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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022087646
(43)【公開日】2022-06-13
(54)【発明の名称】角層水分量が低下した脂性肌に対する肌荒れ改善剤
(51)【国際特許分類】
A61K 8/9789 20170101AFI20220606BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20220606BHJP
A61K 36/716 20060101ALI20220606BHJP
A61K 36/752 20060101ALI20220606BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220606BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20220606BHJP
【ＦＩ】
A61K8/9789
A61P17/16
A61K36/716
A61K36/752
A61P43/00 121
A61Q19/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020199702
(22)【出願日】2020-12-01
(71)【出願人】
【識別番号】591230619
【氏名又は名称】株式会社ナリス化粧品
(72)【発明者】
【氏名】木村 彩映子
(72)【発明者】
【氏名】▲吉▼田 美登里
(72)【発明者】
【氏名】山▲崎▼ 浩子
【テーマコード（参考）】
4C083
4C088
【Ｆターム（参考）】
4C083AA111
4C083AA112
4C083CC03
4C083CC04
4C083CC05
4C083CC07
4C083DD23
4C083DD27
4C083EE12
4C083EE13
4C083FF01
4C088AB32
4C088AB62
4C088AC05
4C088AC11
4C088BA08
4C088CA03
4C088CA08
4C088MA07
4C088MA17
4C088MA63
4C088NA14
4C088ZA89
4C088ZC75
(57)【要約】 （修正有）
【課題】角層水分量が低下している脂性肌に対する肌荒れを改善することができる成分を提供する。
【解決手段】サキシマボタンヅル抽出物及び／又はコブミカン葉抽出物をを有効成分として含む、オレイン酸に起因する表皮角化亢進抑制剤、並びに、サキシマボタンヅル抽出物及び／又はコブミカン葉抽出物を有効成分として含む、皮膚表面は皮脂過剰であり角層水分量は低下した部位の肌荒れ改善剤を提供する。
【効果】外部からの保湿成分の供給に頼ることなく、角層水分量が低下している脂性肌に特有の現象に作用することで、当該肌質における肌荒れの改善が可能となる。さらに、上記の成分は正常状態である皮膚の角化には影響を及ぼさないものであり、顔の部位により異なる肌質が混在している場合でも、当該肌質の肌荒れ部位に対してのみ効果を発揮することができる。
【選択図】図１
【解決手段】サキシマボタンヅル抽出物及び／又はコブミカン葉抽出物をを有効成分として含む、オレイン酸に起因する表皮角化亢進抑制剤、並びに、サキシマボタンヅル抽出物及び／又はコブミカン葉抽出物を有効成分として含む、皮膚表面は皮脂過剰であり角層水分量は低下した部位の肌荒れ改善剤を提供する。
【効果】外部からの保湿成分の供給に頼ることなく、角層水分量が低下している脂性肌に特有の現象に作用することで、当該肌質における肌荒れの改善が可能となる。さらに、上記の成分は正常状態である皮膚の角化には影響を及ぼさないものであり、顔の部位により異なる肌質が混在している場合でも、当該肌質の肌荒れ部位に対してのみ効果を発揮することができる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サキシマボタンヅル（Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｏｓｂｅｃｋ）抽出物及び／又はコブミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｈｙｓｔｒｉｘ ＤＣ.）葉抽出物を有効成分として含む、オレイン酸に起因する表皮角化亢進抑制剤。
【請求項2】
サキシマボタンヅル（Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｏｓｂｅｃｋ）抽出物及び／又はコブミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｈｙｓｔｒｉｘ ＤＣ.）葉抽出物を有効成分として含む、皮膚表面は皮脂過剰であり角層水分量は低下した部位の肌荒れ改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、皮膚表面の皮脂量は極めて多く、角層水分量は低下している肌状態に対する肌荒れ改善剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
