対する結合に関して配列番号３５のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体と競合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【0134】

本発明の競合抗ＴＳＰＡＮ８抗体は、例えば、ヒトＴＳＰＡＮ８発現細胞を抗原として公知の抗体作製技術を用いてヒトＴＳＰＡＮ８に対する抗体を取得し、得られた抗体について、競合対象の抗ＴＳＰＡＮ８抗体とのヒトＴＳＰＡＮ８発現細胞に対する結合に関する競合試験を行うことによって、当業者であれば取得可能である。競合試験としては、フローサイトメトリー法等、当業者に公知の方法を用いることができ、例えば、実施例４－３に記載のヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞を用いた競合試験を使用することができる。競合試験に使用するヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞としては、前述の種々の細胞が使用可能である。

【0135】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記（ａ）及び（ｂ）のいずれかより選択される、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントである：
（ａ）ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に対する結合に関して配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体と競合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に対する結合に関して配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖と配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体と競合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【0136】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記（ｃ）及び（ｄ）のいずれかより選択される、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントである：
（ｃ）ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に対する結合に関して配列番号３４のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と配列番号３６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体と競合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｄ）ヒトＴＳＰＡＮ８発現がん細胞に対する結合に関して配列番号３５のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３７のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体と競合する、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント。

【0137】

＜本発明の他の二重特異性抗体＞
本発明は、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ；ＮＫ）細胞の表面抗原に対する抗体又はその抗原結合フラグメントと連結された本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントを含む二重特異性抗体を提供する。該二重特異性抗体の形状は特に限定されず、例えば非特許文献３又は４に記載されている種々の形状の抗体等、当業者によって一般的に使用されうる形状をとることができる。

【0138】

本発明はまた、以下の二重特異性抗体を提供する：
ＴＳＰＡＮ８及びＴ細胞又はＮＫ細胞の表面抗原に結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる、抗ＴＳＰＡＮ８抗体のＦａｂ領域、
（ｂ）Ｔ細胞又はＮＫ細胞の表面抗原に対する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の表面抗原に対する抗体のｓｃＦｖ領域、及び
（ｃ）（ａ）のＦａｂ領域の重鎖フラグメントに連結された第一Ｆｃポリペプチド及び（ｂ）のｓｃＦｖ領域に連結された第二Ｆｃポリペプチドからなる、Ｆｃ領域、
からなる、二重特異性抗体。

【0139】

本発明の他の二重特異性抗体は、当業者であれば、非特許文献４に記載の方法又は＜本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体＞の記載を参考に一般的な方法を用いて作製することができる。Ｔ細胞又はＮＫ細胞の表面抗原に対する抗体としては、現在までに多くの抗体が知られており（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０２０、Ｖｏｌ．６５、ｐ．９－１６）、これらの抗体の配列情報を使用することができる。本発明の他の二重特異性抗体の実施態様については、抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖ領域を用いること以外は、＜本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体＞に記載のとおりである。本発明の他の二重特異性抗体もまた、がんの治療に使用されうる。

【0140】

１つの実施形態において、本発明の他の二重特異性抗体のＴ細胞又はＮＫ細胞の表面抗原に対する抗体又はその抗原結合フラグメントとしては、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の表面抗原に対する抗体又はその抗原結合フラグメントである。１つの実施形態において、当該Ｔ細胞又はＮＫ細胞の表面抗原に対する抗体又はその抗原結合フラグメント、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ － １）抗体、抗ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １－ Ｌｉｇａｎｄ １）、抗体、抗ＴＩＧＩＴ（Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ＩＴＩＭ ｄｏｍａｉｎｓ）抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｇｒｏｕｐ ２，ｍｅｍｂｅｒ Ｄ）抗体、又はそれら抗原結合フラグメントである。１つの実施形態において、当該Ｔ細胞又に対する抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントである。１つの実施形態において、当該抗ＣＤ３抗体の抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖである。

【0141】

＜本発明の融合体、複合体及び本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞＞
本発明はまた、ＴＳＰＡＮ８以外の他タンパク質（抗体を含む）やポリペプチドを連結した、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント（「本発明の融合体」ともいう）を提供する。本発明の融合体に用いられるタンパク質やポリペプチドは特に限定されず、例えば、各種抗体、サイトカイン、ケモカイン、ヒト血清アルブミン、各種タグペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、その他の多量体化を促進しうるペプチド又はタンパク質等を使用しうる。本発明の融合体の１つの実施形態において、タンパク質やポリペプチドが、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントに連結されている。１つの実施形態において、本発明の融合体に用いられるタンパク質やポリペプチドは、例えば顆粒球、ナチュラルキラーＴ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ；ＮＫＴ）細胞等の免疫細胞、樹状細胞、マクロファージ等の血球細胞の表面抗原に対する抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は各種インターロイキン（例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５）等の免疫細胞を活性化するポリペプチドであってよい。この場合、本発明の融合体に用いられるタンパク質やポリペプチドは、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントに直接連結していてもよく、また、任意のリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結させてもよい。

【0142】

本発明はまた、糖質、脂質、金属（放射性同位体を含む）、有機化合物（毒素、近赤外蛍光色素、キレート剤を含む）等（「修飾剤」ともいう）が結合した、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント（「本発明の複合体」ともいう）を提供する。本明細書において、「修飾剤」とは抗体又はその抗原結合フラグメントに直接又はリンカー等を介して結合している、非ペプチド性の物質を指す。本発明の複合体に用いられる修飾剤は特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、放射線同位体（例えば、ジルコニウム－８９（^８９Ｚｒ）、イットリウム－９０（^９０Ｙ）、インジウム－１１１（^１１１Ｉｎ）、アスタチン－２１１（^２１１Ａｔ）、アクチニウム－２２５（^２２５Ａｃ））、有機化合物、毒素、近赤外蛍光色素（例えばＩＲＤｙｅ（登録商標））、キレート剤等が挙げられる。当該複合体に用いられる修飾剤は、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントに直接結合していてもよく、また、任意のリンカーを介して結合していてもよい。１つの実施形態において、本発明の複合体は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）である。ＡＤＣに用いられる薬物及びリンカーは、当業者が一般に用いる薬剤及びリンカーの中より選定されうる。１つの実施形態において、本発明の複合体は、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントに放射線同位体が結合した放射性同位体標識抗体である。

【0143】

本発明はまた、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞（例えば、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｔ ｃｅｌｌ；ＣＡＲ－Ｔ細胞）を提供する。このような細胞は、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを用いて、当業者であれば作製することができる。本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる細胞としては、各種免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞等）を用いることができる。

【0144】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント、本発明の融合体、本発明の複合体、及び本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞は、ヒトＴＳＰＡＮ８（遺伝子番号：ＮＭ＿００４６１６．２）に結合する。ヒトＴＳＰＡＮ８への結合は、公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。結合活性を測定する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法等の方法が挙げられる。ＥＬＩＳＡ法を用いる場合は、例えば実施例８に記載される方法を用いることができ、フローサイトメトリー法を用いる場合には、例えば実施例１に記載される方法を用いることができる。

【0145】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント、本発明の融合体、及び複合体並びに本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体若しくはその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞における抗体又は抗原結合フラグメント部分は、翻訳後修飾されていてもよい。１つの実施形態において、翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端リジン欠失である。

【0146】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント、本発明の融合体、及び本発明の複合体並びに本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞は、本明細書に開示される本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＨ及びＶＬの配列情報、本発明の融合体に使用される他のペプチド又はタンパク質（例、抗体）、本発明の複合体に用いられる修飾剤の情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者であれば作製し得る。本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントは、特に限定されるものではないが、例えば、＜本発明の二重特異性抗体を生産する方法＞の項に記載の方法に従って生産することができる。

【0147】

＜本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体のポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、及び生産方法＞
本発明はまた、以下の（１）～（４）に記載のポリヌクレオチドを提供する：
（１）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（３）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（４）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0148】

上記（１）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0149】

上記（１）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0150】

上記（２）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0151】

上記（２）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0152】

上記（３）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0153】

上記（４）のポリヌクレオチドの１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0154】

本項に記載のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者であれば作製し得る。

【0155】

本発明はまた、以下の（１）～（４）に記載のポリヌクレオチドのうち１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（「本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の発現ベクター」とも称する）を提供する。１つの発現ベクターにそれぞれのポリヌクレオチドが１つずつ含まれていても、複数含まれていてもよい。
（１）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（２）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（３）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（４）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0156】

上記（１）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域を含むポリヌクレオチド。

【0157】

上記（１）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0158】

上記（２）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0159】

上記（２）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0160】

上記（３）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0161】

上記（４）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の発現ベクターの１つの実施形態において、該発現ベクターは、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0162】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の発現ベクターは、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターである：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0163】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の発現ベクターは、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターである：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0164】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の発現ベクターは、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターである：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0165】

本項に記載の発現ベクターは、前述の＜本発明の二重特異性抗体の発現ベクター＞に記載の方法に準じて、当業者であれば作製し得る。

【0166】

本発明はまた、以下の（１）～（４）のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞（「本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞」とも称する）を提供する。本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞は、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の発現ベクターによる形質転換によって、以下の（１）～（４）のそれぞれのポリヌクレオチドが１つずつ含んでも、複数含んでもよい。
（１）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
（２）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（３）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（４）本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0167】

上記（１）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0168】

上記（１）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0169】

上記（２）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下の（ａ）及び（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0170】

上記（２）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0171】

上記（３）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

【0172】

上記（４）のポリヌクレオチドを含む本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

【0173】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞は、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号８のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0174】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞は、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞である：
（ａ）配列番号４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０７までのアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0175】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞は、以下の（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞である：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0176】

