特開 2022-81520 ヒト人工多能性幹細胞を作製する為のリン酸化されたＴベータ４及び他の因子の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022081520

(43)【公開日】2022-05-31

(54)【発明の名称】ヒト人工多能性幹細胞を作製する為のリン酸化されたＴベータ４及び他の因子の使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20220524BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20220524BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20220524BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

C12N5/074

C07K7/08 ZNA

【審査請求】有

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022026413

(22)【出願日】2022-02-24

(62)【分割の表示】P 2020532852の分割

【原出願日】2018-08-22

(31)【優先権主張番号】62/550,337

(32)【優先日】2017-08-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】16/044,142

(32)【優先日】2018-07-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】520061778

【氏名又は名称】ソー ヤング ライフ サイエンシズ コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＳＯ ＹＯＵＮＧ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】セス，アビナッシュ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４を用いて非胚性及び／又は体細胞に多能性を誘導する為の組成物及び方法を提供する。
【解決手段】人工多能性幹細胞は真猿類又はネズミ類であり得る。外来性のＴβ４はリン酸化され得る。外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び、外来性のＯｃｔ４の少なくとも１つは細胞膜透過部分、及び／又は、核標的化部分とカップリングされ得、其れ等が核に到達する事を許す。加えて、人工多能性幹細胞は少なくとも１００継代に渡って多能性を維持する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

外来性のＴβ４と、
外来性のＳｏｘ２と、
外来性のＯｃｔ４と、
を含む人工多能性幹細胞。

【請求項2】

人工多能性幹細胞が真猿類人工多能性幹細胞を含む、請求項１に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項3】

人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞を含む、請求項２に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項4】

真猿類人工多能性幹細胞がネズミ類人工多能性幹細胞を含む、請求項１に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項5】

齧歯類人工多能性幹細胞がマウス人工多能性幹細胞を含む、請求項４に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項6】

外来性のＴβ４がリン酸化される、請求項１に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項7】

外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも１つが細胞膜透過部分とカップリングされる、請求項１に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項8】

細胞膜透過部分がカチオン性ペプチドを含む、請求項７に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項9】

カチオン性ペプチドが本質的にＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＫＫＫＫＫＫＫＫから成る配列を有する、請求項８に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項10】

外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも１つが核標的化部分とカップリングされる、請求項１に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項11】

核標的化部分がグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを含む、請求項１０に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項12】

人工多能性幹細胞が少なくとも１００継代に渡って多能性を維持する、請求項１に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項13】

外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４を含む、非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。

【請求項14】

外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも２つがリンカーに依ってカップリングされる、請求項１３に記載の非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。

【請求項15】

細胞膜透過部分が外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも１つにカップリングされる、請求項１３に記載の非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。

【請求項16】

細胞膜透過部分がカチオン性ペプチドを含む、請求項１５に記載の非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。

【請求項17】

核標的化部分が外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも１つにカップリングされる、請求項１３に記載の非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。

【請求項18】

核標的化部分がグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを含む、請求項１７に記載の非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。

【請求項19】

（１）体細胞にＴβ４、Ｓｏｘ２、及びＯｃｔ４蛋白質を導入することと、
（２）体細胞に脱分化を誘導する条件下でステップ（１）からの体細胞を培養し、人工多能性幹細胞が得られることと、
を含む、体細胞に多能性を誘導する方法。

【請求項20】

更に、人工多能性幹細胞が１００継代後に多能性を維持する様な条件下で人工多能性幹細胞を培養するステップを含む、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０１７年８月２５日出願の係属中の仮特許出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．６２／５５０，３３７及び「ヒト人工多能性幹細胞を作製する為のリン酸化されたＴベータ４他の因子の使用（Use Of Phosphorylated TBeta4 Other Factors To Generate Human Induced Pluripotent Stem Cells）」と題する２０１８年７月２４日出願の係属中の実用特許出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．１６／０４４，１４２の利益及び優先権を主張し、此れは此処に参照に依って本願に完全に組み込まれる。

【0002】

本願に於いて論じられる此れ等及び全ての他の外部資料は其れ等の全体が参照に依って組み込まれる。組み込まれた参照に依る或る用語の定義又は使用が本願に於いて提供される其の用語の定義と不整合又は反対である所では、本願に於いて提供される其の用語の定義が適用され、参照に依る其の用語の定義は適用されない。

【0003】

本発明の分野は、ヒト人工多能性幹細胞を産生する組成物及び方法である。

【背景技術】

【0004】

次の背景の議論は、本発明を理解する上で有用であり得る情報を包含する。其れは、本願に於いて提供される情報の何れかが先行技術であるか若しくは請求される本発明に関連すると言う事、又は具体的に若しくは暗黙的に参照される何れかの公開物が先行技術であると言う事の承認ではない。