肌質により肌悩みは様々であるが、皮膚表面の皮脂分泌量が多い脂性肌では、テカりやギラつきといった見た目の問題や、ニキビや毛穴の開きといったトラブルを抱えやすい。従来、脂性肌への対処としては、皮脂分泌を抑制する成分を配合した化粧料の使用や、吸脂性の紙を用いた皮脂の除去が提案されてきた（特許文献１）。
【0003】
脂性肌の中には、角層水分量が多く潤っている肌と、角層水分量が少なく乾燥している肌が存在する（非特許文献１）。後者では、テカりやニキビといった脂性肌に共通する肌悩みに加えて、表皮バリア機能が低下することによる、かゆみや肌荒れといった敏感肌のような症状が出る。また、顔全体が、角層水分量が低下した脂性肌となっている場合もあれば、顔の一部が当該肌質になっている場合もある。
【0004】
一方、皮脂成分の１つであるオレイン酸には表皮細胞の角化亢進作用があり、表皮バリア機能を低下させること、またリノール酸によって表皮細胞内へのオレイン酸の取り込みが阻害されることが報告されている（非特許文献２、３）。しかしながら、実際の皮膚において皮脂中のリノール酸含有率が低下することにより、オレイン酸が表皮に及ぼす作用が強まり、肌荒れが生じることは全く知れられていない。
【0005】
角層水分量が多い脂性肌に対しては、皮脂分泌抑制や皮脂除去といった脂性肌向けの一般的な対処方法は有効であるが、角層水分量が少ない脂性肌に対しては、上記の対処方法ではさらなる乾燥と、乾燥による皮脂分泌を招き、逆効果となる。
そのため、角層水分量が少ない脂性肌に対しては、保湿効果の高い化粧料の使用により、乾燥の防止と、過剰な皮脂分泌の改善が試みられてきた。
しかしながらこれらの対処方法では、保湿のしすぎによるテカりや油分過剰によりニキビを促進してしまう場合があり、皮膚に与える油水分量のコントロールが困難であった。
そのため、角層水分量が少ない脂性肌に対しては、保湿効果の高い化粧料の使用により、乾燥の防止と、過剰な皮脂分泌の改善が試みられてきた。
しかしながらこれらの対処方法では、保湿のしすぎによるテカりや油分過剰によりニキビを促進してしまう場合があり、皮膚に与える油水分量のコントロールが困難であった。
【0006】
サキシマボタンヅルについては、サキシマボタンヅルと同属のコボタンヅルのリパーゼ活性抑制効果（特許文献２）や、プロテアーゼ活性（特許文献３）が知られている。また、コブミカンについては、ミカン（Ｃｉｔｒｕｓ）属に属する植物の角層剥離およびデスモソーム分解促進効果（特許文献４）や、フィラグリン蛋白産生促進効果（特許文献５）が知られている。
【0007】
しかしながら、リパーゼ活性抑制効果により、遊離脂肪酸総量を減らすことは可能であるが、オレイン酸など特定の脂肪酸の含有率を低下させる効果は期待できない。また、プロテアーゼ活性やデスモソーム分解により角層剥離を促進する効果は、オレイン酸による角化亢進を抑制できるものではない。また、フィラグリン蛋白の産生促進効果により、一時的に角層水分量を増加することは可能であるが、オレイン酸による角化亢進を抑制しない限り、持続的な効果は見込めない。
そのため、いずれの抽出物も、角層水分量が低下している脂性肌に対する肌荒れに効果を発揮することは全く想像できるものではなかった。
そのため、いずれの抽出物も、角層水分量が低下している脂性肌に対する肌荒れに効果を発揮することは全く想像できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特表２０１０－５０５８００号公報
【特許文献2】特開２００３－１１９１５１号公報
【特許文献3】特開２００３－２２６６１３号公報
【特許文献4】特開２００４－０１０４８０号公報
【特許文献5】特開２００１－２６１５６８号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】日本化粧品技術者会誌 第１９巻第1号，９－１９，１９８５
【非特許文献2】Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９１，４０５－４１２，１９９９
【非特許文献3】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１２４（５），１００８－１０１３，２００５
【発明の概要】
【0010】
本願発明者らは、後述するとおり、角層水分量が少ない脂性肌では、何らかの原因で皮脂中のリノール酸含有率が低下し、オレイン酸による角化亢進作用が増強されることで肌荒れが起こることを突きとめた。本知見によれば、角層水分量が低下した脂性肌のように、皮脂中のリノール酸含有率が低下した皮膚においては、オレイン酸による皮膚への角化亢進を抑制することにより肌荒れの改善が期待できるとの確信に至った。本願発明は、上記知見に基づくものである。