本項に記載の宿主細胞は、前述の＜本発明の形質転換された宿主細胞＞に記載の方法に準じて、当業者であれば作製し得る。

【0177】

本発明はさらに、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体用の宿主細胞を培養する工程を含む、抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントの生産方法を提供する。本方法は、前述の＜本発明の二重特異性抗体を生産する方法＞に準じて当業者であれば実施し得る。

【0178】

＜本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体等の医薬用途＞
本発明はまた、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメント、本発明の融合体、本発明の複合体及び本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞（纏めて以下本項において「本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体等」と称する）、並びに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、がんの治療のために用いることができる。本発明はまた、本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体等の治療有効量を対象に投与する工程を含むがんを治療する方法、がんの治療に使用するための本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体等、がんの治療用医薬組成物の製造における本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体等の使用を提供する。本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体等の医薬用途は、前述の＜本発明の二重特異性抗体の医薬組成物等＞の記載に準じて当業者であれば実施し得る。本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体等の医薬用途の治療の対象となるがんは、前述の＜本発明の二重特異性抗体の医薬組成物等＞に記載のがんが挙げられる。

【0179】

＜本発明の抗ＣＤ３抗体＞
本発明はまた、以下に示す、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号１０１から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号１４のアミノ酸番号１６８から１８１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号１９７から２０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸番号２３６から２４４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメント。

【0180】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントである。

【0181】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＤ３抗体の抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖである。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＤ３抗体の抗原結合フラグメントは、配列番号１４のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸番号１４６から２５４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＣＤ３抗体ｓｃＦｖである。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＤ３抗体の抗原結合フラグメントは、配列番号１４のアミノ酸番号１から２５４までのアミノ酸配列からなる、抗ＣＤ３抗体ｓｃＦｖである。

【0182】

本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントは、＜本発明の抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体＞等の本明細書中の記載を参照して、当業者であれば作製し得る。本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントは、公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。本発明の抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、がんの治療において使用される、腫瘍抗原に対する抗体との二重特異性抗体に使用されうる。

【0183】

本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。

【実施例0184】

［実施例１：がん腹膜播種細胞に発現する抗原に選択的に結合する抗体の取得］
［実施例１－１：患者由来のがん腹膜播種細胞の取得］
患者からのがん腹膜播種細胞の取得を以下の方法で行った。患者からのがん腹膜播種細胞取得は、千脇史子、佐々木博己による文献「腹膜転移がん（胃、膵、卵巣がんなど）細胞株の樹立」（佐々木博己編『患者由来がんモデルを用いたがん研究実践ガイド』羊土社、２０１９年、p.２８-３７）に記載した方法に準じて行った。患者より採取した腹水をプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ ５０ｍＬ遠沈管（住友ベークライト社、ＭＳ－５２５５０、以下、「５０ｍＬ遠沈管」）に分注し、室温、４３０×ｇで３分間遠心した。上清を除去した後に、沈殿に溶血緩衝液を添加し、室温で１０～２０分間溶血させた。溶血緩衝液は、０．７５％ 塩化アンモニウムを含む１７ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ７．６５）を孔径０．２２μｍのフィルターで濾過して調製した。遠心後に上清を除去し、ダルベッコＰＢＳ（－）（日水製薬社、０５９１３、以下「ＰＢＳ（－）」）を５０ｍＬ加えて細胞を洗浄した。その後、室温、４３０×ｇで３分間遠心して細胞を回収した。回収した腹水中の全細胞を１０％ ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１０２７０－１０６）、×１ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１５２４００６２）を含むＲＰＭＩ－１６４０（Ｌ－グルタミン含有）培地（富士フイルム和光純薬社、１８９－０２０２５）、（以下、ＦＢＳ等を添加後の培地を「ＲＰＭＩ－１６４０培地」と称する。）に再懸濁した。１００ｍｍコラーゲンコートディッシュ（以下、「ディッシュ」）（ＩＷＡＫＩ社、４０２０－０１０）に細胞を５×１０^６～１×１０^７個／１０ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターで培養した。
腹水中の細胞には、接着系細胞と浮遊系細胞が存在する。接着系細胞には、がん細胞だけでなくがん細胞以外の細胞（線維芽細胞、腹膜中皮細胞等）も含まれている。がん細胞以外の細胞ががん細胞より短時間で剥離する性質を利用し、これらの細胞を腹水中の全細胞より分離した。具体的には、前述の腹水中の全細胞を培養したディッシュをＰＢＳ（－）で洗浄後、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１５４０００５４）２ｍＬで数分間処理することによってがん細胞以外の細胞を剥離した。剥離した細胞に含まれるがん細胞以外の細胞は、新たなディッシュにて継続培養し、実施例１－５にて使用した。
がん細胞以外の細胞を除いた後、がん細胞がディッシュ面積の８０％コンフルエント程度まで増殖した後に、全細胞の１／２を新しいディッシュへ継代する作業を繰り返し、５回以上継代したものを接着系がん細胞とした。浮遊系細胞については、培養ディッシュより培養上清５ｍＬとＲＰＭＩ－１６４０培地５ｍＬを新しい１００ｍｍディッシュへ播種して継代し、５回以上継代したものを浮遊系がん細胞とした。１人の患者に由来するがん腹膜播種細胞が接着系がん細胞と浮遊系がん細胞の両方を含んだまま増殖する場合は、それらを混合系がん細胞とした。
本明細書において、上記方法にて患者から採取した腹水より単離した接着系がん細胞、浮遊系がん細胞又は混合系がん細胞を総称して「がん腹膜播種細胞」と称する。取得した１２細胞（ＮＳＣ－７Ｃ、ＮＳＣ－９Ｃ、ＮＳＣ－１０Ｃ、ＮＳＣ－１４Ｃ、ＮＳＣ－１５ＣＦ、ＮＳＣ－１６Ｃ、ＮＳＣ－２０Ｃ、ＮＳＣ－２２Ｃ、ＮＳＣ－２４Ｃ、ＮＳＣ－３２Ｃ、ＮＳＣ－３４Ｃ及びＮＳＣ－３５Ｃ－１（以下、「１２種のがん腹膜播種細胞」とも称する。））を以後の検討に用いた。

【0185】

［実施例１－２：抗胃がん抗原抗体産生ハイブリドーマの作製］
ヒ卜モノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標） ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（米国特許６５９６５４１号））マウスを用いてがん腹膜播種細胞に結合する抗胃がん抗原抗体を取得した。
実施例１－１にて取得したがん腹膜播種細胞のうちＮＳＣ－１０Ｃ、ＮＳＣ－３５Ｃ－１、ＮＳＣ－２４Ｃ、ＮＳＣ－７Ｃ、ＮＳＣ－１４Ｃ、ＮＳＣ－３４Ｃを３細胞ずつに分けて混合し、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ ＡＤＪＵＶＡＮＴ（ＭＥＲＣＫ社、Ｔ２６８４）又はＰＢＳ（－）に懸濁し、がん腹膜播種細胞懸濁液を調製した。この懸濁液をベロシミューンマウスに免疫し、常法に従いハイブリドーマを作製した。自動ピッキング装置にてハイブリドーマの単コロニーを単離し、モノクローン化ハイブリドーマ細胞（以下、「クローン」）を取得した。単離したクローンを３７℃、８％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養し、培養４日後の上清を９６ウェルプレートに回収し、以下の実験に用いた。

【0186】

［実施例１－３：がん腹膜播種細胞に選択的に結合する抗胃がん抗原抗体の選別］
１．がん腹膜播種細胞及びＥｐＣＡＭ発現細胞への抗胃がん抗原抗体の結合確認
実施例１－２にて得られたクローンの細胞上清には抗体（以下、「クローン上清に含まれる抗体」）が含まれている。
まず、クローン上清に含まれる抗体と実施例１－１で取得した１２種のがん腹膜播種細胞との結合をフローサイトメトリー法にて測定し、がん腹膜播種細胞に強く結合する抗体を産生するクローンを選抜した。フローサイトメトリーには、ＢＶ４２１ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５６３８４６）を用いた。次に、がん抗原であるＥｐＣＡＭに結合する抗体を提供するクローンを除外するために、クローン上清に含まれる抗体とヒトＥｐＣＡＭ－Ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞との結合を測定した。ヒトＥｐＣＡＭ－Ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＥＰＣＡＭ（Ｍｙｃ－ＤＤＫ－ｔａｇｇｅｄ）－Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥＰＣＡＭ）（ＯＲＩＧＥＮＥ社、ＲＣ２０１９８９）をＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）にトランスフェクションすることにより作製した。当該細胞とクローン上清に含まれる抗体の結合をフローサイトメトリー法にて測定した。フローサイトメトリー法には、ＢＶ４２１ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇを用いた。ＥｐＣＡＭ発現細胞に結合活性を示さない上清を提供するクローンを選択するために、当該細胞に結合するクローンを除外した。陽性コントロールとして、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１Ｂ７）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１４－９３２６）を使用した。
上記実験により、１２種のがん腹膜播種細胞中の１０種以上について結合し、且つ、ヒトＥｐＣＡＭには結合しない抗体を提供するクローンを選定した。

【0187】

２．ヒト末梢血単核細胞に対する抗体の結合確認
さらに、がん腹膜播種細胞に選択的に結合する抗体を提供するクローンを選抜するために、ヒト末梢血単核細胞に結合する抗体を提供するクローンを除外した。
ヒト末梢血単核細胞と各クローンが提供する抗体との結合の測定にはフローサイトメトリー法を用いた。ヒト末梢血由来単核細胞として、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ（ｈＭＮＣ－ＰＢ），ｐｏｏｌｅｄ，ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｅ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｃ－１２９０８）を用いた。フローサイトメトリー法には、ＰＥ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５５０５８９、以下「ＰＥ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ」）、ＢＶ４２１ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ３（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５６２４２６）、ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１４（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５５５３９９）、ＢＢ５１５ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１９（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５６４４５６）を用いた。