【0005】

変性疾患のための根治療法の必要があり、胚性幹細胞インプラントは幾らかの希望を示している（非特許文献１）。然し乍ら、胚性幹細胞の使用には論争がある。２００６年に、山中等は４つの転写因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４を用いてマウス胚性線維芽細胞からの人工多能性幹細胞の作製を報告した（非特許文献２）。２００７年に、此れ等の転写因子はヒト線維芽細胞から多能性幹細胞を誘導する為に使用された（非特許文献３）。

【0006】

人工多能性幹細胞は胚性幹細胞に類似の特性を有し、変性疾患治療へと開発され得る。加えて、疾患の進行を研究する為に、ｉＰＳＣｓ（人工多能性幹細胞）は健康人及び病人の体細胞をリプログラミングする事に依って作製され得る。其れから、ｉＰＳＣｓは疾患を引き起こす事が疑われる変異を導入又は修正する事に依って遺伝子改変され得る。其れから、ｉＰＳＣｓは目当ての細胞型へと分化させられる（非特許文献４）。

【0007】

然し乍ら、幾つもの問題がｉＰＳＣｓが治療に幅広く用いられる事を妨げている。１つの問題は腫瘍の形成である。何故ならば、山中転写因子は腫瘍発生を促進し、其の結果、インプラントされた細胞は正常に挙動しないからである。加えて、我々はウイルスベクターの使用に依る永久的なゲノム改変が原因の影響を予測し得ない。

【0008】

本願に於いて特定される全ての公開物は、各個々の公開物又は特許出願が参照に依って組み込まれる事を具体的に且つ個々に指示されている場合と同じ度合い迄、参照に依って組み込まれる。組み込まれた参照に依る或る用語の定義又は使用が本願に於いて提供される其の用語の定義と不整合又は反対である所では、本願に於いて提供される其の用語の定義が適用され、参照に依る其の用語の定義は適用されない。

【0009】

幾つかの実施形態では、本発明の何らかの実施形態を記載及び請求する為に用いられる成分、特性、例えば濃度、反応条件等の数量を表現する数は、幾つかの場合には用語「約」に依って修飾されていると理解されるべきである。従って、幾つかの実施形態では、記述要件及び付属の請求項に於いて提示される数的パラメータは概算であり、此れ等は、特定の実施形態に依って得られる事を求められる所望の特性に依存して変わり得る。幾つかの実施形態では、数的パラメータは、報告されている有効数字の数に照らして、一般的な丸め技術を適用する事に依って解釈されるべきである。本発明の幾つかの実施形態の広い範囲を提示する数的範囲及びパラメータが概算であるにもかかわらず、具体的な例に於いて提示される数値は実施可能な程度に正確に報告されている。本発明の幾つかの実施形態に於いて提出される数値は、其れ等の夫々の検査測定に於いて見出される標準偏差から必然的に齎される何らかの誤差を含有し得る。

【0010】

文脈が明瞭に別様に述べていない限り、本明細書の記載及び次の請求項に於いて用いられる「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、複数の参照を包含する。文脈が明瞭に別様に述べていない限り、本願の記載に用いられる「ｉｎ」の意味も又「ｉｎ」及び「ｏｎ」を包含する。

【0011】

本願に於ける値の範囲の記載は、単に、範囲内に属する各別個の値を個々に参照する簡略な方法としての用を成す事を意図される。本願に於いて別様に指示されていない限り、或る範囲の各個々の値は、其れが本願に個々に記載されている場合の様に本明細書に組み込まれる。本願に於いて別様に指示されないか又は然もなければ文脈に依って明瞭に否定されない限り、本願に記載される全ての方法は何れかの好適な順序で行われ得る。本願の何らかの実施形態について提供される何れか及び全ての例、又は例示的な文言（例えば「等の」）の使用は、単に本発明をより良く説明する事を意図されており、別様に請求される本発明の範囲に限定を課さない。本明細書の如何なる文言も、本発明の実施に必須な何れかの請求されない要素を指示しているとして解釈されるべきではない。

【0012】

本願に於いて開示される本発明の代替的な要素又は実施形態の群分けは、限定として解釈されるべきではない。各群構成員は、個々に、又は群の他の構成員若しくは本願に見出される他の要素との何れかの組み合わせで、参照及び請求され得る。或る群の１つ以上の構成員は、便宜及び／又は特許性の理由で或る群に包含され得るか又は其れから削除され得る。何れかの斯かる包含又は削除が起こる時には、本願に於いて、本明細書は改変された群を含有すると判断され、其れ故に、添付の請求項に用いられる全てのマーカッシュ群の記述要件を満たす。

【0013】

其れ故に、永久的なゲノム改変を欠き、患者にインプラントされる時に腫瘍を形成しない人工多能性幹細胞の必要が尚ある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】オーレ・リンドバル（Olle Lindvall）及びザール・コカイア（Zaal Kokaia）著，「神経疾患の処置の為の幹細胞（Stem cells for the treatment of neurological disorders）」，第４４１巻，ネイチャー（NATURE），ｐ．１０９４－９６，２００６年

