特開 2022-8045 口腔内細菌叢改善剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022008045

(43)【公開日】2022-01-13

(54)【発明の名称】口腔内細菌叢改善剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/352 20060101AFI20220105BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220105BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20220105BHJP

   A61Q 11/00 20060101ALI20220105BHJP

   A61K 8/49 20060101ALI20220105BHJP

【ＦＩ】

A61K31/352

A61P43/00 121

A61P1/02

A61Q11/00

A61K8/49

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021067086

(22)【出願日】2021-04-12

(31)【優先権主張番号】P 2020109445

(32)【優先日】2020-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】500147333

【氏名又は名称】大木製▲薬▼株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100087398

【弁理士】

【氏名又は名称】水野 勝文

(74)【代理人】

【識別番号】100128783

【弁理士】

【氏名又は名称】井出 真

(74)【代理人】

【識別番号】100128473

【弁理士】

【氏名又は名称】須澤 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100160886

【弁理士】

【氏名又は名称】久松 洋輔

(74)【代理人】

【識別番号】100192603

【弁理士】

【氏名又は名称】網盛 俊

(72)【発明者】

【氏名】天野 滋

【テーマコード（参考）】

4C083

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C083AC841

4C083AC842

4C083CC41

4C083EE32

4C083EE33

4C083FF01

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA08

4C086HA27

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA57

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA67

4C086ZC75

(57)【要約】

【課題】口腔内細菌叢改善剤を提供することを目的とする。
【解決手段】ケンフェライドとベチュレトールを含有し、前記ケンフェライドに対する前
記ベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下であることを特徴とする口腔内細菌叢改
善剤。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ケンフェライドとベチュレトールを含有し、前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下であることを特徴とする口腔内細菌叢改善剤。

【請求項2】

前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が２以上３以下であることを特徴とする請求項１に記載の口腔内細菌叢改善剤。

【請求項3】

前記ケンフェライドと前記ベチュレトールの含有量の合計が、前記口腔内細菌叢改善剤１ｍｌあたり１μｇ～２００μｇであることを特徴とする請求項１又は２に記載の口腔内細菌叢改善剤。

【請求項4】

ケンフェライドとベチュレトールを含有し、前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下であることを特徴とする歯周病予防剤。

【請求項5】

前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が２以上３以下であることを特徴とする請求項４に記載の歯周病予防剤。

【請求項6】

前記ケンフェライドと前記ベチュレトールの含有量の合計が、前記歯周病予防剤１ｍｌあたり１μｇ～２００μｇであることを特徴とする請求項４又は５に記載の歯周病予防剤。

【請求項7】

ケンフェライドとベチュレトールを含有し、前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下であることを特徴とする齲蝕予防剤。

【請求項8】

前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が２以上３以下であることを特徴とする請求項７に記載の齲蝕予防剤。

【請求項9】

前記ケンフェライドと前記ベチュレトールの含有量の合計が、前記齲蝕予防剤１ｍｌあたり１μｇ～２００μｇであることを特徴とする請求項７又は８に記載の齲蝕予防剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、口腔内細菌叢改善剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトの口腔内には様々な細菌が共生しており、細菌叢と呼ばれる細菌集団を形成している。口腔内の細菌叢（以下、「口腔内細菌叢」という）には、歯周病や齲蝕の原因となる菌（以下、「悪玉菌」ともいう）が存在するが、悪玉菌に対して抗菌作用を示す菌（以下、「善玉菌」ともいう）も存在しており、歯周病や齲蝕の発症が抑制されている。しかしながら、食生活の変化、ストレス、加齢などにより体調に変化が生じたり、歯や歯周に歯垢が蓄積したりすると、悪玉菌の増殖を抑制できなくなる。その結果、歯周病や齲蝕が発症する。

【0003】

歯周病や齲蝕を予防するため、様々な技術が提案されている。例えば、特許文献１では、（Ａ）ε－ポリリジン及び／またはその塩と（Ｂ）天然物由来抗菌成分を含む組成物を、齲蝕や歯周病の予防に使用する技術が提案されている。

