特開 2022-82754 ＶＥＧＦのためのＤ－ペプチド性化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022082754

(43)【公開日】2022-06-02

(54)【発明の名称】ＶＥＧＦのためのＤ－ペプチド性化合物

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/00 20060101AFI20220526BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20220526BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220526BHJP

   A61K 51/08 20060101ALI20220526BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20220526BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20220526BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220526BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220526BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220526BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220526BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220526BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220526BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20220526BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220526BHJP

【ＦＩ】

C07K14/00 ZNA

A61K38/16

A61K39/395 N

A61K51/08 200

A61K47/60

A61P27/02

A61P9/00

A61P35/00

A61P29/00

A61P9/10 101

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P17/00

C07K16/18

C12N15/11 Z

【審査請求】有

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022063931

(22)【出願日】2022-04-07

(62)【分割の表示】P 2021559471の分割

【原出願日】2020-03-20

(31)【優先権主張番号】62/865,469

(32)【優先日】2019-06-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/822,241

(32)【優先日】2019-03-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】521437910

【氏名又は名称】リフレクション ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】512080756

【氏名又は名称】ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＧＯＶＥＲＮＩＮＧ ＣＯＵＮＣＩＬ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＯＲＯＮＴＯ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ポール マリネック

(72)【発明者】

【氏名】カイル ランドグラフ

(72)【発明者】

【氏名】ダナ オールト－リッシェ

(72)【発明者】

【氏名】マルチ チャンドラ ウッパラパティ

(72)【発明者】

【氏名】サチデフ シドゥ

(57)【要約】

【課題】ＶＥＧＦのためのＤ－ペプチド性化合物の提供。
【解決手段】ＶＥＧＦに特異的に結合するＤ－ペプチド性化合物が提供される。また、連結成分を介して連結される二つ以上のドメインを含む多価Ｄ－ペプチド性化合物も提供される。多価（例えば、二価、三価、四価など）化合物は、標的タンパク質上の異なる結合部位に特異的に結合し、ＶＥＧＦ標的タンパク質への高い親和性結合、およびＶＥＧＦ標的タンパク質に対する強力な活性をもたらす、複数の別個のドメインを含みうる。多価化合物での用途があるＤ－ペプチド性ＧＡドメインおよびＺドメインも提供され、そのポリペプチドは、ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ）への特異的結合のための特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）を有する。標的タンパク質はホモ二量体（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ）であるため、Ｄ－ペプチド性化合物は同様に二量体であってもよく、多価（例えば、二価）Ｄ－ペプチド性化合物の二量体を含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）のＤ‐ペプチド性化合物

【化101】

またはその薬学的に許容可能な塩であって、
ｐ１およびｐ２はそれぞれ独立して、１または２である、
Ｄ‐ペプチド性化合物。

【請求項2】

式（Ｉ）において、配列番号１１９のＫ ^７ アミノ酸残基と、配列番号１１３のＫ ^１９ アミノ酸残基とを連結するリンカーが、式

【化102】

を有する、請求項１に記載のＤ‐ペプチド性化合物。

【請求項3】

式（Ｉ）において、配列番号１１９のＫ ^７ アミノ酸残基と、配列番号１１３のＫ ^１９ アミノ酸残基とを連結するリンカーが、式

【化103】

を有する、請求項１に記載のＤ‐ペプチド性化合物。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載のＤ‐ペプチド性化合物またはその薬学的に許容可能な塩、および
薬学的に許容可能な賦形剤
を含む、医薬組成物。

【請求項5】

前記組成物は、眼の疾患または状態の治療のために製剤化される、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

血管新生に関連する疾患または状態の治療または予防が必要な対象者において血管新生に関連する疾患または状態を治療または予防する方法において使用するための組成物であって、請求項１～３のいずれか一項に記載のＤペプチド性化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含み、前記方法は、前記組成物を前記対象に投与することを含む、組成物。

【請求項7】

血管新生に関連する前記疾患または状態が、癌、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、黄斑変性症、網膜症および皮膚疾患である、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

血管新生に関連する前記疾患または状態が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）である、請求項６に記載の組成物。

【請求項9】

血管新生に関連する前記疾患または状態が、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である、請求項６に記載の組成物。

【請求項10】

血管新生に関連する疾患または状態をｉｎ ｖｉｖｏで診断または撮像するための方法において使用するための組成物であって、請求項１～３のいずれか一項に記載のＤペプチド性化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含み、
前記方法は、前記組成物を対象に投与すること、および
前記対象者の少なくとも一部を撮像することを含む、
組成物。

【請求項11】

前記撮像が、ＰＥＴ撮像を含み、前記投与が、前記対象者の前記血管系に前記化合物を投与することを含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記方法は、細胞受容体による前記化合物の取込みを検出することをさらに含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項13】

前記方法は、前記対象者にベバシズマブを投与することをさらに含み、血管新生と関連する前記疾患または状態が癌である、請求項１０に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８２２，２４１号明細書、および２０１９年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／８６５，４６９号の利益を主張するものであり、当該出願を参照し、その全体を本明細書に組み込む。

【0002】

血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ－Ａ）は、正常な血管新生、および異常または病理学的な血管新生の両方についての重要な調節因子である。血管新生および血管形成における血管新生因子であることに加えて、ＶＥＧＦは、内皮細胞生存、血管透過性および血管拡張、単球走化性およびカルシウム流入などの他の生理学的プロセスにおいて、複数の生物学的効果を示す多面的成長因子である。血管新生は、血管内皮細胞が増殖して既存の血管網から新しい血管を形成する重要な細胞事象である。血管新生は、腫瘍、増殖性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、および乾癬などの様々な障害の病因に関連付けられる。血管新生は、ほとんどの原発腫瘍の成長と、それに続く様々な癌の転移に不可欠である。

【0003】

眼液中のＶＥＧＦ－Ａの濃度は、糖尿病性および他の虚血関連の網膜症を有する患者における血管の活性増殖の存在と相関する。さらに、ＶＥＧＦは、ＡＭＤに罹患した患者の脈絡膜新生血管膜に局在する。滲出型ＡＭＤは、網膜下での黄色がかった白色の沈着物発生を特徴とする状態である乾燥型ＡＭＤが先行し、網膜組織の変動的な薄化および機能不全を伴うが、異常な新しい血管の成長は欠如している。乾燥型ＡＭＤは、新しい異常な血管が網膜に侵入すると滲出型ＡＭＤに転換する。この異常な新しい血管の成長は脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と呼ばれる。抗ＶＥＧＦ－Ａ薬は、滲出型ＡＭＤの治療に用途がある。

【背景技術】

【0004】

ＶＥＧＦ－Ａ標的療法は、様々な癌の治療に用途がある。ところが、一部の事例では、患者は最終的にそのような療法に対して耐性ができる。ＶＥＧＦ－Ａおよびもう一つの追加的な癌標的を標的とする併用療法が、現時点で関心対象となっており、これには例えば、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）がある。例えば、ベバシズマブおよびアテゾリズマブを使用したＶＥＧＦ－ＡおよびＰＤ－Ｌ１を標的とする併用療法は、ＰＤ－Ｌ１陽性の転移性腎細胞癌を有する患者において疾患進行または死亡のリスクの減少を示した。
ＶＥＧＦ－Ａなどのタンパク質の相互作用を操作する能力は、基礎生物学的研究と治療法および診断法の開発の両方にとって関心対象である。タンパク質リガンドは、高い特異性および親和性を有する結合イベントをもたらす標的分子への複数の接点を有する、大きな結合表面を形成することができる。例えば、抗体は、様々な標的タンパク質に対して特異的かつ緊密な結合リガンドを産生したタンパク質の部類である。さらに、Mandal et al. (“Chemical synthesis and X-ray structure of a heterochiral {D-protein antagonist plus VEGF} protein complex by racemic crystallography”,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 14779-14784 (2012))、およびUppalapati et al. (“A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable and longer-circulating in vivo”, ACS Chem Biol (2016))に、ＶＥＧＦ－ＡのＤタンパク質拮抗薬の記載がある。当該標的分子の多様性およびタンパク質リガンドの結合特性のため、有用な機能を有する結合タンパク質の調製が関心対象である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Mandal et al. (“Chemical synthesis and X-ray structure of a heterochiral {D-protein antagonist plus VEGF} protein complex by racemic crystallography”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 14779-14784 (2012))

【非特許文献2】Uppalapati et al. (“A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable and longer-circulating in vivo”, ACS Chem Biol (2016))

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合するＤ－ペプチド性化合物が提供されている。当該化合物は、ＶＥＧＦ－Ａ結合ＧＡドメインを含みうる。当該化合物は、ＶＥＧＦ－Ａ結合Ｚドメインモチーフを含みうる。また、連結成分を介して連結される当該Ｄ－ペプチド性ドメインのうちの二つ以上を含む多価化合物も提供されている。多価（例えば、二価、三価、四価など）Ｄ－ペプチド性化合物は、標的タンパク質上の異なる結合部位に特異的に結合し、ＶＥＧＦ標的タンパク質への高い親和性結合、およびＶＥＧＦ標的タンパク質に対する強力な活性をもたらす、複数の別個のドメインを含みうる。多価化合物での用途があるＤ－ペプチド性ＧＡドメインおよびＺドメインも提供され、そのポリペプチドは、ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ）への特異的結合のための特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）を有する。標的タンパク質はホモ二量体（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ）であるため、Ｄ－ペプチド性化合物は同様に二量体であってもよく、多価（例えば、二価）Ｄ－ペプチド性化合物の二量体を含む。当該Ｄ－ペプチド性化合物は、ＶＥＧＦ－Ａ標的への特異的結合が望ましい用途において様々な使用法がある。化合物を使用する方法が提供されており、これには、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）または癌の対象者を治療するための方法など、対象者におけるＶＥＧＦに関連する疾患もしくは状態、または対象者における血管新生に関連する疾患もしくは状態を治療するための方法が含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図１は、ＶＥＧＦ－Ａ（空間充填表現）と複合体化された例示的化合物１．１．１（ｃ２１ａ）（白色棒状表現）のＸ線結晶構造図を示す。ＶＥＧＦ－Ａの結合部位残基はピンク色で示す。ＶＥＧＦ－Ａ（８～１０９）結合部位残基は太字で示している：ＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰＫＫＤ（配列番号８８）。

【図2】図２は、Mandal et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 14779-14784 (2012))に記載のあるＤタンパク質拮抗薬の構造（マゼンタ棒状表現）にオーバーレイさせたＶＥＧＦ－Ａ（空間充填表現）と複合体化された例示的化合物１．１．１（ｃ２１ａ） （白色棒状表現） のＸ線結晶構造のオーバレイを示す。ＶＥＧＦ－Ａの結合部位残基はピンク色で示す。構造は、化合物１．１．１（ｃ２１ａ）が、Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．の化合物と同じ拮抗性部位で結合していることを示す。

【図3】図３Ａ－３Ｂは、Ｌ－タンパク質ＧＡドメイン、およびＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合する例示的なＤ－ペプチド性化合物の３らせんバンドル構造の並列比較を示す。図３Ａは、Ｌ－タンパク質ＧＡドメイン（タンパク質データバンク構造１ｔｆ０）のＸ線結晶構造の一つの図と、らせん１～３の配置を示す概略図とを示す。図３Ｂは、ＶＥＧＦ－Ａ（この図では図示せず）と複合体化された化合物１．１．１（ｃ２１ａ）の類似したＸ線結晶構造図と、らせん１～３の配置を示す概略図とを示す。

【図4】図４は、ＶＥＧＦ－Ａ（この図では図示せず）と複合体化された化合物１．１．１（ｃ２１ａ）のＸ線結晶構造図を示す。らせん１（２０１）、らせん２（２０２）、およびらせん３（２０３）は、未変性ＧＡドメインのアルファ－らせん領域に相当するＤ－ペプチド性化合物のアルファ－らせん領域である。２０６は、位置３１（ｆ３１）のフェニルアラニン残基である。２０５、２０７、および２１０はそれぞれ、位置２７（ｈ２７）、位置３４（ｈ３４）、および位置４０（ｈ４０）のヒスチジン残基である。２０９は、３７位（ｙ３７）のチロシン残基である。２０４および２０８はそれぞれ、位置２６（ｐ２６）および位置３６（ｐ３６）のらせん２－末端プロリン残基である。

【図5】図５は、例示的なＤ－ペプチド性化合物（１．１．１（ｃ２１ａ）、棒状表示）と、複合体のＸ線結晶構造から取り出したＶＥＧＦ－Ａ（空間充填表現）との間の結合界面を図示したものである。化合物の残基ｆ３１（２０６）は、複合体の結合界面においてＶＥＧＦ－Ａの結合ポケット内に突出する。位置２７（２０５）、位置３４（２０７）、および位置４０（２１０）のヒスチジン残基は、結合界面においてＶＥＧＦ－Ａと追加的な接触をする。残基ｙ３７（２０９）の側鎖は、ＶＥＧＦ－Ａ表面に向かって突出するが、密接はしない。

【図6】図６Ａ－６Ｄは、３らせんバンドル構造に基づく当該化合物の構造モデルを示す。図６Ａは、未変性ＧＡドメインにおける三つのらせんの配置の概略図を示す。図６Ｂは、Ｄペプチド性ＧＡドメインモチーフにおける三つのらせんの配置の概略図を示す。図６Ｃは、７連子繰返し単位の疎水性充填に基づく、逆平行三本鎖らせんからなるＤｅｇｒａｄｏの構造モデルを示し、７つの残基モチーフ（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎは、モチーフの特定の位置において特徴的な残基を有するらせんセグメントを形成する。図６Ｄは、Ｄ－ペプチド３らせんドメインモチーフへのＤｅｇｒａｄｏの７連子繰返しモデルの適応を示す。

【図7】図７Ａ－７Ｂは、当該Ｄ－ペプチド性化合物の３らせんバンドル構造モデルを示す。図７Ａは、ＧＡドメインモチーフに見られるらせん１～３の第一の配置を示す。図７Ｂは、当該化合物の３らせんバンドルの構造モデルを示す。

【図8】図８Ａ－８Ｃは、２らせん複合体構造に基づく当該化合物の構造モデルを示す。図８Ａは、ＧＡドメインモチーフに見られるものと一致するらせんＡ－Ｂの第一の配置の側面図および上面図を示し、ここでＮおよびＣは、ペプチド性化合物のＮ末端およびＣ末端を示す。図８Ｂは、ＶＥＧＦ－Ａと接触するｇ－ｇ面を含む当該化合物の２らせん複合体の構造的７連子繰返しモデルを示す。図８Ｃは、らせんＡおよびらせんＢによって画定される２らせん複合体７連子繰返しモデル（図８Ｂを参照）の、溶媒に曝露されたｃおよびｇ位置（青色）内に位置する選択されたＶＥＧＦ－Ａ接触残基を含むバリアントモチーフを示し、、ここで、ｈ＊はヒスチジンまたはその類似体であり、ｆ＊はフェニルアラニンまたはその類似体であり、ｕは非極性アミノ酸残基である。図８Ｃでは、“＿”は、基礎となる足場ドメインの位置を示し、破線は、残基の可能性のあるらせん間での接触または連結の位置を示す。

【図9】図９Ａ－９Ｃは、化合物配列を３らせんバンドル構造に関連付ける当該化合物の構造モデルを示す。図９Ａは、例示的化合物の７連子繰返しモデルの一部分の三次元表現を示す。化合物１．１．１（ｃ２１ａ）の選択された残基は、ＶＥＧＦ－Ａと複合体化された化合物のＸ線結晶構造と一致する、７連子繰返し単位モデルの位置に割り当てられる。らせん２およびらせん３によって定義される化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合面は、７連子繰返しモデルのｇ－ｇ面に対応する。図９Ｂは、３らせんバンドル構造のコアに充填される、赤色で示される７連子レジスタのａ残基およびｄ残基を有する化合物１．１．１（ｃ２１ａ）のＸ線結晶構造図を示す。図９Ｃは、三次構造（Ｈ１＝らせん１、Ｈ２＝らせん２、Ｈ３＝らせん３）の７連子繰返しモデルを有する配列の線形アライメントを示し、コア残基は赤色で示され、選択されたＶＥＧＦ－Ａ接触残基は青色で示されている。図９Ａで示されるその構造モデルは、図９Ｃに示すレジスタに基づき、それぞれのらせん１～３内にあるすべての残基をを示すように延長されうることが理解される。簡略化のために、構造の一部分のみを示す。

【図10】図１０Ａ－１０Ｂは、当該化合物の特異的および一般的な７連子繰返しモデルのさらなる描写を提供する。図１０Ａは、三次構造の７連子繰返しモデルを有する例示的化合物１．１．１（ｃ２１ａ）の配列のアライメントを示し、３らせんバンドルのらせん間のコア残基の疎水性接触が矢印で示されている。図１０Ｂは、らせん２およびらせん３によって画定されるｇ－ｇ面（図７Ｂおよび図８Ａ）の溶媒曝露のｃ位置およびｇ位置に位置する、選択されたＶＥＧＦ－Ａ接触残基を含むバリアントモチーフを示し、式中、ｈ＊はヒスチジンまたはその類似体であり、ｆ＊はフェニルアラニンまたはその類似体であり、ｕは非極性アミノ酸残基である。図１０Ｂでは、“＿”は、基礎となるる足場ドメインの位置を示し、破線は、３らせんバンドルのらせん間で可能性のあるコア残基の疎水性接触を示す。

【図11】図１１は、ＶＥＧＦ－Ａ（図示せず）との結合複合体から採取した例示的なＤ－ペプチド性化合物（１．１．１（ｃ２１ａ））のＸ線結晶構造の一部分の拡大スティック図を示す。断片は、位置２６～４５にわたる、らせん２－リンカー２－らせん３の領域の一部に対応する。２０２は、らせん２、２０３は、らせん３を示し、これらはリンカー２によって結合される。位置３２、３５、４１、および４４の疎水性残基は、らせん２－らせん３分子内接触に含まれる。

【図12】図１２は、Ｌ－タンパク質ＧＡドメイン（１ｔｆ０）のＸ線結晶構造の一部の拡張リボン図を示す。この図は、位置３１～４４にわたるらせん２かららせん３領域の一部に対応する。１０２および１０３は、それぞれらせん２（２０２）およびらせん３（２０３）領域に対応する未変性ＧＡドメイン構造のアルファ－らせん領域である。リンカー２は、連結領域である。らせん２－らせん３の間の分子内疎水性接触の一部である、位置３２、３５、４１および４４にある残基が示されており、これは図１２に示すものと類似している。

【図13】図１３は、ＶＥＧＦ－Ａに対する鏡像ファージディスプレイスクリーニングのために無作為化された配列位置（太字）を含む、タンパク質Ｇ（例えば、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）構造１ｔｆ０）のＧＡドメインに基づく、足場ライブラリＳＣＦ３２の構造描写および基礎となる配列（配列番号２）を示す。

【図14】図１４は、当該ＧＡ足場ドメイン（配列番号６－２１）から選んだものと、ＧＡドメインコンセンサス配列（配列番号１）のアライメントを示し（Figure 1 of Johansson et al. (“Structure, Specificity, and Mode of Interaction for Bacterial Albumin-binding Modules”, J. Biol. Chem., Vol. 277, No. 10, pp. 8114-8120, 2002）、これは、当該化合物での足場ドメインとしての使用に適応されうる。

【図15】図１５は、ＧＡ足場ドメイン（配列番号２）と、例示的なＶＥＧＦ－Ａ結合化合物：１（配列番号１０６）、１．１（配列番号２２）、１．１．１（配列番号２３）、および１．１．１（ｃ２１ａ）（配列番号２４）とのアライメントを示す。

【図16】図１６は、例示的化合物１．１．１の融解曲線およびリフォールディング曲線を示す。融解温度を、約５０℃と決定した。

【図17】図１７は、例示的なＤ－ペプチド性化合物（１．１．１（ｃ２１ａ）、スティック表現）とＶＥＧＦ－Ａ（空間出願表示）との間の二量体複合体のＸ線結晶構造図を示す。

【図18】図１８Ａ－１８Ｂは、化合物１．１．１（ｃ２１ａ）に対する切断Ｎ末端を有する例示的化合物（（－）－ＴＩＤＱＷ）の設計を示す。図１８Ａは、例示的なＤ－ペプチド性化合物（１．１．１（ｃ２１ａ）、スティック表現）とＶＥＧＦ－Ａ（空間充填表現）との間の複合体のＸ線結晶構造拡大図を示し、これは、らせん２またはらせん３と接触しないらせん１のＮ末端残基を示す。一部の事例では、選択されたＮ末端残基は、安定性または結合親和性の有意な喪失なしに、らせん１から切断されうる。図１８Ｂは、切断された（－）ＴＩＤＱＷと非切断（＋）－ＴＩＤＱＷ化合物１．１．１（ｃ２１ａ）の構造の並列比較を示す。

【図19】図１９Ａ－１９Ｃは、親和性成熟が実施される、または任意の点変異が組み込まれる化合物中の一連の位置を示す。図１９Ａおよび１９Ｂは、単離された（図１９Ａ）か、またはＸ線結晶構造から取り出されたＶＥＧＦ－Ａと複合体化された（図１９Ｂ）か、いずれかの化合物１．１．１（ｃ２１ａ）の図を示す。図１９Ｃは、化合物１．１．１（ｃ２１ａ）の配列（配列番号２４）を示し、当該変異を注記している。

【図20】図２０は、複合体の結合界面にあるＶＥＧＦ－Ａの結合ポケット内に突出する黄色で示された位置３１にフェニルアラニン（ｆ）残基を有するＶＥＧＦ－Ａ（空間充填表現）と複合体化された、化合物１．１．１（ｃ２１ａ）（スティック表現）のＸ線結晶構造拡大図を示す。

【図21】図２１は、ＶＥＧＦ－Ａ結合界面の結合ポケット内に突出するｆ３１残基側鎖の拡大図を示し、ここで、ＶＥＧＦ－Ａのフェニル環と隣接残基との間の選択距離は、オングストローム単位で示されている。複合体構造の分析は、様々なフェニルアラニン類似体が、位置３１で耐容可能であること、例えば、ＶＥＧＦ－Ａの結合ポケットの利用可能な空間（４．６～５．３オングストローム）を占有できるフェニル環の位置３、４、および／または５に置換基を含む類似体であることを示す。

【図22】図２２は、ＶＥＧＦ－Ａ（空間充填表現）と複合体化された化合物１．１．１（ｃ２１ａ）（スティック表現）のＸ線結晶構造拡大図を示し、選択されたらせん２接点が示されている。２０５および２０７は、それぞれ位置２７および位置３４のヒスチジン残基である。構造は、ヒスチジン３４の窒素原子（ｈ３４；２０７）とＶＥＧＦ－Ａの隣接Ａｓｐ９０との間の弱い水素結合（約４．６オングストローム）を示す。２０９は、ＶＥＧＦ－Ａ表面に向かって突出する３７位の化合物のチロシン残基である。複合体構造の分析は、様々なヒスチジン類似体が、位置２７および位置３４で耐容性があること、例えば、ＶＥＧＦ－Ａの表面上の利用可能空間を占有できる、および／またはＶＥＧＦ－Ａの隣接残基に対するよりも強い水素結合（例えば、４．６オングストローム未満の長さ）を形成できる、置換または非置換のアリール環または複素環を含む類似体に耐容性があることを示している。

【図23】図２３は、ＶＥＧＦ－Ａ（空間充填表現）と複合体化された化合物１．１．１（ｃ２１ａ）（スティック表現）のＸ線結晶構造拡大図を示し、選択されたらせん３接点が示されている。構造は、ヒスチジン４０の窒素原子（ｈ４０、２１０）とＶＥＧＦ－Ａの隣接残基Ｔｙｒ４８との間での中強度の水素結合（２．９オングストローム）を示す。複合体構造の分析は、利用可能空間を占有し、ＶＥＧＦ－Ａへの水素結合を保持または強化することができる類似体を含めて、様々なヒスチジン類似体が位置４０で耐容性があることを示す。

【図24】図２４は、リンカー２の位置３７（２０９）にあるチロシン（ｙ）残基に焦点を合わせた、ＶＥＧＦ－Ａ（シアンのリボン）と複合体化された化合物１．１．１（ｃ２１ａ）（ピンクおよび緑色のスティック表現）のＸ線結晶構造拡大図を示す。ＶＥＧＦ－Ａ表面上で近接して存在するｙ３７酸素と酸素原子または窒素原子との間の距離（例えば、６．５および７．２オングストローム）が示されており、これは、様々なチロシン類似体が、位置３７で耐容性があることを示し、例えば、置換または非置換のアルキル‐アリールまたはアルキル‐ヘテロアリールの伸長側鎖基を含む類似体は、ＶＥＧＦ－Ａの隣接残基とのより近接な接触（例えば、疎水性接触および水素結合）ができる。

【図25】図２５は、ＶＥＧＦ－Ａ（空間充填表現）と複合体化された化合物１．１．１（ｃ２１ａ）（スティック表現）のＸ線結晶構造拡大図を示し、位置２７（２０５）にあるヒスチジン残基（ｈ）に焦点を当てている。構造の分析は、様々な芳香族残基またはヒスチジン類似体が、ＶＥＧＦ－Ａの表面上の同じポケットに接触させるために、一部の事例では、望ましい疎水性接触を増加させるために、位置２７で利用されうることを示す。また、［リンカー１］領域の位置２５（ｅ２５、２１１）にあるグルタミン酸残基も示されており、これはＶＥＧＦ－Ａのペプチド骨格の主鎖カルボニル基への水素結合（２．５オングストローム）を含めて、ＶＥＧＦ－Ａと接触する。

【図26】図２６は、Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａ結合剤のファージディスプレイ鏡像スクリーニング中に同定されたすべてのクローンの選択された位置の配列ロゴを示し、ここで、配列ロゴは、化合物１配列および未変性ＧＡドメイン（ＧＡ－ｗｔ）の対応する残基と比較して整列されている。

【図27】図２７Ａ－２７Ｂは、Ｌ－タンパク質ＧＡドメイン（図２７Ａ）およびＤ－化合物１．１．１（ｃ２１ａ）（図２７Ｂ）の構造の比較を示し、ＶＥＧＦ－Ａ結合化合物において、らせん２と３の間のアライメント角度が増大することを示す。

【図28】図２８Ａ－２８Ｂは、ＶＥＧＦ－Ａホモ二量体に結合したＤ－ペプチド性化合物１１０５５のＸ線結晶構造の二つの描写を示す。図２８Ａは、Ｄ－ペプチド性化合物１１０５５が、主に化合物１１０５５のバリアントＧＡドメインのらせん２（Ｈ２）の結合接触を介してＶＥＧＦ－Ａに結合することを示す。図２８Ｂは、図２８Ａの構造を示し、ここで、Ｄ－ペプチド性化合物１１０５５は、ＶＥＧＦ－Ａに結合したＶＥＧＦＲ２の構造（ドメイン２およびドメイン３）でオーバーレイされた空間充填モデルで表現されている。オーバーレイは、Ｄ－ペプチド性化合物１１０５５が、ＶＥＧＦＲ２のドメイン２（Ｄ２）のＶＥＧＦ－Ａへの結合を阻害することを示す。

【図29】図２９Ａ－２９Ｂは、化合物１１０５５のバリアントＧＡドメインの折り畳みを安定化させる特定の位置で、残基のスクリーニングおよび同定をするように設計された親和性成熟ライブラリの構造（図２９Ａ）および配列（図２９Ｂ）の描写を示す。らせん１（Ｈ１）と、らせん２（Ｈ２）とらせん３（Ｈ３）を接続するループとの間の充填界面での変異について、合計７個の残基が選択された。

【図30-1】図３０Ａ－３０Ｃは、高親和性ＶＥＧＦ－Ａ結合化合物のスクリーニング結果を示し、この化合物は、７位および３８位にあるシステイン残基（図３０Ａ）および選択された当該バリアント配列（図３０Ｂ）（配列番号１０８～１１３）を有するコンセンサス配列ロゴを含み、ＶＥＧＦ－Ａと親化合物１１０５５を対比してのそれらの結合親和性が示されている。図３０Ｃは、親化合物１１０５５（図２９Ａ）の構造の拡大図を示し、同定されたバリアントアミノ酸残基位置ｌ７ｃおよびｖ３８ｃが黄色で示され、互いに近接していること（ベータＣからベータＣへのらせん間距離は５．９オングストローム）、それにより、ｌ７ｃおよびｖ３８ｃの変異が含まれることで、それらの残基間での安定化したジスルフィド結合が形成されるようになることが示されている。

【図30-2】同上。

【図31】図３１Ａ－３１Ｂは、ＶＥＧＦ－Ａ Ｄ－ペプチドの活性を示すデータのグラフを示す。図３１Ａは、ＶＥＧＦＲ１結合ＥＬＩＳＡ中の選択された化合物のＶＥＧＦ－Ａ拮抗活性を示す。図３１Ｂは、ベバシズマブ対照と比較した、選択された化合物によるＶＥＧＦシグナル伝達に応答しての細胞増殖の阻害を示す。

【図32】図３２Ａ－３２Ｂは、親Ｚドメイン足場に基づくファージディスプレイライブラリの、構造（図３２Ａ）および配列（図３２Ｂ）の描写を示す。１０個の位置（Ｘ）を、システインを除くすべてのアミノ酸を表現するトリヌクレオチドコドンを伴うクンケル変異誘発を使用した無作為化のために、Ｚドメインのらせん１～らせん２内で選択した（図３２Ｂ）。

【図33】図３３Ａ－３３Ｂは、Ｚドメインファージディスプレイライブラリを使用したＶＥＧＦ－Ａへの結合についての、鏡像ファージディスプレイスクリーニングの結果を示す。図３３Ａは、ＶＥＧＦ－Ａへの結合を提供するコンセンサス配列ロゴを示す。図３３Ｂは、選択された当該バリアントＺドメイン配列（配列番号１１４～１１８）を、未変性Ｌ－ＶＥＧＦ－Ａに対するそれらの結合親和性と共に示す。ＮＢは非結合を意味する。

【図34】図３４は、化合物９７８３３６および１１０５５の相加的結合を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示し、化合物９７８３３６（バリアントＺドメイン化合物）が、化合物１１０５５（バリアントＧＡドメイン化合物）の結合部位と重複せずに独立している、ＶＥＧＦ－Ａ上の結合部位に結合することを示す。

【図35-1】図３５Ａ－３５Ｇは、ＶＥＧＦ－Ａホモ二量体に結合したＤ－ペプチド性化合物９７８３３６のＸ線結晶構造の三つの描写を示す。図３５Ａは、ＶＥＧＦ－Ａのそれらの結合部位に結合した二つの単量体Ｄ－ペプチド性化合物９７８３３６を示す。図３５Ｂは、図３５Ａの構造を示し、ここで、Ｄ－ペプチド性化合物９７８３３６は、ＶＥＧＦ－Ａに結合されたＶＥＧＦＲ２の構造（ドメイン２および３）でオーバーレイされた空間充填モデルで表現されている。オーバーレイは、Ｄ－ペプチド性化合物９７８３３６が、ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ－Ａに対するドメイン３（Ｄ３）の結合を阻害することを示す。図３５Ｃは、赤色で示されたＺドメインライブラリから選択されるバリアントアミノ酸残基を有する化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合面を見た、分離した状態での９７８３３６の構造を示す。図３５Ｄは、結合部位（上パネル）と接触するバリアントアミノ酸の構成を含む、化合物９７８３３６（配列番号１１７）のタンパク質間接触（上パネル）およびＶＥＧＦ－Ａ上の結合部位（下パネル）の拡大図を示す。図３５Ｅ－３５Ｇは、同定されたコンセンサス配列（配列番号１５８）である、例示的ＶＥＧＦ－Ａ結合化合物９７８３３６（配列番号１１７）の親和性成熟研究（図３５Ｆ）、および例示的化合物９８０１８１（配列番号１１９）の配列を示す。

【図35-2】同上。

【図35-3】同上。

【図35-4】同上。

【図35-5】同上。

【図36】図３６Ａ－３６Ｂは、ビス－マレイミドＰＥＧ８リンカー（図３６Ａ）を使用して、Ｎ末端システイン残基を介して共役結合された化合物１１０５５および９７８３３６を含む、例示的二価化合物共役の構造ベースの設計を示す。図３６Ｂは、ＳＰＲによって測定されるＬ－ＶＥＧＦ－Ａについて１．７ｎＭの結合親和性を示したビスマレイミドＰＥＧ８二官能基との共役を介したＮ末端からＮ末端への連結を含む、二価化合物９７９１１１の配列を示す。

【図37】図３７Ａ－３７Ｂは、親ＧＡドメイン足場（配列番号２）に基づく、ファージディスプレイライブラリ（配列番号１５９）の構造（図３７Ａ）および配列（図３７Ｂ）の描写を示す。１１個の位置（Ｘ）を、システインを除くすべてのアミノ酸を表現するトリヌクレオチドコドンを用いたクンケル変異誘発を使用した無作為化のために、ＧＡドメイン足場のらせん２～らせん３内で選択した。

【図38-1】図３８Ａ－３８Ｅは、例示的二量体二価（すなわち、テトラドメイン含有）化合物９８０８７０および９８０８７１の設計、合成および配列を示す。図３８Ａは、ＶＥＧＦ－Ａに結合された例示的化合物１１０５５および９７８３３６のＸ線結晶構造、ならびに例示的二量体二価のＶＥＧＦ－Ａ結合化合物を生成するためのリンカーの設計の描写を示す。化合物１１０５５の残基ｋ１９および化合物９７８３３６の残基ｋ７は、例えば、長さ約２３オングストローム以上のリンカーを介して、それらの側鎖アミノ基を介して結合することができる。図３８Ｂは、連結されたテトラドメイン化合物９８０８７０および９８０８７１を調製する際に使用するための合成スキームを示す。Ｄ－Ｐｒａは、－ＮＨ－ＰＥＧ２－ＣＯ－リンカーを介して化合物９８０１８１のｋ７のアミン側鎖に連結されたＤ－プロパルギルグリシン残基である。アジド－ＣＨ_２ＣＯＮＨ－ＰＥＧ２／３－ＣＯ－基は、化合物９７９１１０のｋ１９のアミン側鎖に連結され、その後、クリックケミストリーを使用してプロパルギル基に共役結合されてドメイン間リンカーを形成する。図３８Ｃは、図３８Ｂのスキームを介して調製された例示的テトラドメイン化合物の配列の描写を示す。図３８Ｄは、ＧＡドメインの残基ｘ１９とＺドメインの残基ｘ７との間にリンカーＬ^１を含む例示的な二価化合物の概略図である。図３８Ｅは、ＧＡドメインとＺドメインのＣ末端残基の間にある第二のリンカーＬ^２を含む、例示的な二量体二価化合物の概略図である。

【図38-2】同上。

【図38-3】同上。

【図38-4】同上。

【図38-5】同上。

【図38-6】同上。

【図39】図３９Ａ－３９Ｂは、一価ドメイン９７９１１０および９８０１８１およびベバシズマブと比較した、例示的な二量体二価（すなわち、テトラドメイン含有）化合物のＶＥＧＦ－Ａに対する、インビトロ（図３９Ａ）および細胞ベース（図３９Ｂ）での拮抗活性を測定するアッセイの結果のグラフを示す。

【図40】図４０Ａ－４０Ｃは、鏡像ファージディスプレイを使用して開発されたＤ－タンパク質ＶＥＧＦ－Ａ拮抗薬の活性データを示す。（図４０Ａ）滴定可能な結合を示すＤ－ＶＥＧＦ－Ａ標的に対する、ＧＡドメインおよびＺドメインのヒットのファージ滴定ＥＬＩＳＡ。（図４０Ｂ）Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａへのファージ結合を置換するための可溶性競合体としてＧＡドメインヒットに対応する合成Ｌ－エナンチオマーを使用したファージ競合ＥＬＩＳＡ。（図４０Ｃ） ベバシズマブに対する拮抗活性を示すＶＥＧＦ－Ａ遮断ＥＬＩＳＡにおける合成Ｄタンパク質ＲＦＸ－１１０５５およびＲＦＸ－９７８３３６の滴定。

【図41】図４１Ａ－４１Ｆは、ＶＥＧＦ－Ａと複合体化されたＤタンパク質ＲＦＸ－１１０５５およびＲＦＸ－９７８３３６の構造を示す。（図４１Ａおよび４１Ｂ）ＶＥＧＦ－Ａホモ二量体（灰色）の遠位端で別個の重複しないエピトープに結合した、ＲＦＸ－１１０５５（紫色）およびＲＦＸ－９７８３３６（青色）の概観。（図４１Ｃおよび４１Ｄ）ＲＦＸ－１１０５５およびＲＦＸ－９７８３３６について、選択されたライブラリ残基（オレンジ）と、ＲＦＸ－１１０５５についてはらせん２およびらせん３内に、ＲＦＸ－９７８３３６についてはらせん１およびらせん２内にあるオリジナルの足場残基（青）と共に描写された、ＶＥＧＦ－Ａと接触する界面Ｄ－アミノ酸側鎖。ＶＥＧＦ－Ａは、静電表面電位と共に示され、プラス（青色）、マイナス（赤色）、および無極疎水性（白色）の接点部位を強調している。（図４１Ｅ）ＶＥＧＦＲ－１受容体（薄いオレンジ色）と複合体化されたＶＥＧＦ－Ａ（グレー）のこれまでに報告されている結晶構造。ＶＥＧＦＲ－１のＩｇドメイン２および３（Ｄ２およびＤ３）は、ＶＥＧＦ－Ａ（ＰＤＢコード：５Ｔ８９）の受容体係合における分子相互作用を強調するために分離されている（２４）。（図４１Ｆ） ＶＥＧＦ－Ａ阻害の機序としてのＤ２およびＤ３との直接的な競合を示すための、ＶＥＧＦ－Ａ／ＶＥＧＦＲ－１複合体上のＲＦＸ－１１０５５およびＲＦＸ－９７８３３６のオーバーレイ。

【図42】図４２Ａ－４２Ｃは、ＲＦＸ－１１０５５およびＲＦＸ－９７８３３６についての、構造情報に基づく親和性成熟を示す。（図４２Ａ）らせん１とらせん２－３結合界面との間の充填を安定化させる、親和性成熟ライブラリの標的である７つの残基（オレンジ）を示す、ＶＥＧＦ－Ａ（灰色）に結合したＲＦＸ－１１０５５（紫色）の構造。（図４２Ｂ）らせん１－２結合界面、および ソフト無作為化ライブラリ用に選択された４つの残基を示す、ＶＥＧＦ－Ａ（灰色）に結合したＲＦＸ－９７８３３６（青色）の構造。（図４２Ｃ） ベバシズマブに対する拮抗活性を示すＶＥＧＦ遮断ＥＬＩＳＡにおける親和性成熟Ｄタンパク質ＲＦＸ－９７９１１０およびＲＦＸ－９８０１８１の滴定。

【図43】図４３Ａ－４３Ｂは、Ｄタンパク質ヘテロ二量体ＶＥＧＦ－Ａ拮抗薬のインビトロ活性を示す。（図４３Ａ）ベバシズマブおよびＶＥＧＦＲ１－Ｆｃ可溶性デコイ受容体と比較した、ＶＥＧＦ－Ａ遮断ＥＬＩＳＡにおける親和性成熟Ｄタンパク質ＲＦＸ－９７９１１０および高親和性ヘテロ二量体ＲＦＸ－９８０８６９の滴定。（図４３Ｂ）ＲＦＸ－９８０８６９がＶＥＧＦＲ２を介してＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達を強力に遮断し、ベバシズマブと同等の効力を有することを示す、細胞活性アッセイ。

【図44】図４４Ａ－４４Ｂは、滲出型ＡＭＤのウサギ眼モデルにおけるＤタンパク質ＲＦＸ－９８０８６９のインビボ活性を示す。（図４４Ａ）それぞれの薬剤について投与後５日目および２６日目におけるＶＥＧＦ－Ａ１６５誘導性血管漏出の程度を示す、代表的な蛍光眼底血管造影（ＦＡ）画像（対照＝薬物治療なし）。（図４４Ｂ）５日目および２６日目の個々のＦＡスコアのプロット。スコア付けは、０＝主要血管は直線で、小血管にいくらかの屈曲を伴い、拡張はない、１＝主要血管の屈曲と拡張が増える、２＝主要血管間に漏出があり、有意な拡張がある、３＝主要血管と小血管の間に漏出があり、小血管は依然として目に見える、４＝主要血管と軽微の間に漏出があり、小血管が見えにくいか、または全く見えない。Ｎ＝１群当たりウサギ５匹（１０眼）。すべてのデータを、平均±ＳＥＭとしてプロット。（＊＊＊＊ ｐ ＜ ０．０００１、マン・ホイットニー検定）

【図45】図４５Ａ－４５Ｄは、ＲＦＸ－９８０８６９の腫瘍成長阻害活性および免疫原性の欠如を示す。（図４５Ａ）ＲＦＸ－９８０８６９およびニボルマブの両方の用量依存的有効性を示す、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおけるＭＣ３８腫瘍成長曲線。Ｎ＝６マウス／群。（図４５Ｂ）１５日目の腫瘍体積（＊ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定）（図４５Ｃ）抗原特異的血清ＩｇＧ用のＥＬＩＳＡを使用して、２２日目の血清サンプルで測定されたＭＣ３８腫瘍試験からの抗薬剤抗体。（図４５Ｄ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける対応する薬剤の皮下免疫化後４２日目の血清から測定された抗薬剤抗体力価。Ｎ＝５マウス／群。すべてのデータは、平均±ＳＥＭとしてプロットされる。

【図46】図４６Ａ－４６Ｃは、Ｄタンパク質のファージディスプレイライブラリおよび配列を示す。（図４６Ａ）パンニングに使用されるＧＡドメイン足場配列およびライブラリ。ＧＡライブラリ中の下線付きの残基を、完全なアミノ酸多様性についてＮＮＫコドンでハード無作為化した。ＡＭライブラリ中の下線付きの残基を、システインを含む１５アミノ酸多様性についてＮＮＣコドンを使用してハード無作為化した。ＲＦＸ－１１０５５およびＲＦＸ－９７９１１０の小文字のアミノ酸は、Ｄ－アミノ酸を示す。上から下への配列：（配列番号２、配列番号１０８、配列番号１０８、配列番号１０８、配列番号１１３）（図４６Ｂ）パンニングに使用されるＺドメイン足場の配列およびライブラリ。ＧＡライブラリ中の下線残基を、システインを除いて、各アミノ酸のためのトリヌクレオチドコドンを使用して、全アミノ酸多様性についてハード無作為化した。ＡＭライブラリ中の下線付きの残基を、コドンを使用してソフト無作為化し、各アミノ酸で３０％の変異率を組み入れた。ＲＦＸ－９７８３３６およびＲＦＸ－９８０１８１の小文字のアミノ酸は、Ｄ－アミノ酸を示す。上から下への配列：配列番号１６３、配列番号１１７、配列番号１１７、配列番号１１７、配列番号１１９）。（図４６Ｃ）ヘテロ二量体拮抗薬９８０８６９のための全Ｄ－アミノ酸配列。

【図47-1】図４７は、Ｄタンパク質およびベバシズマブについて測定された動的結合パラメータのＳＰＲセンサーグラムを示す。

【図47-2】同上。

【図47-3】同上。

【図48】図４８は、ＲＦＸ－９７８３３６およびＲＦＸ－１１０５５のＳＰＲベースのエピトープマッピングを示す。第一の会合ステップでは、５μＭのＲＦＸ－９７８３３６を使用して、チップ表面上のＶＥＧＦ－Ａを飽和させる。第二の会合ステップでは、１μＭのＲＦＸ－１１０５５が、５μＭのＲＦＸ－９７８３３６と共に含まれ、ＶＥＧＦ－Ａへの相加的結合を示し、ＲＦＸ－１１０５５の部位がＲＦＸ－９７８３３６によって遮断されていないことを示している。どちらのＤタンパク質も、ＶＥＧＦ－Ａからの完全な解離を示す。

【図49】図４９Ａ－４９Ｂは、ＶＥＧＦ－Ａ／ＶＥＧＦＲ－１接点の構造特性を示す。（図４９Ａ）ＶＥＧＦＲ－１（淡いオレンジ色）と複合体化されたＶＥＧＦ－Ａ（灰色）について解決された以前の構造で、要素（白色は炭素、赤色は酸素、青色は窒素、および黄色は硫黄）によって着色されたＶＥＧＦＲ－１のＤ２およびＤ３ Ｉｇドメインが接触したＶＥＧＦ－Ａ上のエピトープを示す（ＰＤＢ ＩＤ：５Ｔ８９、２４）。（図４９Ｂ）Ｄ２ドメインとＤ３ドメインが、ＶＥＧＦ－Ａから１８０度離れて回転し、静電表面電位が両方の分子に対して示されている、（図４９Ａ）の明白な表現。Ｄ２およびＤ３結合部位は丸で囲まれ、Ｄ２相互作用の優勢な非極性疎水性性質およびＤ３相互作用の極性親水性性質を強調している。

【図50-1】図５０Ａ－５０Ｂは、ヘテロ二量体Ｄタンパク質ＲＦＸ－９８０８６９の設計および合成を示す。（図５０Ａ）ＶＥＧＦ－Ａ（灰色）に結合したＲＦＸ－１１０５５（紫色）およびＲＦＸ－９７８３３６（青色）の構造オーバーレイで、提案されたＰＥＧ連結の距離測定値を伴う球体表現でのリジン残基（ＲＦＸ－１１０５５上のＫ１９およびＲＦＸ－９７８３３６上のＫ７）を示す。（図５０Ｂ）ペプチドと「クリック」ケミストリー官能基を備えたＰＥＧ部分とを用いた固相ペプチド合成を使用して、Ｄ－タンパク質ヘテロ二量体、ＲＦＸ－９８０８６９を生成するための合成スキーム。

【図50-2】同上。

【図51】図５１は、Ｄタンパク質およびベバシズマブに対するＳＰＲ由来動的結合パラメータの概要を記載した表を示す。

【図52】図５２は、非平衡ＥＬＩＳＡにおけるＶＥＧＦ－Ａ１２１のＶＥＧＦＲ１－Ｆｃへの結合を阻害するＤタンパク質およびベバシズマブのＩＣ５０値の概要を記載した表を示す。

【図53】図５３は、ＶＥＧＦ／Ｄタンパク質複合体についてのデータ収集および精密統計を記載した表を示す。

【図54】図５４は、細胞シグナル伝達アッセイにおける平衡結合ＥＬＩＳＡへ、およびＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達阻害におけるＶＥＧＦＲ１－ＦｃへのＶＥＧＦ－１２１Ａ結合を遮断するＤタンパク質およびベバシズマブのＩＣ５０値の概要を記載した表を示す。

【図55】図５５は、Ｄ－ペプチド性ＺドメインのＶＥＧＦ－Ａ結合剤についてファージディスプレイ鏡像スクリーニング中に同定されたすべてのクローンの選択された位置の配列ロゴを示し、ここで配列ロゴは、未変性Ｚドメイン（Ｚ－ｗｔ）の対応する残基と比較して整列される。

【発明を実施するための形態】

【0008】

多価Ｄ－ペプチド結合化合物
上述のように、本開示の態様は、ＶＥＧＦと高い親和性で特異的に結合する多価Ｄ－ペプチド性化合物を含む。本開示は、標的タンパク質上の二つ以上の別個の結合部位でＶＥＧＦ標的タンパク質に特異的に結合する能力を有する、多価化合物の類を提供する。「多価」という用語は、標的タンパク質分子の二つ以上の別個かつ明確な部位で発生しうる、化合物と標的タンパク質との間の相互作用を指す。多価Ｄ－ペプチド性化合物には、標的タンパク質に対して高親和性の結合剤を、および標的タンパク質の機能に対して強力な生物学的効果を、提供するために連動して発生しうる複数の結合相互作用の能力がある。「多量体」という用語は、二つ（すなわち、二量体）、三つ（すなわち、三量体）、またはそれ以上の単量体性ペプチド単位（例えば、ドメイン）を含む化合物を指す。多量体化合物が相同であるとき、各ペプチド単位は、同じ結合特性を有することができ、すなわち、各単量体単位は、ＶＥＧＦ標的タンパク質分子上の同じ結合部位に結合することができる。こうした多量体化合物は、ホモ二量体として自然発生する、または多量体化が可能な標的タンパク質の結合での用途を見出しうる。二量体化合物は、ＶＥＧＦ標的タンパク質ホモ二量体の二つの分子上にある二つの同一の結合部位に同時に結合することができる。一部の実例では、標的タンパク質に応じて、本開示の多価Ｄ－ペプチド性化合物は、多量体化されてもよく、例えば、二量体二価Ｄ－ペプチド性化合物は、二つの二価Ｄ－ペプチド性化合物の二量体を含みうる。特定の事例では、多量体化合物は異種であり、各ペプチド単位（例えば、ドメイン単位または二価単位）は、異なる標的部位またはタンパク質に特異的に結合する。

【0009】

多価ペプチド性化合物は、少なくとも二つのペプチド性ドメインを含み、各ドメインは、結合部位で特異的タンパク質間相互作用の界面を提供するように構成されたバリアントアミノ酸から構成される特異性決定モチーフを有する。複数のペプチド性ドメインが互いに連結されている場合、それらは同時に標的タンパク質と接触し、複数の結合部位で複数の界面を提供することができる。複数のタンパク質－タンパク質結合相互作用は、任意の一つのＤ－ペプチド性ドメインのみについて達成することが可能であるよりも、有意に高い有効な親和性をもたらすために、アビディティ効果を介して連動的に発生しうる。本開示は、複数の標的結合部位を結合する複数のペプチド性ドメインを産生するために、足場小タンパク質ドメインライブラリを使用した、鏡像ファージディスプレイスクリーニングの使用を開示しており、しかもそのようなドメインは、強いアビディティ効果を示す高親和性の結合剤を産生するのにうまく連結することができる。本発明者らによって実証された多量体化合物は、対応する抗体剤と同等またはそれよりも良好な親和性を有し、インビボでのＶＥＧＦ標的タンパク質に対する有効な生物活性を提供する。

【0010】

概して、ＶＥＧＦ標的タンパク質は天然起源のＬタンパク質であり、化合物はＤ－ペプチド性化合物である。本明細書に記載されるＤ－ペプチド性化合物のいずれについても、Ｄ－ＶＥＧＦ標的タンパク質に特異的に結合するＬ－ペプチド性化合物バージョンも本開示に含まれることが理解される。当該ペプチド性化合物を、合成Ｄ－ＶＥＧＦ標的タンパク質に結合するための様々な足場ドメインファージディスプレイライブラリの鏡像スクリーニングの方法を使用して部分的に同定した。

【0011】

Ｄ－ペプチド性化合物は、タンパク質分解安定性、免疫原性実質的な低下、およびインビボでの長い半減期など、対応するＬ－ポリペプチドと比較して、治療用途に対して多くの望ましい特性を提供することができる。本開示のＤ－ペプチド性化合物は、ＶＥＧＦに対する抗体剤と比較して、概してサイズは有意に小さい。一部の事例では、当該化合物のより小さなサイズおよび特性は、投与経路、組織分布および組織浸透、ならびに抗体系治療剤よりも優れた投与計画を提供する。

【0012】

本開示は、少なくとも第一および第二のＤ－ペプチド性ドメインを含む多価Ｄ－ペプチド性化合物を提供する。第一および第二のＤ－ペプチド性ドメインは、標的タンパク質の明確な非重複結合部位に特異的に結合することができ、連結成分を介して（例えば、本明細書に記載されるように）互いに連結することができる。連結成分は、標的タンパク質への同時結合または連続結合を可能にするように構成されうる。「連続結合」は、第一のＤ－ペプチド性ドメインの標的への結合は、たとえ結合が同時に起こらないとしても、第二のＤ－ペプチド性ドメインによる結合が生じる可能性を増加させることができることを意味する。

【0013】

第一および第二のＤ－ペプチド性ドメインは、互いに異種、すなわち、ドメインが異なるドメインタイプであってもよい。例えば、第一のＤ－ペプチド性ドメインがバリアントＧＡドメインで、第二のＤ－ペプチド性ドメインがバリアントＺドメインであってもよく、またはその逆であってもよい。二つの異なる足場ドメインライブラリを使用したＶＥＧＦの鏡像ファージディスプレイスクリーニングは、ＶＥＧＦ上の二つの異なる結合部位に向けられたバリアントドメイン結合剤を提供する。