【非特許文献2】高橋和利及び山中伸弥著，「明確な因子に依る培養マウス胚性及び成体線維芽細胞からの多能性幹細胞の誘導（Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors）」，第１２６巻，セル（CELL），ｐ．６６３－７６，２００６年

【非特許文献3】高橋和利等著，「明確な因子に依る成体ヒト線維芽細胞からの多能性幹細胞の誘導（Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors）」，第１３１巻，セル（CELL），ｐ．８６１－７２，２００７年

【非特許文献4】ユーフェン・サマンサ・シー（Yu Fen Samantha Seah）等著，「疾患モデリングに於ける人工多能性と遺伝子編集：展望と課題（Induced Pluripotency and Gene Editing in Disease Modelling: Perspectives and Challenges）」，第１６巻，インターナショナル・ジャーナル・オブ・モレキュラー・サイエンシズ（International Journal of Molecular Sciences），ｐ．２８６１４－３４，２０１５年

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明の主題は、外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４を用いて非胚性及び／又は体細胞に多能性を誘導する為の組成物及び方法を提供する。人工多能性幹細胞は非胚性又は体細胞に由来し得る。企図される人工多能性幹細胞は真猿類（例えばヒト人工多能性幹細胞）又はネズミ類（例えばマウス人工多能性幹細胞）であり得る。更に、本発明者は、多能性が家畜に由来する細胞に於いて誘導され得ると言う事を企図する。本願の何らかの実施形態について提供される何れか及び全ての例、又は例示的な文言（例えば「等の」）の使用は、単に本発明をより良く説明する事を意図されており、別様に請求される本発明の範囲に限定を課さない。

【0016】

好ましくは、外来性のＴβ４はリン酸化される。リン酸化されたＴβ４は、ｐ５３経路を活性化する事とＲａｓ発癌遺伝子及びＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路を抑制する事とに依って多能性を促進する。

【0017】

トランスフェクション効率を増大させる為に、細胞膜透過部分が外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び／又は外来性のＯｃｔ４とカップリングされ得る。本願に於いて用いられる用語「とカップリングされる」は、共有結合される、静電的、アビジン／ストレプトアビジン等を意味する。カップリングはリンカー及び／又はスペーサーを包含する。文脈が別様に述べていない限り、本願に於いて用いられる用語「にカップリングされる」は直接的カップリング（此れに於いては、互いにカップリングされている２つの要素が互いに接触する）及び間接的カップリング（此れに於いては、少なくとも１つの追加の要素が２つの要素間に置かれる）両方を包含する事を意図される。故に、用語「にカップリングされる」及び「とカップリングされる」は同義で用いられる。

【0018】

好ましくは、細胞膜透過部分はカチオン性ペプチドを含む。カチオン性ペプチドは、アルギニン及びリジン、好ましくは、本質的にＲ９－Ｋ９（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＫＫＫＫＫＫＫＫ）から成る配列を包含する。カチオン性ペプチドは１つ以上のグリシンスペーサーを含み得る。任意に、フレキシブルなリンカーがカチオン性ペプチドをＴβ４、Ｓｏｘ２、及び／又はＯｃ４にリンクし得る。此の議論は本発明の主題の多くの例の実施形態を提供する。各実施形態は本発明の要素の単一の組み合わせを表しているが、本発明の主題は開示される要素の全ての可能な組み合わせを包含すると見做される。其れ故に、１つの実施形態が要素Ａ、Ｂ、及びＣを含み、第２の実施形態が要素Ｂ及びＤを含む場合には、明示的に開示されない場合であっても、本発明の主題はＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤの他の残りの組み合わせをも又包含すると見做される。

【0019】

外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び／又は外来性のＯｃｔ４を核標的化部分にカップリングする事は、標的遺伝子の発現を増大させる事が蓋然的である。好ましい核標的化部分はグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼである。

【0020】

本発明者は、本発明の主題に従う人工多能性幹細胞が少なくとも１００継代に渡って多能性を維持するであろう事を企図する。

【0021】

本発明の主題は、非胚性／体細胞に多能性を誘導し得る外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４を含む組成物をも又包含する。企図される組成物では、外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも２つがリンカーに依ってカップリングされる。換言すると、リンカーがＴβ４及びＳｏｘ２、Ｔβ４及びＯｃｔ４、又はＳｏｘ２及びＯｃｔ４をカップリングする。リンカーはＴβ４、Ｓｏｘ２、及びＯｃｔ４をカップリングする為にも又用いられ得る。

【0022】

細胞膜透過部分（例えばカチオン性ペプチド）及び／又は核標的化部分（例えばグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）は、外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び／又は外来性のＯｃｔ４にカップリングされ得る。任意に、核標的化部分が外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも１つにカップリングされ得る。

