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特開2022-8534ＥＧＦＲ及びＣ－ＭＥＴフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン結合分子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022008534
(43)【公開日】2022-01-13
(54)【発明の名称】ＥＧＦＲ及びＣ－ＭＥＴフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン結合分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220105BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220105BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220105BHJP
C07K 14/78 20060101ALI20220105BHJP
C07K 14/765 20060101ALI20220105BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20220105BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220105BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220105BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220105BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220105BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220105BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220105BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220105BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220105BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/12
C07K19/00
C07K14/78
C07K14/765
C07K16/00
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
A61K39/395 D
A61P35/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021155530
(22)【出願日】2021-09-24
(62)【分割の表示】P 2018157120の分割
【原出願日】2013-11-21
(31)【優先権主張番号】61/728,906
(32)【優先日】2012-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】61/728,914
(32)【優先日】2012-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】61/728,912
(32)【優先日】2012-11-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】61/782,550
(32)【優先日】2013-03-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】61/809,541
(32)【優先日】2013-04-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】アンダーソン，マーク
(72)【発明者】
【氏名】アタール，リカルド
(72)【発明者】
【氏名】ディエム，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ヒュン，リナス
(72)【発明者】
【氏名】ジェィコブス，スティーヴン
(72)【発明者】
【氏名】キング，アラステア
(72)【発明者】
【氏名】クレイン，ドンナ
(72)【発明者】
【氏名】ムーアズ，シェリ
(72)【発明者】
【氏名】オニール，カリン
(72)【発明者】
【氏名】ピチャ，クリステン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG24
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB01
4C085BB11
4C085CC23
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA57
4H045CA40
4H045CA42
4H045DA70
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】治療用途及び診断用途のために、更なる単一特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ阻害物質を提供する。
【解決手段】単一特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、該分子をコードする単離ヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及びこれらの作製方法が開示される。これらの単一特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、癌などの疾患及び障害の治療及び診断のための治療用組成物の製造に有用である。
【選択図】図４
【解決手段】単一特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、該分子をコードする単離ヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及びこれらの作製方法が開示される。これらの単一特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、癌などの疾患及び障害の治療及び診断のための治療用組成物の製造に有用である。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを含む
単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長
因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合
をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と
特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、
単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子。
単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長
因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合
をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と
特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、
単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子。
【請求項2】
請求項１に記載の二重特異性分子であって、
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細
胞において測定したとき、約２．５×１０ -6 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ＥＧＦＲ残基チロシ
ン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、前記第２のＦＮ３ドメイ
ンは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定した
とき、約１．５×１０ -6 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけ
るＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｂ）前記第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細
胞において測定したとき、約１．８×１０ -8 Ｍ～約２．５×１０ -6 ＭのＩＣ 50 値にて、Ｅ
ＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、前記第
２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞
において測定したとき、約４×１０ -9 Ｍ～約１．５×１０ -6 ＭのＩＣ 50 値にて、ｃ－Ｍｅ
ｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）前記第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約１×１０ -8 Ｍ未満の解離定数（
Ｋ D ）にて結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ－Ｍｅｔと、約５×１０ -8 Ｍ未
満のＫ D にて結合し、該Ｋ D は、実施例３に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定
されるか、又は
ｄ）前記第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約２×１０ -10 ～約１×１０ -8 Ｍ
のＫ D にて結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ－Ｍｅｔと、約３×１０ -10 ～約
５ｘ１０ -8 ＭのＫ D にて結合し、該Ｋ D は、実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を
用いて測定される、二重特異性分子。
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細
胞において測定したとき、約２．５×１０ -6 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ＥＧＦＲ残基チロシ
ン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、前記第２のＦＮ３ドメイ
ンは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定した
とき、約１．５×１０ -6 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけ
るＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｂ）前記第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細
胞において測定したとき、約１．８×１０ -8 Ｍ～約２．５×１０ -6 ＭのＩＣ 50 値にて、Ｅ
ＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、前記第
２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞
において測定したとき、約４×１０ -9 Ｍ～約１．５×１０ -6 ＭのＩＣ 50 値にて、ｃ－Ｍｅ
ｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）前記第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約１×１０ -8 Ｍ未満の解離定数（
Ｋ D ）にて結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ－Ｍｅｔと、約５×１０ -8 Ｍ未
満のＫ D にて結合し、該Ｋ D は、実施例３に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定
されるか、又は
ｄ）前記第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約２×１０ -10 ～約１×１０ -8 Ｍ
のＫ D にて結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ－Ｍｅｔと、約３×１０ -10 ～約
５ｘ１０ -8 ＭのＫ D にて結合し、該Ｋ D は、実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を
用いて測定される、二重特異性分子。
【請求項3】
前記二重特異性分子は、前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメインの混
合物によるＮＣＩ－Ｈ２９２細胞増殖阻害のＩＣ 50 値と比較した場合、少なくとも３０倍
小さいＩＣ 50 値にて、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞の増殖を阻害し、該細胞増殖は、７．５ｎｇ
／ｍＬのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発される、請求項１又は２に記載の
二重特異性分子。
合物によるＮＣＩ－Ｈ２９２細胞増殖阻害のＩＣ 50 値と比較した場合、少なくとも３０倍
小さいＩＣ 50 値にて、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞の増殖を阻害し、該細胞増殖は、７．５ｎｇ
／ｍＬのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発される、請求項１又は２に記載の
二重特異性分子。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、前記二重特異性分子は
、
ａ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞において測定したと
き、約８×１０ -7 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ
誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｂ）１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定した
とき、約８．４×１０ -7 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけ
るＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）約９．５×１０ -6 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ＨＧＦ誘発性ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞増殖
を阻害し、該細胞増殖は、７．５ｎｇのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発さ
れるか、
ｄ）約２．０×１０ -8 Ｍ未満のＫ D にてＥＧＦＲに結合するか、又は
ｅ）約２．０×１０ -8 Ｍ未満のＫ D にてｃ－Ｍｅｔに結合し、該Ｋ D は、実施例３及び実
施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、二重特異性分子。
、
ａ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞において測定したと
き、約８×１０ -7 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ
誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｂ）１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定した
とき、約８．４×１０ -7 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけ
るＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）約９．５×１０ -6 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ＨＧＦ誘発性ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞増殖
を阻害し、該細胞増殖は、７．５ｎｇのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発さ
れるか、
ｄ）約２．０×１０ -8 Ｍ未満のＫ D にてＥＧＦＲに結合するか、又は
ｅ）約２．０×１０ -8 Ｍ未満のＫ D にてｃ－Ｍｅｔに結合し、該Ｋ D は、実施例３及び実
施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、二重特異性分子。
【請求項5】
前記第１のＦＮ３ドメインは、少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一
であるアミノ酸配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメインは、少なくとも８３％が配列番号
４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記
載の二重特異性分子。
であるアミノ酸配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメインは、少なくとも８３％が配列番号
４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記
載の二重特異性分子。
【請求項6】
前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１０７又は１０８のアミノ酸配列を含み、前記
第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれ
か一項に記載の二重特異性分子。
第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれ
か一項に記載の二重特異性分子。
【請求項7】
前記第１のＦＮ３ドメインは、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３
、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦ
Ｒに結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦ
Ｒに結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項8】
前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ
３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍｅｔ
と結合する、請求項７に記載の二重特異性分子。
３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍｅｔ
と結合する、請求項７に記載の二重特異性分子。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、
ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列又は配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＦＧル
ープと、
ｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＢＣループと、を含み、
ｂ）前記第２のＦＮ３ドメインは、
ｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣストランド及びＣＤループと、
ｉｉ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＦストランド及びＦＧループと、を含む
、二重特異性分子。
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、
ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列又は配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＦＧル
ープと、
ｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＢＣループと、を含み、
ｂ）前記第２のＦＮ３ドメインは、
ｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣストランド及びＣＤループと、
ｉｉ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＦストランド及びＦＧループと、を含む
、二重特異性分子。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列又は配列番号１８３
のアミノ酸配列を含み、
ｂ）前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、二重特異性
分子。
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列又は配列番号１８３
のアミノ酸配列を含み、
ｂ）前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、二重特異性
分子。
【請求項11】
前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配
列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基
位置で置換を含む、請求項５～１０のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基
位置で置換を含む、請求項５～１０のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項12】
前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含み、前記第２のＦＮ
３ドメインは、配列番号１８８のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の二重特異性分
子。
３ドメインは、配列番号１８８のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の二重特異性分
子。
【請求項13】
前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～１３７
、又は１９４～２１１のうちの１つに示される配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメインは
、配列番号３２～４９、１１１～１１４、又は２１２～２２３のうちの１つに示される配
列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
、又は１９４～２１１のうちの１つに示される配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメインは
、配列番号３２～４９、１１１～１１４、又は２１２～２２３のうちの１つに示される配
列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項14】
前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメインは、
ａ）それぞれ、２７及び３２、
ｂ）それぞれ、２７及び４１、
ｃ）それぞれ、２７及び４０、
ｄ）それぞれ、２７及び３３、
ｅ）それぞれ、１０７及び４１、
ｆ）それぞれ、１０７及び４０、
ｇ）それぞれ、１０７及び３３、
ｈ）それぞれ、１０７及び３２、
ｉ）それぞれ、１０７及び１１４、
ｊ）それぞれ、１０８及び１１１、
ｋ）それぞれ、１０８及び１１２、
ｌ）それぞれ、１０８及び１１３、
ｍ）それぞれ、１０８及び１１４、
ｎ）それぞれ、１０９及び１１１、
ｏ）それぞれ、１０９及び１１２、
ｐ）それぞれ、１０９及び１１３、
ｑ）それぞれ、１０９及び１１４、
ｒ）それぞれ、１１０及び１１１、
ｓ）それぞれ、１１０及び１１２、
ｔ）それぞれ、１１０及び１１３、又は
ｕ）それぞれ、１１０及び１１４、の配列番号のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記
載の二重特異性分子。
ａ）それぞれ、２７及び３２、
ｂ）それぞれ、２７及び４１、
ｃ）それぞれ、２７及び４０、
ｄ）それぞれ、２７及び３３、
ｅ）それぞれ、１０７及び４１、
ｆ）それぞれ、１０７及び４０、
ｇ）それぞれ、１０７及び３３、
ｈ）それぞれ、１０７及び３２、
ｉ）それぞれ、１０７及び１１４、
ｊ）それぞれ、１０８及び１１１、
ｋ）それぞれ、１０８及び１１２、
ｌ）それぞれ、１０８及び１１３、
ｍ）それぞれ、１０８及び１１４、
ｎ）それぞれ、１０９及び１１１、
ｏ）それぞれ、１０９及び１１２、
ｐ）それぞれ、１０９及び１１３、
ｑ）それぞれ、１０９及び１１４、
ｒ）それぞれ、１１０及び１１１、
ｓ）それぞれ、１１０及び１１２、
ｔ）それぞれ、１１０及び１１３、又は
ｕ）それぞれ、１１０及び１１４、の配列番号のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記
載の二重特異性分子。
【請求項15】
前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配
列番号１）の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、請
求項１４に記載の二重特異性分子。
列番号１）の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、請
求項１４に記載の二重特異性分子。
【請求項16】
前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅ
ｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離される、請求項１～１５のいずれ
か一項に記載の二重特異性分子。
ｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離される、請求項１～１５のいずれ
か一項に記載の二重特異性分子。
【請求項17】
前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメインは、リンカーによって連結さ
れる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
れる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項18】
前記リンカーは、配列番号７８～８４又は２２４のうちの１つに示されるアミノ酸配列
を含む、請求項１７に記載の二重特異性分子。
を含む、請求項１７に記載の二重特異性分子。
【請求項19】
配列番号５０～７２、１０６、１１８～１２１、１３８～１６５又は１９０～１９３で
示すアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記分子のＮ末端に連結されるメチオニン（Ｍ
ｅｔ）を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
示すアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記分子のＮ末端に連結されるメチオニン（Ｍ
ｅｔ）を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【請求項20】
前記分子のＣ末端に連結されるシステインを更に含む、請求項１９に記載の二重特異性
分子。
分子。
【請求項21】
半減期延長部分に連結される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の二重特異性分子
。
。
【請求項22】
前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ア
ルブミン、アルブミン変異体、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、
請求項２１に記載の二重特異性分子。
ルブミン、アルブミン変異体、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、
請求項２１に記載の二重特異性分子。
【請求項23】
前記半減期延長部分は、配列番号１８９の前記アルブミン変異体である、請求項２２に
記載の二重特異性分子。
記載の二重特異性分子。
【請求項24】
請求項５に記載の二重特異性分子をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項25】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項26】
請求項２５に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項27】
二重特異性分子を作製する方法であって、請求項２６に記載の単離宿主細胞を、該二重
特異性分子が発現するような条件下で培養することと、該二重特異性分子を精製すること
と、を含む、方法。
特異性分子が発現するような条件下で培養することと、該二重特異性分子を精製すること
と、を含む、方法。
【請求項28】
請求項１～２３のいずれか一項に記載の二重特異性分子と、製薬上許容できる担体と、
を含む医薬組成物。
を含む医薬組成物。
【請求項29】
癌の治療を行うために十分な時間にわたって、治療的に有効な量の請求項１に記載の二
重特異性分子を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療す
る方法。
重特異性分子を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療す
る方法。
【請求項30】
癌は、ＥＧＦＲ活性化突然変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅、ｃ－Ｍｅｔ活性化突然変異又は
ｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅と関連がある、請求項２９に記載の方法。
ｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅と関連がある、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記ＥＧＦＲ活性化突然変異は、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、
Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９
Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６
～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６～Ａ７６７間のＡｌａ（Ａ）の
挿入、Ｓ７６８～Ｖ７６９間のＳｅｒ、Ｖａｌ及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、並びにＰ７
７２～Ｈ７７３間のＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入である、請求項３０に記載の方法。
Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９
Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍの置換、Ｅ７４６
～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６～Ａ７６７間のＡｌａ（Ａ）の
挿入、Ｓ７６８～Ｖ７６９間のＳｅｒ、Ｖａｌ及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、並びにＰ７
７２～Ｈ７７３間のＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記被験体は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＣＯ－１６８６、ＡＺＤ
９１９２又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示すか、又は耐性を得ている、請
求項２９に記載の方法。
９１９２又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示すか、又は耐性を得ている、請
求項２９に記載の方法。
【請求項33】
癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、小
細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、鼻腔癌
、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌、胸腺
癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞癌（Ｐ
ＲＣＣ）である、請求項２９に記載の方法。
細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、鼻腔癌
、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌、胸腺
癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞癌（Ｐ
ＲＣＣ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項34】
第２の治療薬を投与することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項35】
前記第２の治療薬は、化学療法剤又は標的抗癌治療剤である、請求項３３に記載の方法
。
。
【請求項36】
前記第２の治療薬は、シスプラチン、ビンブラスチン、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ
２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４若しくはＶＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害物質、エルロチニブ
、ゲフィチニブ又はアファチニブである、請求項３５に記載の方法。
２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４若しくはＶＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害物質、エルロチニブ
、ゲフィチニブ又はアファチニブである、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記第２の治療薬は、前記二重特異性分子と同時に、逐次的に又は別途に投与される、
請求項３４に記載の方法。
請求項３４に記載の方法。
【請求項38】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦ
Ｒとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであ
って、該ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に基づいて設計され
たライブラリから単離される、ＦＮ３ドメイン。
Ｒとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであ
って、該ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に基づいて設計され
たライブラリから単離される、ＦＮ３ドメイン。
【請求項39】
請求項３８に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメインは、
ａ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約２
．５×１０ -6 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発
性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｂ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約１
．８×１０ -8 Ｍ～約２．５×１０ -6 ＭのＩＣ 50 値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３に
おけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｃ）約１×１０ -8 Ｍ未満の解離定数（Ｋ D ）にて、ヒトＥＧＦＲに結合し、該Ｋ D は、実
施例３に記載の条件を用いて測定されるか、又は
ｄ）約２×１０ -10 ～約１×１０ -8 ＭのＫ D にて、ヒトＥＧＦＲに結合し、該Ｋ D は、実
施例３に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、ＦＮ３ドメイン。
ａ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約２
．５×１０ -6 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発
性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｂ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約１
．８×１０ -8 Ｍ～約２．５×１０ -6 ＭのＩＣ 50 値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３に
おけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｃ）約１×１０ -8 Ｍ未満の解離定数（Ｋ D ）にて、ヒトＥＧＦＲに結合し、該Ｋ D は、実
施例３に記載の条件を用いて測定されるか、又は
ｄ）約２×１０ -10 ～約１×１０ -8 ＭのＫ D にて、ヒトＥＧＦＲに結合し、該Ｋ D は、実
施例３に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、ＦＮ３ドメイン。
【請求項40】
少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請
求項３８又は３９に記載のＦＮ３ドメイン。
求項３８又は３９に記載のＦＮ３ドメイン。
【請求項41】
前記ＦＮ３ドメインは、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２
７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦＲに結
合する、請求項３８～４０のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦＲに結
合する、請求項３８～４０のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
【請求項42】
請求項３８～４１のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメイ
ンは、
ａ）配列番号１７９のアミノ酸配列又は配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＦＧルー
プと、
ｂ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＢＣループと、を含む、ＦＮ３ドメイン。
ンは、
ａ）配列番号１７９のアミノ酸配列又は配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＦＧルー
プと、
ｂ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＢＣループと、を含む、ＦＮ３ドメイン。
【請求項43】
配列番号１８２のアミノ酸配列又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含む、請求項４２
に記載のＦＮ３ドメイン。
に記載のＦＮ３ドメイン。
【請求項44】
前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～１３７又は１
９４～２１１のうちの１つに示される配列を含む、請求項３８～４３のいずれか一項に記
載のＦＮ３ドメイン。
９４～２１１のうちの１つに示される配列を含む、請求項３８～４３のいずれか一項に記
載のＦＮ３ドメイン。
【請求項45】
前記ＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６
、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置で置換を含む、請求項４４に記載のＦＮ
３ドメイン。
、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置で置換を含む、請求項４４に記載のＦＮ
３ドメイン。
【請求項46】
前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４
６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、請求項４５に記載のＦＮ３ドメイン
。
６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、請求項４５に記載のＦＮ３ドメイン
。
【請求項47】
請求項４０に記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項48】
請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項49】
請求項４８に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項50】
ＥＧＦＲと特異的に結合するＦＮ３ドメインを作製する方法であって、請求項４８に記
載の単離宿主細胞を、ＥＧＦＲと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインが発現するような条
件下で培養することと、該ＦＮ３ドメインを精製することと、を含む、方法。
載の単離宿主細胞を、ＥＧＦＲと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインが発現するような条
件下で培養することと、該ＦＮ３ドメインを精製することと、を含む、方法。
【請求項51】
肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）と
ｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメ
イン。
ｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメ
イン。
【請求項52】
請求項５１に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメインは、
ａ）１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において
測定したとき、約１．５×１０ -6 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４
９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｂ）１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において
測定したとき、約４×１０ -9 Ｍ～約１．５ｘ１０ -6 ＭのＩＣ 50 値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チ
ロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）約５×１０ -8 Ｍ未満のＫ D にて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合し、該Ｋ D は、実施例３に記
載の条件下で測定されるか、又は
ｄ）約３×１０ -10 ～約５ｘ１０ -8 ＭのＫ D にて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合し、該Ｋ D は、
実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、ＦＮ３ドメイン。
ａ）１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において
測定したとき、約１．５×１０ -6 Ｍ未満のＩＣ 50 値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４
９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｂ）１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において
測定したとき、約４×１０ -9 Ｍ～約１．５ｘ１０ -6 ＭのＩＣ 50 値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チ
ロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）約５×１０ -8 Ｍ未満のＫ D にて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合し、該Ｋ D は、実施例３に記
載の条件下で測定されるか、又は
ｄ）約３×１０ -10 ～約５ｘ１０ -8 ＭのＫ D にて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合し、該Ｋ D は、
実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、ＦＮ３ドメイン。
【請求項53】
少なくとも８３％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請
求項５１又は５２に記載のＦＮ３ドメイン。
求項５１又は５２に記載のＦＮ３ドメイン。
【請求項54】
前記ＦＮ３ドメインは、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、
Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍｅｔに結合
する、請求項５１～５３のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍｅｔに結合
する、請求項５１～５３のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
【請求項55】
請求項５１～５４のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメイ
ンは、
ａ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣストランド及びＣＤループと、
ｂ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＦストランド及びＦＧループと、を含む、Ｆ
Ｎ３ドメイン。
ンは、
ａ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣストランド及びＣＤループと、
ｂ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＦストランド及びＦＧループと、を含む、Ｆ
Ｎ３ドメイン。
【請求項56】
配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載のＦＮ３ドメイン。
【請求項57】
前記ＦＮ３ドメインは、配列番号３２～４９、１１１～１１４、又は２１２～２２３の
うちの１つに示される配列を含む、請求項５１～５６のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメ
イン。
うちの１つに示される配列を含む、請求項５１～５６のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメ
イン。
【請求項58】
前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の１１、１４、１７、
３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置で置換を含む、請求項５７に
記載のＦＮ３ドメイン。
３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置で置換を含む、請求項５７に
記載のＦＮ３ドメイン。
【請求項59】
前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４
６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、請求項５８に記載のＦＮ３ドメイン
。
６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、請求項５８に記載のＦＮ３ドメイン
。
【請求項60】
前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に基づいて設計された
ライブラリから単離される、請求項５１～５９のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
ライブラリから単離される、請求項５１～５９のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
【請求項61】
請求項５３に記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項62】
請求項６１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項63】
請求項６２に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項64】
ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメインを作製する方法であって、請求項６３に
記載の単離宿主細胞を、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインが発現するよう
な条件下で培養することと、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインを精製する
ことと、を含む、方法。
記載の単離宿主細胞を、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインが発現するよう
な条件下で培養することと、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインを精製する
ことと、を含む、方法。
【請求項65】
請求項３８又は５１に記載のＦＮ３ドメインと、製薬上許容できる担体と、を含む医薬
組成物。
組成物。
【請求項66】
癌の治療を行うために十分な時間にわたって、治療的に有効な量の請求項６５に記載の
医薬組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療する
方法。
医薬組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療する
方法。
【請求項67】
前記被験体は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＣＯ－１６８６、ＡＺＤ
９１９２又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示すか、又は耐性を得ている、請
求項６６に記載の方法。
９１９２又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示すか、又は耐性を得ている、請
求項６６に記載の方法。
【請求項68】
癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、小
細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、鼻腔癌
、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌、胸腺
癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞癌（Ｐ
ＲＣＣ）である、請求項６６に記載の方法。
細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、鼻腔癌
、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌、胸腺
癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞癌（Ｐ
ＲＣＣ）である、請求項６６に記載の方法。
【請求項69】
請求項１～３３のいずれか一項に記載の二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子、請求項３
８～４６のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する単
離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、又は、請求項５１～６０のいずれか一
項に記載の肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合する、単離フィブロネク
チンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの、治療のための使用。
８～４６のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する単
離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、又は、請求項５１～６０のいずれか一
項に記載の肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合する、単離フィブロネク
チンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの、治療のための使用。
【請求項70】
癌の治療に使用するための、請求項１～３３のいずれか一項に記載の二重特異性ＦＮ３
ドメイン含有分子、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧ
ＦＲ）に特異的に結合する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、又は、請
求項５１～６０のいずれか一項に記載の肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に
結合する、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
ドメイン含有分子、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧ
ＦＲ）に特異的に結合する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、又は、請
求項５１～６０のいずれか一項に記載の肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に
結合する、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
【請求項71】
請求項７０に記載の使用のための、請求項１～３３のいずれか一項に記載の二重特異性
ＦＮ３ドメイン含有分子、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体
（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであ
って、前記癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺
腺癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌
、鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃
癌、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細
胞癌（ＰＲＣＣ）である、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子、単離ＦＮ３ドメイン。
ＦＮ３ドメイン含有分子、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体
（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであ
って、前記癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺
腺癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌
、鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃
癌、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細
胞癌（ＰＲＣＣ）である、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子、単離ＦＮ３ドメイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、単一特異性又は二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ結合分子及びその
分子の作製方法及び使用方法に関する。
分子の作製方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢｌ又はＨＥＲ１）は、癌原遺伝子ｃ－ｅｒｂ
Ｂｌによってコードされる１７０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質である。ＥＧＦＲは、受
容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーのメン
バーであり、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ
４）が挙げられる。ＥＧＦＲシグナル伝達は、リガンド結合後、立体配座の変化、その他
ＥｒｂＢファミリーメンバーによる受容体のホモ二量体化又は受容体のヘテロ二量体化及
び受容体のトランス自己リン酸化の誘導によって開始され（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ａｎｎ
ｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ，３７：３５３～７３，２００８）、これにより、細胞の増
殖及び生存など、最終的に多種多様な細胞機能に影響を及ぼすシグナル伝達のカスケード
が開始される。ＥＧＦＲの発現又はキナーゼ活性の増加は、ヒト癌の範囲に連動しており
、ＥＧＦＲは治療的介入のための魅力的な対象となった（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、Ｏｎ
ｃｏｇｅｎｅ １９：６５５０～６５６５，２０００；Ｇｒｕｎｗａｌｄら、Ｊ Ｎａｔ
ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９５：８５１～６７，２００３；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら
、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３３：３６９～８５，２００６）。非小細胞肺癌細胞におい
て、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数及びタンパク質の発現がいずれも増加することは、ＥＧＦＲ
チロシンキナーゼ阻害物質（ＩＲＥＳＳＡ（商標）（ゲフィチニブ））への好ましい反応
と関連付けられてきた（Ｈｉｒｓｃｈら、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １８：７５２～６０，２
００７）。
Ｂｌによってコードされる１７０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質である。ＥＧＦＲは、受
容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーのメン
バーであり、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ
４）が挙げられる。ＥＧＦＲシグナル伝達は、リガンド結合後、立体配座の変化、その他
ＥｒｂＢファミリーメンバーによる受容体のホモ二量体化又は受容体のヘテロ二量体化及
び受容体のトランス自己リン酸化の誘導によって開始され（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ａｎｎ
ｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ，３７：３５３～７３，２００８）、これにより、細胞の増
殖及び生存など、最終的に多種多様な細胞機能に影響を及ぼすシグナル伝達のカスケード
が開始される。ＥＧＦＲの発現又はキナーゼ活性の増加は、ヒト癌の範囲に連動しており
、ＥＧＦＲは治療的介入のための魅力的な対象となった（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら、Ｏｎ
ｃｏｇｅｎｅ １９：６５５０～６５６５，２０００；Ｇｒｕｎｗａｌｄら、Ｊ Ｎａｔ
ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９５：８５１～６７，２００３；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら
、Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３３：３６９～８５，２００６）。非小細胞肺癌細胞におい
て、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数及びタンパク質の発現がいずれも増加することは、ＥＧＦＲ
チロシンキナーゼ阻害物質（ＩＲＥＳＳＡ（商標）（ゲフィチニブ））への好ましい反応
と関連付けられてきた（Ｈｉｒｓｃｈら、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １８：７５２～６０，２
００７）。
【0003】
ＥＧＦＲ治療としては、低分子及び抗ＥＧＦＲ抗体を双方ともが挙げられ、大腸癌、膵
癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌細胞（ＮＳＣＬＣ）の治療として認可された（Ｂａｓｅｌｇ
ａ ａｎｄ Ａｒｔｅａｇａ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：２４４５～２４５９（
２０００５；Ｇｉｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５９：７７５５～７７６０，１９
８４；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１：１３１ １～１３
１８；１９９５；Ｐｒｅｗｅｔｔら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４：２９５７～
２９６６，１９９８）。
癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌細胞（ＮＳＣＬＣ）の治療として認可された（Ｂａｓｅｌｇ
ａ ａｎｄ Ａｒｔｅａｇａ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３：２４４５～２４５９（
２０００５；Ｇｉｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５９：７７５５～７７６０，１９
８４；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１：１３１ １～１３
１８；１９９５；Ｐｒｅｗｅｔｔら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４：２９５７～
２９６６，１９９８）。
【0004】
抗ＥＧＦＲ治療の有効性は、腫瘍型及びＥＦＧＲの突然変異／増幅状態に依存し得る。
現在の治療の副作用としては、皮膚毒性を挙げることができる（Ｄｅ Ｒｏｏｃｋら、Ｌ
ａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １１：７５３～７６２，２０１０；Ｌｉｎａｒｄｏｕら、Ｎａ
ｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，６：３５２～３６６，２００９；Ｌｉ ａｎｄ Ｐ
ｅｒｅｚ－Ｓｏｌｅｒ，Ｔａｒｇ Ｏｎｃｏｌ ４：１０７～１１９，２００９）。ＥＧ
ＦＲチロシンキナーゼ阻害物質（ＴＫＩ）は、一般に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の二
次選択治療として使用されるが、多くの場合、耐性経路により１２ヶ月以内に効かなくな
る（Ｒｉｅｌｙら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：８３９～４４，２００６）
。
現在の治療の副作用としては、皮膚毒性を挙げることができる（Ｄｅ Ｒｏｏｃｋら、Ｌ
ａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ １１：７５３～７６２，２０１０；Ｌｉｎａｒｄｏｕら、Ｎａ
ｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，６：３５２～３６６，２００９；Ｌｉ ａｎｄ Ｐ
ｅｒｅｚ－Ｓｏｌｅｒ，Ｔａｒｇ Ｏｎｃｏｌ ４：１０７～１１９，２００９）。ＥＧ
ＦＲチロシンキナーゼ阻害物質（ＴＫＩ）は、一般に、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の二
次選択治療として使用されるが、多くの場合、耐性経路により１２ヶ月以内に効かなくな
る（Ｒｉｅｌｙら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：８３９～４４，２００６）
。
【0005】
ｃ－Ｍｅｔは、チロシンキナーゼ受容体をコードする。発癌性物質を用いた治療により
、恒常的に活性化する融合タンパク質ＴＰＲ－ＭＥＴが発生することが判明した後、ｃ－
Ｍｅｔは、１９８４年に癌原遺伝子として最初に同定された（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１１：２９～３３，１９８４）。そのリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）
によりｃ－Ｍｅｔが活性化することにより、成長、運動性、浸潤、転移、上皮間葉転換、
血管新生／創傷治癒、及び組織再生など、過多の細胞プロセスが刺激される（Ｃｈｒｉｓ
ｔｅｎｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２２５：１～２６，２００５；Ｐｅｔｅｒｓ
ａｎｄ Ａｄｊｅｉ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ９：３１４～２６，２
０１２）。ｃ－Ｍｅｔは、タンパク質分解により、５０ｋＤａのα－サブユニット及び１
４０ｋＤａのβ－サブユニットに分割される、ジスルフィド結合により連結した単鎖タン
パク質として合成される（Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ，２２：３０９～３２５，２００３）。ｃ－Ｍｅｔは、Ｒｏｎなど、他の膜受
容体に構造的に類似している。ＨＧＦの厳密な化学量論としての、ｃ－Ｍｅｔ結合は、明
確でないが、概して、２つのＨＧＦ分子が、２つのｃ－Ｍｅｔ分子に結合し、受容体の二
量化及びチロシン１２３０、１２３４及び１２３５での自己リン酸化をもたしていると考
えられている（Ｓｔａｍｏｓら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２３：２３２５～
２３３５，２００４）。遺伝子増幅、突然変異、又は、受容体過剰発現により、リガンド
－非依存性のｃ－Ｍｅｔ自己リン酸化も発生し得る。
、恒常的に活性化する融合タンパク質ＴＰＲ－ＭＥＴが発生することが判明した後、ｃ－
Ｍｅｔは、１９８４年に癌原遺伝子として最初に同定された（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１１：２９～３３，１９８４）。そのリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）
によりｃ－Ｍｅｔが活性化することにより、成長、運動性、浸潤、転移、上皮間葉転換、
血管新生／創傷治癒、及び組織再生など、過多の細胞プロセスが刺激される（Ｃｈｒｉｓ
ｔｅｎｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２２５：１～２６，２００５；Ｐｅｔｅｒｓ
ａｎｄ Ａｄｊｅｉ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ９：３１４～２６，２
０１２）。ｃ－Ｍｅｔは、タンパク質分解により、５０ｋＤａのα－サブユニット及び１
４０ｋＤａのβ－サブユニットに分割される、ジスルフィド結合により連結した単鎖タン
パク質として合成される（Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ，２２：３０９～３２５，２００３）。ｃ－Ｍｅｔは、Ｒｏｎなど、他の膜受
容体に構造的に類似している。ＨＧＦの厳密な化学量論としての、ｃ－Ｍｅｔ結合は、明
確でないが、概して、２つのＨＧＦ分子が、２つのｃ－Ｍｅｔ分子に結合し、受容体の二
量化及びチロシン１２３０、１２３４及び１２３５での自己リン酸化をもたしていると考
えられている（Ｓｔａｍｏｓら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２３：２３２５～
２３３５，２００４）。遺伝子増幅、突然変異、又は、受容体過剰発現により、リガンド
－非依存性のｃ－Ｍｅｔ自己リン酸化も発生し得る。
【0006】
ｃ－Ｍｅｔは、胃癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膀胱癌、頭頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、甲
状腺癌、膵癌、及び中枢神経系癌など、多くの型の癌において、高い頻度で、増幅、突然
変異又は過剰発現する。典型的には、キナーゼドメインに局在化するミスセンス突然変異
は、一般に、遺伝性乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）に見出され、散在性ＰＲＣＣの１３％に
見られる（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：２３４３～２３５０，１９９９
）。セマフォリン又はｃ－Ｍｅｔの膜近傍ドメインに局在化するｃ－Ｍｅｔ突然変異は、
高い頻度で胃癌、頭頸部癌、頭頸部、肝臓癌、卵巣癌、ＮＳＣＬＣ及び甲状腺癌において
見られる（Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２
２：３０９～３２５，２００３；Ｓａｋａｋｕｒａら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ，１９９９．２４：２９９～３０５）。ｃ－Ｍｅｔの増幅は、脳腫瘍、大
腸癌、胃癌及び肺癌にて検出され、多くの場合、疾患の進行に関連する（Ｍａら、Ｃａｎ
ｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９～３２５，２０
０３）。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の最大４％及び胃癌の最大２０％が、それぞれ、ｃ
－Ｍｅｔ増幅を示す（Ｓａｋａｋｕｒａら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃ
ｅｒ，１９９９．２４：２９９～３０５：Ｓｉｅｒｒａ ａｎｄ Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２
１～３５，２０１１）。遺伝子増幅がない状態であっても、ｃ－Ｍｅｔの過剰発現は、肺
癌にて高い頻度で観察される（Ｉｃｈｉｍｕｒａら、Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
，８７：１０６３～９，１９９６）。更に、臨床サンプルでは、ほぼ半数の肺腺癌が高レ
ベルのｃ－Ｍｅｔ及びＨＧＦを示し、いずれも腫瘍増殖率、転移及び予後不良の憎大と相
関した（Ｓｉｅｒｒａ ａｎｄ Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２１～３５，２０１１；Ｓｉｅｇｆ
ｒｉｅｄら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ ６６：１９１５～８，１９９８）。
状腺癌、膵癌、及び中枢神経系癌など、多くの型の癌において、高い頻度で、増幅、突然
変異又は過剰発現する。典型的には、キナーゼドメインに局在化するミスセンス突然変異
は、一般に、遺伝性乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）に見出され、散在性ＰＲＣＣの１３％に
見られる（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：２３４３～２３５０，１９９９
）。セマフォリン又はｃ－Ｍｅｔの膜近傍ドメインに局在化するｃ－Ｍｅｔ突然変異は、
高い頻度で胃癌、頭頸部癌、頭頸部、肝臓癌、卵巣癌、ＮＳＣＬＣ及び甲状腺癌において
見られる（Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２
２：３０９～３２５，２００３；Ｓａｋａｋｕｒａら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ，１９９９．２４：２９９～３０５）。ｃ－Ｍｅｔの増幅は、脳腫瘍、大
腸癌、胃癌及び肺癌にて検出され、多くの場合、疾患の進行に関連する（Ｍａら、Ｃａｎ
ｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９～３２５，２０
０３）。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の最大４％及び胃癌の最大２０％が、それぞれ、ｃ
－Ｍｅｔ増幅を示す（Ｓａｋａｋｕｒａら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃ
ｅｒ，１９９９．２４：２９９～３０５：Ｓｉｅｒｒａ ａｎｄ Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２
１～３５，２０１１）。遺伝子増幅がない状態であっても、ｃ－Ｍｅｔの過剰発現は、肺
癌にて高い頻度で観察される（Ｉｃｈｉｍｕｒａら、Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
，８７：１０６３～９，１９９６）。更に、臨床サンプルでは、ほぼ半数の肺腺癌が高レ
ベルのｃ－Ｍｅｔ及びＨＧＦを示し、いずれも腫瘍増殖率、転移及び予後不良の憎大と相
関した（Ｓｉｅｒｒａ ａｎｄ Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２１～３５，２０１１；Ｓｉｅｇｆ
ｒｉｅｄら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ ６６：１９１５～８，１９９８）。
【0007】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害物質に耐性を示すようになる全腫瘍のほぼ６０％がｃ－
Ｍｅｔの発現の増加、ｃ－Ｍｅｔの増幅、又はその唯一の既知のリガンドである、ＨＧＦ
の増加を示し（Ｔｕｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１７：７７～８８，２０１０）
、ｃ－Ｍｅｔを介する、ＥＧＦＲの代償経路の存在を示している。ＥＧＦＲキナーゼ阻害
剤であるゲフィチニブに耐性を示すようになった培養細胞において、ｃ－Ｍｅｔの増幅が
最初に確認され、Ｈｅｒ３経路を介して、生存率の向上を示した（Ｅｎｇｅｌｍａｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６：１０３９～４３，２００７）。この点は、ｃ－Ｍｅｔの増幅を
示したエルロチニブ又はゲフィチニブの一方に対して耐性を得た４３名中９名の患者を６
２名中２名のみの未治療患者と比較した臨床サンプルにおいて、更に確認された。治療を
受けた患者９名中、４名が、ＥＧＦＲ活性化突然変異体、Ｔ７９０Ｍも獲得し、同時的な
耐性経路を示した（Ｂｅａｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，
１０４：２０９３２～７，２００７）。
Ｍｅｔの発現の増加、ｃ－Ｍｅｔの増幅、又はその唯一の既知のリガンドである、ＨＧＦ
の増加を示し（Ｔｕｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１７：７７～８８，２０１０）
、ｃ－Ｍｅｔを介する、ＥＧＦＲの代償経路の存在を示している。ＥＧＦＲキナーゼ阻害
剤であるゲフィチニブに耐性を示すようになった培養細胞において、ｃ－Ｍｅｔの増幅が
最初に確認され、Ｈｅｒ３経路を介して、生存率の向上を示した（Ｅｎｇｅｌｍａｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６：１０３９～４３，２００７）。この点は、ｃ－Ｍｅｔの増幅を
示したエルロチニブ又はゲフィチニブの一方に対して耐性を得た４３名中９名の患者を６
２名中２名のみの未治療患者と比較した臨床サンプルにおいて、更に確認された。治療を
受けた患者９名中、４名が、ＥＧＦＲ活性化突然変異体、Ｔ７９０Ｍも獲得し、同時的な
耐性経路を示した（Ｂｅａｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，
１０４：２０９３２～７，２００７）。
【0008】
癌内でのＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ双方の各役割が十分に確立され、これらの標的を、併
用治療にとって魅力的なものとしている。いずれの受容体も同一の生存経路及び抗アポト
ーシス経路（ＥＲＫ及びＡＫＴ）を介して、シグナル伝達するため、このペアを組み合わ
せて阻害することにより、代償経路活性化の可能性が制限され、全体の有効性を向上させ
得る。ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔを標的にした併用療法の試験が、ＮＳＣＬに対して、タル
セバ（登録商標）（エルロチニブ）と抗－ｃ－Ｍｅｔ一価抗体とを併用する治験（Ｓｐｉ
ｇｅｌら、２０１１ ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ ２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｃｈｉｃ
ａｇｏ，ＩＬ．ｐ．７５０５）において、また、タルセバ（エルロチニブ）とＡＲＱ－１
９７（ｃ－Ｍｅｔの低分子阻害剤）とを併用する治験（Ａｄｊｅｉら、Ｏｎｃｏｌｏｇｉ
ｓｔ，１６：７８８～９９，２０１１）において、行われる。併用療法又は二重特異性抗
－ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、例えば、以下に開示されている。国際特許公開第２００
８／１２７７１０号、米国特許公開第ＵＳ２００９／００４２９０６号、国際特許公開第
２００９／１１１６９１号、国際第２００９／１２６８３４号、国際特許公開第２０１０
／０３９２４８号、国際第２０１０／１１５５５１号。
用治療にとって魅力的なものとしている。いずれの受容体も同一の生存経路及び抗アポト
ーシス経路（ＥＲＫ及びＡＫＴ）を介して、シグナル伝達するため、このペアを組み合わ
せて阻害することにより、代償経路活性化の可能性が制限され、全体の有効性を向上させ
得る。ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔを標的にした併用療法の試験が、ＮＳＣＬに対して、タル
セバ（登録商標）（エルロチニブ）と抗－ｃ－Ｍｅｔ一価抗体とを併用する治験（Ｓｐｉ
ｇｅｌら、２０１１ ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ ２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｃｈｉｃ
ａｇｏ，ＩＬ．ｐ．７５０５）において、また、タルセバ（エルロチニブ）とＡＲＱ－１
９７（ｃ－Ｍｅｔの低分子阻害剤）とを併用する治験（Ａｄｊｅｉら、Ｏｎｃｏｌｏｇｉ
ｓｔ，１６：７８８～９９，２０１１）において、行われる。併用療法又は二重特異性抗
－ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、例えば、以下に開示されている。国際特許公開第２００
８／１２７７１０号、米国特許公開第ＵＳ２００９／００４２９０６号、国際特許公開第
２００９／１１１６９１号、国際第２００９／１２６８３４号、国際特許公開第２０１０
／０３９２４８号、国際第２０１０／１１５５５１号。
【0009】
治療のためにＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔシグナル伝達経路をアンタゴナイズする、
現在の小分子及び大分子治療手段は、特異性の欠如の可能性、潜在的な非標的活性及び低
分子阻害物質により遭遇し得る用量制限毒性により、次善の手段であり得る。典型的な二
価抗体により、膜結合型受容体のクラスター形成及び下流シグナル伝達経路の不必要な活
性化がもたらされ得る。一価抗体（ハーフアーム）では、製造工程が著しく複雑になり、
それにかかる費用が発生する。
現在の小分子及び大分子治療手段は、特異性の欠如の可能性、潜在的な非標的活性及び低
分子阻害物質により遭遇し得る用量制限毒性により、次善の手段であり得る。典型的な二
価抗体により、膜結合型受容体のクラスター形成及び下流シグナル伝達経路の不必要な活
性化がもたらされ得る。一価抗体（ハーフアーム）では、製造工程が著しく複雑になり、
それにかかる費用が発生する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
したがって、治療用途及び診断用途のために、更なる単一特異性及び二重特異性ＥＧＦ
Ｒ及び／又はｃ－Ｍｅｔ阻害物質が必要とされている。
Ｒ及び／又はｃ－Ｍｅｔ阻害物質が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメ
インを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは
、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦ
Ｒとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－
Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキ
ングする、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
インを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは
、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦ
Ｒとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－
Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキ
ングする、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
【0012】
また、本発明は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ
３ドメインを含む、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供し、ここで該第１のＦ
Ｎ３ドメインは、少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸
配列を含み、該第２のＦＮ３ドメインは、少なくとも８３％が配列番号４１のアミノ酸配
列と同一であるアミノ酸配列を含む。
３ドメインを含む、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供し、ここで該第１のＦ
Ｎ３ドメインは、少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸
配列を含み、該第２のＦＮ３ドメインは、少なくとも８３％が配列番号４１のアミノ酸配
列と同一であるアミノ酸配列を含む。
【0013】
また、本発明は、特定の配列を有する、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メイン含有分子、及び単一特異性ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン含有分子も
提供する。
メイン含有分子、及び単一特異性ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン含有分子も
提供する。
【0014】
また、本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（
ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ
３）ドメインであって、該ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に
基づいて設計されたライブラリから単離される、ＦＮ３ドメインも提供する。
ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ
３）ドメインであって、該ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に
基づいて設計されたライブラリから単離される、ＦＮ３ドメインも提供する。
【0015】
本発明は、また、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖
因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ
型（ＦＮ３）ドメインを提供する。
因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ
型（ＦＮ３）ドメインを提供する。
【0016】
また、本発明は、本発明の分子をコードする単離ポリヌクレオチドも提供する。本発明
の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【0017】
本発明は、また、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0018】
本発明は、また、二重特異性分子を作製する方法であって、本発明の単離宿主細胞を、
該二重特異性分子が発現するような条件下で培養することと、該二重特異性分子を精製す
ることと、を含む、方法。
該二重特異性分子が発現するような条件下で培養することと、該二重特異性分子を精製す
ることと、を含む、方法。
【0019】
本発明は、また、本発明の分子及び製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物を提供す
る。
る。
【0020】
本発明は、また、癌の治療を行うために十分な時間にわたって、治療的に有効な量の前
記二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子又は前記ＥＧＦＲ若しくは
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有す
る被験体を治療する方法を提供する。
記二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子又は前記ＥＧＦＲ若しくは
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有す
る被験体を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1A】ＥＧＦＲ－結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸アライメントの図である。ＢＣ及びＦＧループは、配列番号１８の残基２２～２８及び７５～８６で四角内に表示されている。変異型のいくつかとして、熱安定性が向上しているＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ及びＥ８６Ｉの置換（残基部分のナンバリングは、Ｔｅｎｃｏｎ配列番号１による）が挙げられる。Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）パラトープ残基には、下線が付いている（配列番号２７のＤ２３、Ｆ２７、Ｙ２８，Ｖ７７、Ｇ８５）。
【図1B】ＥＧＦＲ－結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸アライメントの図である。ＢＣ及びＦＧループは、配列番号１８の残基２２～２８及び７５～８６で四角内に表示されている。変異型のいくつかとして、熱安定性が向上しているＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ及びＥ８６Ｉの置換（残基部分のナンバリングは、Ｔｅｎｃｏｎ配列番号１による）が挙げられる。Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）パラトープ残基には、下線が付いている（配列番号２７のＤ２３、Ｆ２７、Ｙ２８，Ｖ７７、Ｇ８５）。
【図2】Ｔｅｎｃｏｎ２７スカフォールド（配列番号９９）及びランダム化Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ代替表面を有するＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号１００）の配列アラインメントを示す図である。ループ残基は、四角内に表示される。ループ及びストランドは、配列の上に示す。
【図3-1】ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アラインメントを示す図である。Ｃループ及びＣＤストランド並びにＦループ及びＦＧストランドは、四角内に表示され、スパン残基２９～４３及び６５～８１である。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）パラトープ残基には、下線が付いている（Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓ）。