【0014】

多価Ｄ－ペプチド性化合物が二つのそのようなドメインのみを含む場合、二価と呼んでもよい。三価、四価、およびより高い多価性も可能である。三価Ｄ－ペプチド性化合物は、二つの連結成分を介して直線状に、または単一の三価連結成分を介して、連結された三つのＤ－ペプチド性ドメインを含みうる。三価Ｄ－ペプチド性化合物は、各Ｄ－ペプチド性化合物上の二つのシステイン残基間のジスルフィド結合を介して接続された二つの同じ同じＤ－ペプチド性化合物と、ジスルフィドと結合したＤ－ペプチド性化合物の一つと、第三のＤ－ペプチド性化合物との間の連結成分とを含みうる。四価以上の多価化合物は同様に、二価連結成分を介して直線状に、または一つ以上の多価連結成分または分岐連結成分を介して分岐構成で、連結することができる。
連結成分

【0015】

「連結成分」という用語は、当該化合物の二つ以上のＤ－ペプチド性ドメイン間で共有結合を確立することができる多価部分を網羅することを意味する。時には、連結成分は二価である。あるいは、連結成分は、三価または樹状である。連結成分は、Ｄ－ペプチド性ドメインポリペプチドの合成中、または合成後に、例えば、既に折り畳まれている二つ以上のＤ－ペプチド性ドメインの共役を介して、導入されてもよい。連結成分は、二機能性リンカーを使用した二つのＤ－ペプチド性ドメインの共役を介して、当該化合物内に導入されてもよい。また、連結成分は、Ｄ－ペプチド性ドメインポリペプチドの合成中に組み込まれうるように設計されてもよく、例えば、ここで連結成分はそれ自体がペプチド性であり、アミノ酸残基の配列の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を介して調製される。さらに、化学選択官能基および／またはリンカーは、ポリペプチド合成中に導入されて、ＳＰＰＳ後のＤ－ペプチド性ドメインの簡易共役を提供しうる。

【0016】

任意の好都合な連結基またはリンカーは、当該多価化合物における連結成分として使用するために適応されうる。当該連結基およびリンカー単位は、限定されないが、アミノ酸残基、ポリペプチド、ＰＥＧユニット、（ＰＥＧ）ｎリンカー（例えば、ここで、ｎは２～５０であり、２～４０、２～３０、２～２０または２～１０など）、末端修飾ＰＥＧ（例えば、－ＮＨ（ＣＨ_２）_ｍＯ［（ＣＨ_２）_２Ｏ］_ｎ（ＣＨ_２）_ｐＣＯ－、または－ＮＨ（ＣＨ_２）_ｍＯ［（ＣＨ_２）_２Ｏ］_ｎ（ＣＨ_２）_ｍＮＨ－、または－ＣＯ（ＣＨ_２）_ｐＯ［（ＣＨ_２）_２Ｏ］_ｎ（ＣＨ_２）_ｐＣＯ－連結基、式中、ｍは２～６であり、ｐは１～６であり、ｎは１～５０であり、１～２０、１～１２または１～６など）、Ｃ１－Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１－Ｃ６アルキルリンカー、Ｃ２－Ｃ１２アルキルまたは置換Ｃ２－Ｃ１２アルキルリンカー、スクシニル（例えば、－ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ－）単位、ジアミノエチレン単位（例えば、－ＮＲＣＨ_２ＣＨ_２ＮＲ－、式中、ＲはＨ、アルキルまたは置換アルキル）、－ＣＯ（ＣＨ_２）_ｍＣＯ－、－ＮＲ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ－、－ＣＯ（ＣＨ_２）_ｍＮＲ－、－ＣＯ（ＣＨ_２）_ｍＯ－、－ＣＯ（ＣＨ_２）_ｍＳ－（式中、ｍは１～６であり、ｐは２～６であり、各Ｒは独立的にＨ、Ｃ（１－６）アルキルまたは置換Ｃ（１－６）アルキル）、およびそれらの組み合わせであって、例えば、アミド（例えば、ＲがＣ１－Ｃ６アルキルである－ＣＯＮＨ－または－ＣＯＮＲ－）、スルホンアミド、カルバメート、カルボニル（－ＣＯ－）、エーテル、チオエーテル、エステル、チオエステル、アミノ（－ＮＨ－）などの結合官能基を介して結合されるものを含む。連結成分は、ペプチドであってもよく、例えば、アミノ酸残基の配列を含むリンカーであってもよい。連結成分は、式－（Ｌ^１）_ａ－（Ｌ^２）_ｂ－（Ｌ^３）_ｃ－（Ｌ^４）_ｄ－（Ｌ^５）_ｅ－のリンカーであってもよく、式中、Ｌ^１～Ｌ^５はそれぞれ独立的にリンカー単位であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅはそれぞれ独立的に０または１であり、またａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅの総和は１～５である。本明細書に記載される多量体化合物に示されるように、他のリンカーも可能である。

【0017】

連結成分は、任意の好都合な連結ケミストリーを使用してＤ－ペプチド性化合物に接続される末端修飾ＰＥＧリンカーを含みうる。ＰＥＧはポリエチレングリコールである。「末端修飾ＰＥＧ」という用語は、例えば、別の結合基部分、またはペプチド性化合物の末端もしくは側鎖への共役に適した化学選択官能基を含むように、末端の一方または両方が修飾された、任意の好都合な長さのポリエチレングリコールを指す。実施例のセクションには、Ｄ－ペプチド性ドメインの配列中に導入されたシステイン残基など、チオール基に化学選択的に共役結合するための、末端マレイミド官能基を有するいくつかの例示的な末端修飾ＰＥＧ二機能性リンカーの使用について記載している。Ｄ－ペプチド性化合物は、システインまたはリジンなどの多価連結基に接続するための特定の連結または連結ケミストリーを提供できる一つ以上の追加的なアミノ酸残基を含めるために、ＧＡドメインモチーフのＮ末端および／またはＣ末端で修飾されうる。

【0018】

連結基を介して当該ペプチド性化合物を連結する際に利用されうる化学選択的反応性官能基は、限定されないが、アミノ基（例えば、Ｎ末端アミノ基またはリジン側鎖基）、アジド基、アルキニル基、ホスフィン基、チオール（例えば、システイン残基）、Ｃ末端チオエステル、アリールアジド、マレイミド、カルボジイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ヒドラジド、ＰＦＰ－エステル、ヒドロキシメチルホスフィン、ソラレン、イミドエステル、ピリジルジスルフィド、イソシアン酸塩、アミノオキシ－、アルデヒド、ケト、クロロアセチル、ブロモアセチル、およびビニルスルホンを含む。

【0019】

任意の好都合な多価リンカーが、当該多量体に利用されうる。多価とは、リンカーが、本明細書に記載されるように、当該化合物の構成要素、例えばペプチド性ドメインへの付着に適した、二つ以上の末端基または側鎖基を含むことを意味する。一部の事例では、多価リンカーは二価または三価である。一部の実例では、多価リンカーはデンドリマー足場である。任意の好都合なデンドリマー足場が、当該多量体で使用するために適合されうる。デンドリマー足場は、少なくとも一つの分岐点と、オプションのリンカーを介してドメインのＮ末端またはＣ末端に接続するために適切な二つ以上の末端とを含む分岐分子である。デンドリマー足場は、二つ以上のドメインの望ましい空間配置を提供するように選択されてもよい。一部の事例では、二つ以上のドメインの空間配置は、ＶＥＧＦ標的タンパク質に対する望ましい結合親和性およびアビディティを提供するように選択される。

【0020】

一部の事例では、多価リンカー基は、第二のペプチド性ドメイン上の適合する官能基に共役結合することができる化学選択的反応性官能基に由来するか、それを含む。特定の事例では、多価リンカー基は、多価結合部分（例えば、ストレプトアビジンまたは抗体）に特異的に結合することができる特異的結合部分（例えば、ビオチンまたはペプチドタグ）である。特定の事例では、多価リンカー基は、第二の化合物の第二の特異的結合部分とホモ二量体またはヘテロ二量体を直接的に形成することができる特異的結合部分である。したがって、一部の事例では、化合物が多価リンカー基を含む当該分子を含む場合、化合物は多量体の一部であってもよい。あるいは、化合物は、一つ以上の他の化合物で直接的に、または多価結合部分への結合を介して間接的に、のいずれかで多量体化することができる単量体であってもよい。

【0021】

例示的な多価Ｄ－ペプチド性化合物
本開示は、ＶＥＧＦ－Ａを結合する多価化合物を提供する。多価ＶＥＧＦ－Ａ結合化合物は、二価であってもよく、連結成分を介して連結される二つの明確なバリアントドメインを含む（例えば、本明細書に記載されるように）。標的タンパク質上の二つの異なる結合部位のうちの一つに結合する、ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合する例示的な単一のＤ－ペプチド性ドメインが、本明細書に開示されている。図３６Ａは、標的ＶＥＧＦ－Ａに同時に結合するこのような二つの単一ドメインの結晶構造を示す。ＶＥＧＦ－Ａの第一の結合部位で結合する、ＶＥＧＦ－Ａ特異的バリアントＧＡドメインポリペプチドが本明細書に記載されている。一部の事例では、第一の結合部位は、ＶＥＧＦ－Ａのアミノ酸側鎖Ｆ４３、Ｍ４４、Ｙ４７、Ｙ５１、Ｎ８８、Ｄ８９、Ｌ９２、Ｉ７２、Ｋ７４、Ｍ１０７、Ｉ１０９、Ｑ１１５およびＩ１１７によって定義される。一部の事例では、ＶＥＧＦ－Ａ特異的ポリペプチドは、ロックされたバリアントＧＡドメインである（例えば、本明細書に記載されるように）。当該ＶＥＧＦ－Ａ特異的Ｄ－ペプチドバリアントＧＡドメインポリペプチドのいずれも、連結成分を介して、標的ＶＥＧＦ－Ａの第二かつ明確な結合部位に特異的に結合する第二のＤ－ペプチド性ドメインに接続することができる。一部の事例では、第二の結合部位は、ＶＥＧＦ－Ａのアミノ酸側鎖Ｅ９０、Ｆ６２、Ｄ６７、Ｉ６９、Ｅ７０、Ｋ１１０、Ｐ１１１、Ｈ１１２およびＱ１１３によって定義される。例示的ＧＡドメインポリペプチド、化合物１１０５５とは異なる部位で結合する、例示的Ｚドメインポリペプチドを示す図３６Ａを参照。拮抗活性をもたらすために、標的結合部位の少なくとも一方または両方が、ＶＥＧＦ－Ａ標的タンパク質上のＶＥＧＦＲ２結合部位と部分的に重複すべきである。例えば、図３５Ｂを参照。

【0022】

ＶＥＧＦ－Ａ結合二価化合物を提供するために、Ｄ－ペプチドバリアントＺドメインポリペプチドに連結されうるＤ－ペプチドバリアントＧＡドメインポリペプチドには、限定されないが、化合物１１０５５、９７９１０２および９７９１０７－９７９１１０、ならびにそのバリアント（例えば、本明細書に記載されるもの）が含まれる。

【0023】

ＶＥＧＦ－Ａ結合二価化合物を提供するために、Ｄ－ペプチドバリアントＧＡドメインポリペプチドに連結されうるＤ－ペプチドバリアントＺドメインポリペプチドには、限定されないが、化合物９７８３３３～９７８３３７、９８０１８１、９８０１７４－９８０１８０、および９８１１８８－９８１１９０、ならびにそのバリアント（例えば、本明細書に記載されるもの）が含まれる。

【0024】

図３６Ａでは、二つのＤ－ペプチド性ドメインのＮ末端を接続する、一つの可能性のある連結成分の概略図が示されている。一部の事例では、Ｎ末端からＮ末端へのリンカーは、（ＰＥＧ）ｎ二機能性リンカーであり、式中、ｎは、２～２０である（４～２０または８～２０など）（例えば、ｎは、５、６、７、８、９、１０、１１または１２）。共役を提供するために、任意の好都合な化学選択官能基は、連結されているＤ－ペプチド性ドメインに組み込まれてもよい。ドメイン間連結は、互換性のある化学選択官能基（例えば、本明細書に記載されるように）を使用して、ペプチド合成後に達成されうる。連結成分はまた、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）中に、当該多価化合物のＤ－ペプチド性ポリペプチドに組み込まれてもよい。例えば、図５０Ｂを参照。

【0025】

一部の事例では、Ｎ末端からＮ末端へのリンカーは、ドメインのポリペプチド配列を延長して、ホモ二官能性ＰＥＧリンカーを含むマレイミドへの共役を提供するシステイン残基を組み込むことによって導入されうる。例えば、化合物１１０５５および９７８３３６はどちらも、追加的なＮ末端システイン残基で化学的に合成され、これが、Ｎ末端からＮ末端への連結（図３６Ａ）を提供するために、従来の方法を使用してビス－マレイミドＰＥＧ８リンカーと共役結合された。例えば、表５は、ＶＥＧＦ－Ａを高親和性の化合物９７９１１１と結合する例示的な二価化合物の詳細を提供する。図５０Ａは、ＶＥＧＦ－Ａに結合したＤ－ペプチド性ドメイン１１０５５および９７８３３６の結晶構造、ならびに、ＶＥＧＦ－Ａに結合する様々なバリアントＧＡドメインおよびＺドメインポリペプチドから二価化合物を調製するために利用されうる、代替的なドメイン間リンカー、すなわちバリアントＧＡドメインのｋ１９からバリアントＺドメインのｋ７までの位置の図を示する。

【0026】

図３８Ｄは、ＧＡドメインの残基ｘ１９とＺドメインの残基ｘ７との間にリンカーＬ^１を含む、例示的な二価化合物の一般的な構造を示す。任意の例示的なＤ－ペプチド性ＧＡドメイン（例えば、本明細書に記載されるように）およびＤ－ペプチド性Ｚドメイン（例えば、本明細書に記載されるように）は、図３８Ｄに示すように、連結成分Ｌ^１で構成されうる。一部の実施形態では、ｘ１９残基およびｘ７残基はそれぞれ独立的に、リジンおよびオルニチンであり、リンカーは、以下の構造のうちの一つを有する。

【化1】

式中、ｎおよびｍは、独立的に１～１２（例えば１～６）であり、ｐ、ｑおよびｒは、それぞれ独立的に０～３（例えば０または１）であり、ｓは１～６（例えば１～３）である。Ｌ^１の一部の事例では、ｎ＋ｍは、３、４、または５など、２～６である。Ｌ^１の一部の事例では、ｎおよびｍは、それぞれ２である。Ｌ^１の一部の事例では、ｎおよびｍは、それぞれ３である。Ｌ^１の一部の事例では、ｐ、ｑ、およびｒは、それぞれ１である。Ｌ^１の一部の事例では、ｐは０である。Ｌ^１の一部の事例では、ｑは０である。Ｌ^１の一部の事例では、ｒは０である。Ｌ^１の一部の事例では、ｓは２である。Ｌ^１の一部の事例では、ｓは３である。

【0027】

図３８Ｅは、ＧＡドメインとＺドメインのＣ末端残基の間に第二のリンカーＬ^２を含む、例示的な二量体二価化合物の概略図である。図３８Ｂは、二つの二価化合物のＺドメインのＣ末端残基を連結するために使用され、ＳＰＰＳ中に導入することができる、例示的なリンカーＬ^２を示す。Ｃ末端からＣ末端へのリンカーは、一つ以上のアミノ酸残基、および一つ以上の連結単位（例えば、本明細書に記載されるもの）を含むことができ、これには、アミノ酸の分岐（例えば、リジン）およびカップリング、例えば、アミノ側鎖およびアルファアミノ基を提供する少なくとも一つの残基が含まれる。Ｃ末端からＣ末端へのリンカーは、一つ以上のアミノ酸残基、および一つ以上の連結単位（例えば、本明細書に記載される通り）を含みうる。一部の事例では、一つ以上の残基を、ＳＰＰＳ中に共有結合を提供するドメインのＣ末端に導入することができ、それによってタンパク質ドメインは、ＶＥＧＦ標的に同時に結合することができる。

【0028】

例示的な多量体多価Ｄ－ペプチド性化合物
本開示の態様は、本明細書に記載される当該バリアントドメインポリペプチドおよび／または二価化合物の任意の二つ以上を含む多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体など）Ｄ－ペプチド性化合物を含む。本開示の多量体は、二つ以上の相同ドメインまたは二つ以上の相同二価化合物を有する化合物を指しうる。したがって、二価化合物の二量体は、連結成分を介して接続される、本明細書に記載されるいずれか一つの二価化合物の二つの分子を含みうる。標的分子のＶＥＧＦ－Ａは、ホモ二量体であってもよく、相同二量体化合物は、各ＶＥＧＦ－Ａ標的モノマー上の類似部位への結合を提供しうる。例えば、図３６Ａは、ＶＥＧＦ－Ａ二量体に結合されたドメイン１１０５５の二つの分子とドメイン９７８３３６の二つの分子の結晶構造のオーバーレイを示す。４つのドメインを接続する化学的連結を組み込むための例示的な部位が示されている。例示的な連結成分は、図３８Ｂおよび３８Ｃに詳細に示されている。一部の事例では、二価化合物（１１０５５＋９７８３３６）の二量体化は、ドメインのＣ末端間のペプチドリンカーを使用して達成される。例えば、表５および図３８Ｃは、例示的なＶＥＧＦ－Ａ結合二量体二価化合物９８０８７０および９８０８７１の配列および構成を示すもので、これは、任意の好都合な連結基が、ポリペプチドドメインのＣ末端に連結されて、ＳＰＰＳ中（図３８Ｂ）またはＳＰＰＳ後（例えば、本明細書に記載される通り）のいずれかに、二量体化連結成分が導入されうることを示す。

【0029】

ペプチド性ドメイン
任意の好都合なペプチド性ドメインを、当該化合物で利用することができる。様々な小タンパク質ドメインは、本明細書に記載される標的タンパク質に対する鏡像スクリーニングの方法で使用するために適合されうるファージディスプレイスクリーニングで利用される。当該小ペプチド性ドメインは、３０～７０残基、４０～７０残基、４０～６０残基、４５～６０残基、５０～６０残基、または５２～５８残基など、２５～８０アミノ酸残基の単鎖ポリペプチド配列からなりうる。ペプチド性ドメインは、１～２０キロダルトン（ｋＤａ）、例えば２～１５ｋＤａ、２～１０ｋＤａ、２～８ｋＤａ、３～８ｋＤａ、または４～６ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有しうる。

【0030】

ペプチド性ドメインは、３らせんバンドルドメインとしうる。３らせんバンドルドメインは、二つの平行ならせんと、ループ領域によって結合された一つの逆平行らせんとからなる構造を有する。当該３らせんバンドルドメインには、限定されないが、ＧＡドメイン、Ｚドメイン、およびアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ドメインが含まれる。

【0031】

本開示に基づいて、構造物の標的結合表面に位置していないペプチド性ドメインモチーフのアミノ酸残基のいくつかは、結果として生じる修飾化合物の三次元構造または標的結合活性に著しい有害な影響を与えることなく、修飾されうることが理解される。このように、いくつかのアミノ酸修飾／変異は、化合物に望ましい特性を付与するために、必要に応じて当該化合物に組み込むことができ、これには、限定されないが、水溶性の増加、化学合成の容易さ、合成の費用、共役部位、らせん間結合部位、安定性、等電点（ｐＩ）、凝集抵抗、および／または非特異的結合の低減が含まれる。変異の位置は、標的タンパク質への特異的結合をもたらす、特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）または標的結合ドメインモチーフの基礎となる三次元構造への何らかの破壊を回避または最小化するように選択されてもよい。例えば、結合表面からみてドメイン構造の反対側にある溶媒曝露位置の変異は、望ましいバリアントアミノ酸残基を導入するために、例えば、溶解性を増加させる、または望ましいタンパク質ｐＩを提供する、または共役もしくは連結部位を導入するためになしうる。一部の事例では、標的結合ドメインモチーフの三次元構造に基づいて、変異の位置は、安定性の向上（例えば、構造のコア充填残基へのバリアントアミノ酸の導入を介して）、または結合親和性の増加（例えば、ＳＤＭにおけるバリアントアミノ酸の導入を介して）を提供するために選択されうる。一部の実例では、化合物は、ＶＥＧＦ標的タンパク質への結合表面の一部ではない位置で、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上など、２個以上の表面変異を含む。

【0032】

ＶＥＧＦ結合Ｚドメイン
本開示は、ＶＥＧＦに特異的に結合するＤ－ペプチド性Ｚドメインを提供する。Ｚドメインは、Ｚドメインの位置９、位置１０、位置１３、位置１４、位置１７、位置２４、位置２７、位置２８、位置３２、および／または位置３５に位置する、５個以上のバリアントアミノ酸残基（例えば、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のバリアントアミノ酸残基）によって定義される、ＶＥＧＦ特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）を含みうる。様々な基礎となるＺドメイン足場またはペプチド性フレームワーク配列を利用して、Ｚドメインの特徴的な三次元構造を提供することができることが理解される。

【0033】

「Ｚドメイン」という用語は、タンパク質Ａの免疫グロブリンＧ結合ドメインに関連する３らせんバンドル三次構造を有するペプチド性ドメインを指す。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）では、構造２ｓｐｚは、例示的なＺドメイン構造を提供する。また、未変性Ｚドメイン構造および非修飾未変性Ｚドメインの一つの例示的な配列の描写を含む図３２Ａおよび図３２Ｂも参照のこと。「Ｚドメイン足場」という用語は、特徴的な３らせんバンドル構造を提供し、当該化合物で使用するために適合されうる、基礎となるＺドメイン配列を指す。「バリアントＺドメイン」は、標的タンパク質への特異的結合を提供する３らせんバンドル三次構造の選択された位置にバリアントアミノ酸を含むＺドメインである。Ｚドメインモチーフは、概して、次式によって描写されることができる。
［らせん３］－［リンカー１］－［らせん２］－［リンカー２］－［らせん１］
式中、［リンカー１］および［リンカー２］は、独立的に１～１０残基のペプチド結合配列であり、［らせん１］、［らせん２］および［らせん３］は、ＧＡドメインについて上述したとおりである。

【0034】

当該Ｚドメインには、限定されないが、Ｎｙｇｒｅｎ （“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａｆｆｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｓｍａｌｌ ｔｈｒｅｅ－ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ”， ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７５ （２００８）
２６６８-２６７６）、ＵＳ２０１６０２００７７２号、ＵＳ９，４６９，６７０号に
記載があるもの、およびＴｊｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （Ｆｒｏｎｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２８ Ａｐｒｉｌ ２０１５）に記載のある、３３残基が最小化されたタンパク質ＡのＺドメインが含まれ、その開示を参照することによりその全体を本書に組み込む。

【0035】

本開示のいくつかの例示的なＶＥＧＦ－Ａ特異的Ｚドメインを説明する目的で、図３６Ｂの番号付けされた５７の残基足場配列を利用する。一部の実施形態では、Ｄ－ペプチド性Ｚドメインは、次の構造式の３らせんバンドルであり、［らせん１^{（＃８－１８）}］－［リンカー１^{（＃１９－２４）}］－［らせん２^{（＃２５－３６）}］－［リンカー２ ^{（＃３７－４０）}］－［らせん３ ^{（＃４１－５４）}］であり、
式中、＃は、Ｄ－ペプチド性ＧＡドメイン中に含まれるアミノ酸残基の基準位置を示す。らせん１～３は、らせんの末端に延在する一つ以上の追加的な残基を含むように画定されてもよいこと、また、末端に位置する残基は、部分的ならせん状構成を有してもよく、および／または曲がり領域もしくはループ領域の始まりにあってもよいことが理解される。一部の事例では、Ｚドメインのらせん１は、Ｎ末端に一つ以上の追加的なアミノ酸残基、例えば、７位、および任意に６位にらせん状残基をさらに含みうる。一部の事例では、Ｚドメインのらせん１は、７位のアミノ酸残基をさらに含みうる。一部の事例では、Ｚドメインは、例えば、らせん１の安定化、３らせんバンドルの安定化、追加的なＶＥＧＦ結合接触、らせん１の伸長、および第二のドメインまたは当該部分への連結（例えば、本明細書に記載されるように）など、望ましい特性を提供することができる残基Ｎ末端から位置８までを含む。一部の事例では、Ｚドメインは、例えば、らせん３の安定化、３らせんバンドルの安定化、追加的なＶＥＧＦ結合接触、らせん３の伸長、および第二のドメインまたは当該部分への連結（例えば、本明細書に記載されるように）など、望ましい特性を提供することができる残基Ｃ末端から位置５４までを含む。

【0036】

Ｄ－ペプチド性Ｚドメイン化合物は、ＶＥＧＦのアミノ酸側鎖Ｅ９０、Ｆ６２、Ｄ６７、Ｉ６９、Ｅ７０、Ｋ１１０、Ｐ１１１、Ｈ１１２およびＱ１１３によって定義される結合部位で、ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合することができる。

【0037】

例示的なＶＥＧＦ－Ａ結合Ｄ－ペプチド性Ｚドメインには、表４に記載され、化合物９７８３３３～９７８３３７および９８０１８１（配列番号１１４～１１９）、９８０１７４－９８０１８０、および９８１１８８－９８１１９０（配列番号１２０～１２９）の配列によって描写されるものが含まれる。本開示に記載される構造および配列バリアントを考慮すると、ＶＥＧＦ－Ａへの特異的結合を保持しながら、多数のアミノ酸置換が、例示的化合物の配列に作製されうることが理解される。Ｚドメインの三次元構造に悪影響を与えることなく可変性が許容されるような、バリアントＺドメインの位置を選択することによって、多数のアミノ酸置換が組み込まれうる。

【0038】

したがって、本開示は、１～１０個のアミノ酸置換（例えば、１～８個、１～６個、または１～５個の置換、例えば、１個、２、３、４個、または５個のアミノ酸置換）を有する、９７８３３３～９７８３３７および９８０１８１（配列番号１１４～１１９）、９８０１７４－９８０１８０、および９８１１８８－９８１１９０（配列番号１２０～１２９）の配列を含む。１～１０個のアミノ酸置換は、例えば、表６によるなど、アミノ酸側鎖の物理的特性に基づく、アミノ酸の置換でもよい。時には、９７８３３３～９７８３３７および９８０１８１（配列番号１１４～１１９）、９８０１７４－９８０１８０および９８１１８８－９８１１９０（配列番号１２０～１２９）の配列のアミノ酸は、表６による類似のアミノ酸で置換される。一部の事例では、置換は、表６による保存的なアミノ酸置換または高度に保存的なアミノ酸置換についての置換である。

【0039】

本開示は、９７８３３３～９７８３３７および９８０１８１（配列番号１１４～１１９）、９８０１７４－９８０１８０、および９８１１８８－９８１１９０（配列番号１２０～１２９）の配列を有する配列と８０％以上の配列同一性、例えば、８５％以上、８７％以上、８９％以上、９１％以上、９３％以上、９４％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上などの配列同一性を有する配列によって描写されるＶＥＧＦ－Ａ結合Ｄ－ペプチド性Ｚドメインを含む。

【0040】

ＶＥＧＦ－Ａ結合Ｄ－ペプチド性Ｚドメインは、図３３Ａおよび／または図３５Ｆに図示した特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）によって画定されるＺドメイン足場の位置９、１０、１３、１４、１７、２４、２７、２８、３２および３５にアミノ酸残基を有しうる。一部の事例では、特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）は、次の配列モチーフによって定義される。
ｗ^９ｄ^１０－－ｗ^１３ｘ^１４－－ｒ^１７－－－－－－ｘ^２４－－ｋ^２７ｘ^２８－－－ｘ^３２－－ｙ^３５ （配列番号１６０）
式中、ｘ^１４、ｘ^２４、ｘ^２８、およびｘ^３２はそれぞれ独立的に任意のアミノ酸残基である。ＳＤＭの特定の事例では、ｘ^１４は、ｌ、ｒおよびｔから選択され、ｘ^２４は、ｈ、ｉ、ｒおよびｖから選択され、ｘ^２８は、Ｇ、ｒおよびｖから選択され、ｘ^３２は、ａ、ｒ、ｈ、ｓおよびｔから選択される。特定の事例では、特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）は、次のいずれかである。
ｗ^９ｄ^１０－－ｗ^１３ｒ^１４－－ｒ^１７－－－－－ｌ^２４－－ｋ^２７ｒ^２８－－－ｓ^３２－－ｙ^３５ （配列番号１６１）、または
ｗ^９ｄ^１０－－ｗ^１３ｒ^１４－－ｒ^１７－－－－－ｖ^２４－－ｋ^２７ｒ^２８－－－ｒ^３２－－ｙ^３５ （配列番号１６２）。

【0041】

一部の実施形態では、ＶＥＧＦに特異的に結合するＤ－ペプチド性化合物は、次式のアミノ酸残基によって定義されるＶＥＧＦ特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）を含むＤ－ペプチド性Ｚドメインを含む。
ｗ^９ｄ^１０－－ｗ^１３ｘ^１４－－ｒ^１７－－－－－－ｘ^２４－－ｋ^２７ｘ^２８－－－ｘ^３２－－ｙ^３５（配列番号１６０）
式中、
ｘ^１４は、ｌ、ｒおよびｔから選択され、
ｘ^２４は、ｈ、ｉ、ｌ、ｒ、およびｖから選択され、
ｘ^２８は、Ｇ、ｒおよびｖから選択され、
ｘ^３２は、ａ、ｒ、ｈ、ｓおよびｔから選択され、
ｘ^３５は、ｋまたはｙから選択される。

【0042】

ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^１４はｌである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^１４はｒである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^１４はｔである。

【0043】

ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、×^２４は時間である。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^２４はｉである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^２４はｌである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^２４はｒである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^２４はｖである。

【0044】

ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^２８はＧである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^２８はｒである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^２８はｖである。

【0045】

ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^３２はａである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^３２はｒである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、×^３２はｈである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^３２はｓである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^３２はｔである。

【0046】

ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^３５はｋである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^３５はｙである。

【0047】

一部の実施形態では、ＶＥＧＦ ＳＤＭは、次の残基によって定義される。
ｗ^９ｄ^１０－－ｗ^１３ｒ^１４－－ｒ^１７－－－－－－ｌ^２４－－ｋ^２７ｒ^２８－－－ｓ^３２－－ｙ^３５（配列番号１６１）
または
ｗ^９ｄ^１０－－ｗ^１３ｒ^１４－－ｒ^１７－－－－－－ｖ^２４－－ｋ^２７ｒ^２８－－－ｒ^３２－－ｙ^３５（配列番号１６２）である。

【0048】

ＧＡドメインの一部の実施形態では、ＳＤＭ残基は、以下のアミノ酸残基によって画定されるペプチド性フレームワーク残基を含む、ペプチド性フレームワーク配列中に含まれる： －－ｎ^１１ａ－－ｅ^１５ｉ－ｈ^１８ｌｐｎｌｎ－ｅ^２５ｑ－－ａ^２９ｆｉ－ｓ^３３ｌ－ 。

【0049】

一部の実施形態では、ＧＡドメインは、次式のアミノ酸配列に対して８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、または９５％以上）の同一性を有する、ＳＤＭ含有配列を含む。
ｗ^９ｄ^１０ｎａｗ^１３ｘ^１４ｅｉｒ^１７ｈｌｐｎｌｎｘ^２４ｅｑｋ^２７ｘ^２８ａｆｉｘ^３２ｓｌｙ^３５（配列番号１３３）
式中、
ｘ^１４は、ｌ、ｒおよびｔから選択され、
ｘ^２４は、ｈ、ｉ、ｌ、ｒ、およびｖから選択され、
ｘ^２８は、Ｇ、ｒおよびｖから選択され、
ｘ^３２は、ａ、ｒ、ｈ、ｓおよびｔから選択され、
ｘ^３５は、ｋまたはｙから選択される。

【0050】

ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^１４はｌである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^１４はｒである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^１４はｔである。

【0051】

ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^２４はｈである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^２４はｉである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^２４はｌである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^２４はｒである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^２４はｖである。

【0052】

ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^２８はＧである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^２８はｒである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^２８はｖである。

【0053】

ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^３２はａである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^３２はｒである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^３２はｈである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^３２はｓである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^３２はｔである。

【0054】

ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^３５はｋである。ＳＤＭ含有配列の一部の実施形態では、ｘ^３５はｙである。

【0055】

化合物の一部の実施形態では、Ｚドメインのらせん３^{（＃４１～５４）}は、ペプチド性フレームワーク配列ｓ^４１ａｎｌｌａｅａｋｋｌｎｄａ^５４（配列番号１３４）を含む。

【0056】

一部の実施形態では、Ｄ－ペプチド性Ｚドメインは、Ｃ末端ペプチド性フレームワーク配列：ｄ^３６ｄｐｓｑｓａｎｌｌａｅａｋｋｌｎｄａｑａｐｋ^５８（配列番号１３５）を含む。

【0057】

一部の実施形態では、Ｄ－ペプチド性Ｚドメインは、Ｎ末端ペプチド性フレームワーク配列：ｖ^１ｄｎｋｆｎｋｅ^８（配列番号１３６）を含む。

【0058】

ＶＥＧＦ結合ＧＡドメイン
「ＧＡドメイン」および「ＧＡドメインモチーフ」という用語は、タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメインに関連する３らせんバンドル三次構造を有するペプチド性ドメインを指す。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）では、構造１ｔｆ０は、例示的なＧＡドメイン構造を提供する。図３、７Ａ－７Ｂ、１０Ａおよび図 １０Ｂは、未変性ＧＡドメイン構造および非修飾未変性ＧＡドメインの一つの例示的な配列の描写を含む。「ＧＡドメイン足場」という用語は、特徴的な３らせんバンドル構造を提供し、当該化合物で使用するために適合されうる、基礎となるペプチド性フレームワーク配列を指す。一部の事例では、ＧＡドメイン足場またはペプチド性フレームワーク配列は、表３に定義されるコンセンサス配列を有する。表３は、当該化合物での使用に適合されうる、例示的なＧＡドメイン足場配列のリストを提供する。「バリアントＧＡドメイン」、「ＶＥＧＦ結合ＧＡドメイン」、および「ＶＥＧＦに結合するＧＡドメイン」という用語は、互換的に使用され、３らせんバンドル三次構造の選択位置にバリアントアミノ酸を含むＧＡドメインを指し、それらはまとめてＶＥＧＦ標的タンパク質への特異的結合を提供する。

【0059】

ＧＡドメインは、以下の構造式によって記述されることができ、
［らせん１］－［リンカー１］－［らせん２］－［リンカー２］－［らせん３］
式中、［らせん１］、［らせん２］および［らせん３］は、ペプチドリンカー［リンカー１］および［リンカー２］を介して連結された特徴的な３らせんバンドルのらせん領域である。３らせんバンドルでは、［らせん１］、［らせん２］および［らせん３］は、連結されたペプチド領域であり、ここで［らせん２］は、平行アルファらせん［らせん１］および［らせん３］の２らせん複合体に対して実質的に逆平行に構成される。［リンカー１］および［リンカー３］はそれぞれ独立的に、１～１０アミノ酸残基の配列を含みうる。一部の事例では、［リンカー１］は［リンカー３］よりも長い。ＧＡドメインは、３０～９０残基、例えば、３０～８０残基、４０～７０残基、４５～６０残基、４５～６０残基、または４５～５５残基などのペプチド性配列であってもよい。特定の例では、ＧＡドメインモチーフは、４０～５５残基、または４５～５５残基など、３５～５５残基のペプチド性配列である。特定の実施形態では、ＧＡドメインモチーフは、４５残基、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、または５３個の残基のペプチド性配列列である。

【0060】

一部の実施形態では、Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインは、以下の構造式の３らせんバンドルである。
［らせん１^{（＃６－２１）}］－［リンカー１^{（＃２２－２６）}］－［らせん２^{（＃２７－３５）}］－［リンカー２ ^{（＃３６－３７） ］－［らせん３} （＃３８－５１^）］式中、＃は、Ｄ－ペプチド性ＧＡドメイン中に含まれるアミノ酸残基の基準位置を示し、例えば、図９Ｃに示す番号付け方式による。

【0061】

当該ＧＡドメインは、Jonsson et al. (Engineering of a femtomolar affinity binding protein to human serum albumin, Protein Engineering, Design & Selection, 21(8), 2008, 515-527)に記載があり、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、また、足場の位置２５、２７、３１、３４、３６、３７、３９、４０、４３、４４および４７にライブラリ変異を有する足場配列（Ｇ１４８－ＧＡ３）を有する、ＧＡドメインおよびファージディスプレイライブラリを含む。その他の当該ＧＡドメインは、限定されないが、ＵＳ６，５３４，６２８およびＵＳ６，７４０，７３４に記載されるものが含まれ、当該開示は、これらを参照することによりその全体を本書に組み込む。

【0062】

本開示のバリアントＧＡドメインは、２５、２７、３０、３１、３４、３６、３７、３９、４０および４２～４８から選択される位置に、５個以上のバリアントアミノ酸残基を含む特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）を有しうる。一部の実例では、特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）は、ＧＡドメインの位置２８にバリアントアミノ酸をさらに含む。

【0063】

ロックされたＧＡドメイン
本開示は、らせん１とらせん３の隣接残基の間のらせん間リンカーまたは架橋を有するバリアントＧＡドメイン化合物を含む。「ロックされたバリアントＧＡドメイン」および「ロックされたＧＡドメイン」という用語は、ＧＡドメインの任意の二つのらせんの間に構造安定化リンカーを含むバリアントＧＡドメインを指す。時には、連結された隣接残基は、らせん１および３の端部に位置する。図２９Ａおよび図３７Ａは、３らせんバンドルにおけるらせん１～３の構成を示すＧＡ足場ドメインの構造を示す。らせん間リンカーは、ドメインの三次元構造において互いに近位にある、ドメインの位置７（らせん１）と位置３８（らせん３）のアミノ酸残基間に位置しうる。位置７および位置３８は、構造の疎水性コアとの安定した接触をすることができるらせんの端部に位置する残基に面するコアであるとみなしうる。らせん間リンカーは、連結されたアミノ酸残基のアルファ炭素の間で測定される、長さ３～７原子の骨格を有しうる。例えば、二つのシステイン残基間のジスルフィド結合は、二つのシステインアミノ酸残基のアルファ炭素間に長さ４原子の骨格（－ＣＨ_２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ_２－）を提供する。

【0064】

適合する様々な天然および非天然起源のアミノ酸残基は、ＧＡドメインの位置７および３８に組み込むことができ、それらは互いに共役結合されて、らせん間リンカーを提供することができる。適合残基としては、限定されないが、エステルまたはチオエステル連結を介して、セリンまたはシステインに連結されたアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩、アミド連鎖を介してオルニチンまたはリジンに連結されたアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩が含まれる。したがって、らせん間リンカーは、Ｃ_{（１～６）}アルキル、置換Ｃ_{（１～６）}アルキル、－（ＣＨＲ）_ｎ－ＣＯＮＨ－（ＣＨＲ）_ｍ－、および－（ＣＨＲ）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ＣＨＲ）_ｍ－から選択される一つ以上の基を含んでもよく、式中、各Ｒは独立的にＨ、Ｃ_{（１～６）}アルキル、または置換Ｃ_{（１～６）}アルキル、およびｎ＋ｍ＝２、３、４、または５である。任意の好都合な非天然起源の残基は、位置７および位置３８のアミノ酸残基側鎖に、例えば、アジドおよびアルキンタグなどのクリックケミストリータグなど、互換性のある化学選択的タグを組み込むために利用でき、これらはポリペプチド合成後に互いに共役結合することができる。

【0065】

ドメイン内リンカーの組み込みは、ＶＥＧＦ標的タンパク質のために安定性および／または結合親和性の増加をもたらすことができる。一部の事例では、ＶＥＧＦに対するＤ－ペプチド性化合物の結合親和性（Ｋ_Ｄ）は、ドメイン内リンカーを欠く対照ポリペプチドよりも３倍以上強く（すなわち、Ｋ_Ｄが３倍低い）、例えば、５倍以上強い、１０倍以上強い、３０倍以上強い、またはそれ以上に強いなどである。ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合する例示的なロックされたバリアントＧＡドメイン化合物を、以下でより詳細に説明する。

【0066】

バリアントＧＡドメインポリペプチドは、らせん２およびらせん３と非重複とみなしうる、Ｎ末端領域の位置１からおよそ位置６までを含むことができ、これは、この領域が、折り畳まれた３らせんバンドル構造の隣接するらせん２－ループ－らせん３領域との接触に直接関与しないためである（例えば、図３２Ａを参照）。当該Ｄ－ペプチド性化合物では、ＧＡドメインの位置１～５のＮ末端領域は、任意に配列内に保持し、水溶性、安定性または親和性の増加などの望ましい特性を提供するために最適化することができる。バリアントＤ－ペプチド性化合物のＮ末端領域は、化合物の活性に著しい悪影響を及ぼすことなく、置換、修飾、または切断がなされうることが理解される。Ｎ末端領域は、当該分子（例えば、本明細書に記載されるように）、または別のＤ－ペプチド性ドメインもしくは多価化合物（例えば、本明細書に記載されるように）への共役または連結を提供するために修飾されうる。一部の事例では、Ｎ末端残基は、らせん１の伸張したらせん構造を提供するらせん性向を有する。あるいは、Ｎ末端領域は、らせん１のＮ末端を安定化させるらせんキャッピング残基を組み込むことができる。一部の事例では、バリアントＧＡドメイン化合物は、図３２Ａに示すとおり、親ＧＡドメイン構造に対して１個、２個、３個、４個または５個の残基を切断することで（すなわち、位置１－５の切断）、Ｎ末端で切断される。このような場合、当該化合物の番号付け方式は、図３２Ｂに示すように保持される。同様に、らせん３の末端の１個、２個、または３個のＣ末端残基は、３らせんバンドル構造の安定性および標的結合能に悪影響を与えることなく切断されうる。

【0067】

図２９Ａ－２９Ｂは、バリアントＧＡドメイン化合物の位置１～３、６、７、および３７～３８に焦点を置いた例示的な親和性成熟ライブラリの設計を示す。図３０Ａ－３０Ｂは、ｃ７－ｃ３８ジスルフィド架橋およびＶＥＧＦ－Ａに対する結合親和性の改善を有するスクリーニングおよびバリアントＧＡドメイン化合物の結果を示す。様々なバリアントアミノ酸残基が、化合物のＮ末端領域の位置１～３で許容される。

【0068】

一部の実施形態では、Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインは、以下のセグメント（Ｉ）～（ＩＩ）のうち一つ以上（例えば、両方）を含み、
ｘ^１ｘ^２ｘ^３ｑｗｘ^６ｘ^７ （Ｉ）（配列番号１４２）
ｘ^３７ｘ^３８ （ＩＩ）
式中、
ｘ^１～ｘ^３は、任意のＤ－アミノ酸残基から独立的に選択され、
ｘ^６は、ｉおよびｖから選択され、
ｘ^３７は、ｓおよびｎから選択され、および
ｘ^７およびｘ^３８は、アミノ酸残基ｘ^７およびｘ^３８のアルファ－炭素の間で測定された３～７原子長の骨格を有するドメイン内／らせん間リンカーを介して接続されるアミノ酸残基である。式（Ｉ）の一部の実施形態では、ｘ^１～ｘ^３は、ｆ、ｈ、ｉ、ｐ、ｒ、ｙ、ｎ、ｓおよびｖから独立的に選択される。式（Ｉ）の一部の実施形態では、ｘ^６はｖである。式（ＩＩ）の一部の実施形態では、ｘ^３７はｎである。

【0069】

ドメイン内／らせん間リンカーは、ジスルフィド架橋、またはｘ^７とｘ ^３８アミノ酸残基の側鎖間の連結からなることができる。任意の好都合な天然または非天然起源のチオールを含むアミノ酸は、ドメイン内リンカーを提供するために、利用することができる。ジスルフィド結合を介して接続されうるアミノ酸残基×^７および×^３８は、システイン^７－システイン^３８ジスルフィド、ホモシステイン^７－システイン^３８ジスルフィド、システイン^７－ホモモシステイン^３８ジスルフィド、およびホモシステイン^７－ホモシステイン^３８ジスルフィドを含む。あるいは、ドメイン内／らせん間リンカーは、ｘ^７アミノ酸残基とｘ^３８アミノ酸残基の側鎖間でのアミド結合連結を含みうる。任意の好都合な天然または非天然起源のアミンおよびカルボン酸を含むアミノ酸は、ドメイン内リンカーを提供するために利用することができる。アミド連鎖を介して接続され得るアミノ酸残基ｘ^７およびｘ^３８は、Ａｓｐ７－Ｄａｐ３８、Ａｓｐ７－Ｄａｂ３８、Ａｓｐ７－Ｏｒｎ３８、Ｇｌｕ７－Ｄａｐ３８、Ｇｌｕ７－Ｄａｐ３８およびＧｌｕ７－Ｏｒｎ３８を含み、式中、Ｄａｐは□□□－ジアミノプロピオン酸であり、Ｄａｂは□□□－ジアミノ酪酸であり、Ｏｒｎはオルニチンである。ｘ^７残基とｘ^３８残基の対は、Ｄ－アミノ酸残基とすることができる。任意の好都合な化学選択官能基およびその共役は、限定されないが、アジド－アルキン、チオール－マレイミド、チオール－ハロアセチル、チオール－ビニルスルホン、エステル、チオエステル、アミド、エーテルおよびチオエーテルを含む、ドメイン内／らせん間結合を達成するために利用されうる。

【0070】

図１３は、スクリーニングで使用されるファージディスプレイライブラリのうちの一つを画定する、基礎となる５３残基足場配列（配列番号２）、および足場の位置２５、２７、２８、３１、３４、３６、３７、３９、４０、４３、４４および４７での、太字の変異位置を含む、ＧＡドメインライブラリの描写を示す。足場ドメインライブラリのスクリーニングに由来する、選択されたヒット化合物が同定された。当該化合物は、標的タンパク質と接触し、かつＶＥＧＦ－Ａへの特異的結合を提供する、ＶＥＧＦ－Ａ結合面を提示する、基礎となる足場ドメインを含む。選択されたＧＡドメインライブラリヒットからの選択された化合物を、追加的な親和性成熟および点変異の研究（例えば、本明細書に記載されるようなもの）の対象とし、例えば、位置２６、位置２９および位置３０のＧＡドメインモチーフのいくつかの追加的な位置でのバリアントアミノ酸を評価した。ＶＥＧＦ－Ａと複合体化されたＧＡドメイン足場を有する、例示的なＤ－ペプチド性化合物のＸ線結晶構造が、本明細書に記載されており、これは当該ＶＥＧＦ－Ａ結合化合物の構造モデルを提供する。

【0071】

Ｄ－ペプチドバリアントＧＡドメイン化合物は、ＶＥＧＦ－Ａのアミノ酸側鎖Ｆ４３、Ｍ４４、Ｙ４７、Ｙ５１、Ｎ８８、Ｄ８９、Ｌ９２、Ｉ７２、Ｋ７４、Ｍ１０７、Ｉ１０９、Ｑ１１５およびＩ１１７によって定義される結合部位で、ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合することができる（図２８Ａ－２８Ｂを参照）。

【0072】

一部の事例では、ＶＥＧＦ－Ａ結合モチーフは、互いに接触し、まとめてＶＥＧＦ－Ａ結合面を画定する、少なくとも二つの逆平行らせん領域［らせんＡ］および［らせんＢ］を含む。［らせんＡ］および［らせんＢ］の逆平行複合体を含むＶＥＧＦ－Ａ結合モチーフのその部分は、「２らせん複合体」構造と呼ぶことができる。図８Ａ－８Ｂは、２らせん複合体構造の７連子繰返し構造モデルを示す。一部の実例では、当該ＶＥＧＦ－Ａ接触残基は、７連子繰返しのｃまたはｇ位置など、２らせん複合体の表面変異位置または境界変異位置に位置することができる。図８Ｃは、２らせん複合体構造のｇ－ｇ面上のＶＥＧＦ－Ａ接触残基の一つの例示的な配置を示す。ＶＥＧＦ－Ａ結合面は、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上のＶＥＧＦ－Ａ接触残基など、４個以上の残基を含んでもよく、ここで残基は、［らせんＡ］および［らせんＢ］の両方の残基を含む。特定の事例では、ＶＥＧＦ－Ａ接触残基は、非極性残基、芳香族残基、複素環式残基、および炭素環式残基（例えば、本明細書に記載される通り）から独立的に選択される。２らせん複合体の二つのらせんは、［らせんＡ］および［らせんＢ］の実質的に逆平行な構成を維持する任意の好都合な連結を介して接続されうる。一部の事例では、［らせんＡ］および［らせんＢ］は、Ｃ（らせんＡ）からＮ（らせんＢ）のペプチドリンカーを介して連結される。一部の事例では、［らせんＡ］および［らせんＢ］は、Ｃ（らせんＡ）からＮ（らせんＢ）のペプチドリンカーを介して連結される。図８Ａは、２らせん複合体構造に対して可能な末端連結（青色実線）を示す。

【0073】

２らせん複合体は、限定されないが、溶媒曝露位置での望ましいらせん－らせん充填相互作用または親水性を提供する残基の組み込み、らせん間結合の組み込み、らせん内結合の組み込み、らせんを接続する拘束的な屈曲部またはリンカーの組み込み、および［らせんＡ］および［らせんＢ］の両方との接触を安定化することができる第三のペプチド性領域への連結、を含む、任意の好都合な方法によって、さらに安定化されうる。図８Ｂ－８Ｃは、任意の二つの好都合な残基の間に導入しうる様々ならせん間側鎖－側鎖結合（例えば、点線）を図示する。同様に、化合物の構造に望ましい安定性を提供するために、らせん内の側鎖から側鎖への連結、または側鎖から末端への連結の安定化を導入しうる。当該化合物で使用が見出される当該のらせん間およびらせん内の連結には、限定されないが、Ｃｙｓ－Ｃｙｓジスルフィド結合、ステープル化ペプチド結合、および閉環メタセシスによって調製される連結や、Douse et al. (ACS Chem Biol. 2014 Oct 17;9(10):2204-9)に記載のある連結など、非天然の架橋が含まれる。

【0074】

一部の実施形態では、２らせん複合体は、化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合面の反対側で、［らせんＡ］および［らせんＢ］の両方と接触し、これらがまとめて３らせんバンドルを画定する、第三のらせん（Ｈｅｌｉｘ Ｃ）によって安定化されうる。本明細書で使用される場合、「３らせんバンドル」および「３らせんバンドルモチーフ」という用語は、互換的に使用され、三つの実質的に平行なまたは逆平行なアルファらせんを含む、小さなタンパク質三次構造である３らせんバンドルを指す。三つのらせんは、３らせんバンドル構造において平行－逆平行－平行構成で配置された、連結されたらせん領域の線形配列に基づく。

【0075】

DeGrado et al. (Analysis and design of three-stranded coiled coils and three-helix bundles”, Folding & Design 1998, 3: R29-R40)は、三本鎖コイルドコイルおよび３らせんバンドルの集合体のためのモデルを提供し、その開示はその全文を参照し本書に組込む。３らせんバンドルは、非極性コアにおいて互いに規則的な接触を有するらせんを接続するループを有する、一本鎖構造でありうる。構造の三つのらせんは、斜体ａ～ｇ、すなわち（ａｂｃｄｅｆｇ）_ｎ中の文字によって示される、およそ７つの残基の反復モチーフを示すことができる。７連子指定ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇは、特定のアミノ酸の単一文字コードではなく、むしろ７連子配列内の位置に対応する。非極性残基は、疎水性安定化をもたらすために構造の中心に充填される側鎖基を含む、７連子の位置ａおよびｄで発生しうる。非極性ａおよびｄ残基は、層状に充填されうる。一部の事例では、荷電側鎖は、界面のｅおよびｇ位置で生じてもよく、その側鎖の非極性部分が疎水性コアを遮蔽し、極性部分が静電または水素結合相互作用に関わりうる。一部の事例では、溶媒曝露位置ｂおよびｃは、極性残基によって占有されうる。一部の実例では、位置ｆは、高度に溶媒曝露的であり、極性残基または荷電残基によって占有されうる。図６Ｄは、二つの平行らせんと一つの逆平行らせんを示す、３らせんバンドルのＤペプチド性７連子繰返しモデルを示す。一部の事例では、らせん２および３の複合表面によって形成されるｇ－ｇ面の残基は、ＶＥＧＦ－Ａの表面と相互作用し、特異的結合を提供するよう構成されるＶＥＧＦ－Ａ接触残基を含むように修飾される。図６Ｄに図示した構造モデルの２らせん複合体バージョンが可能であることが理解され、これについては図８Ｂに示す。任意の好都合な安定化要素を、当該化合物（例えば、本明細書に記載されるように）で利用して、二つのらせんの望ましい配置を維持し、ＶＥＧＦ－Ａへの特異的結合を提供するＶＥＧＦ－Ａ結合残基を提示することができる。当該化合物は、３らせんバンドル三次構造を有するＶＥＧＦ－Ａ結合ＧＡドメインモチーフを有してもよく、その中にバリアントアミノ酸残基が組み込まれ、ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合することができる結合表面を提供する。図１～２は、例示的なペプチド性化合物とＶＥＧＦ－Ａとの間の結合界面を図示する。図３Ａおよび図３Ｂは、Ｌ－タンパク質ＧＡドメインと例示的なＤ－ペプチド性化合物の３らせんバンドルＸ線結晶構造の並列比較を示す。図３Ａおよび図３Ｂの比較は、ペプチド性化合物が、親ＧＡドメインの基本的な３らせんバンドル構造モチーフを保持することができることを示す。特定の事例では、化合物のアルファらせん構造は、未変性ＧＡ足場ドメインと実質的に同一である。修飾バリアントアミノ酸は、ＧＡ足場ドメイン中に存在しないらせん２領域の末端に、らせん末端残基を含みうる。らせん２領域のバリアントアミノ酸はまた、三つ以上のＶＥＧＦ－Ａ接触残基、例えば、芳香族アミノ酸残基を含みうる。図４は、例示的なＶＥＧＦ－Ａ結合化合物のらせん２領域の位置２６および位置３６（ｐ２６；２０４およびｐ３６；２０８）でのらせん末端プロリン残基、ならびに位置３１（ｆ３１；２０６）でフェニルアラニンと、位置２７および位置３４（ｈ２７；２０５およびｈ３４；２０７）でヒスチジン残基と接触するＶＥＧＦ－Ａを示す。

