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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022089660
(43)【公開日】2022-06-16
(54)【発明の名称】遺伝子スイッチ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20220609BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20220609BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C07K14/195
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020202234
(22)【出願日】2020-12-04
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （刊行物等１）令和１年１２月７日に日本農芸化学会関西支部 支部例会（第５１１回講演会）にて発表した内容（冨永）の写し （刊行物等２）令和１年１２月７日ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｋａｎｓａｉ．ｊｓｂｂａ．ｏｒ．ｊｐ／ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ／２０１９％Ｅ５％Ｂ９％Ｂ４％Ｅ５％ＢＡ％Ａ６％Ｅ６％９４％ＡＦ％Ｅ９％８３％Ａ８％Ｅ８％ＡＣ％９Ｂ％Ｅ６％ＢＣ％９４％Ｅ４％ＢＣ％９Ａ－ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ／％Ｅ９％９６％Ａ２％Ｅ８％Ａ５％ＢＦ％Ｅ６％９４％ＡＦ％Ｅ９％８３％Ａ８％Ｅ４％ＢＥ％８Ｂ％Ｅ４％ＢＣ％９Ａ％ＥＦ％ＢＣ％８８％Ｅ７％ＡＣ％ＡＣ５１１％Ｅ５％９Ｂ％９Ｅ％Ｅ８％ＡＣ％９Ｂ％Ｅ６％ＢＣ％９４％Ｅ４％ＢＣ％９Ａ％ＥＦ％ＢＣ％８９．ｈｔｍｌにて公開した日本農芸化学会関西支部 支部例会（第５１１回講演会）の講演予稿集の該当部分（冨永）の写し （刊行物等３）令和１年１２月７日に日本農芸化学会関西支部 支部例会（第５１１回講演会）にて発表した内容（能崎）の写し （刊行物等４）令和１年１２月７日ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｋａｎｓａｉ．ｊｓｂｂａ．ｏｒ．ｊｐ／ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ／２０１９％Ｅ５％Ｂ９％Ｂ４％Ｅ５％ＢＡ％Ａ６％Ｅ６％９４％ＡＦ％Ｅ９％８３％Ａ８％Ｅ８％ＡＣ％９Ｂ％Ｅ６％ＢＣ％９４％Ｅ４％ＢＣ％９Ａ－ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ／％Ｅ９％９６％Ａ２％Ｅ８％Ａ５％ＢＦ％Ｅ６％９４％ＡＦ％Ｅ９％８３％Ａ８％Ｅ４％ＢＥ％８Ｂ％Ｅ４％ＢＣ％９Ａ％ＥＦ％ＢＣ％８８％Ｅ７％ＡＣ％ＡＣ５１１％Ｅ５％９Ｂ％９Ｅ％Ｅ８％ＡＣ％９Ｂ％Ｅ６％ＢＣ％９４％Ｅ４％ＢＣ％９Ａ％ＥＦ％ＢＣ％８９．ｈｔｍｌにて公開した日本農芸化学会関西支部 支部例会（第５１１回講演会）の講演予稿集の該当部分（能崎）の写し
(71)【出願人】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100118371
【弁理士】
【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】冨永 将大
(72)【発明者】
【氏名】石井 純
(72)【発明者】
【氏名】能崎 健太
(72)【発明者】
【氏名】近藤 昭彦
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】 高機能化した遺伝子スイッチ・センサの変異配列を提供すること。
【解決手段】 生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、組成物。
【選択図】 なし
【解決手段】 生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、組成物。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、組成物。
【請求項2】
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｋ８６Ｔ、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ｇ、Ｅ１４３Ｋ、Ｆ１０９Ｌ、Ｋ２０Ｒ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記遺伝子スイッチが、核移行シグナルの機能が破壊される変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記核移行シグナルの機能が破壊される変異が、核移行シグナルのフレームシフト変異を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＲＫＥＲＳＫＩへの変異を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｋ８Ｎの変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
配列番号５で表される塩基配列またはその改変体の１３位、１６位、３４９位～３５１位、３４９位～３５１位、２５６位、２５７位、４２７位、３２５位、５９位、２０９位、および５５９位から選択される１または複数の塩基が変異されている、核酸分子。
【請求項12】
配列番号５で表される塩基配列またはその改変体において、Ｃ１３Ｔ、Ｔ１６Ｃ、Ａ３５０Ｇ、３５０位および３５１位のＡＡのＣＧへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＡＴＴへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＧＧＴへの変異、Ａ２５７Ｃ、２５６位および２５７位のＡＡのＧＣへの変異、２５６位および２５７位のＡＡのＴＣへの変異、２５６位および２５７位のＡＡのＧＧへの変異、Ｇ４２７Ａ、Ｔ３２５Ｃ、Ａ５９Ｇ、Ａ２０９Ｇ、およびＡ５５９Ｇから選択される１または複数の変異を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項13】
配列番号５で表される塩基配列またはその改変体において、Ａ３５０Ｇ、３５０位および３５１位のＡＡのＣＧへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＡＴＴへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＧＧＴへの変異、Ａ２０９Ｇ、およびＡ５５９Ｇから選択される１または複数の変異を含む、請求項１１または１２に記載の核酸分子。
【請求項14】
前記核酸分子がコードするポリペプチドが、生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドとして機能する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、人工転写因子の変異配列、またそれを利用した遺伝子スイッチに関する。より詳しくは、本開示は、従来の初期型の遺伝子スイッチ・センサの性能を劇的に高めることができる効率的な選択手法よって得られた遺伝子スイッチに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、代謝物などの化合物に応答する遺伝子スイッチ・センサ（メタボライトセンサ）が注目を集めており、特に大腸菌などのバクテリアを中心にその開発が進められている。しかし、真核生物である酵母では、バクテリアに比べて転写制御領域が長く、その機能領域が曖昧なため、高性能な遺伝子スイッチ・センサを開発することが困難である。
【0003】
ところで、遺伝子スイッチ・センサの開発においては、変異体において、遺伝子発現がＯＮであるべき条件下で起動状態にあるもの、および／またはＯＦＦであるべき条件下で抑制状態にあるものをその遺伝子発現量に対して選抜（ＯＮ選抜／ＯＦＦ選抜）することが必須であるが、この２つの状態ともに適切な条件で選抜を実施することが重要となる。従来のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ－ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇでは、選抜条件を変えることはできるものの、一度に一つの条件しか検討することができない。また、薬剤を用いた選抜技術では、選抜条件を変えること自体が困難である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明者らは、人工転写因子の変異体を取得し、有用な変異を同定した。本開示は、そのような変異体および／または遺伝子スイッチを提供する。
【0005】
したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、組成物。
（項目２Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、５位、６位、２０位、７０位、８６位、１０９位、１１７位、１４３位、及び１８７位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目に記載の組成物。
（項目２）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｋ８６Ｔ、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ｇ、Ｅ１４３Ｋ、Ｆ１０９Ｌ、Ｋ２０Ｒ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目に記載の組成物。
（項目２Ｂ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）反転
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、核移行シグナルの機能が破壊される変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記核移行シグナルの機能が破壊される変異が、核移行シグナルのフレームシフト変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５Ａ）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶにおける変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＲＫＥＲＳＫＩへの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６Ａ）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１１６位、２０１位、１４０位、及び３３位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７Ａ）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、４０位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８Ａ）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、８位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｋ８Ｎの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１５７位および４１位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）変異箇所
配列番号５で表される塩基配列またはその改変体の１３位、１６位、３４９位～３５１位、３４９位～３５１位、２５６位、２５７位、４２７位、３２５位、５９位、２０９位、および５５９位から選択される１または複数の塩基が変異されている、核酸分子。
（項目１１）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）具体的な変異
配列番号５で表される塩基配列またはその改変体において、Ｃ１３Ｔ、Ｔ１６Ｃ、Ａ３５０Ｇ、３５０位および３５１位のＡＡのＣＧへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＡＴＴへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＧＧＴへの変異、Ａ２５７Ｃ、２５６位および２５７位のＡＡのＧＣへの変異、２５６位および２５７位のＡＡのＴＣへの変異、２５６位および２５７位のＡＡのＧＧへの変異、Ｇ４２７Ａ、Ｔ３２５Ｃ、Ａ５９Ｇ、Ａ２０９Ｇ、およびＡ５５９Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目に記載の核酸分子。
（項目１２）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）反転変異
配列番号５で表される塩基配列またはその改変体において、Ａ３５０Ｇ、３５０位および３５１位のＡＡのＣＧへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＡＴＴへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＧＧＴへの変異、Ａ２０９Ｇ、およびＡ５５９Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１３）
前記核酸分子がコードするポリペプチドが、生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドとして機能する、上記項目のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目Ａ１）
生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のために使用されるポリペプチドであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、ポリペプチド。
（項目Ａ２Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、５位、６位、２０位、７０位、８６位、１０９位、１１７位、１４３位、及び１８７位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目に記載のポリペプチド。
（項目Ａ２）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、Ｋ２０Ｒ、Ｅ７０Ｇ、Ｋ８６Ｔ、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ｇ、Ｆ１０９Ｌ、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｅ１４３Ｋ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目に記載のポリペプチド。
（項目Ａ２Ｂ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）反転