【0004】

なお、特許文献１において、（Ｂ）天然物由来抗菌成分には、リゾチーム、キトサン、エゴノキ抽出物、ヒバ油、ヒノキチオール、ペクチン分解物、レンギョウ抽出物、カワラヨモギ抽出物、シソの葉エキス、カラシ抽出物、ワサビ抽出物、孟宗竹抽出物、トウガラシ抽出物、タデ抽出物、ウド抽出物、ニンニク抽出物、ピメンタ抽出物、イチジク抽出物、クワ抽出物、ブドウ種子抽出物、ペパー抽出物、マダケ抽出物、オレガノ抽出物、モミガラ抽出物、グローブ抽出物、ショウガ抽出物、セージ抽出物、ハチク抽出物、ブドウ果皮抽出物、ホッコシ抽出物、ユッカフォーム抽出物、及びローズマリー抽出物が用いられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００４－１２３６３０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、口腔内細菌叢改善剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者は、ケンフェライドとベチュレトールを所定の比率で含有する組成物が、口腔内細菌叢の悪玉菌に対して抗菌作用を示す一方で、口腔内細菌叢の善玉菌に対しては抗菌作用を示しにくいことを見出し、本発明を完成するに至った。

【0008】

本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］ケンフェライドとベチュレトールを含有し、前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下であることを特徴とする口腔内細菌叢改善剤。［２］前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が２以上３以下であることを特徴とする［１］に記載の口腔内細菌叢改善剤。
［３］前記ケンフェライドと前記ベチュレトールの含有量の合計が、前記口腔内細菌叢改善剤１ｍｌあたり１μｇ～２００μｇであることを特徴とする［１］又は［２］に記載の口腔内細菌叢改善剤。
［４］ケンフェライドとベチュレトールを含有し、前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下であることを特徴とする歯周病予防剤。
［５］前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が２以上３以下であることを特徴とする［４］に記載の歯周病予防剤。
［６］前記ケンフェライドと前記ベチュレトールの含有量の合計が、前記歯周病予防剤１ｍｌあたり１μｇ～２００μｇであることを特徴とする［４］又は［５］に記載の歯周病予防剤。
［７］ケンフェライドとベチュレトールを含有し、前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下であることを特徴とする齲蝕予防剤。
［８］前記ケンフェライドに対する前記ベチュレトールの質量比率が２以上３以下であることを特徴とする［７］に記載の齲蝕予防剤。
［９］前記ケンフェライドと前記ベチュレトールの含有量の合計が、前記齲蝕予防剤１ｍｌあたり１μｇ～２００μｇであることを特徴とする［７］又は［８］に記載の齲蝕予防剤。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、口腔内細菌叢改善剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1a】図１ａは光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を示すグラフである（試験１ａ）。

【図1b】図１ｂは光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を示すグラフである（試験１ｂ）。

【図2a】図２ａは光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を示すグラフである（試験２ａ）。

【図2b】図２ｂは光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を示すグラフである（試験２ｂ）。

【図3】図３は光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を示すグラフである（試験３）。

【図4】図４は光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を示すグラフである（試験４）。

【図5a】図５ａは光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を示すグラフである（試験５ａ）。

【図5b】図５ｂは光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を示すグラフである（試験５ｂ）。

【図6a】図６ａは光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を示すグラフである（試験６ａ）。

【図6b】図６ｂは光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を示すグラフである（試験６ｂ）。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本発明の一実施形態について説明する。

【0012】

本実施形態は、口腔内細菌叢改善剤に関する。

【0013】

本明細書において、「口腔内細菌叢改善」とは、口腔内細菌叢における悪玉菌と善玉菌の比率を改善することを指し、より具体的には、口腔内細菌叢における悪玉菌に対する善玉菌の比率を、改善前と比較して増加することを指す。

【0014】

また、本明細書において、「悪玉菌」とは、歯周病の原因となる菌や齲蝕の原因となる菌を指し、「善玉菌」とは、悪玉菌に対して抗菌作用を示す菌を指す。なお、本明細書において、抗菌作用とは、菌を増殖させない静菌と、菌を死滅させる殺菌の両方を含む概念である。

【0015】

ここで、齲蝕の原因となる菌（悪玉菌）としては、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）を挙げることができる。

【0016】

また、歯周病の原因となる菌（悪玉菌）としては、例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、タンネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス セロタイプ ｂ（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｂ）プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）が挙げられる。

【0017】

一方、これらの悪玉菌に対して抗菌作用を示す菌（善玉菌）としては、例えば、ストレプトコッカス・サリバリウス Ｋ１２（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ. ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ａｎｄｒｅｗｅｓ ａｎｄ Ｈｏｒｄｅｒ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－１０２４（登録商標））や、ストレプトコッカス・サリバリウス ｓｔｒｅｉｎ Ｍ１８（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ Ａｎｄｒｅｗｅｓ ａｎｄ Ｈｏｒｄｅｒ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－２５９３（登録商標）））を挙げることができる。