【0023】

更に、本発明の主題は、体細胞に多能性を誘導する方法を包含し、（１）体細胞にＴβ４、Ｓｏｘ２、及びＯｃｔ４蛋白質を導入するステップと、（２）体細胞に脱分化を誘導する条件下でステップ（１）からの体細胞を培養し、人工多能性幹細胞が得られるステップとを含む。更に、本発明の方法は、人工多能性幹細胞が１００継代後に多能性を維持する様な条件下で人工多能性幹細胞を培養するステップを包含し得る。

【0024】

本発明の主題の種々の目的、特徴、態様、及び利点は、付随する図面の図と併せて、好ましい実施形態の次の詳細な記載から、より明らかになるであろう。其の中で、同類の数字は同類のコンポーネントを表している。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】本発明の主題に従う方法の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）は糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、心血管疾患、及び筋萎縮性側索硬化症等の疾患を処置するポテンシャルを有する。ｉＰＳＣｓは成体体細胞から作製されるので、ｉＰＳＣｓは自家細胞置換治療及び臓器移植にも又用いられ得る。本発明者は、本発明のｉＰＳＣｓがＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、及びＬｉｎ２８を包含する細胞表面マーカーを発現するであろうと言う仮説を立てる。更に、本発明者は、本発明の主題に従うｉＰＳＣｓが元の細胞のＤＮＡメチル化パターン及び他のエピジェネティックな特徴を見せる事を予想する。

【0027】

本発明の主題は、外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４を用いて非胚性及び／又は体細胞に多能性を誘導する為の組成物及び方法を提供する。外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４は、成体体細胞を包含する非胚性幹細胞をリプログラミングする為に用いられる組換え蛋白質である。人工多能性幹細胞が得られた後で、其れ等は例えば心筋細胞、脂肪細胞、ドーパミン作動性ニューロン、神経細胞、運動ニューロン、膵β細胞、及び造血前駆細胞へと分化させられ得る。斯かる人工多能性幹細胞は疾患モデリング、ドラッグスクリーニング、再生医療、及び細胞治療への見込みある適用を有する。

【0028】

人工多能性幹細胞は、偶蹄目、食肉目、鯨目、翼手目、皮翼目、貧歯目、イワダヌキ目、食虫目、ウサギ目、有袋目、単孔目、奇蹄目、鱗甲目（Pholidata）、鰭脚下目、霊長目、長鼻目、齧歯目、海牛目、及び管歯目の何れかの目からの哺乳動物からの非胚性又は体細胞に由来し得る。企図される人工多能性幹細胞は真猿類（例えば、ヒト人工多能性幹細胞）又はネズミ類（例えば、マウス人工多能性幹細胞）であり得る。更に、本発明者は、多能性（pluripotentcy）が、山羊、牛、馬、及び羊等の家畜に由来する細胞に於いて誘導され得ると言う事を企図する。

【0029】

本発明の主題の好ましい実施形態では、体／非胚性細胞は、線維芽細胞、臍帯血細胞（好ましくはＣＤ３４陽性）、線維芽細胞様滑膜細胞、肝細胞、胃上皮細胞、Ｂリンパ球、膵ベータ細胞、ケラチノサイト、歯幹細胞、間葉系間質細胞、末梢血単核細胞（好ましくはＣＤ３４陽性）、及び／又は何れかの他の好適な細胞を含む。例えば７：５０（https://doi.org/10.1186/s13045-014-0050-z）のジュン・リー（Jun Li）、ウェイ・ソング（Wei Song）、及びジュン・ジョー（Jun Zhou）著，「人工多能性幹細胞の作製に用いられる細胞型及びアプローチの理解の進展（Advances in understanding the cell types and approaches used for generating induced pluripotent stem cells）」，ジャーナル・オブ・ヘマトロジー・アンド・オンコロジー（Journal of Hematology & Oncology），（２０１４年）を見よ。

【0030】

特定の仮説に依って拘束される事を願う事無しに、本発明者は、外来性のチモシンβ４（「Ｔβ４」）が取り分け外来性のＳｏｘ２及びＯｃｔ４との組み合わせで非胚性及び／又は体細胞に多能性を誘導し乍ら、腫瘍発生をも又抑制する事を予想する。Ｔβ４は全ての細胞型（赤血球を例外とする）に存在する４３アミノ酸の４．９ｋＤａ蛋白質である。Ｔβ４に依って演じられる多くの生物学的役割は、Ｇ－アクチンへの結合とＦ－アクチンからＧ－アクチンへの脱重合とを包含し、此れは細胞の増殖、分化、及び遊走にリンクされている。角膜では、Ｔβ４は抗炎症性の特性を有し、アポトーシスを抑制し、細胞遊走及び創傷治癒を促進する（ガブリエル・ソンス（Gabriel Sonse），ピン・キウ（Ping Qiu），ミシェル・クルパクス・ホイーター（Michelle Kurpakus-Wheater）著，「チモシンベータ４：新規の角膜創傷治癒及び抗炎症物質（Thymosin beta 4: A novel corneal wound healing and anti-inflammatory agent）」，第１巻（第３号），クリニカル・オフサルモロジー（CLINICAL OPHTHALMOLOGY），ｐ．２０１－０７（２００７年））。Ｔβ４はオリゴデンドロサイト発生を媒介し、脱髄を処置するので、Ｔβ４は神経損傷の為の見込みある処置としても又特定されている（マノランジャン・サントラ（Manoranjan Santra）等著，「チモシンベータ４はｐ３８ＭＡＰＫを上方制御する事に依ってオリゴデンドロサイト分化を媒介する（Thymosin beta 4 mediates oligodendrocyte differentiation by upregulating p38 MAPK）」，第６０巻（第１２号），グリア（GLIA），ｐ．１８２６－３８（２０１２年））。