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ３）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、核移行シグナルの機能が破壊される変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ４）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記核移行シグナルの機能が破壊される変異が、核移行シグナルのフレームシフト変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ５Ａ）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶにおけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ５）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＲＫＥＲＳＫＩへの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ６Ａ）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１１６位、２０１位、１４０位、及び３３位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ６）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ７Ａ）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、４０位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ７）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ８Ａ）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、８位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ８）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｋ８Ｎの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ９Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１５７位および４１位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ９）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ｂ１）
生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のための組成物を製造するためのポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、使用。
（項目Ｂ２Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、５位、６位、２０位、７０位、８６位、１０９位、１１７位、１４３位、及び１８７位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目に記載の使用。
（項目Ｂ２）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｋ８６Ｔ、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ｇ、Ｅ１４３Ｋ、Ｆ１０９Ｌ、Ｋ２０Ｒ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目に記載の使用。
（項目Ｂ２Ｂ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）反転
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ３）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、核移行シグナルの機能が破壊される変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ４）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記核移行シグナルの機能が破壊される変異が、核移行シグナルのフレームシフト変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ５Ａ）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶにおける変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ５）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＲＫＥＲＳＫＩへの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ６Ａ）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１１６位、２０１位、１４０位、及び３３位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ６）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ７Ａ）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、４０位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ７）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ８Ａ）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、８位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ８）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｋ８Ｎの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ９Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１５７位および４１位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ９）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｃ１）
生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドを含む組成物を用いて、生物における目的遺伝子の発現を誘導性制御する方法であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、方法。
（項目Ｃ２Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、５位、６位、２０位、７０位、８６位、１０９位、１１７位、１４３位、及び１８７位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ２）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｋ８６Ｔ、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ｇ、Ｅ１４３Ｋ、Ｆ１０９Ｌ、Ｋ２０Ｒ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ２Ｂ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）反転
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ３）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、核移行シグナルの機能が破壊される変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ４）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記核移行シグナルの機能が破壊される変異が、核移行シグナルのフレームシフト変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ５Ａ）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶにおけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ５）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＲＫＥＲＳＫＩへの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ６Ａ）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１１６位、２０１位、１４０位、及び３３位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ６）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ７Ａ）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、４０位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ７）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ８Ａ）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、８位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ８）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｋ８Ｎの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ９Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１５７位および４１位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ９）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１）
生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、組成物。
（項目２Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、５位、６位、２０位、７０位、８６位、１０９位、１１７位、１４３位、及び１８７位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目に記載の組成物。
（項目２）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｋ８６Ｔ、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ｇ、Ｅ１４３Ｋ、Ｆ１０９Ｌ、Ｋ２０Ｒ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目に記載の組成物。
（項目２Ｂ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）反転
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、核移行シグナルの機能が破壊される変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記核移行シグナルの機能が破壊される変異が、核移行シグナルのフレームシフト変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５Ａ）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶにおける変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＲＫＥＲＳＫＩへの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６Ａ）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１１６位、２０１位、１４０位、及び３３位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７Ａ）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、４０位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８Ａ）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、８位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｋ８Ｎの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１５７位および４１位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）変異箇所
配列番号５で表される塩基配列またはその改変体の１３位、１６位、３４９位～３５１位、３４９位～３５１位、２５６位、２５７位、４２７位、３２５位、５９位、２０９位、および５５９位から選択される１または複数の塩基が変異されている、核酸分子。
（項目１１）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）具体的な変異
配列番号５で表される塩基配列またはその改変体において、Ｃ１３Ｔ、Ｔ１６Ｃ、Ａ３５０Ｇ、３５０位および３５１位のＡＡのＣＧへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＡＴＴへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＧＧＴへの変異、Ａ２５７Ｃ、２５６位および２５７位のＡＡのＧＣへの変異、２５６位および２５７位のＡＡのＴＣへの変異、２５６位および２５７位のＡＡのＧＧへの変異、Ｇ４２７Ａ、Ｔ３２５Ｃ、Ａ５９Ｇ、Ａ２０９Ｇ、およびＡ５５９Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目に記載の核酸分子。
（項目１２）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）反転変異
配列番号５で表される塩基配列またはその改変体において、Ａ３５０Ｇ、３５０位および３５１位のＡＡのＣＧへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＡＴＴへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＧＧＴへの変異、Ａ２０９Ｇ、およびＡ５５９Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１３）
前記核酸分子がコードするポリペプチドが、生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドとして機能する、上記項目のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目Ａ１）