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、角層水分量が低下している脂性肌に対する肌荒れを改善することができ、且つ外部からの保湿成分の供給によってではなく、当該肌質特有の原因に作用して改善する成分の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
サキシマボタンヅル抽出物及び／又はコブミカン葉抽出物を用い、角層水分量が低下した脂性肌における肌荒れの原因となる、オレイン酸に起因する角化亢進を抑制することで上記課題を解決した。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、外部からの保湿成分の供給に頼ることなく、角層水分量が低下している脂性肌に特有の現象に作用することで、当該肌質における肌荒れの改善が可能となる。さらに、いずれの抽出物も正常状態である皮膚の角化には影響を及ぼさないものであり、顔の部位により異なる肌質が混在している場合でも、当該肌質の肌荒れ部位に対してのみ効果を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】肌測定結果を用いたクラスター分析により得られた樹形図
【図2】正常肌及び２種類の脂性肌における皮脂量、角層水分量、経表皮水分蒸散量の比較
【図3】皮脂中に占めるリノール酸及びオレイン酸量を肌質ごとに比較した図
【図4】脂肪酸組成の異なる試料が角層水分量、経表皮水分蒸散量に及ぼす影響を示す図
【図5】脂肪酸組成の異なる試料が角層細胞面積に及ぼす影響を示す図
【図6】各種植物抽出物添加による、オレイン酸添加表皮細胞の角化亢進の抑制度を示す図
【図7】各種植物抽出物添加による、オレイン酸未添加表皮細胞の角化への影響を示す図
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明で用いるサキシマボタンヅル抽出物は、サキシマボタンヅル（Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｏｓｂｅｃｋ）を抽出原料として得られる抽出液、該抽出液の希釈液もしくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、またはこれらの粗精製物もしくは精製物のいずれもが含まれる。また、抽出原料として使用する部位は特に限定されず、葉、茎、根、種子等或いは、全草であり、いずれの部位も生のまま或いは乾燥したものを用いることができる。これらのうち特に根を抽出原料として用いることが好ましい。
【0016】
本発明で用いるコブミカン葉抽出物には、コブミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｈｙｓｔｒｉｘ ＤＣ.）を抽出原料として得られる抽出液、該抽出液の希釈液もしくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、またはこれらの粗精製物もしくは精製物のいずれもが含まれる。また、抽出原料として使用する部位は葉であり、葉は生のまま或いは乾燥したものを用いることができる。
【0017】
本発明で用いるサキシマボタンヅル抽出物、及びコブミカン葉抽出物の抽出溶媒は特に限定されない。例えば、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール等の低級アルコール或いは、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、等の多価アルコール等があげられるが、特に水、エタノール及び１，３－ブチレングリコールから選ばれる１種又は２種以上を選択することが好ましい。
【0018】
本願発明で用いるサキシマボタンヅル抽出物、及びコブミカン葉抽出物の抽出方法は、特に限定されない。例えば、乾燥植物１質量部に対して１～１００質量部の抽出溶媒を用い、加熱抽出したものでも、あるいは低温または常温抽出したものでもよい。抽出後は、ろ過を行い、そのままの状態でも利用できるが、必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色などの精製処理を行うことも出来る。更には、凍結乾燥等をして粉末の状態で用いることも出来る。
【0019】
サキシマボタンヅル抽出物及びコブミカン葉抽出物の各剤の組成物全体に対する配合量は、有効であれば特に限定されないが、単独で配合する場合、併用して配合する場合においても、乾燥質量に換算して０．００１～１０質量％が好ましく、更に０．００１～０．１質量％が好ましい。
【0020】
本発明の肌荒れ改善剤には、上記必須成分のほか、化粧品、医薬部外品、医薬品に用いられる水性成分、油性成分、植物性抽出物、動物抽出物、粉未、界面活性剤、油剤、アルコール、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、増粘剤、色素、香料等を必要に応じて本発明の目的を達成する範囲内で適宜配合することが出来る。本発明の皮膚外用剤の剤型としては、化粧水、乳液、クリーム、パック、パウダー、スプレー・軟膏、分散液、洗浄料等種々の剤型とすることができる。
