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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022089577
(43)【公開日】2022-06-16
(54)【発明の名称】軽度認知障害の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6827 20180101AFI20220609BHJP
C12Q 1/6883 20180101ALI20220609BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220609BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6827 Z ZNA
C12Q1/6883 Z
G01N33/53 M
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020202075
(22)【出願日】2020-12-04
(71)【出願人】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(71)【出願人】
【識別番号】520358379
【氏名又は名称】株式会社Ｒｈｅｌｉｘａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】服部 信孝
(72)【発明者】
【氏名】西岡 健弥
(72)【発明者】
【氏名】代田 健祐
(72)【発明者】
【氏名】小田 真由美
(72)【発明者】
【氏名】内海 貴夫
(72)【発明者】
【氏名】仲木 竜
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR66
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】軽度認知障害（ＭＣＩ）の検出方法の提供。
【解決手段】被験者から採取された生体試料由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を測定することを含む、当該被験者における軽度認知障害（ＭＣＩ）の検出方法であって、前記標的ＣｐＧサイトが、染色体上の特定の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、方法。前記ゲノムＤＮＡがバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡである方法。前記ＤＮＡメチル化率の測定がマイクロアレイ法、パイロシークエンス法、バイサルファイトシークエンス法、又は定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法を用いて行われる方法。
【選択図】なし
【解決手段】被験者から採取された生体試料由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を測定することを含む、当該被験者における軽度認知障害（ＭＣＩ）の検出方法であって、前記標的ＣｐＧサイトが、染色体上の特定の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、方法。前記ゲノムＤＮＡがバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡである方法。前記ＤＮＡメチル化率の測定がマイクロアレイ法、パイロシークエンス法、バイサルファイトシークエンス法、又は定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法を用いて行われる方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者から採取された生体試料由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を測定することを含む、当該被験者における軽度認知障害（ＭＣＩ）の検出方法であって、
前記標的ＣｐＧサイトが、下記表１の（１）～（３４）に記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、方法。
前記標的ＣｐＧサイトが、下記表１の（１）～（３４）に記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、方法。
【表1】
【請求項2】
前記ゲノムＤＮＡがバイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記ＤＮＡメチル化率の測定がマイクロアレイ法、パイロシークエンス法、バイサルファイトシークエンス法、又は定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法を用いて行われる、請求項２記載の方法。
【請求項4】
前記生体試料が全血試料である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項5】
前記標的ＣｐＧサイトが前記表１の（１）～（３４）に記載される染色体上の位置に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
前記標的ＣｐＧサイトが前記表１の（１）～（２０）に記載される染色体上の位置に位置するＣｐＧサイトである、請求項１～５のいずれか１項の方法。
【請求項7】
前記標的ＣｐＧサイトが前記表１の（１）～（３４）に記載される染色体上の位置に位置するＣｐＧサイトである、請求項１～５のいずれか１項の方法。
【請求項8】
さらに、前記ＤＮＡメチル化率を対照ＤＮＡメチル化率と比較することを含む、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
【請求項9】
さらに、前記ＤＮＡメチル化率を下記式（１）に代入し、得られた値をカットオフ値と比較することによって、当該被験者におけるＭＣＩの有無を検出する、請求項６記載の方法。
（式（１）中、αは－５３３．１７２２を示し、β１は４４６．３３５２、β２は－４５０．７７２８、β３は－２４４．６１８７、β４は３８５．７７５１、β５は２０４．７３５１、β６は５４．８８０７、β７は５０４．２４４５、β８は－１３９．５４３２、β９は３３２．２４３５、β１０は－３５０．７７００、β１１は１１４．３２７３、β１２は２３２．６８０９、β１３は－１８９．６９９４、β１４は６６．６４３４、β１５は－１２．０３３１、β１６は９．２２１９、β１７は－４７．９５２７、β１８は１５２．８１４０、β１９は－６７．５１２１、β２０は－１９．４１５１を示し、ｘ１～ｘ２０は、それぞれ、上記表１の（１）～（２０）に記載される染色体上の位置に位置するＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を示す。）
【数1】
【請求項10】
さらに、前記ＤＮＡメチル化率を下記式（２）に代入し、得られた値をカットオフ値と比較することによって、当該被験者におけるＭＣＩの有無を検出する、請求項７記載の方法。
（式（１）中、αは－５８５．９３４５を示し、β１は７２５．２８４５、β２は－６２９．１５１７、β３は－３９６．５４７０、β４は３５０．７３３５、β５は３１６．９３６８、β６は２９１．４１９３、β７は２３５．９８８０、β８は－２２７．１１３０、β９は２０３．５１８０、β１０は－１９３．７４３６、β１１は１８３．５８７７、β１２は１８２．７９４３、β１３は－１７７．１２４８、β１４は１５９．０１８９、β１５は１３６．６８８９、β１６は－１３４．３１５３、β１７は－１１７．９２８２、β１８は１１５．０９０２、β１９は－１１３．９６８６、β２０は－１１１．６２１４、β２１は－１０８．６５６６、β２２は１０４．５５４７、β２３は－１００．０７３６、β２４は９６．２６１８、β２５は９６．１８０７、β２６は－８９．５２１４、β２７は８７．８０１１、β２８は－５７．１８４１、β２９は５６．５６４０、β３０は－５０．０３９６、β３１は－４２．３３１０、β３２は２９．２７３８、β３３は－２８．２２５７、β３４は－２５．８９６９を示し、ｘ１～ｘ３４は、それぞれ、上記表１の（１）～（３４）に記載される染色体上の位置に位置するＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を示す。）
【数2】
【請求項11】
被験者におけるＭＣＩの検出のためのプライマー又はプローブであって、
前記プライマー又はプローブは、少なくとも１０塩基の鎖長を有し、かつバイサルファイト処理された後の標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ領域、前記標的ＣｐＧサイトの上流のＤＮＡ領域、又は該標的ＣｐＧサイトの下流のＤＮＡ領域にハイブリダイズし、
前記標的ＣｐＧサイトが、上記表１の（１）～（３４）に記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、プライマー又はプローブ。
前記プライマー又はプローブは、少なくとも１０塩基の鎖長を有し、かつバイサルファイト処理された後の標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ領域、前記標的ＣｐＧサイトの上流のＤＮＡ領域、又は該標的ＣｐＧサイトの下流のＤＮＡ領域にハイブリダイズし、