【0076】

本明細書に記載される化合物の特定の実施形態では、番号付け方式は、例えば、特定の当該バリアントアミノ酸残基がＧＡ足場ドメインに組み込まれる位置など、化合物の構造および／または配列における特定の位置を指すための、利便性および単純性のために利用される。この番号付け方式は、図１３に図示した５３残基のＧＡ足場ドメイン用に利用されたものに基づく。任意の好都合なアライメント法を使用して、当該化合物の特定の実施形態を図１５の参照番号付け方式と比較し、番号付けされた位置を、例えば、本明細書に記載されるモチーフまたは構造モデル内の位置など、当該アミノ酸残基に割り当てることができることが理解される。図１４は、様々な当該ＧＡ足場ドメイン配列の例示的なアライメントを示しており、その任意の一つは、当該化合物の基礎となる親配列として機能しうる。図１４はまた、図１３の番号付け方式に対する配列も参照する。さらに、図１３の１～５３の番号付け方式は、線形化合物配列のアミノ酸残基の総数もしくは長さを決定する点、または特定の化合物のありとあらゆる残基を定義する点において、限定するものではないことが理解される。

【0077】

一部の事例では、当該化合物は、Ｎ末端切断（例えば、位置１から）、Ｃ末端切断（例えば、位置５３から）、欠失（例えば、親配列の任意の好都合な位置での単一の残基位置）、挿入（例えば、二つの特定の位置の間の１個、２個、３個、またはそれ以上の隣接する残基）などの番号付き親配列に対する一つ以上のバリエーションを含む。特定の事例では、当該化合物に組み込まれるこうしたバリエーションは、標的への特異的結合を提供する３らせんバンドルの三次元構造を実質的に保存している。当該化合物は、例えば、以下の実施形態に記載されるように、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、または１５個以上の位置など、親構造または配列の一つ以上の位置におけるバリアントアミノ酸をさらに含みうる。

【0078】

本明細書に記載されるように、当該化合物は、３らせんバンドル構造を有してもよく、ここで、［らせん２］および［らせん３］の特定の位置に位置する特定の溶媒曝露バリアントアミノ酸は、ＶＥＧＦ－Ａと接触を形成することができる。一部の事例では、追加的な接触が、［リンカー２］および／または［リンカー１］の特定の残基で起こってもよい。図１は、例示的なペプチド性化合物と、複合体のＸ線結晶構造から取り込まれたＶＥＧＦ－Ａとの間の結合界面を示す。特定の事例では、［らせん２］、［らせん３］、［リンカー２］および／または［リンカー１］の追加的な位置に位置するバリアントアミノ酸は、修飾された３らせんバンドル構造の望ましい安定化を提供する。例えば、図４では、例示的な［らせん２］末端残基が示されており（例えば、プロリン残基２０４および２０８）、これは一部の事例では、望ましい安定化の増加を［らせん２］に与えることができる。特定の例では、修飾された３らせんバンドルの疎水性コアは、親ＧＡ足場ドメインのものと実質的に同じアミノ酸残基によって画定される。例えば、図１１は、［らせん２］－［リンカー２］－［らせん３］構造の例示的なＤ－ペプチド性化合物の一部の拡大図を示しており、これには、［らせん２］の隣接する疎水性残基ｉ３２（イソロイシン、位置３２）およびａ３５（アラニン、位置３５）、ならびに望ましい分子内疎水性接触を提供する［らせん３］の隣接する疎水性残基ｖ４１（バリン、位置４１）およびｌ４４（ロイシン、位置４４）が含まれる。図１２では、未変性Ｌ－ペプチド性ＧＡドメインの類似の領域の拡大図が示されており、ここで類似残基Ｉ３２（イソロイシン、位置３２）、Ａ３５（アラニン、位置３５）、Ｖ４１（バリン、位置４１）およびＬ４４（ロイシン、位置４４）は、ＧＡ足場ドメインの３らせんバンドル構造の特徴である類似の望ましい分子内疎水性接触を提供する。

【0079】

図６Ｃは、逆平行三本鎖らせん構造のＤｅｇｒａｄｏモデルを示す。繰返し７連子単位に基づく逆平行三本鎖らせんのＤｅｇｒａｄｏモデルは、本明細書では、当該化合物配列モチーフを、ＶＥＧＦ－Ａ結合表面を含む当該化合物の修飾された３らせんバンドル構造に関連する構造モデルを提供するように適合される。３らせんバンドルのこの構造モデルは、未変性ＧＡドメイン（例えば、図３Ａ）および例示的なＶＥＧＦ－Ａ結合化合物（図３Ｂ）のＸ線結晶構造と一貫性がある。図９Ａおよび９Ｃは、例示的化合物１．１．１（ｃ２１ａ）に適用されるモデルを示し、ここで化合物配列のアミノ酸残基（図９Ｃ）は、Ｘ線構造（図９Ｂ）と一貫性がある、７連子繰返しモデルの様々な位置と関連するか、構造的に整列する。図９Ａのモデルを、ＶＥＧＦ－Ａと複合体化された化合物のＸ線構造（例えば、図５および図２０の図を参照）と比較したものは、例示的化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合表面が、らせん２およびらせん３によって画定されるｇ－ｇ面（図９Ａ）に位置することを示す。選択されたアミノ酸残基は、当該化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合表面に位置してもよく、ＶＥＧＦ－Ａと相互作用するように構成されてもよい（例えば、らせん２およびらせん３によって画定されるｇ－ｇ面の溶媒曝露されたｃ位置および／またはｇ位置に位置する）。

【0080】

当該化合物の疎水性コアは、［らせん３］の対応するｄおよびａ残基と接触する［らせん２］のｄおよびａ残基を含みうる。図６Ｂおよび図１０Ａは、３らせんバンドルのらせん間での、コア残基の疎水性接触が図示されている、７連子繰返しモデルとの、例示的化合物１．１．１（ｃ２１ａ）のアライメントを示す。これは、図１１に示す［らせん２］－［リンカー２］－［らせん３］領域の部分構造と一貫性があり、これには、［らせん２］の隣接する疎水性残基ｉ３２（イソロイシン、位置３２）およびａ３５（アラニン、位置３５）、ならびに望ましい分子内疎水性接触を提供する［らせん３］の隣接する疎水性残基ｖ４１（バリン、位置４１）およびｌ４４（ロイシン、位置４４）が含まれる。このモデル（例えば、図９Ａに示すもの）では、正確には平行でないらせん２およびらせん３のアライメントが許容される（すなわち、らせん間角度は０度より大きく、例えば、本明細書に記載されるように、また図２７に描写されているように）ことが理解される。

【0081】

図５および図２７に示すように、一部の事例では、らせん２および３は、らせんの方向に対して実質的に逆平行の構成を有しうるが、これらのらせんは、らせんの長さにわたり相互に何か所か接触するが、らせんの軸は、約１０度以上、約１５度以上、約２０度以上、約２５度以上、約３０度以上など、０度より大きい角度の軸と整列することができる。したがって、当該化合物の一部の例では、リンカー２は、リンカー１よりも短く、その結果、らせん２とらせん３の間の角度は、らせんのリンカー２接続から測定される。一部の事例では、らせんのリンカー２末端から最も離れている「ａ」および「ｄ」残基は、部分的に溶媒曝露される、および／またはＶＥＧＦ－Ａと接触できる可能性が高い。

【0082】

特定の例では、当該化合物は、らせん２とらせん３の間の角度の増大、例えば、約１０度以上、または約１５度以上など、約５度以上の増大をもたらす、らせん末端残基を含む。例えば、図２７Ａと図２７Ｂを比較して参照。

【0083】

一部の実施形態では、［らせん２］は、７連子繰返し配列［ｃ^１ｄ^１ｅ^１ｆ^１ｇ^１ａ^２ｂ^２ｃ^２ｄ^２］を含み、［らせん３］は、７連子繰返し配列［ｅ^１ｆ^１ｇ^１ａ^２ｂ^２ｃ^２ｄ^２ｅ^２ｆ^２ｇ^２ａ^３ｂ^３ｃ^３ｄ^３ｅ^３］を含み、個々の７連子繰返し残基は番号付けすることができる。［らせん２］および［らせん３］のこの配置の特定の事例では、残基ｄ^２、ａ^２およびｄ^１の［らせん２］は残基ａ^２、ｄ^２およびａ^３と相互作用し、［らせん３］の構造安定化相互作用のネットワークを形成する。特定の事例では、［らせん２］の残基ｃ^２、ｇ^１およびｃ^１、および［らせん３］の残基ｇ^１はそれぞれ独立的に、ＶＥＧＦ－Ａと接触するよう構成される芳香族、複素環式または炭素環式残基である。

【0084】

当該化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合表面は、残基がＶＥＧＦ－Ａと相互作用するよう表面上に構成されている７連子繰返しモデルのｃおよびｇ位置に位置する芳香族アミノ酸残基の構成によって画定されうる。一部の事例では、ＶＥＧＦ－Ａ結合表面は、２個以上、３個以上の芳香族アミノ酸残基、例えば、７連子繰返し配列のｃ位置およびｇ位置に位置する４個以上、または５個以上の芳香族アミノ酸残基を含む。図８Ｄおよび図１０Ｂは、ＶＥＧＦ－Ａを結合することができる［らせん２］および［らせん３］のｃ残基およびｇ残基の構成を含むバリアントドメインモチーフの実施形態を図示する。特定の事例では、ＶＥＧＦ－Ａ結合表面は、図１０Ｂに示すように、７連子繰返しのｃ位置およびｇ位置で、例えば、らせん３の残基ｃおよび／またはｇで、非極性アミノ酸残基である、追加的な非芳香族アミノ酸残基を含む。特定の事例では、ＶＥＧＦ－Ａ結合表面は、７連子繰返しのｃ位置およびｇ位置で、例えば、らせん３のｃおよび／またはｇ残基で、水素結合が可能な極性アミノ酸残基である、追加的な非芳香族アミノ酸残基を含む。本開示に基づいて、構造物のＶＥＧＦ－Ａ結合表面に位置していないＧＡドメインモチーフのアミノ酸残基のいくつかは、結果として生じる修飾化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合活性に有害な影響を与えることなく、修飾されうることが理解される。

【0085】

式（Ｉ）の一部の実施形態では、［らせん２］は、次式の配列を含む。
ΛｊｘｘΛｊｘΛｊ（配列番号１４３）
（ＩＩ）
式中、各「Λ」は独立的にＤ－芳香族アミノ酸であり、各ｊは独立的に疎水性残基であり、各ｘは独立的にアミノ酸残基である。式（ＩＩ）で使用が見出される当該芳香族アミノ酸には、限定されないが、ｈ、ｆ、ｙおよびｗ、ならびにその置換バージョンが含まれる。式（ＩＩ）の一部の例では、第一のΛは、ｈ、ｆ、またはｙである。第二のΛ残基は、アリール環、ヘテロアリール環、置換アリール環、または置換ヘテロアリール環（例えば、Ａｒがアリールまたは置換アリールである、式-ＣＨ_２－Ａｒの側鎖を有する残基）を
含む芳香族残基であってもよい。式（ＩＩ）の一部の例では、第二のΛは、ｆもしくはｙ、またはその置換バージョンである。第二のΛ残基は、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質と相互作用するように、ＧＡドメインモチーフ構造の結合表面上に構成されてもよく、例えば、図２０および２１に示すＶＥＧＦ－Ａの表面上の深いポケット内に突出する。式（ＩＩ）の一部の例では、第二のΛは、ｆまたはその置換バージョンである。式（ＩＩ）の一部の例では、第三のΛは、ヘテロアリール環または置換ヘテロアリール環を含む芳香族残基（例えば、ＶＥＧＦ－Ａと水素結合することができる側鎖基を含む芳香族残基）である。式（ＩＩ）の一部の例では、各ｊは、ｖ、ｉ、ａおよびｌから独立的に選択される。式（ＩＩ）の一部の例では、第一のｊ残基は、バリンである。式（ＩＩ）の一部の実施形態では、［らせん２］は、式：ｈｖ ｘｘΛｊｘΛｊの配列を含む。

【0086】

式（Ｉ）および（ＩＩ）の一部の実施形態では、［らせん２］は、式（ＩＩＩ）の配列を含む。
ｈ＊ｊｘｘｆ＊ｊｘｈ＊ｊ（配列番号１５１）
（ＩＩＩ）
式中、
各ｈ＊は、独立的にヒスチジンまたはその類似体であり、
ｆ＊は、フェニルアラニンまたはその類似体であり、
各ｊは、独立的に疎水性残基であり、
各ｘは、独立的にアミノ酸残基である。

【0087】

式（ＩＩＩ）の一部の実施形態では、［らせん２］は、式ｈｖｘｘｆ＊ｊｘｈ＊ｊの配列を含む。式（ＩＩＩ）の残基ｆ＊は、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質と相互作用するように、ＧＡドメインモチーフ構造の結合表面上に構成されてもよく、例えば、図２１に示すＶＥＧＦ－Ａの表面上の深いポケット内に突出する。図２０は、例示的化合物１．１．１（ｃ２１ａ）のらせん２の残基ｆ３１（フェニルアラニン、位置３１）が標識され、ＶＥＧＦ－Ａの表面上のポケット内に突出することが示されている、複合体のＸ線構造の広範な図を示す。図２１は、ＶＥＧＦ－Ａ結合界面のポケット内に突出するよう構成されるｆ３１の拡大図を示す。フェニルアラニンフェニル環の原子とＶＥＧＦ－Ａの隣接残基との間で選択された距離は、オングストローム単位で示されている。結晶構造の分析は、ｆ３１が含むものと同じ深いポケット内に突出し、一部の事例では、ＶＥＧＦ－Ａポケットとの望ましい疎水性接触を増大させるために、３らせんバンドル構造上のその位置で様々な芳香族残基が利用されうることを示す。特定の事例では、フェニルアラニン類似体は、フェニル環上に置換基を含む。式（ＩＩＩ）の一部の例では、ｆ＊はフェニルアラニンである。式（ＩＩＩ）の一部の例では、ｆ＊はフェニルアラニンの置換誘導体である。当該フェニルアラニン誘導体には、限定されないが、４－ハロゲン置換フェニルアラニン（例えば、４－クロロ、または４－フルオロ）、３－ハロゲン置換フェニルアラニン（例えば、クロロ、ブロモまたはフルオロ）、３，５－ハロゲン二置換フェニルアラニン（例えば、クロロまたはフルオロ）、３，４－ハロゲン二置換フェニルアラニン（例えば、クロロまたはフルオロ）、４－メチル置換フェニルアラニン）、４－トリフルオロメチル－フェニルアラニン、および４－エチル置換フェニルアラニンが含まれる。位置３１のフェニルアラニン類似体を含む様々な化合物が調製され、活性であることを示した。

【0088】

図２２および図２５は、ＶＥＧＦ－Ａ表面と接触する例示的化合物１．１．１（ｃ２１ａ）の残基ｈ２７（２０５）の拡大図を示す。結晶構造の分析は、様々な芳香族残基またはヒスチジン類似体が、３らせんバンドル構造上の位置２７で利用されて、ｈ２７が有するものと同じ表面ポケットと接触し、一部の事例では、ＶＥＧＦ－Ａ表面との望ましい接触を増大させることができることを示す。式（ＩＩＩ）の一部の例では、第一のｈ＊はヒスチジン、例えば、位置２７の残基である。式（ＩＩＩ）の一部の例では、第一および／または第二のｈ＊は、ヒスチジン類似体（例えば、アルキル－シクロアルキル基を含む側鎖を有する残基、例えば－アルキル－シクロペンチルもしくはアルキル－シクロヘキシル、またはその置換バージョン）である。式（ＩＩＩ）の一部の例では、第一のｈ＊は、主にＶＥＧＦと疎水性接触することができる芳香族残基である。式（ＩＩＩ）の一部の例では、第一のｈ＊はｆまたはｙである。

【0089】

図２２は、ＶＥＧＦ－Ａ表面と接触する例示的化合物１．１．１（ｃ２１ａ）の残基ｈ３４（２０７）の拡大図を示す。複合体構造の分析は、様々なヒスチジン類似体が、位置３４で耐容性があること、例えば、ＶＥＧＦ－Ａの表面上の利用可能空間を占有できる、および／またはＶＥＧＦ－Ａの隣接残基に対するよりも強い水素結合（例えば、４．６オングストローム未満の長さ）を形成できる、置換または非置換のアリール環または複素環を含む類似体に耐容性があることを示している。式（ＩＩＩ）の一部の例では、第二のｈ＊はヒスチジン、例えば、位置３４の残基である。式（ＩＩＩ）の一部の事例では、第二のｈ＊は、ＶＥＧＦと水素結合することができる芳香族残基である。式（ＩＩＩ）の一部の実施形態では、第二のｈ＊は、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリール環を含む芳香族残基（例えば、ＶＥＧＦ－Ａと水素結合することができる側鎖基を含む芳香族残基）である。

【0090】

式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、ｈ＊^２７、ｆ＊^３１、およびｈ＊^３４はそれぞれバリアント残基である。式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、ｊ^２８およびｘ^２９はそれぞれバリアント残基である。式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の特定の実施形態では、ｊ^２８、ｘ^２９およびｘ^３０はそれぞれバリアント残基である。式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の一部の例では、各ｊは、ｖ、ｉ、ａおよびｌから独立的に選択される。式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の一部の例では、第一のｊ残基は、バリンである。一部の事例では、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の７連子繰返しレジスタは、ｂ'ａ'ｇｆｅｄｃｂａである。

【0091】

式（ＩＩＩ）の一部の実施形態では、［らせん２］は、３らせんバンドルの位置２６から位置３６までの、以下のらせんモチーフによって記述される。
ｚ^２６ｈ＊ｊｘｘｆ＊ｊｘｈ＊ｊｚ^３６ （配列番号１４４）
（ＩＶ）
式中、各ｈ＊、ｆ＊、各ｊおよび各ｘは、上記に定義されるとおりであり、ｚ^２６およびｚ^３６はそれぞれ独立的にらせん末端残基である。一部の事例では、らせん末端残基は、構造のらせん状残基とはみなされず、単に［らせん２］領域の末端および回転またはループ構造の始まりを定義するに過ぎないことが理解される。ｆ＊残基および各ｈ＊残基は、ＧＡドメインモチーフ構造の結合表面上に構成されて、例えば、本明細書に記載されるように、標的ＶＥＧＦ－Ａタンパク質と特異的に接触することができる。式（ＩＶ）の一部の実施形態では、［らせん２］は、式：ｚ^２６ｈｖｘｘｆ＊ｊｘｈ＊ｊｐ^３６ （配列番号１４５）の配列を含む。

【0092】

「らせん末端残基」という用語は、類似アラニン残基に対してらせん構造を形成するための高い遊離エネルギーペナルティを有するアミノ酸残基を指す。一部の事例では、高い遊離エネルギーらせんペナルティは、らせん傾向値と呼ばれ、ＰａｃｅおよびＳｃｈｏｌｔｚの方法による定義では０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、値が高いと、ペナルティの増えることを示す（A Helix Propensity Scale Based on Experimental Studies of Peptides and Proteins, Biophysical Journal Volume 75 July 1998 422-427）。一部の事例では、らせん末端残基は、０．５以上（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、例えば、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、または０．７０以上などの、らせん傾向値を有する天然起源の残基である。例えば、表１に示すように、プロリンは、３．１６ｋｃａｌ／ｍｏｌのらせん傾向値を有し、グリシンは、１．００ｋｃａｌ／ｍｏｌのらせん傾向値を有する。非天然起源のらせん末端残基のらせん傾向値は、構造類似体である側鎖基を有する最も近い天然起源の残基の値を使用することによって推定されうる。式（ＩＶ）の一部の例では、らせん末端残基ｚ^２６およびｚ^３６は、ｄ、ｎ、Ｇおよびｐから独立的に選択される。式（ＩＶ）の一部の例では、らせん末端残基は、ｄ、Ｇ、およびｐから独立的に選択される。式（ＩＶ）の一部の例では、らせん末端残基はＧおよびｐから独立的に選択される。式（ＩＶ）の一部の例では、らせん末端残基ｚ^２６およびｚ^３６はそれぞれｐである。式（ＩＶ）の一部の例では、ｚ^３６はｐである。
天然起源のアミノ酸アルファらせん傾向

【表1】

＊遊離エネルギーの推定差は、任意にゼロとして設定されるＡｌａｎｉｎｅに対して、アルファらせん構成での残基当たりのｋｃａｌ／ｍｏｌで推定される。高い数ほど（プラス値の遊離エネルギーが大きいほど）、より好ましくない。一部の事例では、隣接残基の同一性に応じて、これらの平均値からの逸脱が可能である。

【0093】

式（ＩＶ）の特定の実施形態では、ｚ^２６は、フレームワーク残基、例えば、足場ドメインモチーフの残基に対応する残基である。式（ＩＶ）の特定の事例では、ｚ^２６はバリアント残基であり、例えば、配列番号１～２１のうち一つ以上など、足場ドメインモチーフの対応する残基とは異なる残基である。式（ＩＶ）の特定の例では、ｚ^３６はバリアント残基である。式（ＩＶ）の特定の実施形態では、ｈ＊^２７、ｆ^＊３１、およびｈ^＊３４はそれぞれバリアント残基である。式（ＩＶ）の一部の実施形態では、ｊ^２８およびｘ^２９はそれぞれバリアント残基である。式（ＩＶ）の一部の例では、ｊ^{２８、ｘ２９}、およびｘ^３０はそれぞれバリアント残基である。式（ＩＶ）の特定の実施形態では、ｈ＊^２７は、ｈ、ｙ、およびｆから選択される。式（ＩＶ）の特定の実施形態では、ｈ^＊３４は、ｈ、ｙおよびｆから選択される。

【0094】

化合物の一部の実施形態では、［らせん２］は、次式の配列によって定義される。
ｐ^２６ｈｊｊｘｆｊｈｊｐ^３７ （配列番号９３）
（Ｖ）
式中、各ｊは独立的に疎水性残基であり、各ｘはアミノ酸残基である。特定の例では、各ｊは、ａ、ｉ、ｆ、ｌおよびｖから独立的に選択される残基である。特定の事例では、各ｊは、ａ、ｉ、ｌおよびｖから独立的に選択される残基である。特定の事例では、各ｊは、ａ、ｉおよびｖから独立的に選択される残基である。式（Ｖ）の特定の事例では、ｊ^２８はｖである。式（Ｖ）の特定の例では、ｊ^２９は、ａ、ｌまたはｖである。式（Ｖ）の一部の実施形態では、ｊ^２９はｉである。式（Ｖ）の一部の例では、ｊ^３２はｉである。式（Ｖ）の特定の事例では、ｊ^３６はａである。式（Ｖ）の特定の例では、ｘ^３０は極性残基である。式（Ｖ）の一部の事例では、ｘ^３３は極性残基である。式（Ｖ）の特定の実施形態では、×^３０および×^３３は独立的に、ｄ、ｅ、ｋ、ｎ、ｒ、ｓ、ｔおよびｑから選択される。式（Ｖ）の特定の例では、ｘ^３０およびｘ^３３は独立的に、ｓおよびｎから選択される。式（Ｖ）の特定の事例では、ｘ^３０はｓである。式（Ｖ）の一部の事例では、×^３３はｎである。式（Ｖ）の一部の実施形態では、［らせん２］は、式ｐ^２６ｈｖｊｘｆｊｘｈｊｐ^３７（配列番号１３７）の配列を含む。

【0095】

化合物の一部の実施形態では、［らせん２］は、式（ＶＩ）の配列によって定義され、
ｚ^２６ｈｖｊ^２９ｘ^３０ｆｉｘ^３３ｈａｚ^３７（配列番号９４）
（ＶＩ）
式中、
ｚ^２６は、ｄ、ｐおよびＧから選択され、
ｊ^２９は、ｆおよびｉから選択され、
ｘ^３０は、ｎおよびｓから選択され、
ｘ^３３は、ｎおよびｓから選択され、
ｚ^３７は、ｐおよびＧから選択される。

【0096】

式（ＶＩ）の一部の事例では、ｚ^２６はｐである。式（ＶＩ）の一部の例では、ｊ^２９はｉである。式（ＶＩ）の特定の事例では、ｘ^３０はｓである。式（ＶＩ）の一部の実施形態では、ｘ^３３はｎである。式（ＶＩ）の一部の例では、ｚ^３７はｐである。

【0097】

化合物の一部の例では、［らせん２］は、以下から選択される配列によって定義され、
ａ） ｐｈｖｊ^２９ｘ^３０ｆｉｘ^３３ｈａｐ （ＶＩＩ）（配列番号９５）、式中、ｊ^２９はｆおよびｉから選択され、ｘ^３０およびｘ^３３は独立的に極性アミノ酸残基であり、
ｂ）ａ）で定義される式（ＶＩＩ）の配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、例えば、ａ）で定義される配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
ａ）で定義される式（ＶＩＩ）の配列の一部の例では、ｘ^３０、およびｘ^３３は、ｎ、ｓ、ｄ、ｅ、およびｋから独立的に選択される。ａ）で定義される式（ＶＩＩ）の配列の一部の例では、ｊ^２９はｉである。ａ）で定義される式（ＶＩＩ）の配列の一部の例では、ｘ^３０はｓまたはｎである。ａ）で定義される式（ＶＩＩ）の配列の一部の例では、ｘ^３３はｎである。ａ）で定義される式（ＶＩＩ）の配列の一部の例では、ｊ^２９はｉであり、ｘ^３０はｓまたはｎであり、ｘ^３３はｎである。

【0098】

化合物の一部の実施形態では、［らせん２］は、配列番号７４の配列に対して６６％以上の同一性を有し、例えば配列番号７４の配列に対して７７％以上の同一性または８８％以上の同一性を有する。

【0099】

式（Ｉ）の一部の実施形態では、［らせん３］は、次式の配列を含む。
Λｊｘｕｊｘｘｕｊ（配列番号１４６）
（ＶＩＩＩ）
式中、各「Λ」は独立的にＤ－芳香族アミノ酸であり、各ｊは独立的に疎水性残基であり、各ｕは独立的に非極性アミノ酸残基であり、各ｘは独立的にアミノ酸残基である。一部の事例では、式（ＶＩＩＩ）の７連子繰返しレジスタは、ｅｄｃｂａｇ'ｆ'ｅ'ｄ'である。式（ＶＩＩＩ）の一部の例では、Λは、ヘテロアリール環または置換ヘテロアリール環を含む芳香族残基（例えば、ＶＥＧＦ－Ａと水素結合することができる側鎖基を含む芳香族残基）である。ある特定の例では、Λはヒスチジンまたはその置換バージョンである。図２３は、例示的化合物のｈ４０（２１０）の窒素原子と、ＶＥＧＦ－Ａの隣接したＴｙｒ４８との間での中強度の水素結合（２．９オングストローム）を示す。複合体構造の分析は、利用可能空間を占有し、ＶＥＧＦ－Ａへの水素結合を保持または強化することができる類似体を含めて、様々なヒスチジン類似体が位置４０で耐容性があることを示す。式（ＶＩＩＩ）の一部の例では、各ｕは独立的に、Ｈ、低級アルキル、および置換された低級アルキルから選択される側鎖を有する非極性残基である。式（ＶＩＩＩ）の一部の例では、各ｕは、Ｇおよびａから独立的に選択される。式（ＶＩＩＩ）の一部の例では、第一のｕはＧである。式（ＶＩＩＩ）の一部の例では、第二のｕはａである。特定の例では、各ｊは、ａ、ｉ、ｆ、ｌおよびｖから独立的に選択される残基である。特定の事例では、各ｊは、ａ、ｉ、ｌおよびｖから独立的に選択される残基である。式（ＶＩＩＩ）の特定の実施形態では、ｊ^２８はｖである。式（ＶＩＩＩ）の特定の実施形態では、ｊ^２９は、ａ、ｌまたはｖである。

【0100】

式（Ｉ）または（ＶＩＩＩ）の一部の実施形態では、［らせん３］は式（ＩＸ）の配列を含む。
ｘ^３８ｘｈ＊ｊｘｕｊｘｘｕｊｘ^４９（配列番号９６）
（ＩＸ）
式中、ｊ、ｘ、ｕは上記で定義されるとおりであり、ｈ＊はヒスチジンまたはその類似体である。一部の事例では、式（ＩＸ）の７連子繰返しレジスタは、ｇｆｅｄｃｂａｇ'ｆ'ｅ'ｄ'ｃ'である。式（ＩＸ）の一部の例では、ｈ＊はヒスチジンである。式（ＩＸ）の
一部の例では、ｈ＊は、ヒスチジン類似体（例えば、アルキル－シクロアルキル基を含む側鎖を有する残基、例えば－アルキル－シクロペンチルもしくはアルキル－シクロヘキシル、またはその置換バージョン）である。式（ＩＸ）の一部の例では、ｈ＊は置換ヒスチジンである。式（ＸＩ）の一部の例では、ｕ^４３はＧである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｕ^４７はａである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｘ^３８はｖである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｘ^３９はｓである。式（ＩＸ）の特定の例では、各ｊは、ａ、ｉ、ｆ、ｌおよびｖから独立的に選択される残基である。式（ＩＸ）の特定の実施形態では、ｊ^４１は、ｖである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｊ^４４は、ｌである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｊ^４８はｉである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｘ^５１は疎水性残基である。式（ＩＸ）の一部の例では、ｘ^５１はａである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｘ^４２はｎである。式（ＩＸ）の一部の例では、×^４５は、ｋまたはｒである。式（ＩＸ）の一部の例では、×^４５はｋである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｘ^４６はｎである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｘ^４９はｌである。式（ＩＸ）の一部の例では、らせん３は、残基のＣ末端配列でキャップされる。ある特定の例では、式（ＩＸ）のらせん３は、追加的な残基×^５０×^{５１を含み}、ｘはアミノ酸残基である。一部の事例では、ｘ^５０はｋまたはｒである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｘ^５０はｋであり、ｘ^５１はａである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｘ^５０はｅであり、ｘ^５１はｄである。式（ＩＸ）の一部の例では、ｘ^５０はＧであり、ｘ^５１はｒである。特定の例では、式（ＩＸ）のらせん３は、配列番号８５～８７のうち一つから選択されたＣ末端領域を含む。一部の事例では、［らせん３］は、ｇｆｅｄｃｂａｇ'ｆ'ｅ'ｄ'ｃ'ｂ'ａ'の７連子繰返しレジスタを含む。様々な切断（例えば、
１個、２個または３個の残基の切断）および伸長（例えば、１個、２個、３個、またはそれ以上の残基の伸長）は、例えば、図９Ｂに示すように、３らせんバンドル構造またはバリアントドメインを著しく破壊することなく、［らせん３］のＣ末端で使用されうることが理解される。

【0101】

式（ＩＸ）の一部の例では、［らせん３］は、以下から選択される配列によって定義される。
ａ） ｘ^３８ｘ^３９ｈｖｘ^４２Ｇｌｘ^４５ｘ^４６ａｉｘ^４９ （Ｘ） （配列番号９７）であって、式中、ｘ^３８は、ｖ、ｅ、ｋ、ｒから選択され、ｘ^３９、ｘ^４２およびｘ^４６は、極性アミノ酸残基から独立的に選択され、ｘ^４５およびｘ^４９は、ｌ、ｋ、ｒおよびｅから独立的に選択されるもの、および
ｂ）ａ）で定義される式（Ｘ）の配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、例えば、ａ）で定義される配列に対して８３％以上の同一性または９１％以上の同一性を有するアミノ酸配列。

【0102】

式（ＩＸ）の一部の例では、［らせん３］は、以下から選択される配列によって定義される。
ａ） ｘ^３８ｘ^３９ｈｖｘ^４２Ｇｌｘ^４５ｘ^４６ａｉｘ^４９ｘ^５０ａ（ＸＩ） （配列番号９８）であって、式中、ｘ^３８は、ｖ、ｅ、ｋ、ｒから選択され、ｘ^３９、ｘ^４２、ｘ^４６およびｘ^５０は、極性アミノ酸残基から独立的に選択され、ｘ^４５およびｘ^４９は、ｌ、ｋ、ｒおよびｅから独立的に選択されるもの、および
ｂ） ａ）で定義される式（ＸＩ）の配列に対して７８％以上の同一性を有するアミノ酸配列、例えば、ａ）で定義される配列に対して８５％以上の同一性、または９２％以上の同一性を有するアミノ酸配列。

【0103】

式（Ｘ）～（ＸＩ）の一部の例では、ｘ^３９、ｘ^４２、ｘ^４６、およびｘ^５０は、ｎ、ｓ、ｄ、ｅ、およびｋから独立的に選択される。式（Ｘ）～（ＸＩ）の一部の例では、ｘ^３８はｖである。式（Ｘ）～（ＸＩ）の一部の例では、ｘ^４５はｋである。式（Ｘ）～（ＸＩ）の一部の例では、ｘ^４９はｌである。式（Ｘ）～（ＸＩ）の一部の例では、ｘ^３９はｓである。式（Ｘ）～（ＸＩ）の一部の例では、ｘ^４２はｎである。式（Ｘ）～（ＸＩ）の一部の例では、ｘ^４６はｎである。式（ＸＩ）の一部の例では、ｘ^５０はｋである。

【0104】

化合物の一部の実施形態では、［らせん３］は、配列番号７９の配列に対して６５％以上の同一性を有し、例えば配列番号７９の配列に対して、７５％以上の同一性、８３％以上の同一性、または９１％以上の同一性を有する。化合物の一部の実施形態では、［らせん３］は、配列番号８２の配列に対して７０％以上の同一性を有し、例えば配列番号８２の配列に対して、７８％以上の同一性、８５％以上の同一性、または９２％以上の同一性を有する。

【0105】

式（Ｉ）では、［リンカー２］は、［らせん２］と［らせん３］を結合し、ＶＥＧＦ－Ａの表面と随意に追加的に接触させることができるペプチドリンカーである。［リンカー２］は任意の好都合な長さとすることができる。一部の事例では、［リンカー２］は、［リンカー１］よりも短いリンカーである。［らせん２］に隣接する［リンカー２］のＮ末端残基は、例えば本明細書に記載されるように、らせん末端残基とみなすことができる。一部の事例では、［らせん３］に隣接する［リンカー２］のＣ末端残基は、例えば本明細書に記載されるように、らせん末端残基とみなすことができる。一部の事例では、［リンカー２］は、例えば３以下または２以下など、４以下のアミノ酸残基を含みうる。一部の実例では、［リンカー２］は、未変性ＧＡ足場ドメインの対応するらせん接続ループ領域と同じ数の残基を有する。式（Ｉ）の特定の実施形態では、［リンカー２］は、ｚｘであり、式中、ｚは、らせん２末端残基であり、ｘは、アミノ酸残基である。［リンカー２］の一部の例では、ｚはｐまたはＧである。［リンカー２］の一部の例では、ｚはｐである。［リンカー２］の一部の例では、ｘはＶＥＧＦ－Ａ接触残基である。［リンカー２］の一部の例では、ｘは芳香族残基である。［リンカー２］の一部の例では、ｘは、ｗ残基もしくはｈ残基、またはその置換バージョンである。［リンカー２］の一部の例では、ｘはチロシンまたはその類似体である。特定の例では、［リンカー２］は、例えば、本明細書に記載されるように、修飾されたらせん２かららせん３のらせん間角度（すなわち、らせんの軸間の角度）を提供する、らせん末端プロリン残基を含む。図２７を参照。

【0106】

チロシン類似体は、リンカー２の位置３７に組み込まれてもよく、例えば、ＶＥＧＦ－Ａの隣接残基とより緊密な接触（例えば、疎水性接触および／または水素結合）をすることができる置換または非置換のアルキル－アリールまたはアルキル－ヘテロアリール伸長側鎖基を含む類似体が組み込まれてもよい。図２３は、化合物（１．１．１（ｃ２１ａ））とＶＥＧＦ－Ａとの間の結合界面を描写し、ＶＥＧＦ－Ａ表面に向かって突出する残基ｙ３７（２０９）のフェノール酸素が、隣接するＶＥＧＦ－Ａ残基から６．５～７．２オングストローム離れていることを示す。一部の事例では、ｘは、次式の側鎖を有するチロシン類似体である。－（ＣＨ_２）_ｎ－Ａｒ、式中、ｎは１、２、３、または４であり、Ａｒはアリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールである。ｘの特定の例では、Ａｒは置換フェニルである。ｘの特定の例では、Ａｒは置換フェニルであり、ｎは２または３である。ｘの特定の例では、Ａｒは、ＶＥＧＦ－Ａの隣接残基に水素結合するように構成された、水素結合ドナーまたは受容体含有基で置換されたフェニルである。

【0107】

式（Ｉ）の一部の実施形態では、［らせん２］－［リンカー２］－［らせん３］は、ＶＥＧＦ－Ａ結合表面を画定する式（ＸＩＩ）の配列を含む。
ｚ^２６ｈ＊ｊｘｘｆ＊ｊｘｈ＊ｊｚｙ＊ｘｘｈ＊ｊｘｕｊｘｘｕｊｘ^４９（配列番号９９）
（ＸＩＩ）
式中、
各ｚは、らせん末端残基であり、
ｙ＊は、チロシンまたはその類似体であり、
各ｈ＊は、独立的にヒスチジンまたはその類似体であり、
ｆ＊は、フェニルアラニンまたはその類似体であり、
各ｕは独立的に、非極性残基である。
各ｊは、独立的に疎水性残基であり、
各ｘは、独立的にアミノ酸残基である。

【0108】

特定の例では、式（ＸＩＩ）のらせん３は、追加的な残基×^５０×^５１を含み、ｘはアミノ酸残基である。一部の事例では、ｘ^５０はｋまたはｒである。拡張式（ＸＩＩ）の一部の例では、ｘ^５０はｋであり、ｘ^５１はａである。拡張式（ＸＩＩ）の一部の事例では、ｘ^５０はｅであり、ｘ^５１はｄである。式（ＸＩＩ）の特定の例では、ｘ^５０はＧであり、ｘ^５１はｒである。特定の例では、式（ＸＩＩ）のらせん３は、配列番号８５～８７のうち一つから選択されたＣ末端領域を含む。拡張式（ＸＩＩ）の一部の実施形態では、ｘ^５１はフレームワーク残基である。拡張式（ＸＩＩ）の一部の実施形態では、ｘ^５１は、非極性残基（ｕ）である。拡張式（ＸＩＩ）の一部の実施形態では、ｘ^５１は疎水性残基である。

【0109】

化合物の一部の実施形態では、［らせん２］－［リンカー ２］－［らせん３］は、配列番号８０の配列に対して７０％以上の同一性を有する。例えば、配列番号８０の配列に対して、７５％以上の同一性、８３％以上の同一性、８７％以上の同一性、９１％以上の同一性、または９５％以上の同一性を有する。化合物の一部の実施形態では、［らせん２］－［リンカー２］－［らせん３］は、配列番号８３の配列に対して７０％以上の同一性を有し、例えば、配列番号８３の配列に対して８０％以上の同一性、８４％以上の同一性、８８％以上の同一性、９２％以上の同一性、または９６％以上の同一性を有する。

【0110】

式（Ｉ）の特定の例では、［リンカー１］は式の配列を含む。
ｚ（ｘ）_ｎｘ’ｚ（配列番号１４７）
（ＸＩＩＩ）
式中、ｘ’は極性残基であり、各ｘはアミノ酸であり、ｎは１～６の整数であり、各ｚは独立的に、らせん末端残基であり、例えば、第一のｚは、らせん１－末端残基であり、第二のｚは、らせん２－末端残基である。特定の例では、ｘ’は、ＶＥＧＦ－Ａに水素結合することができる極性残基である。一部の事例では、ｘ’は、ｄ、ｅ、ｎ、ｑ、オルニチン、２－アミノ－３－グアニジノプロピオン酸、およびシトルリンから選択される。特定の事例では、ｎは１、２または３である。式（ＸＩＩＩ）の特定の例では、［リンカー１］は式（ＸＩＶ）の配列を有し、
ｚ（ｘ）_ｎｅ＊ｚ（配列番号１４８）
（ＸＩＶ）
式中、各ｘはアミノ酸であり、ｎは１、２、３であり、各ｚは、独立的にらせん末端残基であり、ｅ＊は、グルタミン酸またはその類似体である。式（ＸＩＩＩ）および（ＸＩＶ）のの一部の例では、各ｚは、Ｇおよびｐから選択される。式（ＸＩＩＩ）および（ＸＩＶ）の一部の例では、ｎは２である。

【0111】

式（Ｉ）の特定の例では、［リンカー１］－［らせん２］－［リンカー２］－［らせん３］は、次式の配列を含む。
ｚ^２２ｘｘｅ＊ｚｈ＊ｊｘｘｆ＊ｊｘｈ＊ｊｚｙ＊ｘｘｈ＊ｊｘｕｊｘｘｕｊｘｘｘ^５１（配列番号１００）
（ＸＶ）
式中、
ｅ＊は、グルタミン酸またはその類似体であり、
各ｚは、独立的に、らせん末端残基であり、
ｙ＊は、チロシンまたはその類似体であり、
各ｊは、独立的に疎水性残基であり、
各ｕは、独立的に非極性アミノ酸残基であり、
各ｘは、独立的にアミノ酸残基である。
式（Ｉ）、（ＸＩＩ）および（ＸＶ）の一部の例では、［らせん２］は式（ＸＶＩ）の配列によって定義される：
ｚ^２６ｈｊ^２８ｘｘｆｊ^３２ｘｈｊ^３５ｚ^３６ （配列番号１０１）
（ＸＶＩ）
式中、
ｚ^２６は、ｄ、ｐおよびＧから選択され、
ｚ^３６は、ｐおよびＧから選択され、
ｊ^２８、ｊ^３２およびｊ^３５は、それぞれ独立的に疎水性残基であり、
各ｘは、独立的にアミノ酸残基である。
特定の例では、ｊ^２８、ｊ^３２、およびｊ^３５は、配列番号１～２１から選択されるＧＡ足場ドメインの対応する残基である。一部の事例では、ｊ^２８、ｊ^３２、およびｊ^３５は、ａ、ｉ、ｌ、およびｖから独立的に選択される。

【0112】

式（Ｉ）、（ＸＩＩ）、（ＸＶ）、および（ＸＶＩ）の一部の例では、［らせん２］は、ａ）ｐｈｖｘ^２９ｘ^３０ｆｉｘ^３３ｈａｐ（ＸＶＩＩ）（配列番号１０２）から選択される配列によって定義される。
式中、ｘ^２９は、ｆおよびｉから選択され、ｘ^３０およびｘ^３３は、極性アミノ酸残基から独立的に選択され、
ｂ）ａ）で定義される式（ＸＶＩＩ）の配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列（例えば、９０％以上の同一性）。

【0113】

式（ＸＶＩ）－（ＸＶＩＩ）の一部の例では、ｘ^３０およびｘ^３３は、ｎ、ｓ、ｄ、ｅおよびｋから独立的に選択される。式（ＸＶＩ）－（ＸＶＩＩ）の一部の例では、ｘ^２９はｉである。式（ＸＶＩ）－（ＸＶＩＩ）の一部の例では、ｘ^３０はｓまたはｎである。式（ＸＶＩ）－（ＸＶＩＩ）の一部の例では、ｘ^３３はｎである。式（ＸＶＩ）～（ＸＶＩＩ）の一部の例では、ｘ^２９はｉであり、ｘ^３０はｓまたはｎであり、ｘ^３３はｎである。

【0114】

式（Ｉ）、（ＸＩＩ）および（ＸＶ）の一部の例では、［らせん３］は式（ＸＶＩＩＩ）の配列によって定義される：
ｘｘｈｊ^４１ｘｕｊ^４４ｘｘｕｊ^４８ｘｘｘ^５１（配列番号１０３）
（ＸＶＩＩＩ）
式中、
ｊ^４１、ｊ^４４、およびｊ^４８は、それぞれ独立的に疎水性残基であり、
各ｕは、独立的に非極性アミノ酸残基であり、
各ｘは、独立的にアミノ酸残基である。

【0115】

一部の事例では、ｘ^５０はｋまたはｒである。式（ＸＶＩＩＩ）の一部の例では、ｘ^５０はｋであり、ｘ^５１はａである。式（ＸＶＩＩＩ）の一部の例では、ｘ^５０はｅであり、ｘ^５１はｄである。式（ＸＶＩＩＩ）の一部の例では、ｘ^５０はＧであり、ｘ^５１はｒである。特定の例では、式（ＸＶＩＩＩ）のらせん３は、配列番号８５～８７の一つから選択されるＣ末端領域を含む。式（ＸＶＩＩＩ）の一部の実施形態では、ｘ^５１は、フレームワーク残基である。式（ＸＶＩＩＩ）の一部の実施形態では、ｘ^５１は、非極性残基（ｕ）である。式（ＸＶＩＩＩ）の一部の実施形態では、ｘ^５１は疎水性残基である。式（ＸＶＩＩＩ）の一部の実施形態では、ｊ^{４１、ｊ４４}およびｊ^４８は、ａ、ｉ、ｌおよびｖから独立的に選択される。式（ＸＶＩＩＩ）の一部の実施形態では、ｊ^４１、ｊ^４４およびｊ^４８は、配列番号１～２１から選択されるＧＡ足場ドメインの対応する残基である。

【0116】

式（Ｉ）、（ＸＩＩ）、および（ＸＶ）の一部の例では、［らせん３］は、 ｘ^３８ｘ^３９ｈｖｘ^４２Ｇｌｘ^４５ｘ^４６ａｉｘ^４９ｘ^５０ａ （ＸＩＸ）（配列番号１０４）から選択される配列によって定義される。
式中、
ｘ^３８は、ｖ、ｅ、ｋ、ｒから選択され、
ｘ^３９、ｘ^４２、ｘ^４６、およびｘ^５０は、極性アミノ酸残基から独立的に選択され、
ｘ^４５およびｘ^４９は、ｌ、ｋ、ｒおよびｅから独立的に選択され、
ｂ）ａ）で定義される式（ＸＩＸ）の配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列（例えば、９０％以上の同一性）。

【0117】

式（ＸＩＸ）の一部の例では、×^３９、×^４２、×^４６および×^５０は、ｎ、ｓ、ｄ、ｅおよびｋから独立的に選択される。式（ＸＩＸ）の一部の例では、ｘ^３８はｖである。式（ＸＩＸ）の一部の例では、ｘ^４５はｋである。式（ＸＩＸ）の一部の例では、ｘ^４９はｌである。式（ＸＩＸ）の一部の例では、ｘ^３９はｓである。式（ＸＩＸ）の一部の例では、ｘ^４２はｎである。式（ＸＩＸ）の一部の例では、ｘ^４６はｎである。式（ＸＩＸ）の一部の例では、ｘ^５０はｋである。

【0118】

特定の事例では、［らせん１］は、ｌ^７．．ａ^１０ｋｅ．ａｉ．ｅｌｋ．．^２１のコンセンサス配列を含み、ここで、位置８、９、１３、１６、２０および２１の残基は、表３のＧＡドメイン配列の対応する残基のいずれか一つによって定義される。特定の事例では、［らせん１］は、ｌ^６ｌｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋ^２０の配列に対して、６６％以上の同一性、例えば、７３％以上、８０％以上、８６％以上、または９３％以上の同一性を有する１５残基の配列からなる。

【0119】

化合物の一部の実施形態では、［リンカー１］－［らせん２］－［リンカー２］－［らせん３］は、配列番号８１の配列に対して７０％以上の同一性を有し、例えば、配列番号８１の配列に対して、７８％以上の同一性、８２％以上の同一性、８５％以上の同一性、８９％以上の同一性、９２％以上の同一性、または９６％以上の同一性を有する。化合物の一部の実施形態では、［リンカー１］－［らせん２］－［リンカー２］－［らせん３］は、配列番号８４の配列に対して７０％以上の同一性を有し、例えば、配列番号８４の配列に対して８０％以上の同一性、８３％以上の同一性、８６％以上の同一性、９０％以上の同一性、９３％以上の同一性、または９６％以上の同一性を有する。

【0120】

当該ＧＡドメインの任意の好都合なＮ末端アルファらせんセグメントを、当該化合物での使用に適合させることができる。一部の事例では、［らせん１］は、およそ位置６からおよそ位置２０までのＮ末端残基の配列を含む。図１８Ｂは、３らせんバンドルを安定化させる化合物の分子内疎水性接触に著しい悪影響を及ぼすことなく、残基１～５が化合物から除去されうる、例示的化合物のＮ末端切断誘導体を示す。特定の場合、当該化合物は、本明細書に記載される番号付けシステム１～５３と比較して、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個の残基など、６個以下の残基によってＮ末端で切断される。特定の例では、当該化合物の位置１～５の残基のうちの一つ以上は、欠失または修飾のいずれかであり、例えば、らせんキャッピング、水溶性の増加、または当該分子（例えば、本明細書に記載されるように）への連結などの、得られた化合物に望ましい特性を付与する。

【0121】

特定の事例では、［らせん１］は、ｌ^７．．ａ^１０ｋｅ．ａｉ．ｅｌｋ．．^{． ２１} （配列番号１０５）のコンセンサス配列を含み、ここで、位置８、９、１３、１６、２０および２１の残基は、配列番号２－２１の配列の対応する残基のいずれか一つによって定義される。特定の事例では、［らせん１］は、ｌ^６ｌｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋ^２０（配列番号７４）の配列に対して、６６％以上の同一性、例えば、７３％以上、８０％以上、８６％以上、または９３％以上の同一性を有する１５残基の配列からなる。

【0122】

本明細書では、ペプチド性フレームワーク残基の基礎となる配列に含まれるバリアントアミノ酸残基の構成によって定義される、ＶＥＧＦ特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）を有するＤ－ペプチド性ＧＡドメインが記載されている。本開示に基づいて、任意のＳＤＭおよびペプチド性フレームワーク残基／配列のバリエーションもまた、本開示によって包含されることが理解される。一部の実施形態では、ＧＡドメインは、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、例えば７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の同一性を、本明細書に定義されるＳＤＭ残基および／またはペプチド性フレームワーク残基の実施形態のいずれか一つと共に有するＶＥＧＦ ＳＤＭを含む。一部の実施形態では、ＧＡドメインは、本明細書に定義されるＳＤＭ残基および／またはペプチド性フレームワーク残基の実施形態のうちのいずれか一つに対して１～５個の、例えば、１～４個、または１～３個のアミノ酸残基置換（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個の置換）を有するＶＥＧＦ ＳＤＭを含む。特定の実施形態では、１～３個のアミノ酸残基置換は、表６に従って、類似、保存的、または高度に保存されたアミノ酸残基置換から選択される。

【0123】

ＶＥＧＦに特異的に結合するＤ－ペプチド性化合物の一部の実施形態では、Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインは、以下のアミノ酸残基によって定義されるＶＥＧＦ特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）を含み、
ｅ^２５ｐｈｖｉｓｆ－－ｈ^３４－ｐ^３６ｘ^３７－ｓ^３９ｈ －－Ｇ^４３－－－ａ^４７
（配列番号１４９）
式中、ｘ^３７は、ｓ、ｎ、およびｙから選択される。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^３７はｓである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^３７はｎである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^３７はｙである。