【実施例0021】
以下、本願発明の実施例について具体的に説明するが、本願発明はこれらの実施例により限定されるものでは無い。
【0022】
〔実験１：クラスター分析によるパネラーの肌質分類〕
はじめに、パネラーの肌質を分類するため肌測定を行った。２０～４０代女性１５名を対象に、顔面を洗顔料で洗浄後、２２±１℃、湿度５０±２％の環境下で１０分間順化した後、頬部の皮脂量、角層水分量、経表皮水分蒸散量を測定した。なお、皮脂量の測定にはＳｅｂｕｍａｔｅｒ ＳＭ８１５（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社）、角層水分量の測定にはＣｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ ＣＭ８２５（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社）、経表皮水分蒸散量の測定にはＶａｐｏｍｅｔｅｒ（Ｄｅｌｆｉｎ社）を用いた。特に言及しない限り他の実験でも同じ機械を使用した。
はじめに、パネラーの肌質を分類するため肌測定を行った。２０～４０代女性１５名を対象に、顔面を洗顔料で洗浄後、２２±１℃、湿度５０±２％の環境下で１０分間順化した後、頬部の皮脂量、角層水分量、経表皮水分蒸散量を測定した。なお、皮脂量の測定にはＳｅｂｕｍａｔｅｒ ＳＭ８１５（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社）、角層水分量の測定にはＣｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ ＣＭ８２５（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社）、経表皮水分蒸散量の測定にはＶａｐｏｍｅｔｅｒ（Ｄｅｌｆｉｎ社）を用いた。特に言及しない限り他の実験でも同じ機械を使用した。
【0023】
上記３種の測定結果をパラメーターとしてウォード法によるクラスター分析を行い、図１に示す樹形図を得た。図に示す点線部分にてパネラーの肌質を４群に分け、皮脂量、角層水分量、経表皮水分蒸散量（図中ではＴＥＷＬと表記）の傾向から、図の上から順に角層水分量が多い脂性肌（図中では水分量＋と表記）、正常肌、乾性肌、角層水分量が低下した脂性肌（図中では水分量－と表記）に分類した。
【0024】
図２は、クラスター分析により分類した正常肌および２種の脂性肌の皮脂量、角層水分量、経表皮水分蒸散量を比較した結果である。２種の脂性肌はいずれも、正常肌より皮脂量が多くなっていた。また、角層水分量が低下している脂性肌は、角層水分量が多い脂性肌よりも角層水分量が低く、経表皮水分蒸散量が高くなっており、肌質の特徴が反映されていたことから、クラスター分析の結果は妥当であったと判断した。以降の実験では、ここで得られた肌質分類を用いた。
【0025】
〔実験２：角層水分量が少ない脂性肌に特徴的な皮脂組成の確認〕
次に、以下の手順で、皮脂中の脂肪酸量を分析した。
被験者の頬内側に脂取りフィルム（９ｃｍ×５．５ｃｍ）を押し当て、皮脂の採取を行った。皮脂が付着したテープを、ジエチルエーテルが入ったチューブに混合し、皮脂を溶出したのち、４０℃でジエチルエーテルを乾固することで皮脂を得た。採取した皮脂１ｍｇあたり１００μｌのクロロホルムを加え、７０℃で溶媒を乾固させたものを皮脂サンプルとし、脂肪酸分析に用いた。皮脂サンプルおよび脂肪酸標品は、脂肪酸メチル化キット（ナカライテスク製）にてメチル化を行ったのち、ガスクロマトグラフィー分析法（カラム：３．２ｍｍφ×１．１ｍ パックドカラム、充填剤：ＤＥＧＳ、１５％クロモソルブＷ、カラム温度：１７５℃）により皮脂に含まれる各脂肪酸量を検出した。
次に、以下の手順で、皮脂中の脂肪酸量を分析した。
被験者の頬内側に脂取りフィルム（９ｃｍ×５．５ｃｍ）を押し当て、皮脂の採取を行った。皮脂が付着したテープを、ジエチルエーテルが入ったチューブに混合し、皮脂を溶出したのち、４０℃でジエチルエーテルを乾固することで皮脂を得た。採取した皮脂１ｍｇあたり１００μｌのクロロホルムを加え、７０℃で溶媒を乾固させたものを皮脂サンプルとし、脂肪酸分析に用いた。皮脂サンプルおよび脂肪酸標品は、脂肪酸メチル化キット（ナカライテスク製）にてメチル化を行ったのち、ガスクロマトグラフィー分析法（カラム：３．２ｍｍφ×１．１ｍ パックドカラム、充填剤：ＤＥＧＳ、１５％クロモソルブＷ、カラム温度：１７５℃）により皮脂に含まれる各脂肪酸量を検出した。
【0026】