生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のために使用されるポリペプチドであって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、ポリペプチド。
（項目Ａ２Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、５位、６位、２０位、７０位、８６位、１０９位、１１７位、１４３位、及び１８７位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目に記載のポリペプチド。
（項目Ａ２）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、Ｋ２０Ｒ、Ｅ７０Ｇ、Ｋ８６Ｔ、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ｇ、Ｆ１０９Ｌ、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｅ１４３Ｋ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目に記載のポリペプチド。
（項目Ａ２Ｂ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）反転
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ３）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、核移行シグナルの機能が破壊される変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ４）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記核移行シグナルの機能が破壊される変異が、核移行シグナルのフレームシフト変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ５Ａ）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶにおけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ５）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＲＫＥＲＳＫＩへの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ６Ａ）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１１６位、２０１位、１４０位、及び３３位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ６）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ７Ａ）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、４０位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ７）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ８Ａ）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、８位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ８）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｋ８Ｎの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ９Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１５７位および４１位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ａ９）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目Ｂ１）
生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のための組成物を製造するためのポリペプチドの使用であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、使用。
（項目Ｂ２Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、５位、６位、２０位、７０位、８６位、１０９位、１１７位、１４３位、及び１８７位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目に記載の使用。
（項目Ｂ２）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｋ８６Ｔ、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ｇ、Ｅ１４３Ｋ、Ｆ１０９Ｌ、Ｋ２０Ｒ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目に記載の使用。
（項目Ｂ２Ｂ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）反転
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ３）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、核移行シグナルの機能が破壊される変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ４）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記核移行シグナルの機能が破壊される変異が、核移行シグナルのフレームシフト変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ５Ａ）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶにおける変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ５）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＲＫＥＲＳＫＩへの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ６Ａ）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１１６位、２０１位、１４０位、及び３３位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ６）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ７Ａ）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、４０位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ７）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ８Ａ）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、８位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ８）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｋ８Ｎの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ９Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１５７位および４１位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｂ９）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目Ｃ１）
生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドを含む組成物を用いて、生物における目的遺伝子の発現を誘導性制御する方法であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、方法。
（項目Ｃ２Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、５位、６位、２０位、７０位、８６位、１０９位、１１７位、１４３位、及び１８７位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ２）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｋ８６Ｔ、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ｇ、Ｅ１４３Ｋ、Ｆ１０９Ｌ、Ｋ２０Ｒ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ２Ｂ）（ＤＡＰＧ－ＯＮ）反転
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ３）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、核移行シグナルの機能が破壊される変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ４）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
前記核移行シグナルの機能が破壊される変異が、核移行シグナルのフレームシフト変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ５Ａ）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶにおけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ５）（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）
核移行シグナルのフレームシフト変異が、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＲＫＥＲＳＫＩへの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ６Ａ）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１１６位、２０１位、１４０位、及び３３位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ６）（ＨＳＬ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ７Ａ）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、４０位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ７）（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ８Ａ）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、８位におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ８）（Ｔｅｔ－ＯＮ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｋ８Ｎの変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ９Ａ）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１５７位および４１位から選択される１または複数の位置におけるアミノ酸の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ９）（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）
前記遺伝子スイッチが、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
【0006】
本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【0007】
なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【発明の効果】
【0008】
本開示により、高機能化した遺伝子スイッチ・センサの変異配列を提供することができる。転写因子（タンパク質）上における有用な変異は、酵母だけでなく、バクテリアを含む他の生物種でも同様に機能することが期待されるため、重要な成果物である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【0011】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【0012】
本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
【0013】
本明細書において、「遺伝子スイッチ」または「遺伝子スイッチ・センサ」とは、交換可能に使用され、転写調節ドメインを含有する因子（例えば、分子、その複合体、またはそれらの融合物等）であって、対象となる遺伝子を構成する核酸に相互作用（例えば、結合）することにより当該分子を活性化し得る物質(活性化物質)が相互作用（例えば、結合）する部位を有するものをいう。このような因子は、誘導物質の相互作用（例えば、結合や解離）により活性が調節され、その機能を変化させることができる。遺伝子スイッチに活性化物質が相互作用（例えば、結合）することにより、遺伝子スイッチの標的配列へのその相互作用（例えば、結合）の程度または状態が変化し、その結果、目的の遺伝子の発現が抑制または誘導される。例えば、本明細書における「遺伝子スイッチ」は、転写活性化ドメインを含有する分子であって、結合することにより当該分子を活性化し得る物質が結合する部位を有し、該物質の結合により標的配列への結合もしくは解離が生じる分子が例示される。
【0014】
本明細書において、「遺伝子スイッチ発現配列」は、遺伝子スイッチがタンパク質またはポリペプチドの場合、その遺伝子スイッチをコードする核酸配列を意味する。
【0015】
本明細書において、「遺伝子スイッチの活性化物質」は、遺伝子スイッチに相互作用（例えば、結合）することにより遺伝子スイッチを活性化させ、またはその機能を変化させ、その結果、直接的または間接的に、１または複数の遺伝子の発現の調節を誘導する物質をいい、例えばそのような化合物を意味する。活性化物質は、遺伝子スイッチごとに異なるものとすることもできる。遺伝子スイッチと活性化物質との組み合わせとしては、例えば、ｒｔｅｔＴＡとＤｏｘ、ＣａｍＴＡとＤ－Ｃａｍｐｈｏｒ、ＰｈｌＴＡとＤＡＰＧ、ＬｕｘＴＡとＨＳＬなどを挙げることができる。
【0016】