【0018】

本実施形態の口腔内細菌叢改善剤は、ケンフェライドとベチュレトールを含有する。

【0019】

本実施形態の口腔内細菌叢改善剤に含有されるケンフェライドは、下記式（１）で示される化合物（３，５，７－トリヒドロキシ－３－メトキシ－フラボン）であり、フラボンの１種である。

【0020】

【化1】

【0021】

本実施形態の口腔内細菌叢改善剤に含有されるベチュレトールは、下記式（２）で示される化合物（３，５，７－トリヒドロキシ－６，３－ジメトキシ－フラボン）であり、フラボンの１種である。

【0022】

【化2】

【0023】

ケンフェライドとベチュレトールは、基本骨格（３，５，７－トリヒドロキシ－３－メトキシ－フラボン）が共通する物質であるが、６位の置換基が異なる物質である。具体的には、ケンフェライドにおける６位の置換基は水素であり、ベチュレトールにおける６位の置換基はメトキシ基である。

【0024】

本実施形態の口腔内細菌叢改善剤において、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率は１．５以上４以下である。種類を問わずに悪玉菌に対して抗菌作用を示しやすくなる観点からは、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率は、２以上３以下であることが好ましい。

【0025】

なお、口腔内細菌叢改善剤に含有されるケンフェライドとベチュレトールの比率は、例えば、口腔内細菌叢改善剤を７０％～８０％程度のエタノールで抽出後、抽出液を濃縮し粗エキスを取得し、その後、公知文献などを参考にＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）にてそれぞれの濃度を定量することで求めることができる。なお、口腔内細菌叢改善剤に、７０％～８０％程度のエタノールに溶解するケンフェライドとベチュレトール以外の成分が含まれる場合には、このような成分をエタノールの抽出液からを除去する除去処理を行ってもよい。除去処理の方法は、除去したい成分に応じて設定すればよく、公知の方法を用いることができる。

【0026】

本実施形態の口腔内細菌叢改善剤において、ケンフェライドとベチュレトールの含有量は、特に限定されるものでないが、ケンフェライドとベチュレトールの含有量の合計を、口腔内細菌叢改善剤１ｍｌあたり、例えば、０．１μｇ～４００μｇとすることができ、悪玉菌と善玉菌の比率をより改善する観点からは、１μｇ～２００μｇとすることが好ましく、５μｇ～２００μｇとすることがより好ましい。

【0027】

ケンフェライドとベチュレトールは、ポリフェノールを含有する天然素材（以下、「ポリフェノール含有素材」ともいう）から得ることができる。ケンフェライドとベチュレトールを含有するポリフェノール含有素材としては、例えば、プロポリス、赤ぶどう抽出物、赤ぶどう果皮抽出物、赤ぶどう葉、白ぶどう葉、赤ぶどう果実、白ぶどう果実、白ぶどう果皮、ぶどう種子、イチョウ葉、フランス西海岸松、大麦若葉、小麦若葉、稲若葉、大豆若葉、ブルーベリー果実、果皮、その種子、シソ葉、バラ葉、バラ花、ヤーコン、キクイモ、ムラサキイモ及びそれらの葉、キク科植物、又はエキナセア、レモンバーム、ウコン、グァバ、レモングラス、ラベンダー等のハーブ類、さらに、緑茶、紅茶、ウーロン茶等が挙げられる。

【0028】

ここで、ケンフェライドとベチュレトールの比率を調製する方法について説明する。ケンフェライドとベチュレトールは、上述した通り、ポリフェノール含有素材から取得できるが、抽出方法などにもよるが、通常は、ポリフェノール含有素材から、ベチュレトールとケンフェライドを含む抽出物を得るだけでは、ケンフェライドとベチュレトールを上述した比率（１．５以上４以下）に調整することが難しい。

【0029】

そこで、ケンフェライドとベチュレトールを上述した配合比率（１．５以上４以下）に調整する方法としては、一例として、ポリフェノール含有素材からベチュレトールとケンフェライドを別々に分取（単離）し、これらを上述した配合比率（１．５以上４以下）で配合する方法を用いることができる。