【図3-2】ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アラインメントを示す図である。Ｃループ及びＣＤストランド並びにＦループ及びＦＧストランドは、四角内に表示され、スパン残基２９～４３及び６５～８１である。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）パラトープ残基には、下線が付いている（Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓ）。
【図4】単一特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子により前処理し、ＨＧＦにより刺激を与えたＨ２９２細胞中におけるｃ－Ｍｅｔのリン酸化の阻害を示す図である。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ１）の効力は、単一特異性ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ５、図中、Ａ５として示す）単独の場合、又は、単一特異性ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインをＥＧＦＲ－結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２、図中、８３ｖ２として示す）と組み合わせた場合と比較すると、顕著に上昇した。
【図5】単一特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子により前処理した細胞における、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔのリン酸化の阻害を示す図である。ＥＧＦＲ、ＮＣＩ－Ｈ２９２（図５Ａ）及びＨ５９６図５（Ｂ）が高レベルで発現している細胞株中では、抗－ＥＧＦＲ単一特異性及び二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲリン酸化が低下する時点で、ほぼ同じ効力を示す。ｃ－Ｍｅｔに対して低いレベルのＥＧＦＲが発現する細胞株である、Ｈ４４１では（図５Ｃ）、単一特異性ＥＧＦＲ－結合ＦＮ３ドメイン単独の場合と比較して、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、ＥＧＦＲリン酸化の阻害の効力を向上させる。ＥＧＦＲに対して、低いレベルのｃ－Ｍｅｔを有する細胞株である、Ｈ２９２（図５Ｄ）及びＨ５９６（図５Ｅ）では、単一特異性ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン単独の場合と比較して、ｃ－Ｍｅｔリン酸化の阻害が、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子により大幅に増強される。本試験において、次の分子を使用した：二重特異性ＥＣＢ５（図中、１７－Ａ３として示す）、単一特異性ＥＧＦＲ－結合ＦＮ３ドメインＰ５３Ａ１Ｒ５－１７（図中、「１７」として示す）、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子ＥＣＢ３（図中、８３－Ｈ９として示す）、及び単一特異性ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＰ１１４ＡＲ７Ｐ９３－Ｈ９（図中、Ｈ９として示す）。
【図6】二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子を投与したマウスから単離された腫瘍内における薬力学的シグナル伝達を示す、６時間又は７２時間の場合の図である。６時間及び７２時間のいずれにおいても、いずれの分子も、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫのリン酸化を大幅に減少させた。その程度は、阻害がＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔへの親和性に依存していた。高い（図中の「８３」は、ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２である）又は中程度（図中の「１７ｖ２」は、Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２である）の親和性を有するＥＧＦＲ－結合ＦＮ３ドメインを、高い（図中「Ａ３」は、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３である）又は中程度（図中の「Ａ５」は、Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ５）の親和性を有するｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに対して連結することによって、二重特異性分子を調製した。
【図7】アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）に連結された様々な（variable）親和性の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔ分子の、ＩＰ投与後６時間（左）及び７２時間（右）の、血漿集積（上）及び腫瘍集積（下）を示す。投与後６時間では、中程度の親和性のＥＧＦＲ－結合ＦＮ３ドメイン（１７ｖ２）又は高親和性のＥＧＦＲ結合ドメイン（８３ｖ２）を内部に有する二重特異性分子を投与されたマウスで、腫瘍集積は、最大である。高い又は中程度の親和性のＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを組み込んだ二重特異性分子は、以下の通りである；８３ｖ２－Ａ５－ＡＢＤ（ＥＣＢ１８；ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔに対して高い／中程度）、８３ｖ２－Ａ３－ＡＢＤ（ＥＣＢ３８；高い／高い）、１７ｖ２－Ａ５（ＥＣＢ２８；中程度／中程度）、１７ｖ２－Ａ３－ＡＢＤ（ＥＣＢ３９；中程度／高い）。図中では、８３ｖ２は、ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２を指し、１７ｖ２は、ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２を指し、Ａ３は、ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３を指し、また、Ａ５は、ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ５を指す。
【図8】Ｈ２９２－ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤベージュマウスに埋め込んだ。腫瘍の平均体積が、約８０ｍｍ3に到達すると、マウスは、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子（２５ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢＳビヒクルの投与を３回／週受けた。二重特異性分子はいずれも腫瘍増殖を減少させ、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、ｃ－Ｍｅｔ及びＥＧＦＲについては、その分子の親和性に依存する。（高ＥＧＦＲ－高ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２－ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３（ＥＣＢ３８）を指し、高ＥＧＦＲ－中ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２－ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ５（ＥＣＢ１８）を指し、中ＥＧＦＲ－高ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２－ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３（ＥＣＢ３９）を指し、中ＥＧＦＲ－中－ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７－ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ５（ＥＣＢ２８）を指す）。
【図9】Ｈ２９２－ＨＧＦ腫瘍異種移植片は、ＳＣＩＤベージュマウスに埋め込み、異なる治療法で処置した。本治療法の抗腫瘍活性を示す（二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２－ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３－ＡＢＤ（ＥＣＢ３８）を指し、その他の治療法は、クリゾチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ及びクリゾチニブエルロチニブとの併用である）。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本明細書で用いられる用語「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３
ドメイン）は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質類、サイトカ
イン受容体及び原核酵素を含む、タンパク質中に頻繁に存在するドメインを指す（Ｂｏｒ
ｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９
：８９９０～８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：
１９１０～１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５
：１５６５９～１５６６５，１９９０）。例えば、例示的なＦＮ３ドメインは、ヒトテネ
イシンＣ中に存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）中に
存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、及び米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号
に記載されているような非天然合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ド
メイン番号及びタンパク質名によって、例えば、テネイシンの第３ ＦＮ３ドメイン（Ｔ
Ｎ３）、又はフィブロネクチンの第１０ ＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）と称される。
ドメイン）は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質類、サイトカ
イン受容体及び原核酵素を含む、タンパク質中に頻繁に存在するドメインを指す（Ｂｏｒ
ｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９
：８９９０～８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：
１９１０～１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５
：１５６５９～１５６６５，１９９０）。例えば、例示的なＦＮ３ドメインは、ヒトテネ
イシンＣ中に存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）中に
存在する１５の異なるＦＮ３ドメイン、及び米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号
に記載されているような非天然合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ド
メイン番号及びタンパク質名によって、例えば、テネイシンの第３ ＦＮ３ドメイン（Ｔ
Ｎ３）、又はフィブロネクチンの第１０ ＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）と称される。
【0023】
本明細書で用いられる用語「置換する」若しくは「置換される」、又は「変異する」若
しくは「変異させられる」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列における１つ以
上のアミノ酸又はヌクレオチドを変更、削除、挿入し、その配列の変異体を生成すること
を指す。
しくは「変異させられる」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列における１つ以
上のアミノ酸又はヌクレオチドを変更、削除、挿入し、その配列の変異体を生成すること
を指す。
【0024】
本明細書で用いられる用語「ランダム化する」若しくは「ランダム化される」、又は「
多様化される」若しくは「多様化する」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列にお
いて少なくとも１つの置換、挿入、又は欠失を行うことを指す。
多様化される」若しくは「多様化する」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列にお
いて少なくとも１つの置換、挿入、又は欠失を行うことを指す。
【0025】
本明細書で用いられる「変異体」は、例えば、置換、挿入、又は欠失などのうちの１つ
以上の修飾によって、基準ポリペプチド又は基準ポリヌクレオチドとは異なっている、ポ
リペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
以上の修飾によって、基準ポリペプチド又は基準ポリヌクレオチドとは異なっている、ポ
リペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
【0026】
本明細書で用いられる用語「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、約１×１０-6
Ｍ以下、例えば、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１
×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、約１×１０-12Ｍ以下、又は約１×１０-13Ｍ以
下の解離定数（ＫD）にて、所定の抗原に結合する、本発明のＦＮ３ドメインの能力を指
す。典型的には、本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定したとき、非特異的
抗原（例えば、ＢＳＡ又は力ゼイン）に対するＫDの少なくとも１０倍以下であるＫDにて
、所定の抗原（すなわち、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ）に結合される。したがって、本発明
の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、各ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍ
ｅｔに特異的に結合し、結合親和性（ＫD）は、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの両方に対して
、少なくとも１×１０-6Ｍ以下である。しかし、所定の抗原に特異的に結合する本発明の
単離ＦＮ３ドメインは、他の関連した抗原、例えば、その他の種（同族体類）からの同一
の所定の抗原に対して、交差反応性を有し得る。
Ｍ以下、例えば、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、約１
×１０-10Ｍ以下、約１×１０-11Ｍ以下、約１×１０-12Ｍ以下、又は約１×１０-13Ｍ以
下の解離定数（ＫD）にて、所定の抗原に結合する、本発明のＦＮ３ドメインの能力を指
す。典型的には、本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定したとき、非特異的
抗原（例えば、ＢＳＡ又は力ゼイン）に対するＫDの少なくとも１０倍以下であるＫDにて
、所定の抗原（すなわち、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ）に結合される。したがって、本発明
の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、各ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍ
ｅｔに特異的に結合し、結合親和性（ＫD）は、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの両方に対して
、少なくとも１×１０-6Ｍ以下である。しかし、所定の抗原に特異的に結合する本発明の
単離ＦＮ３ドメインは、他の関連した抗原、例えば、その他の種（同族体類）からの同一
の所定の抗原に対して、交差反応性を有し得る。
【0027】
用語「ライブラリ」は、変異体の集合を指す。ライブラリは、ポリペプチド又はポリヌ
クレオチド変異体からなっていてよい。
クレオチド変異体からなっていてよい。
【0028】
本明細書で用いられる用語「安定性」は、生理学的条件下において、例えば、ＥＧＦＲ
又はｃ－Ｍｅｔなどの所定の抗原に結合しているなど、正常な機能的活動のうちの少なく
とも１つを保持するように、折り畳まれた状態を維持するための分子の能力を指す。
又はｃ－Ｍｅｔなどの所定の抗原に結合しているなど、正常な機能的活動のうちの少なく
とも１つを保持するように、折り畳まれた状態を維持するための分子の能力を指す。
【0029】
本明細書で用いられる用語「上皮成長因子受容体」又は「ＥＧＦＲ」は、配列番号７３
及びＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００５２１９に示される配列を有するヒトＥＧＦＲ（
また、ＨＥＲ－１又はＥｒｂ－Ｂ１としても既知である（Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３０９：４１８～４２５，１９８４））並びにこれらの天然の突然変異体を指す。こ
うした変異体としては、周知のＥＧＦＲｖＩＩＩ及び他の代替スプライス変異体が挙げら
れ、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ００５３３－１（野生
型；配列番号７３及びＮＰ＿００５２１９と同一）、Ｐ００５３３－２（Ｆ４０４Ｌ／Ｌ
４０５Ｓ）、Ｐ００５３３－３（６２８～７０５：ＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰ．．．ＧＥＡＰ
ＮＱＡＬＬＲ→ＰＧＮＥＳＬＫＡＭＬ．．．ＳＶＩＩＴＡＳＳＣＨ及び７０６～１２１０
欠失）、Ｐ００５３３－４（Ｃ６２８Ｓ及び６２９～１２１０欠失）、変異体Ｑ９８、Ｒ
２６６、Ｋ５２１、Ｉ６７４、Ｇ９６２及びＰ９８８（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、ＮＩＥ
ＨＳ－ＳＮＰｓ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｊｅｃｔ，ＮＩＥ
ＨＳ ＥＳ１５４７８），Ｔ７９０Ｍ，Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ及びｄｅｌ（Ｅ７４６，
Ａ７５０）によって同定されるものがある。
及びＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００５２１９に示される配列を有するヒトＥＧＦＲ（
また、ＨＥＲ－１又はＥｒｂ－Ｂ１としても既知である（Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３０９：４１８～４２５，１９８４））並びにこれらの天然の突然変異体を指す。こ
うした変異体としては、周知のＥＧＦＲｖＩＩＩ及び他の代替スプライス変異体が挙げら
れ、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ００５３３－１（野生
型；配列番号７３及びＮＰ＿００５２１９と同一）、Ｐ００５３３－２（Ｆ４０４Ｌ／Ｌ
４０５Ｓ）、Ｐ００５３３－３（６２８～７０５：ＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰ．．．ＧＥＡＰ
ＮＱＡＬＬＲ→ＰＧＮＥＳＬＫＡＭＬ．．．ＳＶＩＩＴＡＳＳＣＨ及び７０６～１２１０
欠失）、Ｐ００５３３－４（Ｃ６２８Ｓ及び６２９～１２１０欠失）、変異体Ｑ９８、Ｒ
２６６、Ｋ５２１、Ｉ６７４、Ｇ９６２及びＰ９８８（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、ＮＩＥ
ＨＳ－ＳＮＰｓ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｊｅｃｔ，ＮＩＥ
ＨＳ ＥＳ１５４７８），Ｔ７９０Ｍ，Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ及びｄｅｌ（Ｅ７４６，
Ａ７５０）によって同定されるものがある。
【0030】
本明細書で用いられる用語「ＥＧＦＲリガンド」は、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ヘパリン結
合ＥＧＦ（ＨＢ－ＥＧＦ）、アンフィレグリン（ＡＲ）及びエピレグリン（ＥＰＩ）など
、ＥＧＦＲの全ての（例えば、生理学的）リガンド、を包含する。
合ＥＧＦ（ＨＢ－ＥＧＦ）、アンフィレグリン（ＡＲ）及びエピレグリン（ＥＰＩ）など
、ＥＧＦＲの全ての（例えば、生理学的）リガンド、を包含する。
【0031】
本明細書で用いられる用語「上皮成長因子」（ＥＧＦ）は、配列番号７４に示されるア
ミノ酸配列を有する既知の５３のアミノ酸ヒトＥＧＦを指す。
ミノ酸配列を有する既知の５３のアミノ酸ヒトＥＧＦを指す。
【0032】
本明細書で用いられる用語「肝細胞増殖因子受容体」又は「ｃ－Ｍｅｔ」は、配列番号
１０１又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１１２０９７２に示されるアミノ酸配列を
有するヒトｃ－Ｍｅｔ及びこれらの天然変異体を指す。
１０１又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１１２０９７２に示されるアミノ酸配列を
有するヒトｃ－Ｍｅｔ及びこれらの天然変異体を指す。
【0033】
本明細書で用いられる用語「肝細胞増殖因子」（ＨＧＦ）は、分割されて、ジスルフィ
ド結合によって連結したα鎖とβ鎖の二量体を形成する、配列番号１０２に示されたアミ
ノ酸配列を有する周知のヒトＨＧＦを指す。
ド結合によって連結したα鎖とβ鎖の二量体を形成する、配列番号１０２に示されたアミ
ノ酸配列を有する周知のヒトＨＧＦを指す。
【0034】
本明細書で用いられる用語「結合をブロッキングする」又は「結合を阻害する」は同じ
意味で用いられ、本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３
ドメイン含有分子の、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ－Ｍｅｔに対するＨＧＦなど
の、ＥＧＦＲリガンドの結合をブロッキング又は阻害する能力を指し、そして、部分的な
ブロッキング／阻害、及び完全なブロッキング／阻害の両方を包含する。ブロッキング又
は阻害のない場合の、ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲリガンドの結合及び／又はｃ－Ｍｅｔに
対するＨＧＦの結合と比較したとき、本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／
ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子による、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ－Ｍ
ｅｔに対するＨＧＦなどの、ＥＧＦＲリガンドのブロッキング又は阻害は、ＥＧＦＲシグ
ナル伝達及び／又はｃ－Ｍｅｔのシグナル伝達の正常レベルを部分的に又は完全に低下さ
せる。本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含
有分子は、阻害が、少なくとも、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６
０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である場合、ＥＧＦＲに対
するＥＧＦ及び／又はｃ－Ｍｅｔに対するＨＧＦなどのＥＧＦＲリガンドの「結合をブロ
ッキングする」。結合の阻害は、例えば、ＦＡＣＳを用いて、かつ本明細書に記載の方法
を用いて、ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分
子にさらされたＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞上でのビオチン化ＥＧＦの結合の阻害を測定す
るか、又は周知の方法及び本明細書に記載の方法を用いて、ｃ－Ｍｅｔ細胞外ドメイン上
のビオチン化ＨＧＦ結合の阻害を測定するなどの、周知の方法を用いて、測定することが
できる。
意味で用いられ、本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３
ドメイン含有分子の、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ－Ｍｅｔに対するＨＧＦなど
の、ＥＧＦＲリガンドの結合をブロッキング又は阻害する能力を指し、そして、部分的な
ブロッキング／阻害、及び完全なブロッキング／阻害の両方を包含する。ブロッキング又
は阻害のない場合の、ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲリガンドの結合及び／又はｃ－Ｍｅｔに
対するＨＧＦの結合と比較したとき、本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／
ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子による、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ－Ｍ
ｅｔに対するＨＧＦなどの、ＥＧＦＲリガンドのブロッキング又は阻害は、ＥＧＦＲシグ
ナル伝達及び／又はｃ－Ｍｅｔのシグナル伝達の正常レベルを部分的に又は完全に低下さ
せる。本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含
有分子は、阻害が、少なくとも、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６
０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である場合、ＥＧＦＲに対
するＥＧＦ及び／又はｃ－Ｍｅｔに対するＨＧＦなどのＥＧＦＲリガンドの「結合をブロ
ッキングする」。結合の阻害は、例えば、ＦＡＣＳを用いて、かつ本明細書に記載の方法
を用いて、ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分
子にさらされたＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞上でのビオチン化ＥＧＦの結合の阻害を測定す
るか、又は周知の方法及び本明細書に記載の方法を用いて、ｃ－Ｍｅｔ細胞外ドメイン上
のビオチン化ＨＧＦ結合の阻害を測定するなどの、周知の方法を用いて、測定することが
できる。
【0035】
用語「ＥＧＦＲシグナル伝達」は、ＥＧＦＲに結合しているＥＧＦＲリガンドによって
引き起こされるシグナル伝達を指し、ＥＧＦＲ中の少なくとも１つのチロシン残基の自己
リン酸化をもたらす。例示的なＥＧＦＲリガンドは、ＥＧＦである。
引き起こされるシグナル伝達を指し、ＥＧＦＲ中の少なくとも１つのチロシン残基の自己
リン酸化をもたらす。例示的なＥＧＦＲリガンドは、ＥＧＦである。
【0036】
本明細書で用いられる用語「ＥＧＦＲシグナル伝達を中和する」は、ＥＧＦなどのＥＧ
ＦＲリガンドによって引き起こされるＥＧＦＲシグナル伝達を少なくとも３０％、３５％
、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
又は１００％阻害する、本発明のＦＮ３ドメインの能力を指す。
ＦＲリガンドによって引き起こされるＥＧＦＲシグナル伝達を少なくとも３０％、３５％
、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
又は１００％阻害する、本発明のＦＮ３ドメインの能力を指す。
【0037】
用語「ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達」は、ｃ－Ｍｅｔに結合しているＨＧＦによって引き起
こされるシグナル伝達を指し、ｃ－Ｍｅｔ中の少なくとも１つのチロシン残基の自己リン
酸化をもたらす。典型的には、１２３０、１２３４、１２３５又は１３４９位において、
少なくとも１つのチロシン残基が、ＨＧＦ結合時に自己リン酸化される。
こされるシグナル伝達を指し、ｃ－Ｍｅｔ中の少なくとも１つのチロシン残基の自己リン
酸化をもたらす。典型的には、１２３０、１２３４、１２３５又は１３４９位において、
少なくとも１つのチロシン残基が、ＨＧＦ結合時に自己リン酸化される。
【0038】
本明細書で用いられる用語「ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達を中和する」は、ＨＧＦによって
引き起こされるｃ－Ｍｅｔシグナル伝達を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、
５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害す
る、本発明のＦＮ３ドメインの能力を指す。
引き起こされるｃ－Ｍｅｔシグナル伝達を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、
５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害す
る、本発明のＦＮ３ドメインの能力を指す。
【0039】
本明細書で用いられる用語「過剰発現」、「過剰発現した」、「過剰発現している」は
、同じ意味であり、同一組織型の正常細胞と比較して、表面上で測定可能なほど高レベル
のＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔを有する癌又は悪性細胞を指す。このような過剰発現は
、遺伝子増幅又は転写若しくは転換の増加によって引き起こされる場合がある。ＥＧＦＲ
及び／又はｃ－Ｍｅｔの発現及び過剰発現は、例えば、生細胞又は溶解細胞でのＥＬＩＳ
Ａ、免疫蛍光法、フローサイトメトリー又はラジオイムノアッセイを使用する、既知のア
ッセイにて測定することができる。あるいは、又は更には、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅ
ｔ－コード核酸分子のレベルは、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法、サ
ザンブロット法又はＰＣＲ法を用いて、細胞中において測定してもよい。細胞表面上のＥ
ＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔレベルが正常細胞と比較して、少なくとも１．５倍以上高い
ときは、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔが過剰発現している。
、同じ意味であり、同一組織型の正常細胞と比較して、表面上で測定可能なほど高レベル
のＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔを有する癌又は悪性細胞を指す。このような過剰発現は
、遺伝子増幅又は転写若しくは転換の増加によって引き起こされる場合がある。ＥＧＦＲ
及び／又はｃ－Ｍｅｔの発現及び過剰発現は、例えば、生細胞又は溶解細胞でのＥＬＩＳ
Ａ、免疫蛍光法、フローサイトメトリー又はラジオイムノアッセイを使用する、既知のア
ッセイにて測定することができる。あるいは、又は更には、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅ
ｔ－コード核酸分子のレベルは、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法、サ
ザンブロット法又はＰＣＲ法を用いて、細胞中において測定してもよい。細胞表面上のＥ
ＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔレベルが正常細胞と比較して、少なくとも１．５倍以上高い
ときは、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔが過剰発現している。
【0040】
本明細書で用いられる用語「Ｔｅｎｃｏｎ」は、配列番号１に示され、米国特許公開第
２０１０／０２１６７０８号に記述されている配列を有する合成フィブロネクチンＩＩＩ
型（ＦＮ３）ドメインを指す。
２０１０／０２１６７０８号に記述されている配列を有する合成フィブロネクチンＩＩＩ
型（ＦＮ３）ドメインを指す。
【0041】
本明細書で用いられる用語「癌細胞」又は「腫瘍細胞」は、必ずしも新規遺伝物質の取
り込みを伴わない、自然発生的又は誘発性表現型の変化を有する、インビボ、エクスビボ
及び組織培養液のいずれかにおける、癌性、前癌性又は形質転換細胞を指す。形質転換は
、形質転換ウイルスによる感染及び新規ゲノム核酸の取り込み又は外因性核酸の摂取から
発生し得るが、自然発生的に又は発癌性物質への暴露後に発生することもあり、これによ
って、内在性遺伝子の突然変異が起こり得る。形質転換／癌の例としては、ヌードマウス
などの好適な動物宿主、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態的変化、
細胞不死化、異常増殖制御、病巣形成、増殖、悪性疾患、腫瘍特異性マーカーレベル、侵
襲性、腫瘍増殖又は抑制などがある（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉ
ｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒ
ｄ ｅｄ．１９９４））。
り込みを伴わない、自然発生的又は誘発性表現型の変化を有する、インビボ、エクスビボ
及び組織培養液のいずれかにおける、癌性、前癌性又は形質転換細胞を指す。形質転換は
、形質転換ウイルスによる感染及び新規ゲノム核酸の取り込み又は外因性核酸の摂取から
発生し得るが、自然発生的に又は発癌性物質への暴露後に発生することもあり、これによ
って、内在性遺伝子の突然変異が起こり得る。形質転換／癌の例としては、ヌードマウス
などの好適な動物宿主、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態的変化、
細胞不死化、異常増殖制御、病巣形成、増殖、悪性疾患、腫瘍特異性マーカーレベル、侵
襲性、腫瘍増殖又は抑制などがある（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉ
ｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒ
ｄ ｅｄ．１９９４））。
【0042】
用語「ベクター」は、生物系内で複製することができる、又はこうした系の間で移動可
能である、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、生
物系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持しやすくするために機能する複製
源、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの要素を含有する。このような生物系
の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物
学的構成要素を利用して再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成する
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であって
もよい。
能である、ポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、生
物系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持しやすくするために機能する複製
源、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの要素を含有する。このような生物系
の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物
学的構成要素を利用して再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成する
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であって
もよい。
【0043】
「発現ベクター」という用語は、生物系又は再構成された生物系において、その発現ベ
クター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を指
示するために使用することができるベクターを意味する。
クター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を指
示するために使用することができるベクターを意味する。
【0044】
「ポリヌクレオチド」なる用語は、糖－リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により
共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖の
ＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖の
ＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【0045】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、ペプチド結合により連結されポリ
ペプチドを生成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０個未満
のアミノ酸の小さなポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合がある。
ペプチドを生成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０個未満
のアミノ酸の小さなポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合がある。
【0046】
本明細書で用いられる用語「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子」又は「二重特異性
ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子」は、直接的に又はリンカーを介しての
いずれかによって、共有結合により１つに連結される、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン及び
異なるｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを含む分子を指す。例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／
ｃ－Ｍｅｔ結合分子としては、ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のＦＮ３ドメイン、及び
ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する第２のＦＮ３ドメインが挙げられる。
ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子」は、直接的に又はリンカーを介しての
いずれかによって、共有結合により１つに連結される、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン及び
異なるｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを含む分子を指す。例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／
ｃ－Ｍｅｔ結合分子としては、ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のＦＮ３ドメイン、及び
ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する第２のＦＮ３ドメインが挙げられる。
【0047】
本明細書では、「価」は、分子中において、指定された数の、抗原特異的な結合部位の
存在を意味する。そのため、用語「一価の」、「二価の」、「四価の」及び「六価の」は
、それぞれ、分子中において抗原特異的な１個、２個、４個及び６個の結合部位の存在を
意味する。
存在を意味する。そのため、用語「一価の」、「二価の」、「四価の」及び「六価の」は
、それぞれ、分子中において抗原特異的な１個、２個、４個及び６個の結合部位の存在を
意味する。
【0048】
本明細書で用いられる用語「混合物」は、共有結合により、共に連結されてない２つ又
はそれ以上のＦＮ３ドメインのサンプル又は製剤を指す。混合物は、２つ又はそれ以上の
同一のＦＮ３ドメイン又は異なるＦＮ３ドメインから構成されていてよい。
はそれ以上のＦＮ３ドメインのサンプル又は製剤を指す。混合物は、２つ又はそれ以上の
同一のＦＮ３ドメイン又は異なるＦＮ３ドメインから構成されていてよい。
【0049】
物質の組成
本発明は、単一特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイ
ン含有分子を提供する。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードしているポリヌクレ
オチド、又はその相補的な核酸、ベクター、宿主細胞及びそれらを作製する方法、及び使
用する方法を提供する。
本発明は、単一特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイ
ン含有分子を提供する。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードしているポリヌクレ
オチド、又はその相補的な核酸、ベクター、宿主細胞及びそれらを作製する方法、及び使
用する方法を提供する。
【0050】
単一特異性ＥＧＦＲ結合分子
本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ
）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイ
ンを提供し、これにより、治療用途及び診断用途において幅広く使用することができる。
本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードしているポリヌクレオチド、又はその相補的
な核酸、ベクター、宿主細胞及びそれらを作製する方法、及び使用する方法を提供する。
本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ
）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイ
ンを提供し、これにより、治療用途及び診断用途において幅広く使用することができる。
本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードしているポリヌクレオチド、又はその相補的
な核酸、ベクター、宿主細胞及びそれらを作製する方法、及び使用する方法を提供する。
【0051】
本発明のＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲと高い親和性で結合し、ＥＧＦＲのシグナル伝達
を阻害し、低分子ＥＧＦＲ阻害物質と比較したときの特異性及び標的外の毒性の低減の点
において、並びに従来の抗体治療と比較したときの組織侵入の改善の点おいて、利益をも
たらし得る。
を阻害し、低分子ＥＧＦＲ阻害物質と比較したときの特異性及び標的外の毒性の低減の点
において、並びに従来の抗体治療と比較したときの組織侵入の改善の点おいて、利益をも
たらし得る。
【0052】
本発明は、また、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、かつ、上皮成長
因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型
（ＦＮ３）ドメインを提供する。
因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型
（ＦＮ３）ドメインを提供する。
【0053】
本明細書に記載の本発明のＦＮ３ドメインは、Ａ４３１細胞を用い、本発明のＦＮ３ド
メインと共に又は本発明のＦＮ３ドメイン無しで、インキュベートしたＡ４３１細胞にお
いて、６００ｎＭにて、ストレプトアビジン－フィコエリトリンコンジュゲートを使用し
て、結合されたビオチン化ＥＧＦからの蛍光量を検出する競合アッセイにおいて、約１×
１０-7Ｍ未満、又は約１×１０-8Ｍ未満、又は約１×１０-9Ｍ未満、又は約１×１０-10
Ｍ未満、又は約１×１０-11Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ
に対するＥＧＦの結合をブロッキングし得る。例示的なＦＮ３ドメインは、配列番号１８
～２９、１０７～１１０又は１２２～１３７のアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３
ドメインなど、約１×１０-9Ｍ～約１×１０-7ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲに対するＥＧ
Ｆの結合をブロッキングし得る。本発明のＦＮ３ドメインは、本発明のＦＮ３ドメインの
不在下で、同じアッセイ条件を用いてＥＧＦとＥＧＦＲとの結合を比較したとき、ＥＧＦ
Ｒに対するＥＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％
、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％
、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ブロッキングし得る
。
メインと共に又は本発明のＦＮ３ドメイン無しで、インキュベートしたＡ４３１細胞にお
いて、６００ｎＭにて、ストレプトアビジン－フィコエリトリンコンジュゲートを使用し
て、結合されたビオチン化ＥＧＦからの蛍光量を検出する競合アッセイにおいて、約１×
１０-7Ｍ未満、又は約１×１０-8Ｍ未満、又は約１×１０-9Ｍ未満、又は約１×１０-10
Ｍ未満、又は約１×１０-11Ｍ未満、又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ
に対するＥＧＦの結合をブロッキングし得る。例示的なＦＮ３ドメインは、配列番号１８
～２９、１０７～１１０又は１２２～１３７のアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３
ドメインなど、約１×１０-9Ｍ～約１×１０-7ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲに対するＥＧ
Ｆの結合をブロッキングし得る。本発明のＦＮ３ドメインは、本発明のＦＮ３ドメインの
不在下で、同じアッセイ条件を用いてＥＧＦとＥＧＦＲとの結合を比較したとき、ＥＧＦ
Ｒに対するＥＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％
、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％
、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ブロッキングし得る
。
【0054】
本明細書に記載の本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を使用した、本発明の
ＦＮ３ドメインの不在下でのシグナル伝達レベルと比較して、少なくとも３０％、３５％
、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
又は１００％、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害し得る。
ＦＮ３ドメインの不在下でのシグナル伝達レベルと比較して、少なくとも３０％、３５％
、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
又は１００％、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害し得る。
【0055】
ＥＧＦなどのリガンドのＥＧＦＲへの結合は、受容体二量体化、自己リン酸化、受容体
内部の活性化、細胞質チロシンキナーゼドメイン、並びにＤＮＡ合成の調節（遺伝子活性
化）及び細胞周期の進行又は分裂に関連する複数のシグナル伝達及び転写促進経路の開始
を刺激する。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害により、１つ以上のＥＧＦＲ下流のシグナル伝
達経路を阻害することもあり、また、このために、ＥＧＦＲの中和が、細胞増殖及び分化
、脈管形成、細胞運動性並びに転移の阻害など、種々の影響を有することもある。
内部の活性化、細胞質チロシンキナーゼドメイン、並びにＤＮＡ合成の調節（遺伝子活性
化）及び細胞周期の進行又は分裂に関連する複数のシグナル伝達及び転写促進経路の開始
を刺激する。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害により、１つ以上のＥＧＦＲ下流のシグナル伝
達経路を阻害することもあり、また、このために、ＥＧＦＲの中和が、細胞増殖及び分化
、脈管形成、細胞運動性並びに転移の阻害など、種々の影響を有することもある。
【0056】
ＥＧＦＲシグナル伝達は、種々の周知の方法、例えば、チロシンＹ１０６８、Ｙ１１４
８及びＹ１１７３のいずれかの受容体の自己リン酸化（Ｄｏｗｎｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１１：４８３～５，１９８４）及び／又は天然基材又は合成基材のリン酸化を測定
すること、を用いて測定することもできる。リン酸化は、ＥＬＩＳＡアッセイ又はウェス
タンブロット法など、周知の方法で、ホスホチロシン特異抗体を用いて検出できる。例示
的なアッセイは、Ｐａｎｅｋら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３
：１４３３～４４，１９９７及びＢａｔｌｅｙら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：１４３～５
０，１９９８で見られ、また、本明細書に記載したアッセイが挙げられる。
８及びＹ１１７３のいずれかの受容体の自己リン酸化（Ｄｏｗｎｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１１：４８３～５，１９８４）及び／又は天然基材又は合成基材のリン酸化を測定
すること、を用いて測定することもできる。リン酸化は、ＥＬＩＳＡアッセイ又はウェス
タンブロット法など、周知の方法で、ホスホチロシン特異抗体を用いて検出できる。例示
的なアッセイは、Ｐａｎｅｋら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３
：１４３３～４４，１９９７及びＢａｔｌｅｙら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：１４３～５
０，１９９８で見られ、また、本明細書に記載したアッセイが挙げられる。
【0057】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍ
ＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞中で測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満、例
えば、約１×１０-6Ｍ未満、約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ
未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12ＭのＩＣ50値にて
、ＥＧＦＲ残基位置チロシン１１７３でのＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害する。
ＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞中で測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満、例
えば、約１×１０-6Ｍ未満、約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ
未満、約１×１０-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12ＭのＩＣ50値にて
、ＥＧＦＲ残基位置チロシン１１７３でのＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害する。
【0058】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍ
ＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞中で測定したとき、１．８×１０-8Ｍ～約２．５
×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基位置チロシン１１７３でのＥＧＦ誘発性のＥＧ
ＦＲのリン酸化を阻害する。こうした例示的なＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、
１０７～１１０又は１２２～１３７のアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインである。
ＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞中で測定したとき、１．８×１０-8Ｍ～約２．５
×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基位置チロシン１１７３でのＥＧＦ誘発性のＥＧ
ＦＲのリン酸化を阻害する。こうした例示的なＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、
１０７～１１０又は１２２～１３７のアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインである。
【0059】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、当業者によって行われているような、表面
プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって測定されたとき、本発明のＦＮ３ドメインは
、約１×１０-8Ｍ未満、例えば、約１×１０-9Ｍ未満又は約１×１０-10Ｍ未満又は約１
×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12Ｍ又は約１×１０-13Ｍの解離定数（ＫD）にて、ヒト
ＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、約２×１０
-10～約１×１０-8ＭのＫDにて、ヒトＥＧＦＲに結合する。ＥＧＦＲのＦＮ３ドメインの
親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定され得る。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓ
ｋｙ，ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ
Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖ
ｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書に記載の方法を参照）。特定のＦＮ３ドメイン－抗
原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、浸透圧モル濃度、ｐＨ）下で測
定される場合に異なる場合がある。したがって、親和性及びその他抗原－結合パラメータ
（例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは、タンパク質スカフォールド及び抗
原の標準化溶液、及び本明細書で記載される緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる
。
プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって測定されたとき、本発明のＦＮ３ドメインは
、約１×１０-8Ｍ未満、例えば、約１×１０-9Ｍ未満又は約１×１０-10Ｍ未満又は約１
×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12Ｍ又は約１×１０-13Ｍの解離定数（ＫD）にて、ヒト
ＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、約２×１０
-10～約１×１０-8ＭのＫDにて、ヒトＥＧＦＲに結合する。ＥＧＦＲのＦＮ３ドメインの
親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定され得る。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓ
ｋｙ，ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ
Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖ
ｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書に記載の方法を参照）。特定のＦＮ３ドメイン－抗
原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、浸透圧モル濃度、ｐＨ）下で測
定される場合に異なる場合がある。したがって、親和性及びその他抗原－結合パラメータ
（例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは、タンパク質スカフォールド及び抗
原の標準化溶液、及び本明細書で記載される緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる
。
【0060】
ＥＧＦＲに結合する本発明のＦＮ３ドメインの例としては、配列番号１８～２９、１０
７～１１０，又は１２２～１３７のＦＮ３ドメインが挙げられる。
７～１１０，又は１２２～１３７のＦＮ３ドメインが挙げられる。
【0061】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメイ
ンは、少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む
。
ンは、少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む
。
【0062】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメイ
ンは、
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（
配列番号１８０）を含むＦＧループを含み、Ｘ9は、Ｍ又はＩであり；
ＢＣループは、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）を含み、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである。
ンは、
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（
配列番号１８０）を含むＦＧループを含み、Ｘ9は、Ｍ又はＩであり；
ＢＣループは、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）を含み、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである。
【0063】
ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する本明細書に記載の本発
明のＦＮ３ドメインは、構造的特徴として、ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７
９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含み、ここで、Ｘ9はＭ又
はＩである、ＦＧループを含み得る。こうしたＦＮ３ドメインは、長さ８又は９個のアミ
ノ酸からなり、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）によって定義される、
ＢＣループを更に含み得る。また、前記ＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦ
を用いて、Ａ４３１細胞中で測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満又は約１．８×１０
-8Ｍ～約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する。
明のＦＮ３ドメインは、構造的特徴として、ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７
９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含み、ここで、Ｘ9はＭ又
はＩである、ＦＧループを含み得る。こうしたＦＮ３ドメインは、長さ８又は９個のアミ
ノ酸からなり、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）によって定義される、
ＢＣループを更に含み得る。また、前記ＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦ
を用いて、Ａ４３１細胞中で測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満又は約１．８×１０
-8Ｍ～約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する。
【0064】
本明細書に記載される、ＥＧＦＲに特異的に結合し、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害す
る、本発明のＦＮ３ドメインは、
配列ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬ
ＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹ
ＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）、又は配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱ
ＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）を更に含み、
ここで、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
る、本発明のＦＮ３ドメインは、
配列ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬ
ＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹ
ＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）、又は配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱ
ＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）を更に含み、
ここで、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
【0065】
本明細書に記載のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、作製し、周知の方法及び本明細書に
記載の方法を用いて、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する能力の試験を行うことができる
。
記載の方法を用いて、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する能力の試験を行うことができる
。
【0066】
本発明は、また、ＥＧＦＲに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインを提供し、ここで該
ＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～１３７又は１９４～
２１１に示す配列を含む。
ＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～１３７又は１９４～
２１１に示す配列を含む。
【0067】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、例えば、
半減期延長分子の発現及び／又は共役を促進させるために、Ｎ末端に連結される開始剤メ
チオニン（Ｍｅｔ）又は特定のＦＮ３ドメインのＣ末端に連結されるシステイン（Ｃｙｓ
）を含む。
半減期延長分子の発現及び／又は共役を促進させるために、Ｎ末端に連結される開始剤メ
チオニン（Ｍｅｔ）又は特定のＦＮ３ドメインのＣ末端に連結されるシステイン（Ｃｙｓ
）を含む。
【0068】
本発明は、また、ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合をブロッキン
グする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメイン
は、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離されている
。
グする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメイン
は、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離されている
。
【0069】
本発明は、また、ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合をブロッキン
グする単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメインは
、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及び
Ｇ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦＲに結合する。
グする単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメインは
、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及び
Ｇ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦＲに結合する。
【0070】
ＦＮ３ドメインのＥＧＦＲへの結合に寄与するアミノ酸残基は、突然変異誘発などの方
法を用いて、及び結晶構造によって結合残基／表面を評価することによって、同定するこ
とができる。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインＰ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残
基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７、Ｇ８５での置換は、ＦＮ３ドメインへのＥＧＦＲの
結合を１００倍超減少させる。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインＰ５４ＡＲ４－４８、Ｐ５４
ＡＲ４－８１、Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２２及びＰ５４ＡＲ４
－８３ｖ２３は、これらの残基を共有し、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２と同じパラトープ残基
によりＥＧＦＲと結合すると予想できる。その他のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、ＢＣ
ループ及びＦＧループの他の位置（２４、２５、７５、７６、７８、７９、８０、８１、
８２、８３、８４及び８６位）にあるアミノ酸を変更する一方で、Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２
８、Ｖ７７、Ｇ８５位を変更せず保持することによって作製できる。これらの変更は、特
定の位置で、特定のアミノ酸を設計することによって、又はこれらの位置を、ランダムな
アミノ酸によりこれらの部位を置換するライブラリに取り込むことによって、行うことが
できる。このような方法で設計された新規ＦＮ３ドメインを使用して、ＥＧＦＲ結合性、
溶解度、安定性、免疫原性又は血清半減期などの最適化された特性をスクリーニング又は
選択することができる。
法を用いて、及び結晶構造によって結合残基／表面を評価することによって、同定するこ
とができる。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインＰ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残
基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７、Ｇ８５での置換は、ＦＮ３ドメインへのＥＧＦＲの
結合を１００倍超減少させる。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインＰ５４ＡＲ４－４８、Ｐ５４
ＡＲ４－８１、Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２２及びＰ５４ＡＲ４
－８３ｖ２３は、これらの残基を共有し、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２と同じパラトープ残基
によりＥＧＦＲと結合すると予想できる。その他のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、ＢＣ
ループ及びＦＧループの他の位置（２４、２５、７５、７６、７８、７９、８０、８１、
８２、８３、８４及び８６位）にあるアミノ酸を変更する一方で、Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２
８、Ｖ７７、Ｇ８５位を変更せず保持することによって作製できる。これらの変更は、特
定の位置で、特定のアミノ酸を設計することによって、又はこれらの位置を、ランダムな
アミノ酸によりこれらの部位を置換するライブラリに取り込むことによって、行うことが
できる。このような方法で設計された新規ＦＮ３ドメインを使用して、ＥＧＦＲ結合性、
溶解度、安定性、免疫原性又は血清半減期などの最適化された特性をスクリーニング又は
選択することができる。
【0071】
単一特異性ｃ－Ｍｅｔ結合分子
本発明は、また、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖
因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングし、これにより、治療用途及び診断
用途において幅広く使用することができる、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイ
ンを提供する。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードしているポリヌクレオチド、
又はその相補的な核酸、ベクター、宿主細胞及びそれらを作製する方法、及び使用する方
法を提供する。
本発明は、また、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖
因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングし、これにより、治療用途及び診断
用途において幅広く使用することができる、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイ
ンを提供する。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードしているポリヌクレオチド、
又はその相補的な核酸、ベクター、宿主細胞及びそれらを作製する方法、及び使用する方
法を提供する。
【0072】
本明細書に記載される本発明のＦＮ３ドメインは、ｃ－Ｍｅｔと高い親和性で結合し、
ｃ－Ｍｅｔのシグナル伝達を阻害し、低分子ｃ－Ｍｅｔ阻害物質と比較したときの特異性
及び標的外の毒性の低減の点において、並びに従来の抗体治療と比較したときの組織侵入
の改善の点おいて、利益をもたらし得る。本発明のＦＮ３ドメインは一価であり、このた
め、他の二価の分子により発生することがある不要な受容体のクラスター形成及び活性化
を妨げる。
ｃ－Ｍｅｔのシグナル伝達を阻害し、低分子ｃ－Ｍｅｔ阻害物質と比較したときの特異性
及び標的外の毒性の低減の点において、並びに従来の抗体治療と比較したときの組織侵入
の改善の点おいて、利益をもたらし得る。本発明のＦＮ３ドメインは一価であり、このた
め、他の二価の分子により発生することがある不要な受容体のクラスター形成及び活性化
を妨げる。
【0073】
本発明は、また、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖
因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ
型（ＦＮ３）ドメインを提供する。
因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ
型（ＦＮ３）ドメインを提供する。
【0074】
本明細書に記載の本発明のＦＮ３ドメインは、本発明のＦＮ３ドメインの存在下で、ビ
オチン化ＨＧＦとｃ－Ｍｅｔ融合タンパク質の結合の阻害を検出するアッセイにおいて、
約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満
、約１×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔに対するＨ
ＧＦの結合をブロッキングし得る。例示的なＦＮ３ドメインは、約２×１０-10Ｍ～約６
×１０-8ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔと結合するＨＧＦをブロッキングし得る。本発明
のＦＮ３ドメインは、本発明のＦＮ３ドメインの不在下で、同じアッセイ条件を用いたＨ
ＧＦとｃ－Ｍｅｔとの結合と比較したとき、ｃ－Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を、少なく
とも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５
％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％又は１００％、ブロッキングし得る。
オチン化ＨＧＦとｃ－Ｍｅｔ融合タンパク質の結合の阻害を検出するアッセイにおいて、
約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０-10Ｍ未満
、約１×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔに対するＨ
ＧＦの結合をブロッキングし得る。例示的なＦＮ３ドメインは、約２×１０-10Ｍ～約６
×１０-8ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔと結合するＨＧＦをブロッキングし得る。本発明
のＦＮ３ドメインは、本発明のＦＮ３ドメインの不在下で、同じアッセイ条件を用いたＨ
ＧＦとｃ－Ｍｅｔとの結合と比較したとき、ｃ－Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を、少なく
とも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５
％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％又は１００％、ブロッキングし得る。
【0075】
本明細書に記載の本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を使用して、本発明の
ＦＮ３ドメインの不在下でのシグナル伝達レベルと比較して、少なくとも３０％、３５％
、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
又は１００％、ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達を阻害し得る。
ＦＮ３ドメインの不在下でのシグナル伝達レベルと比較して、少なくとも３０％、３５％
、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
又は１００％、ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達を阻害し得る。
【0076】
ＨＧＦのｃ－Ｍｅｔへの結合は、受容体二量体化、自己リン酸化、受容体内部の活性化
、細胞質チロシンキナーゼドメイン、並びにＤＮＡ合成の調節（遺伝子活性化）及び細胞
周期の進行又は分裂に関連する複数のシグナル伝達及び転写促進経路の開始を刺激する。
ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達の阻害により、１つ以上のｃ－Ｍｅｔ下流のシグナル伝達経路を
阻害することもあり、また、このために、ｃ－Ｍｅｔの中和が、細胞増殖及び分化、脈管
形成、細胞運動性並びに転移の阻害など、種々の影響を有することもある。
、細胞質チロシンキナーゼドメイン、並びにＤＮＡ合成の調節（遺伝子活性化）及び細胞
周期の進行又は分裂に関連する複数のシグナル伝達及び転写促進経路の開始を刺激する。
ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達の阻害により、１つ以上のｃ－Ｍｅｔ下流のシグナル伝達経路を
阻害することもあり、また、このために、ｃ－Ｍｅｔの中和が、細胞増殖及び分化、脈管
形成、細胞運動性並びに転移の阻害など、種々の影響を有することもある。
【0077】
ｃ－Ｍｅｔシグナル伝達は、種々の周知の方法、例えば、少なくとも１つのチロシン残
基、Ｙ１２３０、Ｙ１２３４、Ｙ１２３５又はＹ１３４９上の受容体の自己リン酸化及び
／又は天然基材又は合成基材のリン酸化を測定すること、を用いて測定することもできる
。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ法において、又はウェスタンブロット法にお
いてリン酸化に対して特異的な抗体を用いて、検出することができる。チロシンキナーゼ
活性のアッセイ（Ｐａｎｅｋら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３
：１４３３～４４，１９９７；Ｂａｔｌｅｙら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：１４３～５０
，１９９８）及び本明細書に記載のアッセイ。
基、Ｙ１２３０、Ｙ１２３４、Ｙ１２３５又はＹ１３４９上の受容体の自己リン酸化及び
／又は天然基材又は合成基材のリン酸化を測定すること、を用いて測定することもできる
。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ法において、又はウェスタンブロット法にお
いてリン酸化に対して特異的な抗体を用いて、検出することができる。チロシンキナーゼ
活性のアッセイ（Ｐａｎｅｋら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａ ２８３
：１４３３～４４，１９９７；Ｂａｔｌｅｙら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６２：１４３～５０
，１９９８）及び本明細書に記載のアッセイ。
【0078】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／
ｍＬの組換えヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞中で測定したとき、約１×１０
-6Ｍ未満、約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０
-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ
残基位置１３４９でのＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔのリン酸化を阻害する。
ｍＬの組換えヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞中で測定したとき、約１×１０
-6Ｍ未満、約１×１０-7Ｍ未満、約１×１０-8Ｍ未満、約１×１０-9Ｍ未満、約１×１０
-10Ｍ未満、約１×１０-11Ｍ未満又は約１×１０-12Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ
残基位置１３４９でのＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔのリン酸化を阻害する。
【0079】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／
ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞中で測定したとき、４×１０
-9Ｍ～約１×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ－ＭｅｔチロシンＹ１３４９でのＨＧＦ誘発性
のｃ－Ｍｅｔのリン酸化を阻害する。
ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞中で測定したとき、４×１０
-9Ｍ～約１×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ－ＭｅｔチロシンＹ１３４９でのＨＧＦ誘発性
のｃ－Ｍｅｔのリン酸化を阻害する。
【0080】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、当業者によって行われているような、表面
プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって測定されたとき、本発明のＦＮ３ドメインは
、約１×１０-7Ｍ以下、１×１０-8Ｍ、１×１０-9Ｍ、１×１０-10Ｍ，１×１０-11Ｍ、
１×１０-12Ｍ、１×１０-13Ｍ、１×１０-14Ｍ又は１×１０-15Ｍの解離定数（ＫD）に
て、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、
約３×１０-10Ｍ～約５×１０-8ＭのＫDにて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合する。ｃ－Ｍｅｔの
ＦＮ３ドメイン親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定され得る。（例えば、
Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ
ｎｓ，」Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，
Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊ
ａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書に記載の方法を参照）。特定のＦＮ
３ドメイン－抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、浸透圧モル濃度
、ｐＨ）下で測定される場合に異なる場合がある。したがって、親和性及びその他抗原－
結合パラメータ（例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは、タンパク質スカフ
ォールド及び抗原の標準化溶液、及び本明細書で記載される緩衝液などの標準化緩衝液を
用いて行われる。
プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって測定されたとき、本発明のＦＮ３ドメインは
、約１×１０-7Ｍ以下、１×１０-8Ｍ、１×１０-9Ｍ、１×１０-10Ｍ，１×１０-11Ｍ、
１×１０-12Ｍ、１×１０-13Ｍ、１×１０-14Ｍ又は１×１０-15Ｍの解離定数（ＫD）に
て、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合する。いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、
約３×１０-10Ｍ～約５×１０-8ＭのＫDにて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合する。ｃ－Ｍｅｔの
ＦＮ３ドメイン親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定され得る。（例えば、
Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ら、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ
ｎｓ，」Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，
Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊ
ａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書に記載の方法を参照）。特定のＦＮ
３ドメイン－抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件（例えば、浸透圧モル濃度
、ｐＨ）下で測定される場合に異なる場合がある。したがって、親和性及びその他抗原－
結合パラメータ（例えば、ＫD、Ｋon、Ｋoff）の測定は、好ましくは、タンパク質スカフ
ォールド及び抗原の標準化溶液、及び本明細書で記載される緩衝液などの標準化緩衝液を
用いて行われる。
【0081】
ｃ－Ｍｅｔに結合する本発明のＦＮ３ドメインの例としては、配列番号３２－４９、１
１１～１１４又は２１２～２２３のアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインが挙げられる。
１１～１１４又は２１２～２２３のアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインが挙げられる。
【0082】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメ
インは、少なくとも８３％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含
む。
インは、少なくとも８３％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含
む。
【0083】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメ
インは、
Ｃストランド及びＣＤループであって、配列、ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ
15ＧＸ16（配列番号１８４）を含み、ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤである、Ｃストランド及びＣＤループと；
Ｆストランド及びＦＧループであって、配列ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21
Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５）を含み、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである、Ｆストランド及びＦＧループと、を含
む。
インは、
Ｃストランド及びＣＤループであって、配列、ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ
15ＧＸ16（配列番号１８４）を含み、ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤである、Ｃストランド及びＣＤループと；
Ｆストランド及びＦＧループであって、配列ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21
Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５）を含み、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである、Ｆストランド及びＦＧループと、を含
む。
【0084】
本明細書に記載する、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合し、ｃ－Ｍｅｔの自己リン酸化を阻害
する、本発明のＦＮ３ドメインは、配列ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴ
ＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16 ＡＩＶＬＴＶＰＧＳ
ＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡ
ＥＦＴＴ（配列番号１８６）、を更に含み、
ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである。
する、本発明のＦＮ３ドメインは、配列ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴ
ＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16 ＡＩＶＬＴＶＰＧＳ
ＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡ
ＥＦＴＴ（配列番号１８６）、を更に含み、
ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである。
【0085】
本発明は、また、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインを提供し、ここで
該ＦＮ３ドメインは、配列番号３２～４９又は１１１～１１４に示す配列を含む。
該ＦＮ３ドメインは、配列番号３２～４９又は１１１～１１４に示す配列を含む。
【0086】
本発明は、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合し、ＨＧＦとｃ－Ｍｅｔとのの結合をブロッキン
グする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメイン
は、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離されている
。
グする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメイン
は、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離されている
。
【0087】