本明細書において、「遺伝子スイッチの標的配列」は、目的のタンパク質をコードする遺伝子の５’上流に位置する核酸配列であって、標的遺伝子の転写を制御する核酸配列をいい、好ましくはプロモータ活性を有し、プロモータ配列や、オペレーター配列とコアプロモータとが融合された人工プロモータであってもよい。好ましくは、エンハンサが、遺伝子スイッチの標的配列に間接的にまたは直接的に作用されることもできる。標的配列への遺伝子スイッチの作用は誘導物質の添加により調節されることができ、それにより標的遺伝子の発現が制御され、標的配列に遺伝子スイッチが作用しないと標的遺伝子は発現しない。例えば、遺伝子スイッチｒｔｅｔＴＡは、その活性化物質Ｄｏｘの添加により、その標的配列ｔｅｔＯプロモータ（ｔｅｔＯを含む人工プロモータ）に作用し、該プロモータの下流に位置する標的遺伝子の転写を促進する。
【0017】
本明細書において、「プロモータ」とは、遺伝子の転写開始を制御し、またその転写の程度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼの結合により転写を開始する核酸配列をいう。プロモータは、使用する宿主細胞の種によって適宜選択して使用されることができる。酵母を宿主として使用する場合、プロモータとして、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、プロモータとして、ＧＡＬ１プロモータ、ＧＡＬ１０プロモータ、ヒートショックタンパク質プロモータ、ＭＦα１プロモータ、ＰＨＯ５プロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＧＡＰプロモータ、ＡＤＨプロモータ、ＴＤＨプロモータ、ＤＡＳ１、およびＡＯＸ１プロモータなどを挙げることができる。
【0018】
本明細書において、「転写調節因子」は、プロモータなどの調節ＤＮＡエレメントに作用して働くタンパク質をいう。転写調節因子は転写抑制因子（リプレッサ）および転写活性化因子（アクチベータ）に大別される。転写抑制因子は調節ＤＮＡエレメントに作用して遺伝子の転写を抑制し、遺伝子の発現量を低減させることができる。転写活性化因子は調節ＤＮＡエレメントに作用して遺伝子の転写を促進し、遺伝子の発現量を増加させることができる。本開示の一実施形態において、転写抑制因子および転写活性化因子は公知の各因子を使用することができる。転写調節因子が作用する調節ＤＮＡエレメントの下流に配置された遺伝子配列は、転写調節因子の作用によりその発現が抑制または促進される。遺伝子の発現とは、遺伝子の情報がｍＲＮＡに転写され、さらに該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列として翻訳される一連の過程を意味する。発現が促進されれば遺伝子によりコードされるタンパク質が産生されてその量が増大し、発現が抑制されれば遺伝子によりコードされるタンパク質は産生されずその量は減少する。
【0019】
本明細書において、「候補転写調節因子」とは、転写調節因子の候補となり得る因子である。
【0020】
本明細書において、「誘導因子」または「誘導剤」とは、転写調節因子と結合することにより、転写調節因子を活性化させ、または不活性化させ、またはその機能を変化させ、その結果、１または複数の遺伝子の直接的または間接的な発現を調節することができる因子をいう。
【0021】
本明細書において、「ＤＮＡライブラリー」とは、天然から単離された核酸配列または合成の核酸配列を含む、核酸ライブラリーである。天然から単離された核酸配列の供給源としては、真核生物細胞、原核生物細胞、またはウイルス由来のゲノム配列やｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。天然から単離された配列に、任意の配列（例えば、シグナル、タグなど）を付加したライブラリーもまた、本開示のＤＮＡライブラリーに含まれる。
【0022】
本明細書において、「宿主細胞」とは、異種（例えば、外因性）核酸またはタンパク質が導入された細胞を指す。宿主細胞には、特定の対象細胞だけでなく、当該細胞の子孫も含むことができる。宿主細胞は原核生物細胞または真核生物細胞を含み、異種の核酸またはタンパク質を受容して産生するために適切な形質を有する任意の細胞である。例えば、原核生物および真核生物の細胞、細菌細胞、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物が含まれる。
【0023】
本明細書において、「発現ベクター」とは、宿主細胞に外部遺伝子を運搬するベクターＤＮＡであって、宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得るＤＮＡをいう。ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択することができる。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡでもよい。代表的なベクターＤＮＡとして、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、およびウイルス由来のベクターＤＮＡを挙げることができる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどを使用することができる。バクテリオファージＤＮＡとしては、λファージなどを挙げることができる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとしては、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなどの動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルス由来のベクターを挙げることができる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡなどを挙げることができる。あるいは、これらを組み合わせて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組み合わせて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミドなど）を挙げることができる。ベクターＤＮＡには、目的遺伝子が発現されるように目的遺伝子を組み込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子と調節ＤＮＡエレメント、例えばプロモータとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組み合わせて公知の手法によりベクターＤＮＡに組み込むことができる。このような遺伝子配列として、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）を挙げることができる。これらから選択した１種類または複数種類の遺伝子配列をベクターＤＮＡに組み込むことができる。
【0024】
本明細書において、「融合遺伝子」とは、人工的にまたは自然に複数の遺伝子が連結されて生じる新たな遺伝子のことをいい、染色体の転座、挿入、逆位などの組換えの結果生じるものも含まれる。また、融合遺伝子は、融合タンパク質をコードしていることもある。融合遺伝子として機能的なタンパク質を生じさせることができるものであれば、融合遺伝子において連結される遺伝子の数は特に限られるものではない。融合遺伝子における各遺伝子の向きも特に限定されず、すべてがフォワード（本来の転写の向き）、すべてがリバース（本来の転写の向きと逆向き）、及びフォワードとリバースとの組み合わせのいずれであってもよい。また融合遺伝子において、各遺伝子はいずれの位置で連結されていてもよい。本明細書における「融合遺伝子」は、異なる遺伝子が連結しているものだけではなく、同一の遺伝子同士が連結しているものも含まれる。
【0025】
本明細書において、「作動可能に連結」とは、核酸にコードされたポリペプチドが、プロモーターなどのエレメントによる制御下に当該ポリペプチドの生物学的活性を示す状態で発現するようにエレメントに連結されていることを意味する。
【0026】
本明細書において、「ランダムな変異」とは、核酸配列において変異がランダムに入っていること、およびそのような変異を指し、変異の数は１個であってもよいし、２個以上であってもよい。ランダムな変異における変異は、人工的に導入されたものであってもよく、または自然に発生した突然変異でもよい。
【0027】
本明細書において、「マーカー遺伝子」とは、細胞内で翻訳されて、マーカーとして機能し、特定の条件を満たした細胞種の判別を可能にする任意のタンパク質をコードする遺伝子をいう。細胞内で翻訳されてマーカーとして機能しうるタンパク質であれば特に限られるものではなく、例えば、蛍光、発光、または呈色を示すもの、あるいは蛍光、発光、または呈色を補助することなどにより、視覚化し、定量化することができるタンパク質が含まれる。蛍光タンパク質としては、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰなどの青色蛍光蛋白質；ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰなどのシアン蛍光タンパク質；ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ（例えば、ｈｍＡＧ１）、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ｍＵｋＧ（Ｕｍｉｋｉｎｏｋｏ Ｇｒｅｅｎ）などの緑色蛍光タンパク質；ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ－ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａなどの黄色蛍光タンパク質；ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ （例えば、ｈｍＫＯ２）、ｍＯｒａｎｇｅなどの橙色蛍光タンパク質；ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、などの赤色蛍光タンパク質；ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ、ＫｅｉｍａＲｅｄ（例えば、ｈｄＫｅｉｍａＲｅｄ）、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍなどの近赤外蛍光タンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。
【0028】
（好ましい実施形態）
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
【0029】
一つの局面において、本開示は、生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、組成物を提供する。このようなポリペプチドまたは組成物は、遺伝子スイッチまたは遺伝子スイッチ分子として機能する。
【0030】
一つの実施形態において、生物は、任意の原核生物または真核生物であり、例えば、動物、植物、菌類、原生生物であり得る。好ましくは真核生物は菌類であり、より好ましくは真核生物は酵母である。本開示において好適な酵母としては、例えば、サッカロミセス属（ＧｅｎｕｓＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ：Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）やメタノール資化性酵母（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉなど）などが挙げられる。
【0031】
一つの実施形態において、遺伝子スイッチ発現配列は任意の配列であり、例えば、遺伝子スイッチがタンパク質またはポリペプチドの場合、その遺伝子スイッチをコードする核酸配列であり得る。遺伝子スイッチ発現配列は、対象となる遺伝子を構成する核酸に相互作用（例えば、結合）することにより当該分子を活性化し得る物質(活性化物質)が相互作用（例えば、結合）する部位を有する転写活性化ドメインを含有する因子である。一実施形態において、遺伝子スイッチ発現配列は、例えば、ＣａｍＴＡ、ＰｈｌＴＡ、ＬｕｘＴＡ、ｒｔｅｔＴＡなどの転写調節因子や、そのような転写調節因子を改変した人工転写調節因子を発現する配列を含むことができる。
【0032】
一つの実施形態において、転写調節因子はプロモータなどの調節ＤＮＡエレメントに作用して働く任意の因子であり、例えば、調節ＤＮＡエレメントに作用して遺伝子の転写を抑制し、遺伝子の発現量を低減させる転写抑制因子（リプレッサ）や、調節ＤＮＡエレメントに作用して遺伝子の転写を促進し、遺伝子の発現量を増加させる転写活性化因子が含まれる。一実施形態において、転写調節因子は、ＣａｍＴＡ、ＰｈｌＴＡ、ＬｕｘＴＡ、ｒｔｅｔＴＡや、そのような転写調節因子を改変した人工転写調節因子を含むことができる。一実施形態において、転写調節因子には、転写活性化ドメイン（ＶＰ１６、４８など）、他の活性化ドメイン配列、転写抑制因子、核移行シグナル（ＮＬＳ）などを融合することができる。
【0033】
一つの実施形態において、誘導因子は転写調節因子と結合することにより、転写調節因子を活性化させ、または不活性化させ、またはその機能を変化させることができる任意の因子である。一実施形態において、誘導因子は、例えば、ＤＡＰＧ、Ｄ－Ｃａｍｐｈｏｒ、ＨＳＬ、Ｄｏｘであり得る。
【0034】
一つの実施形態において、転写調節因子と誘導因子が結合した複合体は、複合体の機能として、１または複数の遺伝子の直接的または間接的な発現を調節することができるものであれば、どのような態様で結合したものであってもよい。
【0035】
一実施形態において、オペレーター配列はプロモーター配列の上流または下流に近接して位置することができ、またオペレーター配列は１つでもよく、またはタンデム化して複数個をつなげることもできる。タンデム化する場合には、例えば、約２個、約３個、約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個などのオペレーター配列をつなげて用いることができる。
【0036】
一つの実施形態において、本開示の組成物に含まれるポリペプチド（遺伝子スイッチ）は、例えば、人工転写活性化ドメイン（ＶＰ１６×３＝ＶＰ４８）や核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む点で共通する構造を含み得る。また他の実施形態において、人工プロモーターは、コアプロモーター（ＧＡＬ１由来）（ピキア酵母を用いる場合にはＡＯＸ１やＤＡＳ１のコアプロモーター）を含む点で共通する構造を含み得る。また一実施形態において、本開示の転写因子（人工転写因子）またはその結合配列（人工プロモーター）として、それぞれ対応するバクテリア由来のリプレッサーとオペレーターを含むことができる。
【0037】
一つの実施形態において、本開示の組成物に含まれるポリペプチド（遺伝子スイッチ）は、（ＤＡＰＧ－ＯＮ）配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、５位、６位、２０位、７０位、８６位、１０９位、１１７位、１４３位、及び１８７位から選択される１または複数の変異を含むもの；（ＨＳＬ－ＯＮ）配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１１６位、２０１位、１４０位、及び３３位から選択される１または複数の変異を含むもの；（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、４０位の変異を含むもの；（Ｔｅｔ－ＯＮ）配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、８位の変異を含むもの；（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶにおける変異を含むもの；（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、１５７位および４１位から選択される１または複数の変異を含むものであり得る。