【0030】

ポリフェノール含有素材からケンフェライドとベチュレトールを別々に分取する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、例えば、次の方法を用いてもよい。まず、ポリフェノール含有素材を７０～８０％程度（例えば、７０～８０％）のエタノールで抽出後、抽出液を濃縮し粗エキスを得る。次に、ポリフェノール含有素材のエタノール抽出物を、担体（セファデックスＬＨ－２０，ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）を充填したカラムに供し、分離用溶媒として１００容量％のエタノールを用いて分離する。分離用溶媒を自然落下させ、紫外線照射装置を用いて紫外部領域の励起光に対して蛍光を発する部分を分取し、３９℃で濃縮する。この濃縮液をシリカゲルカラムに添加し、分離を行う。分離用溶媒には、クロロホルムとメタノールの混合溶液（容量比で９５：５）を用い、分離の流速は１．０ｍｌ／分とすることができる。フォトダイオードアレイを用いてベチュレトール画分及びケンフェライド画分をそれぞれ分取する。分取された溶液をそれぞれ減圧濃縮装置に供して濃縮する。その後、真空乾燥機を用いて４０℃で乾燥し、ベチュレトールとケンフェライドを分取することができる。

【0031】

上述した方法において、ポリフェノール含有素材の抽出に用いられる抽出用溶媒としては、エタノールの他にも、例えば、水、メタノール、プロパノール等の親水性溶媒、アセトン、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルム等を用いることもできる。また、上述した方法で用いられる分離用溶媒としては、エタノールの他にも、水、メタノール、プロパノール、ブタノール等を用いることもできる。

【0032】

なお、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率を上述した範囲（１．５以上４以下）に調整する方法は、上述した方法に限られず、ケンフェライドとベチュレトールを別々に分取しなくてもよい。この場合には、例えば、ポリフェノール含有素材から、ケンフェライドとベチュレトールを異なる含有比率で含む２種類以上の抽出物を取得し、これらの抽出物同士を混合することで、ケンフェライドとベチュレトールの比率を上述した範囲（１．５以上４以下）に調整することができる。

【0033】

また、上述したとおり、ポリフェノール含有素材から、ベチュレトールとケンフェライドを含む抽出物を得るだけでは、ケンフェライドとベチュレトールを上述した比率（１．５以上４以下）に調整することが難しいが、ポリフェノール含有素材の抽出物が、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が当該範囲内にある抽出物である場合には、その抽出物を、本実施形態の口腔内細菌叢改善剤に用いてもよい。

【0034】

本実施形態の口腔内細菌叢改善剤は、ケンフェライドとベチュレトールのみにより構成されていてもよいが、ケンフェライドとベチュレトール以外のその他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、例えば、研磨剤、防腐剤、消炎剤、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴａｓｅ）阻害剤、プラーク抑制剤、知覚過敏抑制剤、歯石予防剤、粘着剤、粘稠剤、賦形剤、滑沢剤、香料、甘味剤、清涼化剤、色素、消臭剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤が挙げられる。

【0035】

本実施形態の口腔内細菌叢改善剤の性状については、特に制限されず、液状、固形状、半固形状（ゲル状、軟膏状、ペースト状）等のいずれであってもよい。

【0036】

本実施形態の口腔内細菌叢改善剤は、口腔内に所定期間滞留させることができれば、口腔内への適用方法は特に限定されない。

【0037】

本実施形態の口腔内細菌叢改善剤は、口腔内に所定期間滞留可能であれば、可食性のものであってもよく、非可食性のものであってもよい。例えば、本実施形態の口腔内細菌叢改善剤は、食品（機能性食品、特定保健用食品、病者用食品等を含む）の形態であってもよく、また医薬品（医薬部外品、指定医薬部外品を含む）や口腔化粧料の形態であってもよい。

【0038】

本実施形態の口腔内細菌叢改善剤の口腔内への適用量については、特に限定されるものではないが、例えば、１回当たり、ケンフェライドとベチュレトールが合計で５～２０μｇ口腔内に滞留する量とすることができる。なお、本実施形態の口腔内細菌叢改善剤の適用頻度は、特に限定されるものではないが、例えば、１日に１～３回とすることができる。

【0039】

本実施形態の口腔内細菌叢改善剤の製剤形態は、口腔内に所定期間滞留し得るものである限り特に限定されないが、例えば、トローチ、可食性フィルム、チューインガム、キャンディ、グミキャンディ、タブレット、顆粒、細粒、粉末、カプセル等の可食性口腔用剤や、液体歯磨剤、練歯磨剤、潤製歯磨剤、粉歯磨剤、洗口剤（マウスウォッシュ）、マウスリンス、含嗽剤、口中清涼剤（マウススプレー等）等の非可食性の製剤形態が挙げられる。