本発明は、また、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合し、ＨＧＦとｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッ
キングする単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメイ
ンは、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及び
Ｉ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍｅｔに結合する。
キングする単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供し、該ＦＮ３ドメイ
ンは、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及び
Ｉ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍｅｔに結合する。
【0088】
ＦＮ３ドメインのｃ－Ｍｅｔへの結合に寄与するアミノ酸残基は、突然変異誘発などの
方法を用いて、及び結晶構造によって結合残基／表面を評価することによって、同定する
ことができる。ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＰ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号２
７）の残基Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓでの置換により、ＦＮ３ドメイン
へのｃ－Ｍｅｔの結合が１００倍超減少した。ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン分子Ｐ１１
４ＡＲ７Ｐ９２－Ｆ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｄ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｆ１０及
びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｈ８は、これらの残基を共有し、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３
と同じパラトープ残基によりｃ－Ｍｅｔと結合すると予想できる。その他のｃ－Ｍｅｔ結
合ＦＮ３ドメインは、Ｃストランド、Ｆストランド、ＣＤループ及び／又はＦＧループの
他の位置（３２、３６、３９、４０、６８、７０、７８及び８１位）にあるアミノ酸を変
更する一方で、Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓ位を変更せず保持することに
よって作製できる。これらの変更は、特定の位置で、特定のアミノ酸を設計することによ
って、又はこれらの位置を、ランダムなアミノ酸によりこれらの部位を置換するライブラ
リに取り込むことによって、行うことができる。このような方法で設計された新規ＦＮ３
ドメインを使用して、ｃ－Ｍｅｔ結合性、溶解度、安定性、免疫原性又は血清半減期など
の最適化された特性をスクリーニング又は選択することができる。
方法を用いて、及び結晶構造によって結合残基／表面を評価することによって、同定する
ことができる。ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＰ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号２
７）の残基Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓでの置換により、ＦＮ３ドメイン
へのｃ－Ｍｅｔの結合が１００倍超減少した。ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン分子Ｐ１１
４ＡＲ７Ｐ９２－Ｆ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｄ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｆ１０及
びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｈ８は、これらの残基を共有し、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３
と同じパラトープ残基によりｃ－Ｍｅｔと結合すると予想できる。その他のｃ－Ｍｅｔ結
合ＦＮ３ドメインは、Ｃストランド、Ｆストランド、ＣＤループ及び／又はＦＧループの
他の位置（３２、３６、３９、４０、６８、７０、７８及び８１位）にあるアミノ酸を変
更する一方で、Ｒ３４Ｓ、Ｆ３８Ｓ、Ｍ７２Ｓ及びＩ７９Ｓ位を変更せず保持することに
よって作製できる。これらの変更は、特定の位置で、特定のアミノ酸を設計することによ
って、又はこれらの位置を、ランダムなアミノ酸によりこれらの部位を置換するライブラ
リに取り込むことによって、行うことができる。このような方法で設計された新規ＦＮ３
ドメインを使用して、ｃ－Ｍｅｔ結合性、溶解度、安定性、免疫原性又は血清半減期など
の最適化された特性をスクリーニング又は選択することができる。
【0089】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づくライブラリからのＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン
の単離
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシン－Ｃの、１５のＦＮ３ドメインの共通
配列から設計された非天然のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａ
ｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌ
ｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７～１１７，２０１２；米国特許公開第２０１０／０２１６７
０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインに特有であるが、７つのβストラ
ンドを接続する６つの表面露出ループを示す。このβストランドは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ
、Ｆ及びＧとし、ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ及びＦＧループと呼ばれる（
Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ ８９：８９９０～８９９２，１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。これら
のループ、又は各ループ内の選択された残基は、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔと結合する新規
分子の選択に使用できるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構
築するために、ランダム化できる。表１には、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の各ループ及
びβストランドの位置及び配列を示す。
の単離
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシン－Ｃの、１５のＦＮ３ドメインの共通
配列から設計された非天然のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａ
ｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌ
ｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７～１１７，２０１２；米国特許公開第２０１０／０２１６７
０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインに特有であるが、７つのβストラ
ンドを接続する６つの表面露出ループを示す。このβストランドは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ
、Ｆ及びＧとし、ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ及びＦＧループと呼ばれる（
Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ ８９：８９９０～８９９２，１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。これら
のループ、又は各ループ内の選択された残基は、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔと結合する新規
分子の選択に使用できるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構
築するために、ランダム化できる。表１には、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の各ループ及
びβストランドの位置及び配列を示す。
【0090】
したがって、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリは、以下に示すように
、ライブラリＴＣＬ１又はＴＣＬ２など、ランダム化ＦＧループ又はランダム化ＢＣルー
プ及びＦＧループを有し得る。Ｔｅｎｃｏｎ ＢＣループは、７個の長いアミノ酸であり
、したがって、１、２、３、４、５、６又は７個のアミノ酸は、ＢＣループで多様化され
、かつ、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリ内でランダム化されてもよい
。Ｔｅｎｃｏｎ ＦＧループは、７個の長いアミノ酸であり、したがって、１、２、３、
４、５、６又は７個のアミノ酸は、ＦＧループで多様化され、かつ、Ｔｅｎｃｏｎ配列に
基づいて設計されたライブラリ内でランダム化されてもよい。Ｔｅｎｃｏｎライブラリ内
のループでの更なる多様性は、ループでの残基の挿入及び／又は欠失によって得ることが
できる。例えば、ＦＧ及び／又はＢＣループは、アミノ酸１～２２個分だけ延長されるか
、又はアミノ酸１～３個分だけ減少させることができる。Ｔｅｎｃｏｎ内のＦＧループは
、７個のアミノ酸の長さであり、抗体の重鎖内の対応するループは、４～２８個の残基の
範囲である。最大の多様性を提供するため、ＦＧループは、配列及び長さを多様化させて
、４～２８の残基の範囲の抗体ＣＤＲ３の長さに対応させることができる。例えば、ＦＧ
ループは、更に１、２、３、４又は５個のアミノ酸でループを延長することによって、長
さを更に多様化することができる。
、ライブラリＴＣＬ１又はＴＣＬ２など、ランダム化ＦＧループ又はランダム化ＢＣルー
プ及びＦＧループを有し得る。Ｔｅｎｃｏｎ ＢＣループは、７個の長いアミノ酸であり
、したがって、１、２、３、４、５、６又は７個のアミノ酸は、ＢＣループで多様化され
、かつ、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリ内でランダム化されてもよい
。Ｔｅｎｃｏｎ ＦＧループは、７個の長いアミノ酸であり、したがって、１、２、３、
４、５、６又は７個のアミノ酸は、ＦＧループで多様化され、かつ、Ｔｅｎｃｏｎ配列に
基づいて設計されたライブラリ内でランダム化されてもよい。Ｔｅｎｃｏｎライブラリ内
のループでの更なる多様性は、ループでの残基の挿入及び／又は欠失によって得ることが
できる。例えば、ＦＧ及び／又はＢＣループは、アミノ酸１～２２個分だけ延長されるか
、又はアミノ酸１～３個分だけ減少させることができる。Ｔｅｎｃｏｎ内のＦＧループは
、７個のアミノ酸の長さであり、抗体の重鎖内の対応するループは、４～２８個の残基の
範囲である。最大の多様性を提供するため、ＦＧループは、配列及び長さを多様化させて
、４～２８の残基の範囲の抗体ＣＤＲ３の長さに対応させることができる。例えば、ＦＧ
ループは、更に１、２、３、４又は５個のアミノ酸でループを延長することによって、長
さを更に多様化することができる。
【0091】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリは、また、ＦＮ３ドメインの側面に
形成されるランダム化された代替表面を有し、かつ、２つ又はそれ以上のβストランド及
び少なくとも１つのループを含み得る。このような１つの代替表面は、Ｃ及びＦβストラ
ンド並びにＣＤループ及びＦＧループ（Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面）内でアミノ酸によって
形成される。Ｔｅｎｃｏｎの代替Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面に基づくライブラリ設計は、図
１に示されており、かつ、こうしたライブラリの詳細な作製は、米国特許公開第２０１３
／０２２６８３４号に記述されている。また、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたラ
イブラリとしては、１１、１４、１７、３７、４６、７３又は８６の残基位置に置換を有
し（配列番号１に対応してナンバリングした残基）、かつ、変異体が熱安定性の改善性を
示すＴｅｎｃｏｎ変異体などの、Ｔｅｎｃｏｎ変異体に基づいて設計されたライブラリが
挙げられる。例示的なＴｅｎｃｏｎ変異体は、米国特許第２０１１／０２７４６２３号に
記述されており、Ｔｅｎｃｏｎ配列番号１と比較して、Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及
びＥ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号９９）が挙げられる。
形成されるランダム化された代替表面を有し、かつ、２つ又はそれ以上のβストランド及
び少なくとも１つのループを含み得る。このような１つの代替表面は、Ｃ及びＦβストラ
ンド並びにＣＤループ及びＦＧループ（Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面）内でアミノ酸によって
形成される。Ｔｅｎｃｏｎの代替Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面に基づくライブラリ設計は、図
１に示されており、かつ、こうしたライブラリの詳細な作製は、米国特許公開第２０１３
／０２２６８３４号に記述されている。また、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたラ
イブラリとしては、１１、１４、１７、３７、４６、７３又は８６の残基位置に置換を有
し（配列番号１に対応してナンバリングした残基）、かつ、変異体が熱安定性の改善性を
示すＴｅｎｃｏｎ変異体などの、Ｔｅｎｃｏｎ変異体に基づいて設計されたライブラリが
挙げられる。例示的なＴｅｎｃｏｎ変異体は、米国特許第２０１１／０２７４６２３号に
記述されており、Ｔｅｎｃｏｎ配列番号１と比較して、Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及
びＥ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号９９）が挙げられる。
【0092】
【表1】
【0093】
Ｔｅｎｃｏｎ及び他のＦＮ３配列ベースのライブラリは、ランダムな又は定義されたア
ミノ酸セットを用いて、選択した残基位置にてランダム化することができる。例えば、ラ
ンダム置換を有するライブラリ中の変異体は、２０の天然のアミノ酸全てをコードするＮ
ＮＫコドンを用いて生成できる。他の多様化スキームにおいて、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ
、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ
、及びＣｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンが使用できる。あるいは、２０全てのア
ミノ酸残基を生じさせ、同時に停止コドンの頻度を低減するために、ＮＮＳコドンが使用
できる。多様化される位置に偏ったアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは
、例えば、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）法（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎ
ｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成できる。この手法は、何千もの遺伝子合成プロセスに十分な普
遍的な構築ブロックとして機能する、あらかじめ作られた二本鎖トリプレットのライブラ
リを使用する。このトリプレットのライブラリは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を構築する
のに必要な、全ての考えられる配列組合せを示す。コドン指定は、よく知られているＩＵ
Ｂコードによる。
ミノ酸セットを用いて、選択した残基位置にてランダム化することができる。例えば、ラ
ンダム置換を有するライブラリ中の変異体は、２０の天然のアミノ酸全てをコードするＮ
ＮＫコドンを用いて生成できる。他の多様化スキームにおいて、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ
、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ
、及びＣｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンが使用できる。あるいは、２０全てのア
ミノ酸残基を生じさせ、同時に停止コドンの頻度を低減するために、ＮＮＳコドンが使用
できる。多様化される位置に偏ったアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは
、例えば、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）法（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎ
ｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成できる。この手法は、何千もの遺伝子合成プロセスに十分な普
遍的な構築ブロックとして機能する、あらかじめ作られた二本鎖トリプレットのライブラ
リを使用する。このトリプレットのライブラリは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を構築する
のに必要な、全ての考えられる配列組合せを示す。コドン指定は、よく知られているＩＵ
Ｂコードによる。
【0094】
本明細書に記載の、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する本発明のＦＮ３ドメイ
ンは、ｃｉｓディスプレイを用いて、スカフォールドタンパク質をコードするＤＮＡフラ
グメントを、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡフラグメントにライゲートし、インビトロ翻訳
後に形成されたタンパク質ＤＮＡ錯体のプールを作製して（ここで、各タンパク質は、安
定的にそれをコードするＤＮＡと結びついている（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏ
ｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１，２８０６～
２８１０，２００４））、ＴｅｎｃｏｎライブラリなどのＦＮ３ライブラリを作製し、Ｅ
ＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔに特異的に結合するためのライブラリを、当該技術分野で周
知の、または、実施例に記載の任意の方法で分析することにより、単離することができる
。使用できる例示的な周知の方法としては、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、並び
に競合アッセイ及び非競合アッセイが挙げられる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ，
１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋを参照されたい）。ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する同定されたＦＮ３ドメ
インについては、本明細書に記載の方法を用いて、ＥＧＦＲに結合するＥＧＦ又はｃ－Ｍ
ｅｔに対するＨＧＦの結合などのＥＧＦＲリガンドをブロッキングする能力、及びＥＧＦ
Ｒ及び／又はｃ－Ｍｅｔシグナル伝達を阻害する能力の特性を更に決定する。
ンは、ｃｉｓディスプレイを用いて、スカフォールドタンパク質をコードするＤＮＡフラ
グメントを、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡフラグメントにライゲートし、インビトロ翻訳
後に形成されたタンパク質ＤＮＡ錯体のプールを作製して（ここで、各タンパク質は、安
定的にそれをコードするＤＮＡと結びついている（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏ
ｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１，２８０６～
２８１０，２００４））、ＴｅｎｃｏｎライブラリなどのＦＮ３ライブラリを作製し、Ｅ
ＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔに特異的に結合するためのライブラリを、当該技術分野で周
知の、または、実施例に記載の任意の方法で分析することにより、単離することができる
。使用できる例示的な周知の方法としては、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、並び
に競合アッセイ及び非競合アッセイが挙げられる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ，
１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋを参照されたい）。ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する同定されたＦＮ３ドメ
インについては、本明細書に記載の方法を用いて、ＥＧＦＲに結合するＥＧＦ又はｃ－Ｍ
ｅｔに対するＨＧＦの結合などのＥＧＦＲリガンドをブロッキングする能力、及びＥＧＦ
Ｒ及び／又はｃ－Ｍｅｔシグナル伝達を阻害する能力の特性を更に決定する。
【0095】
本明細書に記載のように、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する本発明のＦＮ３
ドメインは、ライブラリを作製するためのテンプレートとして、任意のＦＮ３ドメインを
用いて、また、本明細書に記載の方法を用いて、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに特異的に結合
する分子のライブラリをスクリーニングして、作製することができる。使用できる例示的
なＦＮ３ドメインは、テネイシンＣ（配列番号７５）の第３のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）
、フィブコン（Fibcon）（配列番号７６）及びフィブロネクチン（配列番号７７）の第１
０のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）である。インビトロでライブラリを発現又は翻訳させる
ために、ライブラリをベクターにクローニングするか、又はライブラリの二本鎖ｃＤＮＡ
カセットを合成するために、標準的なクローニング及び発現法が使用される。例えば、リ
ボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４，４９３７～４９４２，１９９７）、ｍＲＮＡディス
プレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ，９４，１２２９７～１２３０２，１９９７）、又は他の無細胞系（米国特
許第５，６４３，７６８号）などが使用され得る。ＦＮ３ドメイン変異型のライブラリは
、例えば、任意の好適なバクテリオファージの表面上に提示される融合タンパク質として
発現され得る。バクテリオファージの表面上に融合ポリペプチドを提示する方法は、よく
知られている（米国特許公開第２０１１／０１１８１４４号；国際特許公開第２００９／
０８５４６２号；米国特許第６，９６９，１０８号；米国特許第６，１７２，１９７号；
米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第６，５８２，９１５号；米国特許第６，４
７２，１４７号）。
ドメインは、ライブラリを作製するためのテンプレートとして、任意のＦＮ３ドメインを
用いて、また、本明細書に記載の方法を用いて、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに特異的に結合
する分子のライブラリをスクリーニングして、作製することができる。使用できる例示的
なＦＮ３ドメインは、テネイシンＣ（配列番号７５）の第３のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）
、フィブコン（Fibcon）（配列番号７６）及びフィブロネクチン（配列番号７７）の第１
０のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）である。インビトロでライブラリを発現又は翻訳させる
ために、ライブラリをベクターにクローニングするか、又はライブラリの二本鎖ｃＤＮＡ
カセットを合成するために、標準的なクローニング及び発現法が使用される。例えば、リ
ボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４，４９３７～４９４２，１９９７）、ｍＲＮＡディス
プレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ，９４，１２２９７～１２３０２，１９９７）、又は他の無細胞系（米国特
許第５，６４３，７６８号）などが使用され得る。ＦＮ３ドメイン変異型のライブラリは
、例えば、任意の好適なバクテリオファージの表面上に提示される融合タンパク質として
発現され得る。バクテリオファージの表面上に融合ポリペプチドを提示する方法は、よく
知られている（米国特許公開第２０１１／０１１８１４４号；国際特許公開第２００９／
０８５４６２号；米国特許第６，９６９，１０８号；米国特許第６，１７２，１９７号；
米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第６，５８２，９１５号；米国特許第６，４
７２，１４７号）。
【0096】
本明細書に記載の、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する本発明のＦＮ３ドメイ
ンは、変化させて、熱安定性及び熱的フォールティング並びにアンフォールディングの可
逆性の改善などの特性を向上させることができる。タンパク質及び酵素の見かけの熱安定
性を高めるため、極めて類似性の高い熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスル
フィド架橋の安定化設計、α－ヘリックス傾向を増加させる変異、塩橋の改変、タンパク
質の表面電荷の変化、定方向進化、及び共通配列の組成物を含む、いくつかの方法が適用
されている（Ｌｅｈｍａｎｎ及びＷｙｓｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
，１２，３７１～３７５，２００１）。高い熱安定性は、発現したタンパク質の収率を増
加させ、溶解度又は活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコールドチェーン
の必要性を最小化することができる。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の熱安定性を向上させ
るために、置換することができる残基は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３
、又は８６であり、米国特許公開第２０１１／０２７４６２３号に記述されている。これ
らの残基に対応する置換は、本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有
分子に組み込むことができる。
ンは、変化させて、熱安定性及び熱的フォールティング並びにアンフォールディングの可
逆性の改善などの特性を向上させることができる。タンパク質及び酵素の見かけの熱安定
性を高めるため、極めて類似性の高い熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスル
フィド架橋の安定化設計、α－ヘリックス傾向を増加させる変異、塩橋の改変、タンパク
質の表面電荷の変化、定方向進化、及び共通配列の組成物を含む、いくつかの方法が適用
されている（Ｌｅｈｍａｎｎ及びＷｙｓｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
，１２，３７１～３７５，２００１）。高い熱安定性は、発現したタンパク質の収率を増
加させ、溶解度又は活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコールドチェーン
の必要性を最小化することができる。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の熱安定性を向上させ
るために、置換することができる残基は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３
、又は８６であり、米国特許公開第２０１１／０２７４６２３号に記述されている。これ
らの残基に対応する置換は、本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有
分子に組み込むことができる。
【0097】
本発明は、また、ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合をブロッキン
グし、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～１３７に示す配列を含み、更に、
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応す
る１つ以上の残基位置での置換を含む単離ＦＮ３ドメインを提供する。
グし、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～１３７に示す配列を含み、更に、
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応す
る１つ以上の残基位置での置換を含む単離ＦＮ３ドメインを提供する。
【0098】
本発明は、また、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合し、ＨＧＦとｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッ
キングし、配列番号３２～４９又は１１１～１１４に示す配列を含み、更に、Ｔｅｎｃｏ
ｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上
の残基位置での置換を含む単離ＦＮ３ドメインを提供する。
キングし、配列番号３２～４９又は１１１～１１４に示す配列を含み、更に、Ｔｅｎｃｏ
ｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上
の残基位置での置換を含む単離ＦＮ３ドメインを提供する。
【0099】
例示的な置換は、置換Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｌ１７Ａ、Ｅ３７Ｐ、Ｎ４６Ｖ、Ｇ７３Ｙ
及びＥ８６Ｉ（ナンバリングは、配列番号１に従う）である。
及びＥ８６Ｉ（ナンバリングは、配列番号１に従う）である。
【0100】
いくつかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の
置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する置換を含む。
置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する置換を含む。
【0101】
本明細書に記載のとおり、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメイン（図１）は、Ｔ
ｅｎｃｏｎ（配列番号１）と比較して、延長されたＦＧループを有する。したがって、Ｔ
ｅｎｃｏｎ（配列番号１）の残基１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６に対応す
る残基は、図１Ａ及び１Ｂに示される、配列番号２４のＦＮ３ドメインを除くＥＧＦＲ
ＦＮ３ドメインの、残基１１、１４、１７、３７、４６、７３及び９１であり、ここで、
対応する残基は、ＢＣループでの１つのアミノ酸の挿入により、残基１１、１４、１７、
３８、７４及び９２となる。
ｅｎｃｏｎ（配列番号１）と比較して、延長されたＦＧループを有する。したがって、Ｔ
ｅｎｃｏｎ（配列番号１）の残基１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６に対応す
る残基は、図１Ａ及び１Ｂに示される、配列番号２４のＦＮ３ドメインを除くＥＧＦＲ
ＦＮ３ドメインの、残基１１、１４、１７、３７、４６、７３及び９１であり、ここで、
対応する残基は、ＢＣループでの１つのアミノ酸の挿入により、残基１１、１４、１７、
３８、７４及び９２となる。
【0102】
本発明は、また、ＥＧＦＲと特異的に結合し、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合をブロッキン
グし、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～１３７又は１９４～２１１で示す
アミノ酸配列を含み、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの
置換に対応する、１つ、２つ又は３つの置換を任意選択的に有する、単離ＦＮ３ドメイン
を提供する。
グし、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～１３７又は１９４～２１１で示す
アミノ酸配列を含み、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの
置換に対応する、１つ、２つ又は３つの置換を任意選択的に有する、単離ＦＮ３ドメイン
を提供する。
【0103】
本発明は、また、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合し、ＨＧＦとｃ－Ｍｅとの結合をブロッキ
ングし、配列番号３２～４９、１１１～１１４又は２１２～２２３で示すアミノ酸配列を
含み、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの置換に対応する
、１つ、２つ又は３つの置換を任意選択的に有する、単離ＦＮ３ドメインを提供する。
ングし、配列番号３２～４９、１１１～１１４又は２１２～２２３で示すアミノ酸配列を
含み、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの置換に対応する
、１つ、２つ又は３つの置換を任意選択的に有する、単離ＦＮ３ドメインを提供する。
【0104】
タンパク質安定性及びタンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性と同じ又は異な
る側面として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線又は電離放射線、（溶液中の
場合は）周囲の浸透圧モル濃度及びｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過による機械的剪断
力、紫外線放射、γ線照射などの電離放射線、化学的又は熱的な脱水、又は、タンパク質
構造の破壊を引き起こし得る他の任意の作用又は力に対して感受性があるか、又は「不安
定」である。分子の安定性は、標準的な方法を用いて決定することができる。例えば、分
子の安定性は、標準的な方法を用いて、分子の半分がアンフォールディングされる温度（
℃）である、熱融解（「ＴＭ」）温度を測定することによって決定され得る。典型的には
、ＴＭが高いほど、分子はより安定している。熱に加えて、化学環境もまた、タンパク質
が特有の三次元構造を維持する能力を変化させる。
る側面として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線又は電離放射線、（溶液中の
場合は）周囲の浸透圧モル濃度及びｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過による機械的剪断
力、紫外線放射、γ線照射などの電離放射線、化学的又は熱的な脱水、又は、タンパク質
構造の破壊を引き起こし得る他の任意の作用又は力に対して感受性があるか、又は「不安
定」である。分子の安定性は、標準的な方法を用いて決定することができる。例えば、分
子の安定性は、標準的な方法を用いて、分子の半分がアンフォールディングされる温度（
℃）である、熱融解（「ＴＭ」）温度を測定することによって決定され得る。典型的には
、ＴＭが高いほど、分子はより安定している。熱に加えて、化学環境もまた、タンパク質
が特有の三次元構造を維持する能力を変化させる。
【0105】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、本発明の、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに
結合するＦＮ３ドメインは、改変前の同一ドメインと比較して、少なくとも５％、１０％
、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％
、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の、ＴＭの上昇によ
って測定される増加した安定性を示す。
結合するＦＮ３ドメインは、改変前の同一ドメインと比較して、少なくとも５％、１０％
、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％
、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の、ＴＭの上昇によ
って測定される増加した安定性を示す。
【0106】
化学変性も同様に、様々な方法によって測定することができる。化学的変性剤としては
、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ
、ベンゼン、アセトニトリル）、塩類（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム
、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイ
トール、βメルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン（dinitrothiobenzene）、及び
、水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化物）、非イオン性及びイオン性洗剤、酸類（例え
ば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば
、リン脂質）、及び標的変性剤が挙げられる。変性の程度の定量化は、標的分子に結合す
る能力などの機能特性の損失、又はあるいは凝集傾向、これまで溶媒が到達しにくかった
残基が露出する傾向、ジスルフィド結合が破壊若しくは形成する傾向などの物理化学的性
質による損失に依存し得る。
、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ
、ベンゼン、アセトニトリル）、塩類（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム
、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイ
トール、βメルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン（dinitrothiobenzene）、及び
、水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化物）、非イオン性及びイオン性洗剤、酸類（例え
ば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ3ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば
、リン脂質）、及び標的変性剤が挙げられる。変性の程度の定量化は、標的分子に結合す
る能力などの機能特性の損失、又はあるいは凝集傾向、これまで溶媒が到達しにくかった
残基が露出する傾向、ジスルフィド結合が破壊若しくは形成する傾向などの物理化学的性
質による損失に依存し得る。
【0107】
本明細書に記載するいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに結合する本発
明のＦＮ３ドメインは、化学変性剤としてグアニジン塩酸塩を用いて測定した、改変前の
同じスカフォールドと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３
０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％又は９５％以上の安定性の増加を示す。増加した安定性は、よく知
られている方法を使用して塩酸グアニジンの濃度を増加させる処理における、減少したト
リプトファン蛍光によって測定され得る。
明のＦＮ３ドメインは、化学変性剤としてグアニジン塩酸塩を用いて測定した、改変前の
同じスカフォールドと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３
０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％又は９５％以上の安定性の増加を示す。増加した安定性は、よく知
られている方法を使用して塩酸グアニジンの濃度を増加させる処理における、減少したト
リプトファン蛍光によって測定され得る。
【0108】
本明細書に記載の本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、標的分子の原子価及びしたがっ
て結合活性を増加させるための手段として、又は２つ以上の異なる標的分子に同時に結合
する二重若しくは多特異性スカフォールドを生成するための手段として、単量体、二量体
、若しくは多量体として、生成できる。二量体及び多量体は、例えば、アミノ酸リンカー
、例えば、ポリグリシン、グリシン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含有するリ
ンカーの含有によって、単一特異性、二重又は多特異性タンパク質スカフォールドを結合
することによって生成できる。例示的なリンカーとしては、（ＧＳ）2（配列番号７８）
、（ＧＧＧＳ）2（配列番号２２４）、（ＧＧＧＧＳ）5（配列番号７９）、（ＡＰ）2（
配列番号８０）、（ＡＰ）5（配列番号８１）、（ＡＰ）10（配列番号８２）、（ＡＰ）2
0（配列番号８３）及びＡ（ＥＡＡＡＫ）5ＡＡＡ（配列番号８４）が挙げられる。二量体
及び多量体は、互いにＮ－Ｃ方向に連結され得る。ポリペプチドを新規の結合融合ポリペ
プチドと結合するための天然の、または人工のペプチドリンカーの使用は、文献において
よく知られている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５２６０
～５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８，７２５～７３
１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，
１０９～１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。
て結合活性を増加させるための手段として、又は２つ以上の異なる標的分子に同時に結合
する二重若しくは多特異性スカフォールドを生成するための手段として、単量体、二量体
、若しくは多量体として、生成できる。二量体及び多量体は、例えば、アミノ酸リンカー
、例えば、ポリグリシン、グリシン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含有するリ
ンカーの含有によって、単一特異性、二重又は多特異性タンパク質スカフォールドを結合
することによって生成できる。例示的なリンカーとしては、（ＧＳ）2（配列番号７８）
、（ＧＧＧＳ）2（配列番号２２４）、（ＧＧＧＧＳ）5（配列番号７９）、（ＡＰ）2（
配列番号８０）、（ＡＰ）5（配列番号８１）、（ＡＰ）10（配列番号８２）、（ＡＰ）2
0（配列番号８３）及びＡ（ＥＡＡＡＫ）5ＡＡＡ（配列番号８４）が挙げられる。二量体
及び多量体は、互いにＮ－Ｃ方向に連結され得る。ポリペプチドを新規の結合融合ポリペ
プチドと結合するための天然の、または人工のペプチドリンカーの使用は、文献において
よく知られている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５２６０
～５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８，７２５～７３
１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，
１０９～１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。
【0109】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ結合分子
本明細書に記載される本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有
分子は、低分子ＥＧＦＲ阻害物質と比較したときの特異性及び標的外の毒性の低減の点に
おいて、並びに従来の抗体治療と比較したときの組織侵入の改善の点おいて、利益をもた
らし得る。本発明は、少なくとも一部は、ＥＧＦＲ結合及びｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイ
ンの混合物と比較したとき、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン
含有分子が、大幅に改善された相乗的阻害効果をもたらすとの驚くべき発見に基づく。分
子は、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの双方に対して、特異的親和性となるように調節して、腫
瘍侵入及び保持率を最大化してもよい。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ
３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔシグナル伝達経路のより効果的な
阻害をもたらし、セツキシマブ（Ｅｒｉｂｔｕｘ（登録商標））より効率的に、腫瘍増殖
を阻害する。
本明細書に記載される本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有
分子は、低分子ＥＧＦＲ阻害物質と比較したときの特異性及び標的外の毒性の低減の点に
おいて、並びに従来の抗体治療と比較したときの組織侵入の改善の点おいて、利益をもた
らし得る。本発明は、少なくとも一部は、ＥＧＦＲ結合及びｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイ
ンの混合物と比較したとき、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン
含有分子が、大幅に改善された相乗的阻害効果をもたらすとの驚くべき発見に基づく。分
子は、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの双方に対して、特異的親和性となるように調節して、腫
瘍侵入及び保持率を最大化してもよい。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ
３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔシグナル伝達経路のより効果的な
阻害をもたらし、セツキシマブ（Ｅｒｉｂｔｕｘ（登録商標））より効率的に、腫瘍増殖
を阻害する。
【0110】
本発明は、また、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ
３ドメインを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメ
インは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）と
ＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体
（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブ
ロッキングする、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
３ドメインを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメ
インは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）と
ＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体
（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブ
ロッキングする、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
【0111】
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
は、本発明の任意のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン及びｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの直
接的又はリンカーを介しての共有結合による連結により、生成することができる。このた
め、二重特異性分子の第１のＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインについて、
上述の特徴を有し得る。また、二重特異性分子の第２のＦＮ３ドメインは、ｃ－Ｍｅｔ結
合ＦＮ３ドメインについて、上述の特徴を有し得る。
は、本発明の任意のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン及びｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの直
接的又はリンカーを介しての共有結合による連結により、生成することができる。このた
め、二重特異性分子の第１のＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインについて、
上述の特徴を有し得る。また、二重特異性分子の第２のＦＮ３ドメインは、ｃ－Ｍｅｔ結
合ＦＮ３ドメインについて、上述の特徴を有し得る。
【0112】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３
ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ
４３１細胞において測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残
基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、二重特異性ＥＧ
ＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍ
ＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定したとき、約１．５×１０
-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９における、ＨＧＦ誘発性のｃ
－Ｍｅｔリン酸化を阻害する。
ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ
４３１細胞において測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残
基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、二重特異性ＥＧ
ＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍ
ＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定したとき、約１．５×１０
-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９における、ＨＧＦ誘発性のｃ
－Ｍｅｔリン酸化を阻害する。
【0113】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３
ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ｎ
ＣＩ－Ｈ２９２細胞において測定したとき、約１．８×１０-8Ｍ～約２．５×１０-6Ｍの
ＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化
を阻害し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ド
メインは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定
したとき、約４×１０-9Ｍ～約１．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシ
ン１３４９における、ＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害する。
ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ｎ
ＣＩ－Ｈ２９２細胞において測定したとき、約１．８×１０-8Ｍ～約２．５×１０-6Ｍの
ＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化
を阻害し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ド
メインは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定
したとき、約４×１０-9Ｍ～約１．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシ
ン１３４９における、ＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害する。
【0114】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３
ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、約１×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）に
て、ヒトＥＧＦＲに結合し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
の第２のＦＮ３ドメインは、約５×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合する
。
ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、約１×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）に
て、ヒトＥＧＦＲに結合し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
の第２のＦＮ３ドメインは、約５×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合する
。
【0115】
本明細書に記載される、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの双方に結合する二重特異性分子では
、第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約２×１０-10～約１×１０-8ＭのＫDにて
結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ－Ｍｅｔと、約３×１０-10～約５×１０-
8ＭのＫDにて結合する。
、第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約２×１０-10～約１×１０-8ＭのＫDにて
結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ－Ｍｅｔと、約３×１０-10～約５×１０-
8ＭのＫDにて結合する。
【0116】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子のＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔに対する親和性は、単
一特異性分子の実施例３及び実施例５に記載されているように決定することができる。
一特異性分子の実施例３及び実施例５に記載されているように決定することができる。
【0117】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の第１のＦＮ３ドメインは、Ａ４３１細
胞を用い、第１のＦＮ３ドメインと共に又は第１のＦＮ３ドメイン無しで、インキュベー
トしたＡ４３１細胞において、６００ｎＭにて、ストレプトアビジン－フィコエリトリン
コンジュゲートを使用して、結合されたビオチン化ＥＧＦからの蛍光量を検出するアッセ
イにおいて、約１×１０-9Ｍ～約１．５×１０-7ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲに対するＥ
ＧＦの結合をブロッキングし得る。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の第１
のＦＮ３ドメインは、第１のＦＮ３ドメインの不在下で、同じアッセイ条件を用いてＥＧ
ＦとＥＧＦＲとの結合を比較したとき、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５
０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ＥＧＦ
Ｒに対するＥＧＦの結合をブロッキングし得る。
胞を用い、第１のＦＮ３ドメインと共に又は第１のＦＮ３ドメイン無しで、インキュベー
トしたＡ４３１細胞において、６００ｎＭにて、ストレプトアビジン－フィコエリトリン
コンジュゲートを使用して、結合されたビオチン化ＥＧＦからの蛍光量を検出するアッセ
イにおいて、約１×１０-9Ｍ～約１．５×１０-7ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲに対するＥ
ＧＦの結合をブロッキングし得る。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の第１
のＦＮ３ドメインは、第１のＦＮ３ドメインの不在下で、同じアッセイ条件を用いてＥＧ
ＦとＥＧＦＲとの結合を比較したとき、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５
０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ＥＧＦ
Ｒに対するＥＧＦの結合をブロッキングし得る。
【0118】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子内の第２のＦＮ３ドメインは、第２のＦ
Ｎ３ドメインの存在下で、ビオチン化ＨＧＦとｃ－Ｍｅｔ融合タンパク質の結合の阻害を
検出するアッセイにおいて、約２×１０-10Ｍ～約６×１０-8ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍ
ｅｔに対するＨＧＦの結合をブロッキングし得る。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子
内の第２のＦＮ３ドメインは、第２のＦＮ３ドメインの不在下で、同じアッセイ条件を用
いてＨＧＦとｃ－Ｍｅｔとの結合と比較したとき、少なくとも３０％、３５％、４０％、
４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００
％、ｃ－Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロッキングし得る。
Ｎ３ドメインの存在下で、ビオチン化ＨＧＦとｃ－Ｍｅｔ融合タンパク質の結合の阻害を
検出するアッセイにおいて、約２×１０-10Ｍ～約６×１０-8ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍ
ｅｔに対するＨＧＦの結合をブロッキングし得る。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子
内の第２のＦＮ３ドメインは、第２のＦＮ３ドメインの不在下で、同じアッセイ条件を用
いてＨＧＦとｃ－Ｍｅｔとの結合と比較したとき、少なくとも３０％、３５％、４０％、
４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００
％、ｃ－Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合をブロッキングし得る。
【0119】
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、同じアッセイ条件
を使用した、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の不在下でのシグナル伝達レ
ベルと比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％
、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅ
ｔシグナル伝達を阻害し得る。
を使用した、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の不在下でのシグナル伝達レ
ベルと比較して、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％
、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅ
ｔシグナル伝達を阻害し得る。
【0120】
ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔのシグナル伝達は、単一特異性分子について、上記のとおり種
々の周知の方法を用いて測定することができる。
々の周知の方法を用いて測定することができる。
【0121】
ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のＦＮ３ドメイン及びｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する
第２のＦＮ３ドメインを含む、本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
分子は、第１のＦＮ３ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインの混合物によって観察される相
乗的阻害と比較して、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔのシグナル伝達及び腫瘍細胞増殖の相乗的
阻害の大幅な向上をもたらす。相乗的阻害は、例えば、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
ＦＮ３ドメイン含有分子及び２つの単一特異性分子（一方はＥＧＦＲに結合し、他方は
ｃ－Ｍｅｔに結合する）の混合物による、ＥＲＫリン酸化の阻害を測定することによって
、評価できる。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、２つの単一特異性ＦＮ
３ドメインの混合物についてのＩＣ50値と比較した場合、少なくとも１００倍小さい、例
えば、少なくとも５００、１０００、５０００、１０，０００倍小さいＩＣ50値にて、Ｅ
ＲＫのリン酸化を阻害することができ、これは、この二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
ＦＮ３ドメイン含有分子が、２つの単一特異性ＦＮ３ドメインの混合物と比較して、能力
が少なくとも１００倍増大されていることを示す。例示的な二重特異性ＥＧＦＲ ｃ－Ｍ
ｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、約５×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値にて、ＥＲＫのリン酸
化を阻害することができる。ＥＲＫのリン酸化は、標準的な方法及び本明細書に記載の方
法を用いて測定できる。
第２のＦＮ３ドメインを含む、本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
分子は、第１のＦＮ３ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインの混合物によって観察される相
乗的阻害と比較して、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔのシグナル伝達及び腫瘍細胞増殖の相乗的
阻害の大幅な向上をもたらす。相乗的阻害は、例えば、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
ＦＮ３ドメイン含有分子及び２つの単一特異性分子（一方はＥＧＦＲに結合し、他方は
ｃ－Ｍｅｔに結合する）の混合物による、ＥＲＫリン酸化の阻害を測定することによって
、評価できる。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、２つの単一特異性ＦＮ
３ドメインの混合物についてのＩＣ50値と比較した場合、少なくとも１００倍小さい、例
えば、少なくとも５００、１０００、５０００、１０，０００倍小さいＩＣ50値にて、Ｅ
ＲＫのリン酸化を阻害することができ、これは、この二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
ＦＮ３ドメイン含有分子が、２つの単一特異性ＦＮ３ドメインの混合物と比較して、能力
が少なくとも１００倍増大されていることを示す。例示的な二重特異性ＥＧＦＲ ｃ－Ｍ
ｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、約５×１０-9Ｍ以下のＩＣ50値にて、ＥＲＫのリン酸
化を阻害することができる。ＥＲＫのリン酸化は、標準的な方法及び本明細書に記載の方
法を用いて測定できる。
【0122】
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
は、第１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインとの混合物を用いたＨ２９２細胞の増
殖阻害のＩＣ50値と比較したとき、少なくとも３０倍以下のＩＣ50値にて、Ｈ２９２細胞
の増殖を阻害し得、ここで、この細胞増殖は、７．５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを添加した１０
％ ＦＢＳ含有培地により誘発される。本明細書に記載の本発明の二重特異性分子は、第
１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインとの混合物による腫瘍細胞の増殖阻害のＩＣ
50値と比較したとき、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、
２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００又は約１０００倍以下のＩＣ
50値にて、腫瘍細胞の増殖を阻害し得る。腫瘍細胞増殖の阻害は、標準的な方法及び本明
細書に記載の方法を用いて測定できる。
は、第１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインとの混合物を用いたＨ２９２細胞の増
殖阻害のＩＣ50値と比較したとき、少なくとも３０倍以下のＩＣ50値にて、Ｈ２９２細胞
の増殖を阻害し得、ここで、この細胞増殖は、７．５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを添加した１０
％ ＦＢＳ含有培地により誘発される。本明細書に記載の本発明の二重特異性分子は、第
１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインとの混合物による腫瘍細胞の増殖阻害のＩＣ
50値と比較したとき、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、
２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００又は約１０００倍以下のＩＣ
50値にて、腫瘍細胞の増殖を阻害し得る。腫瘍細胞増殖の阻害は、標準的な方法及び本明
細書に記載の方法を用いて測定できる。
【0123】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３
ドメイン含有分子は、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、
Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦＲに結合す
る。
ドメイン含有分子は、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、
Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦＲに結合す
る。
【0124】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３
ドメイン含有分子は、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３
８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍｅｔに結合する
。
ドメイン含有分子は、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３
８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍｅｔに結合する
。
【0125】
二重特異性分子中のパラトープ残基は、突然変異誘発研究で同定できるか、又はＦＮ３
ドメイン及びＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔの共結晶構造から同定することができる。突然変異
誘発研究では、例えば、アラニンスキャニング法を利用してもよく、得られた変異体のＥ
ＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔへの結合について、標準的な方法により、試験を行ってもよい。典
型的に、パラトープ残基は、突然変異が誘発されたときの残基であり、ＥＧＦＲ又はｃ－
Ｍｅｔへの結合の低減又は消失に伴い変異体が発生する。Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列
番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応するアミノ酸残基位
置にて置換を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、置換されるときに、野生型Ｐ５４Ａ
Ｒ４－８３ｖ２と比較すると、ＥＧＦＲの結合が少なくとも１００倍減少する。二重特異
性分子ＥＣＢ１、ＥＣＢ２、ＥＣＢ３、ＥＣＢ４、ＥＣＢ５、ＥＣＢ６、ＥＣＢ７、ＥＣ
Ｂ１５、ＥＣＢ１７、ＥＣＢ６０、ＥＣＢ３７、ＥＣＢ９４、ＥＣＢ９５、ＥＣＢ９６、
ＥＣＢ９７、ＥＣＢ９１、ＥＣＢ１８、ＥＣＢ２８、ＥＣＢ３８、ＥＣＢ３９、ＥＣＢ１
６８及びＥＣＢ１７６は、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７
７及びＧ８５に対応する残基位置にて、Ｄ、Ｆ、Ｙ、Ｖ及びＧを有し、これらの残基によ
り、ＥＧＦＲと結合することが予測される。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１
）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応するアミノ酸残基位置にて置換を有す
るｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、置換されるとき、野生型Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ
３と比較すると、ｃ－Ｍｅｔ結合を少なくとも１００倍消失又は低減する。二重特異性分
子ＥＣＢ２、ＥＣＢ５、ＥＣＢ１５、ＥＣＢ６０、ＥＣＢ３８及びＥＣＢ３９は、Ｐ１１
４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応
する残基位置にて、Ｒ、Ｆ、Ｍ及びＩを有し、これらの残基によりｃ－Ｍｅｔに結合する
と予測される。
ドメイン及びＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔの共結晶構造から同定することができる。突然変異
誘発研究では、例えば、アラニンスキャニング法を利用してもよく、得られた変異体のＥ
ＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔへの結合について、標準的な方法により、試験を行ってもよい。典
型的に、パラトープ残基は、突然変異が誘発されたときの残基であり、ＥＧＦＲ又はｃ－
Ｍｅｔへの結合の低減又は消失に伴い変異体が発生する。Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列
番号２７）の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応するアミノ酸残基位
置にて置換を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、置換されるときに、野生型Ｐ５４Ａ
Ｒ４－８３ｖ２と比較すると、ＥＧＦＲの結合が少なくとも１００倍減少する。二重特異
性分子ＥＣＢ１、ＥＣＢ２、ＥＣＢ３、ＥＣＢ４、ＥＣＢ５、ＥＣＢ６、ＥＣＢ７、ＥＣ
Ｂ１５、ＥＣＢ１７、ＥＣＢ６０、ＥＣＢ３７、ＥＣＢ９４、ＥＣＢ９５、ＥＣＢ９６、
ＥＣＢ９７、ＥＣＢ９１、ＥＣＢ１８、ＥＣＢ２８、ＥＣＢ３８、ＥＣＢ３９、ＥＣＢ１
６８及びＥＣＢ１７６は、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２の残基Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７
７及びＧ８５に対応する残基位置にて、Ｄ、Ｆ、Ｙ、Ｖ及びＧを有し、これらの残基によ
り、ＥＧＦＲと結合することが予測される。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１
）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応するアミノ酸残基位置にて置換を有す
るｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、置換されるとき、野生型Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ
３と比較すると、ｃ－Ｍｅｔ結合を少なくとも１００倍消失又は低減する。二重特異性分
子ＥＣＢ２、ＥＣＢ５、ＥＣＢ１５、ＥＣＢ６０、ＥＣＢ３８及びＥＣＢ３９は、Ｐ１１
４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応
する残基位置にて、Ｒ、Ｆ、Ｍ及びＩを有し、これらの残基によりｃ－Ｍｅｔに結合する
と予測される。
【0126】
また、本発明は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ
３ドメインを含む二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメイン
は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧ
ＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ
－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッ
キングする、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供し、
該第１のＦＮ３ドメインは、
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（
配列番号１８０）を含むＦＧループを含み、Ｘ9は、Ｍ又はＩであり；
ＢＣループは、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）を含み、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
該第２のＦＮ３ドメインは、
Ｃストランド及びＣＤループであって、配列、ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ
15ＧＸ16（配列番号１８４）を含み、ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤである、Ｃストランド及びＣＤループと；
Ｆストランド及びＦＧループであって、配列ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21
Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５）を含み、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである、Ｆストランド及びＦＧループと、を含
む。
３ドメインを含む二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメイン
は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧ
ＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ
－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッ
キングする、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供し、
該第１のＦＮ３ドメインは、
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（
配列番号１８０）を含むＦＧループを含み、Ｘ9は、Ｍ又はＩであり；
ＢＣループは、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）を含み、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
該第２のＦＮ３ドメインは、
Ｃストランド及びＣＤループであって、配列、ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ
15ＧＸ16（配列番号１８４）を含み、ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤである、Ｃストランド及びＣＤループと；
Ｆストランド及びＦＧループであって、配列ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21
Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５）を含み、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである、Ｆストランド及びＦＧループと、を含
む。
【0127】
本明細書に記載のその他のいくつかの実施形態では、二重特異性分子は、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱ
ＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）、又は、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱ
ＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）、を含む、ＥＧＦＲに
結合する第１のＦＮ３ドメインを含み、
配列番号１８２及び１８３では、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱ
ＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）、又は、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱ
ＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）、を含む、ＥＧＦＲに
結合する第１のＦＮ３ドメインを含み、
配列番号１８２及び１８３では、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
【0128】
本明細書に記載のその他のいくつかの実施形態では、二重特異性分子は、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11
Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧ ＴＥＹＸ17
ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）、を含む
ｃ－Ｍｅｔに結合する第２のＦＮ３ドメインを含み、
ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである、Ｆストランド及びＦＧループと、を含
む。
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11
Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧ ＴＥＹＸ17
ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）、を含む
ｃ－Ｍｅｔに結合する第２のＦＮ３ドメインを含み、
ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである、Ｆストランド及びＦＧループと、を含
む。
【0129】
例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、配列番号５０
～７２、１０６、１１８～１２１、１３８～１６５、１７０～１７８又は１９０～１９３
で示すアミノ酸配列を含む。
～７２、１０６、１１８～１２１、１３８～１６５、１７０～１７８又は１９０～１９３
で示すアミノ酸配列を含む。
【0130】
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、ＥＧＦＲの自己リ
ン酸化の阻害などの、その機能的特性に関連する特定の構造特性を含んでおり、即ち、配
列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（
配列番号１８０）（ここで、Ｘ9は、Ｍ又はＩである）を含む、ＥＧＦＲに結合する第１
のＦＮ３ドメインのＦＧループなどである。
ン酸化の阻害などの、その機能的特性に関連する特定の構造特性を含んでおり、即ち、配
列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ（配列番号１７９）又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（
配列番号１８０）（ここで、Ｘ9は、Ｍ又はＩである）を含む、ＥＧＦＲに結合する第１
のＦＮ３ドメインのＦＧループなどである。
【0131】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
ＦＮ３ドメイン含有分子は、
５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ｈ２９２細胞において測定したとき、約８×１
０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧ
ＦＲリン酸化を阻害するか、
１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定したとき
、約８．４×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨ
ＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
約９．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＨＧＦ誘発性のＮＣＩ－Ｈ２９２細胞増殖を
阻害し、ここで該細胞増殖は、７．５ｎｇのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘
発されるか、
約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ＥＧＦＲに結合するか；又は
約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ｃ－Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施例３又は実施
例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される。
ＦＮ３ドメイン含有分子は、
５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ｈ２９２細胞において測定したとき、約８×１
０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧ
ＦＲリン酸化を阻害するか、
１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定したとき
、約８．４×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけるＨ
ＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
約９．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＨＧＦ誘発性のＮＣＩ－Ｈ２９２細胞増殖を
阻害し、ここで該細胞増殖は、７．５ｎｇのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘
発されるか、
約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ＥＧＦＲに結合するか；又は
約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ｃ－Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施例３又は実施
例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される。
【0132】
別の実施形態においては、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン
含有分子は、
５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ｈ２９２細胞において測定したとき、約４．２
×１０-9Ｍ～８×１０-7ＭのＩＣ50にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ
誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定したとき
、約２．４×１０-8Ｍ～約８．４×１０-7ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１
３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
約２．３×１０-8Ｍ～約９．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＨＧＦ誘発性のＮＣＩ－Ｈ
２９２細胞増殖を阻害し、該細胞増殖は、７．５ｎｇのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳ
によって誘発されるか、
約２×１０-10Ｍ～約２．０×１０-8ＭのＫDにて、ＥＧＦＲに結合するか、又は
約１×１０-9Ｍ～約２．０×１０-8ＭのＫDにて、ｃ－Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施
例３又は実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される。
含有分子は、
５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ｈ２９２細胞において測定したとき、約４．２
×１０-9Ｍ～８×１０-7ＭのＩＣ50にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ
誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定したとき
、約２．４×１０-8Ｍ～約８．４×１０-7ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１
３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
約２．３×１０-8Ｍ～約９．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＨＧＦ誘発性のＮＣＩ－Ｈ
２９２細胞増殖を阻害し、該細胞増殖は、７．５ｎｇのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳ
によって誘発されるか、
約２×１０-10Ｍ～約２．０×１０-8ＭのＫDにて、ＥＧＦＲに結合するか、又は
約１×１０-9Ｍ～約２．０×１０-8ＭのＫDにて、ｃ－Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施
例３又は実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される。
【0133】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインであって、
配列ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬ
ＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹ
ＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）を含み、ここで、
Ｘ1は、Ｄであり；
Ｘ2は、Ｄであり；
Ｘ3は、Ｐであり；
Ｘ4は、存在せず；
Ｘ5は、Ｈ又はＷであり；
Ｘ6は、Ａであり；
Ｘ7は、Ｆであり；
Ｘ8は、Ｙであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと；