【0188】

３．ハイブリドーマ上清からの抗体精製
実施例１－３の１．及び２．の工程において選別したクローンをＣＤハイブリドーマメディウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１１２７９０２３）で培養した。培養上清から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社、１７－５４３８－０２）を用いて、抗体を精製した（以下、「精製抗体」）。抗体の精製は常法に従った。

【0189】

４．培養ヒト腹膜中皮細胞に対する精製抗体の結合
がん腹膜播種細胞に選択的に結合する抗体を選抜するために、実施例１－３の３．で得た精製抗体から培養ヒト腹膜中皮細胞に結合する抗体を除外した。培養ヒト腹膜中皮細胞としてＨｕｍａｎ Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｚｅｎｂｉｏ社、ＭＥＳ－Ｆ、Ｌｏｔ．ＭＥＳＭ０１２９１６Ｂ）（本明細書にて「培養ヒト腹膜中皮細胞」と称す）を用い、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｚｅｎｂｉｏ社、ＭＳＯ－１）にて培養した。精製抗体と培養ヒト腹膜中皮細胞との結合の測定にはフローサイトメ卜リ一法を用いた。フローサイトメ卜リ一法には、ＰＥ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇを用いた。培養ヒト腹膜中皮細胞に結合しない又は弱い結合を示す抗体を選別し、１４種の精製抗体を取得した（以下、「１４種の精製抗体」）。

【0190】

［実施例１－４：取得された抗体が認識する抗原分子候補の同定］
１４種の精製抗体について抗原候補分子の同定を行った。同定方法の例として、１６Ｂ１１、１６Ｂ１２及び２１Ｆ７における抗原候補分子の同定方法を詳述する。
本実験におけるコントロール抗体として、がん腹膜播種細胞への結合パターンが１６Ｂ１１と異なっていた５Ｄ３、９Ａ１、２１Ａ３を使用した。
ＮＳＣ－１５ＣＦ細胞の細胞破砕液を作製した。細胞破砕液に、１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、２１Ｆ７及びコントロール抗体３種（５Ｄ３、９Ａ１、２１Ａ３）のうちのいずれか１抗体を添加した。さらにＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１０００３Ｄ）を加えて攪拌及び洗浄を行った。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに結合したタンパク質をＴｒｉｐｓｉｎ／ＬｙｓＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｖ５０７２）を用いて消化し、ペプチド混合物を得た。ペプチド混合物を含む溶液をＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いたＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定に供した。得られたＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータをＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（Ｗａｔｅｒｓ社）及びＭａｓｃｏｔ（マトリクスサイエンス社）のソフトを用いて比較定量解析及びペプチド／タンパク質同定を行い、結合タンパク質を同定した。１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、又は２１Ｆ７のデータをそれぞれコントロール抗体のデータと比較し、１６Ｂ１１及び２１Ｆ７の抗原候補分子としてＴＳＰＡＮ８を同定した。本実験では１６Ｂ１２の抗原候補分子は同定できなかった。
５Ｂ７、９Ｆ６、１２Ｃ１２、１３Ａ９、１５Ｄ１、１８Ｃ１０及び１９Ｅ４についても上記と同様の手法を用いて実験を行い、ＴＳＰＡＮ８を抗原候補分子として同定した。コントロール抗体として５Ｄ３、９Ａ１、２１Ａ３に加え２４Ｃ７を用いた。１６Ｂ１２は、抗原候補分子の同定には至らなかったが、実施例１－３にて１６Ｂ１１と同様の結合プロファイルを示したので、ＴＳＰＡＮ８を抗原候補と推定して後の検討を行った。
さらに、抗原を特定するために、ヒトＴＳＰＡＮ８－Ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞に対する結合実験を行った。ヒトＴＳＰＡＮ８－Ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞にＴＳＰＡＮ８（Ｍｙｃ－ＤＤＫ－ｔａｇｇｅｄ）－Ｈｕｍａｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ８（ＴＳＰＡＮ８）（ＯＲＩＧＥＮＥ社、ＲＣ２０２６９４）（配列番号２）をトランスフェクションすることにより作製した。結果、１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、５Ｂ７、９Ｆ６、１２Ｃ１２、１３Ａ９、１５Ｄ１、１８Ｃ１０、１９Ｅ４、２１Ｆ７の１０種の抗体（「１０種類の抗ＴＳＰＡＮ８抗体」ともいう）がヒトＴＳＰＡＮ８－Ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合し、ＴＳＰＡＮ８を抗原として認識することが確認された。

【0191】

［実施例１－５：抗ＴＳＰＡＮ８抗体の各種細胞に対する結合活性の確認］
１．がん腹膜播種細胞に対する結合活性の確認及び数値化
胃がん患者腹水より単離した７種のがん腹膜播種細胞（ＫＭ－２９１－Ａｓ、ＫＭ－５５５－Ａｓ、ＫＭ－５５６－Ａｓ、Ｐ－２４９－Ａｓ、ＫＭ－５６８－Ａｓ、ＫＭ－５７０－Ａｓ及びＫＭ－５７７－Ａｓ）と４種類の抗ＴＳＰＡＮ８抗体との結合をフローサイトメトリー法により測定した。
ＫＭ－２９１－Ａｓは、患者の腹水より実施例１－１と同様の方法を用いて調製した。調製したＫＭ－２９１－Ａｓには、ＣＤ４５を発現する血球系細胞が多く含まれていたため、がん細胞を濃縮するために、ＣＤ４５発現細胞をカラムで除去した。詳細には、５×１０^７個の細胞を含む細胞懸濁液を、ＣＤ４５ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０４５－８０１）を用い、常法に従いＰｒｅ－Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（３０μｍ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０４１－４０７）とＳｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０４２－４０１）（以下、「Ｃｏｌｕｍｎ」）に通した。Ｃｏｌｕｍｎ通過液を５０ｍＬ遠沈管に回収して遠心分離した。沈殿にｂｕｆｆｅｒ １０ｍＬを加え細胞を再懸濁した。この細胞懸濁液から５×１０^６個の細胞を１．５ｍＬマイクロチューブ（ＷＡＴＳＯＮ社、１３１－７１５５Ｃ）へ分取し、遠心分離により沈殿を得た。沈殿に２％ ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１５１４０－１２２）を含むＰＢＳ（ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ）を９５０μＬ加えて細胞懸濁液を調製した。ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを５０μＬ加え、氷中で１０分間反応させた。この反応液を７本の１．５ｍＬマイクロチューブへ１００μＬずつ分注し、以下の方法で細胞の染色を行った。７本中３本のマイクロチューブにｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１－ＰＥ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０９２－２１２）を５μＬずつ加え、次にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識されたコントロール抗体を各マイクロチューブへ２．５μＬずつ添加し、Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌとした。コントロール抗体として、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５５８０５３）、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５５８７１３）、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ３ Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５６０８０３）のいずれか使用した。残り４本のマイクロチューブには、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０９１－２５３）を５μＬずつ加え、さらに１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、９Ｆ６、１８Ｃ１０をマイクロチューブにそれぞれ２．５μＬ（０．２５μｇ／チューブ）ずつ加えて細胞を染色し、４種類の評価抗体サンプルとした。各マイクロチューブは、抗体を添加した後に、氷中で３０分間反応させた。ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬを加えて遠心分離を行い、得られた沈殿に、ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒを５００μＬ加えて細胞を再懸濁した。７-ＡＡＤ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５５９９２５）を５μＬ添加し、５ｍＬセルストレーナーキャップ付きラウンドボトムポリスチレンチューブ（ＣＯＲＮＩＮＧ社、３５２２３５）に全量を移し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社）を用いて測定を行った。データ取得にはＢＤ ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社）を用いた。
ＫＭ－５５５－Ａｓ、ＫＭ－５５６－Ａｓ、Ｐ－２４９－Ａｓ、ＫＭ－５６８－Ａｓ、ＫＭ－５７０－Ａｓ、ＫＭ－５７７－Ａｓの調製も、ＫＭ－２９１－Ａｓの調製と同様の方法にて行った。ＫＭ－５５５－Ａｓ、ＫＭ－５５６－Ａｓとの結合測定においては、評価抗体サンプルとして１６Ｂ１１、９Ｆ６及び１８Ｃ１０を用いた。Ｐ－２４９－Ａｓとの結合測定においては、評価抗体サンプルとして１６Ｂ１１及び市販抗ＴＳＰＡＮ８抗体であるＴＳＰＡＮ８ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ，ＲＥＡｆｉｎｉｔｙ（１３０－１０６－８５５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、本明細書において「ＲＥＡ４４３」）と称する）を用いた。ＫＭ－５６８－Ａｓ、ＫＭ－５７０－Ａｓ、ＫＭ－５７７－Ａｓとの結合測定においては評価抗体サンプルとして１６Ｂ１１、９Ｆ６、１８Ｃ１０及びＲＥＡ４４３を用いた。すべての実験において、Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（１３０－１１３－１９６， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）をｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌに用いた。また、細胞の染色にはＩｇＧ２ａ－ＶｉｏＢｌｕｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－１１３－２７７）及びＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）－ＶｉｏＢｌｕｅ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３１－１１３－２６６）を用いた。
各がん腹膜播種細胞のフローサイトメトリーによる測定結果の解析は、ＢＤ ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェアを用いて行った。詳細には、ＦＳＣ－Ａ（ｌｉｎ）／ＳＳＣ－Ａ（ｌｏｇ）にてプロットし、得られた細胞集団にゲートをかけ、再度ＦＳＣ－Ｗ（ｌｉｎ）／ＦＳＣ－Ａ（ｌｉｎ）で展開し、Ｓｉｎｇｌｅｔ集団のみをゲートしてサブセットを作成して解析を行った。ＫＭ－２９１－Ａｓ細胞の測定結果の解析においては、サブセットを、ＰＥ（ｌｏｇ）／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（ｌｏｇ）にて展開した。ＫＭ－５５５－Ａｓ、ＫＭ－５５６－Ａｓ、Ｐ－２４９－Ａｓ、ＫＭ－５６８－Ａｓ、ＫＭ－５７０－Ａｓ、ＫＭ－５７７－Ａｓの測定結果の解析においては、ＶｉｏＢｌｕｅ（ｌｏｇ）／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（ｌｏｇ）で展開したデータを用いた。各サンプルについて１×１０^４個の細胞サブセットについてデータを取得した。取得したｆｃｓファイルをＦｌｏｗＪｏ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社）で解析し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７におけるヒストグラムを作成した。Ｉｓｏｔｙｐｅと各評価抗体について、陽性集団のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７のＭＦＩをそれぞれ算出し、各抗体のＭＦＩより各Ｉｓｏｔｙｐｅ ＭＦＩを引いてΔＭＦＩを算出した（表１）。
得られたヒストグラムの例として、ＫＭ－２９１－Ａｓとの結合測定における１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２並びにＫＭ－５５５－Ａｓ及びＫＭ－５５６－Ａｓとの結合測定における１６Ｂ１１、９Ｆ６、１８Ｃ１０の結合を示すヒストグラムをそれぞれ図１－１から図１－３に示す。