前記標的ＣｐＧサイトが、上記表１の（１）～（３４）に記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、プライマー又はプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、軽度認知障害の検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
軽度認知障害（Ｍｉｌｄ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ：ＭＣＩ）とは、健常な状態とアルツハイマー型認知症、血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症等の認知症の間にあたり、認知機能の低下は生じているものの日常生活は支障なく送ることができる状態である。ＭＣＩの定義は、１．年齢や教育レベルの影響のみでは説明できない記憶障害が存在する、２．本人または家族による物忘れの訴えがある、３．全般的な認知機能は正常範囲である、４．日常生活動作は自立している、５．認知症ではない、の５つである。ＭＣＩ有病者数は、人口の高齢化に従ってますます増加することが予想される。
【0003】
ＭＣＩを放置すると年平均で約５～１５％が認知症に進行する一方、約１６～４１％でＭＣＩから認知機能が正常な状態へと回復することが報告されている（非特許文献１）。さらに、症状が軽いＭＣＩでは、症状が進行し複数の認知機能に低下がみられるＭＣＩに比べて回復率が高いことも報告されている（非特許文献２）。よって、一部の原因疾患が明らかな場合を除いて認知症の根本的治療法は確立されていないところ、認知機能の低下が軽微なＭＣＩの段階で早期診断して早期介入を図ることが肝要である。
【0004】
現在、ＭＣＩは、本人や家族からの問診や認知機能検査に加え、血液検査等の一般的な身体検査、頭部ＭＲＩ、ＣＴ、脳血流ＳＰＥＣＴ等の検査の結果を総合的に踏まえて診断されている。しかしながら、かかる方法では医師の専門的な判断を要する。したがって、ＭＣＩを簡便に診断するための技術が強く望まれている。
【0005】
一方、ＤＮＡのメチル化は、正常な発生に必須であり、遺伝子発現を調節し、細胞の発生、分化、老化、リプログラミング等の生物学的現象に深く関与することが知られている。ＤＮＡのメチル化の異常は、様々な疾患の発症に関わると考えられており、例えば、がんにおいては、一部の遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧアイランドの異常なＤＮＡメチル化が、がん抑制遺伝子の不活化等を通じて発がんに関与することが明らかになっている。
【0006】
認知症の主な原因の１つであるアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）については、血漿内のアミロイドβ（Ａβ）ペプチド、Ｔａｕペプチド、α－シヌクレイン、ＴＤＰ－４３等のバイオマーカーが報告されている（非特許文献３）。また、ＡＤ患者及び健忘性ＭＣＩ患者において、健常者に比して、ＮＣＡＰＨ２／ＬＭＦ２遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化が有意に減少していたことが報告されている（非特許文献４）。しかしながら、非特許文献４では、スクリーニングに用いた検体数が少なく、該ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率は、認知機能障害を反映するＭｉｎｉ－Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ（ＭＭＳＥ）及びＦｒｏｎｔａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｂａｔｔｅｒｙ（ＦＡＢ）のスコアと有意に相関することから、健忘性ＭＣＩを含むＡＤのバイオマーカーとなるに過ぎない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】認知症疾患診療ガイドライン２０１７、日本神経学会監修、「認知症疾患診療ガイドライン」作成委員会編集、２０１７年
【非特許文献2】Brodaty H et al., Alzheimers Dement. 2013, 9(3):310-317
【非特許文献3】Molinuevo JL et al., Acta Neuropathologica, 2018, 136:821-853
【非特許文献4】Kobayashi N et al., PLoS One, 2016, 11(1):e0146449
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、ＤＮＡのメチル化率に基づいてＭＣＩを検出する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、健常者、ＭＣＩ患者、及びＡＤ患者から採取された血液試料を対象として鋭意検討したところ、健常者及びＡＤ患者と比較してＭＣＩ患者でのみ特定のＣｐＧサイトにおいてメチル化が有意に増加しており、当該ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を指標にＭＣＩを検出できることを見出し、本発明を完成した。
【0010】
すなわち、本発明は、以下の１）及び２）に係るものである。
１）被験者から採取された生体試料由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を測定することを含む、当該被験者における軽度認知障害（ＭＣＩ）の検出方法であって、
前記標的ＣｐＧサイトが、下記表１の（１）～（３４）に記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、方法。
２）被験者におけるＭＣＩの検出のためのプライマー又はプローブであって、
前記プライマー又はプローブは、少なくとも１０塩基の鎖長を有し、かつバイサルファイト処理された後の標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ領域、前記標的ＣｐＧサイトの上流のＤＮＡ領域、又は該標的ＣｐＧサイトの下流のＤＮＡ領域にハイブリダイズし、
前記標的ＣｐＧサイトが、上記表１の（１）～（３４）に記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、プライマー又はプローブ。
１）被験者から採取された生体試料由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を測定することを含む、当該被験者における軽度認知障害（ＭＣＩ）の検出方法であって、
前記標的ＣｐＧサイトが、下記表１の（１）～（３４）に記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、方法。
【表1】
前記プライマー又はプローブは、少なくとも１０塩基の鎖長を有し、かつバイサルファイト処理された後の標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ領域、前記標的ＣｐＧサイトの上流のＤＮＡ領域、又は該標的ＣｐＧサイトの下流のＤＮＡ領域にハイブリダイズし、
前記標的ＣｐＧサイトが、上記表１の（１）～（３４）に記載される染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトである、プライマー又はプローブ。
【発明の効果】
【0011】
本発明の方法によれば、ＭＣＩを簡便に検出することが可能となる。本発明により早期にＭＣＩを検出できれば、ＭＣＩ患者に対する適切な治療を早期に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】２０ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を利用する判別式による健常者（ＨＣ）群、ＭＣＩ群、ＡＤ群におけるＭＣＩスコアを示す図。
【図2】３４ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を利用する判別式による健常者（ＨＣ）群、ＭＣＩ群、ＡＤ群におけるＭＣＩスコアを示す図。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本明細書において、「軽度認知障害（ＭＣＩ）」とは、健常な状態と認知症の間にあたり、認知機能の低下は生じているものの日常生活は支障なく送ることができる状態、あるいは認知症の最初期状態をさす。具体的には、Ｍｉｎｉ－Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ（ＭＭＳＥ）のスコアが２０以上２３以下の状態又は認知機能がそれに相当する状態をさす。
【0014】
本明細書において、被験者におけるＭＣＩの「検出」とは、被験者におけるＭＣＩの有無を明らかにする意味であり、検査、測定、判定、又は評価と言い換えることもできる。なお、本明細書において、「判定」又は「評価」という用語は、医師による判定や評価を含むものではない。
【0015】
本明細書において、「ＣｐＧサイト」とは、ＤＮＡ中のシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）がホスホジエステル結合した２塩基配列を意味する。ＣｐＧサイトの出現頻度が高い領域は、ＣｐＧアイランドと呼ばれる。ＣｐＧアイランドは、遺伝子のコード領域に近い位置、例えばプロモーター領域に存在することが多く、したがって遺伝子のＣｐＧサイトは、該遺伝子のコード領域に近い位置に存在するＣｐＧアイランド、又は該遺伝子のプロモーター領域に多く存在する。