図３は、正常肌、角層水分量が多い脂性肌、角層水分量が少ない脂性肌における、皮脂中におけるリノール酸およびオレイン酸の含有率を示したものである。今回の検討により、各肌質によってオレイン酸含有率の差はほとんどないが、角層水分量が低下している脂性肌では、総皮脂量に対するリノール酸の含有率が大幅に低下していることが分かった。
本結果より、角層水分量が少ない脂性肌における肌荒れは、皮脂中のリノール酸含有率が低下することにより、オレイン酸の角化亢進作用が顕著になっていることが原因であると予想された。
本結果より、角層水分量が少ない脂性肌における肌荒れは、皮脂中のリノール酸含有率が低下することにより、オレイン酸の角化亢進作用が顕著になっていることが原因であると予想された。
【0027】
〔実験３：皮脂中のリノール酸含有率の変化が皮膚状態へ与える影響の検証〕
実際に、皮脂中のリノール酸含有率が低下すると、角層水分量が少ない脂性肌と同様の特徴を示すのか、及び、オレイン酸による角化亢進作用が増強されるのかを検証するため、皮膚への脂肪酸塗布試験を行った。
表１に各試料の組成を示す。９５ｖ／ｖ％エタノールを溶媒とし、オレイン酸を１０ｖ／ｖ％、及びリノール酸をそれぞれ０．３、０．０６、０ｖ／ｖ％の割合で混合した。
実際に、皮脂中のリノール酸含有率が低下すると、角層水分量が少ない脂性肌と同様の特徴を示すのか、及び、オレイン酸による角化亢進作用が増強されるのかを検証するため、皮膚への脂肪酸塗布試験を行った。
表１に各試料の組成を示す。９５ｖ／ｖ％エタノールを溶媒とし、オレイン酸を１０ｖ／ｖ％、及びリノール酸をそれぞれ０．３、０．０６、０ｖ／ｖ％の割合で混合した。
【0028】
【表1】
【0029】
３０～４０代男性７名を対象に、前腕内側を試験部位とし、各試料を２週間塗布した。試験開始日および試験開始２週間後に、経表皮水分蒸散量、角層水分量の測定および角層細胞面積測定用の角層採取を行った。
【0030】
〔角層細胞面積の計測方法〕
角層チェッカー（プラスチックプレートタイプ プロモツール社製）を用いて、試験部位の角層細胞を採取した。角層チェッカーをエタノールに２分間浸漬後、水気をとり、ヘマトキシリン－エオシン染色を行った。蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ、４００倍）にて上記処理後の角層画像を取得し、プリントアウトした画像上の細胞の輪郭をなぞり、スキャナー（Ｄｏｃｕｃｅｎｔｅｒ－Ｖ Ｃ４４７６，富士ゼロックス）で取り込んだ。画像解析ソフト上で細胞の輪郭を抽出後、輪郭内の面積を計測した。
角層チェッカー（プラスチックプレートタイプ プロモツール社製）を用いて、試験部位の角層細胞を採取した。角層チェッカーをエタノールに２分間浸漬後、水気をとり、ヘマトキシリン－エオシン染色を行った。蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ、４００倍）にて上記処理後の角層画像を取得し、プリントアウトした画像上の細胞の輪郭をなぞり、スキャナー（Ｄｏｃｕｃｅｎｔｅｒ－Ｖ Ｃ４４７６，富士ゼロックス）で取り込んだ。画像解析ソフト上で細胞の輪郭を抽出後、輪郭内の面積を計測した。
【0031】
図４は、それぞれの試料を塗布した部位での、２週間の角層水分量、経表皮水分蒸散量変化を比較したものである。試料１～３を塗布した群間では、試料中のリノール酸含有率が低下するにしたがい、角層水分量の低下、経表皮水分蒸散量の上昇が見られ、角層水分量が少ない脂性肌の特徴と一致していた。したがって、当該肌質における角層内の乾燥は、皮脂中のリノール酸含有率の低下が原因であることが分かった。
また、図５に示すように試料１～３を塗布した群間での２週間の角層細胞面積変化を比較すると、試料中のリノール酸含有率が低下するにしたがい、角層細胞面積の縮小が顕著になっていた。なお、角化が亢進すると表皮細胞が十分に扁平化できないことが知られており、角層細胞面積の縮小は角化亢進を示すと考えられる。したがって、皮脂中のリノール酸含有率が低下すると、オレイン酸による角化亢進作用が増強されることが分かった。
また、図５に示すように試料１～３を塗布した群間での２週間の角層細胞面積変化を比較すると、試料中のリノール酸含有率が低下するにしたがい、角層細胞面積の縮小が顕著になっていた。なお、角化が亢進すると表皮細胞が十分に扁平化できないことが知られており、角層細胞面積の縮小は角化亢進を示すと考えられる。したがって、皮脂中のリノール酸含有率が低下すると、オレイン酸による角化亢進作用が増強されることが分かった。
【0032】
これまで角層水分量が少ない脂性肌で肌荒れが生じる原因は明確でなかったが、上記の知見を踏まえると、当該肌質では皮脂中のリノール酸含有率が低下することで、オレイン酸が皮膚に及ぼす影響を抑制しきれず、角化亢進作用が顕著になり肌荒れが生じると言える。
したがって当該肌質のように、皮脂中のリノール酸含有率が低下することで、オレイン酸の悪影響が強くなった皮膚に対しては、その悪影響を抑制することが肌荒れの改善に繋がると期待されたため、オレイン酸による角化亢進を抑制する有効成分をスクリーニングした。