【0124】

一部の実施形態では、ＶＥＧＦ ＳＤＭは、以下の残基によってさらに定義される。
ｃ^７－－－－－－－－－－－－－－－－－ｅ^２５ｐｈｖｉｓｆ－－ｈ^３４－ｐ^３６ｘ^３７ｃ^３８ｓｈ －－Ｇ^４３－－－ａ^４７（配列番号１５０）
式中、ｘ^３７は、ｓおよびｎから選択される。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^３７はｓである。ＶＥＧＦ ＳＤＭの一部の実施形態では、ｘ^３７はｎである。

【0125】

ＧＡドメインの一部の実施形態では、らせん１^{（＃６－２１）}は、ペプチド性フレームワーク配列：ｘ^６ｘ^７ｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋａ^２１（配列番号１３８）を含む。
式中、ｘ^６は、ｌ、ｖ、およびｉから選択され、ｘ^７は、ｌおよびｃから選択される。

【0126】

らせん１の一部の実施形態では、ｘ^６はｌである。らせん１の一部の実施形態では、ｘ^６はｖである。らせん１の一部の実施形態では、ｘ^６はｉである。

【0127】

一部の実施形態では、ＧＡドメインは、以下のＮ末端ペプチド性フレームワーク配列を含む。
ｘ^１ｘ^２ｘ^３ｑｗｘ^６ｘ^７ｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋａＧｉｔ^２４（配列番号１３９）
式中、
ｘ^１は、ｔ、ｙ、ｆ、ｉ、ｉ、ｐおよびｒから選択され、
ｘ^２は、ｉ、ｈ、ｎ、ｐ、およびｓから選択され、
ｘ^３は、ｄ、ｉ、およびｖから選択され、
ｘ^６は、ｌ、ｖ、およびｉから選択され、および
ｘ^７は、ｌおよびｃから選択される。

【0128】

ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^１はｔである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^１はｙである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^１はｆである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^１はｉである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^１はｐである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^１はｒである。

【0129】

ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^２はｉである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^２はｈである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^２はｎである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^２はｐである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^２はｓである。

【0130】

ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^３はｄである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^３はｉである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^３はｖである。

【0131】

ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^６はｌである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^６はｖである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^６はｉである。

【0132】

ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^７はｌである。ペプチド性フレームワーク配列の一部の実施形態では、ｘ^７はｃである。

【0133】

一部の実施形態では、Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインは、Ｃ末端のペプチド性フレームワーク配列：ｉｌｋａｈａ（配列番号１４０）を含む。

【0134】

一部の実施形態では、Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインは、以下の配列を含む。
ｘ^１ｘ^２ｘ^３ｑｗｘ^６ｘ^７ｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋａｇｉｔｅｐｈｖｉｓｆｉｎｈａｐｘ^３７ｘ^３８ｓｈｖｎＧｌｋｎａｉｌｋａｈａ^５３（配列番号１４１）
式中、
ｘ^１は、ｔ、ｙ、ｆ、ｉ、ｉ、ｐおよびｒから選択され、
ｘ^２は、ｉ、ｈ、ｎ、ｐ、およびｓから選択され、
ｘ^３は、ｄ、ｉ、およびｖから選択され、
ｘ^６は、ｌ、ｖ、およびｉから選択され、
ｘ^７は、ｌおよびｃから選択され、
ｘ^３７は、ｔ、ｙ、ｎ、およびｓから選択され、
ｘ^３８は、ｖおよびｃから選択され、
ｘ^３９は、ｅおよびｓから選択され、
ｘ^４０は、ｈおよびｅから選択され、
ｘ^４３は、ｇおよびａから選択され、
ｘ^４７は、ａおよびｅから選択される。
一部の実施形態では、ｘ^１はｔである。一部の実施形態では、ｘ^１はｙである。一部の実施形態では、ｘ^１はｆである。一部の実施形態では、ｘ^１はｉである。一部の実施形態では、ｘ^１はｐである。一部の実施形態では、ｘ^１はｒである。一部の実施形態では、ｘ^２はｉである。一部の実施形態では、ｘ^２はｈである。一部の実施形態では、ｘ^２はｎである。一部の実施形態では、ｘ^２はｐである。一部の実施形態では、ｘ^２はｓである。一部の実施形態では、ｘ^３はｄである。一部の実施形態では、ｘ^３はｉである。一部の実施形態では、ｘ^３はｖである。一部の実施形態では、ｘ^６はｌである。一部の実施形態では、ｘ^６はｖである。一部の実施形態では、ｘ^６はｉである。一部の実施形態では、ｘ^７はｌである。一部の実施形態では、ｘ^７はｃである。一部の実施形態では、ｘ^３７はｔである。一部の実施形態では、ｘ^３７はｙである。一部の実施形態では、ｘ^３７はｎである。一部の実施形態では、ｘ^３７はｓである。一部の実施形態では、ｘ^３８はｖである。一部の実施形態では、ｘ^３８はｃである。一部の実施形態では、ｘ^３９はｅである。一部の実施形態では、ｘ^３９はｓである。一部の実施形態では、ｘ^４０はｈである。一部の実施形態では、ｘ^４０はｅである。一部の実施形態では、ｘ^４３はｇである。一部の実施形態では、ｘ^４３はａである。一部の実施形態では、ｘ^４７はａである。一部の実施形態では、ｘ^４７はｅである。

【0135】

一部の実施形態では、Ｄ－ペプチド性化合物は、化合物１１０５５、９７９１０２、および９７９１０７－９７９１１０（配列番号１０８～１１３）のうちの一つから選択される配列を含む。

【0136】

一部の実施形態では、Ｄ－ペプチド性化合物は、化合物１１０５５、９７９１０２、および９７９１０７－９７９１１０（配列番号１０８～１１３）のうちの一つと８０％以上（例えば、９０％以上）の同一性を有する配列を含む。

【0137】

一部の実施形態では、Ｄ－ペプチド性化合物は、化合物１１０５５、９７９１０２および９７９１０７－９７９１１０（配列番号１０８～１１３）のうちの一つに対する、１～１０個のアミノ酸残基置換（例えば、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個であって、１個または２個などのアミノ酸残基置換）を有する配列を含む。特定の実施形態では、１～１０個のアミノ酸残基置換は、例えば、表６に従って、類似の保存的で高度に保存されたアミノ酸残基置換から選択される。

【0138】

ＧＡ足場ドメイン
本開示に基づいて、構造物のＶＥＧＦ－Ａ結合表面に位置していないＧＡドメインモチーフのアミノ酸残基のいくつかは、結果として生じる修飾化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合活性に有害な影響を与えることなく、修飾されうることが理解される。したがって、任意の好都合なアミノ酸を当該化合物に組み込み、所望の特性を付与することができ、これには、限定されないが、水溶性の増大、化学合成の容易さ、コスト、生体共役反応部位、安定性、ｐＩ、凝集、非特異的結合の減少、および／または第二の標的タンパク質への特異的結合が含まれる。変異の位置は、ＶＥＧＦ－Ａ結合ＧＡドメインモチーフの構造への任意の破壊、または標的ＶＥＧＦ－Ａタンパク質への特異的結合を最小化するように、例えば、ＶＥＧＦ－Ａ結合表面から構造の対向する側上の位置を選択することによって、選択されうる。一部の実例では、化合物は、標的ＶＥＧＦ－Ａタンパク質への結合表面の一部ではない位置で、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上など、２個以上の表面変異を含む。

【0139】

例えば、一部の事例では、らせん１のｃ残基、ｆ残基、およびｂ残基、ならびにらせん２および３のｃ残基、およびｆ残基のうちの一つ以上は、これらの残基がＶＥＧＦ－Ａ結合および溶媒曝露に直接関与しないため、修飾することができる（図３Ｂの７連子モデルを参照）。特定の事例では、バリアントアミノ酸残基は、例えば、既知の天然起源タンパク質における、類似位置での既知のアミノ酸の発生率に従って、特定の７連子繰返し位置で当該化合物に組み込むために選択されうる。表２は、バリアントアミノ酸残基、例えば、５％以上、１０％以上、またはさらにそれ以上など、２％以上の発生率を有するアミノ酸残基を選択するために利用されうる、三本鎖コイルドコイルの７連子位置に対するアミノ酸発生率のリストを提供する。一部の事例では、表面変異は、残基を極性残基に変異させること、例えば、化合物に望ましい溶解性を付与するものを含む。一部の事例では、表面変異は、残基を荷電残基に変異させること、例えば、化合物に望ましい溶解性を付与するものを含む。一部の事例では、表面変異は、残基を塩基性残基（例えば、ｋまたはｈ）に変異させることを含む。一部の事例では、表面変異は、残基を酸性残基（例えば、ｄまたはｅ）に変異させること、例えば、化合物に望ましいｐＩを付与するものを含む。
三本鎖コイルドコイルの７連子位置でのアミノ酸発生率＊

【表2】

＊ Ｍは、特定のアミノ酸が７連子位置で発見された総回数である。Ｎは、その７連子位置でカウントされる残基の総数である。ＤｅＧｒａｄ ｅｔ ａｌ．の表３を参照。

【0140】

一部の事例では、当該ペプチド性化合物は、ＧＡ足場ドメインに基づいてファージディスプレイライブラリから選択され、（例えば、追加的な親和性成熟および／または点変異を介して）ＧＡ足場ドメインと統合されたいくつかのバリアントアミノ酸を含むように、さらに開発される。バリアントモチーフは、バリアントアミノ酸を含み、当該化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合表面を画定することができる。配列番号２５は、例示的化合物１．１．１（ｃ２１ａ）のバリアントモチーフを示す。当該化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合表面の態様は、上記に記載されている。バリアントドメインが組み込まれる３らせんバンドル足場構造を提供するために、様々な基礎となるＧＡ足場ドメイン配列が当該化合物において利用されうることが理解される。当該化合物の構造は、バリアントドメインとフレームワークドメインの組み合わせによって画定されうる。当該化合物の配列は、バリアント残基とフレームワーク残基の組み合わせによって画定されうる。したがって、一部の例では、構造または配列モチーフのフレームワーク残基は、足場ドメイン構造または配列の対応する残基によって画定されうる。

【0141】

例えば、足場ＳＣＦ３２（配列番号２）および化合物１．１．１（ｃ２１ａ）（配列番号２４）の比較によって、バリアントモチーフ（配列番号２５）およびフレームワークドメイン（配列番号２６）がもたらされる。バリアントモチーフの態様を本明細書に記載する。様々な修飾が、３らせんバンドル構造またはＶＥＧＦ－Ａ結合表面に有意な悪影響を及ぼすことなく、フレームワークドメインに組み込まれうることが理解される。図３および図４は、当該化合物の７連子繰返し構造モデル上の例示的な配列およびモチーフのアライメントを示す。溶媒曝露され、疎水性コア相互作用に関与しないらせん１の残基は、限定されないが、極性残基を含む任意の好都合なアミノ酸残基でもよい。一部の事例では、当該化合物のらせん１のｂ残基、ｃ残基、および／またはｆ残基（例えば、図６Ｂ参照）は、化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合活性に悪影響を及ぼすことなく変化させることができ、特定の事例では、望ましい特性を提供する。一部の事例では、らせん１のｅ残基およびｇ残基も変化させることができる。特定の実施形態では、らせん２および／またはらせん３のｆ残基は、化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合活性に悪影響を及ぼすことなく変化させることができ、特定の事例では、望ましい特性を提供する。特定の例では、切断または伸長などのＣ末端修飾が、らせん３に含まれてもよい（例えば、らせん３の位置５０～５３に位置する残基で、図１０Ａを参照）。当該化合物は、配列番号２～２１のうち一つによって定義されるフレームワークドメインモチーフを有しうる。一部の事例では、化合物のフレームワークドメインモチーフは、配列番号１により画定される。

【0142】

一部の事例では、ＧＡ足場ドメインの疎水性コア（例えば、図７Ｂに示した７連子繰返しモデルのａ残基およびｄ残基）の修飾は、これらの残基が、３らせんバンドルを安定化させる、らせん‐らせん疎水性接触に関与するため、あまり望ましくない。しかしながら、様々な非極性残基または疎水性残基には、当該化合物の３らせんバンドルの疎水性コアでの用途を見出すことができる。図９Ａ－９Ｃは、例示的化合物の配列および構造を示しており、らせん間疎水性相互作用を形成することができる、７連子繰返しモデルのａ残基およびｄ残基の構成は、赤色で示されている。特定の例では、らせん領域の末端に位置するらせん３の７連子繰返しのＣ末端ｅ残基は、例えば、らせんキャッピング、らせん切断、または連結基への伸長を提供するために修飾されうる。特定の例では、らせん領域の末端に位置する、１個、２個またはそれ以上のらせん１の７連子繰返し（例えば、図１０ＡのＮ末端残基）は、例えば、らせんキャッピング、らせん切断、または連結基への伸長を提供するために修飾されてもよい。特定の実施形態では、当該化合物のａ残基およびｄ残基は、配列番号１～２１のいずれかの対応する疎水性コアから選択されてもよい。

【0143】

特定の例では、［らせん２］のａおよびｄ残基はそれぞれ、当該化合物の修飾された３らせんバンドル構造に安定性を付与することができる残基である。特定の事例では、当該化合物のａ残基およびｄ残基のうちの一つ以上、例えば、［らせん２］の位置２８、３２および３５で、部分的に化合物の疎水性コアを画定する分子内接触を提供する。［らせん２］の特定の実施形態では、各ａおよびｄ残基は、独立的に疎水性残基である。［らせん２］の特定の事例では、各ａおよびｄ残基は、ａ、ｉ、ｆ、ｍ、ｌおよびｖから選択される。［らせん２］の一部の実施形態では、各ａおよびｄ残基は、ａ、ｉ、ｆ、ｌおよびｖから選択される。［らせん２］の特定の例では、各ａおよびｄ残基は、ａ、ｉ、ｌおよびｖから選択される。［らせん２］の一部の例では、位置３２および３５でのａおよびｄ残基は、足場ドメインの一部である（例えば、足場ドメインモチーフの対応する残基と同じ同一性を有するフレームワーク残基）。

【0144】

特定の例では、ＶＥＧＦ－Ａと接触する構造のｇ－ｇ面に最も近い［らせん２］および［らせん３］の「ｄ」残基は、タンパク質と接触することができる。このような場合、ＶＥＧＦ－Ａが接触する「ｄ」残基を、境界残基と呼ぶことができる。当然のことながら、

【0145】

表３は、例示的な足場ドメイン、例示的化合物、および例示的な当該化合物領域の配列のリストを示す。式（Ｉ）～（ＸＩＸ）の一部の実施形態では、残基は、表３に記載される配列番号２２～７１のうちの一つの同じ位置に位置する残基に対応する。式（Ｉ）の特定の実施形態では、化合物は、配列番号２２－７１の一つに対して、８８％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、または９８％以上の同一性など、８５％以上の同一性を有する残基の配列を含む。一部の事例では、配列同一性の比較は、同じ長さ、例えば、４８残基、４９残基、５０残基、５１残基、５２残基、または５３残基の長さを有する配列領域に基づく。これらの当該化合物は、標的ＶＥＧＦ－Ａタンパク質との接触に関与しないＧＡドメインモチーフの表面位置に残基を組み込むようにさらに変異させることができる。残基は、結果的な修飾化合物に望ましい特性（例えば、本明細書に記載されるように）を付与するように選択することができる。
足場および当該化合物の配列

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【表3-7】

【表3-8】

【表3-9】

【表3-10】

【表3-11】

ＶＥＧＦに結合する例示的なＤ－ペプチド性ＺドメインおよびＧＡドメイン

【表4-1】

【表4-2】

例示的な多価ＶＥＧＦ結合Ｄ－ペプチド性化合物

【表5-1】

【表5-2】

【0146】

本開示の態様は、化合物（例えば、本明細書に記載されるような）、その塩（例えば、薬学的に許容可能な塩）、および／またはその溶媒和化合物もしくは水和物形態を含む。本開示によって、あらゆる順列の塩、溶媒和物、および水和物が包含されることが意図されていることが理解される。一部の実施形態では、当該化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で提供される。アミンおよび／または窒素含有ヘテロリル基を含有する化合物は、本質的におそらく塩基性であり、したがって、任意の数の無機酸および有機酸と反応して、薬学的に許容可能な酸付加塩を形成しうる。こうした塩を形成するために一般的に用いられる酸としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにｐａｒａ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸塩、ｐａｒａ－ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、および酢酸などの有機酸のほか、関連する無機酸および有機酸が含まれる。したがって、このような薬学的に許容可能な塩は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素、リン酸二水素、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン－ｌ，４－ジオエート、ヘキシン－ｌ，６－ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、β－ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、マンデル酸塩、馬尿酸塩、グルコン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびこれに類する塩を含む。特定の特定の実施形態では、薬学的に許容可能な酸付加塩は、塩酸および臭化水素酸などの鉱酸で形成されるもの、ならびにフマル酸およびマレイン酸などの有機酸で形成されるものを含む。

【0147】

化合物の特性
当該多価化合物のバリアントＤ－ペプチド性ドメインは、高い機能的親和性（例えば、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ））および特異性（例えば、３００ｎＭ以下であって、１００ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、３ｎＭ以下、１ｎＭ以下、３００ｐＭ以下、さらにはそれ以下など）のタンパク質－タンパク質相互作用を形成するために適切なサイズの結合表面積を画定しうる。バリアントＤ－ペプチド性ドメインはそれぞれ、６００～１８００Å^２、例えば８００～１６００Å^２、１０００～１４００Å^２、１１００～１３００Å^２、または約１２００Å^２の表面積を含んでもよい。

【0148】

一部の事例では、多価Ｄ－ペプチド性化合物は、標的タンパク質の第一および第二の_Ｄ－ペプチド性ドメインのみのそれぞれの結合親和性よりも、例えば３０倍以上、１００倍以上、３００倍以上、１０００倍以上、またはそれ以上など、１０倍以上強い結合親和性（ＫＤ）で標的タンパク質に特異的に結合する。標的タンパク質のペプチド性化合物の親和性は、ＳＰＲ結合アッセイまたはＥＬＩＳＡ結合アッセイＥＬＩＳＡ結合アッセイ（例えば、本明細書に記載されるように）を使用するなど、任意の好都合な方法によって決定することができる。特定の事例では、多価Ｄ－ペプチド性化合物は、１ｎＭ以下、３００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下など、３ｎＭ以下の標的タンパク質に対する結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有し、標的タンパク質に対する第一および第二のＤ－ペプチド性ドメイン単独での結合親和性は、それぞれ独立的に１００ｎＭ以上、例えば２００ｎＭ以上、３００ｎＭ以上、４００ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、または１ｕＭ以上である。多価Ｄ－ペプチド性化合物全体の有効結合親和性は、望ましい生物学的効力および／またはインビボ半減期などの他の特性を提供するように最適化されうる。標的結合部位に対して特定の個々の親和性を有する個々のＤ－ペプチド性ドメインを選択することによって、必要に応じて、多価Ｄ－ペプチド性化合物の全体的機能的親和性を最適化することができる。

【0149】

化合物の効力は、本明細書の実験セクションに記載されるＩＣ５０を測定するＥＬＩＳＡアッセイを介してなど、任意の好都合なアッセイを使用して評価することができる。一部の実例では、当該多価化合物は、第一および第二のＤ－ペプチド性ドメインのみの各々の効力よりも、少なくとも３０倍、少なくとも１００倍、少なくとも３００倍、少なくとも１０００倍など、少なくとも１０倍は強力である標的タンパク質に対するインビトロ拮抗活性を有する。

【0150】

特定の実施形態では、当該ペプチド性化合物は、例えば、ＳＰＲ結合アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイによって決定されるような、高い親和性でＶＥＧＦ－Ａ標的タンパク質に特異的に結合する。当該化合物は、１ｕＭ以下のＶＥＧＦ－Ａに対する親和性を示してもよく、例えば、３００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、６００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、またはさらにそれ以下である。

【0151】

当該Ｄ－ペプチド性化合物は、例えば、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質に対する化合物の親和性を、参照タンパク質（例えば、アルブミンタンパク質）と比較して、ＶＥＧＦ－Ａに対して、例えば、３０：１以上、１００：１以上、３００：１以上、１０００：１以上、またはさらにそれ以上など、５：１以上、１０：１以上の特異性を示しうる。一部の事例では、特異性は、例えば、１０^４以上、１０^５以上、１０^６以上、またはさらにそれ以上など、１０^３以上の倍率での結合親和性の差異でもよい。一部の事例では、ペプチド性化合物は、タンパク質フォールディング、プロテアーゼ安定性、熱安定性、医薬製剤との適合性など、任意の望ましい特性に対して最適化されてもよい。任意の好都合な方法、例えば、構造活性相関（ＳＡＲ）解析、親和性成熟法、またはファージディスプレイ法などを使用して、Ｄ－ペプチド性化合物を選択してもよい。

【0152】

また、高い熱安定性を有するＤ－ペプチド性化合物も提供される。一部の事例では、高い熱安定性を有する化合物は、６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、さらには９０℃以上など、５０℃以上の融解温度を有する。また、高いプロテアーゼ安定性を有するＤ－ペプチド性化合物も提供されている。当該Ｄ－ペプチド性化合物は、プロテアーゼに対して耐性があり、長い血清半減期および／または唾液半減期を有することができる。また、インビボでの長い半減期を有するＤ－ペプチド性化合物も提供されている。本明細書で使用される場合、「半減期」は、時間ゼロでの元の効力、活性、および有効濃度の半分など、化合物の効力、活性、または有効濃度が元のレベルの半分になる測定されたパラメータについて必要な時間を指す。したがって、ポリペプチド分子の効力、活性、または有効濃度などのパラメータは、概して経時的に測定される。本明細書の目的で、半減期は、インビトロまたはインビボで測定することができる。一部の事例では、ペプチド性化合物は、２時間以上、６時間以上、１２時間以上、１日以上、２日以上、７日以上、またはそれ以上の長さなど、１時間以上の半減期を有する。ヒト血液中の安定性は、例えば、化合物をヒトＥＤＴＡ血液中または血清中で指定された時間インキュベートし、混合物のサンプルを急冷して、化合物の量および／または活性について、例えばＨＰＬＣ－ＭＳによって、例えば本明細書に記載される活性アッセイによって、試料を分析することにより、任意の好都合な方法によって測定されうる。

【0153】

また、例えば、非免疫原性など、低い免疫原性を有するＤ－ペプチド性化合物も提供されている。特定の実施形態では、Ｄ－ペプチド性化合物は、Ｌ－ペプチド性化合物と比較して、低い免疫原性を有する。ある特定の実施形態では、Ｄ－ペプチド性化合物は、Dintzis et al., ”A Comparison of the Immunogenicity of a Pair of Enantiomeric Proteins” Proteins: Structure, Function, and Genetics 16:306-308
(1993)に記載のあるものなど、免疫原性アッセイで、Ｌ－ペプチド性化合物と比較して、免疫原性が１０％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、７０％以下、または９０％以下である。

【0154】

また、親和性成熟によるＶＥＧＦ－Ａに対する結合親和性および特異性について最適化されたＤ－ペプチド性化合物、例えば、ＶＥＧＦ－Ａに結合する親化合物に基づく第二世代のＤ－ペプチド性化合物も提供される。一部の実施形態では、当該化合物の親和性成熟は、バリアントアミノ酸位置の一部分を固定位置として保持することを含むことができ、残りのバリアントアミノ酸位置は、各位置で最適なアミノ酸を選択するように変化する。親Ｄ－ペプチド性化合物は、親和性成熟化合物用の足場として選択されてもよい。一部の事例では、親のバリアントアミノ酸位置の限定されたサブセットでの変異を含む多数の親和性成熟化合物が調製され、一方で、残りのバリアント位置は固定位置として保持される。変異の位置は、足場配列を通してタイル状に並べられて、全てのバリアント位置の変異が表現され、多様な範囲のアミノ酸が全ての位置（例えば、２０個の天然起源アミノ酸すべて）で置換されるように、一連の化合物が生成されてもよい。一つ以上のアミノ酸の欠失または挿入を含む変異が、親和性成熟化合物のバリアント位置に含まれてもよい。親和性成熟化合物は、例えば、ファージディスプレイライブラリスクリーニングなどの任意の好都合な方法を使用して調製・スクリーニングされて、例えば、標的分子に対する結合親和性の増加、タンパク質フォールディング、プロテアーゼ安定性、熱安定性、医薬製剤との適合性などの改善された特性を有する第二世代化合物を特定することができる。

【0155】

一部の実施形態では、当該化合物の親和性成熟は、親化合物の可変領域中のバリアントアミノ酸位置のほとんどまたは全てを固定位置として保持すること、およびこれらの可変領域に隣接した位置に隣接的な変異を導入することを含みうる。そのような変異は、元のＧＡ足場ドメイン内の、それまで固定位置であると考えられていた親化合物内の位置に導入されうる。こうした変異は、タンパク質フォールディング、プロテアーゼ安定性、熱安定性、医薬製剤との適合性など、任意の望ましい特性に対して化合物バリアントを最適化するために使用されうる。

【0156】

本開示の態様は、化合物（例えば、本明細書に記載されるような）、その塩（例えば、薬学的に許容可能な塩）、および／またはその溶媒和物、水和物および／またはプロドラッグ形態を含む。塩、溶媒和物、水和物、およびプロドラッグのすべての配列が、本開示によって包含されることを意味することが理解される。

【0157】

一部の実施形態では、当該化合物、またはそのプロドラッグ形態は、薬学的に許容可能な塩の形態で提供される。アミンまたは窒素含有ヘテロリル基を含有する化合物は、本質的におそらく塩基性であり、したがって、任意の数の無機酸および有機酸と反応して、薬学的に許容可能な酸付加塩を形成しうる。こうした塩を形成するために一般的に用いられる酸としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにｐａｒａ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸塩、ｐａｒａ－ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、および酢酸などの有機酸のほか、関連する無機酸および有機酸が含まれる。したがって、このような薬学的に許容可能な塩は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素、リン酸二水素、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン－ｌ，４－ジオエート、ヘキシン－ｌ，６－ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、β－ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、マンデル酸塩、馬尿酸塩、グルコン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびこれに類する塩を含む。特定の特定の実施形態では、薬学的に許容可能な酸付加塩は、塩酸および臭化水素酸などの鉱酸で形成されるもの、ならびにフマル酸およびマレイン酸などの有機酸で形成されるものを含む。

【0158】

多量体化合物
任意の好都合なＤ－ペプチド性化合物（例えば、本明細書に記載される通り）は、多量体化されて、Ｄ－ペプチド性化合物の多量体を提供しうる。特定の実施形態では、多量体は、２個（例えば、二量体）、３個（例えば、三量体）、または４個以上の化合物（例えば、四量体またはデンドリマーなど）などの二つ以上のＤ－ペプチド性化合物を含む。一部の事例では、多量体は式によって記述される：
Ｙ－（ＧＡ）_ｎ
式中、Ｙは多価連結基であり、ｎは１より大きい整数であり、ＧＡは、ＧＡドメインモチーフ（例えば、本明細書に記載される通り）を含むＤ－ペプチド性化合物である。特定の事例では、ｎは２である。特定の事例では、ｎは３である。

【0159】

特定の事例では、多量体は式のうちの一つの二量体である：

【化2】

式中、各ＧＡは独立的に、Ｄ－ペプチド性化合物であり（例えば、本明細書に記載されるように）、Ｙは、化合物のＮ末端（Ｎ－ＧＡ）またはＣ末端（ＧＡ－Ｃ）に接続されたリンカーである。特定の事例では、二量体は、各々がＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合する二つの同一のＧＡドメインモチーフのホモ二量体である。特定の例では、二量体はヘテロ二量体である。ヘテロ二量体は、各々、ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合する二つの別個のＧＡドメインモチーフの二量体、または当該Ｄ－ペプチド性化合物と第二のＤ－ペプチド性結合ドメインの二量体とすることができる。

【0160】

任意の好都合な連結基を、当該マルチマーで利用することができる。「リンカー」、「連結」、および「連結基」という用語は、互換的に使用され、二つ以上の化合物を共有結合する連結部分を指す。一部の事例では、リンカーは二価である。特定の事例では、リンカーは分岐または三価の連結基である。一部の事例では、リンカーは、長さが２００原子以下（例えば、１００原子以下、８０原子以下、６０原子以下、５０原子以下、４０原子以下、３０原子以下、またはさらには２０原子以下）の直鎖または分岐の骨格を有する。連結部分は、二つの基、または長さ１～２００原子、例えば、長さ約１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、または２００個の炭素原子の直鎖または分岐鎖を結合する共有結合であってもよく、リンカーは、直鎖、分岐鎖、環状または単一の原子であってもよい。特定の事例では、リンカー骨格の１個、２個、３個、４個、または５個以上の炭素原子が、硫黄、窒素、または酸素ヘテロ原子で任意に置換されてもよい。ある特定の例では、リンカーがＰＥＧ基を含む場合、リンカー骨格のそのセグメントの３原子毎に酸素で置換される。骨格原子間の結合は、飽和または不飽和であってもよく、通常、１個、２個、または３個を超えないの不飽和結合がリンカー骨格中に存在する。リンカーは、一つ以上の置換基、例えば、アルキル基、アリール基、またはアルケニル基を含みうる。リンカーは、限定されないが、オリゴ（エチレングリコール）、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、炭酸塩、カルバメート、三級アミン、アルキルであって、直鎖または分岐状であってもよく、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル（イソ－プロピル）、ｎブチル、ｎ－ペンチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）などを含みうる。リンカー骨格は、環状基、例えば、アリール基、複素環基、またはシクロアルキル基を含んでもよく、ここで、環状基の２個以上の原子、例えば、２個、３個、または４個の原子が骨格中に含まれる。リンカーは、切断可能であっても、または切断不能であってもよい。リンカーは、例えば、残基の連結配列などのペプチドであってもよい。

【0161】

Ｙは、限定されないが、アミノ酸残基、ＰＥＧ、修飾ＰＥＧ（例えば、－ＮＨ（ＣＨ_２）_ｍＯ［（ＣＨ_２）_２Ｏ］_ｎ（ＣＨ_２）_ｐＣＯ－連結基（式中、ｍは２～６であり、ｐは１～６であり、ｎは１～５０である）、Ｃ２－Ｃ１２アルキルリンカー、－ＣＯ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ単位、およびその組合せ（例えば、アミド結合、スルホンアミド結合、カルバメート、エーテル結合、エステル結合、または－ＮＨ－など、官能基を介して連結）を含む、任意の好都合な基またはリンカー単位を含むことができる。一部の実例では、Ｙはペプチド性である。一部の実施形態では、Ｙは、－（Ｌ１）ａ－（Ｌ２）ｂ－（Ｌ３）ｃ－（Ｌ４）ｄ－（Ｌ５）ｅ－を含むリンカーであり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５はそれぞれリンカー単位であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅはそれぞれ独立的に０または１であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅの総和は１～５である。本明細書に記載される多量体化合物に示されるように、他のリンカーも可能である。

【0162】

一部の実例では、Ｙは、任意の好都合な連結ケミストリーを使用してＤ－ペプチド性化合物に接続される修飾ＰＥＧリンカーを含む。ＰＥＧは、ポリエチレングリコールまたは修飾ポリエチレングリコールである。修飾ＰＥＧとは、末端の一方もしくは両方が、例えば、別の結合基部分、またはペプチド性化合物の末端もしくは側鎖への共役に適した化学選択官能基を含むように修飾される、ポリエチレングリコール、または任意の好都合な長さを意味する。表９および実施例のセクションでは、化合物のＮ末端またはＣ末端のいずれかを介して接続される化合物１．１．１（ｃ２１ａ）のいくつかの例示的なホモ二量体を記載する。Ｄ－ペプチド性化合物は、ＧＡドメインモチーフのＮ末端および／またはＣ末端で修飾されて、システインまたはリジンなどのＹ基に連結するための、特定の連鎖または連結ケミストリーを提供することができる一つ以上の追加的なアミノ酸残基を含みうる。

【0163】

連結基を介して当該ペプチド性化合物を連結する際に利用されうる化学選択的反応性官能基は、限定されないが、アミノ基（例えば、Ｎ末端アミノ基またはリジン側鎖基）、アジド基、アルキニル基、ホスフィン基、チオール（例えば、システイン残基）、Ｃ末端チオエステル、アリールアジド、マレイミド、カルボジイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ヒドラジド、ＰＦＰ－エステル、ヒドロキシメチルホスフィン、ソラレン、イミドエステル、ピリジルジスルフィド、イソシアン酸塩、アミノオキシ－、アルデヒド、ケト、クロロアセチル、ブロモアセチル、およびビニルスルホンを含む。

【0164】

任意の好都合な多価リンカーが、当該多量体に利用されうる。多価とは、リンカーが、例えば本明細書に記載されるように、当該化合物への付着に適した二つ以上の末端基を含むことを意味する。一部の事例では、多価リンカーは二価または三価である。一部の実例では、多価リンカーＹはデンドリマー足場である。任意の好都合なデンドリマー足場が、当該多量体で使用するために適合されうる。デンドリマー足場は、少なくとも一つの分岐点と、オプションのリンカーを介してＧＡドメインモチーフのＮ末端またはＣ末端に接続するために適切な二つ以上の末端とを含む分岐分子である。デンドリマー足場は、二つ以上のＧＡドメインモチーフの望ましい空間配置を提供するように選択されてもよい。一部の事例では、二つ以上のＧＡドメインモチーフの空間配置は、標的タンパク質に対する望ましい結合親和性およびアビディティを提供するように選択される。図１７は、二つのＶＥＧＦ－Ａ分子と二つの化合物を含む複合体を含む、化合物１．１．１（ｃ２１ａ）のＸ線結晶構造を示す。図示した構造の図では、Ｎ末端（約６０オングストローム）とＣ末端（約７０オングストローム）との間の距離は、点線で示されている。一部の事例では、二量体は、約６０オングストローム以上の長さのＮ－Ｎ結合Ｙ基を含む。一部の事例では、二量体は、約７０オングストローム以上の長さのＣ－Ｃ連結Ｙ基を含む。

【0165】

一部の事例では、Ｄ－ペプチド性化合物はそれぞれ独立的に、特異的結合部分（例えば、ビオチンまたはペプチドタグ）を含み、ここで、Ｄ－ペプチド性化合物は、特異的結合部分を特異的に結合する多価結合部分（例えば、ストレプトアビジン、アビジンまたは抗体）を介して互いに結合することができる。一部の実施形態では、二つ以上のＤ－ペプチド性化合物は、例えば、上述のように、各々がビオチン部分である特異的結合部分を含む。特定の実施形態では、特異的結合部分は、任意のリンカーを介して、化合物のＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合される末端ビオチン部分である。特定の事例では、末端ビオチン部分は、ビオチン－（Ｇｌｙ）_ｎ－であり、式中、ｎは１～６またはビオチン－Ａｈｘ－（Ａｈｘ＝６－アミノヘキサン酸残基）である。

【0166】

修飾化合物
任意の好都合な当該の分子または部分は、当該Ｄ－ペプチド性化合物に結合されてもよい。当該分子は、ペプチド性または非ペプチド性、天然起源または合成であってもよい。当該化合物と併用するのに適した当該分子には、限定されないが、追加的なタンパク質ドメイン、ポリペプチドまたはアミノ酸残基、ペプチドタグ、特異的結合部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー部分、炭水化物、デキストランまたはポリアクリレート、リンカー、半減期延長部分、薬剤、毒素、検出可能標識および固体支持体が含まれる。一部の事例では、当該分子は、結果として生じるペプチド性化合物に、限定されないが、水溶性の増大、化学合成の容易さ、費用、生体共役反応部位、安定性、等電点（ｐＩ）、凝集、非特異的結合の減少、および／または本明細書に記載される第二の標的タンパク質への特異的結合など（例えば、本明細書に記載したように）を含む、強化および／または修飾された特性および機能を付与しうる。

【0167】

本明細書に記載されるＶＥＧＦ－Ａ結合ＧＡドメインモチーフ配列のいずれか一つの一部の実施形態では、モチーフは、配列のＮ末端および／またはＣ末端に、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、またはさらにそれ以上の追加的な残基など、一つ以上の追加的な残基を含むように伸長されてもよい。こうした追加的な残基は、ＶＥＧＦ－Ａ結合相互作用を提供しないが、ＧＡドメインモチーフの一部とみなされうる。任意の好都合な残基は、ＶＥＧＦ－Ａ結合ＧＡドメインモチーフのＮ末端および／またはＣ末端に含められて、水溶性基、二量体化または多量体化のための連鎖、標識または特異的結合部分と結合するための連鎖など、望ましい特性または基を提供しうる。

【0168】

一部の事例では、当該修飾化合物は次式で描写される。
Ｘ－Ｌ－Ｚ
式中、ＸはＶＥＧＦ－Ａ結合ＧＡドメインモチーフ（例えば、本明細書に記載されるように）であり、Ｌは任意の連結基であり、Ｚは当該分子であり、任意の好都合な位置でＸに結合される（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、または標的への結合に関与しない表面残基の側鎖を介して）。

【0169】

Ｄ－ペプチド性化合物は、一つ以上の当該分子、例えば、Ｎ末端部分および／またはＣ末端部分を含みうる。一部の実例では、当該分子は、Ｎ末端残基のアルファ－アミノ基を介して共有結合されるか、またはＣ末端残基のアルファ－カルボン酸基に共有結合される。他の実例では、当該分子は、残基の側鎖基を介して（例えば、ｃ、ｋ、ｄまたはｅ残基を介して）モチーフに付加される。

【0170】

当該分子は、ポリペプチドまたはタンパク質ドメインを含みうる。当該ポリペプチドおよびタンパク質ドメインには、限定されないが、ｇＤタグ、ｃ－Ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ベータ－ガラクトシダーゼタンパク質、ＧＳＴ、アルブミン、免疫グロブリン、Ｆｃドメインまたは類似の抗体様断片、ロイシンジッパーモチーフ、コイルドコイルドメイン、疎水性領域、親水性領域、二つ以上の多量体形成ドメインの間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを含むポリペプチド、「空洞への隆起」ドメインと、ベータラクトグロブリン、またはその断片が含まれる。

【0171】

当該分子は、半減期延長部分を含みうる。「半減期延長部分」という用語は、当該化合物に共有結合または共役結合された、薬学的に許容可能な部分、ドメイン、または「ビヒクル」を指し、非共役結合形態の当該化合物と比較して、当該化合物のインビボでのタンパク質分解または他の活性低減化学修飾を防止または緩和する、半減期または他の薬物動態特性を増加させる（例えば、吸収速度）、毒性を低減する、溶解性を改善する、当該標的に対する当該化合物の生物活性および／または標的選択性を増大させる、製作可能性を高める、および／または当該化合物の免疫原性を減少させる。

【0172】

特定の実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）または血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））などの血清タンパク質に結合するポリペプチドである。ポリエチレングリコールは、有用な半減期延長部分の一例である。例示的な半減期延長部分は、ポリアルキレングリコール部分（例えば、ＰＥＧ）、血清アルブミンまたはその断片、トランスフェリン受容体またはそのトランスフェリン結合部分、インビボで半減期を延長するポリペプチドの結合部位を含む部分のほか、エチレングリコールの共重合体、プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン共重合体、ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン）、デキストランｎ－ビニルピロリドン、ポリｎ－ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモポリマー、酸化プロピレン重合体、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖または分岐の糖側鎖、ポリシアル酸、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、米国特許 第６，６６０，８４３号を参照）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン、例えば、米国特許第６，９２６，８９８号および米国特許出願公開第２００５／００５４０５１号、米国特許第 第６，８８７，４７０号を参照）、トランスチレチン（ＴＴＲ、例えば、ＵＳ
２００３／０１９５１５４、２００３／０１９１０５６を参照）、またはチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）を含む。

【0173】

半減期の延長はまた、例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｓ． Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｔ． Ｒｈｏｄｅｓ， Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍによって記載されるように、当該化合物の制御された投与形態または徐放性投与形態を介して達成されうる。Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， ２００２， １１に記載。これは、リポソームおよび薬物－ポリマー共役を含む様々な製剤を介して達成されうる。

【0174】

特定の実施形態では、半減期延長部分は脂肪酸である。任意の好都合脂肪酸が、当該修飾化合物で使用されうる。例えば、Ｃｈａｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｅｘｅｎｄｉｎ－４ ａｎａｌｏｇｓ ｆｏｒ ｔｙｐｅ ２ ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０１０ Ｍａｙ ２１；１４４（１）：１０－６を参照。

【0175】

特定の実施形態では、化合物は、特異的結合部分を含むように修飾される。特異的結合部分は、それに相補的な第二の部分に特異的に結合することができる部分である。一部の事例では、特異的結合部分は、少なくとも１０^‐７Ｍの親和性（例えば、３０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、３ｎＭ以下、１ｎＭ以下、３００ｐＭ以下、または１００ｐＭ以下など、１００ｎＭ以下のＫ_Ｄによって測定された場合など）で相補的な第二の部分に結合する。特異的結合部分の相補的結合部分の対には、限定されないが、リガンドおよび受容体、抗体および抗原、相補ポリヌクレオチド、相補タンパク質ホモ二量体またはヘテロ二量体、アプタマーおよび小分子、ポリヒスチジンタグおよびニッケル、ならびに化学選択性反応性基（例えば、チオール）および求電子性基（例えば、反応性チオール付加がマイケル付加を起こしうる）が含まれる。特異的結合対は、オリジナルの特異的結合メンバーの類似体、誘導体、および断片を含みうる。例えば、タンパク質抗原に対する抗体は、エピトープが存在する限り、ペプチド断片、化学的に合成された、標識タンパク質、誘導体化タンパク質なども認識しうる。特異的結合部分としての用途が見出される当該タンパク質ドメインには、限定されないが、Ｆｃドメインまたは類似の抗体様断片、ロイシンジッパーモチーフ、コイルドコイルドメイン、疎水性領域、親水性領域、二つ以上の多量体化ドメインの間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを含むポリペプチド、または「空洞への隆起」ドメイン（例えば、ＷＯ ９４／１０３０８、米国特許第５，７３１，１６８号、Ｌｏｖｅｊｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１２８８－１２９３、Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１－０５、Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ ３７１：８０－８３、Ｈａｋａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７： ２５５～６４を参照）が含まれる。

【0176】

特定の実施形態では、当該分子は、標的タンパク質に特異的に結合する連結された特異的結合部分である。連結された特異的結合部分は、抗体、抗体断片、アプタマー、または第二のＤ－ペプチド性結合ドメインであってもよい。連結された特異的結合部分は、任意の好都合な標的タンパク質、例えば、当該治療方法でＶＥＧＦ－Ａと併せて標的にすることが望ましい標的タンパク質に特異的に結合することができる。当該標的タンパク質には、限定されないが、ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ－Ｂ）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＯＸ－４０、およびＬＡＧ３が含まれる。特定の例では、連結された特異的結合部分は、ＰＤＧＦ－Ｂを標的とする第二のＤ－ペプチド性結合ドメインである。

【0177】

特定の実施形態では、特異的結合部分は、ビオチン部分などの親和性タグである。例示的なビオチン部分には、ビオチン、デスチオビオチン、オキシビオチン、２’－イミノビオチン、ジアミノビオチン、ビオチンスルホキシド、ビオシチンなどが含まれる。一部の事例では、ビオチン部分は、固定化アビジン、ニュートラアビジン、またはストレプトアビジンを含有するクロマトグラフィー支持体に高親和性で特異的に結合する能力を有する。ビオチン部分は、少なくとも１０^‐８Ｍの親和性でストレプトアビジンに結合することができる。一部の事例では、単量体アビジン支持体は、中程度の親和性を有するビオチン含有化合物に特異的に結合するために使用することができ、それによって、非ビオチン化ポリペプチドが洗い流された後、支持体から（例えば、２ｍＭのビオチン溶液で）結合した化合物を後で競合的に溶出させることができる。特定の例では、ビオチン部分は、溶液中のアビジン、ニュートラアビジン、またはストレプトアビジンに結合して、例えば、アビジン、ニュートラビジン、またはストレプトアビジンを有するＤ－ペプチド性化合物の二量体、または四量体複合体など、多量体化合物を形成することができる。ビオチン部分は、リンカー、例えば、─ＬＣ－ビオチン、─ＬＣ－ＬＣ－ビオチン、─ＳＬＣ－ビオチン、または ─ＰＥＧ_ｎ－ビオチンを含むことができ、式中、ｎは３～１２である（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販）。

【0178】

特定の実施形態では、化合物は、検出可能標識を含むように修飾される。検出可能標識の例としては、対象ペプチド性化合物の存在を直接的および間接的の両方で測定できるようにする標識が含まれる。化合物の直接測定を可能にする標識の例としては、放射標識、フルオロフォア、色素、ビーズ、ナノ粒子（例えば、量子ドット）、化学発光体、コロイド粒子、常磁性標識などが含まれる。放射性標識は、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^６４Ｃｕおよび^１３１Ｉなどの放射性同位体を含んでもよい。当該化合物は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２， Ｃｏｌｉｇｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄ． Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｐｕｂｓ． （１９９１）に記載のあるものなど、任意の好都合な技術を使用して、放射性同位体で標識化されてもよく、また放射能は、シンチレーション計数または陽電子放射を使用して測定することができる。修飾化合物の存在の間接的な測定を可能にする検出可能標識の例には、基質が着色生成物または蛍光生成物を提供しうる酵素が含まれる。例えば、化合物は、適切な基質の添加後に検出可能な生成物シグナルを提供することができる共有結合酵素を含みうる。酵素を化合物に共有結合する代わりに、化合物は、酵素に共役結合された特異的結合対の第二のメンバーと特異的に結合する特異的結合対の第一のメンバーを含んでもよく、例えば、化合物はビオチンに共有結合され、酵素はストレプトアビジンに共役結合されてもよい。共役で使用するための適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが含まれる。市販されていない場合、このような酵素共役体は、任意の好都合な技術によって容易に生成されうる。

【0179】

特定の実施形態では、検出可能標識はフルオロフォアである。「フルオロフォア」という用語は、選択された波長を有する光で励起されたとき、異なる波長の光を放射する分子を指し、これは、励起後に直ちにまたは遅延して光を放射しうる。フルオロフォアは、限定されないが、フルオレセイン色素、例えば、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、２’，４’，１，４，－テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４’－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、および２’，７’－ジメトキシ－４’，５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、シアニン色素（例えば、Ｃｙ３、ＣＹ５、Ｃｙ５．５、ＱＵＡＳＡＲＴＭ色素など）、ダンシル誘導体、ローダミン色素（例えば、６－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ＣＡＬ ＦＬＵＯＲ色素、テトラプロパノ－６－カルボキシローダミン（ＲＯＸ）を含む。ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア、ＡＬＥＸＡ色素、オレゴングリーン、ピレン、ペリレン、ベンゾピレン、スクアリン色素、クマリン色素、発光性遷移金属、およびランタニド複合体、および類似のもの。フルオロフォアという用語は、このような色素のエキシマーおよびエキシプレックスを含む。

【0180】

一部の実施形態では、化合物は、放射標識などの検出可能標識を含む。特定の実施形態では、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴおよび／またはＭＲ撮像での使用に適した放射標識である。特定の実施形態では、放射標識はＰＥＴ撮像標識である。特定の事例では、化合物は、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^６８Ｇａ、^１１１Ｉｎ、^９９ｍＴｃまたは^８６Ｙで放射標識される。

【0181】

検出可能標識は、任意の好都合な位置で、任意の好都合なケミストリーを介して、ペプチド性化合物に付着されうる。当該の方法および材料には、限定されないが、ＵＳＰ ８，５４５，８０９、Meares et al., 1984, Acc Chem Res 17:202-209、Scheinberg et al., 1982, Science 215:1511-13、Miller et al., 2008, Angew Chem Int Ed 47:8998-9033、Shirrmacher et al., 2007, Bioconj Chem 18:2085-89、Hohne et al., 2008, Bioconj Chem 19:1871-79、Ting et al., 2008, Fluorine Chem 129:349-58に記載のあるものが含まれ、Ｐｏｅｔｈｋｏ ｅｔ ａｌ． （J.
Nucl. Med. 2004; 45: 892-902）の標識化方法では、まず、４－［１８Ｆ］フルオロベンズアルデヒドが合成・精製され（Wilson et al,J.Labeled Compounds and Radiopharm. 1990;XXVIII:1189-1199）、次にペプチドに共役結合され、スクシンイミジル［１８Ｆ］フルオロ安息香酸塩（ＳＦＢ）（例えば、Vaidyanathan et al., 1992, Int. J. Rad. Appl. Instrum. B 19:275）、その他のアシル化合物（Tada et al., 1989, Labeled Compd. Radiopharm. XXVII:1317、Wester et al., 1996, Nucl. Med. Biol. 23:365、Guhlke et al., 1994, Nucl. Med. Biol 21:819）、
またはクリックケミストリー付加物（Li et al., 2007, Bioconj Chem. 18:1987）で標識化される。

【0182】

任意の好都合な合成方法または生体共役方法が、当該修飾Ｄ－ペプチド性化合物を調製する際に利用されうる。特定の事例では、検出可能標識は、任意のリンカーを介して化合物に接続される。特定の実施形態では、検出可能標識は、化合物のＮ末端に接続される。特定の実施形態では、検出可能標識は、化合物のＣ末端に接続される。特定の実施形態では、検出可能標識は、化合物の非末端残基、例えば側鎖部分を介して結合される。特定の実施形態では、検出可能標識は、任意のリンカーを介して化合物のＮ末端ペプチド伸長部分に接続される。一部の事例では、Ｎ末端ペプチド伸長部分は、放射標識含有部分の適合官能基と反応することができる反応性官能基を含むように修飾される。任意の好都合な反応性官能基、ケミストリー、および放射標識含有部分は、検出可能標識を化合物に付加するために利用されてもよく、例えば、限定されないが、クリックケミストリー、アジド、アルキン、シクロオクチン、銅を含まないクリックケミストリー、ニトロン、キレート基（例えば、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＯＤＡ－ＮＯＤＡ、（ｔｅｒｔ－ブチル）_２ＮＯＤＡ、ＮＥＴＡ、Ｃ－ＮＥＴＡ、Ｌ－ＮＥＴＡ、Ｓ－ＮＥＴＡ、ＮＯＤＡ－ＭＰＡＡ、およびＮＯＤＡ－ＭＰＡＥＭから選択される）、プロパルギル－グリシン残基が含まれる。

【0183】

特定の例では、当該分子は、第二の活性薬剤、例えば、当該治療方法での標的化ＶＥＧＦ－Ａと併せての用途がある活性薬剤または薬物である。特定の例では、当該分子は、小分子、化学療法剤、抗体、抗体断片、アプタマー、またはＬタンパク質である。一部の実施形態では、化合物は、医薬（例えば、タンパク質、核酸、有機小分子など）として有用な部分を含むように修飾される。例示的な医薬タンパク質としては、例えば、サイトカイン、抗体、ケモカイン、成長因子、インターロイキン、細胞表面タンパク質、細胞外ドメイン、細胞表面受容体、細胞毒などが含まれる。例示的な小分子医薬品には、小分子毒素または治療薬が含まれる。

【0184】

任意の好都合な治療剤または診断用薬（例えば、本明細書に記載されるように）を、Ｄ－ペプチド性化合物に共役結合することができる。限定されないが、抗癌剤、抗増殖剤、細胞毒性薬剤、および化学療法剤を含む様々な治療剤を、併用療法と題するセクションに以下に記載しており、そのどれもが、当該修飾化合物での使用に適合させることができる。例示的な当該化学療法剤には、例えば、ゲムシタビン、ドセタキセル、ブレオマイシン、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、トラメチニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、トラスツズマブ、Ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、リツキシマブ、イピリムマブ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、メトトレキサート、ドキソルビシン、アブラキサン、フォルフィリノックス、シスプラチン、カルボプラチン、５－フルオロウラシル、Ｔｅｙｓｕｍｏ、パクリタキセル、プレドニゾン、レボチロキシン、ペメトレキセド、ナビトクラックス、ＡＢＴ－１９９が含まれる。ＡＤＣでの用途がある任意の例示的細胞毒性薬剤は、当該修飾Ｄ－ペプチド性化合物での使用に適合されうる。関心のＣｙｔｏｔｏｉｃ剤には、限定されないが、オーリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）、メイタンシン、ドラスタチン、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、センタナマイシン（ＭＬ－９７０、インドールカルボキサミド）、ドキソルビシン、α‐アマニチン、およびその誘導体および類似体が含まれる。特定の実施形態では、化合物は、細胞透過性ペプチド（例えば、ｔａｔ）を含み得る。細胞透過性ペプチドは、分子の細胞取込を促進しうる。任意の好都合なタグポリペプチド、およびそれらのそれぞれの抗体を使用してもよい。例としては、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ－ｈｉｓ）タグまたはポリヒスチジン－グリシン（ｐｏｌｙ－ｈｉｓ－ｇｌｙ）タグ、インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)］、ｃ－ｍｙｃタグおよびそれへの８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］、および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質
Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］が含まれる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇ－ペプチド［Hopp et al., BioTechnology 6:1204-1210 (1988)］、ＫＴ３エピトープペプチド［Martin et al., Science 255:192-194 (1992)］、チューブリンエピトープペプチド［Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)］、およびＴ７遺伝子
１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 87:6393-6397 (1990)］が含まれる。