【0016】
本明細書において、「ＤＮＡメチル化」とは、ＤＮＡにおいてシトシンのピリミジン環の５位の炭素がメチル化されている状態のことを意味する。また、本明細書において、あるＣｐＧサイトの「ＤＮＡメチル化率」とは、該ＣｐＧサイトにおいてＤＮＡがメチル化されている割合を意味する。かかる割合は、完全メチル化を１００％、完全非メチル化を０％とした百分率で表してもよいし、完全メチル化を１、完全非メチル化を０として表してもよい。本明細書において、ＤＮＡメチル化率が高い及び低いとは、それぞれ、ＤＮＡがメチル化されている割合が高いこと及び低いことを意味する。
【0017】
本発明は、被験者におけるＭＣＩの検出方法に関する。本発明の方法は、被験者から採取された生体試料由来のゲノムＤＮＡにおける標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を測定することを含む。ここで、被検者としては、ヒト、例えば、認知機能低下を訴える者、認知機能低下の疑いがある者、認知機能の評価を希望する者等が挙げられる。
【0018】
本発明の方法において用いられる被験者から採取された生体試料としては、ゲノムＤＮＡを含むものである限り特に限定されず、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、採取された細胞、組織、血液、血液に由来する血漿や血清、口腔粘液等が挙げられる。このうち、血液試料が好ましく、全血試料がより好ましい。
【0019】
本発明の方法において用いられる被験者から採取された生体試料由来のゲノムＤＮＡとしては、上記生体試料より調製されたゲノムＤＮＡ等が挙げられる。生体試料からゲノムＤＮＡを調製する手法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。ＤＮＡを調製する公知の方法としては、フェノールクロロホルム法、ＣＴＡＢ法、アルカリＳＤＳ法又は市販のＤＮＡ抽出キット、例えばＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）や、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、Ｃｌｅａｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）、ＺＲ Ｐｌａｎｔ／Ｓｅｅｄ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴｒｉｍＧｅｎ社製）、等を用いるＤＮＡ抽出方法等が挙げられる。
【0020】
好ましくは、調製されたゲノムＤＮＡは、バイサルファイト処理される。ＤＮＡのバイサルファイト処理の方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。バイサルファイト処理のための公知の方法としては、例えば、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄキット、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｋｉｔ（いずれもＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｋｉｔ（４８）（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ社製）、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣｐＧ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＣｐＧｅｎｏｍｅ Ｔｕｒｂｏ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＥＲＣＫ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等の市販のキットを用いる方法が挙げられる。
【0021】
さらに、前記バイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡを増幅することが好ましい。増幅の手法には特に制限はないが、好ましくはＰＣＲが利用される。増幅の手法及び条件は、増幅対象のＤＮＡの配列、長さ、量等に応じて、公知の手法及び条件を適宜選択して用いることができる。
【0022】
後述の実施例に示すように、本発明者らは、表２に示す（１）～（３４）のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化率が、健常者群及びアルツハイマー病（ＡＤ）患者群と比較して、ＭＣＩ患者群でのみ有意に高いことを見出した。また、かかるＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化率の群平均の差分は５％以上と非常に大きかった。よって、これらＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化率は、ＭＣＩの検出のためのマーカーとして使用することができる。すなわち、これらＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化率の高低に基づいて、被験者におけるＭＣＩの有無を検出できる。
【0023】
【表2】
【0024】
したがって、本発明の方法において、ＤＮＡメチル化率を測定する標的ＣｐＧサイトとしては、表２に示す染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトが挙げられる。本発明の方法においては、表２に示す染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を測定すればよい。
なお、本明細書において、ＣｐＧサイトの染色体上の位置は、基準ヒトゲノム配列であるＮＣＢＩデータベース Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｕｉｌｄ ３７上の位置を基準にして表されている。また、本明細書において、遺伝子の名称は、ＮＣＢＩデータベースに登録された遺伝子の名前に基づくものである。
なお、本明細書において、ＣｐＧサイトの染色体上の位置は、基準ヒトゲノム配列であるＮＣＢＩデータベース Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｕｉｌｄ ３７上の位置を基準にして表されている。また、本明細書において、遺伝子の名称は、ＮＣＢＩデータベースに登録された遺伝子の名前に基づくものである。
【0025】
本明細書において、染色体上の位置の「近傍」とは、当該染色体上の位置から上流（ＤＮＡの５’側）５００塩基～下流（ＤＮＡの３’側）５００塩基、好ましくは上流２００塩基～下流２００塩基、より好ましくは上流１００塩基～下流１００塩基、さらに好ましくは上流５０塩基～下流５０塩基の領域をいう。ゲノムＤＮＡにおいて、あるＣｐＧサイトの近傍に位置するＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化が、該ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化と多くの場合に相関することが知られている（例えば、Bell JT et al., Genome Biology 2011, 12:R10参照）。
【0026】
表２に示す染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトの例としては、表３に示すＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトが挙げられる。
【0027】
【表3】
【0028】
換言すると、ＤＮＡメチル化率を測定する標的ＣｐＧサイトの例としては、配列番号１～３４のいずれかの塩基配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトが挙げられる。
【0029】
表２に示す染色体上の位置に位置するＣｐＧサイトのうち、５番染色体の１，５９４，７１５位、１，５９４，６７８位、及び１，５９４，７３３位に位置するＣｐＧサイト（表２のＣｐＧサイト（１）、（３）及び（２１））は、５番染色体の１，５９４，２３８～１，５９５，０２７位に存在するＳＤＨＡＰ３遺伝子のＣｐＧアイランド（配列番号３５）に含まれる。また、１６番染色体の８５７，４５４位及び８５７，８６３位に位置するＣｐＧサイト（表２のＣｐＧサイト（８）及び（２２））は、１６番染色体の８５７，３４１～８５８，０２５位に存在するＰＲＲ２５遺伝子のＣｐＧアイランド（配列番号３６）に含まれる。よって、表２に示す染色体上の位置又はその近傍に位置するＣｐＧサイトの別の例としては、５番染色体の１，５９４，２３８～１，５９５，０２７位のＣｐＧアイランドに含まれるＣｐＧサイト又は１６番染色体の８５７，３４１～８５８，０２５位のＣｐＧアイランドに含まれるＣｐＧサイトが挙げられる。
【0030】