【0192】

２．培養ヒト腹膜中皮細胞に対する結合活性の確認及び数値化
実施例１－４にて同定された１０種類の抗ＴＳＰＡＮ８抗体と培養ヒト腹膜中皮細胞の結合活性を測定した。培養ヒト腹膜中皮細胞は正常細胞である。
実施例１－３にて得た１０種類の抗ＴＳＰＡＮ８抗体及び市販抗ＴＳＰＡＮ８抗体のＰｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＴＳＰＡＮ８ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、３６３７０２ Ｃｌｏｎｅ ＴＡＬ６９、本明細書にて「ＴＡＬ６９」と称する）の培養ヒト腹膜中皮細胞への結合をフローサイトメトリー法により測定した。２次抗体としてＰＥ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇを使用した。得られたヒストグラムを図２－１及び図２－２に示す。また、フローサイトメトリーの結果を、ＦｌｏｗＪｏを用いて解析することにより、各細胞集団のＰＥについてのＭＦＩをそれぞれ算出した。陰性コントロール抗体として、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、４０１４０８）、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＮＡ／ＬＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５５４６４５）及びＰｕｒｉｆｉｅｄ ＮＡ／ＬＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５５９５３０）の３種の抗体を解析に用いた。１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、９Ｆ６、１８Ｃ１０及びＴＡＬ６９のΔＭＦＩ値を表１に記載する。抗体のΔＭＦＩ値は、各抗体のＭＦＩ値から陰性コントロール抗体のＭＦＩ値を引いて算出した。

【0193】

３．胃がん腹膜播種患者由来腹膜中皮細胞に対する結合活性の確認及び数値化
ヒト胃がん腹膜播種患者の腹水中から単離された腹膜中皮細胞（本明細書にて「患者由来腹膜中皮細胞」と称する。）であるＫＭ－５０１－Ａｓ及びＫＭ－５０３－Ａｓの取得を以下の方法で行った。
実施例１－１の細胞樹立の過程において、ディッシュ一面に敷石状に増殖した中皮細胞が見られた。この中皮細胞を０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを用いて回収し、１０％ ＦＢＳ、×１ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むＤ－ＭＥＭ（高グルコース）（富士フイルム和光純薬社、０４４－２９７６５）１０ｍＬに再懸濁した。４×１０^５個の細胞を１．５ｍＬマイクロチューブへ分取し、遠心分離後に上清を除去し、ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒを９６μＬ加えて細胞を懸濁した。ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを４μＬ加え、氷中で１０分間反応させた。この反応液５０μＬを別の１．５ｍＬマイクロチューブへ分注し、細胞２×１０^５個／５０μＬのマイクロチューブ２本とした。１本のマイクロチューブへＣＤ４５－ＡＰＣ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０９１－２３０）２μＬ、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－１１３－２６４）０．５μＬを加えた。もう１本のチューブにはｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ－ＡＰＣ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０９１－８３６）２μＬ、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１－ＰＥ抗体０．５μＬを加えた。それぞれのマイクロチューブを氷中で３０分間反応させた。ＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒをマイクロチューブに各１ｍＬ加え、遠心分離して上清を除去した。沈殿にＦＣＭ ｂｕｆｆｅｒ ５００μＬを加えて細胞を再懸濁させ、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅを用いて解析を行った。ＦＳＣ－Ａ（ｌｉｎ）とＳＳＣ－Ａ（ｌｏｇ）により細胞集団をゲーティングし、そのサブセットをＰＥ（ｌｏｇ）とＡＰＣ（ｌｏｇ）で再度展開してデータを取得した。取得したｆｃｓファイルをＦｌｏｗＪｏで解析した。結果、この細胞集団はＣＤ４５陰性且つＥｐＣＡＭ陰性の正常細胞であることが確認できた。当該患者由来腹膜中皮細胞は、腹膜播種時にがん細胞が生着、増殖するための足場となる大網や腸管膜に由来する正常細胞であると考えられる。単離した患者由来腹膜中皮細胞のＫＭ－５０１－Ａｓ及びＫＭ－５０３－Ａｓを以下の実験に使用した。
ＫＭ－５０１－Ａｓ及びＫＭ－５０３－Ａｓに対する１０種類の抗ＴＳＰＡＮ８抗体及びＴＡＬ６９の結合は、実施例１－５の２．に記載の培養ヒト腹膜中皮細胞に対する結合の測定と同様の方法にて実施した。ＫＭ－５０１－Ａｓ及びＫＭ－５０３－Ａｓに対する１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、９Ｆ６、１８Ｃ１０及びＴＡＬ６９のヒストグラムを図３－１及び図３－２に、ΔＭＦＩ値を表１に記載する。

【0194】

４．培養ヒト臍帯血管内皮細胞に対する結合活性の確認及び数値化
培養ヒト臍帯血管内皮細胞に対する１０種類の抗ＴＳＰＡＮ８抗体及びＴＡＬ６９の結合をフローサイトメトリー法により測定した。培養ヒト臍帯血管内皮細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｃ－１２２００）はＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２ Ｋｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｃ－２２１１１）を用いて培養した。陰性コントロール抗体として、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＮＡ／ＬＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、４００３４８）、ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ３，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、４０１３１０）を用いた。２次抗体としてＰＥ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇを使用した。
１０種類の抗ＴＳＰＡＮ８抗体及びＴＡＬ６９の結合のヒストグラムを図４に示す。１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、９Ｆ６、１８Ｃ１０及びＴＡＬ６９についてのΔＭＦＩ値を表１に記載する。ΔＭＦＩ値は、各抗体のＭＦＩより陰性コントロール抗体のＭＦＩを引いて算出した。
図１から図４のヒストグラムの結果及び表１の結果より、１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２は、がん腹膜播種細胞に対して高い結合を示すが、正常細胞（培養ヒト腹膜中皮細胞、患者由来腹膜中皮細胞、培養ヒト臍帯血管内皮細胞）への結合は低いことが示された。一方、他の抗ＴＳＰＡＮ８抗体である９Ｆ６、１８Ｃ１０及び市販抗ＴＳＰＡＮ８抗体（ＴＡＬ６９又はＲＥＡ４４３）のがん腹膜播種細胞に対しての結合は１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２よりも低く、正常細胞に対しての結合は１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２よりも高いことが示された。この結果から、１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２と他の抗ＴＳＰＡＮ８抗体（９Ｆ６、１８Ｃ１０、ＴＡＬ６９等）とは性質が大きく異なっていることが明らかとなった。

【表1】

【0195】

［実施例２：１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２の配列決定］
常法に従い、１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２の重鎖及び軽鎖をコ一ドする遺伝子をクロ一ニングし、抗体の配列決定を行った。ベロシミュ一ン技術は、内因性の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域が対応するヒ卜可変領域で置換されたトランスジェニックマウスを用いて抗体を作製する技術である。よって、ベロシミュ一ン技術を用いて得られた抗体は、ヒ卜抗体の可変領域とマウス抗体の定常領域を有する抗体（本明細書において「キメラ抗体」とも称する）である。得られた１６Ｂ１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３４に、該抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３６にそれぞれ示す。得られた１６Ｂ１２の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３５に、該抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号３７にそれぞれ示す。