【0185】

特定の実施形態では、化合物は、細胞透過性ペプチド（例えば、ｔａｔ）を含みうる。細胞透過性ペプチドは、分子の細胞取込を促進しうる。任意の好都合なタグポリペプチド、およびそれらのそれぞれの抗体を使用してもよい。例としては、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ－ｈｉｓ）タグまたはポリヒスチジン－グリシン（ｐｏｌｙ－ｈｉｓ－ｇｌｙ）タグ、インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)］、ｃ－ｍｙｃタグおよびそれへの８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］、および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質
Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］が含まれる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇ－ペプチド［Hopp et al., BioTechnology 6:1204-1210 (1988)］、ＫＴ３エピトープペプチド［Martin et al., Science 255:192-194 (1992)］、チューブリンエピトープペプチド［Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)］、およびＴ７遺伝子
１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 87:6393-6397 (1990)］が含まれる。

【0186】

当該分子は、任意の好都合な方法を介して、当該修飾化合物に付加されてもよい。一部の事例では、当該分子は、共有結合的共役を介して、末端アミノ酸残基、例えば、アミノ末端またはカルボン酸末端に付加される。当該分子は、単結合を介して、または好適なリンカー、例えば、ＰＥＧリンカー、一つ以上のアミノ酸を含むペプチドリンカー、または飽和炭化水素リンカーを介して、ペプチド性ＧＡドメインモチーフに付加されてもよい。様々なリンカー（例えば、本明細書に記載されるように）は、当該修飾化合物における用途がある。任意の好都合な試薬および方法を使用して、当該分子を当該ＧＡドメインモチーフに含めてもよく、これには例えば、G.T.Hermanson, “Bioconjugate Techniques”
Academic Press, 2nd Ed., 2008に記載のある共役方法、固相ペプチド合成方法、
または融合タンパク質発現方法がある。修飾化合物を産生するために、任意選択のリンカーを介してドメインを共有結合するのに使用されうる官能基には、ヒドロキシル、スルフヒドリル、アミノなどが含まれる。当該分子および／またはＧＡドメインモチーフ上の特定の部分は、都合の良い保護基を使用して保護されてもよく、例えば、Green & Wuts,
Protective Groups in Organic Synthesis (John Wiley & Sons) 3rd Ed. (1999)を参照。ＧＡドメインモチーフへの特定の当該分子および付加部位は、例えば、標的ＶＥＧＦ－Ａタンパク質に対して、望ましい結合活性に実質的に悪影響を及ぼさないように選択されてもよい。

【0187】

当該分子は、ペプチドであってもよい。当該分子は、限定されないが、ビオチン部分および／またはリンカーを含む一つ以上の非ペプチド基をさらに含みうることが理解される。任意の好都合なタンパク質ドメインを、当該修飾ペプチド性化合物中の当該分子として適合させ、利用することができる。当該タンパク質ドメインには、限定されないが、任意の有用な血清タンパク質、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン、例えば、米国特許第６，９２６，８９８号および米国特許出願公開第２００５／００５４０５１号、米国特許第６，８８７，４７０号を参照）、トランスフェリン受容体またはそのトランスフェリン結合部分、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）、免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、米国特許第６，６６０，８４３号を参照）、トランスチレチン（ＴＴＲ；例えば、ＵＳ ２００３／０１９５１５４、２００３／０１９１０５６を参照）、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、またはその断片が含まれる。

【0188】

多量体形成基は、例えば、二つ以上の化合物間の結合を媒介することによって（例えば、多価結合部分を介して直接的または間接的に）、または共有結合を介して二つ以上の化合物を接続することによって、多量体（例えば、二量体、三量体、またはデンドリマー）を形成することができる、任意の好都合な基である。一部の事例では、多量体形成基Ｚは、第二のＤ－ペプチド性化合物上の適合する官能基に共役結合する化学選択的反応性官能基である。他の場合では、多量体形成基は、多価結合部分（例えば、ストレプトアビジンまたは抗体）に特異的に結合する特異的結合部分（例えば、ビオチンまたはペプチドタグ）である。一部の事例では、化合物は多量体形成基を含み、まだ多量体形成されていない単量体である。

【0189】

当該ペプチド性化合物中に含めるための化学選択的反応性官能基には、限定されないが、アジド基、アルキニル基、ホスフィン基、システイン残基、Ｃ末端チオエステル、アリールアジド、マレイミド、カルボジイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）－エステル、ヒドラジド、ＰＦＰ－エステル、ヒドロキシメチルホスフィン、ソラレン、イミドエステル、ピリジルジスルフィド、イソシアン酸塩、アミノオキシ－、アルデヒド、ケト、クロロアセチル、ブロモアセチル、およびビニルスルホンが含まれる。

【0190】

ポリヌクレオチド
また、本明細書に記載される当該ペプチド性化合物に対応する配列をコードするポリヌクレオチドも提供される。ポリヌクレオチドは、Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａ標的タンパク質に特異的に結合するＬ－ペプチド性化合物をコードしてもよい。

【0191】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、３０～８０残基、４０～７０残基、４５～６０残基、４５～６０残基、または４５～５５残基を含むペプチド性化合物をコードする。ある特定の例では、ポリヌクレオチドは、４０～５５残基、または４５～５５残基などの３５～５５残基のペプチド性化合物配列をコードする。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、４５残基、４６残基、４７残基、４８残基、４９残基、５０残基、５１残基、５２残基、または５３残基のペプチド性化合物配列をコードする。

【0192】

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、タンパク質発現系で発現されうるＬ－ペプチド性化合物をコードする核酸配列を含む複製可能な発現ベクターである。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子融合をコードする核酸配列を含む複製可能な発現ベクターであり、遺伝子融合は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部に融合されたＬ－ペプチド性化合物を含む融合タンパク質をコードする。

【0193】

特定の実施形態では、当該ポリヌクレオチドは、細胞ベースの、または無細胞の表示システムで発現・表示されることができる。任意の好都合な表示方法を使用して、細胞ベースの表示技術および無細胞表示技術など、当該ポリヌクレオチドによってコードされるＬ－ペプチド性化合物を表示してもよい。特定の実施形態では、細胞ベースの表示技術は、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、および哺乳類細胞ディスプレイを含む。特定の実施形態では、無細胞表示技術は、ｍＲＮＡディスプレイおよびリボソームディスプレイを含む。

【0194】

方法
本明細書に記載される化合物は、様々な方法で採用されうる。こうした方法の一つは、ＶＥＧＦ－Ａの結合に適した条件下で、当該化合物をＶＥＧＦ－Ａ標的タンパク質と接触させて、複合体を産生することを含む。一部の実施形態では、方法は、Ｄ－ペプチド性化合物を対象者に投与することを含み、ここで化合物は、対象者内でＶＥＧＦ－Ａに結合する。

【0195】

当該化合物は、１０％～１００％の範囲、例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上で、そのＶＥＧＦ－Ａ標的の少なくとも一つの活性を阻害しうる。特定のアッセイでは、当該化合物は、ＩＣ_５０が１×１０^－５Ｍ以下（例えば、１×１０^－６Ｍ以下、１×１０^－７Ｍ以下、１×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、１×１０^‐１０Ｍ以下、または１×１０^－１１Ｍ以下）で、そのＶＥＧＦ－Ａ標的を阻害することができる。特定のアッセイでは、当該化合物は、１×１０_－６Ｍ以下のＩＣ^２０（例えば、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、３ｎＭ以下、または１ｎＭ以下）で、そのＶＥＧＦ－Ａ標的を阻害しうる。特定のアッセイでは、当該化合物は、ＩＣ_１０が１×１０^－６Ｍ以下（例えば、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、３ｎＭ以下、または１ｎＭ以下）で、そのＶＥＧＦ－Ａ標的を阻害しうる。マウスが用いられるアッセイでは、当該化合物は、１ｇ／マウス未満（例えば、１ｎｇ／マウス～約１ｇ／マウス）のＥＤ_５０を有しうる。

【0196】

一部の実施形態では、主題の方法は、標的分子に高親和性で特異的に結合する当該化合物に試料を接触させることを含む、インビトロ方法である。特定の実施形態では、試料は、標的分子を含有する疑いがあるもので、当該方法は、化合物が標的分子に特異的に結合するかどうかを評価することをさらに含む。特定の実施形態では、標的分子は、天然起源Ｌタンパク質であり、化合物はＤ－ペプチド性である。特定の実施形態では、当該化合物は、例えば、蛍光標識などの標識を含む修飾化合物であり、当該方法は、例えば、サンプル中に標識が存在する場合に、光学検出を使用して標識を検出することをさらに含む。特定の実施形態では、化合物は、化合物に結合しない任意の試料が（例えば、洗浄によって）除去されうるように、支持体を用いて修飾される。特異的に結合された標的タンパク質が存在する場合には、標識化された標的特異的プローブの結合を使用したり、蛍光タンパク質反応性試薬を使用したりするなど、任意の好都合な手段を使用して検出されうる。当該方法の別の実施形態では、試料は、標的タンパク質を含有することが知られている。特定の実施形態では、標的ＶＥＧＦ－Ａタンパク質は合成Ｄタンパク質であり、化合物はＬ－ペプチド性である。特定の実施形態では、標的ＶＥＧＦ－Ａタンパク質はＬタンパク質であり、化合物はＤ－ペプチド性である。

【0197】

特定の実施形態では、当該化合物は、ＶＥＧＦ－Ａの存在下で細胞と接触させてもよく、細胞のＶＥＧＦ－Ａ応答表現型がモニターされる。例示的ＶＥＧＦ－Ａアッセイには、単離タンパク質を無細胞系で使用したアッセイ、培養細胞を使用したインビトロアッセイ、またはインビボアッセイが含まれる。例示的ＶＥＧＦ－Ａアッセイとしては、限定されないが、受容体チロシンキナーゼ阻害アッセイ（例えば、Cancer Research June 15,
2006; 66:6025-6032を参照）、インビトロＨＵＶＥＣ増殖アッセイ（FASEB Journal
2006; 20: 2027-2035; Wells et al., Biochemistry 1998, 37, 17754-17764）、インビボ固形腫瘍疾患アッセイ（ＵＳＰＮ ６，８１１，７７９）、およびインビボ血管新生アッセイ（FASEB Journal 2006; 20: 2027-2035）が挙げられる。これらの
アッセイの説明を、参照し本書に組込む。これらの方法に採用されうるプロトコルは多数あり、限定されないが、無細胞アッセイ（例えば、結合アッセイ）、細胞表現型が測定される細胞アッセイ（例えば、遺伝子発現アッセイ）、および特定の動物が関与するインビボアッセイ（特定の実施形態では、標的に関連する状態についての動物モデルであってもよい）が含まれる。特定の事例では、アッセイは、血管新生アッセイであってもよい。特定の実施形態では、標的タンパク質は、ＶＥＧＦ－Ａであり、当該化合物は、ＶＥＧＦ－Ａ依存性血管新生を阻害する。特定の実施形態では、標的タンパク質は、ＶＥＧＦ－Ａであり、当該化合物は、ＶＥＧＦ－Ａ依存性細胞増殖を阻害する。ある特定の例では、標的タンパク質はＶＥＧＦ－Ａであり、化合物はＶＥＧＦＲ２のリン酸化を阻害する。

【0198】

一部の実施形態では、当該方法は、インビボであり、標的分子に高い親和性で特異的に結合するＤ－ペプチド性化合物を対象者に投与することを含む。特定の実施形態では、化合物は、医薬調製物として投与される。様々な対象者が、当該方法に従って治療可能である。一般的に、このような対象者は、これらの用語が、食肉目（例えば、イヌおよびネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモットおよびラット）、および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジーおよびサル）を含む、哺乳綱に属する生物を記述するために広く使用される、「哺乳動物」または「哺乳類」である。一部の実施形態では、対象者はヒトである。対象者は、（例えば、本明細書に記載されるように）対象者内での血管新生に関連する疾患または状態の治療の予防を必要とする対象者とすることができる。

【0199】

当該化合物は、ＶＥＧＦ－Ａに結合し、それを阻害することができ、したがって、血管新生に関連する疾患および状態の治療、インビボ診断および撮像に有用でありうる。「血管新生に関連する疾患および状態」という用語は、本明細書で言及される疾患および状態を含むが、これらに限定されない。これに関して、ＷＯ ９８／４７５４１にも記載がある。血管新生に関連する疾患および状態には、例えば、乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌または卵巣癌などの異なる形態の癌および転移が含まれる。その他の血管新生に関連する疾患および状態は、炎症（例えば、慢性炎症）、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチおよび歯肉炎である。さらなる血管新生に関連する疾患および状態は、動静脈奇形、星状細胞腫、星状細胞腫、絨毛癌、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、血管腫（小児、毛細血管）、肝細胞腫、増殖性子宮内膜、虚血心筋、子宮内膜症、カポジ肉腫、黄斑変性症、黒色腫、神経芽細胞腫、閉塞性末梢動脈疾患、変形関節症、乾癬、網膜症（糖尿病性、増殖性）、強皮症、精上皮腫および潰瘍性大腸炎である。一部の事例では、血管新生に関連する疾患または状態は、癌（例えば、乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌または卵巣癌）、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、黄斑変性症および網膜症である。特に関心が高いのは、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）または加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療である。

【0200】

ＶＥＧＦ－Ａ結合当該化合物は、様々な腫瘍性および非腫瘍性の疾患および障害の治療に有用である。治療に適している新生物および関連状態には、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巣癌、卵胞膜細胞腫、男性胚腫、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭頚部癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、膵臓癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、シュワン細胞腫、乏突起細胞腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症関連の異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど） およびメグズ症候群である。

【0201】

治療に適している非腫瘍性病態としては、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の増殖性網膜症が含まれ、例えば、未熟児網膜症、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、加齢黄斑変性症、甲状腺過形成（グレーブス病を含む）、角膜およびその他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心膜液貯留（心膜炎に関連するものなど） および胸水がある。

【0202】

本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、哺乳動物（ヒトなど）などの、患者における疾患または医学的状態を治療すること、またはその治療を意味し、（ａ）対象者の予防的治療など、疾患または医学的状態の発生の予防、（ｂ）患者の疾患または医学的状態の排除する、または退縮を引き起こすなど、疾患または医学的状態を改善すること、（ｃ）例えば、患者における疾患または医学的状態の進展を遅らせるか、または停止させるなど、疾患または医学的状態を抑制すること、または（ｄ）患者における疾患または医学的状態の症状を軽減することを含む。したがって、治療はまた、対象がもはや病的状態、または少なくとも病的状態を特徴付ける症状を患わないように、症状を少なくとも患わないように、病的状態、または少なくともそれに関連する症状が、完全に阻害（例えば、発生を予防）される、または停止（例えば、終結）される。治療はまた、例えば、上述のように、疾患状態の代理マーカーの調節の形態で顕在化しうる。

【0203】

本開示の態様は、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などのＡＭＤを予防または治療する方法を含む。加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、高齢者人口における重度の視力障害の主要な原因である。滲出型のＡＭＤは、脈絡膜血管新生および網膜色素上皮細胞剥離によって特徴付けられる。脈絡膜血管新生は予後の劇的な悪化と関連しているため、当該ＶＥＧＦ結合化合物は、ＡＭＤの重症度の低減での用途がある。特定の例では、対象者は、乾燥型ＡＭＤに罹患している患者であり、当該方法による化合物の投与は、対象者における滲出型ＡＭＤの発生を防止または重症度を低減する。

【0204】

特定の実施形態では、当該方法は、ＶＥＧＦ－Ａ結合化合物などの化合物を投与してから、その標的タンパク質に結合した後で化合物を検出することを含む。一部の方法では、同じ化合物が、治療化合物と診断化合物の両方としての役目を果たすことができる。

【0205】

本開示のＶＥＧＦ－Ａ結合化合物は、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質またはその断片の除去、阻害、または低減によって改善、寛解、阻害、または予防される任意の疾患または状態を治療するために治療的に有用である。

【0206】

一部の実施形態では、当該方法は、対象者において血管新生を調節する方法であり、その方法は、有効量の、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質と高い親和性で特異的に結合する当該化合物を対象者に投与することを含む。特定の実施形態では、方法は、対象者における疾患状態の存在を診断することをさらに含む。特定の実施形態では、疾患状態は、血管新生の増強によって治療されうる状態である。特定の実施形態では、疾患状態は、血管新生の減少によって治療されうる状態である。特定の実施形態では、当該方法は、血管新生を阻害する方法であり、化合物はＶＥＧＦ－Ａ拮抗薬である。

【0207】

一部の実施形態では、当該方法は、細胞増殖性疾患状態に罹患している対象者を治療する方法であり、その方法は、対象者が細胞増殖性疾患状態について治療されるように、有効量の、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質に高親和性で特異的に結合する当該化合物を対象者に投与することを含む。

【0208】

一部の実施形態では、当該方法は、対象者における腫瘍成長を阻害する方法であり、その方法は、有効量の、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質と高い親和性で特異的に結合する当該化合物を対象者に投与することを含む。特定の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は非固形腫瘍である。

【0209】

投与される化合物の量は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、またはビヒクルに関連して所望の効果を生じるのに十分な量である任意の都合の良い方法を使用して決定することができる。本開示の単位投与形態の仕様は、用いられる特定の化合物、達成される効果、および対象者内での各化合物に関連する薬力学に依存する。

【0210】

一部の実施形態では、有効量の当該化合物は、約５０ｎｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌ（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ～約４０μｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約８００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約７００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約６００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約４００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～約４００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ～約８５ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～約９０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約９００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約８００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約７００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約６００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約４００ｎｇ／ｍｌ、または約２００ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌ）である。

【0211】

一部の実施形態では、有効量の当該化合物は、約１０ｐｇ～約１００ｍｇの範囲の量であり、例えば、約１０ｐｇ～約５０ｐｇ、約５０ｐｇ～約１５０ｐｇ、約１５０ｐｇ～約２５０ｐｇ、約２５０ｐｇ～約５００ｐｇ、約５００ｐｇ～約７５０ｐｇ、約７５０ｐｇ～約１ｎｇ、約１ｎｇ～約１０ｎｇ、約１０ｎｇ～約５０ｎｇ、約５０ｎｇ～約１５０ｎ、約１５０ｎｇ～約２５０ｎｇ、約２５０ｎｇ～約５００ｎｇ、約５００ｎｇ～約７５０ｎｇ、約７５０ｎｇ～約１μｇ、約１μｇ～約１０μｇ、約１０μｇ～約５０μｇ、約５０μｇ～約１５０μｇ、約１５０μｇ～約２５０μｇ、約２５０μｇ～約５００μｇ、約５００μｇ～約７５０μｇ、約７５０μｇ～約１ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約１ｍｇ～約１００ｍｇ、または約５０ｍｇ～約１００ｍｇの範囲の量である。量は、単回用量であってもよく、または総一日量であってもよい。総一日量は、１０ｐｇ～１００ｍｇの範囲とすることができ、または１００ｍｇ～約５００ｍｇの範囲とすることができ、または５００ｍｇ～約１０００ｍｇの範囲とすることができる。

【0212】

一部の実施形態では、当該化合物が単回投与される。その他の実施形態では、当該化合物が複数回投与される。複数回の用量が一定期間にわたって投与される場合、Ｄ－ペプチド性化合物は、１日２回（ｑｉｄ）、１日１回（ｑｄ）、隔日（ｑｏｄ）、３日毎、週３回（ｔｉｗ）、または週２回（ｂｉｗ）、ある期間にわたって投与される。例えば、化合物は、１日～約２年以上の期間にわたり、ｑｉｄ、ｑｄ、ｑｏｄ、ｔｉｗ、またはｂｉｗで投与される。例えば、化合物は、様々な要因に応じて、１週間、２週間、一か月、２か月、６か月、１年、２年、またはそれ以上の期間にわたり、前述の任意の頻度で投与される。

【0213】

治療方法が有効かどうかを判断するために、任意の様々な方法を使用できる。例えば、当該方法を用いて治療を受けた個体から得られた生体試料を、血管新生の存在および／または程度について検定することができる。対象者に対する治療方法の有効性の評価は、任意の好都合な方法を使用して、治療前、治療中、および／または治療後に対象者を評価することを含みうる。当該方法の態様は、治療に対する対象者の治療反応を評価するステップをさらに含む。

【0214】

一部の実施形態では、方法は、治療される当該疾患または状態（例えば、本明細書に記載されるように）に関連する対象者の一つ以上の症状を診断または評価することを含む、対象者の状態の評価を含む。一部の実施形態では、本方法は、対象者から生体試料を取得することと、例えば、当該疾患または状態（例えば、本明細書に記載される通り）に関連する血管新生の存在のために、試料を検定すること、とを含む。試料は、細胞試料であってもよい。一部の事例では、試料は生検である。当該方法の評価ステップは、任意の好都合な方法を使用して、当該化合物の投与の前、最中、および／または後に１回以上実施することができる。

【0215】

一部の事例では、当該化合物またはその塩は、例えば、本明細書に定義されるように、特に、例えばＰＥＴによる、血管新生に関連する疾患または状態のインビボ診断または撮像で、医学における用途がある。特定の実施形態では、化合物は、検出可能標識を含む修飾化合物であり、本方法は、対象者における標識の検出をさらに含む。標識の選択は、検出手段に依存する。任意の好都合な標識化および検出システムを、当該方法に使用することができ、例えば、Baker, “The whole picture,” Nature, 463, 2010, p977-980を参照のこと。特定の実施形態では、化合物は、光学検出に適した蛍光標識を含む。特定の実施形態では、化合物は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を使用した検出のための放射標識を含む。一部の事例では、化合物は、断層検出に適した常磁性標識を含む。当該化合物は、上述のように標識化されてもよいが、一部の方法では、化合物は標識化されず、二次的な標識化剤が撮像に使用される。特定の実施形態では、当該方法は、標識化された座位の数、サイズ、および／または強度を、対応するベースライン値と比較することによる、対象者における疾患状態の診断を含む。ベースライン値は、疾患のない対象者集団の平均レベル、または同じ対象者で決定されたそれまでのレベルを表すことができる。

【0216】

一部の事例では、放射性標識化合物は、望ましいシグナルを発生させるのに十分な量が、ＰＥＴ撮像のための対象者に投与されてもよい。特定の例では、放射性核種の用量は、０．０１～１００ｍＣｉ、例えば０．１～５０ｍＣｉ、または１～２０ｍＣｉであり、これは体重７０ｋｇでは十分である。したがって、放射性標識化合物は、任意の好都合な生理学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して投与するために製剤化されうる。例えば、化合物は、任意に薬学的に許容可能な賦形剤を添加して、水性媒体中に懸濁または溶解されてもよく、結果として生じる溶液または懸濁液はその後で滅菌される。また、インビボ撮像、例えば、血管新生に関連する疾患または状態の撮像などのＰＥＴ撮像の方法で使用するための放射性医薬品の製造用に、本明細書に記載される放射性標識化合物またはその塩も提供されており、これには、人体または動物の体への放射性医薬品の投与、および前記体の少なくとも一部の画像の生成を伴う。

【0217】

一部の実施形態では、方法は、例えば、放射性医薬品を前記体（例えば、血管系）に投与し、前記放射性医薬品が分布した前記身体の少なくとも一部の画像をＰＥＴを使用して生成することを含む、血管新生に関連する疾患または状態のインビボでの診断または撮像のための方法であり、ここで前記放射性医薬品は、放射性標識化合物またはその塩を含む。

【0218】

一部の実施形態では、方法は、血管新生（例えば、癌）に関連する状態と戦うために、人体または動物の体内での治療の効果を薬剤（例えば、細胞毒性薬剤）で監視する方法であり、前記方法は、前記身体に放射性標識化合物またはその塩を投与し、細胞受容体（内皮細胞受容体などで、例えば、ａｌｐｈａ．ｖ．ｂｅｔａ．３受容体）による化合物の取込みを検出することを含み、前記投与および検出が随意に繰り返して、例えば、前記薬剤での治療前、治療中および治療後に行われる。

【0219】

一部の実施形態では、方法は、血管新生に関連する疾患または状態のインビボでの診断または撮像のための方法であり、対象者にＤ－ペプチド性化合物を投与すること、および対象者のうち少なくとも一部を撮像することを含む。特定の実施形態では、撮像は、ＰＥＴ撮像を含み、投与は、対象者の血管系に化合物を投与することを含む。一部の実例では、方法は、細胞受容体による化合物の取り込みを検出することをさらに含む。特定の例では、標的はＶＥＧＦ－Ａであり、対象者はヒトである。特定の実施形態では、方法は、治療用抗体、例えば、アバスチンを対象者に投与することを含み、ここで疾患または状態は、癌に関連する状態である。

【0220】

当該方法は、特定の細胞、組織、または血清中の標的タンパク質の発現を、インビトロまたはインビボで検出するための診断方法であってもよい。一部の事例では、当該方法は、対象者における標的タンパク質のインビボ撮像のための方法である。方法は、標的タンパク質に関連する疾患状態の症状を呈する対象者に化合物を投与することを含みうる。一部の事例では、対象者は無症候性である。当該方法は、それまでに疾患と診断された対象者における疾患進行および／または治療に対する応答を監視することをさらに含みうる。

【0221】

当該ＶＥＧＦ－Ａ結合化合物は、親和性精製剤として使用されてもよい。このプロセスでは、化合物は、任意の好都合な方法を使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂またはろ紙などの固相上に固定される。当該ＶＥＧＦ－Ａ結合化合物を、精製されるＶＥＧＦ－Ａタンパク質（またはその断片）を含有するサンプルと接触させ、その後、ＶＥＧＦタンパク質を除く、固定化化合物に結合されるサンプル中の実質的にすべての物質を除去する適切な溶媒で、支持体を洗浄する。最後に、支持体は、固定化化合物からＶＥＧＦ－Ａタンパク質を放出するグリシン緩衝液、ｐＨ ５．０などの別の適切な溶媒で洗浄される。

【0222】

当該ＶＥＧＦ－Ａ結合化合物はまた、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質の診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織、または血清におけるその発現の検出に有用でありうる。こうした診断方法は、癌診断に有用でありうる。診断用途については、当該化合物は、上述のように修飾されてもよい。

【0223】

併用療法
一部の実施形態では、当該化合物は、一つ以上の追加的な活性薬剤または療法と組み合わせて投与されてもよい。当該方法によって標的化される疾患を治療するために有用な化合物を含む、任意の好都合な薬剤が利用されうる。「薬剤」、「化合物」、および「薬剤」という用語は、本明細書では互換的に使用される。追加的な活性薬剤または療法としては、限定されないが、小分子、抗体、抗体断片、アプタマー、Ｌタンパク質、第二の標的結合分子（第二のＤペプチド性化合物など）、化学療法剤、外科手術、カテーテル装置、および放射線が含まれる。併用療法は、当該化合物および一つ以上の追加的な薬剤を含有する単一医薬用量製剤の投与、ならびに当該化合物およびそれ自体が別個の医薬用量製剤である一つ以上の追加的な薬剤の投与を含む。例えば、当該化合物および細胞毒性薬剤、化学療法剤、または成長阻害剤が、複合製剤などの単一用量組成物でまとめて患者に投与されてもよく、または各薬剤は、別個の剤形で投与されてもよい。別個の剤形が使用される場合、当該化合物および一つ以上の追加的な薬剤は、同時に、または別々に時差的に（例えば、順次に）投与することができる。

【0224】

「同時投与」および「と組み合わせて」という用語は、特定の時間制限なく、同時、同時発生的、または順次のいずれかで、二つ以上の治療薬（例えば、Ｄ－ペプチド性化合物および第二の薬剤）を投与することを含む。一つの実施形態では、薬剤は、細胞内または対象者の体内に同時に存在するか、または同時にその生物学的もしくは治療効果を発揮する。一つの実施形態では、治療剤は、同じ組成物または単位投与形態である。その他の実施形態では、治療剤は、別個の組成物または単位投与形態である。特定の実施形態では、第一の薬剤（例えば、Ｄ－ペプチド性化合物）は、第二の治療剤の投与前（例えば、数分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、同時に、または投与後 （例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、１２週間後）に投与されうる。

【0225】

本開示の医薬組成物と公知の治療薬剤の「併用投与」とは、公知の薬剤および本開示の組成物の両方が治療効果を有することになる時に、Ｄ－ペプチド性化合物および第二の薬剤を投与することを意味する。こうした併用投与は、当該Ｄ－ペプチド性化合物の投与に関して、薬剤の同時投与（すなわち同時に）、前の投与、または後の投与が関与しうる。二つの薬剤の投与経路は異なっていてもよく、代表的な投与経路は以下でより詳細に記載される。当業者であれば、本開示の特定の薬剤および化合物に対する適切な投与のタイミング、順序、および用量を決定することは困難ではない。

【0226】

一部の実施形態では、化合物（例えば、当該Ｄ－ペプチド性化合物および第二の薬剤）は、例えば、互いの１２時間以内、互いの６時間以内、互いの３時間以内、または互いの１時間以内など、互いに２４時間以内に対象者に投与される。特定の実施形態では、化合物は、互いに１時間以内に投与される。特定の実施形態では、化合物は実質的に同時に投与される。実質的に同時に投与されることは、化合物は、互いに約１０分以内、例えば、５分以内、または１分以内など、対象者に投与されることを意味する。

【0227】

また、当該化合物および第二の活性薬剤の医薬調製物も提供される。薬学的投与形態では、化合物は、その薬学的に許容可能な塩の形態で投与されてもよく、または単独で、もしくは適切な会合で、ならびに他の薬学的に活性化合物との組み合わせで使用されてもよい。

【0228】

１日当たり体重約０．０１ｍｇ～約１４０ｍｇ／ｋｇ程度の用量レベルは、代表的な実施形態において有用であり、または代替的に患者１人当たり１日当たり約０．５ｍｇ～約７ｇが有用である。当業者であれば、用量レベルは、特定の化合物、症状の重症度、および対象者の副作用に対する感受性の関数として変化しうることを容易に理解するであろう。所与の化合物の用量は、様々な手段によって当業者によって容易に決定可能である。

【0229】

単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わされうる活性成分の量は、治療対象の宿主および特定の投与形態に応じて変化する。例えば、ヒトの経口投与が意図される製剤は、０．５ｍｇ～５ｇの活性薬剤を含有してもよく、これは、合計組成物の約５～約９５パーセントで変化しうる、適量かつ好都合な量の担体材料と化合物化されてもよい。単位剤形は概して、約１ｍｇ～約５００ｍｇの有効成分、例えば２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、または１０００ｍｇを含有する。

【0230】

ところが、当然のことながら、任意の特定の患者の特定の用量レベルは、治療を受ける特定の疾患の年齢、体重、全般的健康、性別、食事療法、投与時間、投与経路、排泄率、複合製剤、および重症度を含む様々な要因に依存する。

【0231】

任意の好都合な第二の薬剤は、当該方法において用途が考えられる。一部の事例では、第二の活性薬剤は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＯＸ－４０、ＬＡＧ３、Ａｎｇ２、ＩＬ－１、ＩＬ－６、およびＩＬ－１７から選択される標的タンパク質に特異的に結合する。第二の活性薬剤には、ペグプレラニブ（Ｆｏｖｉｓｔａ）、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ）、ニボルマブ，アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブおよびペムブロリズマブを含むがこれに限定されない。

【0232】

癌の治療については、当該化合物は、タキサン、ヌクレオシド類似体、ステロイド、アントラサイクリン、甲状腺ホルモン補充薬、チミジル酸標的薬剤、キメラ抗原受容体／Ｔ細胞療法、キメラ抗原受容体／ＮＫ細胞療法、アポトーシス調節因子阻害剤（例えば、Ｂ細胞性ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ－２）ＢＣＬ－２様１（ＢＣＬ－ＸＬ）阻害剤、ＣＡＲＰ－１／ＣＣＡＲ１（細胞分裂周期およびアポトーシス調節因子１）阻害剤、コロニー刺激因子－１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、癌ワクチン（例えば、Ｔｈ１７－誘発樹状細胞ワクチン）、および他の細胞療法からなる群から選択される化学療法剤と組み合わせて投与される。特定の化学療法剤には、例えば、ゲムシタビン、ドセタキセル、ブレオマイシン、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、トラメチニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、トラスツズマブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、リツキシマブ、イピリムマブ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、メトトレキサート、ドキソルビシン、アブラキサン、フォルフィリノックス、シスプラチン、カルボプラチン、５－フルオロウラシル、Ｔｅｙｓｕｍｏ、パクリタキセル、プレドニゾン、レボチロキシン、ペメトレキセド、ナビトクラックス、ＡＢＴ－１９９が含まれる。

【0233】

癌（例えば、黒色腫、非小細胞肺癌、またはホジキンリンパ腫などのリンパ腫）の治療のために、当該化合物を免疫チェックポイント阻害薬と組み合わせて投与することができる。任意の好都合なチェックポイント阻害剤は、限定されないが、細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）阻害剤、プログラム死１（ＰＤ－１）阻害剤、およびＰＤ－Ｌ１阻害剤を含めて、利用することができる。例示的な当該チェックポイント阻害剤には限定されないが、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、およびニボルマブが含まれる。特定の実施形態では、癌および／または炎症性疾患の治療のために、当該化合物は、コロニー刺激因子－１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）阻害剤と組み合わせて投与することができる。当該ＣＳＦ１Ｒ阻害剤には、限定されないが、エマクツズマブが含まれる。

【0234】

任意の好都合な癌ワクチン療法および薬剤を、当該免疫調節ポリペプチド組成物および方法と組み合わせて使用することができる。癌（例えば、卵巣癌）の治療のために、当該化合物は、ワクチン接種療法、例えば、Ｔｈ１／Ｔｈ１７免疫を促進する樹状細胞（ＤＣ）ワクチン接種剤と組み合わせて投与することができる。Ｔｈ１７細胞浸潤は、卵巣癌患者の全生存期間の顕著な延長と相関する。一部の事例では、免疫調節性ポリペプチドは、Ｔｈ１７誘発ワクチン接種と組み合わせたアジュバント治療としての用途がある。

【0235】

また、ＣＡＲＰ－１／ＣＣＡＲ１（細胞分裂周期およびアポトーシス調節因子１）阻害剤であって、限定されないが、Ｒｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １１， Ｎｕｍｂｅｒ ９， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１５， ｐｐ． １６０８－１６２７（２０）に記載のあるものなど、およびＣＤ４７阻害剤であって、限定されないが、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４などの抗ＣＤ４７抗体剤を含むものなど、である薬剤も対象である。

【0236】

有用性
本発明の化合物は、例えば、上述のように、様々な用途での使用法がある。当該用途としては、限定されないが、治療用途、研究用途、およびスクリーニング用途が含まれる。これらの異なる各用途は、下記に、より詳細に検討する。

【0237】

治療用途
当該化合物は、様々な治療用途での利用法がある。当該治療用途には、標的の活性が疾患進行の原因または複合因子である用途が含まれる。このように、当該化合物は、宿主における標的活性の調節が望ましい様々な異なる条件の治療における利用法がある。

【0238】

当該化合物は、その標的であるＶＥＧＦ－Ａに関連する障害の治療に有用である。本発明の化合物で治療されうる疾患状態の例は、上記に記載されている。

【0239】

特定の実施形態では、疾患状態には、限定されないが、癌、血管新生および転移の阻害、変形関節症の痛み、慢性腰痛、癌関連疼痛、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、および移植角膜の移植片生存が含まれる。

【0240】

一つの実施形態では、本開示は、ＶＥＧＦ－Ａ関連状態のために対象者を治療する方法を提供する。本方法は、概して、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害を有する対象者に、ＶＥＧＦ－Ａ関連障害の少なくとも一つの症状を治療するために有効な量の当該化合物を投与することを伴う。ＶＥＧＦ－Ａに関連する状態は、一般的に、血管内皮細胞増殖、血管透過性、損傷・脳卒中・腫瘍に関連する脳浮腫などの浮腫または炎症、乾癬または関節炎などの炎症性障害に関連する浮腫（関節リウマチを含む）、喘息、熱傷に関連する全身浮腫、腫瘍・炎症・外傷に関連する腹水および胸水、慢性気道炎症、毛細管漏出症候群、敗血症、タンパク質漏れの増加に関連する腎臓病、加齢黄斑変性症や糖尿病性網膜症などの眼障害、を特徴とする。そのような状態には、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、および腎癌が含まれる。

【0241】

研究用途
当該化合物および方法には、様々な研究用途での用途がある。当該化合物および方法は、限定されないが、血管新生、炎症、細胞増殖、代謝、転写の調節、およびリン酸化の調節を含む、様々な生物学的プロセスを調節する際の標的タンパク質の役割を分析するために使用されうる。抗体などの他の標的タンパク質結合分子は、生物学的研究の同様の分野で同様に有用であった。例えば、Sidhu and Fellhouse, “Synthetic therapeutic antibodies,” Nature Chemical Biology, 2006, 2(12), 682-688を参照。こうし
た方法は、当該化合物および方法の様々な研究用途で使用するために容易に修飾されうる。

【0242】

診断用途
当該化合物および方法は、限定されないが、臨床診断薬、例えば、インビトロ診断薬またはインビボ腫瘍撮像剤の開発を含む、様々な診断用途での利用法がある。こうした用途は、疾患状態の診断または診断の確認、またはその感受性に有用である。本方法はまた、それまでに疾患が診断された患者における疾患進行および／または治療に対する応答を監視するためにも有用である。

【0243】

当該診断用途には、上述の病態など、疾患状態の診断が含まれ、これには、限定されないが、癌、血管新生および転移の阻害、変形関節症の疼痛、慢性腰痛、癌関連疼痛、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、および移植角膜の移植片生存を含む。一部の方法では、同じ化合物が、治療化合物と診断化合物の両方としての役目を果たすことができる。

【0244】

アプタマーや抗体などの他の標的タンパク質結合分子も、臨床診断薬の開発における利用法がある。こうした方法は、当該化合物および方法の様々な診断用途で使用するために容易に修飾することができ、例えば、Jayasena, “Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics,” Clinical Chemistry,
1999, 45, 1628-1650を参照。

【0245】

医薬調製物
また、医薬調製物も提供される。医薬調製物は、薬学的に許容可能なビヒクル中に存在する化合物（単独または一つ以上の追加的な活性薬剤の存在下のどちらも）を含む組成物である。「薬学的に許容可能な」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されたか、またはヒトなどの哺乳動物における使用のために米国薬局方もしくは他の一般的に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「賦形剤」という用語は、本発明の化合物が哺乳動物への投与のために製剤化される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体を指す。こうした医薬ビヒクルは、石油、動物、植物、またはピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの合成起源のものを含む、水および油などの液体であってもよい。医薬ビヒクルは、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、澱粉ペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などでありうる。さらに、助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤が使用されうる。哺乳動物に投与されるとき、本発明の化合物および組成物、ならびに薬学的に許容可能なビヒクル、賦形剤、または希釈剤は、滅菌されていてもよい。一部の実例では、本発明の化合物が、水、生理食塩水、および水性デキストロースおよびグリセロール溶液などの静脈内に投与されるとき、水性媒体はビヒクルとして用いられる。

【0246】

医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、小球、ロゼンジ、粉末剤、果粒剤、シロップ剤、エリキシル剤、溶液、懸濁液、乳濁液、坐剤、またはその徐放性形態、または哺乳動物への投与に適した任意の他の形態の形態を取ることができる。一部の実例では、医薬組成物は、ヒトへの経口投与または静脈内投与に適合した医薬組成物として、日常的な手順に従って、投与のために製剤化される。好適な医薬ビヒクルの実施例およびその製剤方法は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、Alfonso R. Gennaro
ed., Mack Publishing Co. Easton, Pa., 19th ed., 1995, Chapters 86, 87, 88, 91, and 92に記載があり、参照し本明細書に組込む。

【0247】

賦形剤の選択は、組成物を投与するために使用される特定の方法だけでなく、特定の化合物によって部分的に決定される。したがって、本発明の医薬組成物の、様々な適切な製剤がある。

【0248】

本開示の化合物の投与は、全身的または局所的でありうる。特定の実施形態では、哺乳動物への投与は、本発明の化合物の全身放出（例えば、血流内へ）をもたらす。投与方法は、経口、口腔内、舌下、および直腸などの経腸経路、経皮および皮内などの局所投与、ならびに非経口投与を含みうる。適切な非経口経路には、皮下注射針またはカテーテルを介した注射、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、動脈内、脳室内、髄腔内、および前房内の注射など、ならびに膣内直腸、または経鼻投与などの非注射経路が含まれる。特定の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、経口投与される。特定の実施形態では、治療を必要とする領域に本発明の一つ以上の化合物を局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、外科手術中の局所注入によって、局所塗布、例えば、手術後の創傷包帯と併せて、注射によって、カテーテルによって、座薬によって、またはインプラントによって達成されてもよく、前記インプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン質材料であり、シアラスティック膜、または繊維などの膜を含む。

【0249】

当該化合物は、植物性油または他の類似の油、合成脂肪族酸グリセリド、より高い脂肪族酸またはプロピレングリコールのエステルなど、水性または非水性溶媒中で、また望ましい場合、溶解剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および防腐剤などの従来的な添加剤と共に、それらを溶解、懸濁、または乳化することによって、注射用の調製物に製剤化することができる。

【0250】

一部の実施形態では、経口投与に適した製剤は、（ａ）水または生理食塩水などの希釈剤に溶解された有効量の化合物などの液体溶液、（ｂ）各々が固体または顆粒として所定量の活性成分を含有するカプセル剤、サシェまたは錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁液、および（ｄ）適切な乳濁液を含みうる。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、および薬理学的に互換性のある賦形剤のうちの一つ以上を含みうる。ロゼンジ形態は、風味中の活性成分、通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカント、ならびにゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアカシア、乳濁液、ゲルなどの不活性塩基中の活性成分を含むパステル剤、および本明細書に記載される活性成分、例えば賦形剤に加えて含有されるものを含みうる。

【0251】

当該製剤は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にすることができる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴霧剤中に配置することができる。これらはまた、ネブライザまたはアトマイザで使用するための非圧力調製物のための医薬品として製剤化されてもよい。

【0252】

一部の実施形態では、非経口投与に適した製剤には、意図されたレシピエントの血液で製剤を等張させる抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬を含みうる、水性および非水性の等張性滅菌注射液、ならびに懸濁化剤、溶解剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含みうる、水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数回用量の密封容器で提示することができ、使用直前に、注射のために滅菌液体賦形剤（例えば、水）の添加のみを必要とする凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存することができる。即座の注射溶液および懸濁液は、前述の種類の無菌粉末剤、果粒剤、および錠剤から調製することができる。

【0253】

局所投与に適した製剤は、適切な担体などの活性成分に加えて、クリーム、ゲル、ペースト、または泡として提示されうる。一部の実施形態では、局所用製剤は、構造剤、増粘剤またはゲル化剤、ならびに軟化剤または潤滑剤から選択される一つ以上の成分を含有する。頻繁に使用される構造剤は、ステアリルアルコール、グリセリルエーテルもしくはエステル、およびオリゴ（エチレンオキシド）エーテルもしくはそのエステルなどの長鎖アルコールを含む。増粘剤およびゲル化剤には、例えば、アクリル酸もしくはメタクリル酸のポリマーおよびそのエステル、ポリアクリルアミド、ならびに寒天、カラゲナン、ゼラチン、およびグアーガムなどの天然起源の増粘剤が含まれる。軟化物の例としては、トリグリセリドエステル、脂肪酸エステルおよびアミドや、蜜ろう、鯨ろう、またはカルナウバろうなどのワックスや、レシチンなどのリン脂質や、ステロールおよびそれらの脂肪酸エステルが含まれる。局所製剤は、他の成分、例えば、収斂薬、芳香剤、色素、皮膚浸透促進剤、日焼け止め剤（例えば、サンブロック剤）などをさらに含みうる。

【0254】

本開示の化合物はまた、経口投与のために製剤化されてもよい。経口医薬製剤については、適切な賦形剤は、マンニトール、ラクトース、グルコース、スクロース、デンプン、セルロース、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、および／または炭酸マグネシウムなど、医薬グレードの担体を含む。経口液体製剤での使用については、組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、またはシロップ剤として調製されてもよく、例えば、水性生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、またはエタノール、好ましくは水または生理食塩水などの水性担体での水分補給に適した固体または液体形態で供給されてもよい。望ましい場合、組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、または緩衝剤などの少量の無毒性補助物質を含有してもよい。本発明の化合物はまた、従来利用可能なものなど、既存の栄養補助成分配合物に組み込まれてもよく、これには、ハーブエキスも含まれうる。

【0255】

シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁液などの経口投与または直腸投与のための単位剤形が提供されてもよく、各用量単位、例えば、茶さじ量、食さじ量、錠剤または坐剤は、一つ以上の阻害剤を含有する組成物の所定量を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位投与形態は、滅菌水、生理食塩水、または別の薬学的に許容可能な担体中の溶液として、組成物中の阻害剤を含みうる。

【0256】

本明細書で使用される場合、「単位投与形態」という用語は、ヒトおよび動物対象者のための単位用量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体またはビヒクルに関連して望ましい効果を生じるのに十分な量で計算された、所定量の本発明の化合物を含有する。本発明の新規単位投与形態の仕様は、用いられる特定の化合物、達成される効果、および宿主内での各化合物に関連する薬力学に依存する。

【0257】

用量レベルは、特定の化合物、送達ビヒクルの性質などの関数として変化しうる。所与の化合物に対する望ましい投与量は、様々な手段によって容易に決定可能である。

【0258】

本発明の文脈において、動物、特にヒトに投与される用量は、例えば、下記でより詳細に記載するように、妥当な時間枠にわたって、動物において予防または治療反応をもたらすのに十分であるべきである。用量は、使用される特定の化合物の強度、動物の状態、および動物の体重、ならびに疾患の重症度および疾患の段階を含む様々な要因に依存する。用量のサイズはまた、特定の化合物の投与に付随しうる有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。

【0259】

薬学的投与形態では、化合物は、遊離塩基、その薬学的に許容可能な塩の形態で、または単独で、もしくは適切な会合で投与されてもよく、ならびに他の薬学的に活性化合物との組み合わせで使用されてもよい。

【0260】

一部の実施形態では、医薬組成物は、標的タンパク質に高親和性で特異的に結合する当該化合物、および薬学的に許容可能なビヒクルを含む。特定の実施形態では、標的タンパク質はＶＥＧＦタンパク質であり、当該化合物はＶＥＧＦ拮抗薬である。

【0261】

キット
また、本開示の化合物を含むキットも提供される。本開示のキットは、化合物の一つ以上の用量、および任意に一つ以上の追加的な活性薬剤の一つ以上の用量を含みうる。好都合にも、製剤は単位用量フォーマットで提供されうる。こうしたキットには、製剤（例えば、単位用量）を含有する容器に加えて、本発明の方法における当該製剤の使用、例えば、病原性血管新生に関連する細胞状態を治療するために、当該単位用量を使用するための説明書を記述する、情報パッケージ挿入物がある。キットという用語は、パッケージ化された活性薬剤を指す。一部の実施形態では、当該システムまたはキットは、血管新生に関連する疾患または状態（例えば、本明細書に記載される）について、対象者を治療するために有効な量の当該化合物の用量（例えば、本明細書に記載されるように）および第二の活性薬剤の用量（例えば、本明細書に記載されるように）を含む。

【0262】

上述の構成要素に加えて、当該キットは、例えば、当該方法を実施するために、キットの構成要素を使用するための説明書をさらに含みうる。説明書は、概して適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基質上に印刷されてもよい。そのため、説明書は、キットの容器またはその構成要素（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに関連する）などのラベルに、キット内にパッケージ挿入物として存在してもよい。その他の実施形態では、説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、ポータブルフラッシュドライブ上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書は、キット中に存在せず、例えば、インターネットを介するなど、遠隔ソースから説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の例は、説明書を閲覧できる、および／または説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るためのこの手段は、適切な基質上に記録される。

【0263】

一部の実施形態では、キットは、当該医薬組成物の第一の用量と、当該医薬組成物の第二の用量とを含む。特定の実施形態では、キットは、第二の血管新生調節剤をさらに含む。

【0264】

当然のことながら、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、そのため、変化しうる。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるものであるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記述するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。

【0265】

値の範囲が提供される場合、文脈によって別途明確に指示されない限り、その範囲の上限と下限の間に介在する各値は、その下限の単位の１０分の１に至るまで、また、その表示された範囲内に表示されたその他任意の値もしくは介在する値は、本発明内に包含されることが理解される。より小さなこれらの範囲の上限および下限は、独立的に、その小さな範囲に含まれてもよく、また表示された範囲内に特定的に除外された限界がない限り、本発明内に包含される。記載の範囲が、限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。

【0266】

特定の範囲は、本明細書では、「約」という用語が先行する数値と共に提示される。「約」という用語は、本明細書では、それが先行する正確な数、ならびにその用語が先行する数に近接する数であるか、または概ねその数である数に対して、文字通りの裏付けを提供するために使用される。ある数値が、具体的に列挙された数値に近接するか、または概ねその数であるかを判定するにあたり、未列挙の近接する数または概ねその数である数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙された数値と実質的に同等な数値を提供する数でありうる。

【0267】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践または試験には、本明細書に記載されるものと類似または同等な任意の方法および材料も使用することができるが、代表的な例示的方法および材料についてここで説明する。

【0268】

本明細書において引用される全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が、参照により組み込まれるものとして、具体的かつ個別に示されているかのごとく、参照により本明細書に援用され、その刊行物は引用される方法および／または材料を開示および記述するために本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであり、先行発明によって、本発明がこうした刊行物を先行する資格を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は、実際の公表日とは異なる場合があり、それらは個別に確認する必要がある場合がある。

【0269】

本明細書で使用される場合、および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって別途明確に指示されない限り、複数の参照を含むことが注目されるべきである。さらに、選択が自由な任意の要素を除外するために、請求項が起草されうることが注目される。したがって、この陳述は、請求要素の列挙、または「負」の制限の使用に関連して、「単に」、「唯一」などの排他的用語を使用するための先行事項としての役割を果たすことを意図している。

【0270】

本開示を読むことで、当業者には明らかであるように、本明細書に説明および図示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離したり、またはそれらと組み合わせることができる、別個の構成要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実施することができる。

【0271】

装置および方法は、文法的な流動性のために機能的説明とともに説明されているが、特許請求の範囲は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１２に基づき明示的に定められている場合を除き、いかなる方法でも、「手段」もしくは「ステップ」の制限の構造によって、必然的に制限されるものとは解釈されるべきでなく、司法上の均等物の原則に基づき、請求の範囲によって提供される、定義の意味および均等物の完全な範囲が許容されるべきであり、また、請求の範囲が３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１２に基づき明示的に策定されている場合、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１２に基づき完全な法定の均等物が許容されるべきである。

【0272】

定義
「ペプチド性」という用語は、主としてポリペプチドとして互いに連結されたアミノ酸残基からなる部分を指す。「ペプチド性」という用語は、従来のポリペプチド配列の1個
、２個、またはそれ以上の残基が、ペプチド模倣体で置換された化合物を含むことを意味する。ペプチド模倣体は、ペプチドまたはアミノ酸残基を模倣するよう設計された低分子有機基である。ペプチド性部分のペプチド模倣基は、従来のポリペプチド骨格に連結された非天然起源または合成の骨格基、および任意の好都合な当該アミノ酸残基の側鎖基を模倣する任意の側鎖基を含みうる。一部の実施形態では、主としてアミノ酸残基からなるペプチド性化合物は、ペプチド模倣部分で置換された親ポリペプチド配列の１０個のアミノ酸残基当たり２個以下の残基を有する。任意の好都合なペプチド模倣基およびペプチド模倣ケミストリーは、当該ペプチド性化合物において利用が可能である。ペプチド性という用語はまた、二つ以上の当該ペプチド性化合物が共有結合している多量体ペプチド性化合物をも含むことを意味する。ペプチド性という用語はまた、非タンパク質性部分が化合物に共有結合している修飾ペプチド性化合物をも含むことを意味する。