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインであって、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11
Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧ ＴＥＹＸ17
ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）を含み、
ここで、
Ｘ10は、Ｗであり；
Ｘ11は、Ｆであり；
Ｘ12は、Ｆであり；
Ｘ13は、Ｖ又はＬであり；
Ｘ14は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｖであり；
Ｘ18は、Ｎであり；
Ｘ19は、Ｌ又はＭであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉであり；
Ｘ23は、Ｐである、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと、を含む。
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインであって、
配列ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬ
ＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹ
ＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）を含み、ここで、
Ｘ1は、Ｄであり；
Ｘ2は、Ｄであり；
Ｘ3は、Ｐであり；
Ｘ4は、存在せず；
Ｘ5は、Ｈ又はＷであり；
Ｘ6は、Ａであり；
Ｘ7は、Ｆであり；
Ｘ8は、Ｙであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと；
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインであって、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11
Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧ ＴＥＹＸ17
ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）を含み、
ここで、
Ｘ10は、Ｗであり；
Ｘ11は、Ｆであり；
Ｘ12は、Ｆであり；
Ｘ13は、Ｖ又はＬであり；
Ｘ14は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｖであり；
Ｘ18は、Ｎであり；
Ｘ19は、Ｌ又はＭであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉであり；
Ｘ23は、Ｐである、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと、を含む。
【0134】
例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、配列番号５７、６１、６２、６３、
６４、６５、６６、６７、６８又は１９０～１９３に示す配列を有する分子である。
６４、６５、６６、６７、６８又は１９０～１９３に示す配列を有する分子である。
【0135】
本明細書に記載の本発明の二重特異性分子は、上述のとおり、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号
１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する第１のＦＮ３ドメイン
及び／又は第２のＦＮ３ドメインにおける１つ以上の残基位置にて、及び２９位にて、置
換を更に含み得る。例示的な置換は、置換Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｌ１７Ａ、Ｅ３７Ｐ、Ｎ
４６Ｖ、Ｇ７３Ｙ及びＥ８６Ｉ及びＤ２９Ｅ（ナンバリングは、配列番号１に従う）であ
る。当業者であれば、後に述べるように、側鎖内で関連付けられるアミノ酸ファミリー内
のアミノ酸など、その他のアミノ酸を置換に使用できることは、理解するであろう。
１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する第１のＦＮ３ドメイン
及び／又は第２のＦＮ３ドメインにおける１つ以上の残基位置にて、及び２９位にて、置
換を更に含み得る。例示的な置換は、置換Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｌ１７Ａ、Ｅ３７Ｐ、Ｎ
４６Ｖ、Ｇ７３Ｙ及びＥ８６Ｉ及びＤ２９Ｅ（ナンバリングは、配列番号１に従う）であ
る。当業者であれば、後に述べるように、側鎖内で関連付けられるアミノ酸ファミリー内
のアミノ酸など、その他のアミノ酸を置換に使用できることは、理解するであろう。
【0136】
生成した変異体については、その安定性及び本明細書の方法を用いたＥＧＦＲ及び／又
はｃ－Ｍｅｔへの結合に関して試験を行うことができる。本明細書に記載のいくつかの実
施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲと
特異的に結合する第１のＦＮ３ドメインと、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合する第２のＦＮ３
ドメインと、を含み、該第１のＦＮ３ドメインは、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ24ＶＴＸ25ＤＳＸ26ＲＬＳＷＤＤＰＸ27ＡＦＹＸ28ＳＦＬＩＱ
ＹＱＸ29ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ30ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹ
Ｘ31ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ32ＲＧＬＰＬＳＡＸ33ＦＴＴ（配列番号：１８７）を含み、
Ｘ24は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ25は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ26は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ27は、Ｈ又はＷであり；
Ｘ28は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ29は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ30は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ31は、Ｇ又はＹであり；
Ｘ32は、Ｍ又はＩであり；
Ｘ33は、Ｅ又はＩであり、
第２のＦＮ３ドメインは、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ34ＶＴＸ35ＤＳＸ36ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦ
Ｘ37ＦＸ38Ｘ39Ｘ40ＧＸ41ＡＩＸ42ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮ
ＩＸ43Ｘ44ＶＫＧＧＸ45ＩＳＰＰＬＳＡＸ46ＦＴＴ（配列番号１８８）を含み；
Ｘ34は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ35は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ36は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ37は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ38は、Ｖ又はＬであり；
Ｘ39は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ40は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ41は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ42は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ43は、Ｌ又はＭであり；
Ｘ44は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ45は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ46は、Ｅ又はＩである。
はｃ－Ｍｅｔへの結合に関して試験を行うことができる。本明細書に記載のいくつかの実
施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲと
特異的に結合する第１のＦＮ３ドメインと、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合する第２のＦＮ３
ドメインと、を含み、該第１のＦＮ３ドメインは、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ24ＶＴＸ25ＤＳＸ26ＲＬＳＷＤＤＰＸ27ＡＦＹＸ28ＳＦＬＩＱ
ＹＱＸ29ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ30ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹ
Ｘ31ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ32ＲＧＬＰＬＳＡＸ33ＦＴＴ（配列番号：１８７）を含み、
Ｘ24は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ25は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ26は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ27は、Ｈ又はＷであり；
Ｘ28は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ29は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ30は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ31は、Ｇ又はＹであり；
Ｘ32は、Ｍ又はＩであり；
Ｘ33は、Ｅ又はＩであり、
第２のＦＮ３ドメインは、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ34ＶＴＸ35ＤＳＸ36ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦ
Ｘ37ＦＸ38Ｘ39Ｘ40ＧＸ41ＡＩＸ42ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮ
ＩＸ43Ｘ44ＶＫＧＧＸ45ＩＳＰＰＬＳＡＸ46ＦＴＴ（配列番号１８８）を含み；
Ｘ34は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ35は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ36は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ37は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ38は、Ｖ又はＬであり；
Ｘ39は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ40は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ41は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ42は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ43は、Ｌ又はＭであり；
Ｘ44は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ45は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ46は、Ｅ又はＩである。
【0137】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３
ドメイン含有分子は、少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が配列番号２７のアミノ酸配
列と同一であるアミノ酸配列を含む第１のＦＮ３ドメインを含み、少なくとも８３％、８
４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一
である、アミノ酸配列を含む第２のＦＮ３ドメインを含む。
ドメイン含有分子は、少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が配列番号２７のアミノ酸配
列と同一であるアミノ酸配列を含む第１のＦＮ３ドメインを含み、少なくとも８３％、８
４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９
４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一
である、アミノ酸配列を含む第２のＦＮ３ドメインを含む。
【0138】
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
は、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔに対して、特異的親和性となるように調節して、腫瘍集積を
最大化してもよい。
は、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔに対して、特異的親和性となるように調節して、腫瘍集積を
最大化してもよい。
【0139】
また、本発明は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ
３ドメインを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメ
インは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）と
ＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体
（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブ
ロッキングする、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメ
イン及び該第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいてデザイン
されたライブラリから単離される、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
３ドメインを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメ
インは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）と
ＥＧＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体
（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブ
ロッキングする、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメ
イン及び該第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいてデザイン
されたライブラリから単離される、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
【0140】
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
は、周知の方法を用いた本発明のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン及びｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３
ドメインの共有結合により、生成することができる。ＦＮ３ドメインは、リンカー、例え
ばポリグリシン、グリシンとセリン又はアラニンとプロリンを含有するリンカーを介して
連結させることもできる。例示的なリンカーとしては、（ＧＳ）2、（配列番号７８）、
（ＧＧＧＳ）２（配列番号２２４）、（ＧＧＧＧＳ）5（配列番号７９）、（ＡＰ）2（配
列番号８０）、（ＡＰ）5（配列番号８１）、（ＡＰ）10（配列番号８２）、（ＡＰ）20
（配列番号８３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）5ＡＡＡ（配列番号８４）が挙げられる。ポリペプ
チドを新規の結合融合ポリペプチドと結合するための天然の、または人工のペプチドリン
カーの使用は、文献においてよく知られている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ ２６４，５２６０～５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇ．８，７２５～７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１０９～１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６
号）。本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、第１のＦＮ３
ドメインのＣ末端から第２のＦＮ３ドメインのＮ末端へ、又は第２のＦＮ３ドメインのＣ
末端から第１のＦＮ３ドメインのＮ末端へ、共に連結されてもよい。いずれのＥＧＦＲ結
合ＦＮ３ドメインも、共有結合により、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに連結されてよい
。例示的なＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２
２～１３７、１９４～２１１に示されたアミノ酸配列を有するドメインであり、例示的な
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号３２～４９、１１１～１１４又は２１２～２
２３に示されたアミノ酸配列を有するドメインである。二重特異性分子と結合したＥＧＦ
Ｒ－結合ＦＮ３ドメインは、更に、Ｎ末端にて、反応開始剤メチオニン（Ｍｅｔ）を含ん
でもよい。
は、周知の方法を用いた本発明のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン及びｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３
ドメインの共有結合により、生成することができる。ＦＮ３ドメインは、リンカー、例え
ばポリグリシン、グリシンとセリン又はアラニンとプロリンを含有するリンカーを介して
連結させることもできる。例示的なリンカーとしては、（ＧＳ）2、（配列番号７８）、
（ＧＧＧＳ）２（配列番号２２４）、（ＧＧＧＧＳ）5（配列番号７９）、（ＡＰ）2（配
列番号８０）、（ＡＰ）5（配列番号８１）、（ＡＰ）10（配列番号８２）、（ＡＰ）20
（配列番号８３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）5ＡＡＡ（配列番号８４）が挙げられる。ポリペプ
チドを新規の結合融合ポリペプチドと結合するための天然の、または人工のペプチドリン
カーの使用は、文献においてよく知られている（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ ２６４，５２６０～５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇ．８，７２５～７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１０９～１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６
号）。本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、第１のＦＮ３
ドメインのＣ末端から第２のＦＮ３ドメインのＮ末端へ、又は第２のＦＮ３ドメインのＣ
末端から第１のＦＮ３ドメインのＮ末端へ、共に連結されてもよい。いずれのＥＧＦＲ結
合ＦＮ３ドメインも、共有結合により、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに連結されてよい
。例示的なＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２
２～１３７、１９４～２１１に示されたアミノ酸配列を有するドメインであり、例示的な
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号３２～４９、１１１～１１４又は２１２～２
２３に示されたアミノ酸配列を有するドメインである。二重特異性分子と結合したＥＧＦ
Ｒ－結合ＦＮ３ドメインは、更に、Ｎ末端にて、反応開始剤メチオニン（Ｍｅｔ）を含ん
でもよい。
【0141】
本明細書に記載されているような二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含
有分子の変異体は、本発明の範囲内である。例えば、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
ＦＮ３ドメイン含有分子における置換は、その結果得られた変異体において、親分子と比
較して、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔに対する同様の感度及び効力が保持される限り、行われ
てもよい。例示的な一時的変異は、例えば、それらの親分子に類似の特徴を有する変異体
となる同類置換である。同類置換とは、側鎖で関連したアミノ酸ファミリー内で起こる置
換である。遺伝的にコードされるアミノ酸は、（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸塩、
グルタミン酸塩）、（２）塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）
非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラ
ニン、メチオニン、トリプトファン）、及び（４）電荷を持たない極性アミノ酸（グリシ
ン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）、の４つ
のファミリーに分類され得る。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳
香族アミノ酸として共に分類される場合もある。あるいは、アミノ酸レパートリーは、以
下のように分類され得る；（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；
（２）塩基性アミノ酸（リジン、アルギニンヒスチジン）；（３）脂肪族アミノ酸（グリ
シン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）（セリン及び
スレオニンは、任意選択的に、脂肪族水酸基として別に、分類される）；（４）芳香族ア
ミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５）アミドアミノ酸（アス
パラギン、グルタミン）；（６）硫黄含有アミノ酸（システイン及びメチオニン）（Ｓｔ
ｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ Ｃｏ．，１９８１）。非同類置換は、異なる分類のアミノ酸間でのアミノ酸残
基の置換を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子に行って、二
重特異性分子の特性を向上させることができる。ポリペプチド又はそのフラグメントのア
ミノ酸配列における変化が機能的相同体をもたらすかどうかは、本明細書に記載のアッセ
イを用いて、改変されていないポリペプチド又はフラグメントと同様のやり方で、この改
変ポリペプチド又はフラグメントによる反応性を評価することによって、容易に評価され
得る。１箇所以上で置換が生じたペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、同様のやり
方で容易に試験することができる。
有分子の変異体は、本発明の範囲内である。例えば、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
ＦＮ３ドメイン含有分子における置換は、その結果得られた変異体において、親分子と比
較して、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔに対する同様の感度及び効力が保持される限り、行われ
てもよい。例示的な一時的変異は、例えば、それらの親分子に類似の特徴を有する変異体
となる同類置換である。同類置換とは、側鎖で関連したアミノ酸ファミリー内で起こる置
換である。遺伝的にコードされるアミノ酸は、（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸塩、
グルタミン酸塩）、（２）塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）
非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラ
ニン、メチオニン、トリプトファン）、及び（４）電荷を持たない極性アミノ酸（グリシ
ン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）、の４つ
のファミリーに分類され得る。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳
香族アミノ酸として共に分類される場合もある。あるいは、アミノ酸レパートリーは、以
下のように分類され得る；（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；
（２）塩基性アミノ酸（リジン、アルギニンヒスチジン）；（３）脂肪族アミノ酸（グリ
シン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）（セリン及び
スレオニンは、任意選択的に、脂肪族水酸基として別に、分類される）；（４）芳香族ア
ミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５）アミドアミノ酸（アス
パラギン、グルタミン）；（６）硫黄含有アミノ酸（システイン及びメチオニン）（Ｓｔ
ｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ
ａｎｄ Ｃｏ．，１９８１）。非同類置換は、異なる分類のアミノ酸間でのアミノ酸残
基の置換を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子に行って、二
重特異性分子の特性を向上させることができる。ポリペプチド又はそのフラグメントのア
ミノ酸配列における変化が機能的相同体をもたらすかどうかは、本明細書に記載のアッセ
イを用いて、改変されていないポリペプチド又はフラグメントと同様のやり方で、この改
変ポリペプチド又はフラグメントによる反応性を評価することによって、容易に評価され
得る。１箇所以上で置換が生じたペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、同様のやり
方で容易に試験することができる。
【0142】
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
は、例えば、原子価を増加させることで、結合している標的分子の結合活性を増大させる
手段として、単量体又は二量体として生成され得る。多量体は、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ
のいずれかに対して少なくとも二重特異性である少なくとも３つの独立したＦＮ３ドメイ
ンを含む分子を形成するために、例えば、周知の方法を用いて、アミノ酸リンカーを含め
ることによって、１つ以上のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと、１つ以上のｃ－Ｍｅｔ結合
ＦＮ３ドメインとを連結することによって、作製してもよい。
は、例えば、原子価を増加させることで、結合している標的分子の結合活性を増大させる
手段として、単量体又は二量体として生成され得る。多量体は、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ
のいずれかに対して少なくとも二重特異性である少なくとも３つの独立したＦＮ３ドメイ
ンを含む分子を形成するために、例えば、周知の方法を用いて、アミノ酸リンカーを含め
ることによって、１つ以上のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと、１つ以上のｃ－Ｍｅｔ結合
ＦＮ３ドメインとを連結することによって、作製してもよい。
【0143】
また、本発明は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ
３ドメインを含む二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメイン
は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧ
ＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ
－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッ
キングする、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、配列番号５０～７２、１０６
、１１８～１２１、１３８～１６５、１７０～１７９又は１９０～１９３で示すアミノ酸
配列を含む、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
３ドメインを含む二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメイン
は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧ
ＦＲとの結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ
－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッ
キングする、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、配列番号５０～７２、１０６
、１１８～１２１、１３８～１６５、１７０～１７９又は１９０～１９３で示すアミノ酸
配列を含む、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子を提供する。
【0144】
半減期延長部分
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
又は単一特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインは、例えば、共有結合による相互
作用を介して他のサブユニットを組み込むことができる。本発明の一態様では、本発明の
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、半減期延長部分を更に含
む。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン－結合タン
パク質及び／又はドメイン、トランスフェリン並びにそのフラグメント及び類縁体並びに
Ｆｃ領域である。例示的なアルブミン結合ドメインは、配列番号１１７に示されており、
例示的なアルブミン変異体は、配列番号１８９に示す。
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
又は単一特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインは、例えば、共有結合による相互
作用を介して他のサブユニットを組み込むことができる。本発明の一態様では、本発明の
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、半減期延長部分を更に含
む。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン－結合タン
パク質及び／又はドメイン、トランスフェリン並びにそのフラグメント及び類縁体並びに
Ｆｃ領域である。例示的なアルブミン結合ドメインは、配列番号１１７に示されており、
例示的なアルブミン変異体は、配列番号１８９に示す。
【0145】
抗体定常領域の全部又は一部分を、本発明の分子に付着させて、抗体様特性、特に、Ｆ
ｃ領域と関連した特性（例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容
体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば
、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などのＦｃエフェクター機能）を付与してもよく、
また、これらの活性に関与するＦｃ中の残基を修飾することによって更に修飾することも
できる（概観のために、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２
０，６８５～６９１，２００９を参照されたい）。
ｃ領域と関連した特性（例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容
体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば
、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などのＦｃエフェクター機能）を付与してもよく、
また、これらの活性に関与するＦｃ中の残基を修飾することによって更に修飾することも
できる（概観のために、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２
０，６８５～６９１，２００９を参照されたい）。
【0146】
ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、
例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン
酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン
二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及
び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリ
ゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を、所望の特性を得るために本発明の二重特異性分
子に組み込むことができる。これらの部分は、タンパク質スカフォールドコード配列との
直接融合であってもよく、標準的なクローニング及び発現法によって生成できる。別の方
法としては、周知の化学カップリング法を使用して、この部分を組換えにより生成された
本発明の分子に付着させてもよい。
例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン
酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン
二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及
び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリ
ゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を、所望の特性を得るために本発明の二重特異性分
子に組み込むことができる。これらの部分は、タンパク質スカフォールドコード配列との
直接融合であってもよく、標準的なクローニング及び発現法によって生成できる。別の方
法としては、周知の化学カップリング法を使用して、この部分を組換えにより生成された
本発明の分子に付着させてもよい。
【0147】
例えば周知の方法を用いて、システイン残基を分子のＣ末端に組み込み、ＰＥＧ基（pe
gyl group）をシステインに付着させることによって、ＰＥＧ部分を本発明の二重特異性
又は単一特異性分子に付加してもよい。Ｃ末端システインを有する例示的な二重特異性分
子としては、配列番号１７０～１７８に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
gyl group）をシステインに付着させることによって、ＰＥＧ部分を本発明の二重特異性
又は単一特異性分子に付加してもよい。Ｃ末端システインを有する例示的な二重特異性分
子としては、配列番号１７０～１７８に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【0148】
追加部分を組み込まれている本明細書に記載の本発明の単一特異性及び二重特異性分子
は、いくつかの周知のアッセイによって、機能を比較してもよい。例えば、Ｆｃドメイン
及び／又はＦｃドメインの変異体の取り込みによる単一特異性及び／又は二重特異性分子
の変化した特性は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ又はＦｃＲｎ受容体など
の受容体の可溶型を使用したＦｃ受容体結合アッセイで、又は例えば、ＡＤＣＣ又はＣＤ
Ｃを測定するか、又はインビボモデル中での本発明の分子の薬物動態的特性を評価する、
周知の細胞ベース分析評価を使用して、分析できる。
は、いくつかの周知のアッセイによって、機能を比較してもよい。例えば、Ｆｃドメイン
及び／又はＦｃドメインの変異体の取り込みによる単一特異性及び／又は二重特異性分子
の変化した特性は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ又はＦｃＲｎ受容体など
の受容体の可溶型を使用したＦｃ受容体結合アッセイで、又は例えば、ＡＤＣＣ又はＣＤ
Ｃを測定するか、又はインビボモデル中での本発明の分子の薬物動態的特性を評価する、
周知の細胞ベース分析評価を使用して、分析できる。
【0149】
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
本発明は、単離したポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、若しく
は、転写／翻訳に使用される線状ＤＮＡ配列を含む線状ＤＮＡ配列の一部として、ＥＧＦ
Ｒ－結合又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン又は本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする核酸類及び組成物又はこれらの定方向突然変異
原（directed mutagen）の原核、真核、線状ファージの発現、分泌及び／又は提示と適合
性のあるベクターを提供する。特定の例示的なポリヌクレオチドは、本明細書にて開示さ
れるが、所与の発現システムにおける、遺伝暗号の縮退又はコドン選択を考慮した、本発
明のＥＧＦＲ－結合ドメイン若しくはｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性Ｅ
ＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする、その他のポリヌクレオチド
もまた、本発明の範囲内である。
本発明は、単離したポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、若しく
は、転写／翻訳に使用される線状ＤＮＡ配列を含む線状ＤＮＡ配列の一部として、ＥＧＦ
Ｒ－結合又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン又は本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする核酸類及び組成物又はこれらの定方向突然変異
原（directed mutagen）の原核、真核、線状ファージの発現、分泌及び／又は提示と適合
性のあるベクターを提供する。特定の例示的なポリヌクレオチドは、本明細書にて開示さ
れるが、所与の発現システムにおける、遺伝暗号の縮退又はコドン選択を考慮した、本発
明のＥＧＦＲ－結合ドメイン若しくはｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性Ｅ
ＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする、その他のポリヌクレオチド
もまた、本発明の範囲内である。
【0150】
本発明は、また、配列番号１８～２９、１０７又は１１０、１２２～１３７又は１９４
～２１１のアミノ酸配列を有する、ＥＧＦＲに特異的に結合する、ＦＮ３ドメインをコー
ドする単離ポリヌクレオチドも提供する。
～２１１のアミノ酸配列を有する、ＥＧＦＲに特異的に結合する、ＦＮ３ドメインをコー
ドする単離ポリヌクレオチドも提供する。
【0151】
本発明は、また、配列番号３２～４９、１１１～１１４又は２１２～２２３のアミノ酸
配列を有する、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する、ＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌ
クレオチドも提供する。
配列を有する、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する、ＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌ
クレオチドも提供する。
【0152】
本発明は、また、配列番号５０～７２、１０６、１１８～１２１、１３８～１６５、１
７０～１７９又は１９０～１９３のアミノ酸配列を有する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
７０～１７９又は１９０～１９３のアミノ酸配列を有する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【0153】
本発明は、また、配列番号９７、９８、１０３、１０４、１１５、１１６又は１６６～
１６９のポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
１６９のポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【0154】
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチドは、自動式ポリヌクレオチド
合成装置での固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成により製造され得、完全一本鎖又
は二本鎖分子に構築され得る。別の方法としては、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ
に続いて慣用的なクローニングを行うなどの他の手法により製造され得る。特定の既知の
配列のポリヌクレオチドを生成又は得るための方法は当該技術分野では周知のものである
。
合成装置での固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成により製造され得、完全一本鎖又
は二本鎖分子に構築され得る。別の方法としては、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲ
に続いて慣用的なクローニングを行うなどの他の手法により製造され得る。特定の既知の
配列のポリヌクレオチドを生成又は得るための方法は当該技術分野では周知のものである
。
【0155】
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター又はエンハ
ンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、シス配列促進ＲｅｐＡ結合など、少
なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列はまた、タンパク質
、シグナル配列、ＲｅｐＡなどの融合タンパク質パートナー、Ｆｃ、又はｐＩＸ若しくは
ｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質の精製又は検出を促進するために、
例えば、マーカー又はヒスチジンタグ若しくはＨＡタグなどのタグ配列をコードする追加
のアミノ酸をコードする更なる配列を含んでもよい。
ンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、シス配列促進ＲｅｐＡ結合など、少
なくとも１つの非コード配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列はまた、タンパク質
、シグナル配列、ＲｅｐＡなどの融合タンパク質パートナー、Ｆｃ、又はｐＩＸ若しくは
ｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質の精製又は検出を促進するために、
例えば、マーカー又はヒスチジンタグ若しくはＨＡタグなどのタグ配列をコードする追加
のアミノ酸をコードする更なる配列を含んでもよい。
【0156】
本発明は、また、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供す
る。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発
現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又
は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意
のベクターであってもよい。かかるベクターは、かかるベクターによってコードされるポ
リペプチドの発現を制御、調整、誘発、又は許容することができる核酸配列因子を含む発
現ベクターであってもよい。このような因子は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリ
メラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現系におけるコードされたポリペ
プチドの発現を促進する他の部位を含んでよい。このような発現系は、当該技術分野にお
いて周知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。
る。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発
現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又
は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意
のベクターであってもよい。かかるベクターは、かかるベクターによってコードされるポ
リペプチドの発現を制御、調整、誘発、又は許容することができる核酸配列因子を含む発
現ベクターであってもよい。このような因子は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリ
メラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現系におけるコードされたポリペ
プチドの発現を促進する他の部位を含んでよい。このような発現系は、当該技術分野にお
いて周知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。
【0157】
本発明は、また、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明の単一特異性Ｅ
ＧＦＲ結合若しくはｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
ＦＮ３ドメイン含有分子は、任意選択的に、当該技術分野において周知のとおり、細胞
株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団によって、製造することがで
きる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，
Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７～２００１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２nd Ｅｄ
ｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）Ｈａｒｌｏｗ
ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａ
ｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４～２００１）Ｃｏｌｌ
ｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９９７～２０
０１）を参照されたい。
ＧＦＲ結合若しくはｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
ＦＮ３ドメイン含有分子は、任意選択的に、当該技術分野において周知のとおり、細胞
株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団によって、製造することがで
きる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，
Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７～２００１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２nd Ｅｄ
ｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）Ｈａｒｌｏｗ
ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａ
ｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４～２００１）Ｃｏｌｌ
ｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９９７～２０
０１）を参照されたい。
【0158】
発現のために選択される宿主細胞は、哺乳類起源であり得るか、又はＣＯＳ－１、ＣＯ
Ｓ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ－１、Ｈｅ Ｇ２、ＳＰ２／０、Ｈ
ｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はその任意の誘導物質、不
死化若しくは形質転換細胞から選択され得る。あるいは、宿主細胞は、ポリペプチドをグ
リコシル化することが不可能な種又は生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ
Ｌ２１－ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１
７４（ＤＥ３）、及び天然又は改変大腸菌種、クレブシエラ種、又はシュードモナス種の
菌株などの原核細胞又は生物、から選択できる。
Ｓ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ－１、Ｈｅ Ｇ２、ＳＰ２／０、Ｈ
ｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はその任意の誘導物質、不
死化若しくは形質転換細胞から選択され得る。あるいは、宿主細胞は、ポリペプチドをグ
リコシル化することが不可能な種又は生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ
Ｌ２１－ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１
７４（ＤＥ３）、及び天然又は改変大腸菌種、クレブシエラ種、又はシュードモナス種の
菌株などの原核細胞又は生物、から選択できる。
【0159】
本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに特異的に結合する本発明の単離Ｆ
Ｎ３ドメイン又は本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分
子を作製する方法であって、本発明の単離宿主細胞を、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに特異的
に結合する単離ＦＮ３ドメイン若しくは単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ド
メイン含有分子が発現するような条件下で培養することと、該ドメイン又は該分子を精製
することと、を含む。
Ｎ３ドメイン又は本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分
子を作製する方法であって、本発明の単離宿主細胞を、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに特異的
に結合する単離ＦＮ３ドメイン若しくは単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ド
メイン含有分子が発現するような条件下で培養することと、該ドメイン又は該分子を精製
することと、を含む。
【0160】
ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメイン又は本発明の単離二重特異
性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、周知の方法、例えば、プロテイン
Ａ精製法、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿法、酸抽出法、陰イオン又は陽イオン交
換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラ
フィーとレクチンクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
よって、組換え細胞培養物から精製できる。
性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子は、周知の方法、例えば、プロテイン
Ａ精製法、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿法、酸抽出法、陰イオン又は陽イオン交
換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラ
フィーとレクチンクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
よって、組換え細胞培養物から精製できる。
【0161】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子及びＥＧＦＲ又は
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの使用
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを使用して、ヒトの疾
患症状又は細胞、組織、器官、流体又は一般に、宿主内での特定の病理の診断、モニター
、調整、治療、軽減、発生の予防の補助、減少を行うことができる。本発明の方法を用い
て任意の分類に属する患畜を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト
、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの使用
本明細書に記載の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを使用して、ヒトの疾
患症状又は細胞、組織、器官、流体又は一般に、宿主内での特定の病理の診断、モニター
、調整、治療、軽減、発生の予防の補助、減少を行うことができる。本発明の方法を用い
て任意の分類に属する患畜を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト
、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
【0162】
本発明の一態様は、細胞を、本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ド
メイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに接触
させることを含む、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔを発現させる細胞の成長又は増殖を阻
害する方法である。
メイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに接触
させることを含む、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔを発現させる細胞の成長又は増殖を阻
害する方法である。
【0163】
本発明の別の態様は、被験体において、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ発現腫瘍細胞又
は癌細胞の増殖又は転移を阻害する方法であって、この方法は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－
Ｍｅｔ発現腫瘍細胞又は癌細胞の増殖又は転移が阻害されるように、有効量の本発明の単
離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメ
イン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを被験体へ投与することを含む。
は癌細胞の増殖又は転移を阻害する方法であって、この方法は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ－
Ｍｅｔ発現腫瘍細胞又は癌細胞の増殖又は転移が阻害されるように、有効量の本発明の単
離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメ
イン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを被験体へ投与することを含む。
【0164】
本発明の別の態様は、治療的に有効な量の本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインを、癌の治療を行うために十分な時間にわたって、その必要のある患者に投与する
ことを含む、癌を有する被験体を治療する方法である。
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインを、癌の治療を行うために十分な時間にわたって、その必要のある患者に投与する
ことを含む、癌を有する被験体を治療する方法である。
【0165】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦ若し
くは他のＥＧＦＲリガンド又はＨＧＦの異常活性化又は産生により特徴付けられる任意の
疾患又は障害、又は、ＥＧＦＲ若しくはｃ－Ｍｅｔの発現に関連する障害の治療に使用し
てもよく、これらは、悪性腫瘍又は癌に関係がある場合もない場合もあり、また、ＥＧＦ
Ｒ、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦ若しくは他のＥＧＦＲリガンド又はＨＧＦの異常活性化及び／又
は産生は、疾患又は障害を有する又は素因になる被験体の細胞又は組織に発生する。本発
明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ド
メイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、癌及び良性腫瘍などの腫瘍の治療に使用で
きる。本発明の二重特異性分子によって、治療を適用できる癌としては、ＥＧＦＲ及び／
又はｃ－Ｍｅｔを過剰発現させる癌、並びにＥＧＦＲ活性及び／又は発現レベルの上昇（
例えば、ＥＧＦＲ活性化突然変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅又はリガンド媒介ＥＧＦＲ活性化
など）及びｃ－Ｍｅｔ活性及び／又は発現レベルの上昇（例えば、ｃ－Ｍｅｔ活性化突然
変異、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅又はリガンド媒介ｃ－Ｍｅｔ活性化など）に関連する癌が挙
げられる。
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦ若し
くは他のＥＧＦＲリガンド又はＨＧＦの異常活性化又は産生により特徴付けられる任意の
疾患又は障害、又は、ＥＧＦＲ若しくはｃ－Ｍｅｔの発現に関連する障害の治療に使用し
てもよく、これらは、悪性腫瘍又は癌に関係がある場合もない場合もあり、また、ＥＧＦ
Ｒ、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦ若しくは他のＥＧＦＲリガンド又はＨＧＦの異常活性化及び／又
は産生は、疾患又は障害を有する又は素因になる被験体の細胞又は組織に発生する。本発
明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ド
メイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、癌及び良性腫瘍などの腫瘍の治療に使用で
きる。本発明の二重特異性分子によって、治療を適用できる癌としては、ＥＧＦＲ及び／
又はｃ－Ｍｅｔを過剰発現させる癌、並びにＥＧＦＲ活性及び／又は発現レベルの上昇（
例えば、ＥＧＦＲ活性化突然変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅又はリガンド媒介ＥＧＦＲ活性化
など）及びｃ－Ｍｅｔ活性及び／又は発現レベルの上昇（例えば、ｃ－Ｍｅｔ活性化突然
変異、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅又はリガンド媒介ｃ－Ｍｅｔ活性化など）に関連する癌が挙
げられる。
【0166】
癌と関連付けることができる例示的なＥＧＦＲ活性化突然変異としては、チロシンキナ
ーゼ活性の上昇、受容体ホモ二量体及びヘテロ二量体の形成、リガンド結合の増大など、
ＥＧＦＲの少なくとも１つの生物学的活性の上昇を引き起こす点変異、欠失変異、挿入変
異、逆位又は遺伝子増幅が挙げられる。突然変異は、ＥＧＦＲ遺伝子の任意の部分又はＥ
ＧＦＲ遺伝子に関連付けられる制御領域の任意の部分に位置していてもよく、エクソン１
８、１９、２０若しくは２１中の突然変異又はキナーゼドメイン中の突然変異が挙げられ
る。例示的な活性化ＥＧＦＲ突然変異としては、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意の
アミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５
Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍ置換、Ｅ７４６～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８
～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６～Ａ７６７間のＡｌａの挿入、Ｓ７６８～Ｖ７６９間のＳＶ
Ａ（Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ）の挿入及びＰ７７２～Ｈ７７３間のＮＳ（Ａｓｎ、Ｓｅｒ
）の挿入が挙げられる。ＥＧＦＲ活性化突然変異の他の例は、当該技術分野で既知である
（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７２０８３号を参照されたい）。受容体ホ
モ二量体及びヘテロ二量体、受容体リガンド、自己リン酸化部位、並びにＥｒｂＢ媒介シ
グナル伝達に関与しているシグナル伝達分子などの、ＥＧＦＲ及び他のＥｒｂＢ受容体に
関する情報は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｈｙｎｅｓ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ５：３４１～３５４，２００５を参照され
たい）。
ーゼ活性の上昇、受容体ホモ二量体及びヘテロ二量体の形成、リガンド結合の増大など、
ＥＧＦＲの少なくとも１つの生物学的活性の上昇を引き起こす点変異、欠失変異、挿入変
異、逆位又は遺伝子増幅が挙げられる。突然変異は、ＥＧＦＲ遺伝子の任意の部分又はＥ
ＧＦＲ遺伝子に関連付けられる制御領域の任意の部分に位置していてもよく、エクソン１
８、１９、２０若しくは２１中の突然変異又はキナーゼドメイン中の突然変異が挙げられ
る。例示的な活性化ＥＧＦＲ突然変異としては、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意の
アミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５
Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍ置換、Ｅ７４６～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８
～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６～Ａ７６７間のＡｌａの挿入、Ｓ７６８～Ｖ７６９間のＳＶ
Ａ（Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ）の挿入及びＰ７７２～Ｈ７７３間のＮＳ（Ａｓｎ、Ｓｅｒ
）の挿入が挙げられる。ＥＧＦＲ活性化突然変異の他の例は、当該技術分野で既知である
（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７２０８３号を参照されたい）。受容体ホ
モ二量体及びヘテロ二量体、受容体リガンド、自己リン酸化部位、並びにＥｒｂＢ媒介シ
グナル伝達に関与しているシグナル伝達分子などの、ＥＧＦＲ及び他のＥｒｂＢ受容体に
関する情報は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｈｙｎｅｓ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ５：３４１～３５４，２００５を参照され
たい）。
【0167】
例示的なｃ－Ｍｅｔ活性化突然変異としては、チロシンキナーゼ活性の上昇、受容体ホ
モ二量体及びヘテロ二量体の形成、リガンド結合の増大など、ｃ－Ｍｅｔタンパク質の少
なくとも１つの生物学的活性の上昇を引き起こす点変異、欠失変異、挿入変異、逆位又は
遺伝子増幅が挙げられる。突然変異は、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子の任意の位置、又は遺伝子に関
連付けられる調節領域にあり得、ｃ－Ｍｅｔキナーゼドメイン内での突然変異などがある
。例示的なｃ－Ｍｅｔ活性化突然変異は、残基位置Ｎ３７５、Ｖ１３、Ｖ９２３、Ｒ１７
５、Ｖ１３６、Ｌ２２９、Ｓ３２３、Ｒ９８８、Ｓ１０５８／Ｔ１０１０及びＥ１６８で
の突然変異である。ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ又は遺伝子増幅を検出する方法は、周知であ
る。
モ二量体及びヘテロ二量体の形成、リガンド結合の増大など、ｃ－Ｍｅｔタンパク質の少
なくとも１つの生物学的活性の上昇を引き起こす点変異、欠失変異、挿入変異、逆位又は
遺伝子増幅が挙げられる。突然変異は、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子の任意の位置、又は遺伝子に関
連付けられる調節領域にあり得、ｃ－Ｍｅｔキナーゼドメイン内での突然変異などがある
。例示的なｃ－Ｍｅｔ活性化突然変異は、残基位置Ｎ３７５、Ｖ１３、Ｖ９２３、Ｒ１７
５、Ｖ１３６、Ｌ２２９、Ｓ３２３、Ｒ９８８、Ｓ１０５８／Ｔ１０１０及びＥ１６８で
の突然変異である。ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ又は遺伝子増幅を検出する方法は、周知であ
る。
【0168】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインによって、治療を受けることができる例
示的な癌としては、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、
肺腺癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭
癌、鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌、
胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）が挙げら
れる。
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインによって、治療を受けることができる例
示的な癌としては、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、
肺腺癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭
癌、鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌、
胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）が挙げら
れる。
【0169】
ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合し、ＨＧＦとｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングする本発明
のＦＮ３ドメインは、癌及び良性腫瘍などの腫瘍の治療に用いてもよい。本発明のｃ－Ｍ
ｅｔ結合ＦＮ３ドメインによる治療を適用できる癌には、ｃ－Ｍｅｔを過剰発現するもの
も含まれる。本発明のＦＮ３ドメインによって治療を受けることのできる例示的な癌とし
ては、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、頭
頸部癌、卵巣癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、膣癌、子宮頚癌、脾臓癌、精巣癌、及
び胸腺癌などが挙げられる。
のＦＮ３ドメインは、癌及び良性腫瘍などの腫瘍の治療に用いてもよい。本発明のｃ－Ｍ
ｅｔ結合ＦＮ３ドメインによる治療を適用できる癌には、ｃ－Ｍｅｔを過剰発現するもの
も含まれる。本発明のＦＮ３ドメインによって治療を受けることのできる例示的な癌とし
ては、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、頭
頸部癌、卵巣癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、膣癌、子宮頚癌、脾臓癌、精巣癌、及
び胸腺癌などが挙げられる。
【0170】
ＥＧＦＲに特異的に結合し、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合をブロッキングする本発明のＦ
Ｎ３ドメインは、癌及び良性腫瘍などの腫瘍の治療に用いてもよい。本発明のＦＮ３ドメ
インによる治療を適用できる癌には、ＥＧＦＲ又は変異型を過剰発現するものも含まれる
。本発明のＦＮ３ドメインによって治療を受けることのできる例示的な癌としては、上皮
細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、卵
巣癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、膣癌、子宮頚癌、脾臓癌、精巣癌、及び胸腺癌な
どが挙げられる。
Ｎ３ドメインは、癌及び良性腫瘍などの腫瘍の治療に用いてもよい。本発明のＦＮ３ドメ
インによる治療を適用できる癌には、ＥＧＦＲ又は変異型を過剰発現するものも含まれる
。本発明のＦＮ３ドメインによって治療を受けることのできる例示的な癌としては、上皮
細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、卵
巣癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、膣癌、子宮頚癌、脾臓癌、精巣癌、及び胸腺癌な
どが挙げられる。
【0171】
本明細書に記載されたいくつかの方法においては、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－
Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ
３ドメインを使用して、１つ以上のＥＧＦＲ阻害物質での治療に対して耐性を示す又は耐
性を得た、癌を有する被験体の治療を行ってよい。癌に耐性を付与し得る例示的なＥＧＦ
Ｒ阻害剤としては、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（アービタックス（登録商標））、パニ
ツムマブ（ベクティビックス（登録商標））、マツズマブ、ニモツズマブ、低分子ＥＧＦ
Ｒ阻害剤タルセバ（登録商標）（エルロチニブ）、イレッサ（ゲフィチニブ）、ＥＫＢ－
５６９（ペリチニブ、不可逆的ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、ｐａｎ－ＥｒｂＢ及び他の受容体型
チロシンキナーゼ阻害剤ラパチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、ペリチニブ（ＥＧ
ＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、バンデタニブ（ＺＤ６４７４、ザクチマ（商標）、ＥＧＦＲ
、ＶＥＧＦＲ２及びＲＥＴ ＴＫＩ）、ＰＦ００２９９８０４（ダコミチニブ、不可逆的
ｐａｎ－ＥｒｂＢ ＴＫＩ）、ＣＩ－１０３３（不可逆的Ｐａｎ－ｅｒｂＢ ＴＫＩ）、
アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２、不可逆的ｐａｎ－ＥｒｂＢ ＴＫＩ）、ＡＶ－４１２
（二重ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ２阻害剤）ＥＸＥＬ－７６４７（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、Ｇ
ＥＶＧＲ及びＥｐｈＢ４阻害剤）、ＣＯ－１６８６（不可逆的な変異体選択ＥＧＦＲ Ｔ
ＫＩ）、ＡＺＤ９２９１（不可逆的な変異体選択ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、及びＨＫＩ－２７
２（ネラチニブ、不可逆性ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２阻害剤）が挙げられる。本明細書に記載
の方法は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ＣＯ－１６８６、ＡＺＤ９２９
１及び／又はセツキシマブを用いた治療への耐性を示す又は耐性を得た癌の治療に使用し
てもよい。使用できる例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分
子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号１８～
２９、１０７～１１０、１２２～１３７、１９４～２１１、３２～４９、１１１～１１４
、２１２～２２３、５０～７２、１０６、１１８～１２１、１３８～１６５、１７０～１
７８又は１９０～１９３に示すアミノ酸配列を有する、本明細書に記載のものである。
Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ
３ドメインを使用して、１つ以上のＥＧＦＲ阻害物質での治療に対して耐性を示す又は耐
性を得た、癌を有する被験体の治療を行ってよい。癌に耐性を付与し得る例示的なＥＧＦ
Ｒ阻害剤としては、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ（アービタックス（登録商標））、パニ
ツムマブ（ベクティビックス（登録商標））、マツズマブ、ニモツズマブ、低分子ＥＧＦ
Ｒ阻害剤タルセバ（登録商標）（エルロチニブ）、イレッサ（ゲフィチニブ）、ＥＫＢ－
５６９（ペリチニブ、不可逆的ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、ｐａｎ－ＥｒｂＢ及び他の受容体型
チロシンキナーゼ阻害剤ラパチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、ペリチニブ（ＥＧ
ＦＲ及びＨＥＲ２阻害剤）、バンデタニブ（ＺＤ６４７４、ザクチマ（商標）、ＥＧＦＲ
、ＶＥＧＦＲ２及びＲＥＴ ＴＫＩ）、ＰＦ００２９９８０４（ダコミチニブ、不可逆的
ｐａｎ－ＥｒｂＢ ＴＫＩ）、ＣＩ－１０３３（不可逆的Ｐａｎ－ｅｒｂＢ ＴＫＩ）、
アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２、不可逆的ｐａｎ－ＥｒｂＢ ＴＫＩ）、ＡＶ－４１２
（二重ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ２阻害剤）ＥＸＥＬ－７６４７（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、Ｇ
ＥＶＧＲ及びＥｐｈＢ４阻害剤）、ＣＯ－１６８６（不可逆的な変異体選択ＥＧＦＲ Ｔ
ＫＩ）、ＡＺＤ９２９１（不可逆的な変異体選択ＥＧＦＲ ＴＫＩ）、及びＨＫＩ－２７
２（ネラチニブ、不可逆性ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２阻害剤）が挙げられる。本明細書に記載
の方法は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ＣＯ－１６８６、ＡＺＤ９２９
１及び／又はセツキシマブを用いた治療への耐性を示す又は耐性を得た癌の治療に使用し
てもよい。使用できる例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分
子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号１８～
２９、１０７～１１０、１２２～１３７、１９４～２１１、３２～４９、１１１～１１４
、２１２～２２３、５０～７２、１０６、１１８～１２１、１３８～１６５、１７０～１
７８又は１９０～１９３に示すアミノ酸配列を有する、本明細書に記載のものである。
【0172】
本発明の別の態様は、治療的に有効な量の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ド
メイン含有分子、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメイン又はＥＧＦＲと特異的に
結合するＦＮ３ドメインを癌の治療に十分な時間にわたって、その必要のある患者に投与
することを含む、癌を有する被験体を治療する方法であり、該被験体は、エルロチニブ、
ゲフィチニブ、アファチニブ、ＣＯ－１６８６（ＣＡＳ番号：１３７４６４０－７０－６
）、ＡＺＤ９２９１又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示す又は耐性を得てい
る。
メイン含有分子、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメイン又はＥＧＦＲと特異的に
結合するＦＮ３ドメインを癌の治療に十分な時間にわたって、その必要のある患者に投与
することを含む、癌を有する被験体を治療する方法であり、該被験体は、エルロチニブ、
ゲフィチニブ、アファチニブ、ＣＯ－１６８６（ＣＡＳ番号：１３７４６４０－７０－６
）、ＡＺＤ９２９１又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示す又は耐性を得てい
る。
【0173】
様々な定性的及び／又は定量的方法を使用して、ＥＧＦＲ阻害剤による治療に対して、
患者が耐性を示しているかどうか、耐性を発達させているかどうか、又は耐性が発達しや
すいかどうかなどを判断してもよい。ＥＧＦＲ阻害剤への耐性に関連があり得る症状とし
ては、例えば、患者の健康状態の低下又は横ばい状態、腫瘍の大きさの増加、腫瘍増殖低
下の抑制又は減速、及び／又は１つの部位から他の器官、組織又は細胞への、身体内にお
ける癌細胞の伝播が挙げられる。また、食欲不振、認知機能障害、鬱病、呼吸困難、疲労
、ホルモン障害、好中球減少、疼痛、末梢神経障害と性的機能不全など、癌に関連する種
々の症状の再発又は悪化は、ＥＧＦＲ阻害剤に対して、被験体が耐性を発達させたか、又
は発達させやすいこと示し得る。癌に関連する症状は、癌の種類によって異なる。例えば
、子宮頸癌に伴う症状としては、異常出血、異常な大量の膣分泌物、正常な月経周期に関
連がない骨盤痛、膀胱痛又は排尿時の痛み及び規則的な月経期間での出血、性交、腟洗浄
又は内診後の出血を挙げることができる。肺癌に伴う症状としては、持続性の咳、喀血、
息切れ、喘鳴、胸痛、食欲不振、努力することのない体重減少、及び疲労を挙げることが
できる。肝臓癌の症状としては、食欲及び体重の低下、腹痛（特に腹部の上部右部におけ
るもの、背部と肩に広がる場合もある）、悪心及び嘔吐、全身の虚弱と疲労、肝臓肥大、
腹部膨満（腹水）、並びに皮膚及び白目の黄変（黄疸）を挙げることができる。腫瘍学分
野の当業者は、特定の癌種に伴う症状を容易に識別し得る。
患者が耐性を示しているかどうか、耐性を発達させているかどうか、又は耐性が発達しや
すいかどうかなどを判断してもよい。ＥＧＦＲ阻害剤への耐性に関連があり得る症状とし
ては、例えば、患者の健康状態の低下又は横ばい状態、腫瘍の大きさの増加、腫瘍増殖低
下の抑制又は減速、及び／又は１つの部位から他の器官、組織又は細胞への、身体内にお
ける癌細胞の伝播が挙げられる。また、食欲不振、認知機能障害、鬱病、呼吸困難、疲労
、ホルモン障害、好中球減少、疼痛、末梢神経障害と性的機能不全など、癌に関連する種
々の症状の再発又は悪化は、ＥＧＦＲ阻害剤に対して、被験体が耐性を発達させたか、又
は発達させやすいこと示し得る。癌に関連する症状は、癌の種類によって異なる。例えば
、子宮頸癌に伴う症状としては、異常出血、異常な大量の膣分泌物、正常な月経周期に関
連がない骨盤痛、膀胱痛又は排尿時の痛み及び規則的な月経期間での出血、性交、腟洗浄
又は内診後の出血を挙げることができる。肺癌に伴う症状としては、持続性の咳、喀血、
息切れ、喘鳴、胸痛、食欲不振、努力することのない体重減少、及び疲労を挙げることが
できる。肝臓癌の症状としては、食欲及び体重の低下、腹痛（特に腹部の上部右部におけ
るもの、背部と肩に広がる場合もある）、悪心及び嘔吐、全身の虚弱と疲労、肝臓肥大、
腹部膨満（腹水）、並びに皮膚及び白目の黄変（黄疸）を挙げることができる。腫瘍学分
野の当業者は、特定の癌種に伴う症状を容易に識別し得る。
【0174】
ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性を被験体が発達したか否かを判断するその他の方法として
は、癌細胞中におけるＥＧＦＲリン酸化、ＥＲＫ１／２リン酸化及び／又はＡＫＴリン酸
化を調べることが挙げられ、ここで、リン酸化の増加は、ＥＧＦＲ阻害剤に対して、被験
体が耐性を発達させたか、又は発達させやすいことを示し得る。ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２
及び／又はＡＫＴのリン酸化を判定する方法は、周知であり、かつ、本明細書に記述され
ている。ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性が発達した被験体の識別には、例えば、ＨＧＦ循環
レベルの上昇、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子活性化変異又はｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅に起因するｃ－Ｍ
ｅｔ発現レベルの上昇又はｃ－Ｍｅｔ活性の上昇の検出を含み得る。
は、癌細胞中におけるＥＧＦＲリン酸化、ＥＲＫ１／２リン酸化及び／又はＡＫＴリン酸
化を調べることが挙げられ、ここで、リン酸化の増加は、ＥＧＦＲ阻害剤に対して、被験
体が耐性を発達させたか、又は発達させやすいことを示し得る。ＥＧＦＲ、ＥＲＫ１／２
及び／又はＡＫＴのリン酸化を判定する方法は、周知であり、かつ、本明細書に記述され
ている。ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性が発達した被験体の識別には、例えば、ＨＧＦ循環
レベルの上昇、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子活性化変異又はｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅に起因するｃ－Ｍ
ｅｔ発現レベルの上昇又はｃ－Ｍｅｔ活性の上昇の検出を含み得る。
【0175】
本発明の別の実施形態は、治療的に有効な量の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインを患者に投与することを含む、ＥＧＦＲ活性化突然変異又はＥＧＦＲ遺伝子増幅を
有するＮＳＣＬＣ腫瘍又は腫瘍転移を有する患者における、ＮＳＣＬＣを治療する方法で
ある。
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインを患者に投与することを含む、ＥＧＦＲ活性化突然変異又はＥＧＦＲ遺伝子増幅を
有するＮＳＣＬＣ腫瘍又は腫瘍転移を有する患者における、ＮＳＣＬＣを治療する方法で
ある。
【0176】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを使用して、扁平上皮細胞癌、腺癌及び
大細胞癌を含む非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療を行うことができる。いくつかの実施
形態では、ＮＳＣＬＣの細胞は、上皮表現型を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳＣ
ＬＣは、１つ以上のＥＧＦＲ阻害剤での治療に対する耐性を獲得している。
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを使用して、扁平上皮細胞癌、腺癌及び
大細胞癌を含む非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療を行うことができる。いくつかの実施
形態では、ＮＳＣＬＣの細胞は、上皮表現型を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳＣ
ＬＣは、１つ以上のＥＧＦＲ阻害剤での治療に対する耐性を獲得している。
【0177】
ＮＳＣＬＣでは、ＥＧＦＲ遺伝子中の特定の突然変異は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻
害剤（ＥＧＦＲ－ＴＫＩ）に対する高い応答率（７０～８０％）と関連している。エクソ
ン１９における５個のアミノ酸欠失又はＥＧＦＲにおけるＬ８５８Ｒの点変異は、ＥＧＦ
Ｒ－ＴＫＩの感応性に関連がある（Ｎａｋａｔａ ａｎｄ Ｇｏｔｏｈ，Ｅｘｐｅｒｔ
Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ １６：７７１～７８１，２０１２）。これらの突
然変異により、ＥＧＦＲキナーゼ活性のリガンド非依存性活性化がもたらされる。ＥＧＦ
Ｒ活性突然変異は、ＮＳＣＬＣ患者の１０～３０％に発生し、東アジア人、女性、非喫煙
者及び腺癌組織像を有する患者において、有意によく見られる（Ｊａｎｎｅ ａｎｄ Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２（１４ Ｓｕｐｐｌ）：４４１６
ｓ～４４２０ｓ，２００６）。また、ＥＧＦＲ遺伝子増幅は、ＥＧＦＲ－ＴＫＩ治療後の
応答と強く相関している（Ｃａｐｐｕｚｚｏら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ
９７：６４３～５５，２００５）。
害剤（ＥＧＦＲ－ＴＫＩ）に対する高い応答率（７０～８０％）と関連している。エクソ
ン１９における５個のアミノ酸欠失又はＥＧＦＲにおけるＬ８５８Ｒの点変異は、ＥＧＦ
Ｒ－ＴＫＩの感応性に関連がある（Ｎａｋａｔａ ａｎｄ Ｇｏｔｏｈ，Ｅｘｐｅｒｔ
Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ １６：７７１～７８１，２０１２）。これらの突
然変異により、ＥＧＦＲキナーゼ活性のリガンド非依存性活性化がもたらされる。ＥＧＦ
Ｒ活性突然変異は、ＮＳＣＬＣ患者の１０～３０％に発生し、東アジア人、女性、非喫煙
者及び腺癌組織像を有する患者において、有意によく見られる（Ｊａｎｎｅ ａｎｄ Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２（１４ Ｓｕｐｐｌ）：４４１６
ｓ～４４２０ｓ，２００６）。また、ＥＧＦＲ遺伝子増幅は、ＥＧＦＲ－ＴＫＩ治療後の
応答と強く相関している（Ｃａｐｐｕｚｚｏら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ
９７：６４３～５５，２００５）。
【0178】
ＥＧＦＲ突然変異を有する多くのＮＳＣＬＣ患者は、初期に、ＥＧＦＲ ＴＫＩ療法に
応答を示すが、事実上、全てが、持続的反応を妨げる耐性を獲得する。患者の５０～６０
％は、ＥＧＦＲのキナーゼドメイン（Ｔ７９０Ｍ）の第２位での点変異により、耐性を獲
得する。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害物質に対して耐性を示すようになる全腫瘍のほぼ
６０％がｃ－Ｍｅｔの発現の増加、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子の増幅、又はその唯一の既知のリガ
ンドであるＨＧＦの増加を示す（Ｔｕｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１７：７７～
８８，２０１０）。
応答を示すが、事実上、全てが、持続的反応を妨げる耐性を獲得する。患者の５０～６０
％は、ＥＧＦＲのキナーゼドメイン（Ｔ７９０Ｍ）の第２位での点変異により、耐性を獲
得する。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害物質に対して耐性を示すようになる全腫瘍のほぼ
６０％がｃ－Ｍｅｔの発現の増加、ｃ－Ｍｅｔ遺伝子の増幅、又はその唯一の既知のリガ
ンドであるＨＧＦの増加を示す（Ｔｕｒｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，１７：７７～
８８，２０１０）。
【0179】
本発明の別の実施形態は、治療的に有効な量の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインを、癌の治療に十分な時間にわたって、それを必要とする患者に投与することを含
む、癌を有する患者を治療する方法であり、該癌は、ＥＧＦＲ活性化突然変異、ＥＧＦＲ
遺伝子増幅、ｃ－Ｍｅｔ活性化突然変異又はｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅と関連がある。
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインを、癌の治療に十分な時間にわたって、それを必要とする患者に投与することを含
む、癌を有する患者を治療する方法であり、該癌は、ＥＧＦＲ活性化突然変異、ＥＧＦＲ
遺伝子増幅、ｃ－Ｍｅｔ活性化突然変異又はｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅と関連がある。
【0180】
いくつかの実施形態では、前記ＥＧＦＲ活性化突然変異は、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（
Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６
Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ
７９０Ｍの置換、Ｅ７４６～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６～Ａ
７６７間のＡｌａ（Ａ）の挿入、Ｓ７６８～Ｖ７６９間のＳｅｒ、Ｖａｌ及びＡｌａ（Ｓ
ＶＡ）の挿入、並びにＰ７７２～Ｈ７７３間のＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入である。
Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６
Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ
７９０Ｍの置換、Ｅ７４６～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６～Ａ
７６７間のＡｌａ（Ａ）の挿入、Ｓ７６８～Ｖ７６９間のＳｅｒ、Ｖａｌ及びＡｌａ（Ｓ
ＶＡ）の挿入、並びにＰ７７２～Ｈ７７３間のＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入である。
【0181】
本発明の別の実施形態は、治療的に有効な量の本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインを、癌の治療に十分な時間にわたって、それを必要とする患者に投与することを含
む、癌を有する患者を治療する方法であり、該癌は、ＥＧＦＲ突然変異Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７
９０Ｍ、若しくは残基Ｅ７４６～Ａ７５０（ｄｅｌ（Ｅ７４６、Ａ７５０））、ＥＧＦＲ
増幅又はｃ－Ｍｅｔ増幅と関連がある。
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインを、癌の治療に十分な時間にわたって、それを必要とする患者に投与することを含
む、癌を有する患者を治療する方法であり、該癌は、ＥＧＦＲ突然変異Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７
９０Ｍ、若しくは残基Ｅ７４６～Ａ７５０（ｄｅｌ（Ｅ７４６、Ａ７５０））、ＥＧＦＲ
増幅又はｃ－Ｍｅｔ増幅と関連がある。
【0182】
いくつかの実施形態において、癌は、野生型ＥＧＦＲ及び野生型ｃ－Ｍｅｔと関連があ
る。
る。
【0183】
いくつかの実施形態において、癌は、野生型ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ増幅と関連がある
。
。
【0184】
いくつかの実施形態において、癌は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ及びＴ７９０Ｍ突然変異並
びに野生型ｃ－Ｍｅｔと関連がある。
びに野生型ｃ－Ｍｅｔと関連がある。
【0185】
いくつかの実施形態において、癌は、ＥＧＦＲＬ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４、Ａ７５０）及
び野生型ｃ－Ｍｅｔと関連がある。
び野生型ｃ－Ｍｅｔと関連がある。
【0186】
いくつかの実施形態において、癌は、ＥＧＦＲＬ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４、Ａ７５０）及
びｃ－Ｍｅｔ増幅と関連がある。
びｃ－Ｍｅｔ増幅と関連がある。
【0187】
いくつかの実施形態において、癌は、ＥＧＦＲ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４、Ａ７５０）、Ｅ
ＧＦＲ増幅及びｃ－Ｍｅｔ増幅と関連がある。
ＧＦＲ増幅及びｃ－Ｍｅｔ増幅と関連がある。
【0188】
いくつかの実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ及びＴ７９０Ｍ突然変異
並びに野生型ｃ－Ｍｅｔと関連があるＮＳＣＬＣを有する。
並びに野生型ｃ－Ｍｅｔと関連があるＮＳＣＬＣを有する。
【0189】
いくつかの実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ増幅及び野生型ｃ－Ｍｅｔと関連があ
るＮＳＣＬＣを有する。
るＮＳＣＬＣを有する。
【0190】
いくつかの実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ増幅及びｃ－Ｍｅｔ増幅と関連がある
ＮＳＣＬＣを有する。
ＮＳＣＬＣを有する。
【0191】
いくつかの実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４、Ａ７５０）及
び野生型ｃ－Ｍｅｔと関連があるＮＳＣＬＣを有する。
び野生型ｃ－Ｍｅｔと関連があるＮＳＣＬＣを有する。
【0192】
いくつかの実施形態において、患者は、ＥＧＦＲ欠失ｄｅｌ（Ｅ７６４、Ａ７５０）及
びｃ－Ｍｅｔ増幅と関連があるＮＳＣＬＣを有する。ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔの増幅は、
例えば、サザンブロット法、ＦＩＳＨ法、又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧ
Ｈ）法によって、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ遺伝子のコピー数を測定することなどの、標準
的な方法によって評価することができる。
びｃ－Ｍｅｔ増幅と関連があるＮＳＣＬＣを有する。ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔの増幅は、
例えば、サザンブロット法、ＦＩＳＨ法、又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧ
Ｈ）法によって、ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ遺伝子のコピー数を測定することなどの、標準
的な方法によって評価することができる。
【0193】
用語「治療する」又は「治療」は、治療的処置及び保護的又は予防的措置のいずれをも
指し、その目的は、癌の成長又は伝播など、望ましくない生理学的変化又は障害を予防す
る又は遅らせる（軽減する）ことである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床
結果には、以下に限定されないが、症状の緩和、疾患範囲の減少、疾患の安定（すなわち
、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は減速、病態の改善又は緩和、及び寛解（部分、
又は、全体）などが、検出可能か又は検出不可能であるかにかかわらず、含まれる。「治
療」は、また、未治療の場合の予想生存期間と比較して、生存期間の延長を意味し得る。
治療が必要な対象としては、これらの状態若しくは障害をすでに有する対象、及びこれら
の状態若しくは障害を有する傾向にある対象、又はこれらの状態若しくは障害を予防すべ
き対象が挙げられる。
指し、その目的は、癌の成長又は伝播など、望ましくない生理学的変化又は障害を予防す
る又は遅らせる（軽減する）ことである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床
結果には、以下に限定されないが、症状の緩和、疾患範囲の減少、疾患の安定（すなわち
、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は減速、病態の改善又は緩和、及び寛解（部分、
又は、全体）などが、検出可能か又は検出不可能であるかにかかわらず、含まれる。「治
療」は、また、未治療の場合の予想生存期間と比較して、生存期間の延長を意味し得る。
治療が必要な対象としては、これらの状態若しくは障害をすでに有する対象、及びこれら
の状態若しくは障害を有する傾向にある対象、又はこれらの状態若しくは障害を予防すべ
き対象が挙げられる。
【0194】
「治療的に有効な量」は、望む治療結果を達成するために、必要な用量、時間で、効果
的な量を意味する。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの治療的に有効な量は
、病態、年齢、性別及び個体重量、並びに個体において、所望の応答を引き出す本発明の
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイ
ン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの性能などの因子によって異なり得る。耐性と関連
して、減少又は低下し得る有効なＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ治療を示すものの例としては、患
者の健康状態の改善、腫瘍の大きさの減少又は収縮、腫瘍増殖の抑制又は減速、及び／又
は身体内の他の位置への癌細胞転移の欠如が挙げられる。
的な量を意味する。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子
、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの治療的に有効な量は
、病態、年齢、性別及び個体重量、並びに個体において、所望の応答を引き出す本発明の
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイ
ン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの性能などの因子によって異なり得る。耐性と関連
して、減少又は低下し得る有効なＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ治療を示すものの例としては、患
者の健康状態の改善、腫瘍の大きさの減少又は収縮、腫瘍増殖の抑制又は減速、及び／又
は身体内の他の位置への癌細胞転移の欠如が挙げられる。
【0195】
投与／医薬組成物
本発明は、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧ
ＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び製薬上許容できる担体で
ある医薬組成物を提供する。治療に使用するために、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－
Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ
３ドメインは、製薬上許容できる担体中において、有効成分として有効量の前記ドメイン
又は分子を含む医薬組成物として、調製することができる。「担体」という用語は、活性
化合物と共に投与する希釈剤、補助剤、賦形剤又はビヒクルのことを指す。かかるビヒク
ルは、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成物由来の
ものを含む、水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３
％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌液であり、一般的に、粒子状物質
を含まない。これらは、従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することが
できる。この組成物は、生理学的条件におおよそ近づけるために必要とされる製薬上許容
できる補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤な
どを含むことができる。かかる医薬製剤中の本発明の分子の濃度は広範囲にわたって様々
であってよく、すなわち約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％～１５又は２
０重量％までであってよく、また、選択される特定の投与方法にしたがって、主として必
要とされる用量、液体の体積、粘度などに基づいて選択される。好適なビヒクル及び製剤
（他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ
，２１st Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａ
ｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１
～１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８～９８９を参照されたい。
本発明は、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧ
ＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び製薬上許容できる担体で
ある医薬組成物を提供する。治療に使用するために、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－
Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ
３ドメインは、製薬上許容できる担体中において、有効成分として有効量の前記ドメイン
又は分子を含む医薬組成物として、調製することができる。「担体」という用語は、活性
化合物と共に投与する希釈剤、補助剤、賦形剤又はビヒクルのことを指す。かかるビヒク
ルは、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成物由来の
ものを含む、水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３
％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌液であり、一般的に、粒子状物質
を含まない。これらは、従来の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することが
できる。この組成物は、生理学的条件におおよそ近づけるために必要とされる製薬上許容
できる補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤な
どを含むことができる。かかる医薬製剤中の本発明の分子の濃度は広範囲にわたって様々
であってよく、すなわち約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％～１５又は２
０重量％までであってよく、また、選択される特定の投与方法にしたがって、主として必
要とされる用量、液体の体積、粘度などに基づいて選択される。好適なビヒクル及び製剤
（他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ
，２１st Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａ
ｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１
～１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８～９８９を参照されたい。
【0196】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの治療的使用のための投与方法は、宿主
に薬剤を送達する、任意の好適な投与法であってよく、タブレット、カプセル、溶液、粉
末、ゲル、粒子内の製剤；シリンジ、埋め込みデバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、
マイクロポンプに収容された製剤を使用した；又は当該技術分野で周知の、当業者には理
解される他の手段を使用した、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若
しくは皮下、肺；経粘膜的（経口、鼻腔内、膣内、直腸）投与；などがある。部位特異的
投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳
室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、
前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内
、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され
得る。
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの治療的使用のための投与方法は、宿主
に薬剤を送達する、任意の好適な投与法であってよく、タブレット、カプセル、溶液、粉
末、ゲル、粒子内の製剤；シリンジ、埋め込みデバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、
マイクロポンプに収容された製剤を使用した；又は当該技術分野で周知の、当業者には理
解される他の手段を使用した、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若
しくは皮下、肺；経粘膜的（経口、鼻腔内、膣内、直腸）投与；などがある。部位特異的
投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳
室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、
前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内
、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され
得る。
【0197】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎ
ｇ～約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ～約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ～約２
５ｍｇの本発明のＦＮ３ドメインを含有するように調製することができる。
ｇ～約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ～約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ～約２
５ｍｇの本発明のＦＮ３ドメインを含有するように調製することができる。
【0198】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、例えば、静脈内（ＩＶ）注入、ボー
ラス注入、筋肉内又は皮下若しくは腹膜腔注入などの非経口注入など、任意の好適な経路
によって、患者に投与され得る。ＩＶ注入は、１５分間ほどで投与し得るが、多くの場合
、３０分間、６０分間、９０分間、又は２時間若しくは３時間、投与することもできる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ
３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、疾患部位（例えば、腫瘍自体）に直接
注入してもよい。癌を有する患者への投与量は、治療対象の疾患を軽減する又は少なくと
も一部、阻止するために十分な量であり（「治療的に有効な量」）、０．１～１０ｍｇ／
ｋｇ体重、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇ体重であっ
てもよいが、更に多量、例えば、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９
０又は１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。固定単位用量（例えば、５０、１００、２
００、５００若しくは１０００ｍｇ）を投与してもよく、又はこの用量は、患者の表面積
に基づいて、例えば、４００、３００、２５０、２００若しくは１００ｍｇ／ｍ2であっ
てもよい。癌治療には、通常、１～８回の用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７又
は８回）を投与してもよいが、しかし、１０、１２、２０回以上の用量を投与してもよい
。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの投与は、１日、２日、３日、４日、５
日、６日、１週、２週、３週、１ヵ月、５週、６週、７週、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５
ヵ月、６ヵ月、又はそれ以上経過後、反復して行ってもよい。長期投与と同様に、治療コ
ースを繰返し行うことも可能である。反復投与は、同じ用量で行っても、異なる用量で行
ってもよい。
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、例えば、静脈内（ＩＶ）注入、ボー
ラス注入、筋肉内又は皮下若しくは腹膜腔注入などの非経口注入など、任意の好適な経路
によって、患者に投与され得る。ＩＶ注入は、１５分間ほどで投与し得るが、多くの場合
、３０分間、６０分間、９０分間、又は２時間若しくは３時間、投与することもできる。
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ
３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、疾患部位（例えば、腫瘍自体）に直接
注入してもよい。癌を有する患者への投与量は、治療対象の疾患を軽減する又は少なくと
も一部、阻止するために十分な量であり（「治療的に有効な量」）、０．１～１０ｍｇ／
ｋｇ体重、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇ体重であっ
てもよいが、更に多量、例えば、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９
０又は１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。固定単位用量（例えば、５０、１００、２
００、５００若しくは１０００ｍｇ）を投与してもよく、又はこの用量は、患者の表面積
に基づいて、例えば、４００、３００、２５０、２００若しくは１００ｍｇ／ｍ2であっ
てもよい。癌治療には、通常、１～８回の用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７又
は８回）を投与してもよいが、しかし、１０、１２、２０回以上の用量を投与してもよい
。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの投与は、１日、２日、３日、４日、５
日、６日、１週、２週、３週、１ヵ月、５週、６週、７週、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５
ヵ月、６ヵ月、又はそれ以上経過後、反復して行ってもよい。長期投与と同様に、治療コ
ースを繰返し行うことも可能である。反復投与は、同じ用量で行っても、異なる用量で行
ってもよい。
【0199】
例えば、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦ
Ｒ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの静脈内注射用医薬組成物は、
８０ｋｇの患者に投与するために、滅菌リンガー溶液約２００ｍＬ、及び二重特異性ＥＧ
ＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体約８ｍｇ～約２４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約１６００ｍｇ又は約
４００ｍｇ～約８００ｍｇを含むように、構成してもよい。非経口的に投与可能な組成物
を調製する方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に、より詳細に記載されている。
Ｒ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの静脈内注射用医薬組成物は、
８０ｋｇの患者に投与するために、滅菌リンガー溶液約２００ｍＬ、及び二重特異性ＥＧ
ＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ抗体約８ｍｇ～約２４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約１６００ｍｇ又は約
４００ｍｇ～約８００ｍｇを含むように、構成してもよい。非経口的に投与可能な組成物
を調製する方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に、より詳細に記載されている。
【0200】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、保管のために凍結乾燥され、かつ、
使用前に好適な担体中で再構成されてもよい。この技術は従来のタンパクの調製において
有効であることが示されており、周知の凍結乾燥と再構成の技術を援用することができる
。
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、保管のために凍結乾燥され、かつ、
使用前に好適な担体中で再構成されてもよい。この技術は従来のタンパクの調製において
有効であることが示されており、周知の凍結乾燥と再構成の技術を援用することができる
。
【0201】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、被験体に単回投与してもよく、又は
、例えば、１日、２日、３日、５日、６日、１週、２週、３週、１ヵ月、５週、６週、７
週、２ヵ月又は３ヵ月経過後、反復投与してもよい。反復投与は、同じ用量で、又は異な
る用量で行ってもよい。投与は１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回
、１０回以上反復して行うことができる。
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、被験体に単回投与してもよく、又は
、例えば、１日、２日、３日、５日、６日、１週、２週、３週、１ヵ月、５週、６週、７
週、２ヵ月又は３ヵ月経過後、反復投与してもよい。反復投与は、同じ用量で、又は異な
る用量で行ってもよい。投与は１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回
、１０回以上反復して行うことができる。
【0202】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、第２の治療薬と併用して、同時に、
逐次的に又は別途に投与されてもよい。第２の治療薬は、化学療法剤、抗血管新生阻害剤
又は細胞毒性薬であってもよい。癌治療に使用するとき、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインは、外科手術、放射線療法、化学療法又はこれらの組み合わせなど、従来の癌治療
と組み合わせて使用することもできる。本発明のＦＮ３ドメインと組み合わせて使用でき
る例示的な薬剤は、アンタゴニストＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦ及びイレッ
サ（登録商標）（ゲフィチニブ）及びＴａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）などのタンパク質
チロシンキナーゼ阻害剤である。
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、第２の治療薬と併用して、同時に、
逐次的に又は別途に投与されてもよい。第２の治療薬は、化学療法剤、抗血管新生阻害剤
又は細胞毒性薬であってもよい。癌治療に使用するとき、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインは、外科手術、放射線療法、化学療法又はこれらの組み合わせなど、従来の癌治療
と組み合わせて使用することもできる。本発明のＦＮ３ドメインと組み合わせて使用でき
る例示的な薬剤は、アンタゴニストＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦ及びイレッ
サ（登録商標）（ゲフィチニブ）及びＴａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）などのタンパク質
チロシンキナーゼ阻害剤である。
【0203】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメ
イン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、同業者に既知の化学療法剤又は他の抗癌治療
剤のいずれか１つ以上と共に投与してもよい。化学療法剤は、癌治療に有用な化学物質で
あり、増殖阻害剤又は他の細胞毒性剤が挙げられ、また、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗
微小管阻害薬、トポイソメラーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、血管形成阻害
剤が挙げられる。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる；アルキル化剤（例えばチ
オテパとシクロホスファミド（サイトキサン（登録商標）））；スルホン酸アルキル、例
えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾ
ドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパ；エチレンイミン及びメチラメラミン、例
えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレン
チオホスホラミド及びトリメチロメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラ
ムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド
、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フ
ェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ
尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、
及びラニムヌスチン；抗生物質（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オー
スラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリ
チアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロ
モマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキ
ソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、
マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシ
ン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラ
マイシン、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツ
ベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）代謝拮抗薬、例えばメトトレキ
セート及び５－ＦＵ；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテ
リン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリ
ン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチ
ジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフル
リジン、エノシタビン、フロキシウリジン）；アンドロゲン（例えばカルステロン、プロ
ピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；
抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；葉酸補充剤、例え
ば、フォリン酸（frolinic acid）；アセグラトン；アルドホスファミドグルコシド；ア
ミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ed
atraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクォン；エフロール
ニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）；エトグルシド
；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサン
トロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；
ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキ
サン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，
２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムス
チン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；
アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類又はタキ
サンファミリのメンバー、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）ドセタキセル
（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））及びその類似体；クロラムブシル；ゲムシタビン；６
－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ類似体、例えば、シス
プラチンとカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ－１６）；イ
ホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；
ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ（
xeloda）；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００
；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシ
タビン；受容体チロシンキナーゼ阻害剤及び／又は血管形成阻害剤、例えば、ソラフェニ
ブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、パゾパ
ニブ（ＶＯＴＲＩＥＮＴ（商標））、トセラニブ（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（商標））、バンデ
タニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（商標））、セディラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（登録商標））、
レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３－４５０６）、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、レスト
ールチニブ（ＣＥＰ－７０１）、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ゲフィチニブ
（ＩＲＥＳＳＡ（商標））、ＢＩＢＷ ２９９２（ＴＯＶＯＫ（商標））、ラパチニブ（
ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、ネラチニブ（ＨＫＩ－２７２）など、及び上記のいずれか
の製薬上許容できる塩、酸又は誘導体。この定義にも含まれるものとしては、腫瘍上での
ホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗エストロゲンなどの抗ホルモン剤が挙
げられ、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダ
ゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（keoxifen
e）、ＬＹ １１７０１８、オナプリストンとトレミフェン（フェアストン（登録商標）
；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドとゴセ
レリン；上記のいずれかの製薬上許容できる塩、酸又は誘導体が挙げられる。Ｗｉｅｍａ
ｎｎら、１９８５，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ｅ
ｔ ａＬ，ｅｄｓ．），Ｃｈａｐｔｅｒ １０，ＭｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ，に開示されているような他の従来の細胞毒性化学物質は、また、本発明の方法に適用
できる。
イン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、同業者に既知の化学療法剤又は他の抗癌治療
剤のいずれか１つ以上と共に投与してもよい。化学療法剤は、癌治療に有用な化学物質で
あり、増殖阻害剤又は他の細胞毒性剤が挙げられ、また、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗
微小管阻害薬、トポイソメラーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、血管形成阻害
剤が挙げられる。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる；アルキル化剤（例えばチ
オテパとシクロホスファミド（サイトキサン（登録商標）））；スルホン酸アルキル、例
えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾ
ドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパ；エチレンイミン及びメチラメラミン、例
えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレン
チオホスホラミド及びトリメチロメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラ
ムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド
、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フ
ェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ
尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、
及びラニムヌスチン；抗生物質（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オー
スラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリ
チアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロ
モマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキ
ソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、
マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシ
ン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラ
マイシン、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツ
ベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）代謝拮抗薬、例えばメトトレキ
セート及び５－ＦＵ；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテ
リン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリ
ン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチ
ジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフル
リジン、エノシタビン、フロキシウリジン）；アンドロゲン（例えばカルステロン、プロ
ピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；
抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；葉酸補充剤、例え
ば、フォリン酸（frolinic acid）；アセグラトン；アルドホスファミドグルコシド；ア
ミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ed
atraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクォン；エフロール
ニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）；エトグルシド
；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサン
トロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；
ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキ
サン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，
２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムス
チン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；
アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類又はタキ
サンファミリのメンバー、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）ドセタキセル
（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））及びその類似体；クロラムブシル；ゲムシタビン；６
－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ類似体、例えば、シス
プラチンとカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ－１６）；イ
ホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；
ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ（
xeloda）；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００
；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシ
タビン；受容体チロシンキナーゼ阻害剤及び／又は血管形成阻害剤、例えば、ソラフェニ
ブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））、パゾパ
ニブ（ＶＯＴＲＩＥＮＴ（商標））、トセラニブ（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（商標））、バンデ
タニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（商標））、セディラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（登録商標））、
レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３－４５０６）、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、レスト
ールチニブ（ＣＥＰ－７０１）、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ゲフィチニブ
（ＩＲＥＳＳＡ（商標））、ＢＩＢＷ ２９９２（ＴＯＶＯＫ（商標））、ラパチニブ（
ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、ネラチニブ（ＨＫＩ－２７２）など、及び上記のいずれか
の製薬上許容できる塩、酸又は誘導体。この定義にも含まれるものとしては、腫瘍上での
ホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗エストロゲンなどの抗ホルモン剤が挙
げられ、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダ
ゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（keoxifen
e）、ＬＹ １１７０１８、オナプリストンとトレミフェン（フェアストン（登録商標）
；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドとゴセ
レリン；上記のいずれかの製薬上許容できる塩、酸又は誘導体が挙げられる。Ｗｉｅｍａ
ｎｎら、１９８５，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ｅ
ｔ ａＬ，ｅｄｓ．），Ｃｈａｐｔｅｒ １０，ＭｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ，に開示されているような他の従来の細胞毒性化学物質は、また、本発明の方法に適用
できる。
【0204】
前記二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３
ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと組み合わせて使用できる例示的な薬剤とし
ては、イレッサ（登録商標）（ゲフィチニブ）、タルセバ（エルロチニブ）などのチロシ
ンキナーゼ阻害剤及び標的抗癌治療剤及びＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４又はＶＥＧＦな
どの他のアンタゴニストが挙げられる。例示的なＨＥＲ２アンタゴニストとしては、ＣＰ
－７２４－７１４、ハーセプチン（商標）（トラスツズマブ）、オムニターグ（ＯＭＮＩ
ＴＡＲＧ）（商標）（ペルツズマブ）、ＴＡＫ－１６５、ラパチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥ
Ｒ２阻害剤）、及びＧＷ－２８２９７４が挙げられる。例示的なＨＥＲ３アンタゴニスト
としては、抗－Ｈｅｒ３抗体が挙げられる（例えば、米国特許第２００４／０１９７３３
２号を参照されたい）。例示的なＨＥＲ４アンタゴニストとしては、抗－ＨＥＲ４ ｓｉ
ＲＮＡが挙げられる（例えば、Ｍａａｔｔａら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １７：６
７～７９，２００６を参照されたい）。例示的なＶＥＧＦアンタゴニストは、ベバシズマ
ブ（アバスチン（商標））である。
ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと組み合わせて使用できる例示的な薬剤とし
ては、イレッサ（登録商標）（ゲフィチニブ）、タルセバ（エルロチニブ）などのチロシ
ンキナーゼ阻害剤及び標的抗癌治療剤及びＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４又はＶＥＧＦな
どの他のアンタゴニストが挙げられる。例示的なＨＥＲ２アンタゴニストとしては、ＣＰ
－７２４－７１４、ハーセプチン（商標）（トラスツズマブ）、オムニターグ（ＯＭＮＩ
ＴＡＲＧ）（商標）（ペルツズマブ）、ＴＡＫ－１６５、ラパチニブ（ＥＧＦＲ及びＨＥ
Ｒ２阻害剤）、及びＧＷ－２８２９７４が挙げられる。例示的なＨＥＲ３アンタゴニスト
としては、抗－Ｈｅｒ３抗体が挙げられる（例えば、米国特許第２００４／０１９７３３
２号を参照されたい）。例示的なＨＥＲ４アンタゴニストとしては、抗－ＨＥＲ４ ｓｉ
ＲＮＡが挙げられる（例えば、Ｍａａｔｔａら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １７：６
７～７９，２００６を参照されたい）。例示的なＶＥＧＦアンタゴニストは、ベバシズマ
ブ（アバスチン（商標））である。
【0205】
低分子を本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦ
Ｒ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと組み合わせて使用するとき、
典型的に、より頻回に、好ましくは、１日１回投与してもよいが、２、３，４回／日以上
であってもよく、２日毎、毎週、又他の何らかの間隔毎に投与してもよい。多くの場合、
低分子薬剤は、経口投与されるが、例えば、例えば、ＩＶ注入又はボーラス注入又は皮下
投与又は筋肉内投与などの非経口的投与も可能である。低分子薬剤の用量は、通常、１０
～１０００ｍｇ、又は約１００、１５０、２００若しくは２５０ｍｇである。
Ｒ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと組み合わせて使用するとき、
典型的に、より頻回に、好ましくは、１日１回投与してもよいが、２、３，４回／日以上
であってもよく、２日毎、毎週、又他の何らかの間隔毎に投与してもよい。多くの場合、
低分子薬剤は、経口投与されるが、例えば、例えば、ＩＶ注入又はボーラス注入又は皮下
投与又は筋肉内投与などの非経口的投与も可能である。低分子薬剤の用量は、通常、１０
～１０００ｍｇ、又は約１００、１５０、２００若しくは２５０ｍｇである。
【0206】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、第２の治療薬と組み合わせて投与す
るとき、その組み合わせは、従来の任意の時間枠を超えて行われてもよい。例えば、本発
明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ド
メイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び第２の治療薬は、同じ日に患者に投与され
てもよく、また同じ静脈内注射において投与されてもよい。しかし、本発明の二重特異性
ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－
Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び第２の治療薬は、隔日、隔週及び２週間毎又は隔月などで
患者に投与されてもよい。いくつかの方法では、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メイン及び第２の治療薬は、治療対象の患者において、検出可能なレベルで（例えば血清
中に）同時に存在する時間内にて、十分に近接して投与される。いくつかの方法では、任
意の期間にわたり、いくつかの投与回数からなる本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインの全治療過程に続いて、又は、それに先立って、いくつかの投与回数からなる第２
の治療薬の治療過程が行われる。いくつかの方法では、最初に投与した第２の治療薬に対
して、患者が耐性を有するか、又は耐性を発達させた場合、二番目に本発明の二重特異性
ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－
Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが投与される治療が開始される。患者は、本発明の二重特異性
ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－
Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び第２の治療薬のいずれか１つ又は双方による単回治療過程
又は複数回治療過程を受けてよい。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ド
メイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの投与
と、第２の治療薬の投与との間に、１日、２日又は数日又は数週間の回復期間を使用して
もよい。第２の治療薬の好適な投与計画がすでに構築されている場合、投与計画は、本発
明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ド
メイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと組み合わせて、その計画を使用してもよい。
例えば、タルセバ（登録商標）（エルロチニブ）は、１日１回、１００ｍｇ又は１５０ｍ
ｇピルとして投与され、イレッサ（登録商標）（ゲフィチニブ）は、２５０ｍｇ錠剤とし
て毎日投与される。
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、第２の治療薬と組み合わせて投与す
るとき、その組み合わせは、従来の任意の時間枠を超えて行われてもよい。例えば、本発
明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ド
メイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び第２の治療薬は、同じ日に患者に投与され
てもよく、また同じ静脈内注射において投与されてもよい。しかし、本発明の二重特異性
ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－
Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び第２の治療薬は、隔日、隔週及び２週間毎又は隔月などで
患者に投与されてもよい。いくつかの方法では、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メイン及び第２の治療薬は、治療対象の患者において、検出可能なレベルで（例えば血清
中に）同時に存在する時間内にて、十分に近接して投与される。いくつかの方法では、任
意の期間にわたり、いくつかの投与回数からなる本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅ
ｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ド
メインの全治療過程に続いて、又は、それに先立って、いくつかの投与回数からなる第２
の治療薬の治療過程が行われる。いくつかの方法では、最初に投与した第２の治療薬に対
して、患者が耐性を有するか、又は耐性を発達させた場合、二番目に本発明の二重特異性
ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－
Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが投与される治療が開始される。患者は、本発明の二重特異性
ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－
Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン及び第２の治療薬のいずれか１つ又は双方による単回治療過程
又は複数回治療過程を受けてよい。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ド
メイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの投与
と、第２の治療薬の投与との間に、１日、２日又は数日又は数週間の回復期間を使用して
もよい。第２の治療薬の好適な投与計画がすでに構築されている場合、投与計画は、本発
明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ド
メイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと組み合わせて、その計画を使用してもよい。
例えば、タルセバ（登録商標）（エルロチニブ）は、１日１回、１００ｍｇ又は１５０ｍ
ｇピルとして投与され、イレッサ（登録商標）（ゲフィチニブ）は、２５０ｍｇ錠剤とし
て毎日投与される。
【0207】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、任意選択的に、第２の治療薬と組み
合わせて、外照射療法、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）及びガンマナイフ、サイバーナ
イフ、リニアックなどの任意の形態の放射線外科手術、及び組織内照射（例えば、放射線
シードインプラント、ＧｌｉａＳｉｔｅ ｂａｌｌｏｏｎ）などの任意の形態の放射線、
並びに／又は外科手術などと合わせて投与してもよい。放射線治療との併用は、特に、頭
頸部癌及び脳腫瘍に適切であり得る。
Ｎ３ドメイン又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、任意選択的に、第２の治療薬と組み
合わせて、外照射療法、強度変調放射線治療（ＩＭＲＴ）及びガンマナイフ、サイバーナ
イフ、リニアックなどの任意の形態の放射線外科手術、及び組織内照射（例えば、放射線
シードインプラント、ＧｌｉａＳｉｔｅ ｂａｌｌｏｏｎ）などの任意の形態の放射線、
並びに／又は外科手術などと合わせて投与してもよい。放射線治療との併用は、特に、頭
頸部癌及び脳腫瘍に適切であり得る。
【0208】
本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を
限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例0209】
実施例１．Ｔｅｎｃｏｎライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシン－Ｃの、１５のＦＮ３ドメインの共通
配列から設計された免疫グロブリン様スカフォールドである、フィブロネクチンＩＩＩ型
（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７～１１７，２０１２；米国
特許公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７つのβストラ
ンドを接続する６つの表面露出ループを示す。これらのループ、又は各ループ内の選択さ
れた残基は、特定の標的と結合する新規分子の選択に使用できるフィブロネクチンＩＩＩ
型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築するために、ランダム化できる。
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシン－Ｃの、１５のＦＮ３ドメインの共通
配列から設計された免疫グロブリン様スカフォールドである、フィブロネクチンＩＩＩ型
（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７～１１７，２０１２；米国
特許公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７つのβストラ
ンドを接続する６つの表面露出ループを示す。これらのループ、又は各ループ内の選択さ
れた残基は、特定の標的と結合する新規分子の選択に使用できるフィブロネクチンＩＩＩ
型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築するために、ランダム化できる。
【0210】
Ｔｅｎｃｏｎ：
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓｌｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｎｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｋｇｇｈｒ
ｓｎｐｌｓａｅｆｔｔ（配列番号１）
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓｌｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｎｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｋｇｇｈｒ
ｓｎｐｌｓａｅｆｔｔ（配列番号１）
【0211】
ＴＣＬ１ライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＦＧループのみランダム化するように設計されたライブ
ラリである、ＴＣＬ１は、ｃｉｓ－ディスプレイ系で使用するために構築された（Ｊａｃ
ｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅ
ｃｔｉｏｎ，２５：１０７～１１７，２０１２）。この系では、Ｔａｃプロモーター、Ｔ
ｅｎｃｏｎライブラリコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓ－エレメント及びｏｒｉ
エレメントの一本鎖ＤＮＡ組み込み配列を作製する。インビトロ転写／翻訳系での発現時
に、コードされているＤＮＡに、ｃｉｓにおいて結合するＴｅｎｃｏｎ－ＲｅｐＡ融合タ
ンパク質の錯体が生成される。次に、標的分子に結合する錯体は、単離され、前述のよう
に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、増幅される。
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＦＧループのみランダム化するように設計されたライブ
ラリである、ＴＣＬ１は、ｃｉｓ－ディスプレイ系で使用するために構築された（Ｊａｃ
ｏｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅ
ｃｔｉｏｎ，２５：１０７～１１７，２０１２）。この系では、Ｔａｃプロモーター、Ｔ
ｅｎｃｏｎライブラリコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓ－エレメント及びｏｒｉ
エレメントの一本鎖ＤＮＡ組み込み配列を作製する。インビトロ転写／翻訳系での発現時
に、コードされているＤＮＡに、ｃｉｓにおいて結合するＴｅｎｃｏｎ－ＲｅｐＡ融合タ
ンパク質の錯体が生成される。次に、標的分子に結合する錯体は、単離され、前述のよう
に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、増幅される。
【0212】
ｃｉｓ－ディスプレイで使用するためのＴＣＬ１ライブラリの構築は、連続的に複数回
ＰＣＲを行い、最終的な線状二本鎖ＤＮＡ分子の２つの半体を生成することによって達成
され、該ＤＮＡの５’フラグメントは、プロモーター及びＴｅｎｃｏｎ配列を含み、３’
フラグメントには、ｒｅｐＡ遺伝子並びにｃｉｓ－及びｏｒｉ－エレメントを含む。これ
らの各２つの半体は、全体構造を作製するために消化を制限することによって結合される
。ＴＣＬ１ライブラリは、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ、ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号８６）
のみで、ランダムアミノ酸を組み込むように設計された。このライブラリの構造内にＮＮ
Ｓコドンを使用した結果、２０の全アミノ酸及び１つの終止コドンをＦＧループ内に取り
込むことができた。ＴＣＬ１ライブラリは、それぞれが、更に多様性を増大させるために
、長さ７～１２の残基を有する異なるランダム化ＦＧループを有する、６つのサブライブ
ラリを別途に包含する。Ｔｅｎｃｏｎベースのライブラリの設計を表２に示す。
ＰＣＲを行い、最終的な線状二本鎖ＤＮＡ分子の２つの半体を生成することによって達成
され、該ＤＮＡの５’フラグメントは、プロモーター及びＴｅｎｃｏｎ配列を含み、３’
フラグメントには、ｒｅｐＡ遺伝子並びにｃｉｓ－及びｏｒｉ－エレメントを含む。これ
らの各２つの半体は、全体構造を作製するために消化を制限することによって結合される
。ＴＣＬ１ライブラリは、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ、ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号８６）
のみで、ランダムアミノ酸を組み込むように設計された。このライブラリの構造内にＮＮ
Ｓコドンを使用した結果、２０の全アミノ酸及び１つの終止コドンをＦＧループ内に取り
込むことができた。ＴＣＬ１ライブラリは、それぞれが、更に多様性を増大させるために
、長さ７～１２の残基を有する異なるランダム化ＦＧループを有する、６つのサブライブ
ラリを別途に包含する。Ｔｅｎｃｏｎベースのライブラリの設計を表２に示す。
【0213】
【表2】
**ＫＧＧＨＲＳＮ：配列番号８６
Ｘは、ＮＮＳコドンによりコードされたアミノ酸の変性を指す。
＃は、本文に記述されている「設計されたアミノ酸分布」を指す。
【0214】
ＴＣＬ１ライブラリを構築するために、連続的に複数回ＰＣＲを行い、Ｔａｃプロモー
ターが付加され、ＦＧループに変性を組み込み、最終的なアセンブリのために、必要な制
限酵素部位を加えた。第１に、プロモーター配列及びＦＧループのＴｅｎｃｏｎ配列５’
を含むＤＮＡ配列は、２工程で、ＰＣＲによって作製された。全Ｔｅｎｃｏｎ遺伝子配列
に対応するＤＮＡは、プライマーＰＯＰ２２２０（配列番号２）及びＴＣ５’ｔｏＦＧ（
配列番号３）と共に、ＰＣＲテンプレートとして、使用した。この反応から得られたＰＣ
Ｒ産物は、プライマー１３０ｍｅｒ（配列番号４）及びＴｃ５’ｔｏＦＧを用いて、次の
回のＰＣＲ増幅を行うために、テンプレートとして使用し、５’及びプロモーター配列を
完全にＴｅｎｃｏｎに加えた。次に、縮重ヌクレオチドを含む、順方向プライマーＰＯＰ
２２２２（配列番号５）、及び逆方向プライマーＴＣＦ７（配列番号６）、ＴＣＦ８（配
列番号７）、ＴＣＦ９（配列番号８）、ＴＣＦ１０（配列番号９）、ＴＣＦ１１（配列番
号１０）、又はＴＣＦ１２（配列番号１１）を用い、第１工程で作製されたＤＮＡ産物を
増幅することによって、多様性をＦＧループ内に導入した。各サブライブラリに対して、
１００μＬ ＰＣＲ反応を少なくとも８回行い、ＰＣＲサイクルを最小化し、ライブラリ
の多様性を最大化させた。少なくとも５μｇの、このＰＣＲ産物に対して、ゲル精製を行
い、プライマーＰＯＰ２２２２（配列番号５）及びＰＯＰ２２３４（配列番号１２）を用
いた、次のＰＣＲ工程で使用し、その結果、６ｘＨｉｓタグ及びＮｏｔＩ制限酵素部位が
Ｔｅｎｃｏｎ配列の３’末端部に結合された。このＰＣＲ反応は、１５ＰＣＲサイクルの
み、少なくとも５００ｎｇのテンプレートＤＮＡを用いて行った。得られたＰＣＲ産物は
、ゲル精製を行い、ＮｏｔＩ制限酵素で消化し、Ｑｉａｇｅｎカラムによって精製した。
ターが付加され、ＦＧループに変性を組み込み、最終的なアセンブリのために、必要な制
限酵素部位を加えた。第１に、プロモーター配列及びＦＧループのＴｅｎｃｏｎ配列５’
を含むＤＮＡ配列は、２工程で、ＰＣＲによって作製された。全Ｔｅｎｃｏｎ遺伝子配列
に対応するＤＮＡは、プライマーＰＯＰ２２２０（配列番号２）及びＴＣ５’ｔｏＦＧ（
配列番号３）と共に、ＰＣＲテンプレートとして、使用した。この反応から得られたＰＣ
Ｒ産物は、プライマー１３０ｍｅｒ（配列番号４）及びＴｃ５’ｔｏＦＧを用いて、次の
回のＰＣＲ増幅を行うために、テンプレートとして使用し、５’及びプロモーター配列を
完全にＴｅｎｃｏｎに加えた。次に、縮重ヌクレオチドを含む、順方向プライマーＰＯＰ
２２２２（配列番号５）、及び逆方向プライマーＴＣＦ７（配列番号６）、ＴＣＦ８（配
列番号７）、ＴＣＦ９（配列番号８）、ＴＣＦ１０（配列番号９）、ＴＣＦ１１（配列番
号１０）、又はＴＣＦ１２（配列番号１１）を用い、第１工程で作製されたＤＮＡ産物を
増幅することによって、多様性をＦＧループ内に導入した。各サブライブラリに対して、
１００μＬ ＰＣＲ反応を少なくとも８回行い、ＰＣＲサイクルを最小化し、ライブラリ
の多様性を最大化させた。少なくとも５μｇの、このＰＣＲ産物に対して、ゲル精製を行
い、プライマーＰＯＰ２２２２（配列番号５）及びＰＯＰ２２３４（配列番号１２）を用
いた、次のＰＣＲ工程で使用し、その結果、６ｘＨｉｓタグ及びＮｏｔＩ制限酵素部位が
Ｔｅｎｃｏｎ配列の３’末端部に結合された。このＰＣＲ反応は、１５ＰＣＲサイクルの
み、少なくとも５００ｎｇのテンプレートＤＮＡを用いて行った。得られたＰＣＲ産物は
、ゲル精製を行い、ＮｏｔＩ制限酵素で消化し、Ｑｉａｇｅｎカラムによって精製した。
【0215】
このライブラリの３’フラグメントは、ｒｅｐＡ遺伝子及びｃｉｓ－及びｏｒｉ－エレ
メントのコード領域、ＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位などの、ディスプレイのためのエレメン
トを含有する一定のＤＮＡ配列である。ＰＣＲ反応は、このＤＮＡフラグメントを含有す
るプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｍ１３順方
向及びＭ１３逆方向プライマーにより実施した。得られたＰＣＲ産物は、ＰｓｐＯＭＩに
より一晩消化させ、ゲル精製した。ライブラリＤＮＡの５’部位をｒｅｐＡ遺伝子を含む
３’ＤＮＡにライゲートするために、２ｐｍｏｌの５’ＤＮＡを、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯ
ＭＩ酵素並びにＴ４リガーゼの存在下で、同じモル量の３’ｒｅｐＡ ＤＮＡにライゲー
トさせた。３７℃で一晩ライゲーションさせた後、ライゲートさせたＤＮＡのごく一部を
ゲル上で泳動させて、ライゲーション効率を確認した。ライゲートさせたライブラリ産物
を１２のＰＣＲ増幅に分割し、プライマー対、ＰＯＰ２２５０（配列番号１３）及びＤｉ
ｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）、を用いて、１２サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＴＣ
Ｌ１ライブラリの各サブライブラリのＤＮＡ収率は、３２～３４μｇの範囲であった。
メントのコード領域、ＰｓｐＯＭＩ制限酵素部位などの、ディスプレイのためのエレメン
トを含有する一定のＤＮＡ配列である。ＰＣＲ反応は、このＤＮＡフラグメントを含有す
るプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｍ１３順方
向及びＭ１３逆方向プライマーにより実施した。得られたＰＣＲ産物は、ＰｓｐＯＭＩに
より一晩消化させ、ゲル精製した。ライブラリＤＮＡの５’部位をｒｅｐＡ遺伝子を含む
３’ＤＮＡにライゲートするために、２ｐｍｏｌの５’ＤＮＡを、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯ
ＭＩ酵素並びにＴ４リガーゼの存在下で、同じモル量の３’ｒｅｐＡ ＤＮＡにライゲー
トさせた。３７℃で一晩ライゲーションさせた後、ライゲートさせたＤＮＡのごく一部を
ゲル上で泳動させて、ライゲーション効率を確認した。ライゲートさせたライブラリ産物
を１２のＰＣＲ増幅に分割し、プライマー対、ＰＯＰ２２５０（配列番号１３）及びＤｉ
ｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）、を用いて、１２サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＴＣ
Ｌ１ライブラリの各サブライブラリのＤＮＡ収率は、３２～３４μｇの範囲であった。
【0216】
ライブラリの質を評価するために、作業ライブラリのごく一部をプライマーＴｃｏｎ５
ｎｅｗ２（配列番号：１５）及びＴｃｏｎ６（配列番号：１６）により増幅し、リガーゼ
非依存クローン化を介して、改変ｐＥＴベクターにクローン化した。プラスミドＤＮＡは
、ＢＬ２１－ＧＯＬＤ（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換
し、ランダムに選択した９６個のコロニーをＴ７プロモータープライマーを用いて、配列
決定した。重複した配列は、検出されなかった。全体的に、約７０～８５％のクローンが
、フレームシフト突然変異のない、完全なプロモーター及びＴｅｎｃｏｎコード配列を有
していた。終止コドンとクローンを除いた機能シーケンス率は５９％～８０％であった。
ｎｅｗ２（配列番号：１５）及びＴｃｏｎ６（配列番号：１６）により増幅し、リガーゼ
非依存クローン化を介して、改変ｐＥＴベクターにクローン化した。プラスミドＤＮＡは
、ＢＬ２１－ＧＯＬＤ（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換
し、ランダムに選択した９６個のコロニーをＴ７プロモータープライマーを用いて、配列
決定した。重複した配列は、検出されなかった。全体的に、約７０～８５％のクローンが
、フレームシフト突然変異のない、完全なプロモーター及びＴｅｎｃｏｎコード配列を有
していた。終止コドンとクローンを除いた機能シーケンス率は５９％～８０％であった。
【0217】
ＴＣＬ２ライブラリの構築
ＴｅｎｃｏｎのＢＣループ及びＦＧループのいずれもランダム化され、各位置でのアミ
ノ酸の分布を厳密に管理したＴＣＬ２ライブラリが構築された。表３には、ＴＣＬ２ライ
ブラリ内での所望のループ位置における、アミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布
には、２つの目的がある。第１に、このライブラリは、Ｔｅｎｃｏｎ結晶構造の解析に基
づき、かつ／又は相同モデリングから、Ｔｅｎｃｏｎのフォールディング及び安定性に、
構造上重要であることが予測された残基に対してバイアスがある点である。例えば、位置
２９は、疎水性アミノ酸のサブセットのみであるように固定された。これは、この残基が
、Ｔｅｎｃｏｎフォールドの疎水性コアに埋め込まれた（buried）変化したためである。
第２層の設計には、高親和性結合剤を効率的に作製するために、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３内
に優先的に見られる残基に対するアミノ酸分布のバイアスが含まれる（Ｂｉｒｔａｌａｎ
ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７７：１５１８～２８，２００８；Ｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｓｃｉ １６：４７６～８４，２００７）。この目標値に対して、表３の「設
計された分布」は、以下の分布を示す。アラニン６％、アルギニン６％、アスパラギン３
．９％、アスパラギン酸７．５％、グルタミン酸２．５％、グルタミン１．５％、グリシ
ン１５％、ヒスチジン２．３％、イソロイシン２．５％、ロイシン５％、リジン１．５％
、フェニルアラニン２．５％、プロリン４％、セリン１０％、スレオニン４．５％、トリ
プトファン４％、チロシン１７．３％、バリン４％。この分布には、メチオニン、システ
イン及び終止コドンは含まれない。
ＴｅｎｃｏｎのＢＣループ及びＦＧループのいずれもランダム化され、各位置でのアミ
ノ酸の分布を厳密に管理したＴＣＬ２ライブラリが構築された。表３には、ＴＣＬ２ライ
ブラリ内での所望のループ位置における、アミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布
には、２つの目的がある。第１に、このライブラリは、Ｔｅｎｃｏｎ結晶構造の解析に基
づき、かつ／又は相同モデリングから、Ｔｅｎｃｏｎのフォールディング及び安定性に、
構造上重要であることが予測された残基に対してバイアスがある点である。例えば、位置
２９は、疎水性アミノ酸のサブセットのみであるように固定された。これは、この残基が
、Ｔｅｎｃｏｎフォールドの疎水性コアに埋め込まれた（buried）変化したためである。
第２層の設計には、高親和性結合剤を効率的に作製するために、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３内
に優先的に見られる残基に対するアミノ酸分布のバイアスが含まれる（Ｂｉｒｔａｌａｎ
ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７７：１５１８～２８，２００８；Ｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｓｃｉ １６：４７６～８４，２００７）。この目標値に対して、表３の「設
計された分布」は、以下の分布を示す。アラニン６％、アルギニン６％、アスパラギン３
．９％、アスパラギン酸７．５％、グルタミン酸２．５％、グルタミン１．５％、グリシ
ン１５％、ヒスチジン２．３％、イソロイシン２．５％、ロイシン５％、リジン１．５％
、フェニルアラニン２．５％、プロリン４％、セリン１０％、スレオニン４．５％、トリ
プトファン４％、チロシン１７．３％、バリン４％。この分布には、メチオニン、システ
イン及び終止コドンは含まれない。
【0218】
【表3】
【0219】
ＴＣＬ２ライブラリの５’フラグメントは、プロモーター及びＴｅｎｃｏｎ（配列番号
１）のコード領域を包含し、ライブラリプール（Ｓｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）として、化学的合成された。このＤＮＡプールには、少なくとも１×１０11の異
なるメンバーが包含された。フラグメントの端部では、ＢｓａＩ制限酵素部位がＲｅｐＡ
へのライゲーションのため、設計に含まれた。
１）のコード領域を包含し、ライブラリプール（Ｓｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）として、化学的合成された。このＤＮＡプールには、少なくとも１×１０11の異
なるメンバーが包含された。フラグメントの端部では、ＢｓａＩ制限酵素部位がＲｅｐＡ
へのライゲーションのため、設計に含まれた。
【0220】
このライブラリの３’フラグメントは、６ｘＨｉｓタグ、ｒｅｐＡ遺伝子及びｃｉｓ－
エレメントのコード領域などの、ディスプレイのためのエレメントを含有する一定のＤＮ
Ａ配列である。このＤＮＡは、既存のＤＮＡテンプレート（上述）及びプライマーＬＳ１
００８（配列番号１７）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて、ＰＣＲ反応
によって調製した。完全なＴＣＬ２ライブラリを組み立てるために、ＢｓａＩ－消化５’
ＴｅｎｃｏｎライブラリＤＮＡ合計１μｇを同じ酵素を用いて、制限消化によって作製さ
れた３’フラグメント３．５μｇにライゲートした。一晩ライゲートした後、ＤＮＡはＱ
ｉａｇｅｎカラムにより精製し、このＤＮＡは、吸光度２６０ｎｍで測定することによっ
て、定量化した。ライゲートされたライブラリ産物は、プライマー対ＰＯＰ２２５０（配
列番号１３）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて、１２サイクルのＰＣＲ
反応によって増幅させた。合計７２の反応を行い、それぞれがテンプレートとして、５０
ｎｇのライゲートされたＤＮＡ産物を含有していた。ＴＣＬ２ワーキングライブラリＤＮ
Ａの全収率は、約１００μｇであった。ワーキングライブラリのごく一部は、ＴＣＬ１ラ
イブラリに関して上述のように、サブクローン化され、配列決定された。重複した配列は
、検出されなかった。約８０％の配列は、フレームシフト変異のない完全なプロモーター
及びＴｅｎｃｏｎコード配列を含んでいた。
エレメントのコード領域などの、ディスプレイのためのエレメントを含有する一定のＤＮ
Ａ配列である。このＤＮＡは、既存のＤＮＡテンプレート（上述）及びプライマーＬＳ１
００８（配列番号１７）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて、ＰＣＲ反応
によって調製した。完全なＴＣＬ２ライブラリを組み立てるために、ＢｓａＩ－消化５’
ＴｅｎｃｏｎライブラリＤＮＡ合計１μｇを同じ酵素を用いて、制限消化によって作製さ
れた３’フラグメント３．５μｇにライゲートした。一晩ライゲートした後、ＤＮＡはＱ
ｉａｇｅｎカラムにより精製し、このＤＮＡは、吸光度２６０ｎｍで測定することによっ
て、定量化した。ライゲートされたライブラリ産物は、プライマー対ＰＯＰ２２５０（配
列番号１３）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて、１２サイクルのＰＣＲ
反応によって増幅させた。合計７２の反応を行い、それぞれがテンプレートとして、５０
ｎｇのライゲートされたＤＮＡ産物を含有していた。ＴＣＬ２ワーキングライブラリＤＮ
Ａの全収率は、約１００μｇであった。ワーキングライブラリのごく一部は、ＴＣＬ１ラ
イブラリに関して上述のように、サブクローン化され、配列決定された。重複した配列は
、検出されなかった。約８０％の配列は、フレームシフト変異のない完全なプロモーター
及びＴｅｎｃｏｎコード配列を含んでいた。
【0221】
ＴＣＬ１４ライブラリの構築
頂部（ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧ）及び底部（ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ）ループ、例えば、Ｆ
Ｎ３ドメイン中の報告された結合表面は、ＦＮ３構造の中心を形成するβストランドによ
って分離される。ループによって形成された表面とは異なる形状を有するＦＮ３ドメイン
の２つの「側面」にある代替表面は、２つの逆並行βストランド、Ｃ及びＦβストランド
とＣＤ及びＦＧループ（本明細書では、Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面と呼ばれている）によっ
て、ＦＮ３ドメインの片面に形成される。
頂部（ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧ）及び底部（ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ）ループ、例えば、Ｆ
Ｎ３ドメイン中の報告された結合表面は、ＦＮ３構造の中心を形成するβストランドによ
って分離される。ループによって形成された表面とは異なる形状を有するＦＮ３ドメイン
の２つの「側面」にある代替表面は、２つの逆並行βストランド、Ｃ及びＦβストランド
とＣＤ及びＦＧループ（本明細書では、Ｃ－ＣＤ－Ｆ－ＦＧ表面と呼ばれている）によっ
て、ＦＮ３ドメインの片面に形成される。
【0222】
Ｔｅｎｃｏｎの代替表面をランダム化するライブラリは、図１に示すように、Ｃ及びＦ
ストランドの残基並びにＤ及びＦＧループの部分に露出された選択表面をランダム化する
ことによって作製した。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）と比較したときに、Ｅ１１Ｒ Ｌ１
７Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ変異体、Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列
番号９９）、を使用して、ライブラリを作製した。このライブラリを構築するために使用
した方法の全詳細は、特許公開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。
ストランドの残基並びにＤ及びＦＧループの部分に露出された選択表面をランダム化する
ことによって作製した。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）と比較したときに、Ｅ１１Ｒ Ｌ１
７Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ変異体、Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列
番号９９）、を使用して、ライブラリを作製した。このライブラリを構築するために使用
した方法の全詳細は、特許公開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。
【0223】
実施例２．ＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦ結合を阻害するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ
３）ドメインの選択
ライブラリのスクリーニング
Ｃｉｓ－ディスプレイを使用して、ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリから、ＥＧＦＲ結
合ドメインを選択した。ＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に融合された組換え
型ヒト細胞外ＥＧＦＲドメインは、標準的な方法を用いて、ビオチン化し、パニングのた
めに使用した（配列番号７３の全長ＥＧＦＲの残基２５～６４５）。インビトロ転写及び
翻訳（ＩＴＴ）のために、ライブラリＤＮＡ ２～６μｇを、全アミノ酸０．１ｍＭ、１
Ｘ Ｓ３０プレミックス成分及びＳ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）３０μＬ、合計量１０
０μＬを用いてインキュベートし、３０℃でインキュベートした。１時間後、ブロッキン
グ溶液４５０μＬ（２％ウシ血清アルブミン、ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ １
００μｇ／ｍＬ及びヘパリン１ｍｇ／ｍＬを加えたＰＢＳ ｐＨ ７．４）を添加し、そ
の反応物を氷上で１５分間インキュベートした。ＥＧＦＲ－Ｆｃ：ＥＧＦ錯体は、ＥＧＦ
Ｒ対ＥＧＦのモル比１：１及び１０：１で、ブロッキング溶液中、室温にて１時間、組換
え型ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とビオチン化組換え型ＥＧＦＲ－Ｆｃを混合
することによって、組み込んだ。結合させるためにブロッキングＩＴＴ反応生成物５００
μＬをＥＧＦＲ－Ｆｃ：ＥＧＦ錯体１００μＬと混合し、結合した錯体は、磁性ニュート
ラアビジン又はストレプトアビジンビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）を用いてプルダウン（pu
lled down）した後、室温で１時間インキュベートした。非結合ライブラリメンバーは、
ＰＢＳＴ及びＰＢＳで連続洗浄して除去した。洗浄後、更にパニング操作のために、１０
分間、６５℃まで加熱することによって、結合錯体からＤＮＡを溶出し、ＰＣＲによって
増幅し、制限消化及びライゲーションによって、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡフラグメン
トに付着させた。高親和性結合剤は、連続的に標的ＥＧＦＲ－Ｆｃ濃度を低下させること
によって、各操作２００ｎＭ～５０ｎＭで、洗浄の厳密性を増大させて単離した。４回目
及び５回目では、非結合及び低結合ＦＮ３ドメインは、ＰＢＳ中において、非ビオチン化
ＥＧＦＲ－Ｆｃの１０倍のモル過剰存在下で、一晩、洗浄することによって除去した。
３）ドメインの選択
ライブラリのスクリーニング
Ｃｉｓ－ディスプレイを使用して、ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリから、ＥＧＦＲ結
合ドメインを選択した。ＩｇＧ１ Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に融合された組換え
型ヒト細胞外ＥＧＦＲドメインは、標準的な方法を用いて、ビオチン化し、パニングのた
めに使用した（配列番号７３の全長ＥＧＦＲの残基２５～６４５）。インビトロ転写及び
翻訳（ＩＴＴ）のために、ライブラリＤＮＡ ２～６μｇを、全アミノ酸０．１ｍＭ、１
Ｘ Ｓ３０プレミックス成分及びＳ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）３０μＬ、合計量１０
０μＬを用いてインキュベートし、３０℃でインキュベートした。１時間後、ブロッキン
グ溶液４５０μＬ（２％ウシ血清アルブミン、ｈｅｒｒｉｎｇ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ １
００μｇ／ｍＬ及びヘパリン１ｍｇ／ｍＬを加えたＰＢＳ ｐＨ ７．４）を添加し、そ
の反応物を氷上で１５分間インキュベートした。ＥＧＦＲ－Ｆｃ：ＥＧＦ錯体は、ＥＧＦ
Ｒ対ＥＧＦのモル比１：１及び１０：１で、ブロッキング溶液中、室温にて１時間、組換
え型ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とビオチン化組換え型ＥＧＦＲ－Ｆｃを混合
することによって、組み込んだ。結合させるためにブロッキングＩＴＴ反応生成物５００
μＬをＥＧＦＲ－Ｆｃ：ＥＧＦ錯体１００μＬと混合し、結合した錯体は、磁性ニュート
ラアビジン又はストレプトアビジンビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）を用いてプルダウン（pu
lled down）した後、室温で１時間インキュベートした。非結合ライブラリメンバーは、
ＰＢＳＴ及びＰＢＳで連続洗浄して除去した。洗浄後、更にパニング操作のために、１０
分間、６５℃まで加熱することによって、結合錯体からＤＮＡを溶出し、ＰＣＲによって
増幅し、制限消化及びライゲーションによって、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡフラグメン
トに付着させた。高親和性結合剤は、連続的に標的ＥＧＦＲ－Ｆｃ濃度を低下させること
によって、各操作２００ｎＭ～５０ｎＭで、洗浄の厳密性を増大させて単離した。４回目
及び５回目では、非結合及び低結合ＦＮ３ドメインは、ＰＢＳ中において、非ビオチン化
ＥＧＦＲ－Ｆｃの１０倍のモル過剰存在下で、一晩、洗浄することによって除去した。
【0224】
パニング後、選択されたＦＮ３ドメインは、ｏｌｉｇｏｓ Ｔｃｏｎ５ｎｅｗ２（配列
番号１５）及びＴｃｏｎ６（配列番号１６）を用いてＰＣＲによって増幅し、リガーゼ非
依存性クローニングサイトを含むように改変されたｐＥＴベクターにサブクローン化し、
標準的な分子生物学的技術を用いて、大腸菌中で、可溶性として発現させるために、ＢＬ
２１－ＧＯＬＤ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞に形質転換させた。Ｃ末端ポリ
－ヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を、精製及び検出が可能になるように、各ＦＮ
３ドメインに付加した。培養物は、温度を３０℃まで低下させて、ＩＰＴＧを１ｍＭまで
添加する前に、１－ｍＬの９６－ウェルブロック中、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン添
加２ＹＴ培地において、３７℃で、吸光度０．６～０．８になるまで増殖させた。細胞は
、遠心分離によって、約１６時間後に収集し、－２０℃で凍結した。室温で、４５分間振
盪させながら、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ ＥＭ
Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）０．６ｍＬ中で各ペレットをインキュベートすることによ
って、細胞溶解物を得た。
番号１５）及びＴｃｏｎ６（配列番号１６）を用いてＰＣＲによって増幅し、リガーゼ非
依存性クローニングサイトを含むように改変されたｐＥＴベクターにサブクローン化し、
標準的な分子生物学的技術を用いて、大腸菌中で、可溶性として発現させるために、ＢＬ
２１－ＧＯＬＤ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞に形質転換させた。Ｃ末端ポリ
－ヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を、精製及び検出が可能になるように、各ＦＮ
３ドメインに付加した。培養物は、温度を３０℃まで低下させて、ＩＰＴＧを１ｍＭまで
添加する前に、１－ｍＬの９６－ウェルブロック中、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン添