【0031】

Ｔβ４が多能性を誘導する事に役割を演ずる前例がある。Ｔβ４は成体心外膜由来前駆細胞から其れ等の胚性表現型への復帰を誘導する事が示されている（ポール（Paul）Ｒ．ライリー（Riley）及びニコラ・スマート（Nicola Smart）著，「チモシンβ４は成体心臓に於ける心外膜由来新生血管形成を誘導する（Thymosin β4 induces epicardium-derived neovascularization in the adult heart）」，第３７巻（第６号），バイオケミカル・ソサエティ・トランザクションズ（Biochemical Society Transactions），ｐ．１２１８－２０（２００９年））。ライリー（Riley）及びスマート（Smart）は、合成Ｔβ４が多能性を回復させる能力が、急性虚血性傷害後の心筋再生及び新生血管形成を助け得る事を示唆した。Ｔβ４が心外膜由来細胞に多能性を誘導した後に、齎された心外膜由来人工多能性細胞は上皮間葉移行を経て、心外膜から遊走し、成体の心臓の新生血管形成に寄与し得る血管前駆体へと分化した。Ｔβ４がＴ細胞及び内皮細胞分化に役割を演ずると言う報告に鑑みて、Ｔβ４が多能性を誘導する能力は予測不可能である。

【0032】

Ｔβ４は腫瘍抑制性及び腫瘍発生性の特性両方を有する事も又示されている。ジョー・カールス（Jo Caers）等はＴβ４が多発性骨髄腫に於いて腫瘍抑制性の効果を有する事を報告した（ジョー・カールス（Jo Caers）等著，「チモシンβ４は腫瘍抑制性の効果を有し、其の減少した発現は多発性骨髄腫の不良な予後及び減少した生存を齎す（Thymosin β4 has tumor suppressive effects and its decreased expression results in poor prognosis and decreased survival in multiple myeloma）」，第９５巻（第１号），ヘマトロジカ（HAEMATOLOGICA），ｐ．１６３－６７（２０１０年））。具体的には、Ｔβ４発現は多発性骨髄腫細胞に於いて下方制御されており、此れはマウスに於けるより短い生存時間と相関した。Ｔβ４発現をブーストする事は生存時間を増大させた。対照的に、Ｔβ４の過剰発現は、固形腫瘍（例えば結腸癌）のインビトロに於ける増大した成長、移動性、及び浸潤、並びにインビボに於ける増大した腫瘍負荷にリンクされている。

【0033】

好ましくは、外来性のＴβ４は発癌経路を抑制する為にリン酸化される。例示的なＴβ４アミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔデータベースアクセッション番号Ｐ６２３２８（一次配列）及び其の保存的に改変されたバリアントを包含する。

【0034】

先に、メング（Meng）等は、発現を増大させる為にウッドチャック転写後制御エレメント及び強い脾フォーカス形成性ウイルスがベクターに包含される時に、臍帯血由来ＣＤ３４^＋細胞が、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２を発現するレンチウイルスベクター単独を用いてリプログラミングされ得ると言う事を実証した（シャンメイ・メング（Xianmei Meng）等著，「ＯＣＴ４及びＳＯＸ２単独に依るヒト臍帯血ＣＤ３４^＋細胞から人工多能性幹細胞への効率的なリプログラミング（Efficient Reprogramming of Human Cord Blood CD34⁺ Cells Into Induced Pluripotent Stem Cells With OCT4 and SOX2 Alone）」，第２０巻（第２号），モレキュラー・セラピー（MOLECULAR THERAPY），ｐ．４０８－１６（２０１２年））。著者は、線維芽細胞が、線維芽細胞に依るトランスジーン発現を増大させるプロモーター、例えばＥＦ１を用いてリプログラミングされ得ると言う事を示唆している。リプログラミングは、ＫＬＦ４及びＭｙｃをコードするベクターとの組み合わせでＯｃｔ４及びＳｏｘ２発現のより弱いプロモーターを用いても又達成され得る。然し乍ら、先に指摘された通り、Ｍｙｃは発癌性である。