【0273】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指すために、互換的に使用される。別途具体的に指示のない限り、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、遺伝的にコードされたアミノ酸およびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されたアミノ酸または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含みうる。この用語は、一つ以上の従来的なアミノ酸が非天然起源アミノ酸または合成アミノ酸で置換されたポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意の長さであってもよく、例えば、２個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、２０個以上のアミノ酸、３０個以上のアミノ酸、４０個以上のアミノ酸、５０個以上のアミノ酸、６０個以上のアミノ酸、１００個以上のアミノ酸、３００個以上のアミノ酸、５００個以上のアミノ酸、または１０００個以上のアミノ酸であってもよい。

【0274】

本明細書に描写されるポリペプチド配列およびモチーフについては、別途記載がない限り、大文字コードはＬ－アミノ酸残基を指し、小文字コードはＤ－アミノ酸残基を指す。アミノ酸残基のグリシンは、ＧまたはＧｌｙとして表される。「ａ」はアラニンである。「ｃ」はシステインである。「ｄ」はアスパラギン酸である。「ｅ」はグルタミン酸である。「ｆ」はフェニルアラニンである。「ｈ」はヒスチジンである。「ｉ」はイソロイシンである。「ｋ」はリジンである。「ｌ」はロイシンである。「ｍ」はメチオニンである。「ｎ」はアスパラギンである。「ｏ」はオルニチンである。「ｐ」はプロリンである。「ｑ」はグルタミンである。「ｒ」はアルギニンである。「ｓ」はセリンである。「ｔ」はトレオニンである。「ｖ」はバリンである。「ｗ」はトリプトファンである。「ｙ」はチロシンである。本明細書に記載される任意の配列およびモチーフ、例えば、ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合するペプチド性化合物を画定する配列については、ＶＥＧＦ－Ａの鏡像に特異的に結合する鏡像化合物も包含されることが理解される。本開示は、当該化合物、例えば、Ｌ－ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合するＤ－ＶＥＧＦ－ＡおよびＤ－ペプチド性化合物に特異的に結合するＬ－ペプチド性化合物の両方のバージョンを包含することを意味する。Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａタンパク質は、主に様々なインビトロ用途において標的化されうる一方で、Ｌ－ＶＥＧＦ－Ａタンパク質は、様々なインビトロ用途および／またはインビボ用途に対して標的化されうることが理解される。

【0275】

アミノ酸残基の「類似体」という用語は、参照アミノ酸残基の側鎖基の構造的および／または機能的な類似体である側鎖基を有する残基を指す。一部の実例では、アミノ酸類似体は、一つ以上の天然アミノ酸の骨格構造、および／または側鎖構造を共有し、その差異は、分子中の一つ以上の修飾基である。こうした修飾には、限定されないが、関連する原子（Ｓなど）に対する原子（Ｎなど）の置換、基（メチル基、もしくはヒドロキシル基など）または原子（Ｆ、Ｃｌ、もしくはＢｒなど）の付加、基の欠失、共有結合の置換（単結合を二重結合になど）、またはそれらの組み合わせが含まれうる。例えば、アミノ酸類似体は、アルファ－ヒドロキシ酸、およびアルファ－アミノ酸等を含んでもよい。一部の事例では、アミノ酸残基の類似体は、アミノ酸の置換バージョンである。アミノ酸残基の「置換バージョン」という用語は、参照アミノ酸残基の側鎖中に存在しない側鎖基上に一つ以上の追加的な置換基を含む側鎖基を有する残基を指す。

【0276】

「芳香族アミノ酸」および「芳香族残基」という用語は、互換的に使用され、側鎖基がアリール、置換アリール、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリール基を含むアミノ酸残基を指す。一部の事例では、側鎖基は、アリール－アルキル、置換アリール－アルキル、ヘテロアリール－アルキル、または置換ヘテロアリール－アルキル基である。この用語は、天然起源および非天然起源のアルファアミノ酸を含むことが意図される。天然起源の当該芳香族残基には、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンが含まれる。

【0277】

「炭素環式アミノ酸」および「炭素環式残基」という用語は、互換的に使用され、側鎖基がアリール基または飽和炭素環式基を含むアミノ酸残基を指す。一部の事例では、側鎖基は、シクロアルキル－アルキル基または置換シクロアルキル－アルキル基である。当該非天然起源の側鎖基には、限定されないが、シクロヘキシル－ＣＨ_２－、シクロペンチル－ＣＨ_２、シクロヘキシル－（ＣＨ_２）_２－ 、およびシクロペンチル－－（ＣＨ_２）_２－が含まれる。

【0278】

「複素環式アミノ酸」および「複素環式残基」という用語は、互換的に使用され、側鎖基がヘテロアリール基または飽和複素環式基などの複素環式基を含むアミノ酸残基を指す。一部の事例では、側鎖基は、ヘテロ環アルキル基または置換ヘテロ環アルキル基である。この用語は、天然起源および非天然起源のアルファアミノ酸を含むことが意図される。天然起源の当該複素環式残基には、トリプトファンおよびヒスチジンが含まれる。

【0279】

「非極性アミノ酸残基」および「非極性残基」という用語は、水素（すなわち、Ｇ）または非極性基である側鎖を含むアミノ酸残基を指す。一部の事例では、非極性アミノ酸側鎖は疎水性基である。この用語は、天然起源および非天然起源のアルファアミノ酸を含むことが意図される。天然起源の当該非極性アミノ酸残基は、天然起源の疎水性残基を含む。

【0280】

「疎水性アミノ酸」および「疎水性残基」という用語は、互換的に使用され、側鎖基が疎水性基であるアミノ酸残基を指す。この用語は、天然起源および非天然起源のアルファアミノ酸を含むことが意図される。天然起源の当該疎水性残基には、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、およびバリンが含まれる。

【0281】

「極性アミノ酸」および「極性残基」という用語は互換的に使用され、側鎖基が極性基または荷電基を含むアミノ酸残基を指す。特定の事例では、極性基は、水素結合ドナーまたは受容体であることができる。この用語は、天然起源および非天然起源のアルファアミノ酸を含むことが意図される。天然起源の当該極性残基には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、およびトリプトファンが含まれる。

【0282】

「足場」および「足場ドメイン」という用語は、互換的に使用され、当該ペプチド性化合物が生成された、または当該ペプチド性化合物が例えば、配列アライメント法または構造アライメント法を介して比較することができる参照ペプチド性フレームワークモチーフを指す。足場ドメインの構造モチーフは、天然起源のタンパク質ドメイン構造に基づくことができる。特定のタンパク質ドメイン構造モチーフについては、いくつかの関連する基礎となる配列が利用可能であることがあり、そのうち任意の一つが、足場ドメインの特定の三次元構造を提供することができる。足場ドメインは、特徴的なコンセンサス配列モチーフの観点から定義することができる。図１４は、ＧＡ足場ドメインの３らせんバンドル構造モチーフを提供する、天然起源の１６個の関連するタンパク質ドメイン配列のアライメントおよび比較に基づく、ＧＡ足場ドメインに対する可能性のある一つのコンセンサス配列を示す。

【0283】

「親アミノ酸配列」、「親配列」および「親ポリペプチド」という用語は、そこからバリアントペプチド性化合物が発生し、それに対してバリアントペプチド性化合物が比較されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。親ポリペプチドは、本明細書に開示される修飾またはバリアントアミノ酸のうちの一つ以上を欠失し、本明細書に開示されるバリアントペプチド性化合物と比較して機能が異なることがある。親ポリペプチドは、未変性ドメイン配列（例えば、配列番号２～２１）、既存のアミノ酸配列修飾（例えば、安定性または溶解性の増加など、ドメインに望ましい物理的特性を付与することが知られている、任意の好都合な点変異または切断など）を有する天然ドメイン足場配列、または非天然起源のコンセンサス配列（例えば、いくつかの当該天然ドメインに基づくコンセンサスモチーフの配列、図１４を参照）でもよい。

【0284】

「対応する残基」および「～に対応する残基」という用語は、例えば、図１３に示すＧＡドメイン番号付け方式によって定義されるように、変異体および親配列の等価の位置に位置するアミノ酸残基を意味するために使用される。図１３の番号付け方式は、当該化合物の配列に含まれなければならない残基の最小数または最大数を定義することを意図するものではないことが理解される。５３の残基番号付け方式に基づく当該化合物は、３らせんバンドル構造モチーフを保持するのに十分な任意の好都合数の残基を含みうる。一部の事例では、当該化合物は、Ｎ末端切断配列および／またはＣ末端切断配列（例えば、本明細書に記載される通り）を含む、５３個未満の残基を含む。

【0285】

「バリアントアミノ酸」および「バリアント残基」という用語は、互換的に使用され、基礎となる足場ドメインと比較して、修飾または変異される当該化合物の特定の残基を指す。バリアント残基は、標的に特異的に結合する望ましいドメインモチーフ構造を提供するために、（例えば、鏡像スクリーニング、親和性成熟および／または点変異を介して）選択された残基を包含する。化合物が、足場ドメインと比較して特定の位置でのアミノ酸変異またはアミノ酸修飾を含む場合、それらの特定の位置に位置するペプチド性化合物のアミノ酸残基は、「バリアントアミノ酸」と称される。こうしたバリアントアミノ酸は、標的タンパク質への特異的結合、水溶性の増加、化学合成の容易さ、代謝安定性など、結果として生じるペプチド性化合物に異なる機能を付与しうる。本開示の態様は、ＧＡ足場ドメインに基づいてファージディスプレイライブラリから選択され、（例えば、追加的な親和性成熟および／または点変異を介して）さらに開発され、そのため、ＧＡ足場ドメインと統合されたいくつかのバリアントアミノ酸を含む、ペプチド性化合物を含む。

【0286】

「バリアントドメイン」および「バリアントモチーフ」という用語は、足場ドメインの特定の位置に組み込まれたバリアントアミノ酸の配置を指す。バリアントモチーフは、残基の連続配列および／または不連続配列を包含しうる。バリアントモチーフは、化合物構造の一つの面に位置するバリアントアミノ酸を包含しうる。バリアントドメインは、基礎となる足場ドメイン構造または配列に組み込まれるか、またはそれらと一体化されるとみなされうる。当該化合物において、足場ドメインは、安定的な三次元タンパク質構造モチーフ、例えば、天然起源のタンパク質ドメインを提供することができ、一方でバリアントドメインは、標的タンパク質を特異的に結合することができる構造の修飾表面での、特徴的な最小数のバリアント残基の配置によって定義することができる。

【0287】

「フレームワーク残基」という用語は、バリアントアミノ酸ではないペプチド性化合物の足場ドメインの残留アミノ酸残基を指す。したがって、フレームワーク残基からなる構造または配列モチーフは、基礎となる足場ドメイン構造または配列の残基の対応する配置によって画定される。当該化合物の配列および構造は、バリアント残基とフレームワーク残基の組み合わせによって画定されうる。

【0288】

「変異」という用語は、足場配列などの参照配列に対するアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換を指す。

【0289】

「ドメイン」という用語は、アミノ酸残基の連続的または不連続的な配列を指す。ドメインは、一つ以上の領域またはセグメントを含みうる。「領域」および「セグメント」という用語は、互換的に使用され、一部の事例では、特定の二次的な構造的特徴を画定しうるアミノ酸残基の連続配列を指す。

【0290】

「非コア変異」という用語は、構造の疎水性コアの一部ではない構造内の位置に位置するペプチド性化合物のアミノ酸変異を指す。ペプチド性化合物の疎水性コア中のアミノ酸残基は、著しく溶媒曝露されるのではなく、分子内疎水性接触を形成する傾向がある。疎水性コア残基の特定に使用される方法論は、Dahiyat et al.(“Probing the role of packing specificity in protein design,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1997, 94, 10172-10177)に記載があり、ここで、ＰＤＢ構造は、どの側鎖がそれらの表面積の１０％未満を溶媒に曝露するかを計算するために使用された。一部の事例では、Ｄｅｇｒａｄｏの７連子繰返しモデル（DeGrado et al. “Analysis and design of three-stranded coiled coils and three-helix bundles”, Folding & Design 1998, 3: R29-R40）は、図６に図示したように、疎水性コアの「ａ」および「ｄ」残基を画定するために使用されうる。こうした方法は、ＧＡドメイン足場と共に使用するために修飾されうる。

【0291】

「表面変異」という用語は、溶媒曝露された構造内の位置に位置する足場ドメインでのアミノ酸変異を指す。Ｄ－ペプチド性化合物の表面位置でのこうしたバリアントアミノ酸残基は、そのような相互作用が起こるか否かにかかわらず、標的分子と直接相互作用することができる。一部の事例では、Ｄｅｇｒａｄｏの７連子繰返しモデルは、図６に示すように、高度に溶媒曝露される「ｃ」および「ｇ」残基を画定するために使用されうる。

【0292】

「境界変異」という用語は、疎水性コアと溶媒曝露表面との間の境界にある構造内の位置に位置する、足場中のアミノ酸変異を指す。ペプチド性化合物の境界位置でのこうしたバリアントアミノ酸残基は、このような相互作用が起こるか否かにかかわらず、部分的に疎水性コア残基と接触し、および／または部分的に溶媒曝露し、標的分子との何らかの相互作用をしうる。構造のコア残基、表面残基、および境界残基を記述するための一つの基準は、Mayo et al. Nature Structural Biology, 5(6), 1998, 470-475に記載がある。一部の事例では、図６および７Ｂに示すように、Ｄｅｇｒａｄｏの７連子繰返しモデルを利用して、少なくとも部分的に溶媒曝露された「ｃ」および「ｇ」残基を画定することができる。こうした方法および基準は、当該化合物と共に使用するために修正することができる。

【0293】

「連結配列」という用語は、二つのペプチドモチーフまたは領域を接続するアミノ酸残基の連続配列、またはその類似体を指す。特定の事例では、連結配列は、二つの逆平行らせん領域を接続するループまたは方向転換領域（例えば、本明細書に記載される通り）である。

【0294】

「安定」という用語は、例えば標的タンパク質への結合など、その通常の機能的活性の少なくとも一つを保持するように、特定の温度で生理学的条件下で折り畳まれた状態を維持することができる化合物を指す。化合物の安定性は、標準方法を使用して決定することができる。例えば、化合物の「熱安定性」は、熱溶融物（Ｔｍ）温度を測定することによって決定することができる。Ｔｍは、化合物の半分が展開される温度を摂氏で表す。一部の実例では、Ｔｍが高いほど、化合物はより安定している。

【0295】

「類似」、「保存的」、および「高度に保存的」という用語の付いたアミノ酸置換は、以下の表６に示すように定義される。アミノ酸残基置換が類似しているか、保存的であるか、または高度に保存的であるかの判定は、ポリペプチド骨格ではなく、アミノ酸残基の側鎖に基づくことができる。
アミノ酸置換の分類

【表6-1】

【表6-2】

【0296】

「特異性決定モチーフ」は、バリアント足場ドメインの特定の位置で組み込まれたバリアントアミノ酸の配置を指し、標的タンパク質へのバリアントドメインの特異的結合を提供する。モチーフは、残基の連続配列および／または不連続配列を包含してもよい。モチーフは、化合物構造の一方の面に位置し、標的タンパク質を接触させることができるバリアントアミノ酸を包含してもよく、または標的との接触を提供しないが、むしろ標的への結合を強化する天然ドメイン構造に対する修飾を提供するバリアント残基を包含してもよい。モチーフは、基礎となる足場ドメイン構造または配列、例えば、天然起源のＧＡドメインまたはＺドメインの３らせんバンドルに組み込まれるか、またはそれらと統合されるとみなされうる。

【0297】

標的タンパク質のエピトープまたは結合部位に「特異的に結合する」化合物は、当技術分野で周知の用語であり、こうした特異的または優先的な結合を決定する方法も当技術分野で周知である。化合物は、代替の細胞もしくは物質とよりも、特定の細胞もしくは物質（標的タンパク質）と、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、および／またはより大きな親和性で会合する場合に、「特異的結合」を示す。Ｄ－ペプチド性化合物は、他の物質と結合するよりも、高い親和性で、高いアビディティで、より簡単に、および／またはより長い持続時間にわたり結合する場合に、標的に「特異的に結合」する。例えば、ＶＥＧＦエピトープまたは部位に特異的にまたは優先的に結合する化合物は、他のＶＥＧＦエピトープまたは非ＶＥＧＦエピトープに結合するよりも、高い親和性で、高いアビディティで、より簡単に、および／またはより長い持続時間にわたり、このエピトープまたは部位に結合する抗体である。また、この定義を読むことによって、例えば、第一の標的に特異的にまたは優先的に結合する化合物は、第二の標的に特異的にまたは優先的に結合してもよく、または結合しなくてもよいことも理解される。そのため、「特異的結合」は、必ずしも排他的な結合を必要としない（含めることはできる）。一般的に、必ずしもではないが、結合への言及は、特異的結合を意味する。

【0298】

化合物は、一つ以上の不斉中心を含んでもよく、従って、絶対立体化学の観点から、アミノ酸およびポリペプチドについて、（Ｒ）－もしくは（Ｓ）－もしくは（Ｄ）－もしくは（Ｌ）－として定義されうるエナンチオマー、ジアステレオマー、および他の立体異性形状を生じうる。本開示は、こうした全ての可能性のある異性体、ならびにそれらのラセミ形態、ジアステレオマー形態、および光学的に純粋な形態を含むことが意図されている。本明細書に記載される化合物が、オレフィン二重結合または幾何学的非対称の他の中心を含有する場合、かつ別途指定がない限り、化合物がＥおよびＺの幾何学的異性体の両方を含むことが意図される。同様に、全ての互変異性体も含有されることが意図されている。

【0299】

「標的タンパク質」という用語は、標的ファミリーの全メンバー、ならびにその断片およびエナンチオマー、ならびにそのタンパク質模倣体を指す。本明細書に記載される当該標的タンパク質は、別途明示的な記載がない限り、標的ファミリーの全メンバー、ならびにその断片およびエナンチオマー、ならびにそのタンパク質模倣体を含むことが意図される。標的タンパク質は、治療標的または診断標的などの任意の当該タンパク質であってもよい。「標的タンパク質」という用語は、任意の好都合な組み換え体発現方法を使用して、または任意の好都合な合成方法を使用して調製されうる、または、商業的に購入される、組換え分子および合成分子、ならびに標的分子を含有する融合タンパク質、ならびに合成Ｌタンパク質またはＤタンパク質を含むことが意図される。

【0300】

本明細書において使用される場合、「ＶＥＧＦ」またはその未省略形の「血管内皮成長因子」という用語は、ＶＥＧＦ遺伝子によってコードされるタンパク質産物を指す。ＶＥＧＦという用語には、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－ＥなどのＶＥＧＦファミリーのすべてのメンバー、およびその断片とエナンチオマーが含まれる。用語ＶＥＧＦは、任意の好都合な組み換え体発現方法を使用して、または任意の好都合な合成方法を使用して調製されうる、または、商業的に購入（例えば、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１０－ＴＡ、ミネソタ州ミネアポリス）される、組換えおよび合成ＶＥＧＦ分子、ならびにＶＥＧＦ分子を含有する融合タンパク質、ならびに合成Ｌ－タンパク質または合成Ｄ－タンパク質を含むことが意図される。ＶＥＧＦは、血管形成（胚性循環系の新規形成）と血管新生（既存の血管系からの血管の成長）の両方に関与し、リンパ脈管新生として知られる過程においてリンパ管の成長にも関与しうる。ＶＥＧＦファミリーのメンバーは、細胞表面上のチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合することにより細胞応答を刺激し、それにより二量体化し、リン酸基転移を介して活性化される。ＶＥＧＦ受容体は、７つのイムノグロブリン様ドメインを含む細胞外部分、単一の膜貫通型スパン領域、および分裂チロシンキナーゼドメインを含む細胞内部分を有する。ＶＥＧＦ－Ａは、ＶＥＧＦＲ－１（Ｆｌｔ－１）およびＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１）に結合する。ＶＥＧＦＲ－２は、ＶＥＧＦに対する細胞応答のいくつかを媒介すると考えられる。ＶＥＧＦ、その生物活性、およびその受容体は十分に研究されており、Matsumoto et al. (VEGF receptor signal transduction Sci STKE.
2001:RE21)、およびMarti et al (Angiogenesis in ischemic disease. Thromb
Haemost. 1999 Suppl 1:44-52)に記載がある。例示的なＶＥＧＦのアミノ酸配列は
、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースにあり、ＶＥＧＦタンパク質および様々な疾患および病態におけるそれらの役割の詳細な説明は、ＮＣＢＩのＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎデータベースにある。
例示的な実施形態

【0301】

本開示の態様は、以下に記載される項目および例示的な実施形態で具体化される。

【0302】

第１項。 ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合するＤ－ペプチド性化合物であって、化合物がＧＢ１ドメイン足場を含まないことを条件とする、Ｄ－ペプチド性化合物。

【0303】

第２項。 非極性残基、芳香族残基、複素環式残基および炭素環式残基から独立的に選択される６個以上のＶＥＧＦ－Ａ接触残基を含むＶＥＧＦ－Ａ結合面を合わせて画定する、少なくとも二つの逆平行らせん領域［らせんＡ］および［らせんＢ］を含むＶＥＧＦ－Ａ結合２らせん複合体を含む、第１項のＤ－ペプチド性化合物。

【0304】

第３項。 ［らせんＡ］および［らせんＢ］がそれぞれ、７連子繰返し配列（ａｂｃｄｅｆｇ）_ｎを含み、６個以上のＶＥＧＦ－Ａ接触残基が、７連子繰返し配列のｃおよびｇ位置に位置付けられる、第２項のＤ－ペプチド性化合物。

【0305】

第４項。 第１項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、
それぞれ７連子繰返し配列（ａｂｃｄｅｆｇ）_ｎを含み、実質的にａ残基およびｄ残基を含む疎水性コアを画定するように構成されたらせん領域［らせん１］、［らせん２］、および［らせん３］を含む、ＶＥＧＦ－Ａ結合３らせんバンドルを含み、
［らせん２］および［らせん３］が、互いに逆平行を構成し、非極性、芳香族、複素環式、および炭素環式残基から独立的に選択される６個以上のＶＥＧＦ－Ａ接触残基を含む、前記３らせんバンドルのＶＥＧＦ－Ａ結合ｇ－ｇ面を合わせて画定する、第１項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0306】

第５項。 ３らせんバンドルが、式（Ｉ）のＧＡドメインモチーフであり、
［らせん１］－［リンカー１］－［らせん２］－［リンカー２］－［らせん３］
（Ｉ）
［リンカー１］および［リンカー２］が独立的に、１～１０残基のペプチド結合配列である、第４項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0307】

第６項。 ６個以上のＶＥＧＦ－Ａ接触アミノ酸残基が、ＶＥＧＦ－Ａに接触するように構成され、ｇ－ｇ面のｃおよびｇの溶媒曝露位置に位置付けられる４個以上の芳香族アミノ酸残基を含む、第４～５項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0308】

第７項。 ［らせん２］が、７連子繰返し配列［ｃ^１ｄ^１ｅ^１ｆ^１ｇ^１ａ^２ｂ^２ｃ^２ｄ^２］を含み、［らせん３］が、７連子繰返し配列［ｅ^１ｆ^１ｇ^１ａ^２ｂ^２ｃ^２ｄ^２ｅ^２ｆ^２ｇ^２ａ^３ｂ^３ｃ^３ｄ^３ｅ^３］を含み、
［らせん２］の残基ｄ^２， ａ^２およびｄ^１が、［らせん３］の残基ａ^２， ｄ^２およびａ^３と相互作用し、
［らせん２］の残基ｃ^２， ｇ^１およびｃ^１、ならびに［らせん３］の残基ｇ^１が、それぞれ独立的に、芳香族、複素環式、または炭素環式残基である、第４～６項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0309】

第８項。 ＶＥＧＦ－Ａ結合表面が、らせんＡおよびらせんＢの７連子繰返し配列のｃおよびｇ位置に位置するＶＥＧＦ－Ａ接触残基の以下の構成を含み、

【化3】

式中、
各ｈ＊は、独立的にヒスチジンまたはその類似体であり、
ｆ＊は、フェニルアラニンまたはその類似体であり、
各ｕは、独立的に、非極性アミノ酸残基である、第２～７項のいずれか一つに記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0310】

第９項。 第４～５項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、
［らせん２］は次式であり、
ｈ＊ｊｘｘｆ＊ｊｘｈ＊ｊ（配列番号１５１）
［らせん３］は次式であり、
ｈ＊ｊｘｕｊｘｘｕｊ （配列番号１５２）
式中、
各ｈ＊は、独立的にヒスチジンまたはその類似体であり、
ｆ＊は、フェニルアラニンまたはその類似体であり、
各ｕは、独立的に、非極性アミノ酸残基であり、
各ｊは、独立的に疎水性残基であり、
各ｘは、独立的にアミノ酸残基である。

【0311】

第１０項。 第９項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、［らせん２］が、次式の配列によって定義される。
ｚｈ＊ｊｘｘｆ＊ｊｘｈ＊ｊｚ（配列番号１５３）
式中、各ｚは独立的に、らせん末端残基である。

【0312】

第１１項。 各らせん末端残基（ｚ）が、ｄ、ｐおよびＧから独立的に選択される、第１０項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0313】

第１２項。 ［リンカー２］が、２アミノ酸残基以下の長さであり、チロシン残基またはその類似体を含む、第５～１１項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0314】

第１３項。 第５～１２項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、［らせん２］－［リンカー２］－［らせん３］が、次式の配列を含む。
ｚｈ＊ｊｘｘｆ＊ｊｘｈ＊ｊｚｙ＊ｘｘｈ＊ｊｘｕｊｘｘｕｊｘ（配列番号１５４）
式中、
ｙ＊は、チロシンまたはその類似体であり、
各ｈ＊は、独立的にヒスチジンまたはその類似体であり、
ｆ＊は、フェニルアラニンまたはその類似体であり、
各ｕは、独立的に、非極性アミノ酸残基であり、
各ｊは、独立的に疎水性残基であり、
各ｘは、独立的にアミノ酸残基である。

【0315】

第１４項。 第５～１３項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、［リンカー１］が、次式の配列を有する。
ｚ（ｘ）_ｎｅ＊ｚ（配列番号１４８）
式中、
各ｘはアミノ酸であり、ｎは１、２、または３であり、
各ｚは独立的に、らせん末端残基（例えば、Ｇまたはｐ）であり、
ｅ＊は、グルタミン酸またはその類似体である。

【0316】

第１５項。 第５～１４項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、［リンカー１］－［らせん２］－［リンカー２］－［らせん３］が、次式の配列を含む。
ｚｘｘｅ＊ｚｈ＊ｊｘｘｆ＊ｊｘｈ＊ｊｚｙ＊ｘｘｈ＊ｊｘｕｊｘｘｕｊｘ（配列番号１５５）
式中、
ｅ＊は、グルタミン酸またはその類似体であり、
各ｚは、独立的に、らせん末端残基であり、
ｙ＊は、チロシンまたはその類似体であり、
各ｊは、独立的に疎水性残基であり、
各ｕは、独立的に非極性アミノ酸残基であり、
各ｘは、独立的にアミノ酸残基である。

【0317】

第１６項。 第４～１５項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、［らせん２］は、次式の配列によって定義される。
ｚ^２６ｈｊ^２８ｘｘｆｊ^３２ｘｈｊ^３５ｚ^３６ （配列番号１０１）。
式中、
ｚ^２６は、ｄ、ｐおよびＧから選択され、
ｚ^３６は、ｐおよびＧから選択され、
ｊ^２８、ｊ^３２およびｊ^３５は、それぞれ独立的に疎水性残基であり、
各ｘは、独立的にアミノ酸残基である。

【0318】

第１７項。 ｊ^２８、ｊ^３２およびｊ^３５が、ａ、ｉ、ｌおよびｖから独立的に選択される、段落１６に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0319】

第１８項。 ｊ^２８、ｊ^３２およびｊ^３５が、２０１９年６月２４日に出願された米国特許出願公開第６２／８６５，４６９号の配列番号１～２１のいずれか一つから選択される、ＧＡ足場ドメインの対応する残基である、第１７項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0320】

第１９項。 第４～１８項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、［らせん２］が、次のうちから選択される配列によって定義される。
ａ） ｐｈｖｘ^２９ｘ^３０ｆｉｘ^３３ｈａｐ（配列番号１０２）
式中、
ｘ^２９は、ｆおよびｉから選択され、
ｘ^３０およびｘ^３３は、極性アミノ酸残基から独立的に選択される、配列と、
ｂ）ａ）で定義される配列に対して８０％以上の同一性（例えば、２残基変化）を有するアミノ酸配列。

【0321】

第２０項。 第１９項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、
ｘ^２９は、ｉであり、
ｘ^３０は、ｓまたはｎであり、
ｘ^３３はｎである。

【0322】

第２１項。 第４～２０項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、［らせん３］は、次式の配列によって定義される。
ｘｘｈｊ^４１ｘｕｊ^４４ｘｘｕｊ^４８ｘｘｘ（配列番号１０３）
式中、
ｊ^４１、ｊ^４４、およびｊ^４８は、それぞれ独立的に疎水性残基であり、
各ｕは、独立的に非極性アミノ酸残基であり、
各ｘは、独立的にアミノ酸残基である。

【0323】

第２２項。 ｊ^４１、ｊ^４４およびｊ^４８は、ａ、ｉ、ｌおよびｖから独立的に選択される、第２１項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0324】

第２３項。 ｊ^４１、ｊ^４４およびｊ^４８が、２０１９年６月２４日に出願された米国第６２／８６５，４６９号の配列番号１～２１から選択されるＧＡ足場ドメインの対応する残基である、第２１項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0325】

第２４項。 段落２１に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、［らせん３］が、次のうちから選択される配列によって定義される。
ａ） ｘ^３８ｘ^３９ｈｖｘ^４２Ｇｌｘ^４５ｘ^４６ａｉｘ^４９ｘ^５０ａ（配列番号９８）
式中、
ｘ^３８は、ｖ、ｅ、ｋ、ｒから選択され、
ｘ^３９、ｘ^４２、ｘ^４６およびｘ^５０は、親水性アミノ酸残基（例えば、ｎ、ｓ、ｄ、ｅおよびｋ）から独立的に選択され、および
ｘ^４５およびｘ^４９は、ｌ、ｋ、ｒおよびｅから独立的に選択され、
ｂ）ａ）で定義される配列に対して８０％以上の同一性（例えば、２残基変化）を有するアミノ酸配列。

【0326】

第２５項。 ｘ^３８はｖであり、ｘ^３９はｓであり、ｘ^４２はｎであり、ｘ^４５はｋであり、ｘ^４６はｎであり、ｘ^４９はｌであり、ｘ^５０はｋである、第２４項のＤ－ペプチド性化合物。

【0327】

第２６項。 段落４－２５のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、化合物のＶＥＧＦ－Ａ結合ドメインが、参照ＧＡ足場配列に対して６個以上のバリアントアミノ酸残基を含み、６個以上のバリアントアミノ酸が、位置２５のｅ、位置２６のｐ、位置２７のｈ、位置２８のｖ、位置２９のｉ、位置３０のｓ、位置３１のｆ、位置３４のｈ、位置３６のｐ、位置３７のｙ、位置３９のｓ、位置４０のｈ、位置４３のＧ、および位置４７のａから選択される。

【0328】

第２７項。 化合物が、位置２６のｐ、位置３１のｆ、および位置３６のｐを含む、第２６項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0329】

第２８項。 化合物が、位置２６のｐ、位置２９のｉ、位置３０のｓといったバリアントアミノ酸を含む、第２６項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0330】

第２９項。 化合物が、位置２７、位置３４、および位置４０にｈを含む、段落２６～２８のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0331】

第３０項。 化合物が、位置４３のＧ、および位置４７のＡを含む、第２６～２９項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0332】

第３１項。 化合物が位置２８のｖを含む、第２６～３０項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0333】

第３２項。 第１～３１項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物であって、化合物が、
ａ） ｌｌｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋｃＧｉｔｅｐｈｖｉｓｆｉｎｈａｐｙｖｓｈｖｎＧｌｋｎａｉｌｋａと、
ｂ）ａ）で定義される配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0334】

第３３項。 ［らせん１］が、ａ） ｌ^６ｌｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋａ^２１（配列番号７４）、およびｂ） ａ）で定義される配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、から選択される配列を含む、第４～３２項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0335】

第３４項。 化合物が、ａ） Ｇ^２２ｉｔｅｐｈｖｉｓｆｉｎｈａｐｙｖｓｈｖｎＧｌｋｎａｉｌｋａ^５１（配列番号８４）、およびｂ） ａ）で定義される配列に対して７５％以上の同一性を有する アミノ酸配列から選択される配列を含む、第１～３３項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0336】

第３５項。 化合物が、ａ） ｌ^６ｌｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋａＧｉｔ．．．．．．．ｉｎ．ａ．．ｖ．ｖｎ．．ｋｎ．ｉｌｋａ^５１（配列番号１５６）、およびｂ） ａ）で定義される配列に対して８８％以上の同一性を有するアミノ酸配列、から選択されるペプチド性フレームワーク配列を含む、第１～３４項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0337】

第３６項。 化合物が、ａ） ｔ^１ｉｄｑｗｌｌｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋａＧｉｔ．．．．．．．ｉｎ．ａ．．ｖ．ｖｎ．．ｋｎ．ｉｌｋａｈａ^５３（配列番号１５７）、およびｂ） ａ）で定義される配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、から選択されるペプチド性フレームワーク配列を含む、第１～３５項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0338】

第３７項。 化合物が、２０１９年６月２４日に出願された米国特許出願公開第６２／８６５，４６９号の配列番号２２～７１から選択される配列を含む、第１～３６項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0339】

第３８項。 連結された非タンパク質性ポリマー部分をさらに含む、第１～３７項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0340】

第３９項。 連結された特異的結合部分をさらに含む、第１～３７項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0341】

第４０項。 連結された特異的結合部分が、第二のＤ－ペプチド性結合ドメインである、第３９項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0342】

第４１項。 化合物が、ＶＥＧＦ結合ＧＡドメインの多量体構成を含む、第３９～４０項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0343】

第４２項。 化合物が、ホモ二量体であり、連結された二つＶＥＧＦ－Ａ結合ＧＡドメインを含む、第４０～４１項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0344】

第４３項。 ＶＥＧＦ－Ａ結合ＧＡドメインが、ポリマーリンカーを介してＮ末端残基によって接続される、第４２項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0345】

第４４項。 ＶＥＧＦ－Ａ結合ＧＡドメインモチーフが、ペプチドリンカーを介してＮ末端残基によって接続される、第４２項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0346】

第４５項。 化合物が、ヘテロ二量体である、第４０～４１項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0347】

第４６項。 第二のＤ－ペプチド性結合ドメインが、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＯＸ－４０、ＤＲ３、Ａｎｇ－２、ＬＡＧ３、ＨＳＡ、およびＩｇから選択される標的タンパク質に特異的に結合する、第４５項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0348】

第４７項。 化合物が、１００ｎＭ以下（例えば、３０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、３ｎＭ以下、１ｎＭ以下など）のＫ_Ｄ値でＶＥＧＦ－Ａタンパク質に特異的に結合する、第１～４６項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0349】

第４８項。 ＶＥＧＦ結合ＧＡドメインが、４５～６０残基（例えば、４６～５５残基、５０～５４残基など）を含む、第１～４７項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。

【0350】

第４９項。 第１～４８項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物またはその薬学的に許容可能な塩、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。

【0351】

第５０条。 組成物が、眼の疾患または状態の治療のために製剤化される、第４９項の医薬組成物。

【0352】

第５１項。 対象者において血管新生に関連する疾患または状態を治療または予防する方法であって、その方法が、それを必要とする対象者に、第１～４８項のいずれか一項に従い、有効量の化合物を、または第４９～５０項のいずれか一項に従い、有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。

【0353】

第５２項。 血管新生に関連する疾患または状態が、癌（例えば、乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌または卵巣癌）、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、黄斑変性症、網膜症および皮膚疾患（例えば、酒さ）である、第５１項に記載の方法。

【0354】

第５３項。 血管新生に関連する疾患または状態が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）である、第５１項に記載の方法。

【0355】

第５４項。 血管新生に関連する疾患または状態が、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である、第５１項に記載の方法。

【0356】

第５５項。 有効量の第二の活性薬剤を対象者に投与することをさらに含む、第５１～５４項のいずれか一項に記載の方法。

【0357】

第５６項。 第二の活性薬剤が、Ｄ－ペプチド性化合物である、第５５項に記載の方法。

【0358】

第５７項。 第二の活性薬剤は、小分子、化学療法剤、抗体、抗体断片、アプタマー、またはＬタンパク質である、第５５項に記載の方法。

【0359】

第５８項。 第二の活性薬剤が、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＯＸ－４０、ＤＲ３、ＬＡＧ３、Ａｎｇ２、ＩＬ－１、ＩＬ－６、およびＩＬ－１７から選択される標的タンパク質に特異的に結合する、第５５～５７項のいずれか一項に記載の方法。

【0360】

第５９項。 第二の活性薬剤が、ＰＤＧＦ－Ｂに特異的に結合する、第５５項に記載の方法。

【0361】

第６０項。 第二の活性薬剤が、ペグプレラニブ（Ｆｏｖｉｓｔａ）、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ）、ニボルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、およびペムブロリズマブから選択される、第５５項に記載の方法。

【0362】

第６１項。 血管新生に関連する疾患または状態のインビボでの診断または撮像のための方法であって、第１～４９項のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物を対象者に投与することと、対象者の少なくとも一部を撮像することと、を含む、方法。

【0363】

第６２項。 前記撮像が、ＰＥＴ撮像を含み、前記投与が、前記対象者の前記血管系に前記化合物を投与することを含む、第６１項に記載の方法。

【0364】

第６３項。 細胞受容体による前記化合物の取込みを検出することをさらに含む、第６１項に記載の方法。

【0365】

第６４項。 対象者にアバスチンを投与することをさらに含み、疾患または状態が、癌に関連する状態である、第６１項に記載の方法。

【0366】

以下の実施例は、限定するものとしてではなく、例証として提供されるものである。

【実施例0367】

以下の実施例は、本発明の作製方法および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、発明者が発明として見なすものの範囲を限定することを意図しておらず、また以下の実験がすべて、または実施される唯一の実験であることを表すことは意図していない。使用した数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するために努力がなされているが、いくらかの実験誤差および逸脱を考慮に入れるべきである。別途示されていない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。

【0368】

分子生化学および細胞生化学における一般的な方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001)、Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds.,
John Wiley & Sons 1999)、Protein Methods (Bollag et al., John Wiley
& Sons 1996)、Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds.,
Academic Press 1999)、Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995)、Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press
1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)に記載があり、その開示
を参照し本書に組込む。本開示の中で言及される方法、またはそれに関連する方法のための試薬、クローニングベクター、細胞、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ａｇｉｌｅｎｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．などの商業ベンダーほか、例えばＡｄｄｇｅｎｅ， Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などのリポジトリから入手可能である。

【0369】

（実施例１） Ｄ－ペプチド性化合物の選択
当該化合物は、ＷＯ２０１４／１４０８８２（Ｕｐｐａｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．）に記載される方法を使用して、合成Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａ標的タンパク質への結合のための足場ＧＡドメインファージディスプレイライブラリの鏡像スクリーニングを介して同定された。図１３は、基礎となる５３残基足場配列（配列番号２）、および足場の位置２５、２７、２８、３１、３４、３６、３７、３９、４０、４３、４４および４７での、太字の変異位置を含む、ＧＡドメインライブラリの描写を示し、その位置は、ファージディスプレイライブラリ内のバリエーションを画定する。

【0370】

手短に、５ｕｇ／ｍｌのＤ－ＶＥＧＦＡをＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに被覆した。ブロッキング後、ＧＡドメインライブラリを含む８つの足場ライブラリのプールを、空のウェル上で枯渇させた後にプレートに追加した。結合ファージを、ＯｍｎｉＭａｘ２ Ｔ１Ｒ細胞中で夜通し溶出して増幅させた。ラウンド３および４では、ラウンド２で溶出濃度が高すぎたため、約１×１０^１３ ｃｆｕ／ｍｌの標準濃度と比較して、低濃度の増幅ファージプール（約５×１０^１１ ｃｆｕ／ｍｌ）を使用した。いくつかのヒットが、ＧＡドメインライブラリからの１７個の異なる配列を含む様々なライブラリから得られた。クローン間の配列同一性に基づいて、化合物１を含む三つの代表的なクローン（図１５を参照）を、さらなる最適化のために選択した。化合物１は、親和性成熟のためのｐ３－融合ベクターへのクローン化の際に、Ｄ－ＶＥＧＦＡへの結合を保持した。

【0371】

親和性成熟の第１ラウンドについては、ソフト無作為化戦略（Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ
ｅｔ．ａｌ， １９９８）を利用して、無作為化位置２５、２７、２８、３１、３４、３６、３７、３９、４０、４３、４４および４７の各々をコードするポリヌクレオチドをハンドミックスした塩基でドープし、その結果、未変性ヌクレオチドが７０％で基礎となり、他の三つのヌクレオチドが１０％の頻度で発生するようにした。これにより、これらの位置の各々で化合物１の親配列に見られるアミノ酸の４０％の確率での保持が可能となる。親和性成熟ライブラリを、以下のＧＡドメインオリジナル配列由来のオリゴヌクレオチドおよびｓｓＤＮＡをテンプレートとして使用して、部位特異的変異誘導プロトコル（Ｆｅｌｌｏｕｓｅ ｅｔ．ａｌ．）によって構築した。
ＡＡＧＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＣ （Ｎ４）（Ｎ２）（Ｎ４） ＧＡＣ （Ｎ２）（Ｎ１）（Ｎ４） （Ｎ３）（Ｎ４）（Ｎ４） ＴＴＣＡＡＣ （Ｎ４）（Ｎ４）（Ｎ４） ＡＴＣＡＡＴ （Ｎ４）（Ｎ１）（Ｎ４） ＧＣＧ （Ｎ２）（Ｎ２）（Ｎ４） （Ｎ４）（Ｎ１）（Ｎ４） ＧＴＧ （Ｎ４）（Ｎ２）（Ｎ４） （Ｎ３）（Ｎ１）（Ｎ４） ＧＴＴＡＡＣ （Ｎ３）（Ｎ２）（Ｎ１） （Ｎ２）（Ｎ４）（Ｎ３） ＡＡＧＡＡＣ （Ｎ３）（Ｎ１）（Ｎ３） ＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴＣＡＣ（配列番号１３０）
ここで、Ｎ１は、７０％Ａ、１０％Ｃ、１０％Ｇ、および１０％Ｔの混合である。
Ｎ２は、１０％Ａ、７０％Ｃ、１０％Ｇ、および１０％Ｔの混合である
Ｎ３は、１０％Ａ、１０％Ｃ、７０％Ｇ、および１０％Ｔの混合である。
Ｎ４は、１０％Ａ、１０％Ｃ、１０％Ｇ、および７０％Ｔの混合である。

【0372】

標準手順（Ｆｅｌｌｏｕｓｅ ｅｔ．ａｌ．）を使用して、親和性成熟ライブラリをＤ－ＶＥＧＦＡに対してパンニングし、ラウンド３からの２４クローンを分析し、競合ＥＬＩＳＡを実施してそれらを親和性でランク付けした。化合物１．１を、このリストから当該クローンとして選択した。すべてのクローンの選択された位置の配列ロゴを、化合物１および未変性ＧＡドメイン（ＧＡ－ｗｔ）と比較して図２６に示す。この研究では、位置２７、位置２８、位置３１、位置３６、および位置４４は、Ｈｉｓ２７、Ｖａｌ２８、Ｐｈｅ３１、Ｐｒｏ３６、およびＬｅｕ４４として、すべてのクローンで高度に保存または保持された。芳香族残基Ｈｉｓ、ＴｙｒおよびＰｈｅは、位置３４で優勢であった。Ｈｉｓ残基またはＡｓｐ残基は、位置４０で優勢であった。ＧｌｕまたはＡｌａは、位置４７で優勢であった。

【0373】

親和性成熟の第二のラウンドを実施して、化合物１．１の親和性および安定性を向上させた。Ｐｒｏ残基が位置３６で大幅に保存されたことを考えると、骨格立体配座の変化は、コア残基それぞれを有するらせん２の配向を変化させ、選択された化合物１．１の安定性に影響を与える可能性がある。その上、Ｃ末端近くの表面曝露残基は、追加的な接触を形成することができる。したがって、コアおよび表面曝露位置を含む以下の位置を、さらなる最適化のために選択した。位置１５、１８、１９、２１、２３、２５、２６、２８、２９、３０、４７、４８、４９、５０、５１および５２。再度、部位特異的変異誘発のために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた、ソフト無作為化戦略を使用した。
ＧＣＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴ （Ｎ１）（Ｎ４）（Ｎ４） ＧＣＡＧＡＡ （Ｎ２）（Ｎ４）（Ｎ２） （Ｎ１）（Ｎ１）（Ｎ１） ＡＡＧ （Ｎ２）（Ｎ２）（Ｎ４） ＧＧＴ （Ｎ１）（Ｎ４）（Ｎ２） ＡＣＣ （Ｎ２）（Ｎ１）（Ｎ１） （Ｎ２）（Ｎ１）（Ｎ２） ＣＡＴ （Ｎ２）（Ｎ４）（Ｎ４） （Ｎ４）（Ｎ４）（Ｎ２） （Ｎ１）（Ｎ１）（Ｎ２） ＴＴＴＡＴＣＡＡＴＣＡＣＧＣＧＣ（配列番号１３１）
ＧＴＴＡＡＣＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣ （Ｎ２）（Ｎ２）（Ｎ２） （Ｎ１）（Ｎ４）（Ｎ２） （Ｎ２）（Ｎ４）（Ｎ２） （Ｎ１）（Ｎ１）（Ｎ１） （Ｎ２）（Ｎ２）（Ｎ４） （Ｎ２）（Ｎ１）（Ｎ２） ＧＣＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＧ（配列番号１３２）

【0374】

ライブラリを構築し、修正されたプロトコルを用いてＤ－ＶＥＧＦＡに対してパンニングした。Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａが高度に安定であり、３Ｍのグアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）でさえも倍率を保持することから、低～中濃度の変性剤の存在下での結合剤の選択は、親和性および安定性が改善されたクローンに対して同時に選択することができると仮定された。本手順では、ライブラリまたは増幅ファージプールを、選択の各ラウンドに対して、変性剤グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）の様々な濃度で、ＰＢＴ緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）中で再懸濁した。ファージを、３７℃で２時間インキュベートして、平衡化させた。また選択も３７℃で実施された。以下の条件が各ラウンドで使用された。

【表14】

【0375】

親和性成熟の４ラウンド後、いくつかのクローンを配列決定し、化合物１．１．１を、競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いた評価により当該クローンとして選択した。Ｃｙｓ２１をバイスタンダー変異として同定し、Ａｌａに戻して（例えば、ジスルフィド二量体化の可能性を排除するために）、当該リード化合物である化合物１．１．１（Ｃ２１Ａ）が得られた。

【0376】

さらに、ＷＯ２０１４／１４０８８２（Ｕｐｐａｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．）によって記載されている、様々な足場ファージディスプレイライブラリを、合成Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａ標的タンパク質への結合についてスクリーニングした。いくつかの足場ドメインライブラリは、ファージディスプレイスクリーニング研究中にヒットクローンを産生し、当該ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合するＤ－ペプチド性化合物が、様々な基礎となる足場ドメインのうちの一つを有しうることを示唆する。最初に、ＧＡドメイン足場ライブラリからのヒットクローンを、さらなる調査のために選択した。
Ｄ－ＶＥＧＦＡへのヒットを生成した足場リスト

【表7-1】

【表7-2】

【0377】

（実施例２） Ｄ－ペプチド性化合物の合成および折り畳み
選択された化合物を、従来のＦｍｏｃ固相ペプチド合成方法を使用して合成・精製した。一部の事例では、追加的な点変異を、例えば、本明細書に記載されるように含めた。化合物を緩衝剤中で折り畳み、本明細書に記載されるようにＶＥＧＦ－Ａ阻害活性について評価した。

【0378】

（実施例３） ＶＥＧＦ－Ａ複合体のＸ線結晶構造
Ｌ－ＶＥＧＦ－Ａと複合体化された化合物１．１．１（Ｃ Ａ）のＸ線結晶構造を得た。図１は、ＶＥＧＦ－Ａ（空間充填表現）と複合体化された例示的化合物１．１．１（ｃ２１ａ）（白色棒状表現）のＸ線結晶構造図を示す。複合体は二量体である。図１および図２では、化合物に接触するＶＥＧＦ－Ａの結合部位残基がピンク色で示されている。ＶＥＧＦ－Ａ（８～１０９）結合部位残基は太字で示している：ＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰＫＫＤ（配列番号８８）；

【0379】

式中、二量体中の単一結合部位が、下記の残基によって定義される。
鎖Ａ：ＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹ（配列番号８９）およびＮＤＥＧＬ（配列番号９０）、および
鎖Ｂ：ＹＩＦＫＰ（配列番号９１）およびＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩ（配列番号９２）。

【0380】

（実施例４） 選択された化合物の効力を評価する
ＶＥＧＦ－Ａに対する当該化合物の結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して測定した。
例示的なＬ－ペプチド性化合物のＤ－ＶＥＧＦ－Ａ結合親和性

【表8】

【0381】

当該化合物を、競合ファージＥＬＩＳＡアッセイでＶＥＧＦ－Ａ結合について評価した。
例示的Ｌペプチド性化合物のＤ－ＶＥＧＦ－Ａ結合活性

【表9-1】

【表9-2】

【0382】

当該化合物を、ＯｃｔｅｔアッセイでＶＥＧＦ－Ａ：ＶＥＧＦＲ１の阻害について評価した。例示的な状態：１０ｎＭでのＶＥＧＦ－Ａ、濃度ｎＭでの阻害剤、ＶＥＧＦ－Ａ：ＶＥＧＦＲ１ Ｋ_ｄ＝２５ｐＭ。
ＶＥＧＦ－Ａ： 例示的なＤ－ペプチド性化合物のＶＥＧＦＲ１阻害活性

【表10】

ＶＥＧＦ－Ａ： 例示的なＤ－ペプチド性化合物のＶＥＧＦＲ１阻害活性

【表11】

【0383】

（実施例５） 二量体化合物の調製および評価
修飾化合物１．１．１（ｃ２１ａ）の一連の二量体を、システインマレイミドまたはジスルフィド共役ケミストリーを使用して、化合物のＮ末端またはＣ末端のいずれかに、様々なＰＥＧ系リンカーを共役することによって、様々な長さのリンカーを有するように調製した。化合物のＣ末端またはＮ末端のいずれかにシステイン残基が組み込まれ、二官能性修飾ＰＥＧリンカーを用いたシステイン－マレイミド共役ケミストリーを介して二量体化が達成された。例示的な二量体化合物の構造を以下に示す。

【化4】

【0384】

得られた二量体化合物を、オクテットアッセイでＶＥＧＦ－Ａ阻害活性について検定した。
ＯｃｔｅｔアッセイによるＶＥＧＦＲ１受容体へのＶＥＧＦ－Ａ結合の阻害

【表12-1】

【表12-2】

条件：１０ｎＭでのＶＥＧＦ－Ａ、２０ｎＭ（または２５ｎＭ＊）での阻害剤、ＶＥＧＦ－Ａ：ＶＥＧＦＲ１ Ｋ_ｄ＝２５ｐＭ。
１００％＝１００ｎＭのＰＥＧ１１リンカーとＣ－Ｃ－連結した（１．１．１（ｃ２１ａ））二量体

【0385】

（実施例６） フェニルアラニン３１および／またはチロシン３７アミノ酸類似体を含む合成点変異の調製および評価
図２１および２４に示すＸ線結晶構造の分析に基づいて、フェニルアラニン３１およびチロシン３７の様々な非天然起源アミノ酸類似体を、例示的化合物１．１．１（ｃ２１ａ）への組み込みのために選択した。化合物１．１．１（ｃ２１ａ）－ＰＥＧ６ Ｎ～Ｎの連結二量体の一連の類似体を、本明細書に記載される方法に従って調製した。化合物の活性は、以下の条件下で阻害アッセイで評価される。表１３は、２０ｎＭでのＶＥＧＦ－Ａ参照化合物１．１．１（ｃ２１ａ）－ＰＥＧ６ Ｎ対Ｎ結合二量体に対する、２０ｎＭの化合物、１０ｎＭのＶＥＧＦ－Ａでの阻害率を示す。
合成点変異を有する１．１．１（ｃ２１ａ）－ＰＥＧ６ Ｎ－Ｎ二量体類似体化合物の活性