加２ＹＴ培地において、３７℃で、吸光度０．６～０．８になるまで増殖させた。細胞は
、遠心分離によって、約１６時間後に収集し、－２０℃で凍結した。室温で、４５分間振
盪させながら、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ ＥＭ
Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）０．６ｍＬ中で各ペレットをインキュベートすることによ
って、細胞溶解物を得た。
【0225】
細胞上でＥＧＦＲに結合するＦＮ３ドメインの選択
より生理学的な場合において、異なるＦＮ３ドメインがＥＧＦＲに結合する能力を評価
するために、Ａ４３１細胞に結合する能力を測定した。Ａ４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ番号ＣＲＬ－１５５５）
は、１細胞当たり約２×１０6個の受容体にて、ＥＧＦＲを過剰発現する。細胞を、不透
明の黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播種し、５％ ＣＯ2の増
湿大気中、３７℃で一晩付着させた。ＦＮ３ドメイン発現細菌溶解物は、ＦＡＣＳ染色緩
衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で１，０００倍希釈し、３つのプレートで、
室温にて１時間インキュベートした。細菌溶解物を除去し、細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液
１５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液で１対１００に希釈し
た抗－ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ－Ａｌｅｘａ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）５０
μＬ／ウェルで、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェル
のＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを
入れ、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、４８８ｎｍにて蛍光を読み取った。
Ａ４３１細胞（ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリの１３２０の粗細菌溶解物）に結合する
能力に関して、細菌溶解物含有ＦＮ３ドメインをスクリーニングし、５１６の陽性クロー
ンが同定された。ここで、結合は、バックグランドシグナルの１０倍以上であった。ＴＣ
Ｌ１４ライブラリからの３００の細菌溶解物の結合をスクリーニングし、その結果、ＥＧ
ＦＲに結合する５８のユニークなＦＮ３ドメイン配列を得た。
より生理学的な場合において、異なるＦＮ３ドメインがＥＧＦＲに結合する能力を評価
するために、Ａ４３１細胞に結合する能力を測定した。Ａ４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ番号ＣＲＬ－１５５５）
は、１細胞当たり約２×１０6個の受容体にて、ＥＧＦＲを過剰発現する。細胞を、不透
明の黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播種し、５％ ＣＯ2の増
湿大気中、３７℃で一晩付着させた。ＦＮ３ドメイン発現細菌溶解物は、ＦＡＣＳ染色緩
衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で１，０００倍希釈し、３つのプレートで、
室温にて１時間インキュベートした。細菌溶解物を除去し、細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液
１５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液で１対１００に希釈し
た抗－ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ－Ａｌｅｘａ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）５０
μＬ／ウェルで、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェル
のＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを
入れ、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、４８８ｎｍにて蛍光を読み取った。
Ａ４３１細胞（ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリの１３２０の粗細菌溶解物）に結合する
能力に関して、細菌溶解物含有ＦＮ３ドメインをスクリーニングし、５１６の陽性クロー
ンが同定された。ここで、結合は、バックグランドシグナルの１０倍以上であった。ＴＣ
Ｌ１４ライブラリからの３００の細菌溶解物の結合をスクリーニングし、その結果、ＥＧ
ＦＲに結合する５８のユニークなＦＮ３ドメイン配列を得た。
【0226】
細胞上でＥＧＦに対するＥＧＦＲの結合を阻害するＦＮ３ドメインの選定
ＥＧＦＲ結合の機序を更によく特徴決定するために、種々の同定ＦＮ３ドメインクロー
ンが、ＥＧＦに競合するようにＥＧＦＲに結合する能力を、Ａ４３１細胞を用いて測定し
、Ａ４３１結合アッセイスクリーニングと並行して実施した。Ａ４３１細胞を、不透明の
黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播種し、５％ ＣＯ2の増湿大
気中、３７℃で一晩付着させた。細胞は、１対１，０００に希釈した細菌溶解物５０μＬ
／ウェルで、３つのプレートにおいて、室温にて１時間インキュベートした。ビオチン化
ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｅ－３４７７）は、各ウェルに添加し、最
終濃度３０ｎｇ／ｍＬとし、室温で１０分間インキュベートした。細胞は、ＦＡＣＳ染色
緩衝液１５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液中に１対１００
に希釈したストレプトアビジン－フィコエリトリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）５０μＬ／ウェルを用いて、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５
０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝
液１００μＬを入れ、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、６００ｎｍにて蛍光
を読み取った。
ＥＧＦＲ結合の機序を更によく特徴決定するために、種々の同定ＦＮ３ドメインクロー
ンが、ＥＧＦに競合するようにＥＧＦＲに結合する能力を、Ａ４３１細胞を用いて測定し
、Ａ４３１結合アッセイスクリーニングと並行して実施した。Ａ４３１細胞を、不透明の
黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播種し、５％ ＣＯ2の増湿大
気中、３７℃で一晩付着させた。細胞は、１対１，０００に希釈した細菌溶解物５０μＬ
／ウェルで、３つのプレートにおいて、室温にて１時間インキュベートした。ビオチン化
ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｅ－３４７７）は、各ウェルに添加し、最
終濃度３０ｎｇ／ｍＬとし、室温で１０分間インキュベートした。細胞は、ＦＡＣＳ染色
緩衝液１５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液中に１対１００
に希釈したストレプトアビジン－フィコエリトリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）５０μＬ／ウェルを用いて、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５
０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝
液１００μＬを入れ、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、６００ｎｍにて蛍光
を読み取った。
【0227】
ＦＮ３ドメインを含有する細菌溶解物を、上記のＥＧＦ競合アッセイでスクリーニング
した。ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリからの１３２０の粗細菌溶解物をスクリーニング
し、その結果、５０％超のＥＧＦ結合を阻害する４５１の陽性クローンが得られた。
した。ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリからの１３２０の粗細菌溶解物をスクリーニング
し、その結果、５０％超のＥＧＦ結合を阻害する４５１の陽性クローンが得られた。
【0228】
同定されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの発現と及び精製
Ｈｉｓ－タグＦＮ３ドメインを、ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて浄化大腸菌溶解物から精製し、リン酸ナトリウム２０ｍＭ
、塩化ナトリウム５００ｍＭ及びイミダゾール２５０ｍＭを含む、ｐＨ ７．４の緩衝液
中に溶出させた。精製サンプルは、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ－２５プレート
（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた分析のために、ｐＨ ７．４のＰＢＳに取り替
えた。
Ｈｉｓ－タグＦＮ３ドメインを、ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて浄化大腸菌溶解物から精製し、リン酸ナトリウム２０ｍＭ
、塩化ナトリウム５００ｍＭ及びイミダゾール２５０ｍＭを含む、ｐＨ ７．４の緩衝液
中に溶出させた。精製サンプルは、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ－２５プレート
（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた分析のために、ｐＨ ７．４のＰＢＳに取り替
えた。
【0229】
サイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＥＧＦＲに結合するＦＮ３ドメインの凝集
状態を測定した。各精製ＦＮ３ドメインのアリコット（１０μＬ）を、移動相（ＰＢＳ、
ｐＨ ７．４）中にて、流速０．３ｍＬ／分で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０カ
ラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。カラムからの溶出を２８０ｎｍの吸光
度でモニターした。ＳＥＣによって高レベルの凝集状態が示されたＦＮ３ドメインは、更
なる分析から除外した。
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＥＧＦＲに結合するＦＮ３ドメインの凝集
状態を測定した。各精製ＦＮ３ドメインのアリコット（１０μＬ）を、移動相（ＰＢＳ、
ｐＨ ７．４）中にて、流速０．３ｍＬ／分で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０カ
ラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。カラムからの溶出を２８０ｎｍの吸光
度でモニターした。ＳＥＣによって高レベルの凝集状態が示されたＦＮ３ドメインは、更
なる分析から除外した。
【0230】
ＥＧＦＲ－Ｆｃからの選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのオフレート
選択したＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインをスクリーニングして、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ
－３６ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上でＥＧＦＲ－Ｆｃへの結合において
、低オフレート（ｋoff）を有するものを同定し、高親和性結合剤を選択しやすくした。
０．００５％のＰＢＳを含有するＴｗｅｅｎ－２０中で、流速３０μＬ／分、チップ上で
の水平配向の６つの全リガンドチャネル上での、アミンカップリング（ｐＨ ５．０）を
介し、５μｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗－ヒトＦｃ ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、
直接固定化した。固定化密度は、平均約１５００応答単位（ＲＵ）であり、チャネル間で
、５％未満の変動があった。ＥＧＦＲ－Ｆｃは、抗ヒトＦｃ ＩｇＧ表面上で、密度約６
００ＲＵにて、縦のリガンド配向で捕捉した。試験対象のＦＮ３ドメインは全て、濃度１
μＭに正規化し、水平配向における結合の試験を行った。ＦＮ３ドメインには、６つ全て
の検体チャネルを使用して、スクリーニング能力を最大化した。解離フェーズは、１０分
間、１００μＬ／分の流速にてモニターした。中間スポット結合シグナルは、基準として
使用し、検体と固定化ＩｇＧ表面との間の非特異的結合をモニターし、全ての結合応答か
ら差し引いた。処理した結合データは、１対１の単純なラングミュアの結合モデルに局所
的にフィッティングし、捕捉したＥＧＦＲ－Ｆｃに結合する各ＦＮ３ドメインのｋoffを
抽出した。
選択したＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインをスクリーニングして、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ
－３６ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上でＥＧＦＲ－Ｆｃへの結合において
、低オフレート（ｋoff）を有するものを同定し、高親和性結合剤を選択しやすくした。
０．００５％のＰＢＳを含有するＴｗｅｅｎ－２０中で、流速３０μＬ／分、チップ上で
の水平配向の６つの全リガンドチャネル上での、アミンカップリング（ｐＨ ５．０）を
介し、５μｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗－ヒトＦｃ ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を、
直接固定化した。固定化密度は、平均約１５００応答単位（ＲＵ）であり、チャネル間で
、５％未満の変動があった。ＥＧＦＲ－Ｆｃは、抗ヒトＦｃ ＩｇＧ表面上で、密度約６
００ＲＵにて、縦のリガンド配向で捕捉した。試験対象のＦＮ３ドメインは全て、濃度１
μＭに正規化し、水平配向における結合の試験を行った。ＦＮ３ドメインには、６つ全て
の検体チャネルを使用して、スクリーニング能力を最大化した。解離フェーズは、１０分
間、１００μＬ／分の流速にてモニターした。中間スポット結合シグナルは、基準として
使用し、検体と固定化ＩｇＧ表面との間の非特異的結合をモニターし、全ての結合応答か
ら差し引いた。処理した結合データは、１対１の単純なラングミュアの結合モデルに局所
的にフィッティングし、捕捉したＥＧＦＲ－Ｆｃに結合する各ＦＮ３ドメインのｋoffを
抽出した。
【0231】
ＥＧＦにより刺激されるＥＧＦＲリン酸化の阻害
ＥＧＦＲのＥＧＦ刺激リン酸化を阻害する能力について、Ａ４３１細胞において、単一
濃度で、精製ＥＧＦＲ－結合ＦＮ３ドメインの試験を行った。ＥＧＦＲリン酸化は、ＥＧ
ＦＲリン酸化（Ｔｙｒ１１７３）キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）
を用いてモニターした。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）と共に、Ｇｌｕｔ
ａＭＡＸ（商標）を含有する、１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）の入っ
た、透明な９６ウェル組織培養処理プレート（Ｎｕｎｃ）に、２０，０００個／ウェルで
、細胞を播種し、５％ ＣＯ2を含む増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。培地は、完
全に除去し、細胞は、ＦＢＳ非含有培地１００μＬ／ウェル中、５％ＣＯ2を含む増湿大
気中、３７℃で、一晩、飢餓させた。次に、細胞は、濃度２μＭの予熱した（３７℃）Ｅ
ＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン含有飢餓培地１００μＬ／ウェルで、５％ ＣＯ2を含む増湿
大気中、１時間、３７℃にて処理した。対照は、飢餓培地のみで処理した。最終濃度がＥ
ＧＦ ５０ｎｇ／ｍＬ及びＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン１μＭとなるように、組換え型ヒ
トＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号２３６－ＥＧ）１００ｎｇ／ｍＬを含
む予熱済み（３７℃）飢餓培地１００μＬ／ウェルを、添加して、穏やかに混合し、３７
℃にて、５％ ＣＯ2で１５分間インキュベートすることによって、細胞を刺激した。陰
性対照として、対照ウェルセットを１つ、非刺激のままとした。培地を完全に除去して、
細胞を、製造者の指示に従って、完全溶解緩衝液１００μＬ／ウェル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａ
ｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で、室温で、１０分間振盪させながら、溶解させた。チロシ
ン１１７３上でリン酸化されたＥＧＦＲの測定のために構成されたアッセイプレート（Ｍ
ｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、製造者の指示に従って、１．５～２時間
、室温で提供されたブロッキング溶液によりブロッキングした。次いで、プレートは、１
Ｘトリス洗浄緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）２００μＬ／ウェル
で４回洗浄した。細胞溶解物アリコット（３０μＬ／ウェル）は、アッセイプレートに移
し、プレートシーリングフィルム（ＶＷＲ）で覆い、室温で、１時間振盪させながら、イ
ンキュベートした。アッセイプレートは、トリス洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルで４回洗
浄し、その後、気泡が入らないように注意して、氷冷検出抗体溶液２５μＬ／ウェル、（
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を各ウェルに添加した。プレートは、室温
で、１時間振盪させながら、インキュベートし、その後、トリス洗浄緩衝液２００μＬ／
ウェルで４回洗浄した。シグナルは、Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）１５０μＬ／ウェル、を添加することによって検出され、製造業者
によるアッセイ特定デフォルト設定を用いて、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ
６０００装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取った。各ＥＧＦＲ
結合ＦＮ３ドメインのＥＧＦにより刺激された陽性対照シグナル伝達の阻害率を算出した
。
ＥＧＦＲのＥＧＦ刺激リン酸化を阻害する能力について、Ａ４３１細胞において、単一
濃度で、精製ＥＧＦＲ－結合ＦＮ３ドメインの試験を行った。ＥＧＦＲリン酸化は、ＥＧ
ＦＲリン酸化（Ｔｙｒ１１７３）キット（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）
を用いてモニターした。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）と共に、Ｇｌｕｔ
ａＭＡＸ（商標）を含有する、１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）の入っ
た、透明な９６ウェル組織培養処理プレート（Ｎｕｎｃ）に、２０，０００個／ウェルで
、細胞を播種し、５％ ＣＯ2を含む増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。培地は、完
全に除去し、細胞は、ＦＢＳ非含有培地１００μＬ／ウェル中、５％ＣＯ2を含む増湿大
気中、３７℃で、一晩、飢餓させた。次に、細胞は、濃度２μＭの予熱した（３７℃）Ｅ
ＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン含有飢餓培地１００μＬ／ウェルで、５％ ＣＯ2を含む増湿
大気中、１時間、３７℃にて処理した。対照は、飢餓培地のみで処理した。最終濃度がＥ
ＧＦ ５０ｎｇ／ｍＬ及びＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン１μＭとなるように、組換え型ヒ
トＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号２３６－ＥＧ）１００ｎｇ／ｍＬを含
む予熱済み（３７℃）飢餓培地１００μＬ／ウェルを、添加して、穏やかに混合し、３７
℃にて、５％ ＣＯ2で１５分間インキュベートすることによって、細胞を刺激した。陰
性対照として、対照ウェルセットを１つ、非刺激のままとした。培地を完全に除去して、
細胞を、製造者の指示に従って、完全溶解緩衝液１００μＬ／ウェル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａ
ｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で、室温で、１０分間振盪させながら、溶解させた。チロシ
ン１１７３上でリン酸化されたＥＧＦＲの測定のために構成されたアッセイプレート（Ｍ
ｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、製造者の指示に従って、１．５～２時間
、室温で提供されたブロッキング溶液によりブロッキングした。次いで、プレートは、１
Ｘトリス洗浄緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）２００μＬ／ウェル
で４回洗浄した。細胞溶解物アリコット（３０μＬ／ウェル）は、アッセイプレートに移
し、プレートシーリングフィルム（ＶＷＲ）で覆い、室温で、１時間振盪させながら、イ
ンキュベートした。アッセイプレートは、トリス洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルで４回洗
浄し、その後、気泡が入らないように注意して、氷冷検出抗体溶液２５μＬ／ウェル、（
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を各ウェルに添加した。プレートは、室温
で、１時間振盪させながら、インキュベートし、その後、トリス洗浄緩衝液２００μＬ／
ウェルで４回洗浄した。シグナルは、Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）１５０μＬ／ウェル、を添加することによって検出され、製造業者
によるアッセイ特定デフォルト設定を用いて、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ
６０００装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取った。各ＥＧＦＲ
結合ＦＮ３ドメインのＥＧＦにより刺激された陽性対照シグナル伝達の阻害率を算出した
。
【0232】
ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリから同定された２３２のクローンについて、ＥＧＦに
より刺激されたＥＧＦＲリン酸化の阻害を測定した。これらのクローンうちの２２個は、
１μＭの濃度で５０％以上のＥＧＦＲのリン酸化を阻害した。発現が不完全であるか、又
はサイズ排除クロマトグラフィーによって多量体であると判断されたクローンを除去後、
９つのクローンについて、更なる生物学的特徴決定を行った。これらのクローンのＢＣ及
びＦＧループ配列は、表４に示す。９個の選択されたクローン中８個は、共通のＦＧルー
プ配列（ＨＮＶＹＫＤＴＮＭＲＧＬ、配列番号９５）を有し、有意な類似性を示す領域は
、ＢＣループ配列中のいくつかのクローン間で見られた。
より刺激されたＥＧＦＲリン酸化の阻害を測定した。これらのクローンうちの２２個は、
１μＭの濃度で５０％以上のＥＧＦＲのリン酸化を阻害した。発現が不完全であるか、又
はサイズ排除クロマトグラフィーによって多量体であると判断されたクローンを除去後、
９つのクローンについて、更なる生物学的特徴決定を行った。これらのクローンのＢＣ及
びＦＧループ配列は、表４に示す。９個の選択されたクローン中８個は、共通のＦＧルー
プ配列（ＨＮＶＹＫＤＴＮＭＲＧＬ、配列番号９５）を有し、有意な類似性を示す領域は
、ＢＣループ配列中のいくつかのクローン間で見られた。
【0233】
【表4】
【0234】
実施例３：ＥＧＦ結合を阻害するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの特徴決定
大規模発現、精製及びエンドトキシン除去
表４に示すＦＮ３ドメインをスケールアップさせて、詳細な特徴決定のために更なる物
質を提供した。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン変異体を含む一晩培養物を使用して、１０
０μｇ／ｍＬのアンピシリンを一晩培養物の１／８０に希釈して、新鮮培地に添加した、
テリフィックブロス（Terrific broth）培地０．８Ｌに接種し、３７℃で、振盪させなが
らインキュベートした。６００ｎｍでの吸光度が約１．２～１．５に到達したとき、最終
濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することによって培養物を誘導し、温度を３０
℃まで低下させた。４時間後、遠心分離によって細胞を回収し、細胞ペレットは、必要に
なるまで、－８０℃で保管された。
大規模発現、精製及びエンドトキシン除去
表４に示すＦＮ３ドメインをスケールアップさせて、詳細な特徴決定のために更なる物
質を提供した。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン変異体を含む一晩培養物を使用して、１０
０μｇ／ｍＬのアンピシリンを一晩培養物の１／８０に希釈して、新鮮培地に添加した、
テリフィックブロス（Terrific broth）培地０．８Ｌに接種し、３７℃で、振盪させなが
らインキュベートした。６００ｎｍでの吸光度が約１．２～１．５に到達したとき、最終
濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することによって培養物を誘導し、温度を３０
℃まで低下させた。４時間後、遠心分離によって細胞を回収し、細胞ペレットは、必要に
なるまで、－８０℃で保管された。
【0235】
細胞溶解のため、解凍したペレットを、２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（登録商標）（Ｓ
ｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１ｋＵ／ｍＬのｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖａ
ｇｅｎ ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した、１Ｘバグバスター（登録商標）
中に、ペレット１グラム当たりバグバスター（登録商標）５ｍＬの比率で、再懸濁した。
溶解を、穏やかに攪拌しながら室温で１時間進行させ、その後、４℃で、５０分間、５６
，０００×ｇで遠心分離した。上清を採取して、０．２μｍフィルターで濾過し、ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ｓクロマトグラフィーシステ
ムを用いて、緩衝液Ａ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ ７．５、ＮａＣｌ ５００
ｍＭ、イミダゾール１０ｍＭ）で事前に平衡化させた５－ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカ
ラムに仕込んだ。このカラムを、２０カラム容量分の緩衝液Ａで洗浄し、更に、６カラム
容量分の１６％緩衝液Ｂ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ ５００
ｍＭ、イミダゾール２５０ｍＭ）で洗浄した。ＦＮ３ドメインを１０カラム容量分の５０
％ Ｂで溶出させ、その後、６カラム容量超の５０～１００％Ｂからの勾配で溶出させた
。ＦＮ３ドメインタンパク質を含有する画分をプールし、濃縮器Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １
０Ｋ ＭＷＣＯを用いて濃縮し、ＰＢＳで事前に平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）１６／
６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に仕込む前
に濾過した。サイズ排除カラムから溶出されるタンパク質モノマーのピークが保持された
。
ｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１ｋＵ／ｍＬのｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖａ
ｇｅｎ ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した、１Ｘバグバスター（登録商標）
中に、ペレット１グラム当たりバグバスター（登録商標）５ｍＬの比率で、再懸濁した。
溶解を、穏やかに攪拌しながら室温で１時間進行させ、その後、４℃で、５０分間、５６
，０００×ｇで遠心分離した。上清を採取して、０．２μｍフィルターで濾過し、ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ｓクロマトグラフィーシステ
ムを用いて、緩衝液Ａ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ ７．５、ＮａＣｌ ５００
ｍＭ、イミダゾール１０ｍＭ）で事前に平衡化させた５－ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカ
ラムに仕込んだ。このカラムを、２０カラム容量分の緩衝液Ａで洗浄し、更に、６カラム
容量分の１６％緩衝液Ｂ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ ５００
ｍＭ、イミダゾール２５０ｍＭ）で洗浄した。ＦＮ３ドメインを１０カラム容量分の５０
％ Ｂで溶出させ、その後、６カラム容量超の５０～１００％Ｂからの勾配で溶出させた
。ＦＮ３ドメインタンパク質を含有する画分をプールし、濃縮器Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ １
０Ｋ ＭＷＣＯを用いて濃縮し、ＰＢＳで事前に平衡化したＨｉＬｏａｄ（商標）１６／
６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に仕込む前
に濾過した。サイズ排除カラムから溶出されるタンパク質モノマーのピークが保持された
。
【0236】
エンドトキシンは、ＡｃｔｉＣｌｅａｎ Ｅｔｏｘ樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いるバッチ法を用いて除去した。エンドトキシン除去前、
この樹脂を、３７℃で２時間（又は４℃で一晩）、１Ｎ ＮａＯＨで前処理し、ｐＨ試験
紙で計測したとき、ｐＨが約７に安定するまで、ＰＢＳで広範囲にわたり洗浄した。精製
されたタンパク質は、樹脂１ｍＬに対してタンパク質１０ｍＬの比率で、Ｅｔｏｘ樹脂１
ｍＬに添加する前に、０．２μｍフィルターで濾過した。エンドトキシンの樹脂への結合
は、少なくとも２時間、室温で、ゆっくり回転させながら進行させた。この樹脂には、２
分間、５００×ｇの遠心分離によって除去が行われ、タンパク質の上清は保持された。エ
ンドトキシンレベルは、ＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）ＰＴＳ（商標）カートリッジを使
用して測定し、読み取り機のＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）－ＭＣＳ（Ｃｈａｒｌｅｓ
Ｒｉｖｅｒ）で分析した。第１のＥｔｏｘ処理後、エンドトキシン濃度が５ＥＵ／ｍｇ超
である場合、エンドトキシンレベルが５ＥＵ／ｍｇ以下に低下するまで、この手順を繰り
返し行った。エンドトキシン濃度が５ＥＵ／ｍｇ超であり、Ｅｔｏｘで２回連続処理した
後にも安定していた場合は、残留エンドトキシンを除去するために、そのタンパク質に対
して、陰イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィー条件を確
立した。
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いるバッチ法を用いて除去した。エンドトキシン除去前、
この樹脂を、３７℃で２時間（又は４℃で一晩）、１Ｎ ＮａＯＨで前処理し、ｐＨ試験
紙で計測したとき、ｐＨが約７に安定するまで、ＰＢＳで広範囲にわたり洗浄した。精製
されたタンパク質は、樹脂１ｍＬに対してタンパク質１０ｍＬの比率で、Ｅｔｏｘ樹脂１
ｍＬに添加する前に、０．２μｍフィルターで濾過した。エンドトキシンの樹脂への結合
は、少なくとも２時間、室温で、ゆっくり回転させながら進行させた。この樹脂には、２
分間、５００×ｇの遠心分離によって除去が行われ、タンパク質の上清は保持された。エ
ンドトキシンレベルは、ＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）ＰＴＳ（商標）カートリッジを使
用して測定し、読み取り機のＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）－ＭＣＳ（Ｃｈａｒｌｅｓ
Ｒｉｖｅｒ）で分析した。第１のＥｔｏｘ処理後、エンドトキシン濃度が５ＥＵ／ｍｇ超
である場合、エンドトキシンレベルが５ＥＵ／ｍｇ以下に低下するまで、この手順を繰り
返し行った。エンドトキシン濃度が５ＥＵ／ｍｇ超であり、Ｅｔｏｘで２回連続処理した
後にも安定していた場合は、残留エンドトキシンを除去するために、そのタンパク質に対
して、陰イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィー条件を確
立した。
【0237】
選択されたＥＧＦＲ－結合ＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ－Ｆｃに対する親和性（ＥＧＦＲ
－Ｆｃ親和性）測定
選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの組換え型ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合親
和性について、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いた表面プ
ラズモン共鳴法から、更に特性を決定した。アッセイ設定（チップの調製、ＥＧＦＲ－Ｆ
ｃの捕捉）は、上述のオフレート分析と同様であった。選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ド
メインの試験は、１μＭの濃度で、３倍希釈系列で、水平方向で行った。緩衝液サンプル
も注入して、ベースラインの安定性をモニターした。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの全
ての濃度に対して、解離相（dissociation phase）を、流速１００μＬ／分で、３０分間
、（オフレートスクリーニングから、ｋoffが約１０-2ｓ-1以上の場合）又は１時間（ｋo
ffが約１０-3ｓ-1以下の場合）モニターした。次の２つの参照データのセットを、応答デ
ータから減算した：１）ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと固定化ＩｇＧ表面間の非特異的相
互作用を修正するためのスポット間シグナル、２）経時的な、捕捉されたＥＧＦＲ－Ｆｃ
表面の解離による、ベースライン変動を修正するための緩衝液チャネルシグナル。各ＦＮ
３ドメインに対する全ての濃度における、処理後の結合データを、１対１の単純なラング
ミュアの結合モデルに全体的にフィッティングし、動力学的定数（ｋon、ｋoff）及び親
和性（ＫD）定数の推定値を抽出した。表５には、各構造の動力学的定数について、２０
０ｐＭ～９．６ｎＭで親和性が変化することが示されている。
－Ｆｃ親和性）測定
選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの組換え型ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合親
和性について、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いた表面プ
ラズモン共鳴法から、更に特性を決定した。アッセイ設定（チップの調製、ＥＧＦＲ－Ｆ
ｃの捕捉）は、上述のオフレート分析と同様であった。選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ド
メインの試験は、１μＭの濃度で、３倍希釈系列で、水平方向で行った。緩衝液サンプル
も注入して、ベースラインの安定性をモニターした。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの全
ての濃度に対して、解離相（dissociation phase）を、流速１００μＬ／分で、３０分間
、（オフレートスクリーニングから、ｋoffが約１０-2ｓ-1以上の場合）又は１時間（ｋo
ffが約１０-3ｓ-1以下の場合）モニターした。次の２つの参照データのセットを、応答デ
ータから減算した：１）ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと固定化ＩｇＧ表面間の非特異的相
互作用を修正するためのスポット間シグナル、２）経時的な、捕捉されたＥＧＦＲ－Ｆｃ
表面の解離による、ベースライン変動を修正するための緩衝液チャネルシグナル。各ＦＮ
３ドメインに対する全ての濃度における、処理後の結合データを、１対１の単純なラング
ミュアの結合モデルに全体的にフィッティングし、動力学的定数（ｋon、ｋoff）及び親
和性（ＫD）定数の推定値を抽出した。表５には、各構造の動力学的定数について、２０
０ｐＭ～９．６ｎＭで親和性が変化することが示されている。
【0238】
細胞上での選択ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとＥＧＦＲとの結合（「Ａ４３１細胞結合
アッセイ」）
Ａ４３１細胞を、不透明の黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播
種し、５％ ＣＯ2の増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。精製されたＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン（１．５ｎＭ～３０μＭ）を細胞（５０μＬ中）に添加し、３つのプレート
で、室温にて１時間インキュベートした。上清を除去し、細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液１
５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液中に１対１００に希釈し
た抗－ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ－Ａｌｅｘａ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）５０
μＬ／ウェルを用いて、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５０μＬ／
ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００
μＬを入れ、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、４８８ｎｍにて蛍光を読み取
った。データは、生蛍光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロ
ットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、Ｓ字形用量反応曲線にフィッティングさせ、ＥＣ50値を算
出した。表５には、各構造のＥＣ50が、２．２ｎＭ～２０μＭ超にわたることが示されて
いる。
アッセイ」）
Ａ４３１細胞を、不透明の黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播
種し、５％ ＣＯ2の増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。精製されたＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン（１．５ｎＭ～３０μＭ）を細胞（５０μＬ中）に添加し、３つのプレート
で、室温にて１時間インキュベートした。上清を除去し、細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液１
５０μＬ／ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液中に１対１００に希釈し
た抗－ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ－Ａｌｅｘａ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）５０
μＬ／ウェルを用いて、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５０μＬ／
ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００
μＬを入れ、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、４８８ｎｍにて蛍光を読み取
った。データは、生蛍光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロ
ットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、Ｓ字形用量反応曲線にフィッティングさせ、ＥＣ50値を算
出した。表５には、各構造のＥＣ50が、２．２ｎＭ～２０μＭ超にわたることが示されて
いる。
【0239】
選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを用いた、細胞上でのＥＧＦＲに対するＥＧＦ
結合の阻害（Ａ４３１細胞ＥＧＦ競合アッセイ）
Ａ４３１細胞を、不透明の黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播
種し、５％ ＣＯ2の増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。精製されたＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン（１．５ｎＭ～３０μＭ）を細胞（５０μＬ／ウェル）に添加し、３つのプ
レートで、室温にて１時間インキュベートした。ビオチン化ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ，カタログ番号Ｅ－３４７７）は、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬとなるように、各ウェルに
添加し、室温で１０分間インキュベートした。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液１５０μＬ／
ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液中に１対１００に希釈したストレプ
トアビジン－フィコエリトリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬ／ウェ
ルを用いて、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦ
ＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを入れ
、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、６００ｎｍにて蛍光を読み取った。デー
タは、生蛍光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロットし、可
変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ）により、Ｓ字形用量反応曲線にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。表
５には、このＩＣ50値が、１．８ｎＭ～１２１ｎＭにわたることが示されている。
結合の阻害（Ａ４３１細胞ＥＧＦ競合アッセイ）
Ａ４３１細胞を、不透明の黒の９６ウェルプレート中にて、５，０００個／ウェルで播
種し、５％ ＣＯ2の増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。精製されたＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン（１．５ｎＭ～３０μＭ）を細胞（５０μＬ／ウェル）に添加し、３つのプ
レートで、室温にて１時間インキュベートした。ビオチン化ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ，カタログ番号Ｅ－３４７７）は、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬとなるように、各ウェルに
添加し、室温で１０分間インキュベートした。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液１５０μＬ／
ウェルで３回洗浄した。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液中に１対１００に希釈したストレプ
トアビジン－フィコエリトリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬ／ウェ
ルを用いて、２０分間、室温にてインキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦ
ＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを入れ
、読み取り機のＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３を用いて、６００ｎｍにて蛍光を読み取った。デー
タは、生蛍光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロットし、可
変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ）により、Ｓ字形用量反応曲線にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。表
５には、このＩＣ50値が、１．８ｎＭ～１２１ｎＭにわたることが示されている。
【0240】
ＥＧＦにより刺激されたＥＧＦＲリン酸化の阻害（リン酸化ＥＧＲＦアッセイ）
ＥＧＦにより刺激されたＥＧＦＲリン酸化が著しく阻害された選択ＦＮ３ドメインにつ
いて、阻害に対するＩＣ50値を測定することによって、更に完全に評価した。ＥＧＦによ
り刺激されたＥＧＦＲリン酸化の阻害を、上記の「ＥＧＦにより刺激されたＥＧＦＲリン
酸化の阻害」に記載されたように、ＦＮ３ドメインの濃度を変化させて（０．５ｎＭ～１
０μＭ）評価した。データは、電気化学発光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の
対数に対して、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４
（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、データをＳ字形用量反応にフィッティ
ングさせ、ＩＣ50値を算出した。表５には、このＩＣ50値が、１８ｎＭ～２．５μＭ超に
わたることが示されている。
ＥＧＦにより刺激されたＥＧＦＲリン酸化が著しく阻害された選択ＦＮ３ドメインにつ
いて、阻害に対するＩＣ50値を測定することによって、更に完全に評価した。ＥＧＦによ
り刺激されたＥＧＦＲリン酸化の阻害を、上記の「ＥＧＦにより刺激されたＥＧＦＲリン
酸化の阻害」に記載されたように、ＦＮ３ドメインの濃度を変化させて（０．５ｎＭ～１
０μＭ）評価した。データは、電気化学発光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の
対数に対して、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４
（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、データをＳ字形用量反応にフィッティ
ングさせ、ＩＣ50値を算出した。表５には、このＩＣ50値が、１８ｎＭ～２．５μＭ超に
わたることが示されている。
【0241】
ヒト腫瘍細胞増殖の阻害（ＮＣＩ－Ｈ２９２増殖及びＮＣＩ－Ｈ３２２増殖アッセイ）
ＥＧＦＲ依存性細胞増殖の阻害を、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインへの暴露の後に、ＥＧ
ＦＲ過剰発現ヒト腫瘍細胞株ＮＣＩ－Ｈ２９２及びＮＣＩ－Ｈ３２２（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号はそれぞれ、ＣＲＬ
－１８４８、ＣＲＬ－５８０６）の生存度を測定することによって評価した。
ＥＧＦＲ依存性細胞増殖の阻害を、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインへの暴露の後に、ＥＧ
ＦＲ過剰発現ヒト腫瘍細胞株ＮＣＩ－Ｈ２９２及びＮＣＩ－Ｈ３２２（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号はそれぞれ、ＣＲＬ
－１８４８、ＣＲＬ－５８０６）の生存度を測定することによって評価した。
【0242】
【表5】
【0243】
不透明な白色９６ウェル組織培養処理済みプレート（Ｎｕｎｃ）中にて、ＧｌｕｔａＭ
ＡＸ（商標）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）１００
μＬ／ウェルに、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／
ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加して、細胞５００個／ウェル（ＮＣＩ－Ｈ２９
２）又は細胞１，０００個／ウェル（ＮＣＩ－Ｈ３２２）で、細胞を播種し、５％ＣＯ2
を含む増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。細胞は、ある濃度範囲のＥＧＦＲ－結合Ｆ
Ｎ３ドメインを含むリン酸塩－緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５μＬ／ウェルを添加すること
によって、処理した。対照は、５μＬ／ウェルのＰＢＳのみ又は２５ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸を含むＰＢＳで処理した。細胞は１２０時間にわたって、３７℃、５％ ＣＯ2
にてインキュベートした。生細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）７５μＬ／ウェルを添加することによって、検出し、その後、プレートシ
ェイカーで２分間混合し、暗所で、室温で、更に１０分間、インキュベートした。培地の
みのブランクに対して、読取り時間０．５秒／ウェルで発光モードに設定した、プレート
リーダーのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて、
プレートの読み取りを行った。データは、ＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対するＰＢ
Ｓ処理細胞増殖率として、プロットした。可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐ
ｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、データをＳ字形用量反応式
にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。表５には、ＮＣＩ－Ｈ２９２及びＮＣＩ－
Ｈ３２２細胞を用いたＩＣ50値が、それぞれ５．９ｎＭ～１．１５μＭ及び９．２ｎＭ～
３．１μＭ超にわたることが示されている。表５は、各アッセイに対するＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメインの生物学的特性の一覧を示す。
ＡＸ（商標）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）１００
μＬ／ウェルに、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／
ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加して、細胞５００個／ウェル（ＮＣＩ－Ｈ２９
２）又は細胞１，０００個／ウェル（ＮＣＩ－Ｈ３２２）で、細胞を播種し、５％ＣＯ2
を含む増湿大気中、３７℃で一晩付着させた。細胞は、ある濃度範囲のＥＧＦＲ－結合Ｆ
Ｎ３ドメインを含むリン酸塩－緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５μＬ／ウェルを添加すること
によって、処理した。対照は、５μＬ／ウェルのＰＢＳのみ又は２５ｍＭエチレンジアミ
ン四酢酸を含むＰＢＳで処理した。細胞は１２０時間にわたって、３７℃、５％ ＣＯ2
にてインキュベートした。生細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）７５μＬ／ウェルを添加することによって、検出し、その後、プレートシ
ェイカーで２分間混合し、暗所で、室温で、更に１０分間、インキュベートした。培地の
みのブランクに対して、読取り時間０．５秒／ウェルで発光モードに設定した、プレート
リーダーのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて、
プレートの読み取りを行った。データは、ＦＮ３ドメインのモル濃度の対数に対するＰＢ
Ｓ処理細胞増殖率として、プロットした。可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐ
ｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、データをＳ字形用量反応式
にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。表５には、ＮＣＩ－Ｈ２９２及びＮＣＩ－
Ｈ３２２細胞を用いたＩＣ50値が、それぞれ５．９ｎＭ～１．１５μＭ及び９．２ｎＭ～
３．１μＭ超にわたることが示されている。表５は、各アッセイに対するＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメインの生物学的特性の一覧を示す。
【0244】
実施例４：ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの改変
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのサブセットは、各分子の立体配座の安定性を高める設計
がなされた。ＦＮ３ドメイン安定性の向上を示した突然変異Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８
６Ｉ（米国特許第２０１１／０２７４６２３号に記載されている）は、ＤＮＡ合成により
クローンＰ５４ＡＲ４－８３、Ｐ５４ＣＲ４－３１及びＰ５４ＡＲ４－３７に組み込んだ
。新規突然変異Ｐ５４ＡＲ５－８３ｖ２、Ｐ５４ＣＲ４３１－ｖ２及びＰ５４ＡＲ４－３
７ｖ２は、前述のように発現させ、精製した。ＰＢＳでの示差走査熱量測定を用いて、対
応する親分子の安定性と比較するために各変異体の安定性を評価した。表６は、各変異体
分子のＴm １８．５℃の平均増加により、大幅に安定化したことを示す。
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのサブセットは、各分子の立体配座の安定性を高める設計
がなされた。ＦＮ３ドメイン安定性の向上を示した突然変異Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８
６Ｉ（米国特許第２０１１／０２７４６２３号に記載されている）は、ＤＮＡ合成により
クローンＰ５４ＡＲ４－８３、Ｐ５４ＣＲ４－３１及びＰ５４ＡＲ４－３７に組み込んだ
。新規突然変異Ｐ５４ＡＲ５－８３ｖ２、Ｐ５４ＣＲ４３１－ｖ２及びＰ５４ＡＲ４－３
７ｖ２は、前述のように発現させ、精製した。ＰＢＳでの示差走査熱量測定を用いて、対
応する親分子の安定性と比較するために各変異体の安定性を評価した。表６は、各変異体
分子のＴm １８．５℃の平均増加により、大幅に安定化したことを示す。
【0245】
【表6】
【0246】
実施例５．ｃ－Ｍｅｔに結合し、ＨＧＦ結合を阻害するフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆ
Ｎ３）ドメインの選択
ヒトｃ－Ｍｅｔのパニング
ＴＣＬ１４ライブラリについて、ビオチン化－ヒトｃ－Ｍｅｔ細胞外ドメイン（ｂｔ－
ｃ－Ｍｅｔ）に対するスクリーニングを行い、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合できるＦＮ３ド
メインを同定した。選択のために、ＴＣＬ１４ライブラリ３μｇは、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｓ３
０ Ｌｉｎｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＣｉ
ｓ－ブロック（２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
、１００μｇ／ｍＬ Ｈｅｒｒｉｎｇ Ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１ｍｇ
／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））でブロッキングした発現ライブラリに
おいてインビトロ転写及び翻訳（ＩＶＴＴ）した。選択のために、ｂｔ－ｃ－Ｍｅｔを４
００ｎＭ（１回目）、２００ｎＭ（２及び３回目）及び１００ｎＭ（４及び５回目）の濃
度で添加した。ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）（１、３及び５回目）又はストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）（２及び４回目）を用いて、結合ライブラリメンバーを回収し、５００μＬの
ＰＢＳ－Ｔで、５～１４回ビーズを洗浄し、その後、５００μＬのＰＢＳで２回洗浄する
ことによって、非結合ライブラリメンバーを除去した。
Ｎ３）ドメインの選択
ヒトｃ－Ｍｅｔのパニング
ＴＣＬ１４ライブラリについて、ビオチン化－ヒトｃ－Ｍｅｔ細胞外ドメイン（ｂｔ－
ｃ－Ｍｅｔ）に対するスクリーニングを行い、ｃ－Ｍｅｔに特異的に結合できるＦＮ３ド
メインを同定した。選択のために、ＴＣＬ１４ライブラリ３μｇは、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｓ３
０ Ｌｉｎｅａｒ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＣｉ
ｓ－ブロック（２％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
、１００μｇ／ｍＬ Ｈｅｒｒｉｎｇ Ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１ｍｇ
／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））でブロッキングした発現ライブラリに
おいてインビトロ転写及び翻訳（ＩＶＴＴ）した。選択のために、ｂｔ－ｃ－Ｍｅｔを４
００ｎＭ（１回目）、２００ｎＭ（２及び３回目）及び１００ｎＭ（４及び５回目）の濃
度で添加した。ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）（１、３及び５回目）又はストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）（２及び４回目）を用いて、結合ライブラリメンバーを回収し、５００μＬの
ＰＢＳ－Ｔで、５～１４回ビーズを洗浄し、その後、５００μＬのＰＢＳで２回洗浄する
ことによって、非結合ライブラリメンバーを除去した。
【0247】
更に選択操作を実施して、改善された親和性を有するＦＮ３ドメイン分子を同定した。
要約すると、上記のとおり、５回目からの産出物を調製し、以下の点を変更して追加の反
復選択操作を行った：ｂｔ－ｃ－Ｍｅｔによるインキュベーションを１時間から１５分に
短縮、ビーズ捕捉を２０分から１５分に短縮、ｂｔ－ｃ－Ｍｅｔを２５ｎＭ（６及び７回
目）又は２．５ｎＭ（８及び９回目）まで低減、かつ、過剰な非ビオチン化ｃ－Ｍｅｔの
存在下で更に１時間洗浄を実施。これらの変更の目的は、より高いオンレート及びより低
いオフレートを有し得、実質的に低いＫDが得られるバインダを同時に選択することであ
った。
要約すると、上記のとおり、５回目からの産出物を調製し、以下の点を変更して追加の反
復選択操作を行った：ｂｔ－ｃ－Ｍｅｔによるインキュベーションを１時間から１５分に
短縮、ビーズ捕捉を２０分から１５分に短縮、ｂｔ－ｃ－Ｍｅｔを２５ｎＭ（６及び７回
目）又は２．５ｎＭ（８及び９回目）まで低減、かつ、過剰な非ビオチン化ｃ－Ｍｅｔの
存在下で更に１時間洗浄を実施。これらの変更の目的は、より高いオンレート及びより低
いオフレートを有し得、実質的に低いＫDが得られるバインダを同時に選択することであ
った。
【0248】
５、７及び９回目の産生物は、ＴＣＯＮ６（配列番号３０）及びＴＣＯＮ５ Ｅ８６Ｉ
ｓｈｏｒｔ（配列番号３１）プライマーを用いて、リガーゼ非依存クローニングサイト
（ｐＥＴ１５－ＬＩＣ）を含有する改変ｐＥＴ１５ベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）にＰＣＲクローン化し、タンパク質は、標準プロト
コールを使用して、形質転換及びＩＰＴＧ導入（最終濃度１ｍＭ、３０℃で１６時間）後
、Ｃ末端Ｈｉｓ６－タグ付きタンパク質として発現された。細胞を、遠心分離によって収
集し、続いて、ニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）０．２ｍｇ／ｍ
Ｌを加えたＢｕｇｂｕｓｔｅｒ ＨＴ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で溶解させた
。細菌溶解物は、遠心分離によって浄化し、上清は、新しい９６ディープウェルプレート
に移した。
ｓｈｏｒｔ（配列番号３１）プライマーを用いて、リガーゼ非依存クローニングサイト
（ｐＥＴ１５－ＬＩＣ）を含有する改変ｐＥＴ１５ベクター（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）にＰＣＲクローン化し、タンパク質は、標準プロト
コールを使用して、形質転換及びＩＰＴＧ導入（最終濃度１ｍＭ、３０℃で１６時間）後
、Ｃ末端Ｈｉｓ６－タグ付きタンパク質として発現された。細胞を、遠心分離によって収
集し、続いて、ニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）０．２ｍｇ／ｍ
Ｌを加えたＢｕｇｂｕｓｔｅｒ ＨＴ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で溶解させた
。細菌溶解物は、遠心分離によって浄化し、上清は、新しい９６ディープウェルプレート
に移した。
【0249】
ｃ－Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を阻害するＦＮ３ドメインのスクリーニング
大腸菌溶解物に存在するＦＮ３ドメインについて、生化学的形式での、精製ｃ－Ｍｅｔ
細胞外ドメインに対するＨＧＦの結合を阻害する能力をスクリーニングした。組換え型ヒ
トｃ－Ｍｅｔ Ｆｃキメラ（ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を、９６
ウェルのＷｈｉｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ）上にコーティングし
、一晩、４℃で、インキュベートした。これらのプレートを、Ｂｉｏｔｅｋ ｐｌａｔｅ
ｗａｓｈｅｒ上で０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ－Ｔ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒ
ｉｃｈ）含有トリス緩衝生理食塩水３００μｌ／ウェルで、２回洗浄した。アッセイプレ
ートは、室温（ＲＴ）で、１時間、振盪させながらＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０
（２００μＬ／ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋ
ｌａｎｄ，ＩＬ）でブロッキングし、再び、ＴＢＳ－Ｔ３００μｌで２回洗浄した。ＦＮ
３ドメイン溶解物は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｐｌｕｓ ｒｏｂｏｔｉｃｓ ｓｙｓ
ｔｅｍを用いて、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０中に希釈した（１：１０～１：１
００，０００）。溶解物（５０μＬ／ウェル）は、振盪させながら、室温で１時間、アッ
セイプレート上でインキュベートした。これらのプレートを洗浄することなく、ｂｔ－Ｈ
ＧＦ（ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０中１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル、ビオチ
ン化）を振盪させながら、室温で３０分間、プレートに添加した。Ｔｅｎｃｏｎ２７溶解
物を含有する対照ウェルには、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０又は希釈ｂｔ－ＨＧ
Ｆのいずれかを入れた。次いで、プレートを、ＴＢＳ－Ｔ３００μＬ／ウェルで４回洗浄
し、３０～４０分間、室温で、振盪させながら、ストレプトアビジン－ＨＲＰ１００μｌ
／ウェルでインキュベートした（ＴＢＳ－Ｔで１：２０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）。再び、これらのプレートをＴＢ
Ｓ－Ｔで４回洗浄した。シグナルを発達させるために、製造業者の指示に従って調製され
たＰＯＤ化学発光基材（５０μＬ／ウェル、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）をプレートに添加し、約３分以内に、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐ
ｒｏを用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｍ５で発光を読み取った。阻害率
は、以下の式を用いて求めた。１００－（（ＲＬＵsample－平均ＲＬＵNo bt-HGF contro
l）／（平均ＲＬＵbt-HGF control－平均ＲＬＵNo bt-HGF control）*１００）。５０％
以上の阻害率は、ヒットとみなされた。
大腸菌溶解物に存在するＦＮ３ドメインについて、生化学的形式での、精製ｃ－Ｍｅｔ
細胞外ドメインに対するＨＧＦの結合を阻害する能力をスクリーニングした。組換え型ヒ
トｃ－Ｍｅｔ Ｆｃキメラ（ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を、９６
ウェルのＷｈｉｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ）上にコーティングし
、一晩、４℃で、インキュベートした。これらのプレートを、Ｂｉｏｔｅｋ ｐｌａｔｅ
ｗａｓｈｅｒ上で０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ－Ｔ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒ
ｉｃｈ）含有トリス緩衝生理食塩水３００μｌ／ウェルで、２回洗浄した。アッセイプレ
ートは、室温（ＲＴ）で、１時間、振盪させながらＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０
（２００μＬ／ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋ
ｌａｎｄ，ＩＬ）でブロッキングし、再び、ＴＢＳ－Ｔ３００μｌで２回洗浄した。ＦＮ
３ドメイン溶解物は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲｐｌｕｓ ｒｏｂｏｔｉｃｓ ｓｙｓ
ｔｅｍを用いて、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０中に希釈した（１：１０～１：１
００，０００）。溶解物（５０μＬ／ウェル）は、振盪させながら、室温で１時間、アッ
セイプレート上でインキュベートした。これらのプレートを洗浄することなく、ｂｔ－Ｈ
ＧＦ（ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０中１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル、ビオチ
ン化）を振盪させながら、室温で３０分間、プレートに添加した。Ｔｅｎｃｏｎ２７溶解
物を含有する対照ウェルには、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０又は希釈ｂｔ－ＨＧ
Ｆのいずれかを入れた。次いで、プレートを、ＴＢＳ－Ｔ３００μＬ／ウェルで４回洗浄
し、３０～４０分間、室温で、振盪させながら、ストレプトアビジン－ＨＲＰ１００μｌ
／ウェルでインキュベートした（ＴＢＳ－Ｔで１：２０００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕ
ｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）。再び、これらのプレートをＴＢ
Ｓ－Ｔで４回洗浄した。シグナルを発達させるために、製造業者の指示に従って調製され
たＰＯＤ化学発光基材（５０μＬ／ウェル、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）をプレートに添加し、約３分以内に、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐ
ｒｏを用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｍ５で発光を読み取った。阻害率
は、以下の式を用いて求めた。１００－（（ＲＬＵsample－平均ＲＬＵNo bt-HGF contro
l）／（平均ＲＬＵbt-HGF control－平均ＲＬＵNo bt-HGF control）*１００）。５０％
以上の阻害率は、ヒットとみなされた。
【0250】
ＦＮ３ドメインのハイスループットな発現及び精製
Ｈｉｓ－タグＦＮ３ドメインを、ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて浄化大腸菌溶解物から精製し、リン酸ナトリウム２０ｍＭ
、塩化ナトリウム５００ｍＭ及びイミダゾール２５０ｍＭを含む、ｐＨ ７．４の緩衝液
中に溶出させた。精製サンプルは、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ－２５プレート
（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた分析のために、ｐＨ ７．４のＰＢＳに取り替
えた。
Ｈｉｓ－タグＦＮ３ドメインを、ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて浄化大腸菌溶解物から精製し、リン酸ナトリウム２０ｍＭ
、塩化ナトリウム５００ｍＭ及びイミダゾール２５０ｍＭを含む、ｐＨ ７．４の緩衝液
中に溶出させた。精製サンプルは、ＰＤ ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ－２５プレート
（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた分析のために、ｐＨ ７．４のＰＢＳに取り替
えた。
【0251】
ｃ－Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合の阻害のＩＣ50測定
選択されたＦＮ３ドメインは、ＨＧＦ競合アッセイにおいて、更に特性決定された。精
製ＦＮ３ドメインの用量反応曲線は、上記のアッセイを用いて作成した（出発濃度５μＭ
）。阻害率を算出した。データは、阻害率として、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対し
て、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４により、デ
ータをＳ字形用量反応にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。
選択されたＦＮ３ドメインは、ＨＧＦ競合アッセイにおいて、更に特性決定された。精
製ＦＮ３ドメインの用量反応曲線は、上記のアッセイを用いて作成した（出発濃度５μＭ
）。阻害率を算出した。データは、阻害率として、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対し
て、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４により、デ
ータをＳ字形用量反応にフィッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。
【0252】
５回目からは、１対１０の希釈において、活性を示す３５個のユニークな配列が同定さ
れ、ＩＣ50値は、０．５～１５００ｎＭの範囲であった。７回目では、１対１００の希釈
において、活性を有する、３９個のユニークな配列が産生し、ＩＣ50値は、０．１６～２
．９ｎＭの範囲であった。１対１０００の希釈で活性があることをヒットと定義して、９
回目からは６６個のユニークな配列が同定された。９回目で観察されたＩＣ50値は、０．
２ｎＭという低さであった（表８）。
れ、ＩＣ50値は、０．５～１５００ｎＭの範囲であった。７回目では、１対１００の希釈
において、活性を有する、３９個のユニークな配列が産生し、ＩＣ50値は、０．１６～２
．９ｎＭの範囲であった。１対１０００の希釈で活性があることをヒットと定義して、９
回目からは６６個のユニークな配列が同定された。９回目で観察されたＩＣ50値は、０．
２ｎＭという低さであった（表８）。
【0253】
選択されたｃ－Ｍｅｔ－結合ＦＮ３ドメインのｃ－Ｍｅｔ－Ｆｃに対する親和性（ｃ－
Ｍｅｔ－Ｆｃ親和性）測定
ｃ－Ｍｅｔ－Ｆｃ融合タンパク質を実験で使用したことを除き、実施例３のＥＧＦＲ結
合ＦＮ３ドメインに対する親和性の測定のために記述されたプロトコールに従って、選択
されたｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに対して、親和性を測定した。
Ｍｅｔ－Ｆｃ親和性）測定
ｃ－Ｍｅｔ－Ｆｃ融合タンパク質を実験で使用したことを除き、実施例３のＥＧＦＲ結
合ＦＮ３ドメインに対する親和性の測定のために記述されたプロトコールに従って、選択
されたｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに対して、親和性を測定した。
【0254】
実施例６：ｃ－Ｍｅｔと結合し、ＨＧＦ結合を阻害するＦＮ３ドメインの特徴決定
上記の実施例２に記載のように、ＦＮ３ドメインを発現させ、精製する。それぞれ、上
述の実施例１及び実施例２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー及び動力学的解析を行
った。表７は、各ドメインの全アミノ酸配列に対する、Ｃストランド、ＣＤループ、Ｆス
トランド及びＦＧループの配列並びに配列番号を示す。
上記の実施例２に記載のように、ＦＮ３ドメインを発現させ、精製する。それぞれ、上
述の実施例１及び実施例２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー及び動力学的解析を行
った。表７は、各ドメインの全アミノ酸配列に対する、Ｃストランド、ＣＤループ、Ｆス
トランド及びＦＧループの配列並びに配列番号を示す。
【0255】
【表7】
ＣＤストランド残基は、配列番号に示した残基３８～４３に対応する
Ｆストランド残基は、配列番号に示した残基６５～７４に対応する
ＦＧストランド残基は、配列番号に示した残基７５～８１に対応する
【0256】
細胞上での選択ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとｃ－Ｍｅｔとの結合（「Ｈ４４１細胞
結合アッセイ」）
ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞（カタログ番号ＨＴＢ－１７４，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）は、ポリ－Ｄ－リジ
ンをコーティングした、底部が透明な黒色の９６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中、細胞２０，０００個／セルで播種し、５％ Ｃ
Ｏ2、３７℃で一晩付着させた。精製ＦＮ３ドメイン（５０μＬ／ウェル；０～１０００
ｎＭ）は、４℃で、１時間、２つのプレートで細胞に添加した。上清を除去し、ＦＡＣＳ
染色緩衝液（１５０μＬ／ウェル、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５５４
６５７）で３回洗浄した。細胞は（ＦＡＣＳ染色緩衝液で１対１６０に希釈、５０μＬ／
ウェル、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＢＡＭ０５０）、４℃で、３０分間、ビ
オチン化抗ＨＩＳ抗体と共にインキュベートした。細胞を、３回、ＦＡＣＳ染色緩衝液（
１５０μＬ／ウェル）で洗浄した後、ウェルを抗マウスＩｇＧ１－Ａｌｅｘａ ４８８コ
ンジュゲート抗体（ＦＡＣＳ染色緩衝液で１対８０に希釈、５０μＬ／ウェル、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ａ２１１２１）で、４℃で、３０分間インキ
ュベートした。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し（１５０μＬ／ウェル）、ＦＡ
ＣＳ染色緩衝液に放置した（５０μＬ／ウェル）。全蛍光量は、読み取り機のＡｃｕｍｅ
ｎ ｅＸ３を使用して測定した。データは、生蛍光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル
濃度の対数に対して、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓ
ｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、Ｓ字形用量反応曲線にフィッテ
ィングさせ、ＥＣ50値を算出した。ＦＮ３ドメインは、表８に示すとおり、ＥＣ50値が１
．４ｎＭ～２２．０ｎＭの間である、結合活性範囲を示すことがわかった。
結合アッセイ」）
ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞（カタログ番号ＨＴＢ－１７４，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）は、ポリ－Ｄ－リジ
ンをコーティングした、底部が透明な黒色の９６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中、細胞２０，０００個／セルで播種し、５％ Ｃ
Ｏ2、３７℃で一晩付着させた。精製ＦＮ３ドメイン（５０μＬ／ウェル；０～１０００
ｎＭ）は、４℃で、１時間、２つのプレートで細胞に添加した。上清を除去し、ＦＡＣＳ
染色緩衝液（１５０μＬ／ウェル、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５５４
６５７）で３回洗浄した。細胞は（ＦＡＣＳ染色緩衝液で１対１６０に希釈、５０μＬ／
ウェル、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＢＡＭ０５０）、４℃で、３０分間、ビ
オチン化抗ＨＩＳ抗体と共にインキュベートした。細胞を、３回、ＦＡＣＳ染色緩衝液（
１５０μＬ／ウェル）で洗浄した後、ウェルを抗マウスＩｇＧ１－Ａｌｅｘａ ４８８コ
ンジュゲート抗体（ＦＡＣＳ染色緩衝液で１対８０に希釈、５０μＬ／ウェル、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ａ２１１２１）で、４℃で、３０分間インキ
ュベートした。細胞は、ＦＡＣＳ染色緩衝液で３回洗浄し（１５０μＬ／ウェル）、ＦＡ
ＣＳ染色緩衝液に放置した（５０μＬ／ウェル）。全蛍光量は、読み取り機のＡｃｕｍｅ
ｎ ｅＸ３を使用して測定した。データは、生蛍光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル
濃度の対数に対して、プロットし、可変スロープを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓ
ｍ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により、Ｓ字形用量反応曲線にフィッテ
ィングさせ、ＥＣ50値を算出した。ＦＮ３ドメインは、表８に示すとおり、ＥＣ50値が１
．４ｎＭ～２２．０ｎＭの間である、結合活性範囲を示すことがわかった。
【0257】
ＨＧＦにより刺激されたｃ－Ｍｅｔリン酸化の阻害
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のｃ
－Ｍｅｔリン酸化（Ｔｙｒ１３４９）キットを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１において、ｃ－
ＭｅｔのＨＧＦ刺激リン酸化を阻害する能力について、精製ＦＮ３ドメインの試験を行っ
た。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する、
１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ及びＨＥＰＥＳ含有、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の入った、透明な９６ウェル組織培養処理プレートに、２０
，０００個／ウェルで、細胞を播種し、５％ ＣＯ2、３７℃で一晩付着させた。培養培
地は、完全に除去して、細胞は、血清非含有ＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）中で、
３７℃で、５％ ＣＯ2にて、一晩飢餓させた。次に、細胞に、１時間、３７℃にて、５
％ ＣＯ2で、２０μＭ以下の濃度の、ＦＮ３ドメインを含有する新鮮な血清非含有ＲＰ
ＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）を補充（replenish）した。対照は、培地のみで処理し
た。細胞は、組換え型ヒトＨＧＦ（１００μＬ／ウェル、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタロ
グ番号２９４－ＨＧＮ）１００ｎｇ／ｍＬで刺激し、３７℃、５％ ＣＯ2、１５分間イ
ンキュベートした。陰性対照として、対照ウェルセットを１つ、非刺激のままとした。次
に、培地を完全に除去して、細胞を、製造者の指示に従って、完全溶解緩衝液（５０μＬ
／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で、室温で、１０分間振盪させ
ながら、溶解させた。リン酸化されたｃ－Ｍｅｔの測定のために構成されたアッセイプレ
ートを、製造者の指示に従って、１時間、室温で提供されたブロッキング溶液によりブロ
ッキングした。次いで、プレートは、トリス洗浄緩衝液（２００μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ
Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で３回洗浄した。細胞溶解物（３０μＬ／ウェル）
は、アッセイプレートに移し、室温で、振盪させながら１時間インキュベートした。アッ
セイプレートは、トリス洗浄緩衝液で４回洗浄し、その後、氷冷検出抗体溶液（２５μＬ
／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を各ウェルに、１時間、室温で
、振盪させながら添加した。プレートは、再び、トリス洗浄緩衝液で４回、すすぎ洗いを
した。シグナルは、１５０ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（１５０μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ
Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加することによって検出され、製造業者によるア
ッセイ特定デフォルト設定を用いて、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ ６０００
装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取った。データは、電気化学
発光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロットし、可変スロー
プを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４により、データをＳ字形用量反応にフィ
ッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。ＦＮ３ドメインは、表８に示すとおり、ＩＣ５０
値４．６ｎＭ～１４１５ｎＭにて、リン酸化ｃ－Ｍｅｔを阻害することがわかった。
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のｃ
－Ｍｅｔリン酸化（Ｔｙｒ１３４９）キットを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１において、ｃ－
ＭｅｔのＨＧＦ刺激リン酸化を阻害する能力について、精製ＦＮ３ドメインの試験を行っ
た。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する、
１００μＬ／ウェルのＲＰＭＩ培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ及びＨＥＰＥＳ含有、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の入った、透明な９６ウェル組織培養処理プレートに、２０
，０００個／ウェルで、細胞を播種し、５％ ＣＯ2、３７℃で一晩付着させた。培養培
地は、完全に除去して、細胞は、血清非含有ＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）中で、
３７℃で、５％ ＣＯ2にて、一晩飢餓させた。次に、細胞に、１時間、３７℃にて、５
％ ＣＯ2で、２０μＭ以下の濃度の、ＦＮ３ドメインを含有する新鮮な血清非含有ＲＰ
ＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）を補充（replenish）した。対照は、培地のみで処理し
た。細胞は、組換え型ヒトＨＧＦ（１００μＬ／ウェル、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタロ
グ番号２９４－ＨＧＮ）１００ｎｇ／ｍＬで刺激し、３７℃、５％ ＣＯ2、１５分間イ
ンキュベートした。陰性対照として、対照ウェルセットを１つ、非刺激のままとした。次
に、培地を完全に除去して、細胞を、製造者の指示に従って、完全溶解緩衝液（５０μＬ
／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で、室温で、１０分間振盪させ
ながら、溶解させた。リン酸化されたｃ－Ｍｅｔの測定のために構成されたアッセイプレ
ートを、製造者の指示に従って、１時間、室温で提供されたブロッキング溶液によりブロ
ッキングした。次いで、プレートは、トリス洗浄緩衝液（２００μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ
Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で３回洗浄した。細胞溶解物（３０μＬ／ウェル）
は、アッセイプレートに移し、室温で、振盪させながら１時間インキュベートした。アッ
セイプレートは、トリス洗浄緩衝液で４回洗浄し、その後、氷冷検出抗体溶液（２５μＬ
／ウェル、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を各ウェルに、１時間、室温で
、振盪させながら添加した。プレートは、再び、トリス洗浄緩衝液で４回、すすぎ洗いを
した。シグナルは、１５０ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ（１５０μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ
Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加することによって検出され、製造業者によるア
ッセイ特定デフォルト設定を用いて、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ ６０００
装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取った。データは、電気化学
発光シグナルとして、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して、プロットし、可変スロー
プを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４により、データをＳ字形用量反応にフィ
ッティングさせ、ＩＣ50値を算出した。ＦＮ３ドメインは、表８に示すとおり、ＩＣ５０
値４．６ｎＭ～１４１５ｎＭにて、リン酸化ｃ－Ｍｅｔを阻害することがわかった。
【0258】
ヒト腫瘍細胞増殖の阻害
ｃ－Ｍｅｔ依存性細胞増殖の阻害は、Ｕ８７－ＭＧ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ番号ＨＴＢ－１４）の生存度を測定
し、その後、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに暴露することによって評価した。１０％
ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地１００μＬ／ウェルの入った不透明な白色９６ウェル組織
培養処理済みプレート（Ｎｕｎｃ）中、細胞８０００個／ウェルで、細胞を播種し、５％
ＣＯ2、３７℃で一晩付着させた。プレーティングから２４時間後、培地を吸引し、細
胞に、無血清ＲＰＭＩ培地を補充した。