【0040】

なお、本実施形態の口腔内細菌叢改善剤の製造方法は、特に限定されるものではなく、製剤形態に応じて、公知の方法を用いることができる。

【0041】

以上説明した本実施形態の口腔内細菌叢改善剤は、歯周病や齲蝕の原因となる悪玉菌に対して抗菌作用を示すが、一方で、善玉菌に対して抗菌作用を示しにくい。このため、本実施形態の口腔内細菌叢改善剤は、口腔内細菌叢における悪玉菌と善玉菌の比率を改善することができる。

【0042】

また、本実施形態の口腔内細菌叢改善剤は、上述したように、歯周病や齲蝕の原因となる悪玉菌に対して抗菌作用を示し、一方で、善玉菌に対しては抗菌作用を示しにくい。このため、本実施形態の口腔内細菌叢改善剤は、歯周病の発生を予防する歯周病予防剤や、齲蝕の発生を予防する齲蝕予防剤として使用することもできる。

【実施例0043】

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

【0044】

［ケンフェライドとベチュレトールの取得］
ブラジル産プロポリスの原塊５０ｇに、７７％のエタノール１２０ｇを加え、６０℃ ２００ｒｐｍで１～２時間抽出した。得られた抽出物をアドバンテック東洋（株）製のＮｏ．２濾紙にて吸引濾過し、得られたろ液１０３ｇを－１５℃以下で冷却した。さらにＮｏ．２濾紙にて自然濾過し、得られたろ液をプロポリスエキスとした（収量：８３ｇ、固形分：２０％）。

【0045】

次に、プロポリスのエタノール抽出物を、担体（セファデックスＬＨ－２０，ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）を充填したカラムに供し、分離用溶媒として１００容量％のエタノールを用いて分離した。分離用溶媒を自然落下させ、紫外線照射装置を用いて紫外部領域の励起光に対して蛍光を発する部分を分取した。カラム容積の１０倍量の１００容量％エタノールで分離された画分を得て、これを減圧濃縮装置に供し、３９℃で濃縮した。

【0046】

この濃縮液をシリカゲルカラムに添加し、分離を行なった。分離用溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合溶液（容量比で９５：５）を用い、分離の流速は１．０ｍｌ／分であった。フォトダイオードアレイを用いてベチュレトール画分及びケンフェライド画分をそれぞれ分取した。分取された溶液をそれぞれ減圧濃縮装置に供して濃縮した。その後、真空乾燥機を用いて４０℃で乾燥し、ベチュレトールとケンフェライドを分取した。なお、得られた物質がベチュレトールとケンフェライドであることは、ＨＰＬＣ分析により確認した。

【0047】

［被験物の取得］
分取したベチュレトールとケンフェライドを用いて、下記表１－１に示す被験物Ａ～Ｅを取得した。また、分取したベチュレトールとケンフェライドを用いて、下記表１－２に示す被験物Ｆ～Ｇを取得した。なお、被験物Ｂ～Ｄ及び被験物Ｆ～Ｇについては、分取したケンフェライドとベチュレトールを混合することで取得した。

【表1-1】

【表1-2】

【0048】

［試験１（ａ）（悪玉菌（歯周病の原因菌）に対する抗菌作用）］
悪玉菌に対する抗菌作用を評価するため、以下に示す試験を行った。

【0049】

歯周病の原因となる悪玉菌として、フソバクテリウム・ヌクレアタム ＡＴＣＣ３１６４７（住商ファーマインターナショナル（株）から入手）を用意した。

【0050】

抗菌作用の測定は、日本化学療法学会標準法に準じて微量液体希釈法で行った。まず、歯周病の原因となる悪玉菌（フソバクテリウム・ヌクレアタム ＡＴＣＣ３１６４７）を、５μｇ／ｍｌヘミン、１μｇ／ｍｌメナジオンを加えたＧｉｆｕ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ）を使用し、窒素（８３%）水素（７%）二酸化炭素（１０%）混合ガス下で、３７℃で嫌気培養した。なお、後述する試験３のう蝕の原因となる悪玉菌（ストレプトコッカス・ミュータンス ＡＴＣＣ２５１７５）に関しては、Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）培地を使用し、３７℃で好気培養した。培養した悪玉菌を２×１０^６ｃｆｕ／ｍｌになるように調製した菌培養液を９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μＬ加えた。菌培養液が加えられたウェルに、被検物Ａ～Ｅをそれぞれ混合した０．８％から０．０１％のＤＭＳＯ水溶液を１００μｌずつ加え、ウェル内の溶液における各被験物の濃度を５μｇ／ｍｌとした。なお、コントロールとして、０．８％から０．０１％のＤＭＳＯ水溶液１００μｌを、菌培養液が加えられたウェルに加えた。