【0038】
あるいは、具体的には、例えば、（ＤＡＰＧ－ＯＮ）配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、Ｑ１１７Ｎ、Ｋ８６Ｔ、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ｇ、Ｅ１４３Ｋ、Ｆ１０９Ｌ、Ｋ２０Ｒ、Ｅ７０Ｇ、及びＴ１８７Ａから選択される１または複数の変異を含むもの；（ＨＳＬ－ＯＮ）配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含むもの；（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ）配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含むもの；（Ｔｅｔ－ＯＮ）配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｋ８Ｎの変異を含むもの；（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＰＫＲＫＥＲＳＫＩへの変異を含むもの；（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異を含むものであり得る。
【0039】
本開示で使用される核酸またはタンパク質は、対象となるアミノ酸または塩基配列において１もしくは複数のアミノ酸またはヌクレオチドが変異された（例えば、置換、欠失および／または付加された）配列またはその改変体を含み得る。ここで、キメラタンパク質全長アミノ酸配列において「１もしくは複数」とは、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。また、ドメインのアミノ酸配列において、「１もしくは複数」とは、通常、６アミノ酸以内であり、好ましくは５アミノ酸以内であり、更に好ましくは４アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。本開示の生物学的活性を維持する場合、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらは本明細書において「保存的置換」ともいい、本開示のポリペプチドにおいて変異を想定する場合は、保存的置換ではない置換が好ましく、変異を想定していないアミノ酸位置では、保存的置換をしてもよいことが理解される。なお、あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することは公知である（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２－５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７－６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１－１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ－ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９－６４１３）。したがって、本開示の一実施形態において「数個」は、例えば、１０、８、６、５、４、３、または２個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。欠失等がなされたタンパク質は、例えば、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、または抗体ファージライブラリを用いたバイオパニング等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （ＴＯＹＯＢＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．）を使用できる。欠失等を導入した変異型抗体から、野生型と同様の活性のある抗体を選択することは、ＦＡＣＳ解析やＥＬＩＳＡ等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。
【0040】
本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の変異（例えば、挿入、置換および／もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加）」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。改変アミノ酸配列は、例えば１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、本開示のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。また一実施形態において、改変体とは、例えば配列番号１～５の各アミノ酸配列や核酸配列において、１番目のＭｅｔを削除したもの、またはそのＮ末端やＣ末端などを削除したものなど、配列の一部分だけのものを含む。
【0041】
また本開示の一実施形態において、本開示のポリペプチドまたは組成物において明示した変異に加え、本開示の機能（遺伝子スイッチなど）に実質的な影響を与えない限り、１または複数の更なる変異をさらに含んでいてもよい。
【0042】
本開示の一実施形態において、遺伝子スイッチは、有用タンパク質の大量生産に応用でき、タンパク質の生産においては、例えば、大腸菌などの宿主細胞に異種生物から得た標的タンパク質を強制発現させる手法が用いられる。宿主細胞にとって毒性を示すタンパク質を生産させる場合、宿主細胞を充分な数まで増殖させて、適切なタイミングで発現を誘導して強制発現させる。したがって、本開示の一実施形態に係る遺伝子スイッチは、非誘導時の基底発現レベルが充分低く（すなわち、漏出発現が小さいこと）、および発現が誘導（ＯＮ）されたときに充分な遺伝子発現を行う（すなわち、ＯＮ／ＯＦＦ時の発現レベル比が大きいこと）ものである。
【0043】
また他の実施形態において、本開示の遺伝子スイッチは、誘導因子の濃度が低い場合にも高感度に下流の遺伝子の発現を調節することができるものである。
【0044】
他の実施形態において、遺伝子スイッチは、代謝工学の手段として使用することができる。代謝工学では、複数の酵素遺伝子を１つの宿主細胞の中で同時に発現させ、ある目的物質の生合成経路を構築する。構築した人工の生合成経路において最高の成果、例えば、バイオマスあたりの最終生成物の収量最大化、副産物の最少化などを目指す場合には、個々の遺伝子の発現レベルを詳細に、かつ独立して調節することが必要となる。そのため、本開示の一実施形態において、望みどおりのＯＮ／ＯＦＦ切り替え特性をもち、複数の遺伝子の発現調節をひとつの細胞で同時に行う場合に、１つの遺伝子スイッチの誘導物質が別の遺伝子スイッチを誤作動させることなく、それぞれの遺伝子スイッチによる発現量を連続的に調節することができる遺伝子スイッチを提供することができる。
【0045】
他の実施形態において、本開示の遺伝子スイッチ・センサは、目的の代謝産物をＨＰＬＣやＧＣＭＳなどの分析手法を用いずに、ＧＦＰ等で簡便かつ高速な生産量（濃度）測定を行うことができる。本開示の遺伝子スイッチ・センサをメタボライトセンサとして用いる場合には、高感度化させた遺伝子スイッチ・センサを用いて生産量が低い化合物を測定するだけではなく、低感度化させた遺伝子スイッチ・センサを用いて生産量が高くなってきた株の生産量を測定することもでき、本開示の方法によれば、その感度調整を容易に行うことができる。
【0046】
本開示の一実施形態において、酵母だけでなく、大腸菌などの原核生物や他の真核生物を含む宿主において転写因子を使用する際に、本開示において得られた人工転写因子で同定した変異を導入すると、同様の効果を得ることができる。天然型の転写因子に変異を加える場合と、人工転写因子にした場合に変異を加える場合の両方が考えられる。
【0047】
本開示の一実施形態において、様々な遺伝子スイッチ・センサ（テトラサイクリン応答型、ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）応答型、２，４－ジアセチルフロログルシノール（ＤＡＰＧ）応答型、など）の改良型を簡便に作出することができる。また、初期型センサではほとんど応答の見られなかった遺伝子センサについても、応答がきちんと見られるレベルにまで簡便に改良できる。また、逆転型のスイッチも簡単に構築することができる。さらに、オペレーター配列をタンデム化することで、さらなる劇的な応答性能の向上を達成した。
（人工転写因子）
本開示の一局面において、生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、組成物が提供される。
（ＤＡＰＧ－ＯＮ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、ＤＡＰＧ－ＯＮ型遺伝子スイッチを提供することができる。２，４－ジアセチルフロログルシノール（ＤＡＰＧ）応答型の転写因子（ＰｈｌＦ）を用いた人工転写因子（ＰｈｌＴＡ）の場合、ＯＦＦ型のスイッチ（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）しか知られていないが、本開示の一実施形態において、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰｈｌＦにＱ１１７Ｒ、Ｋ８６Ｔ、Ｅ１４３Ｋの変異を加えることで応答性が逆転したＤＡＰＧ－ＯＮ型の遺伝子スイッチを提供することができる。一実施形態において、このＤＡＰＧ－ＯＮ型の遺伝子スイッチは、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、またはＱ１１７Ｎを導入することだけでも応答性は逆転する。一実施形態において、ＤＡＰＧ－ＯＮ型の遺伝子スイッチは、さらにＫ８６ＴとＥ１４３Ｋを加えるとその応答性がより顕著に逆転させることができる。一実施形態において、さらに、これらの変異に加えて、Ｆ１０９Ｌ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ａ、またはＫ８６Ｇ変異を加えることで、ＤＡＰＧに対する感度も向上することができる。また他の実施形態において、感度向上に伴うＯＦＦ（ＤＡＰＧ不在時）発現の増加（漏出の増加）が、Ｓ５ＰまたはＰ６Ｓの変異によって抑制することができる。また一実施形態において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、またはＤ９０Ｇの変異を加えることで、応答性を向上させることもでき、例えばＦ１０９Ｌ変異などを導入して高感度化する際に、ＯＦＦ時の漏出発現を抑えることができる。Ｆ１０９については、Ｆ１０９残基のｓｉｔｅ－ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ（ＮＮＫ）から５０バリアントをスクリーニングしても、高感度化変異はＦ１０９Ｌしか見つからないことから、Ｌ以外への変異は高感度化させるものではないということができる。
（人工転写因子）
本開示の一局面において、生物における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ発現配列と、前記遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が結合することによって発現が誘導される目的遺伝子配列とを含む、組成物が提供される。
（ＤＡＰＧ－ＯＮ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、ＤＡＰＧ－ＯＮ型遺伝子スイッチを提供することができる。２，４－ジアセチルフロログルシノール（ＤＡＰＧ）応答型の転写因子（ＰｈｌＦ）を用いた人工転写因子（ＰｈｌＴＡ）の場合、ＯＦＦ型のスイッチ（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）しか知られていないが、本開示の一実施形態において、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰｈｌＦにＱ１１７Ｒ、Ｋ８６Ｔ、Ｅ１４３Ｋの変異を加えることで応答性が逆転したＤＡＰＧ－ＯＮ型の遺伝子スイッチを提供することができる。一実施形態において、このＤＡＰＧ－ＯＮ型の遺伝子スイッチは、Ｑ１１７Ｒ、Ｑ１１７Ｐ、Ｑ１１７Ｇ、またはＱ１１７Ｎを導入することだけでも応答性は逆転する。一実施形態において、ＤＡＰＧ－ＯＮ型の遺伝子スイッチは、さらにＫ８６ＴとＥ１４３Ｋを加えるとその応答性がより顕著に逆転させることができる。一実施形態において、さらに、これらの変異に加えて、Ｆ１０９Ｌ、Ｋ８６Ｓ、Ｋ８６Ａ、またはＫ８６Ｇ変異を加えることで、ＤＡＰＧに対する感度も向上することができる。また他の実施形態において、感度向上に伴うＯＦＦ（ＤＡＰＧ不在時）発現の増加（漏出の増加）が、Ｓ５ＰまたはＰ６Ｓの変異によって抑制することができる。また一実施形態において、Ｐ５Ｓ、Ｓ６Ｐ、またはＤ９０Ｇの変異を加えることで、応答性を向上させることもでき、例えばＦ１０９Ｌ変異などを導入して高感度化する際に、ＯＦＦ時の漏出発現を抑えることができる。Ｆ１０９については、Ｆ１０９残基のｓｉｔｅ－ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ（ＮＮＫ）から５０バリアントをスクリーニングしても、高感度化変異はＦ１０９Ｌしか見つからないことから、Ｌ以外への変異は高感度化させるものではないということができる。
【0048】
また、他の実施形態において、Ｋ２０Ｒ、Ｅ７０Ｇ、および／またはＴ１８７Ａの変異でも応答性が反転したＤＡＰＧ－ＯＮ型のスイッチを提供することができる。一実施形態において、Ｅ７０ＧおよびＴ１８７Ａのいずれかがないと、応答性の反転を得ることができない。
【0049】
さらに、一実施形態において、オペレーター配列をタンデム化することで、応答性が劇的に向上させることもできる（ｐｈｌＯ×６コピーで５００倍以上）。
【0050】
本開示の他の局面において、ＤＡＰＧ－ＯＮ型の遺伝子スイッチは、配列番号５で表される塩基配列またはその改変体において、Ｃ１３Ｔ、Ｔ１６Ｃ、Ａ３５０Ｇ、３５０位および３５１位のＡＡのＣＧへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＡＴＴへの変異、３４９位～３５１位のＣＡＡのＧＧＴへの変異、Ａ２５７Ｃ、２５６位および２５７位のＡＡのＧＣへの変異、２５６位および２５７位のＡＡのＴＣへの変異、２５６位および２５７位のＡＡのＧＧへの変異、Ｇ４２７Ａ、Ｔ３２５Ｃ、Ａ５９Ｇ、Ａ２０９Ｇ、およびＡ５５９Ｇから選択される１または複数の変異を含む核酸分子がコードするものとして提供することもできる。この場合、前記核酸分子がコードするポリペプチドが、ピキア酵母における目的遺伝子発現の誘導性制御のためのポリペプチドとして機能することもできる。
（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、ＤＡＰＧ－ＯＦＦ型遺伝子スイッチを提供することができる。本開示の一実施形態において、２，４－ジアセチルフロログルシノール（ＤＡＰＧ）応答型の転写因子（ＰｈｌＦ）を用いた人工転写因子（ＰｈｌＴＡ）を用いて、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰｈｌＦにＲ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異（配列番号５の核酸配列におけるＧ４７０Ａ（Ｒ１５７Ｈに対応）およびＡ１２２Ｇ（Ｅ４１Ｇに対応）の変異）を加えることで、従来のＯＦＦ型のスイッチ（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）よりもＳ／Ｎ比が大きい遺伝子スイッチを提供することができる。