【0196】

［実施例３：完全ヒ卜抗ＴＳＰＡＮ８抗体の作製］
［実施例３－１：完全ヒ卜抗ＴＳＰＡＮ８抗体作製に用いる発現ベクターの作製］
１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２の完全ヒト抗体を、実施例２にて同定したヒト可変領域のアミノ酸配列とヒト定常領域のアミノ酸配列とを連結して作製した。
１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２の重鎖可変領域のＮ末に配列番号３８に記載のシグナル配列をコードするアミノ酸配列を、Ｃ末にヒ卜ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列（配列番号４又は１０のアミノ酸番号１２２から４５１までの配列）をそれぞれ連結したポリペプチドを設計した。さらに、当該ポリペプチドの重鎖可変領域の１６から１９番目のアミノ酸配列からなるフーリン切断配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２、Ｖｏｌ．２６７、ｐ．１６３９６-１６４０２）の１６番目のアルギニン（Ｒ）をグリシン（Ｇ）に置換する変異を導入した。設計したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に導入した。作製した重鎖ベクターをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１１．１＿ＨＣ及びｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１２．１＿ＨＣと称する。
また、１６Ｂ１１の軽鎖可変領域のＮ末に配列番号３９に記載のシグナル配列をコードするアミノ酸配列を、１６Ｂ１２の軽鎖可変領域のＮ末に配列番号４０に記載のシグナル配列をコードするアミノ酸配列をそれぞれ連結し、両抗体のＣ末側にヒ卜κ鎖の定常領域アミノ酸配列（配列番号８又は１２のアミノ酸番号１０８から２１３までの配列）をそれぞれ連結したポリペプチドを設計した。設計したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに導入した。作製した軽鎖ベクターをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１１＿ＬＣ及びｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１２＿ＬＣと称する。

【0197】

［実施例３－２：完全ヒ卜抗ＴＳＰＡＮ８抗体の作製］
ｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１１．１＿ＨＣ及びｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１１＿ＬＣを用いて１６Ｂ１１．１抗体の作製を行った。
詳細には、ＥｘｐｉＣＨＯＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ２９１０００１）でおよそ６．０×１０^６個／ｍＬの濃度に達するまで培養されたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ２９１２７）に対し、ｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１１．１＿ＨＣ及びｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１１＿ＬＣを遺伝子導入試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ２９１２９）を用いてでトランスフェクションし、１２日間培養した。培養上清を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅを用いて精製し、完全ヒ卜抗体の精製抗体を得た。得られた抗体を１６Ｂ１１．１と称する。１６Ｂ１１．１の重鎖の塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号７に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号８にそれぞれ示す。
１６Ｂ１２．１は、ｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１２．１＿ＨＣ及びｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１２＿ＬＣを用いて上記と同様の方法により作製することができる。１６Ｂ１２．１の重鎖の塩基配列を配列番号９に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１０に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号１１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１２にそれぞれ示す。

【0198】

［実施例４：抗体の結合する抗原側のエピトープ部位の同定］
［実施例４－１：水素－重水素交換質量分析法によるエピトープマッピング］
１６Ｂ１１．１のエピトープを同定するために、水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）を実施した。結果、配列番号２のアミノ酸番号１２６～１５５に相当するヒトＴＳＰＡＮ８領域が１６Ｂ１１．１の存在下で重水素交換度が減少する領域として検出された。この結果から、配列番号２のアミノ酸番号１２６～１５５に相当するヒトＴＳＰＡＮ８領域が１６Ｂ１１．１のエピトープであると推定された。

【0199】

［実施例４－２：ヒトＴＳＰＡＮ８変異導入による重要エピトープの絞り込み］
実施例４－１で推定された領域が１６Ｂ１１．１のエピトープであるかどうかを確認するために、当該領域をマウス又はラットのＴＳＰＡＮ８の相同する領域と入れ替えたキメラタンパク質を作製して結合を評価した。ヒトＴＳＰＡＮ８のアミノ酸番号１２６～１５５に相当するマウスＴＳＰＡＮ８のアミノ酸番号１２６～１５５を配列番号４１に、ラットＴＳＰＡＮ８のアミノ酸番号１２６～１５５を配列番号４２に示す。
ＴＳＰＡＮ８とＧＦＰの融合タンパク質を発現する細胞を作製するために、実施例１－４で用いたＴＳＰＡＮ８（Ｍｙｃ－ＤＤＫ－ｔａｇｇｅｄ）－Ｈｕｍａｎ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ８（ＴＳＰＡＮ８）（ＯＲＩＧＥＮＥ社、ＲＣ２０２６９４）から制限酵素を用いヒトＴＳＰＡＮ８配列を切り出した。切り出したヒトＴＳＰＡＮ８配列ｐＣＭＶ６－ＡＣ－ＧＦＰベクター（ＯＲＩＧＥＮＥ社、ＰＳ１０００１０）にサブクローニングした（以下、「ヒトＴＳＰＡＮ８－ＧＦＰ発現ベクター」）。更に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社、６３９６３３）を用いて、配列番号２に記載のヒトＴＳＰＡＮ８－ＧＦＰ発現ベクターのアミノ酸番号１２６～１５５に相当する配列をマウス又はラットＴＳＰＡＮ８のアミノ酸番号１２６～１５５の配列に置換したベクターを作製した。作製したベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞にそれぞれ導入し、ヒトＴＳＰＡＮ８－ＧＦＰタンパク、ヒトマウスＴＳＰＡＮ８－ＧＦＰキメラタンパク又はヒトラットＴＳＰＡＮ８－ＧＦＰキメラタンパクを一過性に発現する細胞を作製した。作製した細胞をそれぞれ野生型ヒトＴＳＰＡＮ８発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ヒトマウスＴＳＰＡＮ８キメラタンパク発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞又はヒトラットＴＳＰＡＮ８キメラタンパク発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞と称する。またｐＣＭＶ６－ＡＣ－ＧＦＰベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞に導入した細胞（モック細胞と称する）を作製した。これらの細胞中のＧＦＰ陽性細胞に対する１６Ｂ１１、１６Ｂ１２及びＴＡＬ６９の結合をフローサイトメトリー法により測定した。ＴＡＬ６９はヒトラット、ヒトマウスＴＳＰＡＮ８キメラタンパク発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞のいずれに対しても結合の低下は認められなかった。１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２は、ヒトラットＴＳＰＡＮ８キメラタンパク発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞に対しては野生型ヒトＴＳＰＡＮ８発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞と同等の結合を示した。一方で、ヒトマウスＴＳＰＡＮ８キメラタンパク発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞に対しては野生型ヒトＴＳＰＡＮ８発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞と比べて結合の減弱が認められた（図５－１）。
ヒトマウスＴＳＰＡＮ８キメラタンパク発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞に対する結合活性の減弱に寄与するアミノ酸配列を特定するために、ヒト、マウス、ラット及びカニクイザルのＴＳＰＡＮ８タンパク質について、ヒトＴＳＰＡＮ８のアミノ酸配列の１２６～１５５に相当する配列の比較を行った（図５－２）。マウス、ラット及びカニクイザルＴＳＰＡＮ８のアミノ酸配列の１２６～１５５に相当する配列をそれぞれ配列番号４１、４２及び４３に示す。結果、マウスのＴＳＰＡＮ８タンパク質のみでアミノ酸配列が異なるのは１３１番目のアミノ酸だけであった。この情報により、配列番号２に記載のヒトＴＳＰＡＮ８タンパク質の１３１番目のトレオニン（Ｔ）が１６Ｂ１１又は１６Ｂ１２との結合に重要であることが推察された。
さらに、ヒトＴＳＰＡＮ８の１３１番目のアミノ酸が１６Ｂ１１又は１６Ｂ１２の結合に寄与しているかどうかを確かめるために、当該アミノ酸の置換体を作製した。具体的には、配列番号２のヒトＴＳＰＡＮ８－ＧＦＰにおけるヒトＴＳＰＡＮ８のアミノ酸配列の１３１番目のトレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）又はアスパラギン（Ｎ）に置換したヒトＴＳＰＡＮ８－ＧＦＰ融合タンパク質（それぞれ、「ヒトＴＳＰＡＮ８（Ｔ１３１Ａ）－ＧＦＰ」又は「ヒトＴＳＰＡＮ８（Ｔ１３１Ｎ）－ＧＦＰ」と称する）をコードする塩基配列を含むベクターを作製し、ＣＨＯ－Ｋ１細胞にそれらベクターを遺伝子導入し、ヒトＴＳＰＡＮ８（Ｔ１３１Ａ）－ＧＦＰ、ヒトＴＳＰＡＮ８（Ｔ１３１Ｎ）－ＧＦＰを一過性に発現させた細胞を構築した。構築した細胞をヒトＴＳＰＡＮ８（Ｔ１３１Ａ）発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞又はヒトＴＳＰＡＮ８（Ｔ１３１Ｎ）細胞と称する。これらの細胞中のＧＦＰ陽性細胞に対する１６Ｂ１１、１６Ｂ１２及びＴＡＬ６９の結合をフローサイトメトリー法により測定した（図５－３）。結果、ヒトＴＳＰＡＮ８（Ｔ１３１Ａ）発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞及びヒトＴＳＰＡＮ８（Ｔ１３１Ｎ）発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞に対する１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２の結合は、野生型ヒトＴＳＰＡＮ８発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞に対する結合に比べて減弱していた。一方で、ＴＡＬ６９はいずれの細胞に対しても同等の結合活性を示した。結果、エピトープと同定された配列番号２のアミノ酸番号１２６～１５５に対応するヒトＴＳＰＡＮ８の領域において、１３１番目のトレオニンが１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２との結合に必須なアミノ酸であることが分かった。
各ＴＳＰＡＮ８発現細胞への結合のＭＦＩからモック細胞への結合のＭＦＩを引いて算出したΔＭＦＩの値を表２－１に記載する。また、表２－１の野生型ヒトＴＳＰＡＮ８発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合のΔＭＦＩを１００とした時のヒトマウスＴＳＰＡＮ８キメラタンパク発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ヒトラットＴＳＰＡＮ８キメラタンパク発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞及びヒトＴＳＰＡＮ８（Ｔ１３１Ａ又はＴ１３１Ｎ）発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合のΔＭＦＩ相対値を表２－２に示す。