【表13-1】

【表13-2】

【0386】

（実施例７） ＶＥＧＦ－ＡのＤ‐ペプチド性拮抗薬の親和性最適化
ＧＡドメインライブラリの鏡像ファージディスプレイスクリーニングを使用して、Ｄ－ペプチド性ＶＥＧＦ－Ａ拮抗薬を特定した。Ｕｐｐａｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．により２０１８年６月２１日に出願され、かつ題名「Ｄ－ペプチド性ＶＥＧＦ－Ａ結合化合物および使用方法」を有する、米国特許出願公開第６２／６８８，２７２号を参照のこと。例示的化合物１１０５５（図３Ｂ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定される、３１ｎＭのＶＥＧＦ－Ａ結合親和性を示す。これは、臨床的に承認されたＶＥＧＦ－Ａ拮抗薬であるベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）よりも有意に弱く、ＶＥＧＦ－Ａへのサブナノモル結合を示し、ｉｎ ｖｉｖｏでその生物活性を遮断することができる。本開示は、ＶＥＧＦ－Ａの強力な拮抗薬である、１１０５５の高親和性バリアントを提供するファージディスプレイに基づく親和性成熟の使用について説明する。

【0387】

１１０５５の高親和性バリアントを設計するために、ｐＩＩＩ融合ファージディスプレイライブラリを、ＶＥＧＦ－Ａに結合した化合物１１０５５のＸ線結晶構造の分析に基づいて設計した。２．３オングストローム分解能構造を、ハンギングドロップ法を使用して、ＶＥＧＦ－Ａと複合体化された１１０５５で解決した。回折品質の結晶を、０．１ＭのトリスｐＨ８．５、０．２Ｍの塩化カルシウム、１８％ｗ／ｖのＰＥＧ４０００中で成長させた。構造を、分子置換によって解決した。結晶構造は、ＶＥＧＦ－Ａホモ二量体に結合された１１０５５の二つの分子を示し、ここでＶＥＧＦ－Ａ単量体上の同一の結合部位を占め、これらの部位は、ＶＥＧＦ－ＡのＶＥＧＦＲ２受容体結合部位と重複している（図２８Ａおよび２８Ｂ）。

【0388】

この構造に基づいて、ライブラリは、バリアントＧＡドメインの３らせん構造をさらに安定化するように設計した。らせん１（Ｈ１）と、らせん２（Ｈ２）およびらせん３（Ｈ３）を接続するループとの間の充填界面で、無作為化のために合計７個のアミノ酸残基を選択した（図２９Ａ）。クンケル変異誘発を使用して、ライブラリを調製し、同時に１５個の可能性のあるＡＡ置換を表すＮＮＣ縮重コドンでそれぞれの選択された残基を無作為化した（図２９Ｂ）。結果として生じるファージライブラリは、１×１０^１０超の個々のバリアントを含み、鏡像ファージディスプレイ方法を使用して、再折り畳みされたＤ－ＶＥＧＦ－Ａ標的への結合についてスクリーニングした。例えば、Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ （２０１２）， １０９（３７）， １４７７９－１４７８４を参照のこと。簡潔に述べると、ビオチン化Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａ標的に対して、４ラウンドのパンニングを実施した。各ラウンドについて、ファージライブラリをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の標的と共にインキュベートし、ストレプトアビジン被覆ビーズ上で捕捉した標的結合ファージを洗浄し、次ラウンドの感染およびファージ増幅用に溶出した。各ラウンド中、結合されたファージクローンは、ますます厳しい温度および洗浄条件に曝露され、標的に対する高親和性の結合剤を生成するために選択圧を増加させた。第四ラウンドの選択後、個別のファージクローンが配列決定され、バリアントＧＡドメインの位置７と位置３８に二つの固定システイン残基、および位置１、位置２、位置３、位置４、位置６、および位置３７に好ましいアミノ酸残基を含有する好ましいコンセンサスモチーフが同定された（図３０Ａ）。

【0389】

上述のＸ線結晶構造に基づき（図２９Ａ）、位置７および位置３８のシステイン変異は、側鎖スルフヒドリル基を、分子内ジスルフィド結合を形成するのに十分に近接した範囲内に配置するようである（図３０Ｃ）。三次元構造のこの分析は、コンセンサスモチーフの結果に示す位置７および位置３８で対になったシステインの固定保存と一貫性がある（図３０Ａ）。５つの代表的なバリアント（配列番号２１～２５）を、Ｄ－エナンチオマーとして合成し、天然Ｌ－ＶＥＧＦ－Ａに対するそれらの結合親和性を、ＳＰＲを使用して測定した（図３０Ｂ）。バリアント９７９１１０は、最も高いＶＥＧＦ－Ａ親和性を有し、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の測定値は３．６ｎＭであった。したがって、親和性最適化により、ＶＥＧＦ結合は１１０５５の約１０倍に改善された。

【0390】

親和性成熟Ｄ－ペプチド性化合物を、それらの拮抗活性を測定するために、ＶＥＧＦ－Ａ遮断ＥＬＩＳＡで特徴解析した。ここで、ＶＥＧＦＲ１－Ｆｃ融合物を、ＰＢＳ中、１ｕｇ／ｍＬで、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上で夜通し被覆した。１ｎＭのビオチン化－ＶＥＧＦ－Ａを拮抗薬滴定と混合し、ビオチン化－ＶＥＧＦ－ＡのＶＥＧＦＲ１－Ｆｃへの結合をストレプトアビジン－ＨＲＰで検出した。バリアント化合物９７９１１０は、ＶＥＧＦＲ１へのＶＥＧＦ－Ａ結合を遮断し、このアッセイでの阻害定数（ＩＣ５０）３．５ｎＭを示したが、これは、１１０５５（５２ｎＭ）よりも１４．８倍優れており、結合親和性の改善と一貫性がある（図３１Ａ）。

【0391】

ＨＵＶＥＣ細胞増殖アッセイを使用して、ＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達を遮断するＤペプチド性化合物の能力を評価した。ここで、ＨＵＶＥＣ細胞増殖は、組換え体ＶＥＧＦ－Ａの存在下で増大し、ＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達を遮断する拮抗薬化合物は、ＨＵＶＥＣ細胞増殖を低減させる。ＨＵＶＥＣアッセイにおける化合物９７９１１０の見かけのＩＣ_５０は１３１ｎＭであり、これは親化合物１１０５５よりも４倍強力であるが、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）よりも１８５倍弱いままである（図３１Ｂ）。これらのデータは、１１０５５と比較し９７９１１０のた結合親和性の改善は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）に匹敵する効力でインビボでのＶＥＧＦ－Ａ生物学的活性を遮断するのには十分ではない可能性を示唆している。

【0392】

（実施例８Ａ） ＶＥＧＦ－Ａ上の重複していないエピトープに対するＤ－ペプチド性拮抗薬のエンジニアリング
ＶＥＧＦ受容体と複合体化されたＶＥＧＦ－Ａの構造、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、利用可能であり、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインと、ＶＥＧＦ－Ａホモ二量体上の二つの同一の結合部位との間の多価相互作用を明らかにする（Markovic-Mueller et al., Structure (2017), 25, 341-352）（Brozzo et al., Blood (2012), 119(7), 1781-1788.）。ＶＥＧＦＲ２を有する化合物１１０５５／ＶＥＧ
Ｆ－Ａ複合体構造のオーバーレイは、１１０５５結合エピトープとＶＥＧＦＲ２のＩｇ様ドメインのうちの一つとの間の有意な重複を強調し（ドメイン２、Ｄ２）（図２８Ｂ）、１１０５５の拮抗活性との一貫性がある（図３１Ａ）。ところが、ＶＥＧＦＲ２の第二のＩｇ様ドメイン（ドメイン３、Ｄ３）は、１１０５５結合部位とは別個のＶＥＧＦ－Ａ上の追加的な結合部位に結合する（図２８Ｂ）。我々は、ＶＥＧＦ－Ａ上のＶＥＧＦＲ２ Ｄ３結合部位に結合することになる第二のＤ－ペプチド性拮抗薬を設計し、それによって、１１０５５とは独立して追加的な受容体結合部位を遮断するようにした。

【0393】

Ｚドメイン足場に基づいて、新規ファージディスプレイライブラリを、Ｍ１３ファージへのｐＶＩＩＩ融合として生成した。１０個の位置を、システインを除くすべてのアミノ酸を表現するトリヌクレオチドコドンを伴うクンケル変異誘発を使用した無作為化のために、Ｚドメイン内で選択した（図３２Ａおよび図３２Ｂ）。結果として生じるライブラリを、鏡像ファージディスプレイ方法を使用して、再折り畳みされたＤ－ＶＥＧＦ－Ａ標的への結合についてスクリーニングした。簡潔に述べると、ビオチン化Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａに対する３ラウンドのパンニングを、しだいに厳しくなる洗浄条件下で行った。第３ラウンドの後、ファージプールをｐＩＩＩ融合に移し、ファージ粒子上のコピー数を減少させ、移されたファージに追加２回のパンニングを行った。Ｐ３上の最終ラウンドの選択の後、個々のファージクローンが配列決定され、それぞれ位置９、位置１０、位置１３、位置１７、位置２７、および位置３５で固定アミノ酸Ｗ、Ｄ、Ｗ、Ｒ、Ｋ、およびＹを含有する好ましいコンセンサスモチーフが同定された（図３３Ａ）。代表的な５つのバリアントＤ－ペプチド性化合物を合成し（配列番号２６～３１）、未変性Ｌ－ＶＥＧＦ－Ａに対するそれらの結合親和性を、ＳＰＲを使用して測定した（図３３Ｂ）。バリアント９７８３３６は、最も高いＶＥＧＦ－Ａ親和性を有し、Ｋ_Ｄの測定値は５００ｎＭであった。ＳＰＲを使用したエピトープマッピングを実施して、化合物９７８３３６および化合物１１０５５がＶＥＧＦ－Ａ上の重複しない結合部位に結合しているかどうかを判定した。ここで、ビオチン化ＶＥＧＦ－ＡをＳＰＲチップ上に捕捉し、その結合部位を飽和させるために、５μＭの化合物９７８３３６を第一の会合ステップで結合させた。第二の会合ステップでは、５μＭの化合物９７８３３６を１μＭ １１０５５と混合し、定常状態結合の変化を測定した。センサーグラムデータは、化合物９７８３３６の飽和応答レベルを超えた化合物１１０５５の結合による応答単位の増加を示し、化合物９７８３３６および１１０５５の相加的結合を示す（図３４）。最後に、ＶＥＧＦ－Ａ遮断ＥＬＩＳＡにおいて、化合物９７８３３６は、ＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦＲ１との間の相互作用を拮抗することができ、ＩＣ_５０の測定値は９３５ ｎＭであった（図３１Ａ）。これらのデータは、９７８３３６が、１１０５５部位から独立した重複していないエピトープに結合すること、およびＶＥＧＦ－Ａ拮抗薬であることを示す。

【0394】

化合物９７８３３６のＶＥＧＦ－Ａ結合部位をさらに特徴解析するために、９７８３３６と複合体化されたＬ－ＶＥＧＦ－Ａの２．９オングストローム分解能結晶構造を解決した。回折品質の結晶を、ハンギングドロップ法を使用して、０．１Ｍビス－トリス、ｐＨ５．５、０．１５Ｍの塩化マグネシウム、２５％ｗ／ｖのＰＥＧ ３３５０中で成長させた。構造を、分子置換によって解決した。９７８３３６の二つの分子を、単一のＶＥＧＦ－Ａホモ二量体上の同一の結合部位に結合させた（図３５Ａ）。構造によって、化合物９７８３３６が、ＶＥＧＦ－Ａ上のＤ３結合部位と直接重複することが明らかになり（図３５Ｂ）、１１０５５および９７８３３６は、それぞれＶＥＧＦ－Ａ上のＤ２およびＤ３部位の両方を直接遮断する重複していないエピトープを有することが確認される（図２８Ｂおよび３５Ｂ）。

【0395】

（実施例８Ｂ） 化合物９７８３３６の親和性成熟スクリーニング
構造ベースの親和性成熟方法を使用して、化合物９７８３３６のＶＥＧＦ－Ａ結合親和性を改善した。図６Ａで画定されたＶＥＧＦ－Ａ結合ポリペプチドのコンセンサス配列に基づき、４つの残基位置（１４、２４、２８、および３２）は、強力なコンセンサスが欠失し、有意な変動が示された（すなわち、ｒ１４、ｌ２４、ｒ２８、およびｓ３２）。ＶＥＧＦ－Ａに結合した９７８３３６の結晶構造（図３５Ｅ）において、これら４つの残基は、埋設界面接触ではなかったが、概して、最適化されていない相互作用を弱くするようである。具体的には、残基ｒ１４およびｓ２８は、ＶＥＧＦと直接は接触せず、ｌ２４は酸性パッチの近くに位置する疎水性側鎖であり、ｒ２８は任意の酸性側鎖から離れすぎて、最適な塩架橋を形成することができない（４オングストローム未満）。これらの部位を、クンケル変異誘発を用いたソフト無作為化のために選択した（図３５Ｇのｘ位置を参照）。結果として生じるｐＩＩＩファージライブラリ（配列番号１５８）を、上述のような類似の高厳密性の条件を使用してパンニングして、Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａに対する改善された結合剤を特定した。選択の第３ラウンドの後、親化合物９７８３３６（配列番号１１７）と比較して、二つの優勢な変異Ｌ２４ＶおよびＳ３２Ｒを含有する、好ましいコンセンサスモチーフが同定された（図３５Ｆ）。代表的なクローン、バリアントＺドメイン９８０１８１（図３５Ｇ、配列番号１１９）を、新しいＤ－タンパク質結合剤として合成し、ＳＰＲで測定して６６ ｎＭのＶＥＧＦ－Ａ親和性が示された（図３５Ｇ）。したがって、親和性最適化により、親化合物９７８３３６の約８倍だけＶＥＧＦ結合親和性が改善された。

【0396】

（実施例９） ＶＥＧＦ－Ａの二価Ｄ‐ペプチド性拮抗薬
Ｄ‐ペプチド性拮抗薬化合物１１０５５および９７８３３６がＶＥＧＦ－Ａ上の非重複エピトープに結合し、Ｄ２およびＤ３結合部位の両方を直接遮断するものとして、標的への結合および拮抗活性についての全体的な効果を評価するために、化合物１１０５５および９７８３３６の化学的に連結された共役を設計した。化合物１１０５５および９７８３３６はどちらも、追加的なＮ末端システイン残基で化学的に合成され、これが、Ｎ末端からＮ末端への連結（図３６Ａ）を提供するために、従来の方法を使用してビス－マレイミドＰＥＧ８リンカーと共役結合された。

【化5】

ビス－Ｍａｌ－ＰＥＧ（ｎ）二機能性リンカー、式中、ｎは３、６、または８である。

【0397】

新しいヘテロ二量体、化合物９７９１１１は、ＳＰＲで測定して１．７ ｎＭのＶＥＧＦ－Ａ結合親和性が示された（図９Ｂ）。これは、二つの独立した結合剤を単一のヘテロ二量体に連結させることで、結果的に、どちらの結合剤単独よりも高い親和性を有する分子をもたらす、アビディティ効果と一貫性がある。重要なことに、ＨＵＶＥＣ細胞増殖アッセイにおいて、ヘテロ二量体９７９１１１は、Ａｖａｓｔｉｎと類似のＶＥＧＦ－Ａ遮断活性を示した。ＶＥＧＦシグナル伝達に対する細胞増殖阻害のＩＣ５０は、９７９１１１については１．１ｎＭであり、Ａｖａｓｔｉｎについては０．７ｎＭであり、１１０５５に比べて５００倍超の改善を表す（図３１Ｂ）。これらの結果をまとめると、ＶＥＧＦ－Ａのヘテロ二量体Ｄ－ペプチド性拮抗薬は、細胞ベースのアッセイでシグナル伝達活性を効果的に遮断し、ＶＥＧＦ拮抗薬として治療能力を有することが示されている。

【0398】

（実施例１０） ＶＥＧＦ－ＡのテトラドメインＤ－ペプチド性拮抗薬
Ｄ－ペプチド性化合物の親和性および力価の両方をさらに改善するために、単量体Ｄ－タンパク質拮抗薬の二量体二価拮抗薬への化学的結合のためのスキームを考案した。概念上、二つの９８０１８１ポリペプチドは、それらの炭素末端を介して互いに繋がれ、次いでポリペプチド９７９１１０は、二量体中の９８０１８１ポリペプチドの各々に部位特異的に共役されて、ＶＥＧＦ受容体係合を模倣するテトラドメインＤタンパク質を提供する。図３８Ａは、ＶＥＧＦ－Ａ二量体に結合された化合物１１０５５および９７８３３６の両方の構造のオーバーレイを示し、ここでドメインの化学結合のための例示的な部位は、ＰＥＧ誘導体を使用して示されている（図３８Ａ）。具体的には、９７８３３６炭素末端は、互いに約１５オングストローム以内であり、二つのリジン側鎖、１１０５５のｋ１９および９７８３３６のｋ７は、約２３オングストローム以内である。

【0399】

固相ペプチド合成を使用して二つの成分を並列に合成し、シングルクリック共役ステップで最終精製のために完全テトラドメイン化合物を集合する、合成戦略が開発された（図３８Ｂ）。Ｄ－タンパク質９７９１１０を、リシン１９から延びるＰＥＧ２－アジド誘導体またはＰＥＧ３－アジド誘導体のいずれかを含有する単量体として合成し、ｃ７－ｃ３８間の酸化分子内ジスルフィド結合である。９８０１８１は、ａａ炭素末端結合リンカー樹脂から合成され、合成中にホモ二量体が生成された。さらに、ＰＥＧ２－アルキン誘導体をリジン７に組み込み、９７９１１０への共役を促進させた。最終共役ステップでは、９７９１１０の二つのコピーを、クリックケミストリーを使用して９８０１８１ホモ二量体に連結して、ＰＥＧ２／ＰＥＧ２（９８０８７０）またはＰＥＧ３／ＰＥＧ２（９８０８７１）のリンカー長の組み合わせのいずれかで、テトラドメインＤ－タンパク質誘導体が得られた（図３８Ｃ）。四量体Ｄタンパク質のＳＰＲ滴定は超高結合親和性を示し、Ｋ_Ｄ測定値は、９８０８７０では０．３２ｎＭ、９８０８７１では０．４２ｎＭであった。

【0400】

Ｄ－タンパク質テトラドメイン化合物は、ＶＥＧＦ－Ａへのサブナノモル結合が可能なため、ＶＥＧＦ－Ａのサブナノモル濃度および長期インキュベーション平衡結合条件を使用して、その拮抗活性のより正確な特徴解析を、ＶＥＧＦ－Ａ／ＶＥＧＦＲ１遮断ＥＬＩＳＡで得ることができる。具体的には、１５０ｐＭのＶＥＧＦ－Ａを拮抗薬滴定をしながら夜通しインキュベートし、次いでプレート被覆されたＶＥＧＦＲ１－Ｆｃ上で５時間インキュベートして、任意の遊離ＶＥＧＦ－Ａを受容体に結合させた。これらの条件下で、親和性成熟単量体９７９１１０は、７ｎＭのＩＣ５０を有し、一方でＤ－タンパク質テトラドメイン化合物は、それらのサブナノモル結合親和性と一致して、強力なＩＣ_５０である１２８ ｐＭ（９８０８７０）および１６３ ｐＭ（９８０８７１）を示した（図３９Ａ）。重要なことに、Ｄ－タンパク質テトラドメイン化合物は、７０１ｐＭのＩＣ５０を有するベバシズマブよりも約４倍強力であり、可溶性デコイＶＥＧＦＲ１－Ｆｃ（ＩＣ５０は２２０ｐＭ）よりもわずかに良好であった。

【0401】

これらの所見をＶＥＧＦシグナル伝達阻害に翻訳するために、２９３個のルシフェラーゼレポーター細胞株で、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達のための細胞ベースのアッセイを使用した。ここで、ＶＥＧＦ－Ａは、２９３個の細胞でＶＥＧＦＲ２シグナル伝達を活性化し、機能的な読出しとしてルシフェラーゼ発現をもたらす。この系におけるＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達の阻害は、ルシフェラーゼシグナルの喪失をもたらす。ＥＬＩＳＡ条件を模倣する試みにおいて、１５０ｐＭのＶＥＧＦ－Ａを使用して、測定可能なルシフェラーゼシグナルを誘発させ、拮抗薬を滴定してこの活性を遮断した。ここで、９７９１１０は６．１ｎＭのＩＣ５０を示し、一方でテトラドメインＤ－タンパク質は、インビトロＥＬＩＳＡの結果と非常によく一致して、１８０ｐＭ（９８０８７０）および９０ｐＭ（９８０８７１）のサブナノモルＩＣ_５０を示した（図３９Ｂ）。さらに、この設定では、Ｄタンパク質テトラドメイン化合物は、ＶＥＧＦの活性を遮断するベバシズマブ（ＩＣ_５０／５３０ ｐＭ）よりも３～６倍強力であり、抗体様活性を達成する合成Ｄタンパク質の可能性を実証した。

【0402】

（実施例１１） 血管内皮成長因子の強力な非免疫原性Ｄ－タンパク質拮抗薬は、網膜血管漏出を防止し、腫瘍成長を阻害する
化学的に合成されたＤタンパク質は、抗体様効力を有するＶＥＧＦシグナル伝達を遮断し、眼疾患モデルおよび腫瘍疾患モデルにおいて有効性を示し、液性抗薬物抗体反応を回避する。

【0403】

鏡像ファージディスプレイおよび構造誘導最適化を使用して、受容体模倣メカニズムを使用したＶＥＧＦ－Ａに拮抗する完全合成Ｄタンパク質を設計した。鏡像Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａに対するファージパンニングは、正準の受容体相互作用部位を結合する独立したタンパク質を産生した。結晶構造は、親和性の成熟および化学結合の設計を誘導し、天然ＶＥＧＦ－Ａに強く結合したヘテロ二量体Ｄタンパク質を産生し、ピコモル濃度でシグナル伝達活性を阻害する。本明細書に記載されるＤ－タンパク質ＶＥＧＦ拮抗薬は、全化学合成により調製され、滲出型加齢黄斑変性のウサギ眼モデルにおける血管漏出を防止し、ＭＣ３８同系マウス腫瘍モデルにおける腫瘍成長を遅らせ、治療中または皮下免疫化後に非免疫原性であった。

【0404】

本文：
Ｄ－タンパク質は、Ｄ－アミノ酸およびアキラル性アミノ酸グリシンから全体が構成された鏡像分子である。Ｄタンパク質は、内因性プロテアーゼによる消化に抵抗し、免疫学的提示（１、４、８）に必要なペプチドへの断片化を回避し、強力なアジュバント中で乳化されて皮下注射（１、２）によって繰り返し投与される時でさえ、免疫応答を刺激しないという報告がある。

【0405】

本明細書に記載されるＶＥＧＦの拮抗薬は、滲出型ＡＭＤのウサギ眼モデルにおいて、ＶＥＧＦ－Ａによって誘発される血管漏出を完全に遮断することができた。さらに、ヒトおよびマウスのＶＥＧＦ－Ａに対する異種間活性は、ＭＣ３８同系マウスモデルにおける腫瘍成長阻害の実証、および治療後の免疫原性の欠如を可能にした。さらに、アジュバント中で乳化させた当社のＤタンパク質拮抗薬を用いた反復的な皮下免疫化後に、液性抗体応答は完全に不在であった。

【0406】

鏡像タンパク質ファージディスプレイ
多価Ｄタンパク質拮抗薬を開発するために、ＶＥＧＦ－Ａ上の非重複エピトープに対するタンパク質結合剤を同定した。それぞれ細菌タンパク質Ｇおよびタンパク質Ａに由来する５３－残基ＧＡドメインおよび５８－残基Ｚドメインタンパク質（２２、２３）は、その高い安定性、小さなサイズ、および化学合成の容易さから、ファージディスプレイのための二つの異なる３らせんバンドル足場として選択された。Ｍ１３ファージディスプレイライブラリを、それぞれ１０および１２のハード無作為化ライブラリ位置を含むＺドメイン足場およびＧＡドメイン足場用に生成された（図４６Ａ－４６Ｃ）。標的Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａ（８～１０９）のビオチン化形態を全化学合成により調製し、各ファージライブラリを、しだいに厳しくなる標的濃度および洗浄条件下（Ｓｕｐ方法）で、Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａ－ビオチンに対して個別にパンニングした。定性結合ＥＬＩＳＡでは、コンセンサスを表すファージクローンは、濃度依存的な様式でＤ－ＶＥＧＦ－Ａに結合したＧＡドメインおよびＺドメインの両方に対してヒットする（図４０Ａ）。ＧＡ結合剤は、Ｌタンパク質として合成され、Ｄタンパク質としてヒットを合成する前に可逆的結合を確認するために、ファージ競合ＥＬＩＳＡにおいて競合体として利用された。ＧＡ結合剤は、２８０ｎＭのＩＣ５０でその親ファージクローンのＤ－ＶＥＧＦ－Ａへの結合を直接遮断したが、Ｚドメインのファージクローンの結合には影響を及ぼさず（図４０Ｂ）、ＶＥＧＦ－Ａ上の二つのタンパク質が独立したエピトープを標的にしたことが示唆された。

【0407】

ＧＡおよびＺドメインヒットの両方を、Ｄ－タンパク質として合成し（それぞれＲＦＸ－１１０５５およびＲＦＸ－９７８３３６）、ＶＥＧＦ－Ａの天然Ｌタンパク質形態への結合剤としてさらに特徴解析した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してＬ－ＶＥＧＦ－Ａに対して実施されたＤ－タンパク質結合剤の滴定は、ＧＡドメイン結合剤ＲＦＸ－１１０５５に対する４３ｎＭおよびＺドメイン結合剤ＲＦＸ－９７８３３６に対する１６８ｎＭの結合親和性を明らかにし（図４７および図５１）、Ｄ－エナンチオマーが特異的結合活性を保持していたことを実証した。さらに、ＳＰＲベースのエピトープマッピング研究は、ＲＦＸ－１１０５５およびＲＦＸ－９７８３３６がＶＥＧＦ－Ａへの同時結合および相加的結合能力を有することを示し（図４８）、それらが独立エピトープおよび非重複エピトープに結合したことが確認された。

【0408】

ＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達の拮抗薬は、対称性ＶＥＧＦ－Ａホモ二量体（１６、２４）の界面に形成された二つの結合部位との相互作用を、ＶＥＧＦ受容体が遮断しないようにする必要がある。ＶＥＧＦ拮抗を評価するために、プレート上にコーティングされたＶＥＧＦＲ１－Ｆｃへのビオチン化ＶＥＧＦ－Ａ１２１アイソフォーム１２１（ＶＥＧＦ－Ａ１２１－ｂｉｏｔ）の結合を測定する、非平衡ＶＥＧＦ－Ａ１２１遮断ＥＬＩＳＡを使用した（Ｓｕｐ方法）。ＲＦＸ－１１０５５およびＲＦＸ－９７８３３６の両方が、それぞれ見かけのＩＣ５０値が５２ｎＭおよび９３５ｎＭで、ＶＥＧＦ－Ａ１２１のＶＥＧＦＲ１への結合の阻害を示した（図４０Ｃおよび図５２）。これらのＤタンパク質は、明らかな阻害活性を示した。

【0409】

Ｄタンパク質ＶＥＧＦ－Ａ拮抗薬の構造情報に基づく親和性成熟
Ｄタンパク質拮抗薬のさらなる最適化を誘導するために、ＲＦＸ－１１０５５およびＲＦＸ－９７８３３６と複合体化されたＶＥＧＦ－Ａの、それぞれ２．３Åおよび２．９Åの二つの独立した結晶構造を解決した（図５３）。いずれの場合も、Ｄタンパク質は、ＶＥＧＦ－Ａの遠位端の結合部位と対称的に相互作用する（図４１Ａおよび図４１Ｂ）。ＲＦＸ－１１０５５は、パンニング（ｈ２７、ｖ２８、ｆ３１、ｈ３４、ｐ３６、ｙ３７、ｈ４０、ｌ４４およびａ４７）を通して選択された疎水性残基および極性残基を主に利用して、ＶＥＧＦ－Ａ上の約８００ Ａ２の表面積と相互作用する（図４１Ｃ）。対照的に、Ｄタンパク質ＲＦＸ－９７８３３６は、塩基性の高い接点（ｒ１４、ｒ１７、ｋ２７およびｒ２８）を用いて、ＶＥＧＦ－Ａ上の酸性パッチと相互作用し、いくつかの極性接点（ｗ９、ｗ１３およびｙ３５）に加えて、最終的に小さめの約４５０ Ａ２の表面積を含む（図４１Ｄ）。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２と複合体化されたＶＥＧＦ－Ａの構造、ならびにホモ二量体マルチＩｇドメイン受容体とＶＥＧＦ－Ａとの間に形成される相互作用の詳細が記載されている（１６、２４）。具体的には、受容体Ｉｇ様ドメイン２および３（Ｄ２およびＤ３）は、Ｃ２対称性を有するホモ二量体ＶＥＧＦ－Ａタンパク質分子の遠位端上の二つの同一の部位に結合する（図４１Ｅ）。ＲＦＸ－１１０５５結合およびＲＦＸ－９７８３３６を有するＶＥＧＦ－Ａ／ＶＥＧＦＲ１構造のオーバーレイは、ＶＥＧＦＲ１のＤ２およびＤ３とＤ－タンパク質の直接的な重複を強調し、受容体結合阻害の競合メカニズムを明らかにする（図４１Ｆ）。興味深いことに、ＲＦＸ－１１０５５による疎水性接触、およびＲＦＸ－９７８３３６による極性接触の優勢な使用は、Ｄ２およびＤ３によって作られたＶＥＧＦ－Ａとの特定の相互作用の性質を厳密に模倣するものである（図４９Ａ－４９Ｂ）。

【0410】

ＲＦＸ－１１０５５の３らせんバンドル構造に基づいて、Ｎ末端らせん１とらせん２～３ループとの間の充填を安定化するように、７残基のソフト無作為化ライブラリを設計した（図４２Ａ）。クンケル変異誘発を使用して、システインを含む１５個の可能性のある置換を表すＮＮＣ縮重コドンでそれぞれの選択された残基を、同時に無作為化した（図２９Ｂ）。Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａに対する競合タンパク質としてＬ－ＲＦＸ－１１０５５を使用した、４ラウンドの高ストリンジェンシーのパンニングの後、位置Ｌ７および位置Ｖ３８に二つの固定システイン残基を含有するコンセンサスモチーフが同定された（図４６Ａ－４６Ｃ）。位置７および位置３８の保存されたシステイン変異は、側鎖スルフヒドリル基を近傍に配置して、分子内ジスルフィド結合を形成するものとみられる。酸化ジスルフィド結合を有するＤタンパク質として合成されたコンセンサスバリアントＲＦＸ－９７９１１０は、ＳＰＲによる結合親和性が２．３ｎＭであり、ＲＦＸ－１１０５５と比較して１９倍の親和性改善を示した（図４７および図５１）。

【0411】

ＲＦＸ－９７８３３６の親和性成熟は、ソフト無作為化を使用したさらなる調査のために、最初のパンニングから最小限の保存を示すＶＥＧＦ－Ａ接触残基の選択に関係した。合計４個の残基が選択され、クンケル変異誘発を使用して各残基をソフト無作為化した（図４２Ｂおよび図４６Ａ－４６Ｃ）。高ストリンジェンシーのパンニングの類似したアプローチを、合成Ｌ－ＲＦＸ－９７８３３６を競合体として用いて採用した。３ラウンドの選択の後、Ｌ２４Ｖ変異およびＳ３２Ｒ変異を含有する好ましいコンセンサスモチーフが同定された（図４２Ｂ）。ＺドメインコンセンサスバリアントＲＦＸ－９８０１８１をＤ‐タンパク質として合成し、結合親和性の測定値は１８ｎＭが示されたが、これはＲＦＸ－９７８３３６と比較して９倍の親和性の改善を表す（図４７および図５１）。

【0412】

親和性成熟Ｄ－タンパク質を、非平衡ＶＥＧＦ－Ａ１２１遮断ＥＬＩＳＡで評価し、それらの拮抗活性を測定した。ＲＦＸ－９７９１１０は、ＶＥＧＦＲ１－ＦｃへのＶＥＧＦ－Ａ１２１の結合を遮断し、ＩＣ５０は３．５ｎＭであり、ＲＦＸ－１１０５５と比較して１５倍の改善を示すとともに、このアッセイにおいてＩＣ５０が１．８ｎＭであったベバシズマブの効力に接近している（図４２Ｃおよび図５２）。ＲＦＸ－９７９１１０とは対照的に、ＲＦＸ－９８０１８１に対する改善された結合親和性は、その拮抗活性に効果を示さなかった（ＩＣ５０は１，６５８ｎＭであり、同じアッセイで測定されたオリジナルのリードＲＦＸ－９７８３３６の実験的な不確かさの範囲内であった（図５２）を参照）。従前の研究がＶＥＧＦ－ＡのＶＥＧＦＲ１結合が主に高親和性Ｄ２ドメイン（１５）によって駆動されることを示したことを考えると、Ｄ３ドメイン部位の遮断が、全体的な受容体係合に付随的効果を有するというのが適切な説明である。

【0413】

ＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達のヘテロ二量体Ｄタンパク質拮抗薬の全化学合成
単量体Ｄ－タンパク質の親和性および効力は、それらを化学的に連結することによって強化され、ＶＥＧＦ受容体Ｄ２ドメインとＤ３ドメインとＶＥＧＦ－Ａとの相互作用を再現した。ＶＥＧＦ－Ａに結合したＲＦＸ－１１０５５およびＲＦＸ－９７８３３６の構造、ならびにＲＦＸ－９７９１１０およびＲＦＸ－９８０１８１とのそれらの類似性に基づいて、クリック反応を使用して、それぞれ化学修飾されたリジン側鎖Ｋ１９およびＫ７を介して、部位特異的結合をそれらの間で行い、天然受容体係合を模倣するように設計されたヘテロ二量体Ｄタンパク質構築物を生成した（図５０Ａおよび図５０Ｂ）。全化学合成を採用することにより、ＲＦＸ－９７９１１０は、Ｌｙｓ１９の側鎖から延びるＰＥＧ３－アジド誘導体を含有する単量体として、Ｃｙｓ７－Ｃｙｓ３８間の分子内ジスルフィド結合を用いて合成された。Ｄ－タンパク質ＲＦＸ－９８０１８１を、ＲＦＸ－９８０１８１内に組み込まれたＰＥＧ２－アルキン誘導体でＬｙｓ７の側鎖上で合成し、ＰＥＧ－アジ化物を備えたＲＦＸ－９７９１１０への共役を促進させた。最終連結ステップにおいて、ＲＦＸ－９７９１１０を、クリックケミストリーを使用してＲＦＸ－９８０１８１と反応させて、１３ｋＤａのヘテロ二量体Ｄタンパク質（ＲＦＸ－９８０８６９）がＰＥＧ３／ＰＥＧ２リンカーと共に産生された（補足方法、図４６Ｃおよび５０Ｂ）。ＲＦＸ－９８０８６９は、化学合成および精製後のＬＣ／ＭＳスペクトルによって特徴付けされた

【0414】

ヘテロ二量体Ｄタンパク質ＲＦＸ－９８０８６９のＳＰＲ滴定は、超高結合親和性を示し、ＫＤ測定値は０．０７ｎＭで、０．１６ｎＭでのベバシズマブのものと類似したものであった（図４７および図５１）。ベバシズマブ抗体は、同様の条件下で滴定されて、サブナノモル濃度範囲における親和性を正確に決定するための測定の限界に達したと結論付けられた。観察された異常に高い結合親和性は、個々のＤ－タンパク質のヘテロ二量体への化学結合によって可能になる多価相互作用と一致したものである。

【0415】

その拮抗活性をさらに特徴解析するために、ＶＥＧＦ－Ａ１２１／ＶＥＧＦＲ１遮断ＥＬＩＳＡを採用して、長期インキュベーション平衡結合条件下でのＶＥＧＦ－Ａ１２１のサブナノモル濃度を使用した（補足的方法）。これらの条件下で、親和性成熟単量体ＲＦＸ－９７９１１０のＩＣ５０は７．６ｎＭで、一方で、Ｄタンパク質ヘテロ二量体のＩＣ５０は０．３１ｎＭであり、ＳＰＲによって測定される親和性と合理的に一致する（図４３Ａおよび図５４）。特に、Ｄタンパク質ヘテロ二量体のＩＣ５０値は、ベバシズマブよりも低く（ＩＣ５０は０．７０ｎＭ）、可溶性デコイ受容体ＶＥＧＦＲ１－Ｆｃと類似しており、ＩＣ５０値は０．２３ｎＭであった。合成ヘテロ二量体および可溶性デコイ受容体について測定されたＩＣ５０値は、アッセイ中のＶＥＧＦ－Ａ１２１の濃度に接近するもので、このアッセイで測定できる値よりも高い効力を示す。

【0416】

これらのＤタンパク質拮抗薬のＶＥＧＦシグナル伝達に対する効果を実証するために、ＶＥＧＦＲ２受容体活性化によって駆動される細胞ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイを使用した。このアッセイでは、１５０ｐＭのＶＥＧＦ－ＡがＶＥＧＦＲ２シグナル伝達を活性化し、ルシフェラーゼ発現の増加を引き起こし、一方でＶＥＧＦ－Ａの阻害はルシフェラーゼ発現の減少をもたらす。単量体Ｄタンパク質ＲＦＸ－９７９１１０は、６．１ｎＭのＩＣ５０を有し、一方でヘテロ二量体Ｄタンパク質ＲＦＸ－９８０８６９は、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達の遮断においてベバシズマブ（ＩＣ５０は０．５３ｎＭ）に相当する０．４９ｎＭのサブナノモルＩＣ５０値を示した（図４３Ｂおよび図５４）。要約すると、これらのデータは、全化学合成を使用した単量体Ｄタンパク質の化学結合が、ＶＥＧＦ－Ａとその受容体との間での非常に高い親和性の相互作用を妨害することができるヘテロ二量体をもたらしたことを実証している。

【0417】

ＲＦＸ－９８０８６９は、インビボで強力な活性を示し、非免疫原性である
ＲＦＸ－９８０８６９の活性を、滲出型ＡＭＤのウサギ眼モデルおよび同系マウス腫瘍モデルで調査し、眼疾患および腫瘍疾患の両方における用途をそれぞれ実証した。滲出型ＡＭＤのウサギ眼モデルでは、外因性ＶＥＧＦ－Ａ１６５による硝子体内負荷は、蛍光眼底血管造影（ＦＡ）を使用してモニタリングできる網膜の血管漏出を誘発する。ＶＥＧＦ－Ａ遮断は、眼内へのフルオレセインの拡散性漏出を防止することができ、これは有効性の尺度としての役割を果たす。ここでは、ＲＦＸ－９８０８６９を、アフリベルセプトと比較して、用量依存的有効性および耐久性について試験した。ＲＦＸ－９８０８６９を０．２５ｍｇまたは１．０ｍｇ／眼で単回硝子体内投与した後、ウサギは１カ月間に２回（２日目および２３日目）、外因性ＶＥＧＦ－Ａで負荷をかけ、３日後（５日目および２６日目）に眼を検査した。特に、０．２５ｍｇまたは１ｍｇのいずれかでのＲＦＸ－９８０８６９の単回投与は、両方のＶＥＧＦ負荷後に対照眼で観察された血管漏出を有意に遮断することができた（図４３Ｃ）。さらに、２６日目に、１．０ｍｇのＲＦＸ－９８０８６９の用量が、１．０ｍｇのアフリベルセプトと同等に血管漏出を完全に遮断し、０．２５ｍｇの用量は、フルオレセイン漏出および血管屈曲の増加によって特徴付けられる有効性の減少が示された（図４３Ｃ）。これらの結果は、２６日目（図４４Ａ－４４Ｂ）の研究に関与したすべての眼からのＦＡ画像の詳細な検査とスコアリングによって確認され、ＲＦＸ－９８０８６９を用いた治療の用量依存性の明確な持続性が実証された。

【0418】

ＲＦＸ－９８０８６９の腫瘍成長阻害能力を評価するために、ＲＦＸ－９８０８６９とマウスＶＥＧＦ－Ａとの交差反応性（データは示さず）の研究を行い、同系ＭＣ３８マウス腫瘍モデルを使用した。ＭＣ３８結腸癌腫瘍は、ヒトＰＤ－１用に遺伝子導入したＣ５７ＢＬ６マウスにおいて確立され、治療開始前に８２ｍｍ３に達した。同系ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＶＥＧＦ－Ａ拮抗薬の有効性について公表された先行文献を見つけることができなかったため、ニボルマブを正の対照として使用した。ＲＦＸ－９８０８６９を６ｍｇ／ｋｇ、２週間毎日投与したところ、ニボルマブを３ｍｇ／ｋｇ、隔週投与した場合と類似した腫瘍成長の阻害が示された（図４４Ａ）。２ｍｇ／ｋｇのＲＦＸ－９８０８６９および１ｍｇ／ｋｇのニボルマブは、ビヒクル対照群に対して腫瘍成長阻害を示さず、この設定において二つの処置の用量依存的有効性が確認された。１日１回のＲＦＸ－９８０８６９投与の終了後の１５日目に、腫瘍成長阻害は、ＲＦＸ－９８０８６９では６ｍｇ／ｋｇで３１％であり、ニボルマブでは３ｍｇ／ｋｇで４８％であった（図４４Ｂ）。

【0419】

ヘテロ二量体Ｄタンパク質拮抗薬の非免疫原性の可能性を強調するために、腫瘍試験の終了時に抗薬物抗体（ＡＤＡ）についてマウス血清を分析した。この完全免疫適合マウス腫瘍モデルでは、低用量および高用量の両方のＲＦＸ－９８０８６９治療群からの血漿は、ＲＦＸ－９８０８６９に対するＩｇＧ力価応答の完全な欠如を示し、一方でニボルマブ治療群は飽和レベルのＩｇＧ力価であった（図４５Ｃ）。したがって、両薬剤は完全に異種抗原であるにもかかわらず、ニボルマブのみが強いＡＤＡ反応を誘発した。腫瘍成長阻害の異なる機序を考慮して、非免疫原性がＲＦＸ－９８０８６９の固有の性質であるかどうかを判断するために、アジュバント中で乳化させたＲＦＸ－９８０８６９、ニボルマブ、またはベバシズマブのうちいずれかを反復的に皮下注射することによって、マウスを直接的に免疫化する別の試験を実施した。モノクローナル抗体を用いた免疫化は、４２日後、強力なＩｇＧ力価を発生したが、ＲＦＸ－９８０８６９は液性抗体応答が全くなかった（図４５Ｄ）。まとめると、インビボの結果は、眼および腫瘍の両方の設定における当社の合成ＶＥＧＦ－Ａ拮抗薬の強力な活性を示すだけでなく、免疫原性の欠如に関してモノクローナル抗体に対する明確な差別化も示している。

【0420】

考察
鏡像タンパク質ファージディスプレイおよび構造誘導最適化を使用して、ＶＥＧＦ－Ａ上のＤ２およびＤ３結合部位を占有したＤタンパク質拮抗薬に、二つの異なる３らせんバンドルを独立的に成熟させた（図４１Ｆ）。単量体の側鎖選択的な化学結合を介して、結果として生じる１３ｋＤａのＤタンパク質は、約１，２５０のÅ２を結合することができた。

【0421】

ＶＥＧＦ－Ａの表面積は、ピコモル親和性を達成しつつ、ＶＥＧＦ受容体結合と非常に類似したメカニズムを再現する。ＶＥＧＦ－Ａ上の４つの受容体相互作用部位すべてを遮断することによって、ＶＥＧＦ－Ａの結果的な中和は、インビボでの代謝回転とクリアランスの時間尺度では不可逆的である可能性が高い。受容体デコイメカニズムを利用してＶＥＧＦ－Ａを遮断するアフリベルセプト（２５、２６）と同様に、本明細書に記載されるヘテロ二量体Ｄタンパク質ＶＥＧＦ拮抗薬も、受容体模倣体を用い、ずっと小さな化学的に合成されたＤタンパク質フォーマットではあるものの、ＶＥＧＦ－Ａ上の全てのＶＥＧＦ受容体結合部位を遮断する。

【0422】

本明細書に記載されるヘテロ二量体Ｄ－タンパク質ＶＥＧＦ拮抗薬は、ブロルシズマブの半分のサイズであり、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に容易に可溶性であり、高用量製剤に適している。その小さなサイズから、網膜への浸透が改善され、眼から離れた後での全身的なクリアランスが迅速である。その上、タンパク質分解安定性の増加および免疫原性の欠如を含むその特性は、治療反応の持続性、炎症の低減、および長期の慢性治療によるＡＤＡの不在といった、さらなる利点を提供する。
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【0460】

材料および方法
タンパク質合成試薬
Ｆｍｏｃ－Ｄ－アミノ酸は、Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｚｈｅｎｇｙｕａｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，
ＬｔｄおよびＣｈｅｎｇｄｕ Ｃｈｅｎｇｎｕｏ Ｎｅｗ-Ｔｅｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ
， Ｌｔｄ．から購入した。Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｉｌｅ－ＯＨは、Ｃｈｅｍｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．から購入した。Ｆｍｏｃ－Ｄ－プロパルギルグリシン（Ｆｍｏｃ－Ｄ－Ｐｒａ－ＯＨ）は、Ｈａｉｙｕ Ｂｉｏｃｈｅｍから購入した。ＭＢＨＡ樹脂は、Ｓｕｎｒｅｓｉｎ Ｎｅｗ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏ． Ｌｔｄ．（西安）から購入した。Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅリンカーは、Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｔａｃｈｅｍ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｌｔｄ．から購入した。クロロ－（２－Ｃｌ）－トリチル樹脂は、Ｔｉａｎｊｉｎ Ｎａｎｋａｉ Ｈｅｃｈｅｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｌｔｄ．から購入した。Ｆｍｏｃ－ＮＨ２（ＰＥＧ）ｎ－ＣＯＯＨおよび他のＰＥＧリンカーは、Ｂｉｏｍａｔｒｉｋ Ｉｎｃ．から購入した。２－アジド酢酸は、Ａｍａｔｅｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ．から購入した。アスコルビン酸ナトリウムは、ＴＣＩ（Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｌｔｄ．から購入した。硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）は、Ｅｎｅｒｇｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。

【0461】

Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａ合成およびリフォールディング
Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａポリペプチド鎖（ＣＯＯＨ酸、残基８－１０９（３３））は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）および天然化学ライゲーションを使用して化学的に合成し、以前の研究から適合された方法を使用して、折り畳んで、タンパク質共有結合ホモ二量体を形成した（２１）。１： Ｇｌｙ１－ｔｏ－Ｄ－Ｔｙｒ１８、２： Ｄ－Ｃｙｓ１９－ｔｏＤ－Ａｒｇ４９、３： Ｄ－

【0462】

Ｃｙｓ５０－ｔｏＤ－Ａｓｐ１０２に対応する個々のペプチド断片を、段階的ＳＰＰＳ用に標準的なＦｍｏｃ化学プロトコルを使用して合成した。断片１および２をＮＨ_２ＮＨ－（２－Ｃｌ）トリチル－樹脂上で合成し、断片３を予め装填されたＷａｎｇ樹脂から合成した。簡潔に述べると、予め装填されたＦｍｏｃ－アミノアシル－Ｗａｎｇ樹脂を、まずＤＭＦ（１０ｍＬ／ｇ）で１時間膨潤させ、次いで２０％ピペリジン／ＤＭＦ（３０分）で処理してＦｍｏｃ基を除去し、ＤＭＦで再び洗浄した（５回）。それぞれ３当量の保護アミノ酸（ＤＭＦ中０．４Ｍ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の予め活性化した溶液を樹脂に追加することにより、Ｆｍｏｃ－Ｄ－アミノ酸残基を結合させた。１～２時間後、ニンヒドリン試験により、反応が完了したことが示され、樹脂をＤＭＦ（３回）で洗浄した。Ｆｍｏｃ基を除去するために、ピペリジン（ＤＭＦ中２０％）を樹脂に３０分間添加した。最後のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をＤＭＦ（３回）およびＭｅＯＨ（２回）で洗浄し、真空下で乾燥させてから、取り出して８５％ＴＦＡ、５％チオアニソール、５％ＥＤＴ、２．５％フェノールおよび２．５％の切断用の水に入れた。２時間後、樹脂をＴＦＡで洗浄し、溶出されたペプチドを、泡立つ窒素ガスにより濃縮した。粗製ペプチドを、低温のエーテルで沈殿させ、遠心分離によりペレット化し、低温のエーテルで２回洗浄してから、真空下で乾燥させた。ペプチド残基を水に溶解し、分取逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＨＰＬＣおよびＭＳにより分析した。

【0463】

Ｄ－ペプチド－ヒドラジド断片とＤ－Ｃｙｓ－ペプチド断片との間のライゲーションを以下のとおり行った：Ｄ－ペプチド－ヒドラジドを緩衝液Ａ（６ＭのＧｎＨＣｌ、ｐＨ３．０を含有する、０．２Ｍリン酸ナトリウム）中に溶解し、氷塩浴中で－１５℃に冷却し、磁気攪拌器によって穏やかに攪拌した。ＮａＮＯ_２（７当量）を加え、溶液を２０分間攪拌して、Ｄ－ペプチド－ヒドラジドをペプチド－アジドに酸化させた。４－メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）（５０当量）を、緩衝液Ｂ（６ＭのＧｎＨＣｌ、ｐＨ７．０を含有する０．２Ｍリン酸ナトリウム）中に溶解した溶液を、新たに形成されたＤ－ペプチド－アジ化物（等量）を含有する溶液に急速に添加して、余剰のＮａＮＯ_２を除去し、ペプチド－アジ化物をペプチド－ＭＰＡＡチオエステルに変換した。次に、Ｄ－Ｃｙｓ－ペプチドを緩衝液Ｂ（等量）に入れたの溶液を、新たに形成されたペプチド－ＭＰＡＡチオエステルを含有する溶液に加えた。そして反応混合物を、ＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整し、夜通しでの天然化学ライゲーションを開始させた。分析ＲＰ－ＨＰＬＣにより、反応の進捗を完了までモニタリングしてから、ＴＣＥＰにより処理した後でＨＰＬＣ精製をした。

【0464】

連結されたペプチド生成物の精製を、ＣＸＴＨＬＣ６０００／Ｈａｎｂｏｎ ＮＵ３０００調製システムで、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８／ＹＭＣ Ｃ４シリカ上、寸法２１．２×２５０ｍｍ／２０．０×２５０ｍｍのカラムを用いて行った。粗製ペプチドを調製カラムに装填し、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡの水溶液）中の、溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡの８０％アセトニトリル溶液）の濃度を浅勾配で増加させながら、毎分５ｍＬの流量で溶出した。精製された標的ペプチドを含有する画分を、分析ＬＣ－ＭＳにより同定し、合わせて、凍結乾燥させた。

【0465】

最終的な線形Ｄ－ＶＥＧＦ－Ａペプチドを、グルタチオン還元（２ｍＭ）／グルタチオン酸化（０．４ｍＭ）酸化還元対を含有する水性Ｇｕ・ＨＣｌ（０．１５Ｍ）中、ｐＨ８．４で折り畳み、５日間攪拌して完了させた（２１）。折り畳まれたＤ－ＶＥＧＦ－ＡをＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。

【0466】

ファージディスプレイライブラリおよびパンニング
以前に説明した方法（３４）により、無感作ＧＡドメインおよびＺドメインの足場ライブラリを、Ｎ末端遺伝子８主要コートタンパク質への融合物として構築した。所望のライブラリ位置の無作為化（図４６Ａ－４６Ｃ）を、トリヌクレオチドオリゴを含むクンケル変異誘発（３５）を使用して実施し、システインを除く全ての天然アミノ酸の組み込みをさせた。結果として生じるライブラリには、１０１０超の固有のメンバーが含まれていた。親和性成熟ライブラリについて、それぞれ標的ＮＮＣまたはソフト無作為化オリゴを使用して、ＲＦＸ－１１０５５またはＲＦＸ－９７８３３６親配列上でクンケル変異誘発を行った。親和性成熟の標的となる位置が図Ｓ１で強調表示されている。