ｃ－Ｍｅｔ依存性細胞増殖の阻害は、Ｕ８７－ＭＧ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ番号ＨＴＢ－１４）の生存度を測定
し、その後、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに暴露することによって評価した。１０％
ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地１００μＬ／ウェルの入った不透明な白色９６ウェル組織
培養処理済みプレート（Ｎｕｎｃ）中、細胞８０００個／ウェルで、細胞を播種し、５％
ＣＯ2、３７℃で一晩付着させた。プレーティングから２４時間後、培地を吸引し、細
胞に、無血清ＲＰＭＩ培地を補充した。
【0259】
【表8】
【0260】
血清飢餓から２４時間後、細胞はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン含有無血清培地の添加
によって処理した（３０μＬ／ウェル）。細胞は７２時間にわたって、３７℃、５％ Ｃ
Ｏ2にてインキュベートした。生細胞は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬
（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μＬ／ウェルを添加することによって、検出し、その後、プレ
ートシェイカーで１０分間混合した。読取り時間０．５秒／ウェルで発光モードに設定し
た、プレートリーダーのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅｓ）にて、プレートの読み取りを行った。データは、ＦＮ３ドメインのモル濃度の対数
に対する生蛍光単位（ＲＬＵ）として、プロットした。可変スロープを用いて、Ｇｒａｐ
ｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４により、データをＳ字形用量反応式にフィッティングさせ、Ｉ
Ｃ50値を算出した。表８に、１ｎＭ～１０００ｎＭ超の範囲のＩＣ50値を示す。
によって処理した（３０μＬ／ウェル）。細胞は７２時間にわたって、３７℃、５％ Ｃ
Ｏ2にてインキュベートした。生細胞は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬
（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μＬ／ウェルを添加することによって、検出し、その後、プレ
ートシェイカーで１０分間混合した。読取り時間０．５秒／ウェルで発光モードに設定し
た、プレートリーダーのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃ
ｅｓ）にて、プレートの読み取りを行った。データは、ＦＮ３ドメインのモル濃度の対数
に対する生蛍光単位（ＲＬＵ）として、プロットした。可変スロープを用いて、Ｇｒａｐ
ｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４により、データをＳ字形用量反応式にフィッティングさせ、Ｉ
Ｃ50値を算出した。表８に、１ｎＭ～１０００ｎＭ超の範囲のＩＣ50値を示す。
【0261】
表８に、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの特性をまとめる。
【0262】
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの熱安定性
ＰＢＳ中の示差走査熱量測定は、各ＦＮ３ドメインの安定性を評価するために使用した
。実験結果は、表９に示す。
ＰＢＳ中の示差走査熱量測定は、各ＦＮ３ドメインの安定性を評価するために使用した
。実験結果は、表９に示す。
【0263】
【表9】
【0264】
実施例７：二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の生成及び特徴決定
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の生成
実施例１～６に記載のＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの多数の組み合わせ
を、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの双方と結合できる二重特異性分子へと接合した。更に、配
列番号１０７～１１０に示されるアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、及
び配列番号１１１～１１４に示されるアミノ酸配列を有するｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイ
ンを作製し、二重特異性分子へと接合した。以下のフォーマットを維持するように、配列
番号５０～７２、１０６、１１８～１２１又は１９０～１９３（表１０）に示すアミノ酸
配列をコードする合成遺伝子を作製した。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインにペプチドリンカ
ーが続き、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが続く。ポリ－ヒスチジンタグは、精製を補助
するため、Ｃ末端で組み込まれた。表１０に記載されているこれらの分子に加え、２つの
ＦＮ３ドメイン間のリンカーを、表１１に記載されているものに従い、長さ、配列の組成
及び構造によって変化させた。いくつかの他のリンカーが、こうしたＦＮ３ドメインに連
結するために使用できると考えられている。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、単
一特異性ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインについて記載されているように、ＩＭ
ＡＣ及びゲル濾過クロマトグラフィー方法を用いて、大腸菌から発現させ、精製した。二
重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、開始剤メチオニンを含んでいても、含んでいなく
てもよいことは、当業者に明らかである。開始剤メチオニンを有する例示的な分子は、配
列番号１０６、１１８～１２１、１３８～１６５、１９０及び１９２に示すアミノ酸配列
を有する分子であり、開始剤メチオニンを有さない例示的な分子は、配列番号５０～７２
、１９１及び１９３に示す。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのための開始剤メチオニンの存
在により、適切な活性が確保され、この開始剤メチオニンは、ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイ
ンに対して影響が少ない。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の生成
実施例１～６に記載のＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの多数の組み合わせ
を、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの双方と結合できる二重特異性分子へと接合した。更に、配
列番号１０７～１１０に示されるアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、及
び配列番号１１１～１１４に示されるアミノ酸配列を有するｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイ
ンを作製し、二重特異性分子へと接合した。以下のフォーマットを維持するように、配列
番号５０～７２、１０６、１１８～１２１又は１９０～１９３（表１０）に示すアミノ酸
配列をコードする合成遺伝子を作製した。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインにペプチドリンカ
ーが続き、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが続く。ポリ－ヒスチジンタグは、精製を補助
するため、Ｃ末端で組み込まれた。表１０に記載されているこれらの分子に加え、２つの
ＦＮ３ドメイン間のリンカーを、表１１に記載されているものに従い、長さ、配列の組成
及び構造によって変化させた。いくつかの他のリンカーが、こうしたＦＮ３ドメインに連
結するために使用できると考えられている。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、単
一特異性ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインについて記載されているように、ＩＭ
ＡＣ及びゲル濾過クロマトグラフィー方法を用いて、大腸菌から発現させ、精製した。二
重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、開始剤メチオニンを含んでいても、含んでいなく
てもよいことは、当業者に明らかである。開始剤メチオニンを有する例示的な分子は、配
列番号１０６、１１８～１２１、１３８～１６５、１９０及び１９２に示すアミノ酸配列
を有する分子であり、開始剤メチオニンを有さない例示的な分子は、配列番号５０～７２
、１９１及び１９３に示す。ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのための開始剤メチオニンの存
在により、適切な活性が確保され、この開始剤メチオニンは、ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイ
ンに対して影響が少ない。
【0265】
【表10】
【0266】
【表11】
【0267】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子により、単一特異性分子のみと比較して、効力が
向上し、これは、結合活性を示す。
ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞を、９６ウェルプレートにて、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭ
Ｉ培地中に播種した。２４時間後、培地を無血清培地ＲＰＭＩに置き換えた。血清飢餓の
２４時間後、細胞は、異なるＦＮ３ドメイン濃度（高親和性単一特異性ＥＧＦＲ ＦＮ３
ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２）、低親和性単一特異性ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン
（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ５）、２つの単一特異性ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ド
メインの混合物、又は高親和性ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメイン（ＥＣＢ１）に連結する低親和
性ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインからなる二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の混合物の
いずれか）で処理した。細胞は、１時間、単一特異性又は二重特異性分子で処理し、その
後、ＥＧＦ、ＨＧＦ又はＥＧＦとＨＧＦとの組み合わせで、３７℃にて、５％ ＣＯ2で
１５分間刺激した。細胞はＭＳＤ溶解緩衝液で溶解させ、細胞のシグナル伝達は、適切な
ＭＳＤアッセイプレートを用いて、製造業者の指示に従って、上記のとおり、評価した。
向上し、これは、結合活性を示す。
ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞を、９６ウェルプレートにて、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭ
Ｉ培地中に播種した。２４時間後、培地を無血清培地ＲＰＭＩに置き換えた。血清飢餓の
２４時間後、細胞は、異なるＦＮ３ドメイン濃度（高親和性単一特異性ＥＧＦＲ ＦＮ３
ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２）、低親和性単一特異性ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン
（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ５）、２つの単一特異性ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ド
メインの混合物、又は高親和性ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメイン（ＥＣＢ１）に連結する低親和
性ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインからなる二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の混合物の
いずれか）で処理した。細胞は、１時間、単一特異性又は二重特異性分子で処理し、その
後、ＥＧＦ、ＨＧＦ又はＥＧＦとＨＧＦとの組み合わせで、３７℃にて、５％ ＣＯ2で
１５分間刺激した。細胞はＭＳＤ溶解緩衝液で溶解させ、細胞のシグナル伝達は、適切な
ＭＳＤアッセイプレートを用いて、製造業者の指示に従って、上記のとおり、評価した。
【0268】
低親和性ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインは、６１０ｎＭのＩＣ50にて、ｃ－Ｍｅｔのリン
酸化を阻害した（図４）。予想されたとおり、ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメインは、ｃ－Ｍｅｔ
のリン酸化を阻害することができず、また、単一特異性分子の混合物は、ｃ－Ｍｅｔ Ｆ
Ｎ３ドメイン単体と同様であった。しかし、二種特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、１
ｎＭのＩＣ50（図４）にて、ｃ－Ｍｅｔのリン酸化を阻害し、ｃ－Ｍｅｔ単一特異性単体
と比較した効力の向上は、２－ｌｏｇ超もシフトした。
酸化を阻害した（図４）。予想されたとおり、ＥＧＦＲ ＦＮ３ドメインは、ｃ－Ｍｅｔ
のリン酸化を阻害することができず、また、単一特異性分子の混合物は、ｃ－Ｍｅｔ Ｆ
Ｎ３ドメイン単体と同様であった。しかし、二種特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、１
ｎＭのＩＣ50（図４）にて、ｃ－Ｍｅｔのリン酸化を阻害し、ｃ－Ｍｅｔ単一特異性単体
と比較した効力の向上は、２－ｌｏｇ超もシフトした。
【0269】
結合活性効果を介して、ｃ－Ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲのリン酸化の阻害を向上させる
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の可能性は、変動するｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲの密度
及び比率を有する複数の細胞型において評価された（図５）。ＮＣＩ－Ｈ２９２、ＮＣＩ
－Ｈ４４１又はＮＣＩ－Ｈ５９６細胞を、９６ウェルプレートにて、１０％ＦＢＳを含有
するＲＰＭＩ培地中に播種した。２４時間後、培地を無血清培地ＲＰＭＩに置き換えた。
血清飢餓の２４時間後、細胞は、異なるＦＮ３ドメイン濃度（単一特異性ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン、単一特異性ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍ
ｅｔ分子（Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２及びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３から構成されるＥ
ＣＢ５）のいずれか）で処理した。細胞は、１時間、単一特異性又は二重特異性分子で処
理し、その後、ＥＧＦ、ＨＧＦ又はＥＧＦとＨＧＦとの組み合わせで、３７℃にて、５％
ＣＯ2で１５分間刺激した。細胞はＭＳＤ溶解緩衝液で溶解させ、細胞のシグナル伝達
は、適切なＭＳＤアッセイプレートを用いて、製造業者の指示に従って、上記のとおり、
評価した。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の可能性は、変動するｃ－ＭｅｔとＥＧＦＲの密度
及び比率を有する複数の細胞型において評価された（図５）。ＮＣＩ－Ｈ２９２、ＮＣＩ
－Ｈ４４１又はＮＣＩ－Ｈ５９６細胞を、９６ウェルプレートにて、１０％ＦＢＳを含有
するＲＰＭＩ培地中に播種した。２４時間後、培地を無血清培地ＲＰＭＩに置き換えた。
血清飢餓の２４時間後、細胞は、異なるＦＮ３ドメイン濃度（単一特異性ＥＧＦＲ結合Ｆ
Ｎ３ドメイン、単一特異性ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍ
ｅｔ分子（Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２及びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３から構成されるＥ
ＣＢ５）のいずれか）で処理した。細胞は、１時間、単一特異性又は二重特異性分子で処
理し、その後、ＥＧＦ、ＨＧＦ又はＥＧＦとＨＧＦとの組み合わせで、３７℃にて、５％
ＣＯ2で１５分間刺激した。細胞はＭＳＤ溶解緩衝液で溶解させ、細胞のシグナル伝達
は、適切なＭＳＤアッセイプレートを用いて、製造業者の指示に従って、上記のとおり、
評価した。
【0270】
図５（Ａ～Ｃ）は、３つの異なる細胞株において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分
子と比較して、単一特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを用いるＥＧＦＲの阻害を示す。
ＥＧＦＲリン酸化アッセイにおいて、結合活性を評価するために、中程度の親和性のＥＧ
ＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１．９ｎＭ）（Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２）を、高親和性のｃ
－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（０．４ｎＭ）（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３）に連結され
た同一のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含有する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子と
比較した。Ｈ２９２及びＨ５９６細胞では、単一特異性及び二重特異性分子についてＥＧ
ＦＲのリン酸化の阻害は同等であった（図５Ａ及び図５Ｂ）。これはおそらく、これらの
細胞株は、ＥＧＦＲ対ｃ－Ｍｅｔ受容体の比率が高いためである。この理論を試してみる
ために、ＥＧＦＲよりｃ－Ｍｅｔ受容体が多いＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において、ＥＧＦＲ
のリン酸化の阻害を評価した。ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
分子で処理することにより、単一特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して、ＥＧＦ
Ｒのリン酸化の阻害を示すＩＣ50が３０倍低下した（図５Ｃ）。
子と比較して、単一特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを用いるＥＧＦＲの阻害を示す。
ＥＧＦＲリン酸化アッセイにおいて、結合活性を評価するために、中程度の親和性のＥＧ
ＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１．９ｎＭ）（Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２）を、高親和性のｃ
－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（０．４ｎＭ）（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３）に連結され
た同一のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含有する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子と
比較した。Ｈ２９２及びＨ５９６細胞では、単一特異性及び二重特異性分子についてＥＧ
ＦＲのリン酸化の阻害は同等であった（図５Ａ及び図５Ｂ）。これはおそらく、これらの
細胞株は、ＥＧＦＲ対ｃ－Ｍｅｔ受容体の比率が高いためである。この理論を試してみる
ために、ＥＧＦＲよりｃ－Ｍｅｔ受容体が多いＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において、ＥＧＦＲ
のリン酸化の阻害を評価した。ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
分子で処理することにより、単一特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して、ＥＧＦ
Ｒのリン酸化の阻害を示すＩＣ50が３０倍低下した（図５Ｃ）。
【0271】
ｃ－Ｍｅｔリン酸化アッセイで、ＥＧＦＲ親和性が高く（０．２６ｎＭ）、ｃ－Ｍｅｔ
親和性が中程度（１０．１ｎＭ）である分子を用いて、二種特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
分子により能力が増大する可能性を評価した。ＮＣＩ－Ｈ２９２及びＮＣＩ－Ｈ５９６細
胞では、いずれも、ｃ－Ｍｅｔのリン酸化の阻害が二重特異性分子により、単一特異性ｃ
－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと比較して、それぞれ、１３４倍及び１０１２倍、増大した
（図３Ｄ及び３Ｅ）。
親和性が中程度（１０．１ｎＭ）である分子を用いて、二種特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
分子により能力が増大する可能性を評価した。ＮＣＩ－Ｈ２９２及びＮＣＩ－Ｈ５９６細
胞では、いずれも、ｃ－Ｍｅｔのリン酸化の阻害が二重特異性分子により、単一特異性ｃ
－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと比較して、それぞれ、１３４倍及び１０１２倍、増大した
（図３Ｄ及び３Ｅ）。
【0272】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子により、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔリン酸化の阻害
の効力が増大されることにより、シグナル伝達及び増殖の阻害の増大がもたらされること
が確認された。これらの実験では、ＦＮ３ＥＧＦＲ結合とｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン
との混合物を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子と比較した。表１２及び１３に記載さ
れている通り、細胞を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子で処理したとき、単一特異性
結合剤の混合物と比較して、ＥＲＫリン酸化のＩＣ50値（表１２）及びＨ２９２細胞の増
殖（表１３）は、低下した。二種特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子のＥＲＫリン酸化の阻
害に対するＩＣ50は、２つの単一特異性ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインの混合
物と比べて、１４３倍低く、本アッセイにおける、分子の効力に対する結合活性の効果を
示している。表１２では、単一特異性ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、十
分に活性が阻害されることはなく、このため、示されるＩＣ50値は、下限値を考慮する必
要がある。増殖アッセイは、混合物又は二重特異性の形式で連結されたもののいずれかで
、異なるＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとの組み合わせを
用いて、完了した。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の増殖阻害を示すＩＣ50値は、
単一特異性親ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの混合物と比較して、３４～２
３６倍低かった。受容体レベルで観察された結合活性効果（図４及び図５）は、細胞シグ
ナル伝達（表１２）及び細胞増殖（表１３）の阻害の改善に変換されることが確認された
。
の効力が増大されることにより、シグナル伝達及び増殖の阻害の増大がもたらされること
が確認された。これらの実験では、ＦＮ３ＥＧＦＲ結合とｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン
との混合物を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子と比較した。表１２及び１３に記載さ
れている通り、細胞を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子で処理したとき、単一特異性
結合剤の混合物と比較して、ＥＲＫリン酸化のＩＣ50値（表１２）及びＨ２９２細胞の増
殖（表１３）は、低下した。二種特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子のＥＲＫリン酸化の阻
害に対するＩＣ50は、２つの単一特異性ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメインの混合
物と比べて、１４３倍低く、本アッセイにおける、分子の効力に対する結合活性の効果を
示している。表１２では、単一特異性ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、十
分に活性が阻害されることはなく、このため、示されるＩＣ50値は、下限値を考慮する必
要がある。増殖アッセイは、混合物又は二重特異性の形式で連結されたもののいずれかで
、異なるＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとの組み合わせを
用いて、完了した。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の増殖阻害を示すＩＣ50値は、
単一特異性親ＥＧＦＲ又はｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの混合物と比較して、３４～２
３６倍低かった。受容体レベルで観察された結合活性効果（図４及び図５）は、細胞シグ
ナル伝達（表１２）及び細胞増殖（表１３）の阻害の改善に変換されることが確認された
。
【0273】
【表12】
【0274】
【表13】
【0275】
インビボでの腫瘍の異種移植片：ＰＫ／ＰＤ
単一特異性ＦＮ３ドメイン分子及び二重特異性ＦＮ３ドメイン分子のインビボでの有効
性を判断するために、ヒトＨＧＦ（マウスＨＧＦはヒトｃ－Ｍｅｔに結合しない）を分泌
するように腫瘍細胞を改変した。ヒトＨＧＦは、レンチウィルス感染（レンチウィルスＤ
ＮＡベクター発現ヒトＨＧＦ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃Ｘ１６３２２）及びレンチウイル
スパッケージングキット（Genecopoeia））を用いてＮＣＩ－Ｈ２９２細胞内に安定して
発現させた。感染後、ＨＧＦ発現細胞を、プロマイシン４μＧ／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）で選択した。ヒトＨＧＦタンパク質は、アッセイプレート（MesoScale Discovery
）を用いて、プールされた細胞のコンディショニングした培地で検出された。
単一特異性ＦＮ３ドメイン分子及び二重特異性ＦＮ３ドメイン分子のインビボでの有効
性を判断するために、ヒトＨＧＦ（マウスＨＧＦはヒトｃ－Ｍｅｔに結合しない）を分泌
するように腫瘍細胞を改変した。ヒトＨＧＦは、レンチウィルス感染（レンチウィルスＤ
ＮＡベクター発現ヒトＨＧＦ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃Ｘ１６３２２）及びレンチウイル
スパッケージングキット（Genecopoeia））を用いてＮＣＩ－Ｈ２９２細胞内に安定して
発現させた。感染後、ＨＧＦ発現細胞を、プロマイシン４μＧ／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）で選択した。ヒトＨＧＦタンパク質は、アッセイプレート（MesoScale Discovery
）を用いて、プールされた細胞のコンディショニングした培地で検出された。
【0276】
ＳＣＩＤベージュマウスの各動物の背側腹部に、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞発現ヒトＨＧＦ
（細胞２．０×１０6個、２００μＬのＣｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中）を皮下
接種した。腫瘍の測定は、腫瘍体積が１５０～２５０ｍｍ3となるまで、週２回行った。
マウスには、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子（半減期を増大するアルブミン結合ド
メインに連結される）又はＰＢＳビヒクルを腹腔内に単回投与した。腫瘍は、投与の６時
間又は７２時間後に抽出され、すぐに液体窒素で凍結した。血液サンプルを心穿刺を介し
てプロテアーゼ阻害剤を含有する３．８％クエン酸に採取した。採取直後、血液試料を遠
心分離し、得られた血漿をサンプルチューブに移し、－８０℃で保管した。腫瘍は、重量
を計測し、小さな断片に切断し、ＨＡＬＴプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Ｐｉｅ
ｒｃｅ）、フッ化ナトリウム５０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、活性化オルトバナジウム酸塩２ｍ
Ｍ（シグマ）及びＰＭＳＦ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）１ｍＭを含む、
ＲＩＰＡ緩衝液の入った溶解マトリックスＡチューブ（ＬＭＡ）で溶解した。溶解物は、
ＬＭＡマトリックスから除去し、遠心分離し、不溶性タンパク質を除去した。可溶性腫瘍
タンパク質は、ＢＣＡタンパク質アッセイで定量化し、腫瘍溶解緩衝液で同等のタンパク
質レベルに希釈した。リン酸化ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫは、（製造業者のプロト
コールに従って、上述のとおり）アッセイプレート（MesoScale Discovery）を用いて測
定した。
（細胞２．０×１０6個、２００μＬのＣｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中）を皮下
接種した。腫瘍の測定は、腫瘍体積が１５０～２５０ｍｍ3となるまで、週２回行った。
マウスには、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子（半減期を増大するアルブミン結合ド
メインに連結される）又はＰＢＳビヒクルを腹腔内に単回投与した。腫瘍は、投与の６時
間又は７２時間後に抽出され、すぐに液体窒素で凍結した。血液サンプルを心穿刺を介し
てプロテアーゼ阻害剤を含有する３．８％クエン酸に採取した。採取直後、血液試料を遠
心分離し、得られた血漿をサンプルチューブに移し、－８０℃で保管した。腫瘍は、重量
を計測し、小さな断片に切断し、ＨＡＬＴプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Ｐｉｅ
ｒｃｅ）、フッ化ナトリウム５０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）、活性化オルトバナジウム酸塩２ｍ
Ｍ（シグマ）及びＰＭＳＦ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）１ｍＭを含む、
ＲＩＰＡ緩衝液の入った溶解マトリックスＡチューブ（ＬＭＡ）で溶解した。溶解物は、
ＬＭＡマトリックスから除去し、遠心分離し、不溶性タンパク質を除去した。可溶性腫瘍
タンパク質は、ＢＣＡタンパク質アッセイで定量化し、腫瘍溶解緩衝液で同等のタンパク
質レベルに希釈した。リン酸化ｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫは、（製造業者のプロト
コールに従って、上述のとおり）アッセイプレート（MesoScale Discovery）を用いて測
定した。
【0277】
図６は、実験の結果を示す。各二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子により、６時間及
び７２時間の両方の時点で、リン酸化されたｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫのレベルが
大幅に減少した。図６に提示されたデータから、ｃ－Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方を同時に
阻害する重要性及び各受容体の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の親和性の下流ＥＲ
Ｋの阻害における役割がわかる。高親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子（Ｐ５
４ＡＲ４－８３ｖ２、図では「８」として示す、ＫD＝０．２６ｎＭ）は、中程度の親和
性を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２、図では「１７」と
して示す、ＫD＝１．９ｎＭ）を含むものと比較して、６時間及び７２時間の両方で、よ
り大きな程度でＥＧＦＲのリン酸化を阻害した。試験した４つの全ての二重特異性分子で
は、親和性に関係なく、６時間の時点で、完全にＥＲＫのリン酸化が阻害された。７２時
間の時点で、高い親和性のｃ－Ｍｅｔ結合ドメインを含有する分子（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９
４－Ａ３；図では「Ａ３」として示す、ＫD＝０．４ｎＭ）は、中程度の親和性のｃ－Ｍ
ｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ５；図中「Ａ５」として示す；Ｋ
D＝１０．１ｎＭ；図６）と比較して、ＥＲＫのリン酸化が大幅に阻害された。
び７２時間の両方の時点で、リン酸化されたｃ－Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ及びＥＲＫのレベルが
大幅に減少した。図６に提示されたデータから、ｃ－Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方を同時に
阻害する重要性及び各受容体の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の親和性の下流ＥＲ
Ｋの阻害における役割がわかる。高親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子（Ｐ５
４ＡＲ４－８３ｖ２、図では「８」として示す、ＫD＝０．２６ｎＭ）は、中程度の親和
性を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２、図では「１７」と
して示す、ＫD＝１．９ｎＭ）を含むものと比較して、６時間及び７２時間の両方で、よ
り大きな程度でＥＧＦＲのリン酸化を阻害した。試験した４つの全ての二重特異性分子で
は、親和性に関係なく、６時間の時点で、完全にＥＲＫのリン酸化が阻害された。７２時
間の時点で、高い親和性のｃ－Ｍｅｔ結合ドメインを含有する分子（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９
４－Ａ３；図では「Ａ３」として示す、ＫD＝０．４ｎＭ）は、中程度の親和性のｃ－Ｍ
ｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ５；図中「Ａ５」として示す；Ｋ
D＝１０．１ｎＭ；図６）と比較して、ＥＲＫのリン酸化が大幅に阻害された。
【0278】
各二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の濃度は、血液及び腫瘍に投与後、６時間及び
７２時間の時点で、測定した（図７）。興味深いことに、高親和性ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３
ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３；ＫD＝０．４ｎＭ）を有する二重特異性分子で
はなく、中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ドメイン（Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２；ＫD＝１
．９ｎＭ）が、６時間の時点で、他の分子に対して、大幅に多い腫瘍集積を有したが、こ
の差は、７２時間で減少した。腫瘍外の細胞では、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの表面発現レ
ベルはいずれも低く、このため、高親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して、中
程度の親和性ＥＧＦＲ分子は、正常組織に強く結合しないと仮定できる。このため、腫瘍
内では、結合できる中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含有していない。し
たがって、各受容体に対する適切な親和性を同定することにより、全身毒性の低下及び腫
瘍集積の増大を伴う治療法が特定できると考えられる。
７２時間の時点で、測定した（図７）。興味深いことに、高親和性ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３
ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３；ＫD＝０．４ｎＭ）を有する二重特異性分子で
はなく、中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ドメイン（Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２；ＫD＝１
．９ｎＭ）が、６時間の時点で、他の分子に対して、大幅に多い腫瘍集積を有したが、こ
の差は、７２時間で減少した。腫瘍外の細胞では、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの表面発現レ
ベルはいずれも低く、このため、高親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して、中
程度の親和性ＥＧＦＲ分子は、正常組織に強く結合しないと仮定できる。このため、腫瘍
内では、結合できる中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含有していない。し
たがって、各受容体に対する適切な親和性を同定することにより、全身毒性の低下及び腫
瘍集積の増大を伴う治療法が特定できると考えられる。
【0279】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子による腫瘍有効性の研究
ＳＣＩＤベージュマウスの各動物の背側腹部に、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞発現ヒトＨＧＦ
（細胞２．０×１０6個、２００μＬのＣｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中）を皮下
接種した。注入後１週間、マウスを同等の腫瘍体積を有する群に階層化した（平均腫瘍容
積＝７７．９＋／－１．７ｍｍ3）。マウスは、週３回、二重特異性分子の投与を受け、
腫瘍体積を週２回記録した。ｃ－Ｍｅｔ及びＥＧＦＲに対して異なる親和性を有する４つ
の異なる二重特異性分子により、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を観察した。図８に、高親和性
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子で処置したマウスにおいて、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ
３ドメインが中程度の親和性であるとき、中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
と比較して、腫瘍増殖の遅延が観察されたため、ｃ－Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方を阻害す
る利点を示す（白三角ｖｓ黒三角、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２～Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ
５、Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７～Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ５と比較）。更に、データから、
高親和性又は中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのいずれかを含む二重特異性
分子として、高親和性ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを有することの重要性が明らかであ
り、高親和性のｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが、最も高い有効性を示した（灰色及び黒
の点線、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２～Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３及びＰ５３Ａ１Ｒ５－１
７ｖ２～Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３）。
ＳＣＩＤベージュマウスの各動物の背側腹部に、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞発現ヒトＨＧＦ
（細胞２．０×１０6個、２００μＬのＣｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中）を皮下
接種した。注入後１週間、マウスを同等の腫瘍体積を有する群に階層化した（平均腫瘍容
積＝７７．９＋／－１．７ｍｍ3）。マウスは、週３回、二重特異性分子の投与を受け、
腫瘍体積を週２回記録した。ｃ－Ｍｅｔ及びＥＧＦＲに対して異なる親和性を有する４つ
の異なる二重特異性分子により、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を観察した。図８に、高親和性
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子で処置したマウスにおいて、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ
３ドメインが中程度の親和性であるとき、中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
と比較して、腫瘍増殖の遅延が観察されたため、ｃ－Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方を阻害す
る利点を示す（白三角ｖｓ黒三角、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２～Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ
５、Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７～Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４－Ａ５と比較）。更に、データから、
高親和性又は中程度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのいずれかを含む二重特異性
分子として、高親和性ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを有することの重要性が明らかであ
り、高親和性のｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが、最も高い有効性を示した（灰色及び黒
の点線、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２～Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３及びＰ５３Ａ１Ｒ５－１
７ｖ２～Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３）。
【0280】
二重特異性分子並びにＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの他の阻害剤の有効性
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ３８）及び低分子阻害剤クリゾチニブ（
ｃ－Ｍｅｔ阻害剤）及びエルロチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）、セツキシマブ（抗－ＥＧＦＲ
抗体）（それぞれ単剤として）、及びクリゾチニブとエルロチニブを組み合わせたものの
インビボ治療有効性を、ＳＣＩＤ／ベージュマウスのＨ２９２－ＨＧＦヒト肺癌異種移植
皮下モデルの治療において、評価した。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ３８）及び低分子阻害剤クリゾチニブ（
ｃ－Ｍｅｔ阻害剤）及びエルロチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）、セツキシマブ（抗－ＥＧＦＲ
抗体）（それぞれ単剤として）、及びクリゾチニブとエルロチニブを組み合わせたものの
インビボ治療有効性を、ＳＣＩＤ／ベージュマウスのＨ２９２－ＨＧＦヒト肺癌異種移植
皮下モデルの治療において、評価した。
【0281】
Ｈ２９２－ＨＧＦ細胞は、インビトロで、ウシ胎児血清（１０％ ｖ／ｖ）、Ｌ－グル
タミン（２ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、大気中、５％ ＣＯ２雰囲気で、
３７℃で維持した。細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により、２回／週、定期的に、継
代培養した。指数関数的増殖フェーズにおいて、増殖した細胞を採取し、腫瘍接種のため
に計数した。
タミン（２ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、大気中、５％ ＣＯ２雰囲気で、
３７℃で維持した。細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により、２回／週、定期的に、継
代培養した。指数関数的増殖フェーズにおいて、増殖した細胞を採取し、腫瘍接種のため
に計数した。
【0282】
【表14】
【0283】
Ｎ：動物数；ｐ．ｏ．：経口投与；ｉ．ｐ．：腹腔内投与３回／週：週の第１日目、第
３日目、第５日目に投与
ＱＤ：１日に１回Ｑ４ｄ：４日に１回；クリゾチニブとエルロチニブを組み合わせたも
のの間隔は、０．５時間；投与量は、体重（１０ｌ／ｇ）を基準に調整した；ａ：グルー
ピング後、第１４日目には投与しなかった。
３日目、第５日目に投与
ＱＤ：１日に１回Ｑ４ｄ：４日に１回；クリゾチニブとエルロチニブを組み合わせたも
のの間隔は、０．５時間；投与量は、体重（１０ｌ／ｇ）を基準に調整した；ａ：グルー
ピング後、第１４日目には投与しなかった。
【0284】
それぞれのマウスには、右腹部に、腫瘍成長のために、ｃｕｌｔｒｅｘを含むＰＢＳ、
０．１ｍＬ（１：１）中の、Ｈ２９２－ＨＧＦ腫瘍細胞（２×１０6個）を皮下接種した
。治療は、平均腫瘍サイズが１３９ｍｍ3に達したときに開始された。各研究群における
試験品の投与及び動物数は、以下の実験デザイン表に示す。腫瘍細胞の接種日は、第０日
目と示した。表１４は、治療群を示す。
０．１ｍＬ（１：１）中の、Ｈ２９２－ＨＧＦ腫瘍細胞（２×１０6個）を皮下接種した
。治療は、平均腫瘍サイズが１３９ｍｍ3に達したときに開始された。各研究群における
試験品の投与及び動物数は、以下の実験デザイン表に示す。腫瘍細胞の接種日は、第０日
目と示した。表１４は、治療群を示す。
【0285】
治療開始前に、全動物の重量を計量し、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は任意の所与の
治療の有効性に影響を及ぼし得るため、マウスは、腫瘍体積に基づく、無作為化ブロック
デザインを用いて各群に割り当てた。これにより、全群がベースライン値で比較できる。
無作為化ブロックデザインを用いて、各群に実験動物を割り当てた。第１に、実験動物は
、初期腫瘍体積によって、同種ブロックに分けた。第２に、各ブロック内で、治療に対す
る実験動物のランダム化を行った。無作為化ブロックデザインを用いて、実験動物を割り
当てることによって、所与の治療に割り当てるにあたって、各動物が確実に同じ確率を有
するようにして、系統誤差を低減させた。
治療の有効性に影響を及ぼし得るため、マウスは、腫瘍体積に基づく、無作為化ブロック
デザインを用いて各群に割り当てた。これにより、全群がベースライン値で比較できる。
無作為化ブロックデザインを用いて、各群に実験動物を割り当てた。第１に、実験動物は
、初期腫瘍体積によって、同種ブロックに分けた。第２に、各ブロック内で、治療に対す
る実験動物のランダム化を行った。無作為化ブロックデザインを用いて、実験動物を割り
当てることによって、所与の治療に割り当てるにあたって、各動物が確実に同じ確率を有
するようにして、系統誤差を低減させた。
【0286】
定期的モニター時に、腫瘍増殖及び治療が通常の行動に及ぼすあらゆる影響（運動性、
摂餌量及び摂水量の視覚的評価、体重増加／減少（体重は、週２回測定した）、眼／毛の
つや、並びに他のあらゆる異常作用など）について、各動物を調べた。
摂餌量及び摂水量の視覚的評価、体重増加／減少（体重は、週２回測定した）、眼／毛の
つや、並びに他のあらゆる異常作用など）について、各動物を調べた。
【0287】
エンドポイントは、腫瘍増殖を遅延させることができるか、又は腫瘍を有するマウスを
治癒することができるかのどちらかとした。腫瘍サイズは、２つの寸法を、キャリパを用
いて週２回測定し、体積は、以下の式を用いて、ｍｍ3で表された：Ｖ＝０．５ａ×ｂ2（
ここで、ａ及びｂは、それぞれ、腫瘍の長径と短径を指す）。次に、腫瘍サイズを、Ｔ－
Ｃ値及びＴ／Ｃ値の両方の計算に使用した。Ｔ－Ｃ値は、治療群の平均腫瘍サイズが１０
００ｍｍ3に到達するまでの所要時間（日）をＴ値として、また、対照群の平均腫瘍サイ
ズが同サイズに到達するまでの所要時間（日）をＣ値として算出した。Ｔ／Ｃ値（％）は
、抗腫瘍効果を示し、Ｔ値及びＣ値は、所与の日の治療群及び対照群のそれぞれの平均腫
瘍体積とした。完全な腫瘍退縮（ＣＲ）は、触診の下限値（６２．５ｍｍ3）未満まで縮
小した腫瘍と定義する。一部腫瘍退縮（ＰＲ）は、初期の腫瘍体積から縮小された腫瘍と
定義する。持続的と考え得るＣＰ又はＰＲには、最短期間として、３回以上の連続した腫
瘍測定の間でのＣＲ又はＰＲが必要とされる。
治癒することができるかのどちらかとした。腫瘍サイズは、２つの寸法を、キャリパを用
いて週２回測定し、体積は、以下の式を用いて、ｍｍ3で表された：Ｖ＝０．５ａ×ｂ2（
ここで、ａ及びｂは、それぞれ、腫瘍の長径と短径を指す）。次に、腫瘍サイズを、Ｔ－
Ｃ値及びＴ／Ｃ値の両方の計算に使用した。Ｔ－Ｃ値は、治療群の平均腫瘍サイズが１０
００ｍｍ3に到達するまでの所要時間（日）をＴ値として、また、対照群の平均腫瘍サイ
ズが同サイズに到達するまでの所要時間（日）をＣ値として算出した。Ｔ／Ｃ値（％）は
、抗腫瘍効果を示し、Ｔ値及びＣ値は、所与の日の治療群及び対照群のそれぞれの平均腫
瘍体積とした。完全な腫瘍退縮（ＣＲ）は、触診の下限値（６２．５ｍｍ3）未満まで縮
小した腫瘍と定義する。一部腫瘍退縮（ＰＲ）は、初期の腫瘍体積から縮小された腫瘍と
定義する。持続的と考え得るＣＰ又はＰＲには、最短期間として、３回以上の連続した腫
瘍測定の間でのＣＲ又はＰＲが必要とされる。
【0288】
２０％を超える重量減少が認められた場合、又は、群の平均腫瘍サイズが２０００ｍｍ
3を超えた場合、動物を安楽死させた。本研究は、最終投与から２週間観察後に終了した
。
3を超えた場合、動物を安楽死させた。本研究は、最終投与から２週間観察後に終了した
。
【0289】
表１５に示すように、各時点での各群の腫瘍体積について、平均値及び標準誤差（ＳＥ
Ｍ）などの統計概要を示す。一方向ＡＮＯＶＡに続いて、Ｇａｍｅｓ－Ｈｏｗｅｌｌを用
いて個別に比較することにより（等分散性は想定せず）、腫瘍体積の群間差に関する統計
解析を、評価した。全データを、ＳＰＳＳ１８．０を使用して解析した。ｐ＜０．０５は
、統計学的に有意であると考えられた。
Ｍ）などの統計概要を示す。一方向ＡＮＯＶＡに続いて、Ｇａｍｅｓ－Ｈｏｗｅｌｌを用
いて個別に比較することにより（等分散性は想定せず）、腫瘍体積の群間差に関する統計
解析を、評価した。全データを、ＳＰＳＳ１８．０を使用して解析した。ｐ＜０．０５は
、統計学的に有意であると考えられた。
【0290】
【表15】
【0291】
ビヒクル治療群（群１）の平均腫瘍サイズは、腫瘍接種後第２３日目に１，７５８ｍｍ
3に達した。２５ｍｇ／ｋｇの投与レベル（群２）での二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
分子による治療により、全マウスにおいて、完全腫瘍退縮（ＣＲ）となり、これは、３回
超の連続した腫瘍測定において持続性が認められた（第２３日のビヒクル群と比較して、
平均ＴＶ＝２３ｍｍ3、Ｔ／Ｃ値＝１％、ｐ＝０．００４）。
3に達した。２５ｍｇ／ｋｇの投与レベル（群２）での二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ
分子による治療により、全マウスにおいて、完全腫瘍退縮（ＣＲ）となり、これは、３回
超の連続した腫瘍測定において持続性が認められた（第２３日のビヒクル群と比較して、
平均ＴＶ＝２３ｍｍ3、Ｔ／Ｃ値＝１％、ｐ＝０．００４）。
【0292】
投与レベル５０ｍｇ／ｋｇの単剤としての、クリゾチニブ治療群（群３）は、いかなる
抗腫瘍活性も示さず、第２３日において、平均腫瘍サイズは２，１０２ｍｍ3であった（
ビヒクル群と比較して、Ｔ／Ｃ値＝１２０％、ｐ＝０．９４４）。
抗腫瘍活性も示さず、第２３日において、平均腫瘍サイズは２，１０２ｍｍ3であった（
ビヒクル群と比較して、Ｔ／Ｃ値＝１２０％、ｐ＝０．９４４）。
【0293】
投与レベル５０ｍｇ／ｋｇの単剤としての、エルロチニブ治療群（群４）は、わずかに
抗腫瘍活性を示したが、ビヒクル群と比較して、有意な差は認められず、第２３日に、平
均腫瘍サイズ１，１２２ｍｍ3（ビヒクル群と比較して、Ｔ／Ｃ値＝６４％、ｐ＝０．４
２９）であり、ビヒクル群と比較すると、腫瘍サイズ１０００ｍｍ3において、４日の腫
瘍増殖遅延であった。
抗腫瘍活性を示したが、ビヒクル群と比較して、有意な差は認められず、第２３日に、平
均腫瘍サイズ１，１２２ｍｍ3（ビヒクル群と比較して、Ｔ／Ｃ値＝６４％、ｐ＝０．４
２９）であり、ビヒクル群と比較すると、腫瘍サイズ１０００ｍｍ3において、４日の腫
瘍増殖遅延であった。
【0294】
クリゾチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、群５）及びエルロチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、群５）の
組み合わせは、有意に抗腫瘍活性を示し、第２３日に、平均腫瘍サイズ２６５ｍｍ3（Ｔ
／Ｃ値＝１５％、ｐ＝０．００８）であり、腫瘍増殖遅延１７日目には、ビヒクル群と比
較して、腫瘍サイズ１，０００ｍｍ3であり、ビヒクル群と比較すると、腫瘍サイズ１０
００ｍｍ3において、１７日の腫瘍増殖遅延であった。
組み合わせは、有意に抗腫瘍活性を示し、第２３日に、平均腫瘍サイズ２６５ｍｍ3（Ｔ
／Ｃ値＝１５％、ｐ＝０．００８）であり、腫瘍増殖遅延１７日目には、ビヒクル群と比
較して、腫瘍サイズ１，０００ｍｍ3であり、ビヒクル群と比較すると、腫瘍サイズ１０
００ｍｍ3において、１７日の腫瘍増殖遅延であった。
【0295】
投与レベル１ｍｇ／マウスの単剤としてのセツキシマブ（群６）は、有意に抗腫瘍活性
を示し、第２３日に、平均腫瘍サイズ４８５ｍｍ3（Ｔ／Ｃ値＝２８％、ｐ＝０．０１８
）であり、ビヒクル群と比較すると、腫瘍サイズ１０００ｍｍ3において、１７日の腫瘍
増殖遅延であった。図９及び表１６は、様々な治療法の抗腫瘍活性を示す。
を示し、第２３日に、平均腫瘍サイズ４８５ｍｍ3（Ｔ／Ｃ値＝２８％、ｐ＝０．０１８
）であり、ビヒクル群と比較すると、腫瘍サイズ１０００ｍｍ3において、１７日の腫瘍
増殖遅延であった。図９及び表１６は、様々な治療法の抗腫瘍活性を示す。
【0296】
【表16】
【0297】
ビヒクル群では、腫瘍量の増加によると考えられる中程度から重篤な体重減少が認めら
れた。マウス３匹が死に、１匹のマウスを、２３日目にＢＷＬ２０％超のとき安楽死させ
た。群２では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子のわずかな毒性が認められ、治療期
間中、ＢＷＬ２０％超のとき３匹のマウスを安楽死させ、治療終了後２週間の観察期間中
、体重は徐々に回復した。クリゾチニブ又はエルロチニブ単剤療法群では、ビヒクル群と
比較して、更に重篤な体重減少が認められ、治療と毒性との関連が示唆された。クリゾチ
ニブとエルロチニブとの組み合わせは、投与段階中には、全般的に許容されたが、研究終
了時に重篤な体重減少が認められ、これは非治療期間中の急速な腫瘍増殖の再開によるも
のと考えられる。セツキシマブ単独療法は、本研究において、十分に許容され、体重減少
は、腫瘍増殖の再開により、研究終了時のみに観察された。
れた。マウス３匹が死に、１匹のマウスを、２３日目にＢＷＬ２０％超のとき安楽死させ
た。群２では、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子のわずかな毒性が認められ、治療期
間中、ＢＷＬ２０％超のとき３匹のマウスを安楽死させ、治療終了後２週間の観察期間中
、体重は徐々に回復した。クリゾチニブ又はエルロチニブ単剤療法群では、ビヒクル群と
比較して、更に重篤な体重減少が認められ、治療と毒性との関連が示唆された。クリゾチ
ニブとエルロチニブとの組み合わせは、投与段階中には、全般的に許容されたが、研究終
了時に重篤な体重減少が認められ、これは非治療期間中の急速な腫瘍増殖の再開によるも
のと考えられる。セツキシマブ単独療法は、本研究において、十分に許容され、体重減少
は、腫瘍増殖の再開により、研究終了時のみに観察された。
【0298】
要約すると、２５ｍｇ／ｋｇでの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子（３回／週ｘ３
週間）により、ＳＣＩＤ／ベージュマウスでのＨ２９２－ＨＧＦヒト肺癌異種移植モデル
において、完全奏効が得られた。マウス１０匹中７匹が、治療に耐性を示し、その結果、
１０匹中３匹のマウスに重篤な体重減少が認められた。図９は、治療後の時間内での、様
々な治療が腫瘍サイズに及ぼす影響を示す。
週間）により、ＳＣＩＤ／ベージュマウスでのＨ２９２－ＨＧＦヒト肺癌異種移植モデル
において、完全奏効が得られた。マウス１０匹中７匹が、治療に耐性を示し、その結果、
１０匹中３匹のマウスに重篤な体重減少が認められた。図９は、治療後の時間内での、様
々な治療が腫瘍サイズに及ぼす影響を示す。
【0299】
実施例８：二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の半減期延長
腎臓での濾過作用を低減することで、タンパク質の血中半減期を延長する多数の方法が
公開されており、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその他のポリマーによる修飾、
アルブミンへの結合、アルブミン又は他の血清タンパク質に結合するタンパク質ドメイン
との融合、アルブミンとの遺伝的融合、ＩｇＧ Ｆｃドメインとの融合及び長く、構造化
されていないアミノ酸配列との融合などが挙げられる。
腎臓での濾過作用を低減することで、タンパク質の血中半減期を延長する多数の方法が
公開されており、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその他のポリマーによる修飾、
アルブミンへの結合、アルブミン又は他の血清タンパク質に結合するタンパク質ドメイン
との融合、アルブミンとの遺伝的融合、ＩｇＧ Ｆｃドメインとの融合及び長く、構造化
されていないアミノ酸配列との融合などが挙げられる。
【0300】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、遊離システインを分子のＣ末端に組み込むこ
とによって、流体力学的半径を増大させるために、ＰＥＧにより修飾された。最も一般的
には、システイン残基の遊離チオール基を使用して、標準的な方法を用いて、マレイミド
基又はイオドアセタマイド（iodoacetemide）基により官能基化できるＰＥＧ分子を結合
させる。ＰＥＧの様々な形態を使用して、１，０００、２，０００、５，０００、１０，
０００、２０，０００、又は４０，０００ｋＤａの線状ＰＥＧを含むタンパク質を修飾で
きる。これらの分子量の分鎖状ＰＥＧ分子を修飾に使用することもできる。場合によって
は、ＰＥＧ基は、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子中において、第１級アミンを介し
て結合されてもよい。
とによって、流体力学的半径を増大させるために、ＰＥＧにより修飾された。最も一般的
には、システイン残基の遊離チオール基を使用して、標準的な方法を用いて、マレイミド
基又はイオドアセタマイド（iodoacetemide）基により官能基化できるＰＥＧ分子を結合
させる。ＰＥＧの様々な形態を使用して、１，０００、２，０００、５，０００、１０，
０００、２０，０００、又は４０，０００ｋＤａの線状ＰＥＧを含むタンパク質を修飾で
きる。これらの分子量の分鎖状ＰＥＧ分子を修飾に使用することもできる。場合によって
は、ＰＥＧ基は、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子中において、第１級アミンを介し
て結合されてもよい。
【0301】
ＰＥＧ化のほかに、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の半減期を、天然の３－ヘリ
ックスバンドル血清アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）又はコンセンサスアルブミン結合
ドメイン（ＡＢＤＣｏｎ）との融合分子としてこれらのタンパク質を生成することによっ
て、延長させた。これらのタンパク質のドメインは、表１２に記載されているリンカーの
いずれかを介して、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインのＣ末端に連結された。ＡＢＤ又はＡ
ＢＤＣｏｎドメインは、一次配列において、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ－Ｍｅｔ結
合ＦＮ３ドメインとの間に配置されてもよい。場合によっては、アルブミン又はアルブミ
ン変異体（配列番号：１８９）は、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子と、ｃ－Ｍｅｔ
結合ＦＮ３ドメインのＣ末端に連結された。
ックスバンドル血清アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）又はコンセンサスアルブミン結合
ドメイン（ＡＢＤＣｏｎ）との融合分子としてこれらのタンパク質を生成することによっ
て、延長させた。これらのタンパク質のドメインは、表１２に記載されているリンカーの
いずれかを介して、ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインのＣ末端に連結された。ＡＢＤ又はＡ
ＢＤＣｏｎドメインは、一次配列において、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ－Ｍｅｔ結
合ＦＮ３ドメインとの間に配置されてもよい。場合によっては、アルブミン又はアルブミ
ン変異体（配列番号：１８９）は、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子と、ｃ－Ｍｅｔ
結合ＦＮ３ドメインのＣ末端に連結された。
【0302】
実施例９．選択二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の特性決定
選択二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの双方に対する
親和性、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの自己リン酸化を阻害する能力、及びＨＧＦ細胞の増殖
への影響に関して特性決定した。組換え型ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ細胞外ドメイン
への二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の結合親和性は、実施例３に記載されているプ
ロトコールに従って、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用し
て、表面プラズモン共鳴法によって更に分析した。特性決定結果を表１７に示す。
選択二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの双方に対する
親和性、ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔの自己リン酸化を阻害する能力、及びＨＧＦ細胞の増殖
への影響に関して特性決定した。組換え型ＥＧＦＲ及び／又はｃ－Ｍｅｔ細胞外ドメイン
への二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子の結合親和性は、実施例３に記載されているプ
ロトコールに従って、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用し
て、表面プラズモン共鳴法によって更に分析した。特性決定結果を表１７に示す。
【0303】
【表17】
ルブミン変異体Ｃ３４ＳにコンジュゲートされたＥＣＢ１６８である。
【0304】
実施例１０：ＥＧＦＲ及びｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインのパラトープ
ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合に重要な残基を決定するために、分子Ｐ５４ＡＲ４－
８３ｖ２（配列番号：２７）に対して一連の突然変異体を作製した。この分析のため、Ｂ
Ｃループ及びＦＧループ中の全てのアミノ酸位置を、１つずつアラニンに変異させ、１８
個の新しい分子を生成した。これらの変異体がＥＧＦＲに結合する親和性は、Ｐｒｏｔｅ
ｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いたＳＰＲ分析によって測定された。その結果は、表１
８に示す。１０個の位置において、１０倍以上の結合親和性の損失がもたらされ、これに
より、これらのタンパク質が、ＥＧＦＲへの結合に寄与していることがわかる。倍率変化
（fold change）は、親分子Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２と比較したときの変異体のＫD値の倍
率変化を示す。ＢＣループ及びＦＧループからの残基の組み合わせは、結合面を構成する
。１０個の位置が、ＥＧＦＲへの結合を１０倍以上弱め、５個の位置では、ＥＧＦＲへの
結合を１００倍以上弱めることがわかった（Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７、Ｇ８５）
。Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２のほかに、ＥＧＦＲ結合分子Ｐ５４ＡＲ４－４８、Ｐ５４ＡＲ
４－８１、Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２２及びＰ５４ＡＲ４－８
３ｖ２３（それぞれ、配列番号：２１、２５、１０７、１０８及び１０９）は、変異時に
１００倍以上ＥＧＦＲ結合を弱めるパラトープ位置に同じ残基を有する。生成されたいく
つかの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、表１０に示すように、ＥＧＦＲ結合ＦＮ
３ドメインとしてＰ５４ＡＲ４－８３ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４－４８、Ｐ５４ＡＲ４－８１、
Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２２又はＰ５４ＡＲ４－８３ｖ２を含
む。
ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合に重要な残基を決定するために、分子Ｐ５４ＡＲ４－
８３ｖ２（配列番号：２７）に対して一連の突然変異体を作製した。この分析のため、Ｂ
Ｃループ及びＦＧループ中の全てのアミノ酸位置を、１つずつアラニンに変異させ、１８
個の新しい分子を生成した。これらの変異体がＥＧＦＲに結合する親和性は、Ｐｒｏｔｅ
ｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いたＳＰＲ分析によって測定された。その結果は、表１
８に示す。１０個の位置において、１０倍以上の結合親和性の損失がもたらされ、これに
より、これらのタンパク質が、ＥＧＦＲへの結合に寄与していることがわかる。倍率変化
（fold change）は、親分子Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２と比較したときの変異体のＫD値の倍
率変化を示す。ＢＣループ及びＦＧループからの残基の組み合わせは、結合面を構成する
。１０個の位置が、ＥＧＦＲへの結合を１０倍以上弱め、５個の位置では、ＥＧＦＲへの
結合を１００倍以上弱めることがわかった（Ｄ２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７、Ｇ８５）
。Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２のほかに、ＥＧＦＲ結合分子Ｐ５４ＡＲ４－４８、Ｐ５４ＡＲ
４－８１、Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２２及びＰ５４ＡＲ４－８
３ｖ２３（それぞれ、配列番号：２１、２５、１０７、１０８及び１０９）は、変異時に
１００倍以上ＥＧＦＲ結合を弱めるパラトープ位置に同じ残基を有する。生成されたいく
つかの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子は、表１０に示すように、ＥＧＦＲ結合ＦＮ
３ドメインとしてＰ５４ＡＲ４－８３ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４－４８、Ｐ５４ＡＲ４－８１、
Ｐ５３Ａ１Ｒ５－１７ｖ２、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２２又はＰ５４ＡＲ４－８３ｖ２を含
む。
【0305】
【表18】
【0306】
同様に、標的の結合に重要な位置を定義するために、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配
列番号：４１）分子の推定ｃ－Ｍｅｔ相互作用表面に対して一連の突然変異体を作製した
。この分析は、二重特異性分子ＥＣＢ１５（配列番号：１４５）の場合において行われ、
上記のとおり、アラニンの代わりに、セリンを置換として使用した。セリンは、得られる
突然変異体の疎水性を低下させるために選択された。表１９は、分子Ａ３（配列番号：４
１）の番号に関連する、各突然変異位置の番号と共に、ＳＰＲ結果を示す。７つの位置が
、ｃ－Ｍｅｔとの結合を１０倍以上弱めることが示された。Ｍ７２Ｓ、Ｒ３４Ｓ及びＩ７
９Ｓ変異体については、測定可能な結合は認められなかった。Ｆ３８Ｓ変異体により、１
００倍以上、ｃ－Ｍｅｔとの結合が低減した。このデータから、ｃ－Ｍｅｔ結合に寄与す
る位置は、Ｃストランド、Ｆストランド、ＣＤループ及びＦＧループに分布していること
がわかる。倍率変化は、親分子Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３と比較したときの変異体のＫ
D値の倍率変化を示す。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３に加えて、ｃ－Ｍｅｔ結合分子Ｐ１
１４ＡＲ７Ｐ９２－Ｆ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｄ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｆ１０
及びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｈ８（それぞれ、配列番号：３４、４４、４７及び４９）は
、変異時に１００倍以上ｃ－Ｍｅｔ結合を弱めるパラトープ位置に同じ残基を有する。
列番号：４１）分子の推定ｃ－Ｍｅｔ相互作用表面に対して一連の突然変異体を作製した
。この分析は、二重特異性分子ＥＣＢ１５（配列番号：１４５）の場合において行われ、
上記のとおり、アラニンの代わりに、セリンを置換として使用した。セリンは、得られる
突然変異体の疎水性を低下させるために選択された。表１９は、分子Ａ３（配列番号：４
１）の番号に関連する、各突然変異位置の番号と共に、ＳＰＲ結果を示す。７つの位置が
、ｃ－Ｍｅｔとの結合を１０倍以上弱めることが示された。Ｍ７２Ｓ、Ｒ３４Ｓ及びＩ７
９Ｓ変異体については、測定可能な結合は認められなかった。Ｆ３８Ｓ変異体により、１
００倍以上、ｃ－Ｍｅｔとの結合が低減した。このデータから、ｃ－Ｍｅｔ結合に寄与す
る位置は、Ｃストランド、Ｆストランド、ＣＤループ及びＦＧループに分布していること
がわかる。倍率変化は、親分子Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３と比較したときの変異体のＫ
D値の倍率変化を示す。Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４－Ａ３に加えて、ｃ－Ｍｅｔ結合分子Ｐ１
１４ＡＲ７Ｐ９２－Ｆ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｄ３、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｆ１０
及びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ｈ８（それぞれ、配列番号：３４、４４、４７及び４９）は
、変異時に１００倍以上ｃ－Ｍｅｔ結合を弱めるパラトープ位置に同じ残基を有する。
【0307】
【表19】
【0308】
実施例１１．二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ分子によるヒト腫瘍細胞増殖の阻害
ヒト腫瘍細胞増殖の阻害を、実施例３又は６によって、若しくは低付着状態で、標準付
着培養物において評価した。低付着状態での生存を評価するために、１ｍＭピルビン酸ナ
トリウム（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、及び１０％加熱不活性
化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、ＧｌｕｔａＭＡＸ及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
含有ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬ／ウェルの入ったＵｌｔｒａ Ｌｏ
ｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）中に
、細胞を播種し、５％ ＣＯ2、３７℃で一晩付着させた。細胞は、異なる濃度（最終濃
度０．０３５～７００ｎＭ）の抗体で、ＨＧＦ（７．５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ、カタログ番号２９４－ＨＧＮ）と共に処理し、３７℃、５％ ＣＯ2で、７２時間
インキュベートした。いくつかのウェルは、対照として、ＨＧＦ又は抗体のいずれかで処
理されないままとした。生細胞は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を用いて検出し、データは、発光を読み取る前に、溶解物を、不透明な白い
９６ウェルの組織培養処理済プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移した点以外は、実
施例３の「ヒト腫瘍細胞増殖の阻害（ＮＣＩ－Ｈ２９２増殖及びＮＣＩ－Ｈ３２２増殖ア
ッセイ）」に上述されているとおり分析した。
ヒト腫瘍細胞増殖の阻害を、実施例３又は６によって、若しくは低付着状態で、標準付
着培養物において評価した。低付着状態での生存を評価するために、１ｍＭピルビン酸ナ
トリウム（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、及び１０％加熱不活性
化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、ＧｌｕｔａＭＡＸ及び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
含有ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬ／ウェルの入ったＵｌｔｒａ Ｌｏ
ｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）中に
、細胞を播種し、５％ ＣＯ2、３７℃で一晩付着させた。細胞は、異なる濃度（最終濃
度０．０３５～７００ｎＭ）の抗体で、ＨＧＦ（７．５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ、カタログ番号２９４－ＨＧＮ）と共に処理し、３７℃、５％ ＣＯ2で、７２時間
インキュベートした。いくつかのウェルは、対照として、ＨＧＦ又は抗体のいずれかで処
理されないままとした。生細胞は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を用いて検出し、データは、発光を読み取る前に、溶解物を、不透明な白い
９６ウェルの組織培養処理済プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移した点以外は、実
施例３の「ヒト腫瘍細胞増殖の阻害（ＮＣＩ－Ｈ２９２増殖及びＮＣＩ－Ｈ３２２増殖ア
ッセイ）」に上述されているとおり分析した。
【0309】
これらの場合のうち、細胞増殖の最大阻害が４０％超えであり、相対ＩＣ50が５ｍＭ未
満であるときには、細胞株は、ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ二重特異性分子に対する強力な応答
因子として分類された。
満であるときには、細胞株は、ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ二重特異性分子に対する強力な応答
因子として分類された。
【0310】
ＥＣＢ１５の阻害活性は、野生型、増幅型又は変異型ＥＧＦＲ及び野生型又は変異型ｃ
－Ｍｅｔを有する、複数の細胞株において評価した。ＥＣＢ１５は、表２０に示す細胞株
の腫瘍細胞増殖を阻害した。ＥＣＢ１５は、また、エルロチニブなどのＴＫＩに耐性を示
すことが明らかである変異型Ｔ７９０Ｍを有するＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞株の増殖を阻害
した。
－Ｍｅｔを有する、複数の細胞株において評価した。ＥＣＢ１５は、表２０に示す細胞株
の腫瘍細胞増殖を阻害した。ＥＣＢ１５は、また、エルロチニブなどのＴＫＩに耐性を示
すことが明らかである変異型Ｔ７９０Ｍを有するＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞株の増殖を阻害
した。
【0311】
【表20】
ＡＭＰ：増幅
Ｄｅｌ：欠失
【0312】
【表21-1】
【0313】
【表21-2】
【0314】
【表21-3】
【0315】
【表21-4】
【0316】
【表21-5】
【0317】
配列番号：７３，ＰＲＴ，Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ，ＥＧＦＲ
【0318】
【0319】
【表22】
【0320】
配列番号：７５，ＰＲＴ，Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ，Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ
【0321】
【0322】
【表23】
【0323】
＞配列番号１０１
ＰＲＴ
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ｃＭｅｔ
ＰＲＴ
Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ
ｃＭｅｔ
【0324】
【0325】
【表24-1】
【0326】
【表24-2】
【0327】
【表24-3】
【0328】
【表24-4】
【0329】
【表24-5】
【0330】
【表24-6】
【0331】
【表24-7】
【0332】
【表24-8】
【0333】
＞配列番号１７９
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ；
ここで、Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬ；
ここで、Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
【0334】
＞配列番号１８０
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号：１８０）
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号：１８０）
【0335】
＞配列番号１８１
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＢＣループ
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）；ここで、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである。
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＢＣループ
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8（配列番号１８１）；ここで、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである。
【0336】
＞配列番号１８２
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱ
ＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱ
ＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ9ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ9は、Ｍ又はＩである。
【0337】
＞配列番号１８３
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱ
ＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）、
ここで、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである。
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6Ｘ7Ｘ8ＤＳＦＬＩＱ
ＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）、
ここで、
Ｘ1はＡ、Ｔ、Ｇ又はＤであり；
Ｘ2はＡ、Ｄ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ3はＰ、Ｄ又はＮであり；
Ｘ4はＬ又は存在せず；
Ｘ5はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ又はＷであり；
Ｘ6はＧ、Ｄ又はＡであり；
Ｘ7は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ又はＤであり；
Ｘ8は、Ｙ、Ｆ又はＬである。
【0338】
＞配列番号１８４
ＰＲＴ
人工
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、Ｃストランド及びＣＤループ配列
ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16（配列番号１８４）、ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤである。
ＰＲＴ
人工
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、Ｃストランド及びＣＤループ配列
ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11ＥＸ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16（配列番号１８４）、ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤである。
【0339】
＞配列番号１８５
ＰＲＴ
人工
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、Ｆストランド及びＦＧループ
ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20Ｖ ＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５）、ここで
、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである。
ＰＲＴ
人工
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、Ｆストランド及びＦＧループ
ＴＥＹＸ17ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20Ｖ ＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23（配列番号１８５）、ここで
、
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである。
【0340】
＞配列番号１８６
ＰＲＴ
人工
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11
Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16 ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ17
ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）、
ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである。
ＰＲＴ
人工
ｃ－Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦ ＤＳＦＸ10ＩＲＹＸ11
Ｅ Ｘ12Ｘ13Ｘ14Ｘ15ＧＸ16 ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ17
ＶＸ18ＩＸ19Ｘ20ＶＫＧＧＸ21Ｘ22ＳＸ23ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）、
ここで、
Ｘ10は、Ｗ、Ｆ又はＶであり；
Ｘ11は、Ｄ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ12は、Ｖ、Ｆ又はＬであり；
Ｘ13は、Ｖ、Ｌ又はＴであり；
Ｘ14は、Ｖ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ又はＳであり；
Ｘ15は、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｔ又はＫであり；
Ｘ16は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ17は、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ18は、Ｎ、Ｔ、Ｑ又はＧであり；
Ｘ19は、Ｌ、Ｍ、Ｎ又はＩであり；
Ｘ20は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ21はＳ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ又はＫであり；
Ｘ22は、Ｉ、Ｖ又はＬであり；
Ｘ23は、Ｖ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ又はＬである。
【0341】
＞配列番号１８７
ＰＲＴ
人工
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子のＥＧＦＲ ＦＮ３ドメイ
ン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ24ＶＴＸ25ＤＳＸ26ＲＬＳＷＤＤＰＸ27ＡＦＹＸ28ＳＦＬＩＱ
ＹＱＸ29ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ30ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹ
Ｘ31ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ32ＲＧＬＰＬＳＡＸ33ＦＴＴ（配列番号Ｏ：１８７）、ここで
、
Ｘ24は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ25は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ26は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ27は、Ｈ又はＷであり；
Ｘ28は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ29は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ30は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ31は、Ｇ又はＹであり；
Ｘ32は、Ｍ又はＩであり；
Ｘ33は、Ｅ又はＩである。
ＰＲＴ
人工
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子のＥＧＦＲ ＦＮ３ドメイ
ン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ24ＶＴＸ25ＤＳＸ26ＲＬＳＷＤＤＰＸ27ＡＦＹＸ28ＳＦＬＩＱ