【表2-1】

【表2-2】

【0200】

［実施例４－３：結合競合実験］
１６Ｂ１１又は１６Ｂ１２と他の抗ＴＳＰＡＮ８抗体（９Ｆ６、１８Ｃ１０又はＴＡＬ６９）がＴＳＰＡＮ８との結合において競合するかどうかを調べた。
１６Ｂ１１と他の抗ＴＳＰＡＮ８抗体（９Ｆ６、１８Ｃ１０又はＴＡＬ６９）との競合を調べるために、ＮＳＣ－１５ＣＦ細胞への１６Ｂ１１の結合量の変化をフローサイトメトリー法により測定した（実験１；図６－１）。具体的には、２×１０⁵個のＮＳＣ－１５ＣＦに、終濃度１μg／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識１６Ｂ１１と他の抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、９Ｆ６、１８Ｃ１０又はＴＡＬ６９のうちの１抗体）を終濃度１００μg／ｍＬとなるように添加し、ＮＳＣ－１５ＣＦへの１６Ｂ１１の結合量をフローサイトメーターにて測定した。陰性コントロール抗体として、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、４００２６４）、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙを用いた。結果、１６Ｂ１１の結合は自身の１６Ｂ１１を添加した場合にのみ減弱した。
１６Ｂ１２と他の抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、９Ｆ６、１８Ｃ１０又はＴＡＬ６９）との競合を調べるために、ＮＳＣ－１５ＣＦへの１６Ｂ１２による１６Ｂ１１、９Ｆ６又は１８Ｃ１０の結合量の変化をフローサイトメトリー法により測定した（実験２；図６－２）。具体的には、１×１０⁵個のＮＳＣ－１５ＣＦに、終濃度０．２５μg／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識１６Ｂ１１、９Ｆ６又は１８Ｃ１０と終濃度１００μg／ｍＬの１６Ｂ１２を添加し、ＮＳＣ－１５ＣＦへの１６Ｂ１１、９Ｆ６又は１８Ｃ１０の結合量をフローサイトメーターにて測定した。陰性コントロール抗体として、ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ３，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙを用いた。結果、１６Ｂ１２により１６Ｂ１１の結合が減弱した。その他の抗体の結合には影響しなかった。同様にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識１６Ｂ１２と他の抗ＴＳＰＡＮ８抗体（１６Ｂ１１、１６Ｂ１２、９Ｆ６、１８Ｃ１０又はＴＡＬ６９）を用いた競合実験を実施した（実験３；図６－３）。陰性コントロール抗体として、ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ３，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ及びＵｌｔｒａ－ＬＥＡＦ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１，κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙを用いた。結果、１６Ｂ１２の結合は１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２自身を添加した場合にのみ減弱した。１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２の結合は互いに競合することから、１６Ｂ１１と１６Ｂ１２は近似のエピトープを認識すると推察された。各標識抗体結合のＭＦＩから未染色細胞のＭＦＩを引いて算出した値においてＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌを競合抗体として添加した時の値を１００とした時の競合抗体添加時の相対値を表３に示す。

【表3】

【0201】

［実施例５：６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の作製］
胃がん患者腹水由来株化細胞である６０Ａｓ６細胞にｌｕｃｉｆｅｒａｓｅタンパク質及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させた６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を、以下の方法で作製した。
［実施例５－１：Ｌｕｃ／ＧＦＰを含むウイルス溶液の作製］
Ｌ２９３Ｔ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｋ４９７５－００）を用い、常法に従ってレンチウイルスの作製を行った。
レンチウイルスの作製には、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（ＳＩＧＭＡ社、ＳＨＰ００１）及びｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＧＬ３－ＥＦ１ａ－ＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ｐｕｒｏ改変ベクター（広島大学 医系科学研究科 細胞分子生物学研究室 高橋陵宇准教授より寄贈（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、２０１５、Ｖｏｌ．１０、ｅ０１２３４０７、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．、２００８、Ｖｏｌ．１３、ｐ．１６１９－１６３３））を用いた。ウイルスを含む細胞の培養上清から、４５μｍ Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＨＶフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＳＬＨＶ０３３ＲＳ）を用いてウイルスをろ過したものをウイルス溶液とし、－８０℃で凍結保存した。
［実施例５－２：６０Ａｓ６細胞へのウイルスの感染］
６０Ａｓ６細胞（国立がん研究センター 柳原 五吉 先生より寄贈）へのウイルスの感染は、常法に従って行った。培地には、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０を使用した。感染３日後に６０Ａｓ６細胞プレートより培養液を除去し、１０％ＦＢＳ、２μｇ／ｍＬ Ｐｕｒｏｍａｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ－１１１３８－０２）含むＲＰＭＩ－１６４０（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ培地）へ置換し、培養を継続した。その後、ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ培地での培養及び継代を繰り返すことにより未感染の細胞を除去し、ウイルスが完全に除去されたことを確認した。樹立した細胞を６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞と称する。この細胞は、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ及びＧＦＰを発現していた。さらに、６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞は内因性にＴＳＰＡＮ８が高発現していることをフローサイトメトリー法により確認した。

【0202】

［実施例６：完全ヒト抗体である１６Ｂ１１．１のＡＤＣＣ活性評価］
完全ヒト抗体抗ＴＳＰＡＮ８抗体の１６Ｂ１１．１によって誘導されるＡＤＣＣ活性を測定した。ＡＤＣＣ活性は、エフェクター細胞が標的細胞を傷害する作用を評価することで測定が可能である。本実施例では、エフェクター細胞であるＮＫ細胞と標的細胞である６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の共培養下において、１６Ｂ１１．１によりＮＫ細胞が活性化され、その結果として６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞がＡＤＣＣ活性により傷害される細胞傷害活性を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを指標に測定した。
ＮＫ細胞は、凍結ヒトＰＢＭＣ（ｅＰＢＭＣ（登録商標），Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社、ＣＴＬ－ＣＰ１）からＮＫ細胞単離キット（ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ｈｕｍａｎ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０９２－６５７）を用いて単離し、ＮＫ細胞用培地（ＮＫ ＭＡＣＳ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－１１４－４２９）にて培養したものを使用した。
丸底９６ウェルプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｂａｋｅｌｉｔｅ社、ＭＳ－９０９６Ｕ）に５％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ＳＨ３００８４．０３）含有ＲＰＭＩ－１６４０（ＳＩＧＭＡ社、Ｒ８７５８－５００ｍＬ）培地に懸濁した６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を５×１０^３個／２５μＬ／ｗｅｌｌ、ＮＫ細胞を５×１０^４個／５０μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。さらに、１６Ｂ１１．１又は陰性コントロール抗体としての自社製の抗ＫＬＨ抗体（３Ｇ６）を終濃度１、１０、１００、１０００、１００００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈した溶液を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、２４時間後のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光量をルシフェラーゼ定量化キット（ＯＮＥ－ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｅ６１２０）を用いて測定した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光量は６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の生存量を示すため、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光量の減少によりＡＤＣＣ活性による細胞傷害活性を測定することができる。
図７の縦軸は培地のみを測定した場合のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光量を１００％とし、抗体無添加時の６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞中のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光量を０％とした場合の各サンプルのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光量の相対値を表す。横軸は各ウェルに添加した抗体の濃度を示す。図７に示した通り、１６Ｂ１１．１を添加した場合のみＡＤＣＣ活性により標的細胞が傷害された。

【0203】

［実施例７：抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体の作製］
［実施例７－１：抗ＴＳＰＡＮ８抗体の二重特異性抗体ベクター作製］
１６Ｂ１１．１の重鎖のアミノ酸番号２３８及び２３９（ＥＵインデックス：２３４及び２３５）のアミノ酸をそれぞれロイシン（Ｌ）からアラニン（Ａ）に置換したＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）、アミノ酸番号３７０、３７２及び４１１（ＥＵインデックス：３６６、３６８及び４０７）のアミノ酸をそれぞれトレオニン（Ｔ）からセリン（Ｓ）、ＬからＡ、チロシン（Ｙ）からバリン（Ｖ）に置換するノブズ・イントゥー・ホールズ（Ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）変異、並びに、アミノ酸番号３０１（ＥＵインデックス：２９７）のアミノ酸をアスパラギン（Ｎ）からグリシン（Ｇ）に置換する変異を導入した。設計した１６Ｂ１１．１の重鎖アミノ酸配列を配列番号６に示す。作製したベクターをｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１１．１＿ＨＣ＿Ｈと称する。

【0204】

［実施例７－２：抗ヒトＣＤ３抗体の二重特異性抗体ベクター作製］
ヒト化抗ＣＤ３抗体の配列設計は、日本特許第５６８６９５３号に記載のマウス抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列をもとに、文献（Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．、２００８、Ｖｏｌ．１３、ｐ．１６１９－１６３３）記載の方法に準じて行った。この際に、バックミューテーションを導入した。立体構造情報（ＰＤＢ Ｃｏｄｅ：５ＦＣＳ）をＭＯＬＳＩＳ Ｉｎｃ．社が提供する統合計算化学システムＭＯＥで解析して、フレームワーク領域内のバックミューテーション導入位置を決定した。ヒト化抗ＣＤ３抗体は、重鎖可変領域（配列番号１４ アミノ酸番号１から１２５）、リンカー（配列番号１４ アミノ酸番号１２６から１４５）、軽鎖可変領域（配列番号１４ アミノ酸番号１４６から２５４）、ヒンジ（配列番号１４ アミノ酸番号２５５から２６９）、ＣＨ２ドメイン（配列番号１４ アミノ酸番号２７０から３７９）及び、ＣＨ３ドメイン（配列番号１４ アミノ酸番号３８０から４８６）の順に配置されるように設計した。さらに、配列番号１４には（１）アミノ酸番号４４とアミノ酸番号２４７に該当するアミノ酸をシステイン（Ｃ）に置換、（２）アミノ酸番号２５９（ＥＵインデックス：２２０）のアミノ酸をＣからＳに置換、（３）アミノ酸番号２７３及び２７４（ＥＵインデックス：２３４及び２３５）のアミノ酸をＬからＡに置換するＬＡＬＡ変異、（４）アミノ酸番号４０５（ＥＵインデックス：３６６）のアミノ酸をＴからトリプトファン（Ｗ）に置換するＫｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ変異、（５）アミノ酸番号３３６（ＥＵインデックス：２９７）のアミノ酸をＮからＧに置換する変異が導入されている。これらの変異を導入するため、それぞれの変異点を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを合成し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 、Ｖ７９０２０）に挿入した。作製したベクターをｐｃＤＮＡ３．１－ｍ７＿ｓｃＦＶ＿Ｋと称する。作製したヒト化抗ＣＤ３抗体の塩基配列を配列番号１３に、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。