本発明の方法においては、上述の標的ＣｐＧサイトのうちの少なくとも１つのＣｐＧサイトについてのＤＮＡメチル化率を測定すればよい。例えば、本発明の方法においては、上記表２に示す染色体上の位置に位置するＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を測定すればよい。あるいは、本発明の方法においては、上記の表３に示すＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を測定すればよい。あるいは、本発明の方法においては、配列番号１～３６のヌクレオチド配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域に含まれるＣｐＧサイトからなる群より選択される少なくとも１つのＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を測定すればよい。
【0031】
また、検出感度の向上という観点からは、前述したＣｐＧサイトを組み合わせて標的ＣｐＧサイトとしてもよい。かかる組み合わせの例としては、表２に示すいずれかのＣｐＧサイトとその近傍に位置するＣｐＧサイトとの組み合わせ、表２に示すＣｐＧサイトのいずれか２つ以上の組み合わせ、表２に示す（１）～（２０）のＣｐＧサイトの組み合わせ、表２に示す（１）～（３４）のＣｐＧサイトの組み合わせ、等が挙げられる。このうち、表２に示すいずれかのＣｐＧサイトとその近傍に位置するＣｐＧサイトとの組み合わせ、表２に示す（１）～（２０）のＣｐＧサイトの組み合わせ、及び表２に示す（１）～（３４）のＣｐＧサイトの組み合わせが好ましい。
【0032】
したがって、本発明の方法において前述したようにバイサルファイト処理されたＤＮＡをＰＣＲ等で増幅する場合、上述の標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ領域が増幅される。増幅されるＤＮＡ領域のサイズは、そこに標的ＣｐＧサイトが含まれている限りにおいて、特に限定されない。
【0033】
本発明において、ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を測定する手法としては、特に限定されず、公知のＤＮＡメチル化率を測定できる手法を適宜用いることができる。かかる公知の手法としては、マイクロアレイ法、パイロシークエンス法、バイサルファイトシークエンス法、メチル化特異的ＰＣＲ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ：ＭＳＰ）法、定量的ＭＳＰ法、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0034】
マイクロアレイ法は、各ＣｐＧサイトについて３’末端にメチル化シトシン又は非メチル化シトシンに相補的な塩基を有するように構築されたプローブを用いた１塩基伸長反応を利用して、ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡのメチル化を定量する方法である。該方法は、例えば、次のように実施することができる。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。なお、このバイサルファイト処理によって、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換されるが、メチル化シトシン残基は変換されない。次いで、このようにバイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、全ゲノム増幅を行い、酵素による断片化（通常３００～６００ｂｐ程度の断片化）を行い、一本鎖に解離させる。
【0035】
一方、バイサルファイト処理によって変換されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、該プローブの３’末端の塩基が、前記ＣｐＧサイトのシトシンに相補的な塩基であるプローブを調製する。すなわち、該ＣｐＧサイトがメチル化されている場合には、プローブの３’末端の塩基はグアニンとなり、該ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合には、プローブの３’末端の塩基はアデニンとなる。
【0036】
そして、このような前記ＣｐＧサイトに相補的な３’末端の塩基のみが異なる２種類のプローブと、前記一本鎖ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせ、蛍光標識した塩基の存在下、１塩基伸長反応を行う。その結果、該一本鎖断片のＣｐＧサイトがメチル化されている場合、３’末端の塩基がグアニンであるプローブ（メチル化検出用プローブ）には１塩基伸長反応により蛍光標識した塩基が取り込まれるが、３’末端の塩基がアデニンであるプローブ（非メチル化検出用プローブ）には、３’末端の塩基のミスマッチのため１塩基伸長反応が起こらず、蛍光標識した塩基は取り込まれない。一方、該一本鎖断片のＣｐＧサイトがメチル化されていない場合、非メチル化検出用プローブには蛍光標識した塩基が取り込まれるが、メチル化検出用プローブには蛍光標識した塩基は取り込まれない。したがって、メチル化検出用プローブ及び／又は非メチル化検出用プローブが発する蛍光の強度からＤＮＡメチル化率を算出することができる。
【0037】
また、該方法においては、別の態様として、前記メチル化検出用プローブ及び非メチル化検出用プローブの代わりに、バイサルファイト処理によって変換されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、該プローブの３’末端の塩基が前記ＣｐＧサイトのグアニンに相補的な塩基となっているプローブを用いてもよい。そして、かかるプローブと、前記一本鎖ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせ、蛍光物質にて標識したグアニン及び／又は該蛍光物質とは異なる蛍光色素にて標識したアデニンの存在下、１塩基伸長反応を行う。その結果、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合には、当該プローブに蛍光標識したグアニンが取り込まれることになり、一方、前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合には、当該プローブに蛍光標識したアデニンが取り込まれることになるため、前記プローブに取り込まれた各蛍光物質が発する蛍光の強度からＤＮＡメチル化率を算出することができる。
【0038】
かかる方法の好ましい例としては、例えば、ビーズアレイ法（例えば、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）Ａｓｓａｙ）が挙げられる。
【0039】
パイロシークエンシング法は、例えば、次のように実施することができる。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。なお、このバイサルファイト処理によって、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換されるが、下記伸長反応（シークエンス反応）においてはウラシルはチミンとして示される。次いで、このようにバイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを少なくとも一つ含むＤＮＡを増幅する。そして、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。そして、前記ＣｐＧサイトの塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。このようにして得られたメチル化シトシン残基由来の発光の強度（シトシンの発光強度）と、非メチル化シトシン残基由来の発光の強度（チミンの発光強度）とを比較し、例えば、下記式（１）によって前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化率を算出する。
【0040】
【数1】
【0041】
バイサルファイトシークエンス法は、例えば、次のように実施することができる。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを鋳型として、直接シークエンシング反応を行う。そして、決定された塩基配列に基づく蛍光強度、すなわちメチル化シトシン残基由来の蛍光強度（シトシンの蛍光強度）と、非メチル化シトシン残基由来の蛍光強度（チミンの蛍光強度）とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化率を算出する。
【0042】
ＭＳＰ法は、例えば、次のように実施することができる。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合に増幅可能なプライマーセット、及び前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合に増幅可能なプライマーセットを調製する。そして、前記バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記ＣｐＧサイトを少なくとも１つ含むヌクレオチドを、これらのプライマーセットを用いて各々増幅する。そして、得られた増幅産物の量、すなわちメチル化ＣｐＧサイト特異的な増幅産物の量、及び非メチル化ＣｐＧサイト特異的な増幅産物の量を比較することにより、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化率を算出する。
【0043】