【0051】

その後、フソバクテリウム・ヌクレアタム ＡＴＣＣ３１６４７については菌培養液を３７℃で９６時間培養し、マイクロプレートリーダーで、ウェル内の溶液の光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を測定した。結果を図１ａに示す。

【0052】

図１ａに示すように、被験物Ｃ及びＤを添加した場合には、ＯＤ値がコントロールよりも低くなっており、ＯＤ値がほぼ０になっていた。なお、ＯＤ値がコントロールよりも低いことは、菌が死滅していることを指す。この結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲内であることで、フソバクテリウム・ヌクレアタム（悪玉菌）に対して抗菌作用を示すことが理解できた。

【0053】

一方で、被験物Ａ、Ｂ及びＥは、図１ａに示すように、ＯＤ値がコントロールと同等程度であった。この結果から、ケンフェライドとベチュレトールのいずれか一方しか含まない場合や、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲外である場合には、フソバクテリウム・ヌクレアタム（悪玉菌）に対して抗菌作用を示しにくいことが明らかとなった。

【0054】

［試験１（ｂ）（濃度の影響）］
本試験では、ウェルに添加する被験物を試験１（ａ）とは異なる濃度とし、抗菌作用に対する被験物の濃度の影響を評価した。

【0055】

本試験では、評価１（ａ）においてフソバクテリウム・ヌクレアタム（悪玉菌）に対する抗菌作用が確認できた被験物Ｃ及びＤを、被験物として用いた。また、本試験では、ウェル内の溶液における被験物の濃度を、１０～６０μｇ／ｍｌとした。これら以外の条件は、試験１（ａ）と同様の方法で、フソバクテリウム・ヌクレアタム ＡＴＣＣ３１６４７の培養を行い、ウェル内の溶液の光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を測定した。結果を図１ｂに示す。

【0056】

図１ｂに示すように、被験物の濃度を１０～６０μｇ／ｍｌとしても、被験物Ｃ及びＤを添加した場合には、コントロールよりもＯＤ値が低くなっており、ＯＤ値がほぼ０であった。この結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲内とすれば、その濃度に関係なく、フソバクテリウム・ヌクレアタム（悪玉菌）に対して抗菌作用を示すことが理解できた。

【0057】

［試験２（ａ）（他の悪玉菌（歯周病の原因菌）に対する抗菌作用）］
本試験では、試験１とは異なる悪玉菌を使用し、抗菌作用を評価した。

【0058】

本試験では、悪玉菌として、歯周病の原因となるアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス ストレインＹ４（国立研究開発法人 理化学研究所 バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ） 微生物材料開発室（ＪＣＭから入手）を用いた。また、本試験では、ウェル内の溶液における被験物の濃度を、４０～２００μｇ／ｍｌとした。これら以外の条件は、試験１（ａ）と同様の方法で４０時間の培養を行い、ウェル内の溶液の光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を測定した。結果を図２ａに示す。

【0059】

図２ａに示すように、被験物Ｃ及びＤを添加した場合には、被験物が４０～２００μｇ／ｍｌの範囲内のどの濃度であっても、ＯＤ値がコントロールよりも低く、コントロールのＯＤ値の１／６以下であった。この結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲内である場合には、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスに対しても抗菌作用を示すことが理解できた。

【0060】

一方、被験物Ａ、Ｂ及びＥは、図２ａに示すように、コントロールのＯＤ値よりも低くなったが、被験物Ｃ及びＤと比較すると、ＯＤ値が３倍以上も高くなっていた。この結果から、ケンフェライドとベチュレトールのいずれか一方しか含まない場合や、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲外である場合には、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（悪玉菌）に対して抗菌作用を示すものの、その抗菌作用は、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲内である場合と比較し、大幅に弱いことが明らかとなった。

【0061】

［試験２（ｂ）（被験物Ｆ及びＧの抗菌作用）］
本試験では、試験２（ａ）で用いた被験物Ａ～Ｅにかえて被験物Ｆ～Ｇを用いたこと、及び、ウェル内の溶液における被験物の濃度６０～２００μｇ／ｍｌとしたこと以外は、試験２（ａ）と同様の方法で４０時間の培養を行い、ウェル内の溶液の光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を測定した。結果を図２ｂに示す。