【0035】

リプログラミング効率が発現レベルに依って限定される問題は、蛋白質Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２に依って細胞を直接的にリプログラミングする事に依って取り除かれ得る。リプログラミングは、Ｔβ４、好ましくはリン酸化されたＴβ４に依って更に向上させられる事が予想される。Ｓｏｘ２の例示的なアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔデータベースアクセッション番号Ｐ４８４３１（一次配列）及び其の保存的に改変されたバリアントを包含する。Ｏｃｔ４の例示的なアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔデータベースアクセッション番号Ｑ０１８６０（一次配列）及び其の保存的に改変されたバリアントを包含する。

【0036】

本発明の主題に従う組成物及び方法を用いると、トランスフェクション効率は１％、２％、５％、及び１０％よりも多大であると見積もられる。トランスフェクション効率、其れ故にリプログラミング効率を更に増大させる為に、細胞膜透過部分が外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び／又は外来性のＯｃｔ４とカップリングされ得る。文脈が別様に述べていない限り、本願に於いて用いられる用語「カップリングされる」は直接的カップリング（此れに於いては、互いにカップリングされている２つの要素が互いに接触する）及び間接的カップリング（此れに於いては、少なくとも１つの追加の要素が２つの要素間に置かれる）両方を包含する事を意図される。故に、用語「にカップリングされる」及び「とカップリングされる」は同義で用いられる。例えば、外来性の蛋白質及びペプチドは、ペプチド結合に依って共有結合、静電相互作用に依ってカップリング、親和性に依ってカップリング（例えば、アビジン又はストレプトアビジンとビオチン）等され得る。カップリングは、リンカー及び／又はスペーサー、例えばＧ４Ｓ、ポリエチレングリコール、又は他の好適なリンカーを包含する。プロテオケム（ProteoChem）^ＴＭは幾つもの好適なヘテロ二官能性架橋剤をオファーしており、ＡＮＢ－ＮＯＳ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＬＣ－ＳＰＤＰ、ＭＢＳ、ＰＤＰＨ、ＳＢＡ、ＳＩＡ、スルホ－ＳＩＡ、ＳＭＰＨ、ＳＰＤＰ、スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＡＮＰＡＨ、及び／又はスルホ－ＭＳＣＣを包含する（www.proteochem.com/proteincrosslinkersheterobifunctionalcrosslinkers-c-1_7.html?gclid=CIWr7pS42tUCFUtNfgodO_sB3A）。

【0037】

好ましくは、細胞膜透過部分はカチオン性ペプチドを含む。カチオン性ペプチドは、４及び２０個の間のアルギニン及び／又はリジン残基、好ましくは９つのアルギニン及び９つのリジン残基を包含する。リポソーム又はハイドロゲル製剤等の他の送達方法も又企図される。斯かる製剤では、細胞膜透過部分は、外来性のＴβ４、Ｓｏｘ２、及び／又はＯｃｔ４にではなく寧ろ（或いは其れに加えて）リポソーム又はハイドロゲルにカップリングされ得る。此の議論は本発明の主題の多くの例の実施形態を提供する。各実施形態は本発明の要素の単一の組み合わせを表しているが、本発明の主題は開示される要素の全ての可能な組み合わせを包含すると見做される。其れ故に、１つの実施形態が要素Ａ、Ｂ、及びＣを含み、第２の実施形態が要素Ｂ及びＤを含む場合には、明示的に開示されない場合であっても、本発明の主題はＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤの他の残りの組み合わせをも又包含すると見做される。

【0038】

外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び／又は外来性のＯｃｔ４を核標的化部分にカップリングする事は、体／非胚性細胞をリプログラミングして多能性状態に復帰させる事を担う標的遺伝子（例えばＯｃｔ３／４、Ｒｅｘ１、Ｎａｎｏｇ、Ｇａｔａ６、Ｍｓｘ２、Ｐａｘ６、Ｈａｎｄ１）の発現を増大させる事が蓋然的である。好ましい核標的化部分はグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼである（例えばＵｎｉＰｒｏｔデータベースアクセッション番号Ｐ２８１６１）。斯かるリポソーム及び／又はハイドロゲル製剤では、核標的化部分は、外来性のＴβ４、Ｓｏｘ２、及び／又はＯｃｔ４にではなく寧ろ（或いは其れに加えて）リポソーム又はハイドロゲルにカップリングされ得る。

【0039】

外来性の蛋白質は当分野に於いて公知の組換え技術を用いて産生され得る。本発明者は、Ｔβ４、Ｓｏｘ２、及びＯｃｔ４が単一の発現配列から翻訳され得る事を企図する。代替的には、発現配列は、Ｔβ４及びＳｏｘ２、Ｔβ４及びＯｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＯｃｔ４、Ｔβ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、並びに其れ等の何れかの組み合わせを含み得る。外来性の蛋白質の産生は、原核（例えば大腸菌）、酵母（例えば出芽酵母、ピチア、クルイウェロマイセス、ハンゼヌラ、及びヤロウィア）、又は真核細胞（例えばＨＥＫ２９３及びＣＨＯ）を用いて達成され得る。昆虫細胞及び無細胞法も又企図される。