定量的ＭＳＰ法は、例えば、次のように実施することができる。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次に、前記ＣｐＧサイトがメチル化されている場合にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドを有し、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。また、前記ＣｐＧサイトがメチル化されていない場合にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドを有し、前記レポーター蛍光色素とは異なるレポーター蛍光色、及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡに前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズしたゲノムＤＮＡを鋳型として前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出する。このようにして検出されたメチル化シトシンＣｐＧサイト特異的なレポーター蛍光色素が発する蛍光の強度と、非メチル化シトシンＣｐＧサイト特異的なレポーター蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較することによって、前記ＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化率を算出する。
【0044】
該方法としては、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を用いたＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ法等が挙げられる。
【0045】
ＣＯＢＲＡ法は、例えば、次のように実施することができる。先ず、前記ゲノムＤＮＡにバイサルファイト処理を施す。次いで、バイサルファイト変換された前記ＣｐＧサイトを含むヌクレオチドを鋳型として、前記ＣｐＧサイトを含む領域をＰＣＲにて増幅する。次いで、増幅したＤＮＡ断片を、該ＣｐＧサイトがメチル化されている場合とされていない場合とで配列が異なる箇所を認識する制限酵素で処理する。そして、電気泳動することによって分画された、メチル化ＣｐＧサイトに由来する制限酵素断片と非メチル化ＣｐＧサイトに由来する制限酵素断片とのバンドの濃さを定量的に解析することにより、該ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を算出することができる。
【0046】
本発明において「ＤＮＡメチル化率を検出する手法」としては、上記手法に限定されないが、パイロシークエンス法、バイサルファイトシークエンス法、又は定量的ＭＳＰ法が好ましい。上記手法では、ゲノムＤＮＡは、バイサルファイト処理に供される。したがって、本発明の方法においてＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率の測定に用いられるゲノムＤＮＡは、好ましくは、バイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡである。
【0047】
斯くして、被験者から採取された生体試料由来のゲノムＤＮＡにおける本発明の標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率が測定され、当該ＤＮＡメチル化率に基づいて、当該被験者におけるＭＣＩの有無が検出される。検出のための具体的な指標（閾値）は、当業者であれば、ＤＮＡメチル化率を検出する手法に合わせて適宜設定することができる。検出の手順の実施形態について以下に述べる。
【0048】
第一の実施形態においては、前記検出は、測定された標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を対照ＤＮＡメチル化率と比較することによって行われる。ここで、「対照ＤＮＡメチル化率」とは、例えば、健常者における該標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率が挙げられる。健常者の標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率は、健常者集団から測定した該標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率の統計値（例えば平均値等）であってもよい。該標的ＣｐＧサイトが複数の場合は、各々のＣｐＧサイトについて基準レベルを求めることが好ましい。
前記第一の実施形態においては、被験者から採取された生体試料について、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率が対照ＤＮＡメチル化率よりも高い場合、ＤＮＡメチル化率は診断閾値を超えたと判断され、該被験者はＭＣＩを有すると判定される。一方、ＤＮＡメチル化率が対照ＤＮＡメチル化率以下であれば、該被験者はＭＣＩを有さないと判定される。
前記第一の実施形態においては、被験者から採取された生体試料について、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率が対照ＤＮＡメチル化率よりも高い場合、ＤＮＡメチル化率は診断閾値を超えたと判断され、該被験者はＭＣＩを有すると判定される。一方、ＤＮＡメチル化率が対照ＤＮＡメチル化率以下であれば、該被験者はＭＣＩを有さないと判定される。
【0049】
第二の実施形態においては、前記検出は、測定された標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率の上昇を検出することにより行われる。この場合は、測定された標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率が、各ＣｐＧサイトのカットオフ値（参照値）と比較される。カットオフ値は、予め健常者における該標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を基準データとして取得しておき、それに基づくＤＮＡメチル化率の平均値や標準偏差等の統計的数値に基づき、適宜決定すれば良い。
前記第二の実施形態においては、被験者から採取された生体試料について、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率がカットオフ値より高い場合、ＤＮＡメチル化率は診断閾値を超えたと判断され、該被験者はＭＣＩを有すると判定される。一方、ＤＮＡメチル化率が該カットオフ値以下であれば、該被験者はＭＣＩを有さないと判定される。
前記第二の実施形態においては、被験者から採取された生体試料について、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率がカットオフ値より高い場合、ＤＮＡメチル化率は診断閾値を超えたと判断され、該被験者はＭＣＩを有すると判定される。一方、ＤＮＡメチル化率が該カットオフ値以下であれば、該被験者はＭＣＩを有さないと判定される。
【0050】
前記第一及び第二の実施形態において、複数のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率が測定される場合は、ＤＮＡメチル化率が診断閾値を超えたＣｐＧサイトの数又は割合を、判定のための指標とすることができる。例えば、調べた全てのＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率がいずれも診断閾値を超えた場合に、被験者がＭＣＩを有すると判定することができる。あるいは、調べたＣｐＧサイトのうちの一定割合以上でＤＮＡメチル化率が診断閾値を超えた場合に、被験者がＭＣＩを有すると判定することができる。あるいは、一定数以上のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率が診断閾値を超えた場合に、被験者がＭＣＩを有すると判定することができる。一方、これらの基準を満たさなかった被験者は、ＭＣＩを有さないと判定され得る。
【0051】
第三の実施形態においては、前記検出は、ＭＣＩ患者から採取された生体試料について測定された標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率と、健常者及び／又はＡＤ患者から採取された生体試料由来の標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率の測定値を利用して、ＭＣＩ患者を見出す判別式（予測モデル）を構築し、該判別式を利用することにより行われる。判別式は、例えば、後述する実施例に示すとおり、標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率の実測値をもとにして、ロジスティック回帰モデルを計算することで構築される。
そして、被験者から採取された生体試料について標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を同様に測定し、得られたＤＮＡメチル化率の値を判別式に代入してスコア化し、該スコアをカットオフ値（参照値）と比較することによって、被検者におけるＭＣＩの有無を評価できる。
前記第三の実施形態においては、被験者由来の生体試料について、該判別式により算出される値がカットオフ値以上である場合、診断閾値を超えたと判断され、該被験者はＭＣＩを有すると判定される。一方、値が該カットオフ値未満であれば、該被験者はＭＣＩを有さないと判定される。