したがって当該肌質のように、皮脂中のリノール酸含有率が低下することで、オレイン酸の悪影響が強くなった皮膚に対しては、その悪影響を抑制することが肌荒れの改善に繋がると期待されたため、オレイン酸による角化亢進を抑制する有効成分をスクリーニングした。
【0033】
＜実施例１＞オレイン酸添加表皮細胞の角化亢進度を指標としたスクリーニング
以下の手順で、オレイン酸を添加した表皮細胞の角化亢進度を指標とした、角層水分量が低下している脂性肌に対する肌荒れ改善剤のスクリーニングを行った。なお、角化亢進度は、表皮細胞の角化に伴い発現量が増加するタンパク質であるトランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）をコードする遺伝子の発現量変化を指標とした。
〔被験物質の調製〕
乾燥したサキシマボタンヅル（Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｏｓｂｅｃｋ）の根２０ｇに精製水を５００ｍＬ加え、８０℃にて８時間抽出して得られた成分を、１．５ｗ/ｖ％となるように５０ｖ／ｖ％１，３－ブチレングリコール溶液に溶かし、サキシマボタンヅル抽出物を得た。乾燥したコブミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｈｙｓｔｒｉｘ ＤＣ.）の葉２０ｇに８０ｖ／ｖ％エタノールを２００ｍＬ加え、８０℃にて２時間抽出して得られた成分を、１．０ｗ/ｖ％となるように７０ｖ／ｖ％１，３－ブチレングリコール溶液に溶かし、コブミカン葉抽出物を得た。
乾燥したウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）の果実、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ Ｌｉｍｏｎ Ｂｕｒｍａｎｎ ｆｉｌ．）の果実各２０ｇにそれぞれ５０ｖ／ｖ％エタノールを１００ｍＬ加え、室温（約２５℃）にて１週間抽出して得られた成分を、それぞれ１．５ｗ／ｖ％、１．０ｗ/ｖ％、となるように５０ｖ／ｖ％１，３－ブチレングリコール溶液に溶かし、ウメ抽出物、レモン抽出物を得た。
以下の手順で、オレイン酸を添加した表皮細胞の角化亢進度を指標とした、角層水分量が低下している脂性肌に対する肌荒れ改善剤のスクリーニングを行った。なお、角化亢進度は、表皮細胞の角化に伴い発現量が増加するタンパク質であるトランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）をコードする遺伝子の発現量変化を指標とした。
〔被験物質の調製〕
乾燥したサキシマボタンヅル（Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｏｓｂｅｃｋ）の根２０ｇに精製水を５００ｍＬ加え、８０℃にて８時間抽出して得られた成分を、１．５ｗ/ｖ％となるように５０ｖ／ｖ％１，３－ブチレングリコール溶液に溶かし、サキシマボタンヅル抽出物を得た。乾燥したコブミカン（Ｃｉｔｒｕｓ ｈｙｓｔｒｉｘ ＤＣ.）の葉２０ｇに８０ｖ／ｖ％エタノールを２００ｍＬ加え、８０℃にて２時間抽出して得られた成分を、１．０ｗ/ｖ％となるように７０ｖ／ｖ％１，３－ブチレングリコール溶液に溶かし、コブミカン葉抽出物を得た。
乾燥したウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）の果実、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ Ｌｉｍｏｎ Ｂｕｒｍａｎｎ ｆｉｌ．）の果実各２０ｇにそれぞれ５０ｖ／ｖ％エタノールを１００ｍＬ加え、室温（約２５℃）にて１週間抽出して得られた成分を、それぞれ１．５ｗ／ｖ％、１．０ｗ/ｖ％、となるように５０ｖ／ｖ％１，３－ブチレングリコール溶液に溶かし、ウメ抽出物、レモン抽出物を得た。
【0034】
〔細胞の培養〕
正常ヒト表皮角化細胞（Ｐａｓｓａｇｅ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に分散し、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｒｕｅ Ｌｉｎｅ）に５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養後、培地を除き、カルシウムイオン濃度が０．０３ｍＭのＥｐｉｌｉｆｅ培地および０．２５ｖ／ｖ％の被験物質を加えた。さらに１日間インキュベートした後、エタノールに溶解したオレイン酸（富士フィルム和光純薬）を２０μＭとなるように各ウェルに添加した。１日間培養後にＲＮＡ抽出キット（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＲＮＡを抽出した。