【0040】

本発明者は、本発明の主題に従う人工多能性幹細胞が少なくとも５継代、少なくとも１０継代、少なくとも２０継代、少なくとも５０継代、好ましくは少なくとも１００継代に渡って多能性を維持するであろう事を企図する。

【0041】

本発明の主題は、非胚性／体細胞に多能性を誘導し得る外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４を含む組成物をも又包含する。企図される組成物では、外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも２つがリンカーに依ってカップリングされる。換言すると、リンカーがＴβ４及びＳｏｘ２、Ｔβ４及びＯｃｔ４、又はＳｏｘ２及びＯｃｔ４をカップリングする。リンカーはＴβ４、Ｓｏｘ２、及びＯｃｔ４をカップリングする為にも又用いられ得る。

【0042】

細胞膜透過部分（例えばカチオン性ペプチド）及び／又は核標的化部分（例えばグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）は、外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び／又は外来性のＯｃｔ４にカップリングされ得る。任意に、核標的化部分は外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも１つにカップリングされる。

【0043】

図１は、体（非胚性）細胞に多能性を誘導する方法のフローチャートを示している。ステップ（１）では、Ｔβ４、Ｓｏｘ２、及びＯｃｔ４蛋白質が体細胞に導入される。ステップ（２）では、ステップ（１）からの体細胞が、体細胞に脱分化を誘導する条件下で培養されて、人工多能性幹細胞を得る。任意のステップ（３）では、人工多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞が１０、２０、５０、又は１００継代後に多能性を維持する様な条件下で培養される。

【実施例0044】

例１
線維芽細胞又は脂肪細胞を２８日に渡って１２時間毎に１２ｍｇ／ｍｌのタグ付き組換え蛋白質に依ってトランスフェクションして、細胞をリプログラミングする。ＥＭ培地、好ましくは馴化ＥＭ培地でフィーダー細胞上で培養する。ｉＰＳコロニーを拾い、拡大培養する。例えばケジン・ホー（Kejin Hu）著，「全ての道は人工多能性幹細胞に通ずる：ｉＰＳＣ作製のテクノロジー（All Roads Lead to Induced Pluripotent Stem Cells: The Technologies of iPSC Generation）」，第２３巻（第１２号），ステムセルズ・アンド・デベロップメント（STEM CELLS AND DEVELOPMENT），ｐ．１２８５－１３００（２０１４年）、シャオユウ・デング（Xiao-Yue Deng）等著，「インテグレーション無しの人工多能性幹細胞を作製する為の非ウイルス的方法（Non-Viral Methods For Generating Integration-Free, Induced Pluripotent Stem Cells）」，第１０巻，カレント・ステムセル・リサーチ・アンド・セラピー（CURRENT STEM CELL RESEARCH & THERAPY），ｐ．１５３－５８（２０１５年）を見よ。

【0045】

形質転換されたｉＰＳＣｓは、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９／６Ｅ、及び／又はＮａｎｏｇ等の多能性幹細胞マーカーの発現を検出する為にアルカリホスファターゼに依って染色されるであろう。

【0046】

リプログラミングは胚様体及び／又はテラトーマの形成について検査する事に依って検査され得る（高橋和利等著，「明確な因子に依る成体ヒト線維芽細胞からの多能性幹細胞の誘導（Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors）」，第１３１巻，セル（CELL），ｐ．８６１－７２（２００７年））。多能性（pluripotentcy）の誘導はキメラマウスを作製する事に依ってもまた確認され得る（シーラ・ネメス（Csilla Nemes）等著，「蛋白質トランスダクションに依るマウス人工多能性幹細胞の作製（Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells by Protein Transduction），第２０巻（第５号)，ティッシュー・エンジニアリング（TISSUE ENGINEERING）パートＣ，ｐ．３８３－３９２（２０１４年））。

【0047】

本願に於ける本発明の概念から逸脱する事無しに、既に記載された物以外にずっと多くの改変が可能であると言う事は当業者には明らかな筈である。故に、本発明の主題は添付の請求項の範囲内を例外として制限されない。更に其の上、明細書及び請求項両方を解釈する上で、全ての用語は文脈と整合する最も広い可能な様式で解釈されるべきである。特に、用語「含む」及び「含む事」は、要素、コンポーネント、又はステップを非排他的な様式で参照していると解釈されるべきであり、参照される要素、コンポーネント、又はステップが、はっきりと参照されていない他の要素、コンポーネント、又はステップと共に存在するか、利用されるか、又は組み合わせられ得ると言う事を指示している。明細書や請求項が、Ａ、Ｂ、Ｃ…及びＮから成る群から選択される何かの少なくとも１つを参照している所では、文章は、ＡプラスＮ、又はＢプラスＮ等ではなく群からの１つの要素のみを要求すると解釈されるべきである。