【0062】

図２ｂに示すように、被験物Ｆ～Ｇを添加した場合には、被験物が６０～２００μｇ／ｍｌの範囲内のどの濃度であっても、ＯＤ値がほぼ０であり、その値がコントロールよりも低くなっていた。この結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５である場合や、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が４である場合についても、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスに対して抗菌作用を示すことが理解できた。

【0063】

［試験３（他の悪玉菌（齲蝕の原因菌）に対する抗菌作用）］
本試験では、試験１とは異なる悪玉菌を使用し、抗菌作用を評価した。

【0064】

本試験では、悪玉菌として、齲蝕の原因となるストレプトコッカス・ミュータンス ＡＴＣＣ２５１７５（国立研究開発法人 理化学研究所 バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ） 微生物材料開発室（ＪＣＭ）から入手）を用いた。また、本試験では、ウェル内の溶液における被験物の濃度を、２００μｇ／ｍｌとした。これら以外の条件は、試験１（ａ）と同様の方法で４０時間の培養を行い、ウェル内の溶液の光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を測定した。結果を図３に示す。

【0065】

図３に示すように、被験物Ｃ及びＤを添加した場合には、ＯＤ値がコントロールよりも低くなっており、コントロールのＯＤ値の１／２程度であった。この結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲内である場合には、ストレプトコッカス・ミュータンスに対しても抗菌作用を示すことが理解できた。

【0066】

一方で、被験物Ａ及びＥは、図３に示すように、ＯＤ値がコントロールと同等程度あった。また、ＯＤ値がコントロールよりも低くなった被験物Ｂであっても、被験物Ｃ及びＤと比較すると、ＯＤ値が約１．５倍程度高くなっていた。この結果から、ケンフェライドとベチュレトールのいずれか一方しか含まない場合や、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲外である場合には、ストレプトコッカス・ミュータンス（悪玉菌）に対して抗菌作用を示しにくいことが明らかとなった。

【0067】

［試験４（他の悪玉菌（歯周病の原因菌）に対する抗菌作用）］
本試験では、試験１とは異なる悪玉菌を使用し、抗菌作用を評価した。

【0068】

本試験では、悪玉菌として、歯周病の原因となるプレボテラ・インターメディア ＡＴＣＣ２５６１１（国立研究開発法人 理化学研究所 バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ） 微生物材料開発室（ＪＣＭ）から入手）を用いた。また、本試験では、ウェル内の溶液における被験物の濃度を、１００μｇ／ｍｌとした。これら以外の条件は、試験１と同様の方法で４８時間の培養を行い、ウェル内の溶液の光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を測定した。結果を図４に示す。

【0069】

図４に示すように、被験物Ｃ及びＤを添加した場合には、ＯＤ値がコントロールよりも低く、コントロールのＯＤ値の１／６以下であった。この結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲内であることで、プレボテラ・インターメディア（悪玉菌）に対して抗菌作用を示すことが理解できた。

【0070】

一方で、被験物Ａ及びＥは、図４に示すように、ＯＤ値がコントロールと同等程度であった。また、ＯＤ値がコントロールよりも低くなった被験物Ｂであっても、被験物Ｃ及びＤと比較すると、ＯＤ値が約４倍以上も高くなっていた。この結果から、ケンフェライドとベチュレトールのいずれか一方しか含まない場合や、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲外である場合には、プレボテラ・インターメディア（悪玉菌）に対して抗菌作用を示しにくいことが明らかとなった。

【0071】

［試験５（ａ）（善玉菌に対する抗菌作用）］
本試験では、試験１で使用した悪玉菌にかえて善玉菌を使用し、抗菌作用を評価した。

【0072】

本試験では、試験１で用いた悪玉菌にかえて、善玉菌であるストレプトコッカス・サリバリウス ｓｔｒｅｉｎ Ｍ１８（住商ファーマインターナショナル（株）から入手）を用いた。また、本試験では、ウェル内の溶液における被験物の濃度を、４０～２００μｇ／ｍｌとした。これら以外の条件は、試験１と同様の方法で４０時間の培養を行い、ウェル内の溶液の光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を測定した。結果を図５ａに示す。

【0073】

図５ａに示すように、被験物Ｃ及びＤは、被験物が４０～２００μｇ／ｍｌの範囲内のどの濃度であっても、ＯＤ値がコントロールと同等程度であった。この結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲内である場合には、善玉菌（ストレプトコッカス・サリバリウス Ｍ１８）に対して抗菌作用を示しにくいことが明らかとなった。