（ＨＳＬ－ＯＮ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、ＨＳＬ－ＯＮ型遺伝子スイッチを提供することができる。本開示の一実施形態において、ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）応答型の転写因子（ＬｕｘＲ）を用いた人工転写因子（ＬｕｘＴＡ）を利用した遺伝子スイッチ（ＨＳＬ－ＯＮ）を提供することができ、ＬｕｘＲにＳ１１６Ｙ変異を加えることで、従来知られていたＳ１１６Ａ変異よりも、ＨＳＬに対する感度を向上させることができる。また、一実施形態において、Ｓ１１６Ｙに追加して、Ｗ２０１Ｒ、Ｔ３３Ａ、および／またはＨ１４０Ｎ変異を加えることで、さらにＨＳＬに対する感度を向上させることができる。したがって、本開示の一実施形態において、前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含むことが好ましい。
（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ型遺伝子スイッチを提供することができる。この場合、前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含むことが好ましい。
（Ｔｅｔ－ＯＮ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、Ｔｅｔ－ＯＮ型遺伝子スイッチを提供することができる。本開示の一実施形態において、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）応答型の転写因子（ＴｅｔＲ）を用いた人工転写因子（ｒＴｅｔＴＡ）を利用した遺伝子スイッチ（Ｔｅｔ－ＯＮ）を提供することができ、Ｒ８Ｋ変異を加えることで、従来知られていたＧ７２Ｖ変異（～５００倍）よりも高いＳ／Ｎ比（～６００倍）を実現することができる。したがって、本開示の一実施形態において、前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ８Ｋの変異を含むことが好ましい。
（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ型遺伝子スイッチを提供することができる。本開示の一実施形態において、Ｄ－ｃａｍｐｈｏｒ応答型の転写因子（ＣａｍＲ）を用いた人工転写因子（ＣａｍＴＡ）を利用した遺伝子スイッチ（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）を提供することができ、Ｃ末端に配置した核移行シグナル（ＮＬＳ）に対して、ＮＬＳ機能の破壊（たとえばフレームシフトや終始コドンの挿入）を行うことにより、毒性を回避して酵母で機能的に発現させることができる。本開示の一実施形態において、このようなＮＬＳ機能を破壊するフレームシフト変異としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＰＫＲＫＥＲＳＫＩへの変異を挙げることができる。この場合、遺伝子配列としては、Ａ６９５ｄｅｌの変異を含むことができる。また他の実施形態において、ＣａｍＲにＹ４０Ｃ（またはＱ８７Ｒ、またはＲ２０Ｋ）変異を加えることで、ｃａｍｐｈｏｒだけでなく、ｂｏｒｎｅｏｌやβ－ｐｉｎｅｎｅに対する感度が向上したスイッチを提供することもできる。
（ピキア酵母の遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ：Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）やメタノール資化性酵母（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉなど）を用いて、オペレーター配列（ｐｈｌＯ）とコアプロモーター（ピキア酵母由来ＡＯＸ１またはＤＡＳ１のコアプロモーターなど）を融合した人工プロモーターを導入して遺伝子スイッチとすることもできる。これにより、出芽酵母で作出したＰｈｌＦ変異体（ＰｈｌＴＡ変異体）を発現させることで、ピキア酵母を含むメタノール資化性酵母でもＤＡＰＧ－ＯＮ型のプロモーターとして機能させることが可能となる。一実施形態において、オペレーター配列（ｐｈｌＯ）を最大４８コピーまでタンデム化することで、メタノール資化性酵母で機能する極めて強力な人工型の誘導プロモーターを作出することができる。
（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、ＤＡＰＧ－ＯＦＦ型遺伝子スイッチを提供することができる。本開示の一実施形態において、２，４－ジアセチルフロログルシノール（ＤＡＰＧ）応答型の転写因子（ＰｈｌＦ）を用いた人工転写因子（ＰｈｌＴＡ）を用いて、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰｈｌＦにＲ１５７ＨおよびＥ４１Ｇから選択される１または複数の変異（配列番号５の核酸配列におけるＧ４７０Ａ（Ｒ１５７Ｈに対応）およびＡ１２２Ｇ（Ｅ４１Ｇに対応）の変異）を加えることで、従来のＯＦＦ型のスイッチ（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）よりもＳ／Ｎ比が大きい遺伝子スイッチを提供することができる。
（ＨＳＬ－ＯＮ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、ＨＳＬ－ＯＮ型遺伝子スイッチを提供することができる。本開示の一実施形態において、ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）応答型の転写因子（ＬｕｘＲ）を用いた人工転写因子（ＬｕｘＴＡ）を利用した遺伝子スイッチ（ＨＳＬ－ＯＮ）を提供することができ、ＬｕｘＲにＳ１１６Ｙ変異を加えることで、従来知られていたＳ１１６Ａ変異よりも、ＨＳＬに対する感度を向上させることができる。また、一実施形態において、Ｓ１１６Ｙに追加して、Ｗ２０１Ｒ、Ｔ３３Ａ、および／またはＨ１４０Ｎ変異を加えることで、さらにＨＳＬに対する感度を向上させることができる。したがって、本開示の一実施形態において、前記遺伝子スイッチが、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ、Ｈ１４０Ｎ、及びＴ３３Ａから選択される１または複数の変異を含むことが好ましい。
（Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、Ｂｏｒｎｅｏｌ－ＯＮ型遺伝子スイッチを提供することができる。この場合、前記遺伝子スイッチが、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｙ４０Ｃの変異を含むことが好ましい。
（Ｔｅｔ－ＯＮ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、Ｔｅｔ－ＯＮ型遺伝子スイッチを提供することができる。本開示の一実施形態において、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）応答型の転写因子（ＴｅｔＲ）を用いた人工転写因子（ｒＴｅｔＴＡ）を利用した遺伝子スイッチ（Ｔｅｔ－ＯＮ）を提供することができ、Ｒ８Ｋ変異を加えることで、従来知られていたＧ７２Ｖ変異（～５００倍）よりも高いＳ／Ｎ比（～６００倍）を実現することができる。したがって、本開示の一実施形態において、前記遺伝子スイッチが、配列番号４で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、Ｒ８Ｋの変異を含むことが好ましい。
（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ型遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ型遺伝子スイッチを提供することができる。本開示の一実施形態において、Ｄ－ｃａｍｐｈｏｒ応答型の転写因子（ＣａｍＲ）を用いた人工転写因子（ＣａｍＴＡ）を利用した遺伝子スイッチ（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）を提供することができ、Ｃ末端に配置した核移行シグナル（ＮＬＳ）に対して、ＮＬＳ機能の破壊（たとえばフレームシフトや終始コドンの挿入）を行うことにより、毒性を回避して酵母で機能的に発現させることができる。本開示の一実施形態において、このようなＮＬＳ機能を破壊するフレームシフト変異としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列またはその改変体において、ＰＫＫＫＲＫＶからＰＫＲＫＥＲＳＫＩへの変異を挙げることができる。この場合、遺伝子配列としては、Ａ６９５ｄｅｌの変異を含むことができる。また他の実施形態において、ＣａｍＲにＹ４０Ｃ（またはＱ８７Ｒ、またはＲ２０Ｋ）変異を加えることで、ｃａｍｐｈｏｒだけでなく、ｂｏｒｎｅｏｌやβ－ｐｉｎｅｎｅに対する感度が向上したスイッチを提供することもできる。
（ピキア酵母の遺伝子スイッチ）
本開示の一実施形態において、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ：Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）やメタノール資化性酵母（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉなど）を用いて、オペレーター配列（ｐｈｌＯ）とコアプロモーター（ピキア酵母由来ＡＯＸ１またはＤＡＳ１のコアプロモーターなど）を融合した人工プロモーターを導入して遺伝子スイッチとすることもできる。これにより、出芽酵母で作出したＰｈｌＦ変異体（ＰｈｌＴＡ変異体）を発現させることで、ピキア酵母を含むメタノール資化性酵母でもＤＡＰＧ－ＯＮ型のプロモーターとして機能させることが可能となる。一実施形態において、オペレーター配列（ｐｈｌＯ）を最大４８コピーまでタンデム化することで、メタノール資化性酵母で機能する極めて強力な人工型の誘導プロモーターを作出することができる。
【0051】
本開示の一実施形態において、ＤＮＡライブラリーは公知の種々の方法を用いて作製することができ、遺伝子スイッチ発現配列および／または該遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子が結合するプロモータにランダムな変異が導入されているものであれば特に限られるものではない。本開示の一実施形態において、このようなＤＮＡライブラリーを宿主細胞に導入する場合には、宿主細胞に発現ベクターを導入することによって行うことができる。「発現ベクター」は、宿主細胞に外部遺伝子を運搬するベクターＤＮＡであって、宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得るＤＮＡをいう。ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択することができる。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡでもよい。代表的なベクターＤＮＡとして、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、およびウイルス由来のベクターＤＮＡを挙げることができる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどを使用することができる。バクテリオファージＤＮＡとしては、λファージなどを挙げることができる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとしては、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなどの動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルス由来のベクターを挙げることができる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡなどを挙げることができる。あるいは、これらを組み合わせて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組み合わせて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミドなど）を挙げることができる。ベクターＤＮＡには、目的遺伝子が発現されるように目的遺伝子を組み込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子と調節ＤＮＡエレメント、例えばプロモータとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組み合わせて公知の手法によりベクターＤＮＡに組み込むことができる。このような遺伝子配列として、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）を挙げることができる。これらから選択した１種類または複数種類の遺伝子配列をベクターＤＮＡに組み込むことができる。
【0052】
ベクターＤＮＡに目的遺伝子を組み込む方法は、公知の遺伝子工学的技術を適用することができる。例えば、目的遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼにより再結合する手法を用いることもできる。あるいは、目的遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても所望のベクターＤＮＡを得ることができる。
【0053】
宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、宿主細胞にベクターＤＮＡを導入して宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得る導入方法であれば特に限定されず、宿主細胞の種により適宜選択した公知の方法のいずれを使用してもよい。例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などを挙げることができる。
【0054】
本開示の一実施形態において、発現配列と遺伝子スイッチとを同一の発現ベクターに含む必要はなく、上記融合レポーター遺伝子の発現配列を含む発現ベクターと、遺伝子スイッチを含む発現ベクターとを同一の細胞に共形質転換することにより実施することもできる。
【0055】
本開示において使用される細胞は、特に限定されるものではなく、酵母や大腸菌などの種々の細胞を用いることができる。本開示の一実施形態において、細胞死や細胞の死滅とは、増殖能などの細胞としての機能を消失している状態を意味する。例えば、酵母などの細胞を固形培地上で培養したとき、一個の細胞から増殖して可視的に計数できる一定以上の大きさの細胞集落(コロニー)を形成できる能力を消失している状態をさす。また他の実施形態において、細胞死や細胞の死滅には、生理的または病理的な要因により生じた不要な細胞や障害細胞などを積極的に除去する能動的細胞死(アポトーシス)および外的要因への反応による受動的細胞死(ネクローシス)も含まれ得る。
【0056】