そして、被験者から採取された生体試料について標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を同様に測定し、得られたＤＮＡメチル化率の値を判別式に代入してスコア化し、該スコアをカットオフ値（参照値）と比較することによって、被検者におけるＭＣＩの有無を評価できる。
前記第三の実施形態においては、被験者由来の生体試料について、該判別式により算出される値がカットオフ値以上である場合、診断閾値を超えたと判断され、該被験者はＭＣＩを有すると判定される。一方、値が該カットオフ値未満であれば、該被験者はＭＣＩを有さないと判定される。
【0052】
カットオフ値（参照値）の決定方法は特に制限されず、公知の手法に従って決定することができる。例えば、判別式を使用して作成されたＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｃｕｒｖｅ）曲線より求めることができる。ＲＯＣ曲線では、縦軸に陽性患者において陽性の結果がでる確率（感度）と、横軸に陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率）がプロットされる。ＲＯＣ曲線に示される「真陽性（感度）」及び「偽陽性（１－特異度）」に関し、「真陽性（感度）」－「偽陽性（１－特異度）」が最大となる値（Ｙｏｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘ）をカットオフ値（参照値）とすることができる。
【0053】
後述する実施例では、表２に示す標的ＣｐＧサイトについて、下記式（２）のＭＣＩを検出するための判別式（予測モデル）が構築された。
【0054】
【数2】
【0055】
式（２）中、αはインターセプト（切片）を、β１～βｋは各標的ＣｐＧサイトの係数を、ｘ１～ｘｋは各標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を、ｋは標的ＣｐＧサイト数を示す。式（２）では、インターセプト（α）に、それぞれの標的ＣｐＧサイトについて係数（β１～βｋ）とＤＮＡメチル化率（ｘ１～ｘｋ）をかけたものを足し合わせ、ＭＣＩスコア（ｌｉｎｅａｒ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）を算出する。ここで、ＤＮＡメチル化率の値としては、完全メチル化を１、完全非メチル化を０とした割合が挙げられ、いわゆるβ値であってもよい。表２に示す標的ＣｐＧサイト（１）～（２０）の２０個のＣｐＧサイトを利用する場合の判別式におけるαは－５３３．１７２２であり、係数を表４に示す。また、標的ＣｐＧサイト（１）～（３４）の３４個のＣｐＧサイトを利用する場合の判別式におけるαは－５８５．９３４５であり、係数を表５に示す。
式（２）で算出されるＭＣＩスコアは、被験者がＭＣＩを有するか否かを評価するための指標で、カットオフ値は０であり、算出したＭＣＩスコアの値が０以上であれば、被験者はＭＣＩを有すると判定され、一方、算出した値が負の値であれば、被験者はＭＣＩを有さないと判定される。
式（２）で算出されるＭＣＩスコアは、被験者がＭＣＩを有するか否かを評価するための指標で、カットオフ値は０であり、算出したＭＣＩスコアの値が０以上であれば、被験者はＭＣＩを有すると判定され、一方、算出した値が負の値であれば、被験者はＭＣＩを有さないと判定される。
【0056】
【表4】
【0057】
【表5】
【0058】
このように、本発明によれば、被験者におけるＭＣＩの有無を判定することができる。本発明の方法によりＭＣＩ患者を早期に発見することができれば、早期介入を行うことで、認知機能の改善、認知症発症の回避や遅延、ＱＯＬの改善等に貢献することができる。
したがって、本発明はまた、前記本発明の方法によりＭＣＩを有すると判定された被験者に早期介入することに関する。この本発明の態様は、ＭＣＩを有する被験者における認知機能の改善、認知症の予防、早期診断、又は早期治療を可能にする。
さらに本発明は、前記本発明の方法によりＭＣＩを有すると判定された被験者を治療することを含む、ＭＣＩの治療方法を提供する。この本発明の態様は、ＭＣＩを有する被験者に対してより早期に適切な治療を施すことを可能にする。治療の手段としては、運動療法、食事療法、認知機能トレーニング、化学療法等が挙げられるが、特に限定されない。
したがって、本発明はまた、前記本発明の方法によりＭＣＩを有すると判定された被験者に早期介入することに関する。この本発明の態様は、ＭＣＩを有する被験者における認知機能の改善、認知症の予防、早期診断、又は早期治療を可能にする。
さらに本発明は、前記本発明の方法によりＭＣＩを有すると判定された被験者を治療することを含む、ＭＣＩの治療方法を提供する。この本発明の態様は、ＭＣＩを有する被験者に対してより早期に適切な治療を施すことを可能にする。治療の手段としては、運動療法、食事療法、認知機能トレーニング、化学療法等が挙げられるが、特に限定されない。
【0059】
さらに本発明は、ＭＣＩの検出のためのプライマー又はプローブを提供する。該プライマー又はプローブは、少なくとも１０塩基の鎖長を有し、かつバイサルファイト処理された後の標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ領域、該標的ＣｐＧサイトの上流のＤＮＡ領域、又は該標的ＣｐＧサイトの下流のＤＮＡ領域にハイブリダイズする。
【0060】
本発明のプライマー又はプローブの一例は、表３に示すいずれかのＤＮＡ領域（例えば、配列番号１～３４のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列からなるＤＮＡ領域）若しくは配列番号３５若しくは３６のヌクレオチド配列若しくはその相補配列からなるＤＮＡ領域に含まれる標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ領域、該標的ＣｐＧサイトの上流のＤＮＡ領域、又は該標的ＣｐＧサイトの下流のＤＮＡ領域にハイブリダイズするプライマー又はプローブである。
【0061】
本発明のプライマー又はプローブの好ましい一例は、配列番号１～３６のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列からなるプライマー又はプローブである。本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、配列番号１～３６のいずれかのヌクレオチド配列又はその相補配列と９５％以上の同一性を有し、かつ当該配列がハイブリダイズするＣｐＧサイトと同じＣｐＧサイトにハイブリダイズするプライマー又はプローブである。また、これらのプライマー又はプローブがハイブリダイズするＣｐＧサイトと同じＣｐＧサイトにハイブリダイズする該プライマー又はプローブの断片も、本発明のプライマー又はプローブとして使用することができる。
【0062】
本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ断片（例えば、配列番号１～３６のいずれかのヌクレオチド配列を含む断片又はその相補鎖）にハイブリダイズし、かつその３’末端にメチル化シトシン又は非メチル化シトシンに相補的な塩基を有するように構築されたプローブである（例えば前述したマイクロアレイ法に用いることができるプローブ）。本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ断片（例えば、配列番号１～３６のいずれかのヌクレオチド配列を含む断片又はその相補鎖）にハイブリダイズし、かつその３’末端に前記標記ＣｐＧサイトのグアニンに相補的な塩基を有するように構築されたプローブである（例えば前述したマイクロアレイ法に用いることができるプローブ）。
【0063】
本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記標的ＣｐＧサイトの塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行うことができるプライマー（シークエンシングプライマー）である（例えば前述したパイロシークエンス法に用いることができるプライマー）。
【0064】
本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ断片（例えば、配列番号１～３６のいずれかのヌクレオチド配列を含む断片又はその相補鎖）における、メチル化された又はメチル化されていない該標的ＣｐＧサイトを含む領域を特異的に増幅可能なプライマーセットである（例えば前述したＭＳＰ法、定量的ＭＳＰ法又はＣＯＢＲＡ法におけるＰＣＲ増幅に用いることができるプライマーセット）。
【0065】
本発明のプライマー又はプローブの別の好ましい一例は、バイサルファイト処理された前記標的ＣｐＧサイトを含むＤＮＡ断片（例えば、配列番号１～３６のいずれかのヌクレオチド配列を含む断片又はその相補鎖）に該ＣｐＧサイトがメチル化されている場合又はメチル化されていない場合に特異的にハイブリダイズし、かつレポーター蛍光色素及びクエンチャーが標識されたプローブである（例えば前述した定量的ＭＳＰ法に用いることができるプローブ）。
【0066】