【0205】

［実施例７－３：抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体の作製］
抗ＴＳＰＡＮ８抗体のＦａｂ領域と、抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖ領域と、Ｆｃ領域により構成される二重特異性抗体を作製するために、ｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１１．１＿ＨＣ＿Ｈ、ｐｃＤＮＡ３．４－１６Ｂ１１＿ＬＣ、ｐｃＤＮＡ３．１－ｍ７＿ｓｃＦＶ＿Ｋを実施例３の方法と同様にＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（登録商標）細胞にトランスフェクションした。培養上清をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅを用いて精製し、更にゲル濾過カラムＨｉＬｏａｄ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標） ２００ｐｇ（ＧＥ ヘルスケア社、２８－９８９３－３６）を用いて精製することにより、純度９５％以上の精製抗体を得た。得られた抗体を抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体と称する。

【0206】

［実施例８：抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体の結合活性評価］
抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体のＴＳＰＡＮ８とＣＤ３に対する結合活性を、ＴＳＰＡＮ８のＬＥＬタンパク又はＣＤ３εδ複合タンパクを用いたＥＬＩＳＡ法によりそれぞれ評価した。
詳細には、ＰＢＳで希釈したＴＳＰＡＮ８ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｈｕｍａｎ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、１５６８３－Ｈ０７Ｈ）又はＨｕｍａｎ ＣｅｌｌＥｘｐ ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ ＆ ＣＤ３ ｄｅｌｔａ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ， Ｈｕｍａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社、Ｐ１１８３－１０）１μｇ／ｍＬを３８４－Ｗｅｌｌ Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｔｅｓ， ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎｕｎｃ社、４６０３７２）に３０μＬ／ｗｅｌｌ添加した。４℃にて終夜静置した後に上清を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ社、０３９５３－９５）を１２０μＬ／ｗｅｌｌ添加した。室温に１時間静置した後に、上清を除去し、ＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２８３６０）で２回洗浄後、１０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ含有ＴＢＳＴで希釈した抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体を３０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温にて１時間静置した。抗体溶液を除去し、ＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄後、１０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ含有ＴＢＳＴで５０００倍希釈したＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｋａｐｐａ， Ｍｏｕｓｅ ａｄｓ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、２０６１－０５）を３０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温にて３０分間静置した。抗体溶液を除去し、ＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄後、ＢＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＯＤ）（Ｒｏｃｈｅ社、１１５８２９５０００１）を３０μＬ／ｗｅｌｌ添加した。室温にて１５分反応させた後に、ＡＲＶＯ Ｘ３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）にて化学発光を測定した。結果、ＴＳＰＡＮ８及びＣＤ３に対するＥＣ５０値はそれぞれ１．０μｇ／ｍＬ（８．１ｎＭ）、４．６μｇ／ｍＬ（３６ｎＭ）と算出された（図８）。

【0207】

［実施例９：抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体のＲＴＣＣ活性評価］
ＲＰＭＩ－１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１１８７５－１１９）５００ｍＬにＦＢＳ ５０ｍＬ、ＭＥＭ Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｍ７１４５）５ｍＬ、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｓ８６３６）５ｍＬ、ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、３５０５０－０６１）５ｍＬ、ペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１５０７０－０６３）５ｍＬ、ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１５６３０－０８０）５ｍＬを加えたものを培養培地として用いた（以下、本実施例で「培養培地」と称する）。実施例４にて作製した６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を培養培地で２×１０^５個／ｍＬに調製した細胞懸濁液を平底９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社、３８６０－０９６）に５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。３時間後、培養培地にて１×１０^６個／ｍＬに調製した凍結ヒト末梢血単核細胞（ＬＰ．ＣＲ．ＭＮＣ １０Ｍ；ＡｌｌＣｅｌｌｓ ＬＬＣ社、４Ｗ－２７０）を、培養中の９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種した。終濃度０、３、１０、３０、１００、３００、１０００、３０００、１００００ ｎｇ／ｍＬになるように調製した抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体を５０μＬずつ添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２培養下、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標） ＺＯＯＭ（ザルトリウス社）にて各ウェルの蛍光（ＧＦＰ）面積を３日後に測定した。蛍光面積を細胞増殖の指標とし、図９に細胞増殖曲線を示した。図９の縦軸は、培地のみのウェルの蛍光面積を０％とし、抗体溶液未添加のウェルの蛍光面積を１００％とした場合の６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の蛍光面積の相対値を示す。結果、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体はＴＳＰＡＮ８発現胃がん細胞である６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞に対し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞増殖抑制作用を示した。

【0208】

［実施例１０：抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体の患者腹水細胞を用いた薬効評価］
患者腹水細胞に含まれるがん細胞及び免疫細胞に抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体が結合すると、免疫細胞が活性化され、がん細胞が傷害される。抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体によるがん細胞傷害作用及び免疫細胞活性化作用を以下の方法で評価した。
患者腹水細胞は実施例１－１と同様に患者腹水を溶血処理まで実施した後、凍結保存された細胞を用いた。融解した細胞を実施例９と同様の培養培地で２×１０^６個／ｍＬとなるように調製し、その細胞溶液を平底９６ウェルプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。被験抗体として抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体及び対照抗体（１６Ｂ１１．１のＦａｂを抗ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）抗体のＦａｂに置き換えた抗ＫＬＨ抗体と抗ＣＤ３抗体のバイスペシフィック抗体）を使用した。被験抗体は、１０μｇ／ｍＬから１０倍公比で０．１ｎｇ／ｍＬまで希釈した。被験抗体を、細胞を播種した９６ウェルプレートに添加した後に、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。培養には、培養培地を使用した。３日後に細胞を回収し、Ｖ底マイクロプレートに撒種した。回収時にプレートに接着していた細胞はＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＡＴ－１０４）で剥離した後、Ｖ底マイクロプレートに添加した。７２０×ｇ ２分遠心分離した後に上清を除去し、ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０％ ＦＢＳ含有ＰＢＳ ０．０９％ ＮａＮ_３ ２ｍＭ ＥＤＴＡ）に４０分の１量のＨｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５６４２２０）を加えた液体を２０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。それぞれのウェルに対しｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで希釈したＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、 ５５０６２８）、ＡＰＣ－Ｈ７ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ８（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５６０１７９）、ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４５（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５５５４８５）、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２５（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５５５４３２）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３２６ （ＥｐＣＡＭ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、３２４２２０）を１０μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、４℃で５０分静置した。細胞をｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後、１／２００量の７－ＡＡＤ ｓｏｌｕｔｉｏｎを含むｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いてフローサイトメトリー法により各種抗体の腹水細胞への結合を測定した。デ一タ解析はＦｌｏｗＪｏで行った。生細胞の指標である７－ＡＡＤ陰性細胞画分について、免疫細胞の指標であるＣＤ４５及びがん細胞の指標であるＥｐＣＡＭで展開した。ＣＤ４５陰性ＥｐＣＡＭ陽性がん細胞はＦｓｃ（ｌｉｎ）とＳｓｃ（ｌｉｎ）に展開し、断片化した分画を除いた細胞をがん細胞の生細胞数とした。さらに、ＣＤ４５陽性画分のＣＤ４又はＣＤ８陽性細胞における活性化マーカーのＣＤ２５の発現を測定し、ａｎｔｉ－ＣＤ２５－ＰＥ蛍光強度のＭＦＩを算出した。図１０－１には、がん細胞の生細胞数の変化を示す。縦軸は、抗体溶液未添加時のがん細胞の細胞数を１００％とした時の細胞数の相対値を示す。図１０－２及び１０－３には、被験抗体によるＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞上のＣＤ２５発現量の変化を示す。縦軸は、ａｎｔｉ－ＣＤ２５－ＰＥ蛍光強度のＭＦＩの相対値を算出した値を示す。
結果、図１０－１に示すように抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体添加により腹水中がん細胞の生細胞数の減少が認められ、図１０－２、図１０－３に示すように腹水中ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化が観察された。この結果から、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体は腹水中ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化し腹水中がん細胞を殺傷させることが示唆された。