【0074】

［試験５（ｂ）（被験物Ｆ及びＧの抗菌作用）］
本試験では、試験５（ａ）で用いた被験物Ａ～Ｅにかえて被験物Ｆ～Ｇを用いたこと以外は、試験５（ａ）と同様の方法で４０時間の培養を行い、ウェル内の溶液の光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を測定した。結果を図５ｂに示す。

【0075】

図５ｂに示すように、被験物Ｆ～Ｇは、被験物が４０～２００μｇ／ｍｌの範囲内のどの濃度であっても、ＯＤ値がコントロールと同等程度であった。この結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５である場合や、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が４である場合についても、善玉菌（ストレプトコッカス・サリバリウス Ｍ１８）に対して抗菌作用を示しにくいことが明らかとなった。

【0076】

［試験６（ａ）（他の悪玉菌（歯周病の原因菌）に対する抗菌作用）］
本試験では、試験１とは異なる悪玉菌を使用し、抗菌作用を評価した。

【0077】

本試験では、悪玉菌として、歯周病の原因となるポルフィロモナス・ジンジバリス ストレイン３８１（国立研究開発法人 理化学研究所 バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ） 微生物材料開発室（ＪＣＭ）から入手）及びポルフィロモナス・ジンジバリス ＡＴＣＣ３３２７７（国立研究開発法人 理化学研究所 バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ） 微生物材料開発室（ＪＣＭ）から入手）を用いた。また、本試験では、被験物として、被験物Ｃ及びＤを、ウェル内の溶液における被験物の濃度１０～６０μｇ／ｍｌとして用いた。これら以外の条件は、試験１（ａ）と同様の方法で、ポルフィロモナス・ジンジバリス ストレイン３８１については７２時間培養し、ポルフィロモナス・ジンジバリス ＡＴＣＣ３３２７７については４８時間培養した後、ウェル内の溶液の光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を測定した。結果を図６ａに示す。

【0078】

図６ａに示すように、ポルフィロモナス・ジンジバリス ストレイン３８１とポルフィロモナス・ジンジバリス ＡＴＣＣ３３２７７を用いた両方の試験において、被験物Ｃ及びＤは、被験物が１０～６０μｇ／ｍｌの範囲内のどの濃度であっても、ＯＤ値がコントロールよりも低くなっており、ＯＤ値がほぼ０になるものもあった。この結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲内である場合には、ポルフィロモナス・ジンジバリス（悪玉菌）に対して抗菌作用を示すことが明らかとなった。

【0079】

［試験６（ｂ）（被験物Ｆ及びＧの抗菌作用）］
悪玉菌としてポルフィロモナス・ジンジバリス ＡＴＣＣ３３２７７を使用した試験６（ａ）において、被験物Ｃ及びＤにかえて、ウェル内の溶液における濃度を２０～８０μｇ／ｍｌとした被験物Ｆ及びＧを用いたこと以外、試験６（ａ）と同様の方法で４８時間の培養を行い、ウェル内の溶液の光学濃度（５９５ｎｍでのＯＤ値）を測定した。結果を図６ｂに示す。

【0080】

図６ｂに示すように、被験物Ｆ及びＧは、被験物が２０～８０μｇ／ｍｌの範囲内のどの濃度であっても、ＯＤ値がコントロールよりも低くなっており、ＯＤ値がほぼ０であった。この結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５である場合や、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が４である場合についても、ポルフィロモナス・ジンジバリス（悪玉菌）に対して抗菌作用を示すことが明らかとなった。

【0081】

上述した試験１～６の結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率を１．５以上４以下とした場合には、どのような悪玉菌に対しても抗菌作用を示すが、善玉菌に対しては抗菌作用を示しにくいことが理解できた。つまり、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下である場合には、善玉菌よりも悪玉菌に対してより強く抗菌作用を示すため、口腔内細菌叢における悪玉菌と善玉菌の比率を改善できることが理解できた。

【0082】

また、上述した試験１～６の結果から、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率を１．５以上４以下とした場合には、ケンフェライドとベチュレトールのいずれか一方しか含まない場合や、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲外である場合と比較し、悪玉菌の種類を問わずに抗菌作用を示しやすく、加えて、悪玉菌に対する抗菌作用がより強いことが理解できた。つまり、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下である場合には、ケンフェライドとベチュレトールのいずれか一方しか含まない場合や、ケンフェライドに対するベチュレトールの質量比率が１．５以上４以下の範囲外である場合と比較し、口腔内細菌叢における悪玉菌と善玉菌の比率をより改善できることも明らかとなった。

【図1a】

【図1b】

【図2a】

【図2b】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図6a】

【図6b】