本開示の一実施形態において、酵母としては、出芽酵母、分裂酵母などを用いることができる。出芽酵母としては、例えば、Saccharomyces属（Saccharomyces cerevisiaeなど）、Zygosaccharomyces属（Zygosaccharomyces rouxiiなど）や、ピキア酵母（Komagataella phaffii、Komagataella pastoris、Komagataella pseudopastoris）、メタノール資化性酵母（Ogataea polymorpha、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Ogataea minuta、Ogataea angusta、Pichia methanolica、Ogataea parapolymorphaなど）などを用いることができる。分裂酵母としては、例えば、Zygosaccharomyces属（Zygosaccharomyces rouxiiなど）を用いることができる。これらのうちでも特に好ましい酵母は、Saccharomyces cerevisiaeまたはピキア酵母（Komagataella phaffii、Komagataella pastoris、Komagataella pseudopastoris）である。一実施形態において、メタノール資化性酵母とは、唯一の炭素源としてメタノールを利用して培養可能な酵母細胞と定義されるが、本来メタノール資化性酵母細胞であったが、人為的な改変あるいは変異によりメタノール資化性能を喪失した酵母細胞もメタノール資化性酵母細胞に包含される。
【0057】
ピキア酵母はメタノール資化性の性質をもち、主にタンパク質生産で産業的に広く使われている。このピキア酵母では、メタノール誘導システムとしてＡＯＸ１プロモータが広く用いられている。このＡＯＸ１プロモータは発現量が非常に強く、メタノール下で増殖した細胞では全ｍＲＮＡ量の５％がＡＯＸ１ｐ由来といわれており、その発現はメタノールで厳密に制御することができる。
【0058】
本開示の一実施形態においては、人工転写活性化因子であるｒＰｈｌＴＡと誘導剤としてＤＡＰＧを用いることで、ＡＯＸ１プロモータに匹敵する新規誘導性プロモータを提供することができる。
【0059】
遺伝子スイッチは、誘導プロモーターとして利用することができ、使用しにくい特性を持つ天然型の誘導プロモーターの欠点を克服した性能の良い人工の遺伝子スイッチはニーズが高い。また、遺伝子スイッチは生産物の簡便な間接定量評価や遺伝子発現の調節を行うことができるため、近年その利用ニーズが高まってきている。産業微生物としても有用な酵母において、本手法により、簡便に高性能遺伝子スイッチ・センサを作ることができれば、菌株構築の時間を圧倒的に短縮したり、高度な代謝や遺伝子ネットワーク制御を行うことができる。そのため、特に代謝工学や合成生物学分野において産業応用が期待される。また本開示の遺伝子スイッチは、有用タンパク質の大量生産や毒性を示すタンパク質などの発現制御、代謝化合物の簡易的な濃度測定などに利用できる。
【0060】
本開示の一実施形態において、誘導プロモーターはタンパク質の誘導発現（分泌または細胞内での生産）に利用することができる。
【0061】
本開示の一実施形態において、Ｓ／Ｎ比に優れたＴｅｔ－ＯＮ、ＤＡＰＧ－ＯＮ、ＨＳＬ－ＯＮは、代謝酵素の発現制御への利用を想定することができる。例えば代謝経路を分岐させる酵素への使用が考えられる。例えばテルペノイドの一種のスクアレンの生産において、スクアレン消費する下流のエルゴステロール経路の酵素を、スクアレンを高生産するタイミングでのみＯＦＦにすることで、スクアレンの生産量を高めることができる。または他の実施形態において、細胞に強い毒性を示す有用タンパク質、例えば抗体タンパク質などを候補として挙げることができる。抗体タンパク質の生産では、化学反応の変換プロセスを構築する代謝工学とはことなり、抗体タンパク質の発現量がそのまま生産量に比例する。そのため、発現量を限界まで高める必要があるが、発現誘導系のＳ／Ｎ比が低いと、発現の漏出が起き、タンパク質の過剰発現による細胞毒性のために酵母株を得ること自体不可能である。ＤＡＰＧ－ＯＮやＴｅｔ－ＯＮ、ＨＳＬ－ＯＮスイッチでは、その高いＳ／Ｎ比ゆえに、毒性タンパク質の高生産が見込まれる。
【0062】
本開示の一実施形態において、遺伝子スイッチは、特に細胞に対して毒性を示す遺伝子の発現のＯＮ／ＯＦＦ切り替えに利用されることができる。医薬品としての利用が期待される抗体タンパク質、あるいは植物代謝物の合成を担う異種酵素遺伝子の酵母内発現は、過剰に発現させ過ぎると往々にして細胞毒性を示す。しかし、細胞増殖期には毒性を示す遺伝子であっても、増殖完了後の発現誘導であればその毒性が緩和されることがある。そこで、遺伝子スイッチを用いて、増殖期には毒性遺伝子の発現をＯＦＦ、増殖完了後にＯＮにすることで、異種遺伝子の過剰発現による細胞毒性を回避できる。
【0063】
本開示の一実施形態において、遺伝子スイッチは、バイオコンピューティングの分野でも注目を集めている。複数の遺伝子スイッチの組み合わせで構成される「遺伝子回路」は、細胞に与えられた外部情報を処理する「電子回路」のアナロジーとして解釈することができる。実際に、合成生物学分野では、遺伝子回路を構築し、細胞に新規機能を付与すること目的として、実際のコンピュータに実装されている論理回路と同じトポロジーを持つ多数の遺伝子回路を設計・構築してきた。しかし、電子回路とは異なり、遺伝子スイッチのＯＮ／ＯＦＦ切り替えはアナログであるため、遺伝子回路の組み合わせは数個に止まり、その拡張性を制限していた。ＯＦＦとＯＮの比に優れた遺伝子スイッチによって遺伝子回路の抱えるこのような弱点を解決できる可能性がある。
【0064】
本開示の一実施形態において、酵母をメインとして、その他の真核生物や大腸菌を含む原核細胞など様々な生物種において、高性能な新たな遺伝子スイッチまたはメタボライトセンサを作出するために本開示の方法を使用することができる。作出するスイッチ・センサをライセンス若しくはキットの一部としての販売する、あるいはスイッチ・センサの受託開発をすることもできる。また、作出した遺伝子スイッチは、安全かつ安価で使いやすい（たとえば防爆設備が不要、炭素源を限定しない、など）新たなタンパク質生産の誘導プロモーターとして利用したり、代謝経路中の遺伝子発現を厳密にコントロールしたり、遺伝子回路を組むことによって、実用プロセスまたは研究用途の高性能（高生産）な物質生産株を開発（自社開発・受託開発を含む）するために利用することもできる。また、開発したメタボライトセンサは、ＨＰＬＣやＧＣＭＳの代わりに目的産物や副産物の生産量を簡易的にハイスループット定量するために利用し、高性能（高生産）な物質生産株の開発スピードを加速させることもできる。
【0065】
本開示の一実施形態において、より安価かつ安全な化合物を誘導剤とする遺伝子スイッチを開発し、そのライセンス化やキットの一部としての販売を行うことができる。さまざまな生物種が持つ転写因子について、誘導剤の物性を指標にスクリーニングを行い、これを用いた遺伝子スイッチのプロトタイプを試作する。試作したプロトタイプについて、その構成要素にランダムな遺伝子変異を導入する。そうして作製した遺伝子スイッチライブラリに対して、ＯＦＦ／ＯＮ選抜を行う。すなわち、遺伝子スイッチライブラリを保持する酵母株を、１００ｎＭの５ＦｄＵ存在下で培養したのちに、誘導剤を加えた培地に移すことで、遺伝子発現を誘導する。培養液を１～３ｍＭのＺｅｏｃｉｎと誘導剤を含む培地へと移すことで、ＯＮ選抜を行う。用途に合わせて誘導剤の濃度を調整することで、より低濃度の誘導剤に応答する遺伝子スイッチ変異体の単離（高感度化）も行う。開発した遺伝子スイッチは、物質生産の鍵となる代謝酵素の発現制御や、細胞にとって負荷の大きいタンパク質の生産を誘導することに用いる。スイッチ・センサの受託開発においては、指定の誘導剤と転写因子のペアについて同様の進化分子工学サイクルを実施する。誘導剤・転写因子ペアについては、代謝工学上重要な化合物、例えば目的の生産物やあるいはその中間体などに応答するものを選定することで，これらの濃度を簡易モニタリングできるメタボライトセンサを開発する。こうして得たメタボライトセンサは、菌株開発のスピードアップに用いる。
【0066】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８９）． Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ， ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ； Ｓｎｉｎｓｋｙ， Ｊ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９９）． ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９８９）． Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ； Ｉｎｎｉｓ， Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ， ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ； Ｓｎｉｎｓｋｙ， Ｊ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９９）． ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【0067】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．（１９８５）． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．（１９９０）． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｆ．（１９９１）． Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ； Ａｄａｍｓ， Ｒ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９９２）． Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ； Ｓｈａｂａｒｏｖａ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ； Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｇ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９９６）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【0068】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
【0069】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【0070】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例0071】
（実施例１：Ｔｅｔ－ＯＮ型遺伝子スイッチのＳ／Ｎ比の評価）
Ｔｅｔ－ＯＮ型遺伝子スイッチは、以前の研究により、Ｄｏｘ添加時に３倍の誘導しか示さなかったことがわかっているが、これはｒｔＴｅｔＴＡがｔｅｔＯに非特異的に結合したこと、およびｐｔｅｔＯ７の上流でのプロモーターの偶然の出現によるものと考えられている。ｔｅｔＯへの非特異的結合を減少させるために、ｒＴｅｔＴＡ発現カセットの全領域を、エラーを起こしやすいＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）によってランダムに変異させ、その結果得られたＰＣＲ産物を、ＧＡＰ修復クローニングによって、ｐｔｅｔＯ７－ＴＢＧをもつ細胞内のプラスミドに直接クローニングした（図１Ａ）。得られた形質転換体（～１０５個のユニークなクローン）を、Ｄｏｘを含まない５ＦｄＵ含有液体培地で培養することにより、漏出の（すなわち、Ｄｏｘに依存しない）ＴＢＧ発現を有する変異体を除去してＯＦＦ選抜を行った。次に、非機能性バリアントを除去し、これにより良好なスイッチを濃縮するために、様々な条件下でＯＮ選抜を行った。具体的には、ＯＦＦ選抜された細胞のプールを、Ｄｏｘ（０．０１～１０μｇ／ｍＬ）とゼオシン（１または２ｍＭ）の様々な組み合わせを含む１４本の試験管に分注し、サンプルを一晩振盪した。
Ｔｅｔ－ＯＮ型遺伝子スイッチは、以前の研究により、Ｄｏｘ添加時に３倍の誘導しか示さなかったことがわかっているが、これはｒｔＴｅｔＴＡがｔｅｔＯに非特異的に結合したこと、およびｐｔｅｔＯ７の上流でのプロモーターの偶然の出現によるものと考えられている。ｔｅｔＯへの非特異的結合を減少させるために、ｒＴｅｔＴＡ発現カセットの全領域を、エラーを起こしやすいＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）によってランダムに変異させ、その結果得られたＰＣＲ産物を、ＧＡＰ修復クローニングによって、ｐｔｅｔＯ７－ＴＢＧをもつ細胞内のプラスミドに直接クローニングした（図１Ａ）。得られた形質転換体（～１０５個のユニークなクローン）を、Ｄｏｘを含まない５ＦｄＵ含有液体培地で培養することにより、漏出の（すなわち、Ｄｏｘに依存しない）ＴＢＧ発現を有する変異体を除去してＯＦＦ選抜を行った。次に、非機能性バリアントを除去し、これにより良好なスイッチを濃縮するために、様々な条件下でＯＮ選抜を行った。具体的には、ＯＦＦ選抜された細胞のプールを、Ｄｏｘ（０．０１～１０μｇ／ｍＬ）とゼオシン（１または２ｍＭ）の様々な組み合わせを含む１４本の試験管に分注し、サンプルを一晩振盪した。
【0072】
１４本のＯＮ選抜された細胞混合物のそれぞれをフローサイトメトリーを用いて分析した（図１Ａ）。機能的なスイッチを、様々な選抜条件下で異なる程度に濃縮した。すべての場合において、試験したゼロではない濃度のＤｏｘにおいて、望ましい（Ｄｏｘ誘導性）変異体の有意な濃縮が観察された（図１Ａ）。一般に、誘導条件（Ｄｏｘ＋）の下での出力シグナルは、低い選択圧（ラン１～７；１ｍＭゼオシン）の下でのそれぞれの対応するプールよりも、より高い選択圧（２ｍＭゼオシン）がＯＮ条件の下で適用されたラン８～１４からのプールの方が高かった。しかし、２ｍＭゼオシンでＯＮ選抜されたプールは、Ｄｏｘの非存在下でも高い蛍光シグナルを示した高割合の「常にＯＮ」のバリアントで汚染されていた。２ｍＭのゼオシンを用いたＯＮ選抜は、Ｄｏｘ誘導時に高い出力を持つ陽性（望ましい）クローンにも毒性効果を及ぼし、それによって「常にＯＮ」の表現型を持つ非スイッチング変異体（スーパーアクチベーター）と比較してスイッチング変異体の割合を減少させたことがわかった。いずれの場合にも、低濃度のＤｏｘ、特に０．１μｇ／ｍＬ以下の濃度では、プール内に漏出発現のあるバリアントが徐々に蓄積される結果となった。この特定のケースでは、機能的スイッチの最も効率的な濃縮は、ラン９および１１（プール＃９および＃１１）で達成された。最高の誘導出力と最高のストリンジェンシーの両方を持つバリアントを分離するため、その後のスクリーニングにはラン８と１１を用いた。
【0073】
選択された２つのプールから、９３個のクローンをランダムに選び、９６ウェルプレートで蛍光スクリーニングを行った（図１Ｂ）。試験したクローンの合計４８％（４５／９３）は、Ｄｏｘ（１０μｇ／ｍＬ）で５倍以上の誘導を示し、最高のｒＴｅｔＴＡ変異体（ｒＴｅｔＴＡＫ８Ｎ、Ｌ１３１Ｌ）は、０．３および１０μｇ／ｍＬのＤｏｘの存在下でそれぞれ８倍および１１倍の誘導を示した（図１Ｃ）。
【0074】
図１Ａに示すように、Ｔｅｔ－ＯＮスイッチのｒＴｅｔＴＡをコードする発現カセットにランダムな変異を導入し、得られたライブラリーを異なる選抜条件でＯＦＦ／ＯＮ選抜の並列操作を行った。スイッチバリアントが濃縮される条件をスクリーニングするために、得られた細胞集団をＤｏｘ依存性の蛍光シフトについて評価した。緑と青で示した領域は、望ましくない挙動、すなわち漏出発現のあるバリアント（Ｄｏｘが存在しない場合に１０４以上のＧＦＰ蛍光を持つ細胞）と不活性バリアント（１０μｇ／ｍＬのＤｏｘの存在下で１０４未満のＧＦＰ蛍光を持つ細胞）のそれぞれ相対的な量（％）を示す。スイッチングバリアントの相対的な量（％）は、これらの２つの数値の両方を１００％から差し引くことによって得られた。破線は、ｒＴｅｔＴＡを含まないプラスミドをもつ酵母株から得られたヒストグラムを示す。図１Ｂでは、Ｔｅｔ－ＯＮバリアントの９６ウェルプレートでの蛍光スクリーニングの結果を示した。また図１Ｃでは、選択された変異体のトランスファー機能を示した。エラーバーは、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。５０％有効濃度（ＥＣ５０）値は、最小二乗法によりヒル式に適合した用量反応曲線から計算した。上のパネルは、野生型および進化させたＴｅｔ－ＯＮスイッチ（ｒＴｅｔＴＡＫ８Ｎ、Ｌ１３Ｌ）をもつ酵母株の細胞ペレットを１０μｇ／ｍＬのＤｏｘの有無にかかわらずインキュベートした場合の蛍光画像を示す。