【0467】

すべてのファージ選択を、以前に確立されたプロトコル（３４）に従って実行した。簡潔に述べると、ペプチドライブラリを用いた選択は、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で捕捉されたビオチン化Ｄ－ＶＥＧＦを使用して行われた。最初に、Ｄ－ＶＥＧＦの量を減少させながら（２．０ｍＭ、１．０ｍＭ、および０．５ｍＭ）、３ラウンドの選択を完了した。次いでファージプールを、Ｎ末端遺伝子３マイナーコートタンパク質ディスプレイベクターに移し、さらにＤ－ＶＥＧＦの量を減少させながら（２００ｎＭ、１００ｎＭ、および５０ｎＭ）、かつ洗浄時間を延長しながら、３ラウンドのパンニングを施した。次いで、個々のファージクローンを配列解析のために送付した。

【0468】

Ｄ－タンパク質結合剤の合成
親和性成熟Ｄタンパク質ＲＦＸ－９７９１１０およびＲＦＸ－９８０１８のポリペプチド鎖（図４６Ａ－４６Ｃ）を、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂上でＦｍｏｃケミストリー段階的ＳＰＰＳにより手動で調製した。アミノ酸の側鎖保護は以下の通りであった：Ｄ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｄ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｄ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｄ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｄ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｄ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｄ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｄ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｄ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｄ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｄ－Ｔ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）。Ｄ－ポリペプチドの鎖集合が完了し、最終的なＦｍｏｃ基が除去された後、結果として生じるＤ－ペプチドは、その側鎖を脱保護し、同時に２．５％トリイソプロピルシランおよび２．５％Ｈ_２Ｏを含有するＴＦＡで２．５時間、室温で処理することによって、樹脂支持体から切断された。粗製Ｄ－ポリペプチド生成物を、濾過により樹脂から回収し、沈殿させ、冷却ジエチルエーテルで粉砕してから、真空下で乾燥させた。Ｄ－ポリペプチド鎖は、溶解時に適切な緩衝液中で自発的に折り畳まれ、機能性Ｄタンパク質結合分子が生成された。

【0469】

Ｄ－タンパク質ヘテロ二量体の合成
ステップ１：アジド－ＰＥＧ３Ｄ－９７９１１０樹脂の調製。
Ｆｍｏｃ－アミノアシル－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂をＤＭＦ（１０～１５ｍＬ／ｇ樹脂）中で１時間膨潤させた。懸濁液を濾過し、２０％ピペリジンを含有するＤＭＦ中に交換し、連続的な窒素ガス灌流下で０．５時間、室温で維持した。次いで、樹脂をＤＭＦで５回洗浄した。Ｆｍｏｃ－Ｄ－アミノ酸－ＯＨ、ＤＩＣ、ＨＯＢｔおよびＤＭＦを樹脂に添加した。懸濁液を室温で１時間保持し、その間に窒素流を泡立たせた。ニンヒドリン試験を使用して、完了までカップリング反応を監視した。親和性成熟Ｄタンパク質ＲＦＸ－９７９１１０に対応する残りのＤ－アミノ酸を、ペプチジル樹脂に順次結合させた。アジド－ＰＥＧ３-ＣＯＯＨを、Ｌｙｓ１９の一級アミンに結合させた。保護され
たＲＦＸ－９７９１１０ポリペプチド鎖のアミノ酸配列の集合が完了した後、２０％ピペリジンを含有するＤＭＦで処理することによって、最終的なＦｍｏｃ基を除去した。ペプチジル－樹脂を、ＤＭＦ（５回）、ＭｅＯＨ（２回）、ＤＣＭ（２回）、およびＭｅＯＨ（２回）で洗浄し、次いで真空下で夜通し乾燥させた。

【0470】

ステップ２：アジド－ＰＥＧ３Ｄ－９７９１１０－樹脂の切断および脱保護。
切断溶液（ＴＦＡ／チオアニソール／ＥＤＴ／フェノール／Ｈ_２Ｏ ＝ ８７．５／５／２．５／２．５／２．５／２．５ ｖ／ｖ、１０ｍＬ／ｇペプチド樹脂）を、乾燥アジド－ＰＥＧ３－Ｄ－９７９１１０-樹脂に添加した。懸濁液を３時間振とうさせ、濾過し
、濾液を回収した。低温のエーテルを濾液に加えてペプチドを沈殿させ、これを遠心分離により回収した。白色沈殿物をエーテルで２回洗浄し、次いで真空下で夜通し乾燥させて、白色固体の粗製アジド－ＰＥＧ３－Ｄ－９７９１１０が得られた。

【0471】

ステップ３：酸化および精製。粗製アジド－ＰＥＧ３－Ｄ－９７９１１０を、Ｉ _２ を使用して酸化した。
簡潔に述べると、ペプチド（２３．５ｍｇ）を、１１ｍＬの３０％ ＡＣＮに溶解し、３３０μＬのＣＨ_３ＣＯＯＨと混合した。Ｉ_２／ＭｅＯＨ溶液を、混合物が淡黄色になるまで滴下し、次いでアスコルビン酸ナトリウム水溶液を滴下して、過剰Ｉ_２をクエンチした。酸化アジド－ＰＥＧ３－Ｄ－９７９１１０の精製を、ＣＸＴＨ ＬＣ６０００／Ｈａｎｂｏｎ ＮＵ３０００調製システムで、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８シリカ上、寸法２１．２×２５０ｍｍのカラムを用いて行った。粗製ペプチドを調製カラムに装填し、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡの水溶液）中の、溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡの８０％アセトニトリル水溶液）の濃度を浅勾配で増加させながら、毎分５ｍＬの流量で溶出した。純粋な標的ペプチドを含有する画分を、分析ＬＣ－ＭＳにより同定し、まとめて凍結乾燥して、（アルキニル－ＰＥＧ２）－Ｄ－９８０１８１とのその後のクリック反応用の精製アジド－ＰＥＧ３－Ｄ－９７９１１０が得られた。

【0472】

ステップ４：アルキニル－ＰＥＧ２Ｄ－９８０１８１樹脂の調製。
Ｆｍｏｃ－アミノアシル－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂をＤＭＦ（１０～１５ｍＬ／ｇ樹脂）中で１時間膨潤させた。懸濁液を濾過し、２０％ピペリジンを含有するＤＭＦ中に交換し、連続的な窒素ガス灌流下で０．５時間、室温で維持した。次いで、樹脂をＤＭＦで５回洗浄した。Ｆｍｏｃ－Ｄ－アミノ酸－ＯＨ、ＤＩＣ、ＨＯＢｔおよびＤＭＦを樹脂に添加した。懸濁液を室温で１時間保持し、その間に窒素流を泡立たせた。ニンヒドリン試験を使用して、完了までカップリング反応を監視した。親和性成熟Ｄタンパク質９８０１８１ポリペプチド鎖に対応する残りのＤ－アミノ酸を、順次添加した。アルキニル－ＰＥＧ２-ＣＯＯＨを、Ｌｙｓ７の一級アミンに結合させた。保護されたＲＦＸ－
９７９１８１ポリペプチド鎖のアミノ酸配列の集合が完了した後、２０％ピペリジンを含有するＤＭＦで処理することによって、最終的なＦｍｏｃ基を除去した。

【0473】

ペプチジル－樹脂を、ＤＭＦ（５回）、ＭｅＯＨ（２回）、ＤＣＭ（２回）、およびＭｅＯＨ（２回）で洗浄し、次いで真空下で夜通し乾燥させた。

【0474】

ステップ５：アルキニル－ＰＥＧ２Ｄ－９８０１８１の切断および脱保護。
切断溶液（ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ ９５／２．５／２．５ｖ／ｖ、１０ｍＬ／ｇペプチド樹脂）をアルキニル－ＰＥＧ２－Ｄ－９８０１８１ホモ二量体樹脂に添加した。混合物を３時間振とうし、濾液を回収した。低温のエーテルを濾液に加えてペプチドを沈殿させ、これを遠心分離により回収した。白色沈殿物をエーテルで２回洗浄し、次いで真空下で夜通し乾燥させて、白色固体の粗製アルキニル－ＰＥＧ２－Ｄ－９８０１８１ホモ二量体が得られた。

【0475】

ステップ６：精製。
粗アルキニル－ＰＥＧ２－Ｄ－９８０１８１ホモ二量体の精製を、ＣＸＴＨ ＬＣ６０００／Ｈａｎｂｏｎ ＮＵ３０００調製システムで、ＹＭＣ Ｃ４シリカ上、寸法２１．２×２５０ｍｍのカラムを用いて行った。粗製ペプチドを調製カラムに装填し、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡの水溶液）中の、溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡの８０％アセトニトリル水溶液）の濃度を浅勾配で増加させながら、毎分１０ｍＬの流量で溶出した。純粋な標的ペプチドを含有する画分を、分析ＬＣＭＳにより同定し、まとめて、凍結乾燥して、アジド－ＰＥＧｎ－Ｄ－９７９１１０とのクリック反応用の精製アルキニル－ＰＥＧ２－Ｄ－９８０１８１ホモ二量体が得られた。

【0476】

ステップ７：クリック反応および精製。
アジド－ＰＥＧ３－Ｄ－９７９１１０およびアルキニル－ＰＥＧ２－Ｄ－９８０１８１をエタノール：Ｈ_２Ｏ（ｖ／ｖ、１：１）に溶解し、次いで０．２ＭのＣｕＳＯ_４を反応混合物に添加し、続いて０．２Ｍのアスコルビン酸ナトリウムを添加し、反応混合物を３０℃で２時間攪拌した。反応混合物を、さらなる後処理を行うことなくＲＰ－ＨＰＬＣ上に装填し、上述のように勾配溶出により精製した。望ましい生成物を含有する画分を、ＬＣＭＳによって同定し、まとめて、凍結乾燥した。質量観測値（ＬＣ－ＭＳ）： １３１７４．０ Ｄａ、質量計算値（平均同位体組成）： １３１７６．８ Ｄａ。

【0477】

Ｄ－タンパク質のＬＣ－ＭＳ分析
分析ＲＰ－ＨＰＬＣを、ＨＰ １０９０システムで、Ｗａｔｅｒｓ Ｃ４／Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８シリカカラム（４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ／４．６×１５０ｍｍ、５．０μｍ粒子サイズ）を用いて、１．０ｍＬ／分の流量（５０℃のカラム温度）で行った。ペプチドを、水／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）と８０％のアセトニトリルの水／０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）の勾配１．０％Ｂ／分を用いて、カラムから溶出した。ペプチドのかたまりが、Ａｇｉｌｅｎｔ ６１２０ ＬＣ／ＭＳＤイオントラップを使用したインラインエレクトロスプレーＭＳ検出によって得られた。

【0478】

表面プラズモン共鳴親和性測定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ２００（ＧＥ）上で行った。ビオチン化ＶＥＧＦ－Ａ（８～１０９）をビオチンＣＡＰｔｕｒｅチップ（ＧＥ）上に固定し、段階希釈のＤ－タンパク質を、緩衝液流（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＰ２０）中で、３０ｕＬ／分でチップ上に流した。会合反応は、ＲＦＸ－１１０５５、－９７８３３６、－９７９１１０、および－９８０１８１で６０秒、またＲＦＸ－９８０８６９で１２０秒であった。解離反応を、１２０秒（ＲＦＸ－１１０５５、－９７８３３６、－９７９１１０、－９８０１８１）または３６０秒（ＲＦＸ－９８０８６９）のいずれかについて、緩衝液流中で行った。すべての測定を、２５℃で実施した。ＳＰＲデータは、複数の独立した滴定を表す。キネティックフィットを、Ｂｉａｃｏｒｅソフトウェアで、グローバル単一部位結合モデルを使用して実施した。

【0479】

結晶構造解析のためのＶＥＧＦ－Ａの発現および精製
ＶＥＧＦ－Ａ（８～１０９）ポリペプチド鎖の遺伝子配列を、発現ベクターｐＥＴ２１ｂ内にクローニングし、Ｎ末端にＨｉｓ_６タグおよびＴＥＶ切断部位配列を追加した。組換えプラスミドを、アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）で補充されたＬＢ培地中で増殖した大腸菌ＢＬ２１－Ｇｏｌｄに形質転換し、Ｈｉｓタグ付きタンパク質の発現を、１６℃で夜通し、０．３ｍＭのイソプロピル－ｂ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により誘発させた。細胞を遠心分離により採取し、次いで－８０℃で保存した。

【0480】

３０Ｌの培養物からのペレット化細胞を、１Ｌ緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、４００ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁させ、次いで高圧均質化を通過させた（３サイクル）。上清からのＨｉｓタグ付きタンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂カラム（３０ｍｌ）上で捕捉した。カラムを、２０ｍＭイミダゾールを含有する２０ＣＶの緩衝液Ａ、５ＣＶの緩衝液Ｃ（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ）、および５０ｍＭイミダゾールを含有する１０ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。Ｈｉｓ_６－タグ付き－ＴＥＶ部位－ＶＥＧＦ－Ａタンパク質を、緩衝液Ａ（５ＣＶ）中の高濃度のイミダゾール（０．２５Ｍ）で溶出した。溶出したタンパク質を、１：２０の比率（ＴＥＶ：タンパク質）でＴＥＶプロテアーゼで消化し、４℃で夜通し、５Ｌ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ）に対して透析した。切断された試料を、第二のＮｉ－ＮＴＡカラムに装填して、遊離Ｈｉｓタグを除去した。溶出されたＶＥＧＦ－Ａタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーにより、リソースＱカラム（６ｍｌ）上でさらに精製した。緩衝液Ａで平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムを使用して、最終的なＳＥＣ研磨工程を実施した。単分散ＶＥＧＦ－Ａピーク画分を、２８０ｎｍでの吸光度により同定し、まとめて緩衝液Ａ中で１０～１５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。最終的に精製されたＶＥＧＦ－Ａ（８～１０９）タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により評価したとき、９５％純粋であり、分子量は直接注入ＭＳにより確認した。

【0481】

ＶＥＧＦ－Ａ／Ｄ－タンパク質複合体の結晶構造解析
ＶＥＧＦ－Ａ／ＲＦＸ－１１０５５複合体。ＶＥＧＦ－Ａ／ＲＦＸ－１１０５５用の結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散により１８℃で成長させた。液滴は、０．８ μＬのＶＥＧＦ－Ａ／Ｄ－タンパク質複合体（２．７２ｍｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａおよび０．５ｍＭのＲＦＸ－１１０５５）と、０．２Ｍの塩化カルシウム、０．１ＭのトリスｐＨ８．５、１８％のｗ／ｖのＰＥＧ４０００を含有する０．８ μＬの結晶化溶液を、１：１で混合したもので構成された。結晶を、結晶化溶液と２０％（ｖ／ｖ）グリセロールとを含有する凍結防止溶液に浸し、液体窒素中で急速凍結した。回折データを、上海シンクロトロン放射施設のビームラインＢＬ１９Ｕ１から２．３１オングストロームの分解能まで収集し、ＸＤＳを使用して、空間群Ｐ２_１２_１２_１で処理した。構造を、検索モデルとしてＶＥＧＦ構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＱＴＫ）を有するＰｈａｓｅｒを用いて、分子置換によって解決した。初期モデル上での構造精密化とモデル構築を、Ｒｅｆｍａｃ５とＣｏｏｔの間で繰り返し行った。非対称ユニットには、｛ＶＥＧＦ－Ａ ｐｌｕｓ ＲＦＸ－１１０５５｝複合体のコピーが二つある。詳細なデータ処理および構造精密統計が図５３にリストされている。

【0482】

ＶＥＧＦ－Ａ／ＲＦＸ－９７８３３６複合体。
ＶＥＧＦ－Ａ／ＲＦＸ－９７８３３６用の結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散により１８℃で成長させた。液滴は、０．８ μＬのＶＥＧＦ－Ａ／Ｄ－タンパク質複合体（５．４４ｍｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａおよび０．４６ｍＭのＲＦＸ－９７８３３６）と、０．１５Ｍの塩化マグネシウム、０．１ＭのトリスｐＨ５．５、２５％のｗ／ｖのＰＥＧ３３５０を含有する０．８ μＬの結晶化溶液を、１：１で混合したもので構成された。結晶を、結晶化溶液と１０％（ｖ／ｖ）グリセロールとを含有する凍結防止溶液に浸し、液体窒素中で急速凍結した。回折データをＡＬＳビームライン８．３．１から２．９オングストロームの分解能で収集し、ＸＤＳを使用して空間群Ｐ２_１２_１２_１でインデックス付けした。構造を、検索モデルとしてＶＥＧＦ構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＱＴＫ）を有するＰｈａｓｅｒを用いて、分子置換によって解決した。初期モデル上での構造精密化とモデル構築を、Ｒｅｆｍａｃ５とＣｏｏｔの間で繰り返し行った。非対称ユニットには、｛ＶＥＧＦ＿Ａ ｐｌｕｓ ＲＦＸ－９７８３３６｝複合体のコピーが４つある。詳細なデータ処理および構造精密統計が図５３にリストされている。すべての構造画像は、Ｐｙｍｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社）を使用してレンダリングされた。

【0483】

ＶＥＧＦ－Ａ１２１／ＶＥＧＦＲ１－Ｆｃ結合ＥＬＩＳＡ
ビオチン化ヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１（アイソフォーム１２１）は、Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＶＥ１－Ｈ８２Ｅ７）から購入した。ＶＥＧＦＲ－１－Ｆｃは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号３５１６－ＦＬ－０５０）から購入した。

【0484】

ベバシズマブは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．によって製造された。（ロット番号３０６７９９７）。すべての場合において、１ｕｇ／ｍＬのＶＥＧＦＲ１－Ｆｃを、４℃で夜通し、ＭａｘｉＳｏｒｐプレート上で被覆した。翌日、被覆ウェルを、室温で振とうしながら、Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社）で２時間遮断した。非平衡ＥＬＩＳＡについては、Ｄタンパク質およびベバシズマブの滴定を、１．０ｎＭのビオチン化ＶＥＧＦ－Ａ１２１で３０分間インキュベートし、その後、遮断されたＶＥＧＦＲ１－Ｆｃ被覆ウェルに添加した。

【0485】

拮抗薬／ＶＥＧＦ－Ａ１２１混合物を、室温で振とうしながら、ＶＥＧＦＲ１－Ｆｃウェル上で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）で３回洗浄し、結合されたビオチン化ＶＥＧＦ－Ａ１２１をストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）で検出した。平衡結合ＥＬＩＳＡについては、Ｄタンパク質、ベバシズマブ、および溶解性ＶＥＧＦＲ１－Ｆｃの滴定を、０．１５ｎＭのビオチン化ＶＥＧＦ－Ａ１２１で、４℃で夜通しインキュベートし、その後、遮断されたＶＥＧＦＲ１－Ｆｃ被覆ウェルに添加した。拮抗薬／ＶＥＧＦ－Ａ１２１混合物を、ＶＥＧＦＲ１－Ｆｃウェル上で室温で振とうしながら、５時間インキュベートし、上記のように成長させた。プロットされたデータは、三つ揃いの測定値の平均±標準偏差である。ＩＣ_５０値は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して３パラメータ当てはめから導出され、報告されたエラーは、当てはめから導出される。

【0486】

ＶＥＧＦ細胞シグナル伝達アッセイ
ＶＥＧＦ細胞シグナル伝達の測定は、ＶＥＧＦ Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して行った。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞は、ルシフェラーゼ応答要素（ＫＤＲ／ＮＦＡＴ－ＲＥ ＨＥＫ２９３）に結合されたＶＥＧＦＲ－２を発現するように改変した。ＶＥＧＦＲ－２を介したＶＥＧＦシグナル伝達は、生物発光を使用して定量化できるルシフェラーゼの発現を媒介する。プレートに載せた細胞を、０．１５ｎＭのＶＥＧＦ－Ａ１６５と、Ｄタンパク質またはベバシズマブ滴定の存在下で３７℃で、５％のＣＯ_２で６時間インキュベートする。インキュベーション後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏを製造業者のプロトコルに従ってウェルに加え、相対発光単位（ＲＬＵ）を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ
２３００ Ｅｎｓｐｉｒｅ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅプレートリーダー上で測定した。プロットされたデータは、三つ揃いの測定値の平均±標準偏差である。ＩＣ_５０値は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して３パラメータ当てはめから導出され、報告されたエラーは、当てはめから導出される。

【0487】

ウサギ滲出型ＡＭＤモデル
Ｄｕｔｃｈ Ｂｅｌｔｅｄウサギ（１．５～２．５ｋｇ）をＷｅｓｔｅｒｎ Ｏｒｅｇｏｎ Ｒａｂｂｉｔ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。アフリベルセプトをＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから購入した。０日目に、ウサギを治療群（群当たりＮ＝５）に無作為化し、ベースライン眼科検査を行ってから、ＲＦＸ－９８０８６９（０．２５ｍｇまたは１．０ｍｇ）またはアイリーア（１．０ｍｇ）の単回硝子体内注射（眼当たり２５ｕＬ）をした。ウサギは、２日目および２３日目に、両眼に１μｇのＶＥＧＦ－Ａ_１６５で負荷をかけた。５日目および２６日目に、蛍光眼底血管造影を両眼で実施し、血管漏出を評価するために画像を撮影した。ＦＡ画像に基づく血管漏出のスコアリングを、５日目および２６日目に行った（図４４Ｂ）

【0488】

Ｃ５７ＢＬ６マウスにおけるＭＣ３８同系腫瘍モデル
ヒトＰＤ－１（１２～１３週）用に遺伝子導入したメスＣ５７ＢＬ６マウスは、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏ．から購入した。Ｎｉｖｏｌｕｍａｂは、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ロット番号＃ＡＡＹ１９９９）から購入した。ＭＣ３８腫瘍細胞（１×１０６個）を右前脇腹に皮下移植し、平均体積が８２ｍｍ３になるまで腫瘍を確立させた。マウスは、治療開始が始まった０日目に治療群（群当たりＮ＝６）に無作為化された。ＲＦＸ－９８０８６９を２ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇで毎日、２週間（１４用量）にわたり腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、ニボルマブを１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇで、２週間に１回、６用量にわたり腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。すべてのデータは、平均±ＳＥＭとしてプロットされる。

【0489】

ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける皮下免疫化
アジュバントは、ＴｉｔｅｒＭａｘから購入した。ベバシズマブは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅから購入した。メスＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週間）を、０日目に免疫群に無作為化した（群当たりｎ＝５）。０、２１、３５日目に、抗原２５μｇの皮下注射により免疫化を実施した。抗原は、０日目に注射用アジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ）中で乳化され、２１日目および３５日目にＰＢＳで投与された。血清プレブリードを、免疫化前の０、２１、３５日目に行った。最大力価応答用の最終的な出血を４２日目に採取した。

【0490】

特定の実施形態は、説明および実施例によって、理解の明瞭さを目的として、ある程度詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正がなされうることは、本発明の教示に照らして容易に理解される。

【0491】

したがって、前述は、本発明の原理を単に例示するに過ぎない。本明細書に明示的に説明または示されていないが、本発明の原理を具体化し、その精神および範囲内に含まれる様々な改作が考案されうる。さらに、本明細書に列挙されるすべての実施例および条件付き文言は、本発明の原理および発明者によって当技術分野を促進するために貢献する概念を理解する際に、読者を助けることを主に意図しており、そのような具体的に列挙された実施例および条件に限定されるものではないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態ならびにそれらの特定の実施例を列挙する本明細書のすべての記述は、その構造的および機能的な等価物の両方を包含することが意図されている。さらに、かかる等価物は、現在公知の等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造に関係なく同じ機能を実行する開発される任意の要素を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、説明される例示的な実施形態に限定されることを意図していない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ＶＥＧＦに特異的に結合する多価Ｄ‐ペプチド性化合物であって、
ＶＥＧＦの第一の結合部位に特異的に結合する能力を有するＤ－ペプチド性Ｚドメインと、
ＶＥＧＦの第二の結合部位に特異的に結合する能力を有するＤ－ペプチド性ＧＡドメインとを含む、Ｄ‐ペプチド性化合物。
(項目２)
前記第一の結合部位が、ＶＥＧＦのアミノ酸側鎖Ｅ９０、Ｆ６２、Ｄ６７、Ｉ６９、Ｅ７０、Ｋ１１０、Ｐ１１１、Ｈ１１２およびＱ１１３を含み、
前記第二の結合部位が、ＶＥＧＦの前記アミノ酸側鎖Ｆ４３、Ｍ４４、Ｙ４７、Ｙ５１、Ｎ８８、Ｄ８９、Ｌ９２、Ｉ７２、Ｋ７４、Ｍ１０７、Ｉ１０９、Ｑ１１５およびＩ１１７を含み、
前記第一および第二の結合部位がそれぞれ、前記ＶＥＧＦ標的タンパク質上のＶＥＧＦＲ２結合部位と少なくとも部分的に重複する、項目１に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目３)
前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインが、９、１０、１３、１４、１７、２４、２７、２８、３２、および３５から選択される位置に、５個以上のバリアントアミノ酸残基（例えば、６個、７個、８個、９個または１０個など、６個以上）を含むＶＥＧＦ特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）を含む、項目１または２に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目４)
前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインが、項目３０～４１のいずれか一項に記載のものである、項目２に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目５)
前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインが、２５、２７、３０、３１、３４、３６、３７、３９、４０、および４２～４８から選択される位置に、５個以上（例えば、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個）のバリアントアミノ酸残基を含む、ＶＥＧＦ特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）を含む、項目１～３のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目６)
前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインが、項目４２～６０のいずれか一項に記載のものである、項目４に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目７)
前記Ｄ－ペプチド性ＺドメインおよびＧＡドメインを共有結合する連結成分をさらに含む、項目１～３のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目８)
前記連結成分が、前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインの末端アミノ酸残基を、前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインの末端アミノ酸残基（例えば、Ｎ末端からＮ末端へのリンカーまたはＣ末端からＣ末端へのリンカー）に接続するリンカーである、項目７に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目９)
前記連結成分が、Ｎ末端からＮ末端へのリンカーである、項目８に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目１０)
前記Ｎ末端からＮ末端へのリンカーが、前記Ｄ－ペプチド性ＺドメインおよびＧＡドメインのＮ末端アミノ酸残基を接続する（ＰＥＧ） _ｎ 個の二機能性リンカーであり、式中、ｎは２～２０である（例えば、ｎは５、６、７、８、９、１０、１１または１２である）、項目９に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目１１)
前記連結成分が、
前記Ｄ－ペプチド性ＺドメインおよびＧＡドメインが前記標的タンパク質に同時に結合された時に互いに近接している、前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインのアミノ酸側鎖と、前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインの末端アミノ酸残基とを接続するリンカーであるか、または
前記Ｄ－ペプチド性ＺドメインおよびＧＡドメインが前記標的タンパク質に同時に結合される時に互いに近接している、前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインの末端アミノ酸残基と、前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインのアミノ酸側鎖とを接続するリンカーである、項目７に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目１２)
前記連結成分が、前記Ｄ－ペプチド性ＺドメインおよびＧＡドメインが同時に前記ＶＥＧＦに結合されるときに互いに近接している、前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインのアミノ酸側鎖と、前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインのアミノ酸側鎖とを接続するリンカーである、項目１１に記載のＤペプチド性化合物。
(項目１３)
前記リンカーが、前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインの位置７のアミノ酸残基の側鎖と、前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインの１９位のアミノ酸残基の側鎖とを接続する、項目１２に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目１４)
前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインとＺドメインが、前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインのｋ ^７ 残基と、前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインのｋ ^１９ 残基との間でリンカーを介して接続される、項目１３に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目１５)
前記連結成分が、前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインの前記Ｎ末端を、前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインの近位残基（例えば、ｋ ^１９ 、ｋ ^２０ またはｋ ^５０ 残基）の側鎖に接続する、項目６～１４のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目１６)
前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインが、前記ドメインの７位と３８位にある近位アミノ酸残基の間にらせん間リンカーを含む、項目１～１５のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目１７)
前記らせん間リンカーが、前記近位アミノ酸残基のアルファ－炭素間で測定される、３～７原子長の骨格を有する、項目１６に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目１８)
前記らせん間リンカーが、Ｃ _{（１－６）} アルキル、置換Ｃ _{（１－６）} アルキル、－（ＣＨＲ） _ｎ －ＣＯＮＨ－（ＣＨＲ） _ｍ －、および－（ＣＨＲ） _ｎ －Ｓ－Ｓ－（ＣＨＲ） _ｍ －から選択される一つ以上の基を含み、各Ｒが独立的にＨ、Ｃ _{（１－６）} アルキル、または置換Ｃ _{（１－６）} アルキルであり、ｎ＋ｍ ＝ ０～５（例えば、ｎ＋ｍ ＝ ２、３、４または５）である、項目１６または１７のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目１９)
前記連結成分が、前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインおよびＺドメインを連結するように構成され、それによって前記ドメインが、ＶＥＧＦ－Ａに同時に結合することができる、項目７～１８のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目２０)
前記連結成分が、アミノ酸残基、ポリペプチド、（ＰＥＧ） _ｎ リンカー（例えば、ｎは２～５０、３－５０、４－５０、６～５０または６～２０）、修飾ＰＥＧ部分、Ｃ _{（１－６）} アルキルリンカー、置換Ｃ _{（１－６）} アルキルリンカー、－ＣＯ（ＣＨ _２ ） _ｍ ＣＯ－、－ＮＲ（ＣＨ _２ ） _ｐ ＮＲ－、－ＣＯ（ＣＨ _２ ） _ｍ ＮＲ－、－ＣＯ（ＣＨ _２ ） _ｍ Ｏ－、－ＣＯ（ＣＨ _２ ） _ｍ Ｓ－、および連結された化学選択官能基（例えば、－ＣＯＮＨ－、－ＯＣＯＮＨ－、クリックケミストリー共役（１，２，３－トリアゾールなど）、マレイミド－チオール共役チオスクシンイミド、ハロアセチル－チオール共役チオエーテル、など）から選択される一つ以上の基を含み、式中、ｍは１～６であり、ｐは２～６であり、各Ｒは独立的にＨ、Ｃ _{（１－６）} アルキルまたは置換Ｃ _{（１－６）} アルキルである、項目７～１９のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目２１)
前記化合物が二価である、項目１～２０のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目２２)
前記化合物が三価である、項目１～２０のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目２３)
前記化合物が四価である、項目１～２０のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目２４)
前記化合物が、前記第一のＤ－ペプチド性Ｚドメインと相同な第二のＤ－ペプチド性Ｚドメインをさらに含む、項目１～２３のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目２５)
前記化合物が、前記第一のＤ－ペプチド性ＧＡドメインと相同な第二のＤ－ペプチド性ＧＡドメインをさらに含む、項目１～２４のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目２６)
前記化合物が、各々前記Ｄ－ペプチド性ＺドメインおよびＧＡドメインを含む二つの二価Ｄ－ペプチド性化合物の二量体として構成された四つのＤ－ペプチド性ドメインを含む、項目２３～２５のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目２７)
各二価Ｄ－ペプチド性化合物の前記Ｄ－ペプチド性ＺドメインおよびＧＡドメインが、前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインのｋ ^７ 残基と、前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインのｋ ^１９ 残基との間にあるリンカーを介して接続される、項目２６に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目２８)
前記リンカーが、次式であり、

【化6】

式中、ｎおよびｍは独立的に１～６（例えば、１、２または３）である、項目１７に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目２９)
前記二つの二価Ｄ－ペプチド性化合物が、前記二価Ｄ－ペプチド性化合物の前記Ｄ－ペプチド性ＺドメインのＣ末端アミノ酸残基間にあるリンカーを介して共有結合している、項目２８に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目３０)
前記Ｃ末端からＣ末端へのリンカーが、次式を含み、
＊－アラニン－リシン（－）＊）
式中、各－＊は、Ｄ－ペプチド性ドメインへの連結である、項目２９に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目３１)
ＶＥＧＦに特異的に結合するＤ－ペプチド性化合物であって、
Ｄ－ペプチド性Ｚドメインであって、
ａ） 以下のアミノ酸残基によって定義されるＶＥＧＦ特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）、
ｗ ^９ ｄ ^１０ －－ｗ ^１３ ｘ ^１４ －－ｒ ^１７ －－－－－－ｘ ^２４ －－ｋ ^２７ ｘ ^２８ －－－ｘ ^３２ －－ｙ ^３５ （配列番号１６０）
式中、
ｘ ^１４ は、ｌ、ｒおよびｔから選択され、
ｘ ^２４ は、ｈ、ｉ、ｌ、ｒ、およびｖから選択され、
ｘ ^２８ は、Ｇ、ｒおよびｖから選択され、
ｘ ^３２ は、ａ、ｒ、ｈ、ｓおよびｔから選択され、
ｘ ^３５ は、ｋまたはｙから選択され、
ｂ） （ａ）で定義される前記ＳＤＭ残基と８０％以上（例えば、９０％以上）の同一性を有するＶＥＧＦ ＳＤＭ、または
ｃ） （ａ）で定義される前記ＳＤＭ残基に対して１～３個のアミノ酸残基置換を有するＶＥＧＦ ＳＤＭであって、前記１～３個のアミノ酸残基置換が、
ｉ） 表６による類似のアミノ酸残基置換、
ｉｉ） 表６による保存的アミノ酸残基置換、
ｉｉｉ） 表６による高度に保存されたアミノ酸残基置換、および
ｉｖ） 図３３Ａで定義されたモチーフによるアミノ酸残基置換、から選択されるもの、を含む、Ｄ－ペプチド性化合物。
(項目３２)
（ａ）で定義される前記ＳＤＭ残基が、
ｗ ^９ ｄ ^１０ －－ｗ ^１３ ｒ ^１４ －－ｒ ^１７ －－－－－－ｌ ^２４ －－ｋ ^２７ ｒ ^２８ －－－ｓ ^３２ －－ｙ ^３５ （配列番号１６１）
または
ｗ ^９ ｄ ^１０ －－ｗ ^１３ ｒ ^１４ －－ｒ ^１７ －－－－－－ｖ ^２４ －－ｋ ^２７ ｒ ^２８ －－－ｒ ^３２ －－ｙ ^３５ （配列番号１６２）である、項目３１に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目３３)
前記ＶＥＧＦ ＳＤＭが、以下の残基、
ｗ ^９ ｄ ^１０ －－ｗ ^１３ ｒ ^１４ －－ｒ ^１７ －－－－－－ｌ ^２４ －－ｋ ^２７ ｒ ^２８ －－－ｓ ^３２ －－ｙ ^３５ （配列番号１６１）
または
ｗ ^９ ｄ ^１０ －－ｗ ^１３ ｒ ^１４ －－ｒ ^１７ －－－－－－ｖ ^２４ －－ｋ ^２７ ｒ ^２８ －－－ｒ ^３２ －－ｙ ^３５ （配列番号１６２）によって選択される、項目３１に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目３４)
前記ＳＤＭ残基が、
ａ） 以下のアミノ酸残基によって定義されるペプチド性フレームワーク残基、
－－ｎ ^１１ ａ－－ｅ ^１５ ｉ－ｈ ^１８ ｌｐｎｌｎ－ｅ ^２５ ｑ－－－ａ ^２９ ｆｉ－ｓ ^３３ ｌ－ 、
ｂ） （ａ）で定義される残基と８０％以上（例えば、９０％以上）の同一性を有するペプチド性フレームワーク残基、または
ｃ） （ａ）で定義される残基に対して１～３個のアミノ酸残基置換を有するペプチド性フレームワーク残基であって、前記１～３個のアミノ酸残基置換が、
ｉ） 表６による類似のアミノ酸残基置換、
ｉｉ） 表６による保存的アミノ酸残基置換、および
ｉｉｉ） 表６による高度に保存されたアミノ酸残基置換、から選択されるものを含むペプチド性フレームワーク配列内に含まれる、項目４３～５７のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目３５)
以下のアミノ酸配列に対して８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、または９５％以上）の同一性を有するＳＤＭ含有配列を含み、
ｗ ^９ ｄ ^１０ ｎａｗ ^１３ ｘ ^１４ ｅｉｒ ^１７ ｈｌｐｎｌｎｘ ^２４ ｅｑｋ ^２７ ｘ ^２８ ａｆｉｘ ^３２ ｓｌｙ ^３５ （配列番号１３３）
式中、
ｘ ^１４ は、ｌ、ｒおよびｔから選択され、
ｘ ^２４ は、ｈ、ｉ、ｌ、ｒ、およびｖから選択され、
ｘ ^２８ は、Ｇ、ｒおよびｖから選択され、
ｘ ^３２ は、ａ、ｒ、ｈ、ｓおよびｔから選択され、
ｘ ^３５ は、ｋまたはｙから選択される、項目３１～３４のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目３６)
前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインが、３らせんバンドルの構造式：
［らせん１ ^{（＃８－１８）} ］－［リンカー１ ^{（＃１９－２４）} ］－［らせん２ ^{（＃２５－３６）} ］－［リンカー２ ^{（＃３７－４０）} ］－［らせん３ ^{（＃４１－５４）} ］であり、
式中、
＃は、Ｄ－ペプチド性ＧＡドメイン中に含まれるアミノ酸残基の基準位置を示し、および
らせん３ ^{（＃４１～５４）} は、
ａ） ｓ ^４１ ａｎｌｌａｅａｋｋｌｎｄａ ^５４ （配列番号１３４）、
ｂ） （ａ）に記載される前記配列と７０％以上（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上）の同一性を有する配列、または
ｃ） （ａ）に記載される配列に対して１～５個のアミノ酸残基置換を有する配列であって、前記１～５個のアミノ酸残基置換が、
ｉ） 表６による類似のアミノ酸残基置換、
ｉｉ） 表６による保存的アミノ酸残基置換、および
ｉｉｉ） 表６による高度に保存されたアミノ酸残基置換、から選択されるペプチド性フレームワーク配列を含む、項目４３～５７のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目３７)
前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインが、
ａ） ｄ ^３６ ｄｐｓｑｓａｎｌｌａｅａｋｋｌｎｄａｑａｐｋ ^５８ （配列番号１３５）、および
ｂ） （ａ）に記載される配列に対して７０％以上（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上）の同一性を有する配列、から選択されるＣ末端ペプチド性フレームワーク配列をさらに含む、項目３１～３６のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目３８)
前記Ｄ－ペプチド性Ｚドメインが、
ａ） ｖ ^１ ｄｎｋｆｎｋｅ ^８ （配列番号１３６）、および
ｂ） （ａ）に記載される前記配列に対して６０％以上（例えば、７５％以上、８５％以上）の同一性を有する配列、から選択されるＮ末端ペプチド性フレームワーク配列を含む、項目３１～３７のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目３９)
（ａ） 化合物９７８３３３～９７８３３７（配列番号１１４～１１８）、９８０１８１（配列番号１１９）、９８０１７４～９８０１８０（配列番号１２０～１２６）、および９８１１８８～９８１１９０（配列番号１２７～１２９）のうちの一つから選択される配列、
（ｂ） （ａ）で定義される配列と８０％以上の配列同一性を有する配列、または
（ｃ） （ａ）で定義される配列に対して１～１０個のアミノ酸置換を有する配列であって、前記１～１０個のアミノ酸置換が、
ｉ）表６による類似のアミノ酸置換、
ｉｉ）表６による保存的アミノ酸置換、または
ｉｉｉ）表６による高度に保存的なアミノ酸置換であるもの、を含む、項目３１～３８のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目４０)
化合物９７８３３３～９７８３３７および９８０１８１（配列番号１１４～１１９）のうちの一つのアミノ酸配列を含む、項目３９に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目４１)
前記化合物が二量体である、項目３１～４０のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目４２)
前記化合物が、前記第一のＤ－ペプチド性Ｚドメインと相同な第二のＤ－ペプチド性Ｚドメインをさらに含む、項目３１～４０のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目４３)
ＶＥＧＦに特異的に結合するＤ－ペプチド性化合物であって、
Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインであって、
ａ）以下のアミノ酸残基によって定義されるＶＥＧＦ特異性決定モチーフ（ＳＤＭ）、
ｅ ^２５ ｐｈｖｉｓｆ－－ｈ ^３４ －ｐ ^３６ ｘ ^３７ －ｓ ^３９ ｈ －－Ｇ ^４３ －－－ａ ^４７ （配列番号１４９）
式中、ｘ ^３７ は、ｓ、ｎ、およびｙから選択され、
ｂ） （ａ）で定義される前記ＳＤＭ残基と８０％以上（例えば、９０％以上）の同一性を有するＶＥＧＦ ＳＤＭ、または
ｃ） （ａ）で定義される前記ＳＤＭ残基に対して１～３個のアミノ酸残基置換を有するＶＥＧＦ ＳＤＭであって、前記１～３個のアミノ酸残基置換が、
ｉ） 表６による類似のアミノ酸残基置換、
ｉｉ） 表６による保存的アミノ酸残基置換、
ｉｉｉ） 表６による高度に保存されたアミノ酸残基置換、および
ｉｖ） 図２６に定義されるモチーフによるアミノ酸残基置換、を含む、Ｄ－ペプチド性化合物。
(項目４４)
（ａ）で定義される前記ＶＥＧＦ ＳＤＭが、以下の残基によってさらに定義され、
ｃ ^７ －－－－－－－－－－－－－－－－－ｅ ^２５ ｐｈｖｉｓｆ－－ｈ ^３４ －ｐ ^３６ ｘ ^３７ ｃ ^３８ ｓｈ －－Ｇ ^４３ －－－ａ ^４７ （配列番号１５０）
式中、ｘ ^３７ は、ｓおよびｎから選択される。項目４３に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目４５)
以下のセグメント（Ｉ）－（ＩＩ）をさらに含み、
ｘ ^１ ｘ ^２ ｘ ^３ ｑｗｘ ^６ ｘ ^７ （Ｉ）
ｘ ^３７ ｘ ^３８ （ＩＩ）
式中、
ｘ ^１ ～ｘ ^３ は、任意のＤ－アミノ酸残基から独立的に選択され、
ｘ ^６ は、ｉおよびｖから選択され、
ｘ ^３７ は、ｓおよびｎから選択され、および
ｘ ^７ およびｘ ^３８ は、アミノ酸残基ｘ ^７ およびｘ ^３８ のアルファ－炭素の間で測定された３～７原子長の骨格を有するドメイン内リンカーを介して接続されるアミノ酸残基である、項目４３または４４に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目４６)
ｘ１～ｘ ^３ が、ｆ、ｈ、ｉ、ｐ、ｒ、ｙ、ｎ、ｓおよびｖから独立的に選択される、項目４５に記載の ^Ｄ －ペプチド性化合物。
(項目４７)
ｘ６がｖである、項目４５または４６に記載の ^Ｄ －ペプチド性化合物。
(項目４８)
ｘ３７がｎである、項目４４～４７のいずれか一項に記載の ^Ｄ －ペプチド性化合物。
(項目４９)
前記ｘ ^７ およびｘ ^３８ のアミノ酸残基が、ジスルフィドドメイン内結合を介して接続され、
システイン ^７ －システイン ^３８ ジスルフィド、
ホモシステイン ^７ －システイン ^３８ ジスルフィド、
システイン ^７ －ホモシステイン ^３８ ジスルフィド、および
ホモシステイン ^７ －ホモシステイン ^３８ ジスルフィド、から選択される、項目４４～４８のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目５０)
ｘ７およびｘ ^３８ がそれぞれシステインであり、前記ドメイン内リンカーが、前記ｃ ^７ とｃ ^３８ のアミノ酸残基の間にジスルフィド結合を含む、項目４９に記載の ^Ｄ －ペプチド性化合物。
(項目５１)
前記ドメイン内リンカーが、前記ｘ７アミノ酸残基とｘ ^３８ アミノ酸残基の側鎖の間にアミド結合連結を含む、項目４５～５０のいずれか一項に記載の ^Ｄ －ペプチド性化合物。
(項目５２)
前記アミド結合連鎖が、以下の対のｘ ^７ とｘ ^３８ Ｄ－アミノ酸残基のうちの一つであり、
アスパラギン酸７およびＤａｐ３８、
アスパラギン酸７およびＤａｂ３８、
アスパラギン酸７およびオルニチン－３８、
グルタミン酸７およびＤａｐ３８、
グルタミン酸７およびＤａｐ３８、および
グルタミン酸７およびオルニチン３８、
式中、Ｄａｐは□□□－ジアミノプロピオン酸であり、Ｄａｂは□□□－ジアミノ酪酸である、項目５１に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目５３)
前記ドメイン内リンカーを欠く対照化合物よりも３倍以上強い（すなわち、３倍低いＫＤ）ＶＥＧＦに対する結合親和性（Ｋ _Ｄ ）を有する、項目４５～５２のいずれか一項に記載の _Ｄ －ペプチド性化合物。
(項目５４)
前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインが、３らせんバンドルの構造式を含み、
［らせん１ ^{（＃６－２１）} ］－［リンカー１ ^{（＃２２－２６）} ］－［らせん２ ^{（＃２７－３５）} ］－［リンカー２ ^{（＃３６－３７）} ］－［らせん３ ^{（＃３８－５１）} ］
式中、
＃は、Ｄ－ペプチド性ＧＡドメイン中に含まれるアミノ酸残基の基準位置を示し、および
らせん１ ^{（＃６－２１）} は、以下から選択されるペプチド性フレームワーク配列を含み、
ａ） ｘ ^６ ｘ ^７ ｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋａ ^２１ （配列番号１３８）
式中、
ｘ ^６ は、ｌ、ｖ、およびｉから選択され、および
ｘ ^７ は、ｌおよびｃから選択され、および
ｂ） （ａ）で定義される配列に対して、７０％以上（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上）の同一性を有する配列と、を含む、項目４３～５３のいずれか一項に記載の _Ｄ －ペプチド性化合物。
(項目５５)
前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインが、
ａ） ｘ ^１ ｘ ^２ ｘ ^３ ｑｗｘ ^６ ｘ ^７ ｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋａＧｉｔ ^２４ （配列番号１３９）
式中、
ｘ ^１ は、ｔ、ｙ、ｆ、ｉ、ｉ、ｐおよびｒから選択され、
ｘ ^２ は、ｉ、ｈ、ｎ、ｐ、およびｓから選択され、
ｘ ^３ は、ｄ、ｉ、およびｖから選択され、
ｘ ^６ は、ｌ、ｖ、およびｉから選択され、および
ｘ ^７ は、ｌおよびｃから選択され、および
ｂ） （ａ）で定義される配列に対して、７０％以上（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上）の同一性を有する配列、から選択されるＮ末端ペプチド性フレームワーク配列を含む、項目４３～５３のいずれか一項に記載の _Ｄ －ペプチド性化合物。
(項目５６)
前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインが、
ａ） ｉｌｋａｈａ（配列番号１４０）、および
ｂ） （ａ）で定義される配列に対して５０％以上（例えば、６５％以上、または８０％以上）の同一性を有する配列、から選択されるＣ末端ペプチド性フレームワーク配列を含む、項目４３～５５のいずれか一項に記載の _Ｄ －ペプチド性化合物。
(項目５７)
前記Ｄ－ペプチド性ＧＡドメインが、配列：
ｘ ^１ ｘ ^２ ｘ ^３ ｑｗｘ ^６ ｘ ^７ ｋｎａｋｅｄａｉａｅｌｋｋａｇｉｔｅｐｈｖｉｓｆｉｎｈａｐｘ ^３７ ｘ ^３８ ｓｈｖｎＧｌｋｎａｉｌｋａｈａ ^５３ （配列番号１４１）
式中、
ｘ ^１ は、ｔ、ｙ、ｆ、ｉ、ｉ、ｐおよびｒから選択され、
ｘ ^２ は、ｉ、ｈ、ｎ、ｐ、およびｓから選択され、
ｘ ^３ は、ｄ、ｉ、およびｖから選択され、
ｘ ^６ は、ｌ、ｖ、およびｉから選択され、
ｘ ^７ は、ｌおよびｃから選択され、
ｘ ^３７ は、ｔ、ｙ、ｎ、およびｓから選択され、
ｘ ^３８ は、ｖおよびｃから選択され、
ｘ ^３９ は、ｅおよびｓから選択され、
ｘ ^４０ は、ｈおよびｅから選択され、
ｘ ^４３ は、ｇおよびａから選択され、
ｘ ^４７ は、ａおよびｅから選択される、項目５６に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目５８)
（ａ） 化合物１１０５５、９７９１０２、および９７９１０７－９７９１１０（配列番号１０８～１１３）のうちの一つから選択される配列か、
ｂ） （ａ）で定義される前記配列と８０％以上（例えば、９０％以上）の同一性を有する配列か、
ｃ） （ａ）で定義される配列に対して１～１０個のアミノ酸残基置換を有する配列かを含み、前記１～１０個のアミノ酸残基置換が、
ｉ） 表６による類似のアミノ酸残基置換、
ｉｉ） 表６による保存的アミノ酸残基置換、および
ｉｉｉ） 表６による高度に保存されたアミノ酸残基置換、から選択される、項目４３～５７のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目５９)
化合物１１０５５、９７９１０２および９７９１０７－９７９１１０（配列番号１０８～１１３）のうちの一つを含む、項目５８に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目６０)
前記第一のＤ－ペプチド性ＧＡドメインと相同な第二のＤ－ペプチド性ＧＡドメインをさらに含む、項目４３～５９のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目６１)
前記化合物が二量体である、項目４３～５９のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物。
(項目６２)
医薬組成物であって、
項目１～６１のいずれか一項に記載のＤ－ペプチド性化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、および
薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む、医薬組成物。
(項目６３)
前記組成物が、眼の疾患または状態の治療のために製剤化される、項目６２に記載の医薬組成物。
(項目６４)
対象者において血管新生に関連する疾患または状態を治療または予防する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象者に、項目１～６０のいずれか一項に従い、有効量のＶＥＧＦに特異的に結合するＤペプチド性化合物またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む、方法。
(項目６５)
血管新生に関連する前記疾患または状態が、癌（例えば、乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌または卵巣癌）、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、黄斑変性症、網膜症および皮膚疾患（例えば、酒さ）である、項目６４に記載の方法。
(項目６６)
血管新生に関連する前記疾患または状態が、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）である、項目６４に記載の方法。
(項目６７)
血管新生に関連する前記疾患または状態が、滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である、項目６４に記載の方法。
(項目６８)
有効量の第二の活性薬剤を対象者に併用投与することをさらに含む、項目６４～６７のいずれか一項に記載の方法。
(項目６９)
前記第二の活性薬剤が、Ｄ－ペプチド性化合物である、項目６８に記載の方法。
(項目７０)
前記第二の活性薬剤が、小分子、化学療法剤、抗体、抗体断片、アプタマー、およびＬタンパク質から選択される、項目６８に記載の方法。
(項目７１)
前記第二の活性薬剤が、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＯＸ－４０、ＤＲ３、ＬＡＧ３、Ａｎｇ２、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＦｃＲｎ、ＣＤ３、ＩＬ－１７、およびＢＣＭＡから選択される標的タンパク質に特異的に結合する、項目６８～７０のいずれか一項に記載の方法。
(項目７２)
前記第二の活性薬剤剤が、ペグプレラニブ（Ｆｏｖｉｓｔａ）、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、およびペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）から選択される、項目７１に記載の方法。
(項目７３)
前記第二の活性薬剤が、ＰＤ－１の拮抗薬であるＤ－ペプチド性化合物である、項目６８に記載の方法。
(項目７４)
血管新生に関連する疾患または状態をインビボで診断または撮像するための方法であって、
項目１～６０のいずれか一項に記載のＶＥＧＦに特異的に結合するＤペプチド性化合物を対象者に投与することと、
前記対象者の少なくとも一部を撮像することと、を含む、方法。
(項目７５)
前記撮像が、ＰＥＴ撮像を含み、前記投与が、前記対象者の前記血管系に前記化合物を投与することを含む、項目７４に記載の方法。
(項目７６)
細胞受容体による前記化合物の取込みを検出することをさらに含む、項目７４に記載の方法。
(項目７７)
前記対象者にベバシズマブを投与することをさらに含む、項目７４に記載の方法であって、血管新生と関連する前記疾患または状態が癌である、方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30-1】

【図30-2】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35-1】

【図35-2】

【図35-3】

【図35-4】

【図35-5】

【図36】

【図37】

【図38-1】

【図38-2】

【図38-3】

【図38-4】

【図38-5】

【図38-6】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47-1】

【図47-2】

【図47-3】

【図48】

【図49】

【図50-1】

【図50-2】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【配列表】

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