本発明のプライマー又はプローブの鎖長は、少なくとも１０塩基であればよいが、好ましくは少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基、さらに好ましくは１５～２００塩基である。プローブの場合、好ましい鎖長は１００～２００塩基、より好ましくは１００～１５０塩基である。ＰＣＲプライマーの場合、好ましい鎖長は１０～６０塩基、より好ましくは１５～４０塩基である。また、本発明のプライマー又はプローブは、標識（例えば蛍光標識）されていてもよい。また、本発明のプライマー又はプローブは、好ましくは、マイクロアレイ法、パイロシークエンス法、バイサルファイトシークエンス法、ＭＳＰ法、定量的ＭＳＰ法、及びＣＯＢＲＡ法のいずれかに用いることができるプライマー又はプローブであり、より好ましくは、パイロシークエンス法、バイサルファイトシークエンス法、又は定量的ＭＳＰ法に用いることができるプライマー又はプローブである。
【0067】
さらに、本発明は、前記本発明のプライマー又はプローブを含む、ＭＣＩの検出のためのキットを提供する。好ましくは、本発明のキットは、マイクロアレイ法、パイロシークエンス法、バイサルファイトシークエンス法、ＭＳＰ法、定量的ＭＳＰ法、及びＣＯＢＲＡ法のいずれかによる、より好ましくは、パイロシークエンス法、バイサルファイトシークエンス法、又は定量的ＭＳＰ法による、ＭＣＩの検出のために用いられる。
【0068】
本発明のキットは、前記本発明のプライマー又はプローブ以外の成分を含むことができる。このような成分の例としては、バイサルファイト処理に必要な試薬（例えば、亜硫酸水素ナトリウム溶液等）、ＰＣＲ反応に必要な試薬（例えば、デオキシリボヌクレオチドや耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等）、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ａｓｓａｙに必要な試薬（例えば、蛍光物質にて標識されたヌクレオチド）、パイロシークエンス法に必要な試薬（例えば、ピロリン酸の検出のためのＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン－５’－ホスホ硫酸、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、一本鎖ＤＮＡを分離するためのストレプトアビジン等）、標識の検出に必要な試薬（例えば、基質や酵素、陽性対照や陰性対照サンプル）、ＣＯＢＲＡ法に必要な試薬（例えば、制限酵素等）、試料（組織由来のゲノムＤＮＡ等）の希釈や洗浄に用いる緩衝液等等が挙げられるが、これらに限定されない。また、該キットには、その使用説明書を含めることができる。
【実施例0069】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0070】
実施例１ ＭＣＩを検出可能なＤＮＡメチル化マーカーの同定
（１）サンプル
順天堂大学ＤＮＡバンクに保存された健常者（ＨＣ）群２４検体、軽度認知障害患者（ＭＣＩ）群８検体、及びアルツハイマー病患者（ＡＤ）群１４検体の全血サンプルを用いた。各検体の詳細を表６に示す。認知機能検査の１種であるＭｉｎｉ－Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ（ＭＭＳＥ）のスコアは、ＭＣＩ群で２０≦ＭＭＳＥ≦２３であり、ＡＤ群でＭＭＳＥ≦１９であった。ＨＣ群、ＭＣＩ群、及びＡＤ群は、男女比率及び年齢分布がほぼ等しくなるようにした。なお、若年性ＡＤ病及び強い家族性ＡＤ病の患者は除外した。
各全血サンプルより、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを調製した。
（１）サンプル
順天堂大学ＤＮＡバンクに保存された健常者（ＨＣ）群２４検体、軽度認知障害患者（ＭＣＩ）群８検体、及びアルツハイマー病患者（ＡＤ）群１４検体の全血サンプルを用いた。各検体の詳細を表６に示す。認知機能検査の１種であるＭｉｎｉ－Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ（ＭＭＳＥ）のスコアは、ＭＣＩ群で２０≦ＭＭＳＥ≦２３であり、ＡＤ群でＭＭＳＥ≦１９であった。ＨＣ群、ＭＣＩ群、及びＡＤ群は、男女比率及び年齢分布がほぼ等しくなるようにした。なお、若年性ＡＤ病及び強い家族性ＡＤ病の患者は除外した。
各全血サンプルより、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを調製した。
【0071】
【表6】
【0072】
（２）ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率の測定
得られたゲノムＤＮＡを亜硫酸ナトリウムで１６時間処理後、スルホン化した。バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅した。これにより、メチル化されていないシトシン（Ｃ）はウラシル（Ｕ）に変換され、ＰＣＲ増幅を介してＴと認識される。この工程はＥＺ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ社製、Ｃａｔ＃Ｄ５００１／Ｄ５００２）を用いて行い、プロトコールに記載されているＡｐｐｅｎｄｉｘに従いＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標） Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ用の条件で処理を行った。
ＤＮＡメチル化測定用ビーズアレイ（Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標） ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用い、約８５万箇所のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化率を測定した。具体的には、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、上記アレイ上のプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたＤＮＡに対し、１塩基伸長反応により蛍光標識した塩基を取り込ませ、各ＣｐＧサイトのメチル化又は非メチル化に応じた蛍光標識を行った。その後、ｉＳｃａｎ Ｒｅａｄｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて蛍光シグナルを測定し、得られたデータを、Ｒ ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ＣｈＡＭＰ（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ChAMP.html）を用いて解析した。各ＣｐＧサイトについて、メチル化検出用プローブ及び非メチル化検出用プローブからのシグナルの合計に対する、メチル化検出用プローブからの蛍光シグナルの相対比を算出した。各ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率は、いわゆるβ値として算出される。β値は、０（完全に非メチル化）～１（完全にメチル化）で表される。ＣｈＡＭＰを用いて正規化を行ったβ値を以下の試験に用いた。
得られたゲノムＤＮＡを亜硫酸ナトリウムで１６時間処理後、スルホン化した。バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅した。これにより、メチル化されていないシトシン（Ｃ）はウラシル（Ｕ）に変換され、ＰＣＲ増幅を介してＴと認識される。この工程はＥＺ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ社製、Ｃａｔ＃Ｄ５００１／Ｄ５００２）を用いて行い、プロトコールに記載されているＡｐｐｅｎｄｉｘに従いＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標） Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ用の条件で処理を行った。
ＤＮＡメチル化測定用ビーズアレイ（Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標） ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ ＢｅａｄＣｈｉｐ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用い、約８５万箇所のＣｐＧサイトにおけるＤＮＡメチル化率を測定した。具体的には、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を、上記アレイ上のプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたＤＮＡに対し、１塩基伸長反応により蛍光標識した塩基を取り込ませ、各ＣｐＧサイトのメチル化又は非メチル化に応じた蛍光標識を行った。その後、ｉＳｃａｎ Ｒｅａｄｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて蛍光シグナルを測定し、得られたデータを、Ｒ ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ＣｈＡＭＰ（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ChAMP.html）を用いて解析した。各ＣｐＧサイトについて、メチル化検出用プローブ及び非メチル化検出用プローブからのシグナルの合計に対する、メチル化検出用プローブからの蛍光シグナルの相対比を算出した。各ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率は、いわゆるβ値として算出される。β値は、０（完全に非メチル化）～１（完全にメチル化）で表される。ＣｈＡＭＰを用いて正規化を行ったβ値を以下の試験に用いた。