【0209】

［実施例１１：抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍評価］
抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体によるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍作用を、胃がん腹膜播種モデルを用いて評価した。
［実施例１１－１：Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎＴ細胞の作製］
ＰＢＳで３μｇ／ｍＬに溶解した抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、３１７３１５）を２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社、３８２０－０２４）に２５０μＬずつ添加し、４℃にて静置した。翌日、プレートを培養培地で２度洗浄した後に培養培地を添加し、後述の細胞播種まで室温で静置した。ＨＰＢＭＣ，ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ，Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ（ＬＯＮＺＡ社、ＣＣ－２７０２）からｐａｎＴ細胞（ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の両方を含む）を単離した。単離にはＰａｎＴ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０９６－５３５）を用い、添付のプロトコルに基づいて実験を行った。前述の２４ウェルプレートから培養培地を除き、プレートに培養培地にて３×１０^６個／ｍＬに調製したｐａｎＴ細胞を５００μＬずつ播種した。さらに２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、２００－２）及び２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、３０２９２３）を含む培養培地を５００μＬずつ添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養を行った。細胞を、新たなプレート（ＩＷＡＫＩ社、３８１０－００６）に培養開始３日後、５日後及び７日後に継代し、終濃度１０ｎｇ／ｍＬになるようにＩＬ－２を添加した。培養開始７日後と１０日後の細胞を回収し、実施例１０－２において使用した。ここで単離、増殖させた細胞をＥｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎＴ細胞と称する。

【0210】

［実施例１１－２：胃がん腹膜播種モデルにおける薬効確認］
各群７例の７週齢Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌ雌マウス（日本クレア社）の腹腔内に１×１０^６個／１ｍＬ／ＰＢＳの６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を移植した。移植６日後に６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞に導入されているＬｕｃｉｆｅｒａｓｅによる基質Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎの発光量を指標とし、各群が均等になるように群分けを行った。Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎの発光量は腫瘍体積を示す指標として用いた。
詳細には、各個体に３ｍｇ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（ＶｉｖｏＧｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｒａｄｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｐ１０４３）を０．５ｍＬのＰＢＳに溶解した溶液を腹腔内に投与し、投与１０分後に発光量をＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩ（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社）にて測定した。次に６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞移植７日後及び１０日後に１×１０^７個のｅｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎＴ細胞を０．５ｍＬのＰＢＳに懸濁した液及び０、０．３、１．０、３．０ｍｇ／ｋｇ 抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体を０．２ｍＬのＰＢＳに懸濁した液を腹腔内投与した。胃がん細胞移植１４日後に、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎの発光量を測定し、腫瘍体積の増減を評価した。また、同腹膜播種モデルマウスの生存を６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞移植３４日後まで観察した。図１１－１に示す通り、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体投与群において、有意な腫瘍体積縮小作用が示され、図１１－２に示す通り、１．０及び３．０ｍｇ／ｋｇ投与群においては、有意な生存期間延長効果が認められた。表４に生存中央値及び検定結果を示す。表中の有意確率Ｐ値は、ログランク検定により対照群（溶媒投与群）の生存期間と抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体投与群の生存期間を比較することにより求めた。＊＊は、Ｐ値がボンフェローニの方法にて補正した有意水準０．０１／３より小さい群を示す。

【表4】

【0211】

［実施例１２：抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体の各癌腫細胞株に対する作用］
［実施例１２－１：抗ＴＳＰＡＮ８抗体の各癌腫細胞株に対する結合活性の確認］
胃がん細胞株（ＫＡＴＯIII細胞：Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）、ＪＣＲＢ０６１１、ＮＵＧＣ－４細胞：ＲＩＫＥＮ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＲＣ）、ＲＣＢ１９３９、６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞）、結腸がん細胞株（ＨＴ－２９細胞：ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－３８、ＬｏＶｏ細胞：ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２２９、ＧＰ２ｄ細胞：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、９５０９０７１４）、膵臓がん細胞株（ＡｓＰＣ－１細胞：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６８２）、食道がん細胞株（ＯＥ１９細胞：ＥＣＡＣＣ、９６０７１７２１）、肝臓がん細胞株（Ｌｉ－７細胞：ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ、ＲＣＢ１９４１）に対するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識１６Ｂ１１の結合をフローサイトメトリー法により測定した。陰性コントロール抗体として、自社製の抗ＫＬＨ抗体（１７３Ａ１）をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識して用いた。各癌腫細胞株における１６Ｂ１１と陰性コントロール抗体の結合のヒストグラムを図１２に示す。

【0212】

［実施例１２－２：抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体の各癌腫細胞株に対するＲＴＣＣ活性評価］
ＫＡＴＯIII細胞、ＮＵＧＣ－４細胞、ＨＴ－２９細胞、ＬｏＶｏ細胞、ＧＰ２ｄ細胞、ＡｓＰＣ－１細胞、ＯＥ１９細胞、Ｌｉ－７細胞を培養培地にて２×１０^５個／ｍＬに調製し、平底９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社、３８６０－０９６）に５０μＬずつ播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。培養培地にて１×１０^６個／ｍＬに調製した凍結ヒト末梢血単核細胞（ＬＯＮＺＡ社、ＣＣ－２７０２）を、培養中の９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種した。抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体を、４０μｇ／ｍＬ又は２０μｇ／ｍＬを最高濃度とし、２倍公比となるように培養培地で希釈した。希釈した抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体を５０μＬ添加した（最高終濃度は１０μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬ）。がん細胞株、凍結ヒト末梢血単核細胞及び抗体を添加した９６ウェルプレートを３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。３日後に細胞を回収し、Ｖ底マイクロプレートに撒種した。回収時に培養プレートに接着していた細胞はＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＡＴ１０４）で剥離した後、Ｖ底マイクロプレートに添加した。７２０×ｇにて２分間遠心分離した後に上清を除去し、ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに４０分の１量のＨｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋを加えた液体を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加した。それぞれのウェルに対しｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで希釈したＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、 ５５５３４９）、ＡＰＣ－Ｈ７ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ８、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ４５（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５６３８７９）、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２５を１０μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、４℃で１時間静置した。ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後、１／２００量の７－ＡＡＤ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた。ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓを用いてフローサイトメトリー法により各種抗体の結合を測定した。デ一タ解析はＦｌｏｗＪｏで行った。生細胞の指標の７－ＡＡＤ陰性細胞画分中のＣＤ４５陰性細胞数をがん細胞の生細胞数とした。抗体溶液未添加を１００％とした。さらにＣＤ４５陽性画分のＣＤ４又はＣＤ８陽性細胞について活性化マーカーのＣＤ２５の発現をａｎｔｉ－ＣＤ２５－ＰＥ蛍光強度のＭＦＩを、抗体溶液未添加を１とした場合の倍率変化としてそれぞれ算出した。結果、図１３－１に示すように抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体添加によりＴＳＰＡＮ８発現がん細胞の生細胞数の減少が見られた。さらに、図１３－２及び図１３－３に示すように、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化がそれぞれ観察された。

【0213】

［実施例１２－３：ヒトＰＢＭＣ移入ＨＴ－２９細胞皮下担癌モデルにおける薬効確認］
正常ヒトＰＢＭＣ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３０００－１０Ｍ）を１．２５×１０^７個／ｍＬとなるようにＰＢＳに懸濁し、６週齢ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ＲγＫＯ（ＮＯＧ）雌マウス（インビボサイエンス）に２．５×１０^６個／２００μＬの細胞をマウス尾静脈内に注射した。ヒトＰＢＭＣ移入の１０日後、ＨＴ－２９細胞を５×１０^７個／ｍＬとなるようにＰＢＳに懸濁し、５×１０^６個／１００μＬでマウスの皮下に担癌した。ＨＴ－２９細胞の担癌から１０日後にノギスを使って腫瘍体積を測定し、各群均等になるように群分けを行った（ｎ＝１０）。抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与を同日から開始した。投与初日を０日目と定義した。０、４、７日目にマウスにＰＢＳ又は０．３、１、３、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体を静脈内投与した。０、４、７、及び１１日目に腫瘍体積を測定した（図１４－１）。腫瘍体積［ｍｍ^３］は次式で計算した。
（腫瘍長軸の長さ［ｍｍ］）×（腫瘍短軸の長さ［ｍｍ］）^２×０．５
図１４－２に示す通り、抗ＴＳＰＡＮ８（１６Ｂ１１）－抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＨＴ－２９腫瘍の増殖を０．３、１、３、及び１０ ｍｇ／ｋｇで有意に抑制した。

【産業上の利用可能性】

【0214】

本発明の抗ＴＳＰＡＮ８抗体及び抗ＴＳＰＡＮ８－抗ＣＤ３二重特異性抗体等の抗ＴＳＰＡＮ８抗体の融合体は、がんの治療に有用であると期待される。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換された宿主細胞、及び抗体を生産する方法は、前記抗ＴＳＰＡＮ８抗体及びその融合体を生産するのに有用である。

【配列表フリーテキスト】

【0215】

以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列番号２はヒトＴＳＰＡＮ８－Ｍｙｃ－ＤＤＫのアミノ酸配列を示し、配列番号１に示される塩基配列は、配列番号２に示されるヒトＴＳＰＡＮ８のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。配列番号４、６、又は１０は抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖のアミノ酸配列であり、配列番号３、５、又は９に示される塩基配列は、配列番号４、６、又は１０に示される抗ＴＳＰＡＮ８抗体の重鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。配列番号８又は１２の配列は抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号７又は１１で示される塩基配列は、配列番号８又は１２に示される抗ＴＳＰＡＮ８抗体の軽鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列である。配列番号１４は抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドのアミノ酸配列であり、配列番号１３に示される塩基配列は、配列番号１４に示される抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ領域と第二Ｆｃポリペプチドが連結されたポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列である。配列番号１５～２３は発明の詳細な説明にて記載した各種リンカーのアミノ酸配列である。配列番号２４～３７は１６Ｂ１１及び１６Ｂ１２のＣＤＲ及び可変領域のアミノ酸配列である。配列番号３８～４０はシグナル配列のアミノ酸配列である。配列番号４１～４３はそれぞれマウス、ラット又はカニクイザルのＴＳＰＡＮ８のアミノ酸番号１２６～１５５の領域のアミノ酸配列である。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14-1】

【図14-2】

【配列表】

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