正常ヒト表皮角化細胞（Ｐａｓｓａｇｅ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に分散し、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｒｕｅ Ｌｉｎｅ）に５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養後、培地を除き、カルシウムイオン濃度が０．０３ｍＭのＥｐｉｌｉｆｅ培地および０．２５ｖ／ｖ％の被験物質を加えた。さらに１日間インキュベートした後、エタノールに溶解したオレイン酸（富士フィルム和光純薬）を２０μＭとなるように各ウェルに添加した。１日間培養後にＲＮＡ抽出キット（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＲＮＡを抽出した。
【0035】
〔ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ〕
その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、トランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を以下のプライマー及び酵素を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ）にて測定した。プライマーには、ＴＧＭ１用センスプライマー（５’－ＴＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＡＴＧＣＴＡＧＴＡＧ－３’）、アンチセンスプライマー（５’－ＧＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＴＣＧＴＣＧＴＡＣＴＣＡ－３’）、ＧＡＰＤＨ用センスプライマー（５’－ＣＣＡＣＡＴＣＧＣ ＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ－３’）、アンチセンスプライマー（５’－ＴＧＡＣＣＡＧＧＣ ＧＣＣＣＡＡＴＡ－３’）を用いた。ＰＣＲの反応にはＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、被験物質添加による遺伝子発現量の変化は、オレイン酸未添加のコントロール群のＴＧＭ１のＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、トランスグルタミナーゼ１（ＴＧＭ１）およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）の発現量を以下のプライマー及び酵素を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムズ）にて測定した。プライマーには、ＴＧＭ１用センスプライマー（５’－ＴＣＣＧＡＧＡＧＧＧＣＡＴＧＣＴＡＧＴＡＧ－３’）、アンチセンスプライマー（５’－ＧＣＡＣＴＡＴＣＡＧＣＴＣＧＴＣＧＴＡＣＴＣＡ－３’）、ＧＡＰＤＨ用センスプライマー（５’－ＣＣＡＣＡＴＣＧＣ ＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ－３’）、アンチセンスプライマー（５’－ＴＧＡＣＣＡＧＧＣ ＧＣＣＣＡＡＴＡ－３’）を用いた。ＰＣＲの反応にはＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。つまり、被験物質添加による遺伝子発現量の変化は、オレイン酸未添加のコントロール群のＴＧＭ１のＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値で補正した値を１とし、それに対する相対量として求めた。
【0036】
図６に示すように、オレイン酸の添加により増加した表皮細胞の角化関連遺伝子ＴＧＭ１の発現量は、サキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物を添加した群では減少しており、サキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物はオレイン酸による表皮細胞の角化亢進作用を抑制できることが示された。一方、レモン抽出物、ウメ抽出物には保湿作用、皮膚バリア機能向上作用が報告されているが、オレイン酸の添加により増加したＴＧＭ１の発現量は減少せず、むしろ増加していた。そのため、保湿作用および皮膚バリア機能向上作用は、オレイン酸による角化亢進抑制作用とは連動しないものであると考えられた。
【0037】
＜実施例２＞オレイン酸未添加表皮細胞の細胞分化度への影響の検討
以下の手順で、＜実施例１＞にてオレイン酸による表皮細胞の角化亢進作用を抑制したサキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物が角化関連遺伝子ＴＧＭ１の発現量へ及ぼす影響を確認した。
〔被験物質の調製〕
＜実施例１＞と同様に調製したサキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物を用いた。