ＹＱＸ29ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ30ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹ
Ｘ31ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ32ＲＧＬＰＬＳＡＸ33ＦＴＴ（配列番号Ｏ：１８７）、ここで
、
Ｘ24は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ25は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ26は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ27は、Ｈ又はＷであり；
Ｘ28は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ29は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ30は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ31は、Ｇ又はＹであり；
Ｘ32は、Ｍ又はＩであり；
Ｘ33は、Ｅ又はＩである。
【0342】
＞配列番号１８８
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子のｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメ
イン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ34ＶＴＸ35ＤＳＸ36ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦ
Ｘ37ＦＸ38Ｘ39Ｘ40ＧＸ41ＡＩＸ42ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮ
ＩＸ43Ｘ44ＶＫＧＧＸ45ＩＳＰＰＬＳＡＸ46ＦＴＴ（配列番号１８８）、ここで、
Ｘ34は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ35は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ36は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ37は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ38は、Ｖ又はＬであり；
Ｘ39は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ40は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ41は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ42は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ43は、Ｌ又はＭであり；
Ｘ44は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ45は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ46は、Ｅ又はＩである。
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメイン含有分子のｃ－Ｍｅｔ ＦＮ３ドメ
イン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ34ＶＴＸ35ＤＳＸ36ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦ
Ｘ37ＦＸ38Ｘ39Ｘ40ＧＸ41ＡＩＸ42ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮ
ＩＸ43Ｘ44ＶＫＧＧＸ45ＩＳＰＰＬＳＡＸ46ＦＴＴ（配列番号１８８）、ここで、
Ｘ34は、Ｅ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ35は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ36は、Ｌ又はＡであり；
Ｘ37は、Ｅ又はＰであり；
Ｘ38は、Ｖ又はＬであり；
Ｘ39は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ40は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ41は、Ｅ又はＤであり；
Ｘ42は、Ｎ又はＶであり；
Ｘ43は、Ｌ又はＭであり；
Ｘ44は、Ｇ又はＳであり；
Ｘ45は、Ｓ又はＫであり；
Ｘ46は、Ｅ又はＩである。
【0343】
＞配列番号１８９
ＨＳＡ変異体Ｃ３４Ｓ
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨ
ＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴ
ＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥ
ＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫ
ＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫ
ＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴ
ＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣ
ＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹ
ＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫ
ＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧ
ＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫ
ＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥ
ＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫ
ＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣ
ＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
ＨＳＡ変異体Ｃ３４Ｓ
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨ
ＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴ
ＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥ
ＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫ
ＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫ
ＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴ
ＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣ
ＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹ
ＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫ
ＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧ
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ＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
【0344】
＞配列番号１９０
ＥＣＢ１６８
ＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＤＤＰＷＡＦＹＥＳＦＬＩＱＹＱＥＳ
ＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹ
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ＥＣＢ１６８
ＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＤＤＰＷＡＦＹＥＳＦＬＩＱＹＱＥＳ
ＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹ
ＫＤＴＮＩＲＧＬＰＬＳＡＩＦＴＴＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥ
ＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＥＦＬＧＳＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲ
ＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＬＳＶＫＧＧＳＩＳＰＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0345】
＞配列番号１９１
ＭｅｔのないＥＣＢ１６８
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＤＤＰＷＡＦＹＥＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫ
ＤＴＮＩＲＧＬＰＬＳＡＩＦＴＴＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤ
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ＭｅｔのないＥＣＢ１６８
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＤＤＰＷＡＦＹＥＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫ
ＤＴＮＩＲＧＬＰＬＳＡＩＦＴＴＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤ
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ＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＬＳＶＫＧＧＳＩＳＰＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0346】
＞１９２
ＥＣＢ、名前なし、リスト１７ｖ２－Ｃ５ｖ２の最後（last in the list 17v2-C5v2）
ｍＬｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗａｄｐｈｇｆｙｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓ
ｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙ
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ＳＰＰＬＳＡＩＦＴＴ
ＥＣＢ、名前なし、リスト１７ｖ２－Ｃ５ｖ２の最後（last in the list 17v2-C5v2）
ｍＬｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗａｄｐｈｇｆｙｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓ
ｅｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙ
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ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＥＦＬ
ＧＳＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＬＳＶＫＧＧＳＩ
ＳＰＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0347】
＞１９３
ＥＣＢ、名前なし、ｍｅｔなし、リスト１７ｖ２－Ｃ５ｖ２の最後
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗａｄｐｈｇｆｙｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
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ＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＬＳＶＫＧＧＳＩＳＰＰＬＳＡＩＦＴＴ
ＥＣＢ、名前なし、ｍｅｔなし、リスト１７ｖ２－Ｃ５ｖ２の最後
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗａｄｐｈｇｆｙｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
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ＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＥＦＬＧＳＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲ
ＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＬＳＶＫＧＧＳＩＳＰＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0348】
＞配列番号１９４
８３ｖ２ Ｄ２２Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗａｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
８３ｖ２ Ｄ２２Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗａｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0349】
＞配列番号１９５
＞８３ｖ２ Ｄ２３Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄａｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｄ２３Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄａｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0350】
＞配列番号１９６
＞８３ｖ２ Ｐ２４Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄａｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｐ２４Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄａｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0351】
＞配列番号１９７
＞８３ｖ２ Ｗ２５Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐａａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｗ２５Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐａａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0352】
＞配列番号１９８
＞８３ｖ２ Ｆ２７Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａａｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｆ２７Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａａｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0353】
＞配列番号１９９
＞８３ｖ２ Ｙ２８Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆａｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｙ２８Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆａｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0354】
＞配列番号２００
＞８３ｖ２ Ｈ７５Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖａｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｈ７５Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖａｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0355】
＞配列番号２０１
＞８３ｖ２ Ｎ７６Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈａｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｎ７６Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈａｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0356】
＞配列番号２０２
＞８３ｖ２ Ｖ７７ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎａｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｖ７７ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎａｙｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0357】
＞配列番号２０３
＞８３ｖ２ Ｙ７８Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖａｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｙ７８Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖａｋ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0358】
＞配列番号２０４
＞８３ｖ２ Ｋ７９Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙａ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｋ７９Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙａ
ｄｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0359】
＞配列番号２０５
＞８３ｖ２ Ｄ８０Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ａｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｄ８０Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ａｔｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0360】
＞配列番号２０６
＞８３ｖ２ Ｍ８３Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎａｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｍ８３Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎａｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0361】
＞配列番号２０７
＞８３ｖ２ Ｒ８４Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍａｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｒ８４Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍａｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0362】
＞配列番号２０８
＞８３ｖ２ Ｇ８５Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒａｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｇ８５Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒａｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0363】
＞配列番号２０９
＞８３ｖ２ Ｌ８６Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇａｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｌ８６Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔｎｍｒｇａｐｌｓａｉｆｔｔ
【0364】
＞配列番号２１０
＞８３ｖ２ Ｔ８１Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄａｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｔ８１Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄａｎｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0365】
＞配列番号２１１
＞８３ｖ２ Ｎ８２Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔａｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
＞８３ｖ２ Ｎ８２Ａ
Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｄｄｐｗａｆｙｅｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅ
ｋｖｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｈｎｖｙｋ
ｄｔａｍｒｇｌｐｌｓａｉｆｔｔ
【0366】
配列番号２１２
＞Ｋ７８Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇＳｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｋ７８Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇＳｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
【0367】
配列番号２１３
＞Ｇ４０Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
Ｓｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｇ４０Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
Ｓｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
【0368】
配列番号２１４
＞Ｌ３９Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆＳ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｌ３９Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆＳ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
【0369】
配列番号２１５
＞Ｖ６８Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙＳｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｖ６８Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙＳｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
【0370】
配列番号２１６
＞Ｎ７０Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖＳｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｎ７０Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖＳｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
【0371】
配列番号２１７
＞Ｐ８１Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓＳｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｐ８１Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓＳｐｌｓａｉｆｔｔ
【0372】
配列番号２１８
＞Ｆ３６Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙＳｅｆｌ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｆ３６Ｓ
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ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
【0373】
配列番号２１９
＞Ｗ３２Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆＳｉｒｙｆｅｆｌ
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ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｗ３２Ｓ
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ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
【0374】
配列番号２２０
＞Ｍ７２Ｓ
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ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｍ７２Ｓ
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ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
【0375】
配列番号２２１
＞Ｒ３４Ｓ
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ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｒ３４Ｓ
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ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋｉ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
【0376】
配列番号２２２
＞Ｆ３８Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅＳｌ
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ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｆ３８Ｓ
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ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
【0377】
配列番号２２３
＞Ｉ７９Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋＳ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
＞Ｉ７９Ｓ
ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｒｖｔｅｄｓａｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｗｉｒｙｆｅｆｌ
ｇｓｇｅａｉｖｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｖｖｎｉｍｇｖｋｇｇｋＳ
ｓｐｐｌｓａｉｆｔｔ
【0378】
配列番号２２４
ＰＲＴ
人工
リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
本出願は、例えば以下の発明を提供する。
[１] 第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを
含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは、上皮
成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの
結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ
）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングす
る、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子。
[２] [１]に記載の二重特異性分子であって、
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細
胞において測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシ
ン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、前記第２のＦＮ３ドメイ
ンは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定した
とき、約１．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけ
るＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｂ）前記第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細
胞において測定したとき、約１．８×１０-8Ｍ～約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、Ｅ
ＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、前記第
２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞
において測定したとき、約４×１０-9Ｍ～約１．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅ
ｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）前記第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約１×１０-8Ｍ未満の解離定数（
ＫD）にて結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ－Ｍｅｔと、約５×１０-8Ｍ未
満のＫDにて結合し、該ＫDは、実施例３に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定
されるか、又は
ｄ）前記第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約２×１０-10～約１×１０-8Ｍ
のＫDにて結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ－Ｍｅｔと、約３×１０-10～約
５ｘ１０-8ＭのＫDにて結合し、該ＫDは、実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を
用いて測定される、二重特異性分子。
[３] 前記二重特異性分子は、前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメイン
の混合物によるＮＣＩ－Ｈ２９２細胞増殖阻害のＩＣ50値と比較した場合、少なくとも３
０倍小さいＩＣ50値にて、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞の増殖を阻害し、該細胞増殖は、７．５
ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発される、[１]又は[２]に記載
の二重特異性分子。
[４] [１]～[３]のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、前記二重特異性分子
は、
ａ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞において測定したと
き、約８×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ
誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｂ）１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定した
とき、約８．４×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけ
るＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）約９．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＨＧＦ誘発性ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞増殖
を阻害し、該細胞増殖は、７．５ｎｇのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発さ
れるか、
ｄ）約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにてＥＧＦＲに結合するか、又は
ｅ）約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにてｃ－Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施例３及び実
施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、二重特異性分子。
[５] 前記第１のＦＮ３ドメインは、少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と
同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメインは、少なくとも８３％が配列
番号４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、[１]～[４]のいずれか一項に
記載の二重特異性分子。
[６] 前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１０７又は１０８のアミノ酸配列を含み、
前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む、[１]～[５]のいず
れか一項に記載の二重特異性分子。
[７] 前記第１のＦＮ３ドメインは、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ
２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、Ｅ
ＧＦＲに結合する、[１]～[６]のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
[８] 前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残
基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍ
ｅｔと結合する、[７]に記載の二重特異性分子。
[９] [１]～[８]のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、
ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列又は配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＦＧル
ープと、
ｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＢＣループと、を含み、
ｂ）前記第２のＦＮ３ドメインは、
ｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣストランド及びＣＤループと、
ｉｉ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＦストランド及びＦＧループと、を含む
、二重特異性分子。
[１０] [１]～[９]のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列又は配列番号１８３
のアミノ酸配列を含み、
ｂ）前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、二重特異性
分子。
[１１] 前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏ
ｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上
の残基位置で置換を含む、[５]～[１０]のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
[１２] 前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含み、前記第２
のＦＮ３ドメインは、配列番号１８８のアミノ酸配列を含む、[１１]に記載の二重特異性
分子。
[１３] 前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～
１３７、又は１９４～２１１のうちの１つに示される配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメ
インは、配列番号３２～４９、１１１～１１４、又は２１２～２２３のうちの１つに示さ
れる配列を含む、[１]～[１２]のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
[１４] 前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメインは、
ａ）それぞれ、２７及び３２、
ｂ）それぞれ、２７及び４１、
ｃ）それぞれ、２７及び４０、
ｄ）それぞれ、２７及び３３、
ｅ）それぞれ、１０７及び４１、
ｆ）それぞれ、１０７及び４０、
ｇ）それぞれ、１０７及び３３、
ｈ）それぞれ、１０７及び３２、
ｉ）それぞれ、１０７及び１１４、
ｊ）それぞれ、１０８及び１１１、
ｋ）それぞれ、１０８及び１１２、
ｌ）それぞれ、１０８及び１１３、
ｍ）それぞれ、１０８及び１１４、
ｎ）それぞれ、１０９及び１１１、
ｏ）それぞれ、１０９及び１１２、
ｐ）それぞれ、１０９及び１１３、
ｑ）それぞれ、１０９及び１１４、
ｒ）それぞれ、１１０及び１１１、
ｓ）それぞれ、１１０及び１１２、
ｔ）それぞれ、１１０及び１１３、又は
ｕ）それぞれ、１１０及び１１４、の配列番号のアミノ酸配列を含む、[１３]に記載の
二重特異性分子。
[１５] 前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏ
ｎ（配列番号１）の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含
む、[１４]に記載の二重特異性分子。
[１６] 前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１
のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離される、[１]～[１５]のい
ずれか一項に記載の二重特異性分子。
[１７] 前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメインは、リンカーによって
連結される、[１]～[１６]のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
[１８] 前記リンカーは、配列番号７８～８４又は２２４のうちの１つに示されるアミノ
酸配列を含む、[１７]に記載の二重特異性分子。
[１９] 配列番号５０～７２、１０６、１１８～１２１、１３８～１６５又は１９０～１
９３で示すアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記分子のＮ末端に連結されるメチオニ
ン（Ｍｅｔ）を含む、[１]～[１８]のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
[２０] 前記分子のＣ末端に連結されるシステインを更に含む、[１９]に記載の二重特異
性分子。
[２１] 半減期延長部分に連結される、[１]～[２０]のいずれか一項に記載の二重特異性
分子。
[２２] 前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）、アルブミン、アルブミン変異体、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部で
ある、[２１]に記載の二重特異性分子。
[２３] 前記半減期延長部分は、配列番号１８９の前記アルブミン変異体である、[２２]
に記載の二重特異性分子。
[２４] [５]に記載の二重特異性分子をコードする、単離ポリヌクレオチド。
[２５] [２４]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[２６] [２５]に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
[２７] 二重特異性分子を作製する方法であって、[２６]に記載の単離宿主細胞を、該二
重特異性分子が発現するような条件下で培養することと、該二重特異性分子を精製するこ
とと、を含む、方法。
[２８] [１～２３]のいずれか一項に記載の二重特異性分子と、製薬上許容できる担体と
、を含む医薬組成物。
[２９] 癌の治療を行うために十分な時間にわたって、治療的に有効な量の[１]に記載の
二重特異性分子を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療
する方法。
[３０] 癌は、ＥＧＦＲ活性化突然変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅、ｃ－Ｍｅｔ活性化突然変
異又はｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅と関連がある、[２９]に記載の方法。
[３１] 前記ＥＧＦＲ活性化突然変異は、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは、任意のアミノ
酸）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ
７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍの置換、Ｅ
７４６～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６～Ａ７６７間のＡｌａ（
Ａ）の挿入、Ｓ７６８～Ｖ７６９間のＳｅｒ、Ｖａｌ及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、並び
にＰ７７２～Ｈ７７３間のＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入である、[３０]に記載の方法
。
[３２] 前記被験体は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＣＯ－１６８６、
ＡＺＤ９１９２又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示すか、又は耐性を得てい
る、[２９]に記載の方法。
[３３] 癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺
癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、
鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌
、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞
癌（ＰＲＣＣ）である、[２９]に記載の方法。
[３４] 第２の治療薬を投与することを含む、[２９]に記載の方法。
[３５] 前記第２の治療薬は、化学療法剤又は標的抗癌治療剤である、[３３]に記載の方
法。
[３６] 前記第２の治療薬は、シスプラチン、ビンブラスチン、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、
ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４若しくはＶＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害物質、エルロ
チニブ、ゲフィチニブ又はアファチニブである、[３５]に記載の方法。
[３７] 前記第２の治療薬は、前記二重特異性分子と同時に、逐次的に又は別途に投与さ
れる、[３４]に記載の方法。
[３８] 上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）と
ＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイ
ンであって、該ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に基づいて設
計されたライブラリから単離される、ＦＮ３ドメイン。
[３９] [３８]に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメインは、
ａ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約２
．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発
性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｂ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約１
．８×１０-8Ｍ～約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３に
おけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｃ）約１×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）にて、ヒトＥＧＦＲに結合し、該ＫDは、実
施例３に記載の条件を用いて測定されるか、又は
ｄ）約２×１０-10～約１×１０-8ＭのＫDにて、ヒトＥＧＦＲに結合し、該ＫDは、実
施例３に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、ＦＮ３ドメイン。
[４０] 少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含
む、[３８]又は[３９]に記載のＦＮ３ドメイン。
[４１] 前記ＦＮ３ドメインは、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３
、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦ
Ｒに結合する、[３８]～[４０]のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
[４２] [３８]～[４１]のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ド
メインは、
ａ）配列番号１７９のアミノ酸配列又は配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＦＧルー
プと、
ｂ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＢＣループと、を含む、ＦＮ３ドメイン。
[４３] 配列番号１８２のアミノ酸配列又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含む、[４
２]に記載のＦＮ３ドメイン。
[４４] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～１３７
又は１９４～２１１のうちの１つに示される配列を含む、[３８]～[４３]のいずれか一項
に記載のＦＮ３ドメイン。
[４５] 前記ＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７
、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置で置換を含む、[４４]に記載のＦ
Ｎ３ドメイン。
[４６] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の置換Ｌ１７Ａ
、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、[４５]に記載のＦＮ３ドメイ
ン。
[４７] [４０]に記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
[４８] [４７]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[４９] [４８]に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
[５０] ＥＧＦＲと特異的に結合するＦＮ３ドメインを作製する方法であって、[４８]に
記載の単離宿主細胞を、ＥＧＦＲと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインが発現するような
条件下で培養することと、該ＦＮ３ドメインを精製することと、を含む、方法。
[５１] 肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧ
Ｆ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３
）ドメイン。
[５２] [５１]に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメインは、
ａ）１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において
測定したとき、約１．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４
９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｂ）１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において
測定したとき、約４×１０-9Ｍ～約１．５ｘ１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チ
ロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）約５×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施例３に記
載の条件下で測定されるか、又は
ｄ）約３×１０-10～約５ｘ１０-8ＭのＫDにて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、
実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、ＦＮ３ドメイン。
[５３] 少なくとも８３％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含
む、[５１]又は[５２]に記載のＦＮ３ドメイン。
[５４] 前記ＦＮ３ドメインは、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ
３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍｅｔ
に結合する、[５１]～[５３]のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
[５５] [５１]～[５４]のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ド
メインは、
ａ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣストランド及びＣＤループと、
ｂ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＦストランド及びＦＧループと、を含む、Ｆ
Ｎ３ドメイン。
[５６] 配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、[５５]に記載のＦＮ３ドメイン。
[５７] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号３２～４９、１１１～１１４、又は２１２～２
２３のうちの１つに示される配列を含む、[５１]～[５６]のいずれか一項に記載のＦＮ３
ドメイン。
[５８] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の１１、１４、
１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置で置換を含む、[５７]
に記載のＦＮ３ドメイン。
[５９] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の置換Ｌ１７Ａ
、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、[５８]に記載のＦＮ３ドメイ
ン。
[６０] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に基づいて設計
されたライブラリから単離される、[５１]～[５９]のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイ
ン。
[６１] [５３]に記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
[６２] [６１]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[６３] [６２]に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
[６４] ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメインを作製する方法であって、[６３
に記載の単離宿主細胞を、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインが発現するよ
うな条件下で培養することと、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインを精製す
ることと、を含む、方法。
[６５] [３８]又は[５１]に記載のＦＮ３ドメインと、製薬上許容できる担体と、を含む
医薬組成物。
[６６] 癌の治療を行うために十分な時間にわたって、治療的に有効な量の[６５]に記載
の医薬組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療す
る方法。
[６７] 前記被験体は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＣＯ－１６８６、
ＡＺＤ９１９２又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示すか、又は耐性を得てい
る、[６６]に記載の方法。
[６８] 癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺
癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、
鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌
、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞
癌（ＰＲＣＣ）である、[６６]に記載の方法。
[６９] [１]～[３３]のいずれか一項に記載の二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子、[３
８～４６]のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する
単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、又は、[５１]～[６０]のいずれか一
項に記載の肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合する、単離フィブロネク
チンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの、治療のための使用。
[７０] 癌の治療に使用するための、[１]～[３３]のいずれか一項に記載の二重特異性Ｆ
Ｎ３ドメイン含有分子、[３８]～[４６]のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（Ｅ
ＧＦＲ）に特異的に結合する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、又は、
[５１～６０]のいずれか一項に記載の肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結
合する、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
[７１] [７０]に記載の使用のための、[１]～[３３]のいずれか一項に記載の二重特異性
ＦＮ３ドメイン含有分子、[３８]～[４６]のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（
ＥＧＦＲ）に特異的に結合する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであっ
て、前記癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺
癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、
鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌
、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞
癌（ＰＲＣＣ）である、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子、単離ＦＮ３ドメイン。
ＰＲＴ
人工
リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
本出願は、例えば以下の発明を提供する。
[１] 第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインを
含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であって、該第１のＦＮ３ドメインは、上皮
成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）とＥＧＦＲとの
結合をブロッキングし、該第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ
）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングす
る、単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子。
[２] [１]に記載の二重特異性分子であって、
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細
胞において測定したとき、約２．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシ
ン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、前記第２のＦＮ３ドメイ
ンは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定した
とき、約１．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけ
るＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｂ）前記第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細
胞において測定したとき、約１．８×１０-8Ｍ～約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、Ｅ
ＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害し、前記第
２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞
において測定したとき、約４×１０-9Ｍ～約１．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅ
ｔ残基チロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）前記第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約１×１０-8Ｍ未満の解離定数（
ＫD）にて結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ－Ｍｅｔと、約５×１０-8Ｍ未
満のＫDにて結合し、該ＫDは、実施例３に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定
されるか、又は
ｄ）前記第１のＦＮ３ドメインは、ヒトＥＧＦＲと、約２×１０-10～約１×１０-8Ｍ
のＫDにて結合し、前記第２のＦＮ３ドメインは、ヒトｃ－Ｍｅｔと、約３×１０-10～約
５ｘ１０-8ＭのＫDにて結合し、該ＫDは、実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を
用いて測定される、二重特異性分子。
[３] 前記二重特異性分子は、前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメイン
の混合物によるＮＣＩ－Ｈ２９２細胞増殖阻害のＩＣ50値と比較した場合、少なくとも３
０倍小さいＩＣ50値にて、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞の増殖を阻害し、該細胞増殖は、７．５
ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発される、[１]又は[２]に記載
の二重特異性分子。
[４] [１]～[３]のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、前記二重特異性分子
は、
ａ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞において測定したと
き、約８×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ
誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｂ）１００ｎｇ／ｍＬのヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において測定した
とき、約８．４×１０-7Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４９におけ
るＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）約９．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＨＧＦ誘発性ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞増殖
を阻害し、該細胞増殖は、７．５ｎｇのＨＧＦを含有する１０％ ＦＢＳによって誘発さ
れるか、
ｄ）約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにてＥＧＦＲに結合するか、又は
ｅ）約２．０×１０-8Ｍ未満のＫDにてｃ－Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施例３及び実
施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、二重特異性分子。
[５] 前記第１のＦＮ３ドメインは、少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と
同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメインは、少なくとも８３％が配列
番号４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、[１]～[４]のいずれか一項に
記載の二重特異性分子。
[６] 前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１０７又は１０８のアミノ酸配列を含み、
前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む、[１]～[５]のいず
れか一項に記載の二重特異性分子。
[７] 前記第１のＦＮ３ドメインは、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ
２３、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、Ｅ
ＧＦＲに結合する、[１]～[６]のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
[８] 前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残
基Ｒ３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍ
ｅｔと結合する、[７]に記載の二重特異性分子。
[９] [１]～[８]のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、
ｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列又は配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＦＧル
ープと、
ｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＢＣループと、を含み、
ｂ）前記第２のＦＮ３ドメインは、
ｉ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣストランド及びＣＤループと、
ｉｉ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＦストランド及びＦＧループと、を含む
、二重特異性分子。
[１０] [１]～[９]のいずれか一項に記載の二重特異性分子であって、
ａ）前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列又は配列番号１８３
のアミノ酸配列を含み、
ｂ）前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、二重特異性
分子。
[１１] 前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏ
ｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上
の残基位置で置換を含む、[５]～[１０]のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
[１２] 前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含み、前記第２
のＦＮ３ドメインは、配列番号１８８のアミノ酸配列を含む、[１１]に記載の二重特異性
分子。
[１３] 前記第１のＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～
１３７、又は１９４～２１１のうちの１つに示される配列を含み、前記第２のＦＮ３ドメ
インは、配列番号３２～４９、１１１～１１４、又は２１２～２２３のうちの１つに示さ
れる配列を含む、[１]～[１２]のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
[１４] 前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメインは、
ａ）それぞれ、２７及び３２、
ｂ）それぞれ、２７及び４１、
ｃ）それぞれ、２７及び４０、
ｄ）それぞれ、２７及び３３、
ｅ）それぞれ、１０７及び４１、
ｆ）それぞれ、１０７及び４０、
ｇ）それぞれ、１０７及び３３、
ｈ）それぞれ、１０７及び３２、
ｉ）それぞれ、１０７及び１１４、
ｊ）それぞれ、１０８及び１１１、
ｋ）それぞれ、１０８及び１１２、
ｌ）それぞれ、１０８及び１１３、
ｍ）それぞれ、１０８及び１１４、
ｎ）それぞれ、１０９及び１１１、
ｏ）それぞれ、１０９及び１１２、
ｐ）それぞれ、１０９及び１１３、
ｑ）それぞれ、１０９及び１１４、
ｒ）それぞれ、１１０及び１１１、
ｓ）それぞれ、１１０及び１１２、
ｔ）それぞれ、１１０及び１１３、又は
ｕ）それぞれ、１１０及び１１４、の配列番号のアミノ酸配列を含む、[１３]に記載の
二重特異性分子。
[１５] 前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏ
ｎ（配列番号１）の置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含
む、[１４]に記載の二重特異性分子。
[１６] 前記第１のＦＮ３ドメイン及び／又は前記第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１
のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離される、[１]～[１５]のい
ずれか一項に記載の二重特異性分子。
[１７] 前記第１のＦＮ３ドメイン及び前記第２のＦＮ３ドメインは、リンカーによって
連結される、[１]～[１６]のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
[１８] 前記リンカーは、配列番号７８～８４又は２２４のうちの１つに示されるアミノ
酸配列を含む、[１７]に記載の二重特異性分子。
[１９] 配列番号５０～７２、１０６、１１８～１２１、１３８～１６５又は１９０～１
９３で示すアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記分子のＮ末端に連結されるメチオニ
ン（Ｍｅｔ）を含む、[１]～[１８]のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
[２０] 前記分子のＣ末端に連結されるシステインを更に含む、[１９]に記載の二重特異
性分子。
[２１] 半減期延長部分に連結される、[１]～[２０]のいずれか一項に記載の二重特異性
分子。
[２２] 前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）、アルブミン、アルブミン変異体、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部で
ある、[２１]に記載の二重特異性分子。
[２３] 前記半減期延長部分は、配列番号１８９の前記アルブミン変異体である、[２２]
に記載の二重特異性分子。
[２４] [５]に記載の二重特異性分子をコードする、単離ポリヌクレオチド。
[２５] [２４]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[２６] [２５]に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
[２７] 二重特異性分子を作製する方法であって、[２６]に記載の単離宿主細胞を、該二
重特異性分子が発現するような条件下で培養することと、該二重特異性分子を精製するこ
とと、を含む、方法。
[２８] [１～２３]のいずれか一項に記載の二重特異性分子と、製薬上許容できる担体と
、を含む医薬組成物。
[２９] 癌の治療を行うために十分な時間にわたって、治療的に有効な量の[１]に記載の
二重特異性分子を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療
する方法。
[３０] 癌は、ＥＧＦＲ活性化突然変異、ＥＧＦＲ遺伝子増幅、ｃ－Ｍｅｔ活性化突然変
異又はｃ－Ｍｅｔ遺伝子増幅と関連がある、[２９]に記載の方法。
[３１] 前記ＥＧＦＲ活性化突然変異は、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｘ（Ｘは、任意のアミノ
酸）、Ｌ８６１Ｘ（Ｘは、任意のアミノ酸）、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７４６Ｋ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ
７４９Ｑ、Ａ７５０Ｐ、Ａ７５５Ｖ、Ｖ７６５Ｍ、Ｌ８５８Ｐ又はＴ７９０Ｍの置換、Ｅ
７４６～Ａ７５０の欠失、Ｒ７４８～Ｐ７５３の欠失、Ｍ７６６～Ａ７６７間のＡｌａ（
Ａ）の挿入、Ｓ７６８～Ｖ７６９間のＳｅｒ、Ｖａｌ及びＡｌａ（ＳＶＡ）の挿入、並び
にＰ７７２～Ｈ７７３間のＡｓｎ及びＳｅｒ（ＮＳ）の挿入である、[３０]に記載の方法
。
[３２] 前記被験体は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＣＯ－１６８６、
ＡＺＤ９１９２又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示すか、又は耐性を得てい
る、[２９]に記載の方法。
[３３] 癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺
癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、
鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌
、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞
癌（ＰＲＣＣ）である、[２９]に記載の方法。
[３４] 第２の治療薬を投与することを含む、[２９]に記載の方法。
[３５] 前記第２の治療薬は、化学療法剤又は標的抗癌治療剤である、[３３]に記載の方
法。
[３６] 前記第２の治療薬は、シスプラチン、ビンブラスチン、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、
ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４若しくはＶＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害物質、エルロ
チニブ、ゲフィチニブ又はアファチニブである、[３５]に記載の方法。
[３７] 前記第２の治療薬は、前記二重特異性分子と同時に、逐次的に又は別途に投与さ
れる、[３４]に記載の方法。
[３８] 上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）と
ＥＧＦＲとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイ
ンであって、該ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に基づいて設
計されたライブラリから単離される、ＦＮ３ドメイン。
[３９] [３８]に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメインは、
ａ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約２
．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３におけるＥＧＦ誘発
性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｂ）５０ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦを用いて、Ａ４３１細胞において測定したとき、約１
．８×１０-8Ｍ～約２．５×１０-6ＭのＩＣ50値にて、ＥＧＦＲ残基チロシン１１７３に
おけるＥＧＦ誘発性のＥＧＦＲリン酸化を阻害するか、
ｃ）約１×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）にて、ヒトＥＧＦＲに結合し、該ＫDは、実
施例３に記載の条件を用いて測定されるか、又は
ｄ）約２×１０-10～約１×１０-8ＭのＫDにて、ヒトＥＧＦＲに結合し、該ＫDは、実
施例３に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、ＦＮ３ドメイン。
[４０] 少なくとも８７％が配列番号２７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含
む、[３８]又は[３９]に記載のＦＮ３ドメイン。
[４１] 前記ＦＮ３ドメインは、Ｐ５４ＡＲ４－８３ｖ２（配列番号２７）の残基Ｄ２３
、Ｆ２７、Ｙ２８、Ｖ７７及びＧ８５に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ＥＧＦ
Ｒに結合する、[３８]～[４０]のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
[４２] [３８]～[４１]のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ド
メインは、
ａ）配列番号１７９のアミノ酸配列又は配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＦＧルー
プと、
ｂ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＢＣループと、を含む、ＦＮ３ドメイン。
[４３] 配列番号１８２のアミノ酸配列又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含む、[４
２]に記載のＦＮ３ドメイン。
[４４] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１８～２９、１０７～１１０、１２２～１３７
又は１９４～２１１のうちの１つに示される配列を含む、[３８]～[４３]のいずれか一項
に記載のＦＮ３ドメイン。
[４５] 前記ＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の１１、１４、１７、３７
、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置で置換を含む、[４４]に記載のＦ
Ｎ３ドメイン。
[４６] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の置換Ｌ１７Ａ
、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、[４５]に記載のＦＮ３ドメイ
ン。
[４７] [４０]に記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
[４８] [４７]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[４９] [４８]に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
[５０] ＥＧＦＲと特異的に結合するＦＮ３ドメインを作製する方法であって、[４８]に
記載の単離宿主細胞を、ＥＧＦＲと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインが発現するような
条件下で培養することと、該ＦＮ３ドメインを精製することと、を含む、方法。
[５１] 肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合し、肝細胞増殖因子（ＨＧ
Ｆ）とｃ－Ｍｅｔとの結合をブロッキングする、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３
）ドメイン。
[５２] [５１]に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ドメインは、
ａ）１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において
測定したとき、約１．５×１０-6Ｍ未満のＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チロシン１３４
９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｂ）１００ｎｇ／ｍＬの組換え型ヒトＨＧＦを用いて、ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞において
測定したとき、約４×１０-9Ｍ～約１．５ｘ１０-6ＭのＩＣ50値にて、ｃ－Ｍｅｔ残基チ
ロシン１３４９におけるＨＧＦ誘発性のｃ－Ｍｅｔリン酸化を阻害するか、
ｃ）約５×１０-8Ｍ未満のＫDにて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、実施例３に記
載の条件下で測定されるか、又は
ｄ）約３×１０-10～約５ｘ１０-8ＭのＫDにて、ヒトｃ－Ｍｅｔに結合し、該ＫDは、
実施例５に記載のように表面プラズモン共鳴を用いて測定される、ＦＮ３ドメイン。
[５３] 少なくとも８３％が配列番号４１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含
む、[５１]又は[５２]に記載のＦＮ３ドメイン。
[５４] 前記ＦＮ３ドメインは、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５－Ａ３（配列番号４１）の残基Ｒ
３４、Ｆ３８、Ｍ７２及びＩ７９に対応する１つ以上のアミノ酸残基により、ｃ－Ｍｅｔ
に結合する、[５１]～[５３]のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイン。
[５５] [５１]～[５４]のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインであって、前記ＦＮ３ド
メインは、
ａ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣストランド及びＣＤループと、
ｂ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＦストランド及びＦＧループと、を含む、Ｆ
Ｎ３ドメイン。
[５６] 配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、[５５]に記載のＦＮ３ドメイン。
[５７] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号３２～４９、１１１～１１４、又は２１２～２
２３のうちの１つに示される配列を含む、[５１]～[５６]のいずれか一項に記載のＦＮ３
ドメイン。
[５８] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の１１、１４、
１７、３７、４６、７３及び８６位に対応する１つ以上の残基位置で置換を含む、[５７]
に記載のＦＮ３ドメイン。
[５９] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列の置換Ｌ１７Ａ
、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉに対応する１つ以上の置換を含む、[５８]に記載のＦＮ３ドメイ
ン。
[６０] 前記ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列に基づいて設計
されたライブラリから単離される、[５１]～[５９]のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメイ
ン。
[６１] [５３]に記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
[６２] [６１]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[６３] [６２]に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
[６４] ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合するＦＮ３ドメインを作製する方法であって、[６３
に記載の単離宿主細胞を、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインが発現するよ
うな条件下で培養することと、ｃ－Ｍｅｔと特異的に結合する該ＦＮ３ドメインを精製す
ることと、を含む、方法。
[６５] [３８]又は[５１]に記載のＦＮ３ドメインと、製薬上許容できる担体と、を含む
医薬組成物。
[６６] 癌の治療を行うために十分な時間にわたって、治療的に有効な量の[６５]に記載
の医薬組成物を、その必要のある患者に投与することを含む、癌を有する被験体を治療す
る方法。
[６７] 前記被験体は、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ＣＯ－１６８６、
ＡＺＤ９１９２又はセツキシマブによる治療に対して、耐性を示すか、又は耐性を得てい
る、[６６]に記載の方法。
[６８] 癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺
癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、
鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌
、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞
癌（ＰＲＣＣ）である、[６６]に記載の方法。
[６９] [１]～[３３]のいずれか一項に記載の二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子、[３
８～４６]のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合する
単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、又は、[５１]～[６０]のいずれか一
項に記載の肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結合する、単離フィブロネク
チンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの、治療のための使用。
[７０] 癌の治療に使用するための、[１]～[３３]のいずれか一項に記載の二重特異性Ｆ
Ｎ３ドメイン含有分子、[３８]～[４６]のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（Ｅ
ＧＦＲ）に特異的に結合する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、又は、
[５１～６０]のいずれか一項に記載の肝細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｍｅｔ）と特異的に結
合する、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
[７１] [７０]に記載の使用のための、[１]～[３３]のいずれか一項に記載の二重特異性
ＦＮ３ドメイン含有分子、[３８]～[４６]のいずれか一項に記載の上皮成長因子受容体（
ＥＧＦＲ）に特異的に結合する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであっ
て、前記癌は、上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺
癌、小細胞肺癌、結腸直腸癌、肛門癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、咽頭癌、
鼻腔癌、膵癌、皮膚癌、口腔癌、舌癌、食道癌、膣癌、子宮頸癌、脾臓癌、精巣癌、胃癌
、胸腺癌、大腸癌、甲状腺癌、肝癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、散発性又は遺伝乳頭状腎細胞
癌（ＰＲＣＣ）である、二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子、単離ＦＮ３ドメイン。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-10-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本願明細書に記載された発明。