【0073】
（３）群間でＤＮＡメチル化率の異なるＣｐＧサイトの抽出
（２）で得られた各ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル率のデータについて、ロジスティック回帰解析を行い、ｐ＜０．０５を有意として、（ｉ）ＨＣ群－ＭＣＩ群、及び（ｉｉ）ＭＣＩ群－ＡＤ群の間でＤＮＡメチル化率が有意に異なるＣｐＧサイトを抽出した。その結果、（ｉ）及び（ｉｉ）の比較のそれぞれでＨＣ群及びＡＤ群に比較してＭＣＩ群で有意にＤＮＡメチル化率が高いＣｐＧサイトが２２１９個見出された。
（２）で得られた各ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル率のデータについて、ロジスティック回帰解析を行い、ｐ＜０．０５を有意として、（ｉ）ＨＣ群－ＭＣＩ群、及び（ｉｉ）ＭＣＩ群－ＡＤ群の間でＤＮＡメチル化率が有意に異なるＣｐＧサイトを抽出した。その結果、（ｉ）及び（ｉｉ）の比較のそれぞれでＨＣ群及びＡＤ群に比較してＭＣＩ群で有意にＤＮＡメチル化率が高いＣｐＧサイトが２２１９個見出された。
【0074】
（４）血液細胞比率のＤＮＡメチル化への影響の確認
（３）で得られた２２１９ＣｐＧサイトについて、ＤＮＡメチル化率への血液細胞比率の影響を確認した。具体的には、血液細胞種間のメチル化の比較をＥＷＡＳ Ａｔｌａｓ（https://bigd.big.ac.cn/ewas）のデータベースに格納された２５血液細胞種のＤＮＡメチル化アレイＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０Ｋ（ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣと同様のプラットフォームで約半数の共通ＣｐＧプローブを持つ）のＤＮＡメチル化データを使って行った。２５細胞種の各ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率平均値との比較を行ったところ、比較可能であった１４１０ＣｐＧサイトは、多くの細胞種で全血の場合と同様のパターンを示したが、唯一ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞は６１３ＣｐＧサイトで高メチル化であった（ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞で５０％以上、ＷＢＣで２０％以下）。７９７ＣｐＧサイトはｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞と全血の間に差異がなかった。
（３）で得られた２２１９ＣｐＧサイトについて、ＤＮＡメチル化率への血液細胞比率の影響を確認した。具体的には、血液細胞種間のメチル化の比較をＥＷＡＳ Ａｔｌａｓ（https://bigd.big.ac.cn/ewas）のデータベースに格納された２５血液細胞種のＤＮＡメチル化アレイＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０Ｋ（ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣと同様のプラットフォームで約半数の共通ＣｐＧプローブを持つ）のＤＮＡメチル化データを使って行った。２５細胞種の各ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率平均値との比較を行ったところ、比較可能であった１４１０ＣｐＧサイトは、多くの細胞種で全血の場合と同様のパターンを示したが、唯一ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞は６１３ＣｐＧサイトで高メチル化であった（ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞で５０％以上、ＷＢＣで２０％以下）。７９７ＣｐＧサイトはｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞と全血の間に差異がなかった。
【0075】
（５）ＣｐＧサイトの選抜
（３）で得られた２２１９ＣｐＧサイトのうち、ＤＮＡメチル化率の群平均の差分が５％以上（β値において０．０５以上）である３４ＣｐＧサイトを見出した（表７）。これらのＣｐＧサイトが位置する領域は、ＧＲＥＢ１、ＲＵＮＸ１、ＳＦＦ４、ＫＤＭ５Ｂ等の一群の転写因子と関連性が高い領域であった。また、３４ＣｐＧサイトのうち、４ＣｐＧサイトのみがｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞特異的な高メチル化を示すＣｐＧサイトだった（表７中のＣＤ４Ｎａｉｖｅ）。一方、１４ＣｐＧサイトは、ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞と全血の間でメチル化に差異がなかった（表７中のＯｔｈｅｒｓ）。このことから、３４ＣｐＧサイトの選抜は、Ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞特異的なメチル化に基づくものでない可能性が高いことが示唆された。
（３）で得られた２２１９ＣｐＧサイトのうち、ＤＮＡメチル化率の群平均の差分が５％以上（β値において０．０５以上）である３４ＣｐＧサイトを見出した（表７）。これらのＣｐＧサイトが位置する領域は、ＧＲＥＢ１、ＲＵＮＸ１、ＳＦＦ４、ＫＤＭ５Ｂ等の一群の転写因子と関連性が高い領域であった。また、３４ＣｐＧサイトのうち、４ＣｐＧサイトのみがｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞特異的な高メチル化を示すＣｐＧサイトだった（表７中のＣＤ４Ｎａｉｖｅ）。一方、１４ＣｐＧサイトは、ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞と全血の間でメチル化に差異がなかった（表７中のＯｔｈｅｒｓ）。このことから、３４ＣｐＧサイトの選抜は、Ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ細胞特異的なメチル化に基づくものでない可能性が高いことが示唆された。
【0076】
【表7】
【0077】
実施例２ ＭＣＩ検出用判別式の構築
実施例１の（５）で得た３４ＣｐＧサイトより２０個又は３４個のＣｐＧサイトを選択し、各ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率の実測データ（完全メチル化を１、完全非メチル化を０とした割合）をもとにして、ロジスティック回帰モデルを計算し、下記式（２）のＭＣＩを検出するための判別式（予測モデル）を構築した。
実施例１の（５）で得た３４ＣｐＧサイトより２０個又は３４個のＣｐＧサイトを選択し、各ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率の実測データ（完全メチル化を１、完全非メチル化を０とした割合）をもとにして、ロジスティック回帰モデルを計算し、下記式（２）のＭＣＩを検出するための判別式（予測モデル）を構築した。
【0078】
【数3】
【0079】
式（２）中、αはインターセプト（切片）を、β１～βｋは各標的ＣｐＧサイトの係数を、ｘ１～ｘｋは各標的ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を、ｋは標的ＣｐＧサイト数を示す。式（２）では、インターセプト（α）に、それぞれのＣｐＧサイトについて係数（β１～βｋ）とＤＮＡメチル化率（ｘ１～ｘｋ）をかけたものを足し合わせ、ＭＣＩスコア（ｌｉｎｅａｒ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）を算出する。表７に示す標的ＣｐＧサイト（１）～（２０）の２０個のＣｐＧサイトを利用する場合の判別式におけるαは－５３３．１７２２であり、係数を表８に示す。また、標的ＣｐＧサイト（１）～（３４）の３４個のＣｐＧサイトを利用する場合の判別式におけるαは－５８５．９３４５であり、係数を表９に示す。ＭＣＩスコアのカットオフ値は０であり、算出したＭＣＩスコアの値が０以上であれば、被験者はＭＣＩを有すると判定され、一方、算出した値が負の数であれば、被験者はＭＣＩを有さないと判定される。
【0080】
【表8】
【0081】
【表9】
【0082】
標的ＣｐＧサイト（１）～（２０）の２０個のＣｐＧサイトを利用する判別式を用いた場合の各群のＭＣＩスコアを図１に示す。ウィルコクソンの順位和検定を行ったところ、ＨＣ群ｖｓＭＣＩ群でｐ－ｖａｌｕｅ＝１．９０１ｅ－０７、ＡＤ群ｖｓＭＣＩ群で、ｐ－ｖａｌｕｅ＝６．２５４ｅ－０６であった。また、標的ＣｐＧサイト（１）～（３４）の３４個のＣｐＧサイトを利用する判別式を用いた場合の各群のＭＣＩスコアを図２に示す。ウィルコクソンの順位和検定を行ったところ、ＨＣ群ｖｓＭＣＩ群でｐ－ｖａｌｕｅ＝１．９０１ｅ－０７、ＡＤ群ｖｓＭＣＩ群で、ｐ－ｖａｌｕｅ＝６．２５４ｅ－０６であった。複数のＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化率を用いたかかる判別式により、被験者がＭＣＩを有しているか否かを精度よく検出することができる。
【図1】
【図2】
【配列表】