〔被験物質における角化関連遺伝子ＴＧＭ１発現量への影響の検討〕
正常ヒト表皮角化細胞（Ｐａｓｓａｇｅ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に分散し、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｒｕｅ Ｌｉｎｅ）に５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養後、培地を除き、カルシウム濃度が０．０３ｍＭのＥｐｉｌｉｆｅ培地および０．２５ｖ／ｖ％の被験物質を加えた。さらに２日間培養後にＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、＜実施例１＞と同様の方法でＴＧＭ１の遺伝子発現量を測定した。
以下の手順で、＜実施例１＞にてオレイン酸による表皮細胞の角化亢進作用を抑制したサキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物が角化関連遺伝子ＴＧＭ１の発現量へ及ぼす影響を確認した。
〔被験物質の調製〕
＜実施例１＞と同様に調製したサキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物を用いた。
〔被験物質における角化関連遺伝子ＴＧＭ１発現量への影響の検討〕
正常ヒト表皮角化細胞（Ｐａｓｓａｇｅ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に分散し、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｒｕｅ Ｌｉｎｅ）に５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養後、培地を除き、カルシウム濃度が０．０３ｍＭのＥｐｉｌｉｆｅ培地および０．２５ｖ／ｖ％の被験物質を加えた。さらに２日間培養後にＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、＜実施例１＞と同様の方法でＴＧＭ１の遺伝子発現量を測定した。
【0038】
図７に示すように、サキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物は、オレイン酸未添加の表皮細胞の角化関連遺伝子ＴＧＭ１の発現量にほとんど変化を与えないことが確認された。つまり、サキシマボタンヅル抽出物とコブミカン葉抽出物そのものは表皮細胞の角化を抑制する作用は保持しておらず、図６で確認された効果はオレイン酸による角化亢進に特異的な作用であったことが確認された。
【0039】
〔実験３〕にて、オレイン酸を皮膚に塗布すると、その角化亢進作用により、角層水分量の低下、経表皮水分蒸散量の上昇、角層細胞面積の縮小が起こり、角層水分量が低下している脂性肌と同様の特徴が現れることがわかった。
サキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物は、オレイン酸による角化亢進を抑制する作用を有するため、皮膚に塗布することで、角層水分量が低下している脂性肌における角化亢進を抑制し、当該肌質における肌荒れを防ぐことが期待できる。
サキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物は、オレイン酸による角化亢進を抑制する作用を有するため、皮膚に塗布することで、角層水分量が低下している脂性肌における角化亢進を抑制し、当該肌質における肌荒れを防ぐことが期待できる。
【0040】
本発明によると、サキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物を用いることで、オレイン酸に起因する角化亢進を抑制し、皮膚表面が皮脂過剰であり角層水分量が低下した部位における肌荒れを改善することができる。
また、抽出物そのものに表皮細胞の角化を抑制する作用は無いため、正常状態である部位へは何ら影響を与えない。そのため、顔の部位により肌質が異なる場合でも、サキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物を配合した化粧料によるスキンケアを全顔に行うことで、皮膚表面が皮脂過剰であり角層水分量は低下している部位に特異的に作用し、肌荒れを改善することができる。
また、抽出物そのものに表皮細胞の角化を抑制する作用は無いため、正常状態である部位へは何ら影響を与えない。そのため、顔の部位により肌質が異なる場合でも、サキシマボタンヅル抽出物、コブミカン葉抽出物を配合した化粧料によるスキンケアを全顔に行うことで、皮膚表面が皮脂過剰であり角層水分量は低下している部位に特異的に作用し、肌荒れを改善することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