【図1】

【手続補正書】

【提出日】2022-03-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

ヒト身体の外部で体細胞に多能性を誘導するインビトロ方法であって、
（１）前記体細胞にＴβ４、Ｓｏｘ２、及びＯｃｔ４蛋白質を接触させることと、
（２）前記体細胞に脱分化を誘導する条件下でステップ（１）からの前記体細胞を培養し、人工多能性幹細胞が得られることと、
を含む、方法。

【請求項2】

前記人工多能性幹細胞が１００継代後に多能性を維持する様な条件下で前記人工多能性幹細胞を培養するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記Ｔβ４、Ｓｏｘ２、及びＯｃｔ４の少なくとも１つが、細胞膜透過部分とカップリングされている、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞膜透過部分がカチオン性ペプチドを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記カチオン性ペプチドが本質的にＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＫＫＫＫＫＫＫＫから成る配列を有する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記Ｔβ４、Ｓｏｘ２、及びＯｃｔ４の少なくとも１つが、核標的化部分にカップリングされている、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記核標的化部分がグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを含む、請求項６に記載の方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0047】

本願に於ける本発明の概念から逸脱する事無しに、既に記載された物以外にずっと多くの改変が可能であると言う事は当業者には明らかな筈である。故に、本発明の主題は添付の請求項の範囲内を例外として制限されない。更に其の上、明細書及び請求項両方を解釈する上で、全ての用語は文脈と整合する最も広い可能な様式で解釈されるべきである。特に、用語「含む」及び「含む事」は、要素、コンポーネント、又はステップを非排他的な様式で参照していると解釈されるべきであり、参照される要素、コンポーネント、又はステップが、はっきりと参照されていない他の要素、コンポーネント、又はステップと共に存在するか、利用されるか、又は組み合わせられ得ると言う事を指示している。明細書や請求項が、Ａ、Ｂ、Ｃ…及びＮから成る群から選択される何かの少なくとも１つを参照している所では、文章は、ＡプラスＮ、又はＢプラスＮ等ではなく群からの１つの要素のみを要求すると解釈されるべきである。
（付記）
好ましい実施形態として、上記実施形態から把握できる技術的思想について、以下に記載する。
［項目１］
外来性のＴβ４と、
外来性のＳｏｘ２と、
外来性のＯｃｔ４と、
を含む人工多能性幹細胞。
［項目２］
人工多能性幹細胞が真猿類人工多能性幹細胞を含む、項目１に記載の人工多能性幹細胞。
［項目３］
人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞を含む、項目２に記載の人工多能性幹細胞。
［項目４］
真猿類人工多能性幹細胞がネズミ類人工多能性幹細胞を含む、項目１に記載の人工多能性幹細胞。
［項目５］
齧歯類人工多能性幹細胞がマウス人工多能性幹細胞を含む、項目４に記載の人工多能性幹細胞。
［項目６］
外来性のＴβ４がリン酸化される、項目１に記載の人工多能性幹細胞。
［項目７］
外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも１つが細胞膜透過部分とカップリングされる、項目１に記載の人工多能性幹細胞。
［項目８］
細胞膜透過部分がカチオン性ペプチドを含む、項目７に記載の人工多能性幹細胞。
［項目９］
カチオン性ペプチドが本質的にＲＲＲＲＲＲＲＲＲＫＫＫＫＫＫＫＫＫから成る配列を有する、項目８に記載の人工多能性幹細胞。
［項目１０］
外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも１つが核標的化部分とカップリングされる、項目１に記載の人工多能性幹細胞。
［項目１１］
核標的化部分がグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを含む、項目１０に記載の人工多能性幹細胞。
［項目１２］
人工多能性幹細胞が少なくとも１００継代に渡って多能性を維持する、項目１に記載の人工多能性幹細胞。
［項目１３］
外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４を含む、非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。
［項目１４］
外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも２つがリンカーに依ってカップリングされる、項目１３に記載の非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。
［項目１５］
細胞膜透過部分が外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも１つにカップリングされる、項目１３に記載の非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。
［項目１６］
細胞膜透過部分がカチオン性ペプチドを含む、項目１５に記載の非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。
［項目１７］
核標的化部分が外来性のＴβ４、外来性のＳｏｘ２、及び外来性のＯｃｔ４の少なくとも１つにカップリングされる、項目１３に記載の非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。
［項目１８］
核標的化部分がグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを含む、項目１７に記載の非胚性細胞に多能性を誘導する為の組成物。
［項目１９］
（１）体細胞にＴβ４、Ｓｏｘ２、及びＯｃｔ４蛋白質を導入することと、
（２）体細胞に脱分化を誘導する条件下でステップ（１）からの体細胞を培養し、人工多能性幹細胞が得られることと、
を含む、体細胞に多能性を誘導する方法。
［項目２０］
更に、人工多能性幹細胞が１００継代後に多能性を維持する様な条件下で人工多能性幹細胞を培養するステップを含む、項目１９に記載の方法。

【外国語明細書】