（実施例２：遺伝子スイッチの改良）
Ｔｅｔ－ＯＮシステムを開発するためのプロトコルに従って、任意の転写因子を真核生物の転写スイッチの構成要素として使用することができる。しかし、異なる転写因子の場合、安定性、ＤＮＡ結合親和性、およびｓＴＡを生成するために他のタンパク質またはドメインと融合したときにそれらの機能がどのように変化するのかがそれぞれ異なるため、得られるスイッチの性能は予測不可能である。さらに、ｓＴＡのスイッチング挙動は、種々の要因（発現レベル、プロモーターの位置およびコピー数、および株の種類）に大きく依存する。実際には、それぞれの条件において適切な性能を確保するために、新しいシステムを再進化させる必要がある。
（実施例２：遺伝子スイッチの改良）
Ｔｅｔ－ＯＮシステムを開発するためのプロトコルに従って、任意の転写因子を真核生物の転写スイッチの構成要素として使用することができる。しかし、異なる転写因子の場合、安定性、ＤＮＡ結合親和性、およびｓＴＡを生成するために他のタンパク質またはドメインと融合したときにそれらの機能がどのように変化するのかがそれぞれ異なるため、得られるスイッチの性能は予測不可能である。さらに、ｓＴＡのスイッチング挙動は、種々の要因（発現レベル、プロモーターの位置およびコピー数、および株の種類）に大きく依存する。実際には、それぞれの条件において適切な性能を確保するために、新しいシステムを再進化させる必要がある。
【0075】
負に制御された真核生物の遺伝子スイッチを改良するため、２つの酵母の転写スイッチを再構築した。２，４－ジアセチルフロログシノール（ＤＡＰＧ）－ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）スイッチとＤ－Ｃａｍｐｈｏｒ－ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）スイッチ（図２Ａ）。具体的には、ＤＡＰＧおよびＤ－Ｃａｍｐｈｏｒ応答性細菌リプレッサー（ＰｈｌＦおよびＣａｍＲ）をＶＰ４８活性化ドメインおよび核局在化シグナル（ＮＬＳ）と融合させ、公表されている配列と同一のタンパク質配列を有するｓＴＡ（それぞれＰｈｌＴＡおよびＣａｍＴＡ）を生成した。また、７コピーのｔｅｔＯの代わりに、ＰｈｌＦとＣａｍＲのシングルオペレーター（それぞれｐｈｌＯとｃａｍＯ）をｐＧＡＬ１－ｃに融合させ、合成プロモーター（それぞれｐｐｈｌＯ１とｐｃａｍＯ１）を作製した。本発明者らの手法は可能な限り報告された方法と一致していたものの、初期のコンストラクトは、報告されているように機能しなかった。これはおそらくｓＴＡの発現を駆動するために使用されるシス制御エレメント（プロモーター／ターミネーター）のわずかな違いに起因するものと思われた。さらに、本発明者らはＰｈｌＴＡ発現プラスミドで高い毒性を観察した。プラスミドを酵母に形質転換したところ、ＤＡＰＧに感受性のない数個の生存可能なコロニーのみが得られた（図２Ｂ）。これらの単離株は、ＶＰ１６を過剰に発現させた場合の毒性効果を緩和すると思われるＰｈｌＴＡ発現プラスミドの自然発生的なダウンチューニング変異を持つ突然変異体と考えられた。ＣａｍＴＡ発現プラスミドは、酵母においてより低い毒性を示したが、再構成されたＣａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦスイッチは、Ｄ－ｃａｍｐｈｏｒの存在下で有意な漏出発現を示した（図２Ｃ）。
【0076】
ｅｐＰＣＲを用いて、ＰｈｌＴＡおよびＣａｍＴＡ発現カセット全体を変異させ、得られたライブラリーをＯＮ／ＯＦＦ選抜をおこなった。この選抜により、ＤＡＰＧ添加時に４倍の発現低下を示した機能的なＤＡＰＧ－ＯＦＦ変異体（１－２Ｅおよび１－６Ｈ）（図２Ｂ）、ならびにＤ－Ｃａｍｐｈｏｒに対する応答性がＳ／Ｎ比で２倍に改善されたＣａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦスイッチ変異体（１－８Ｄ）（図２Ｃ）を迅速に単離することができた。特筆すべきことに、新たに単離された変異体については、酵母において明らかな毒性は観察されなかった。最良の性能を有するＣａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦスイッチのうちの５つは、完全なＮＬＳを無効にするフレームシフト変異（Ａ６９５ｄｅｌ）（アミノ酸ＰＫＫＫＲＫＶからＲＫＥＲＳＫＩへの変異）を共有していた。その一方で、最良の性能を有するＤＡＰＧ－ＯＦＦスイッチのうちの４つは、無傷のＮＬＳを保持していたが、ＰｈｌＴＡ発現カセットに同じ変異を有していた。これらの観察から、Ｄ－ｃａｍｐｈｏｒの存在下で漏出のＴＢＧ発現がないか、またはそれ以下であることを確実にするために、最適なＣａｍＴＡ活性のためには、ＮＬＳ機能（およびおそらく核内局在性）の部分的な障害が必要であることが示唆された。コントロール実験では、ＮＬＳを欠いたＣａｍＴＡによる転写活性化は検出されなかった。
【0077】
図２に酵母転写スイッチの作出と進化方法を示す模式図を示した（Ｓ／Ｎ比、感度、行動タイプで評価）。図２Ａに本開示で開発した酵母遺伝子スイッチを示す。特定されたｓＴＡ変異体のプラスミド発現によって、宿主細胞においてｐｐｈｌＯ１、ｐｃａｍＯ１、またはｐｌｕｘＯ１の制御下に置かれた用量依存的な活性化遺伝子が発現した。図２Ｂ～図２Ｆに、ＤＡＰＧ－ＯＦＦスイッチ（図２Ｂ）、Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦスイッチ（図２Ｃ）、ＤＡＰＧ－ＯＮスイッチ（図２Ｄ）、およびＨＳＬ－ＯＮスイッチ（図２Ｆ）の親および変異体のトランスファー機能を示した。ＴＢＧ由来のＧＦＰ蛍光は、各誘導剤濃度の関数としてプロットした。示されているエラーバーは、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表している。ＯＦＦ／ＯＮ選抜中に添加された誘導剤の濃度は、矢印および破線で示した。ＥＣ５０値は、最小二乗法によりヒル式に適合した用量反応曲線から計算され、マイクロモル濃度単位で表した。図２Ｅおよび図２Ｇには、それぞれＰｈｌＴＡを反転／増感させ、ＬｕｘＴＡを増感させる、ＰｈｌＦおよびＬｕｘＲにおける変異の構造マッピングを示した。ＰｈｌＦとＬｕｘＲの構造は、それぞれＴｅｔＲファミリーの転写調節因子ＳＣＯ０３３２（ＰＤＢ：２ＺＢ９）とクォーラムセンサータンパク質ＴｒａＲ（ＰＤＢ：１Ｌ３Ｌ）の結晶構造をもとに、Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌサーバーを用いてモデル化した。ＤＮＡ構造は対応する参照結晶構造から引用した。
（実施例３：ＤＡＰＧ－ＯＦＦシステムからＤＡＰＧ－ＯＮシステムへの変換）
突然変異によって、新規なスイッチング動作を持つ転写因子を出現させることができる。様々な細菌のリプレッサーは、いくつかの突然変異が生じることによって、それらのリガンド応答を反転させることが知られている。したがって、前述のＤＡＰＧ－ＯＦＦスイッチをコードする遺伝子に変異を誘発させることにより、ＤＡＰＧ－ＯＮスイッチにコンストラクトを変換することができるかどうかを確認した。この目的のために、ＤＡＰＧ－ＯＦＦスイッチの単離に使用したのと同じＰｈｌＴＡライブラリーを、ＤＡＰＧの非存在下でＯＦＦ選抜にかけ、次いでこの化合物（５μＭ）の存在下でＯＮ選抜にかけた。生存プールから、３０のバリアントをランダムに選択し、ＯＦＦ／ＯＮスクリーニングを行った結果、ＤＡＰＧ－ＯＮバリアント（１－１１Ｅ、１－１１Ｇ）を単離し、８倍のＤＡＰＧ依存性の蛍光増加を示した（図２Ｄ、図４Ａ）。このバリアントの変異解析を行ったところ、３つの新規変異の存在を明らかにした。そのうちの１つ（Ｑ１１７Ｒ）は、ＰｈｌＴＡ（ｒＰｈｌＴＡ）の機能の反転に必須であり、他の２つの変異（Ｅ１４３Ｋおよび／またはＫ８６Ｔ）は、反転したスイッチの応答性（感度および倍数変化の両方）の改善に必須であった（図２Ｅ）。ＯＮ選抜のためのより低い濃度のＤＡＰＧ（０．５μＭ）を用いた別のサイクルの突然変異誘発、選抜、およびスクリーニングによって、最大１／８倍に減少したＥＣ５０値を示す３つの第２世代バリアント（２－１Ｅ、２－４Ｅ、および２－７Ｅ）を得た（図２Ｄ）。これらの第２世代バリアントはすべて、ＤＡＰＧに対する感受性の増加の原因となった新規変異（Ｆ１０９Ｌ）を共有していた（図２Ｅ）。ＰｈｌＦはこれまでに、大腸菌においてＤＡＰＧに対する感度および選択性を改変されているが、本実施例において反転ＰｈｌＦ（ｒＰｈｌＦ）機能を示す変異は、これまでに報告されていない。同様に、ｒＰｈｌＦの感度をあげる変異はこれまで報告されていない。
（実施例３：ＤＡＰＧ－ＯＦＦシステムからＤＡＰＧ－ＯＮシステムへの変換）
突然変異によって、新規なスイッチング動作を持つ転写因子を出現させることができる。様々な細菌のリプレッサーは、いくつかの突然変異が生じることによって、それらのリガンド応答を反転させることが知られている。したがって、前述のＤＡＰＧ－ＯＦＦスイッチをコードする遺伝子に変異を誘発させることにより、ＤＡＰＧ－ＯＮスイッチにコンストラクトを変換することができるかどうかを確認した。この目的のために、ＤＡＰＧ－ＯＦＦスイッチの単離に使用したのと同じＰｈｌＴＡライブラリーを、ＤＡＰＧの非存在下でＯＦＦ選抜にかけ、次いでこの化合物（５μＭ）の存在下でＯＮ選抜にかけた。生存プールから、３０のバリアントをランダムに選択し、ＯＦＦ／ＯＮスクリーニングを行った結果、ＤＡＰＧ－ＯＮバリアント（１－１１Ｅ、１－１１Ｇ）を単離し、８倍のＤＡＰＧ依存性の蛍光増加を示した（図２Ｄ、図４Ａ）。このバリアントの変異解析を行ったところ、３つの新規変異の存在を明らかにした。そのうちの１つ（Ｑ１１７Ｒ）は、ＰｈｌＴＡ（ｒＰｈｌＴＡ）の機能の反転に必須であり、他の２つの変異（Ｅ１４３Ｋおよび／またはＫ８６Ｔ）は、反転したスイッチの応答性（感度および倍数変化の両方）の改善に必須であった（図２Ｅ）。ＯＮ選抜のためのより低い濃度のＤＡＰＧ（０．５μＭ）を用いた別のサイクルの突然変異誘発、選抜、およびスクリーニングによって、最大１／８倍に減少したＥＣ５０値を示す３つの第２世代バリアント（２－１Ｅ、２－４Ｅ、および２－７Ｅ）を得た（図２Ｄ）。これらの第２世代バリアントはすべて、ＤＡＰＧに対する感受性の増加の原因となった新規変異（Ｆ１０９Ｌ）を共有していた（図２Ｅ）。ＰｈｌＦはこれまでに、大腸菌においてＤＡＰＧに対する感度および選択性を改変されているが、本実施例において反転ＰｈｌＦ（ｒＰｈｌＦ）機能を示す変異は、これまでに報告されていない。同様に、ｒＰｈｌＦの感度をあげる変異はこれまで報告されていない。
【0078】
図４に進化させたＤＡＰＧ－ＯＮスイッチのｒＰｈｌＴＡ発現カセットに見出されたヌクレオチドおよびアミノ酸（ＡＡ、括弧内に示す）変異を示した。その変異が親である（１－１１Ｅ）変異体にも見出された第二世代の変異体を除いて、第一世代（図４Ａ）および第二世代（図４Ｂ）のｒＰｈｌＴＡ発現カセットに見出された変異を赤線で示した。フォールドチェンジは、１０μＭのＤＡＰＧの存在下および非存在下での蛍光強度の平均±ＳＤ比として、図２Ｄに示すデータから計算した。
（実施例４：その他の新規なスイッチ）
これまでのところ、原核生物の転写活性化因子は酵母の転写活性化因子として利用されていない。そこで、３－オキソ－ヘキサノイルホモセリンラクトン（ＨＳＬ）誘導細菌転写活性化因子であるＶｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＬｕｘＲを誘導成分として用いて、ｓＴＡの生成を試みた。ＬｕｘＴＡ（ＬｕｘＲ、ＶＰ４８、およびＮＬＳの融合体、図２Ａ）の単純なプラスミド発現では、ｐｌｕｘＯ１（ＬｕｘＲ結合ボックス（ｌｕｘＯ）と融合したＧＡＬ１コアプロモーター）の制御下では、ＴＢＧのＨＳＬ依存性発現はみられなかった（図２Ｆ）。この非機能的な親を出発材料として、誘導剤の濃度を段階的に減少させながら２ラウンドの突然変異誘発および選抜を行い（１ラウンド目、１０μＭのＨＳＬ；２ラウンド目、１μＭのＨＳＬ）、機能的なＨＳＬ－ＯＮのバリアントを同定することに成功した。このようにして、迅速に、酵母が細菌のシグナルを感知し、応答することを初めて可能にした。
（実施例４：その他の新規なスイッチ）
これまでのところ、原核生物の転写活性化因子は酵母の転写活性化因子として利用されていない。そこで、３－オキソ－ヘキサノイルホモセリンラクトン（ＨＳＬ）誘導細菌転写活性化因子であるＶｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＬｕｘＲを誘導成分として用いて、ｓＴＡの生成を試みた。ＬｕｘＴＡ（ＬｕｘＲ、ＶＰ４８、およびＮＬＳの融合体、図２Ａ）の単純なプラスミド発現では、ｐｌｕｘＯ１（ＬｕｘＲ結合ボックス（ｌｕｘＯ）と融合したＧＡＬ１コアプロモーター）の制御下では、ＴＢＧのＨＳＬ依存性発現はみられなかった（図２Ｆ）。この非機能的な親を出発材料として、誘導剤の濃度を段階的に減少させながら２ラウンドの突然変異誘発および選抜を行い（１ラウンド目、１０μＭのＨＳＬ；２ラウンド目、１μＭのＨＳＬ）、機能的なＨＳＬ－ＯＮのバリアントを同定することに成功した。このようにして、迅速に、酵母が細菌のシグナルを感知し、応答することを初めて可能にした。
【0079】
３μＭのＨＳＬを添加したときにＴＢＧ発現の６倍の増強を示した最高のパフォーマンスのバリアント（図２Ｆ）は、２つの非同義変異（Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ）を持っていた（図２Ｇ、図５）。酵母のＨＳＬ－ＯＮスイッチでは、いずれの変異も、程度は異なるものの、ＬｕｘＴＡを単独でＨＳＬに増感させるのに十分であった。しかし、それぞれの変異は大腸菌では全く異なる挙動を示した。酵母で見られるように、ＬｕｘＲ構造のリガンド結合領域に位置するＳ１１６Ｙ変異は、大腸菌ではＬｕｘＲ／ｐｌｕｘ転写制御因子のＨＳＬ感度を増加させた。一方、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼと相互作用することが知られているＬｕｘＲの表面に位置するもう一つの変異（Ｗ２０１Ｒ）は、大腸菌におけるｌｕｘプロモーターからの発現を著しく低下させた。Ｗ２０１Ｒ置換がＲＮＡポリメラーゼのリクルーターとしてのＬｕｘＲの機能に負の影響を与えると考えられるが、これはこの変異がこれまでにＨＳＬによる活性化のためにタンパク質を増感させるＬｕｘＲ変異を見つけるためのスクリーニングで見落とされていた理由となり得ると考えられる。酵母のＨＳＬ－ＯＮスイッチでは、ＬｕｘＲの役割は、ＨＳＬによって誘導されたＤＮＡ結合を促進することとなる。したがって、この増感性変異は酵母の遺伝子スイッチでのみ同定できると考えられる。
【0080】
図５は進化させたＨＳＬ－ＯＮスイッチのＬｕｘＴＡ発現カセットに見出されたヌクレオチドおよびアミノ酸（ＡＡ、括弧内に示す）の変異を示す。その変異が親である（１－４Ａ）変異体にも見出された第２世代の変異体を除いて、第１世代（図５Ａ）および第２世代（図５Ｂ）のＬｕｘＴＡ発現カセットに見出された変異は赤線で示した。フォールドチェンジは、１００μＭのＨＳＬ（２－４Ｆについては３μＭ）の存在下および非存在下での蛍光強度の平均±ＳＤ比として、図２Ｆに示すデータから計算した。
（実施例５：酵母スイッチ変異体のＡＮＤゲートβ－カロテン生合成経路への統合）
酵母では、Ｓ／Ｎ比を向上させた一連の遺伝子スイッチを開発してきたので、これらの構造をパスウェイ・フラックス制御に応用することを試みた。単離された３つのｓＴＡ（ＤＡＰＧ－ＯＮ２－１Ｅ、ＨＳＬ－ＯＮ２－４Ｆ、およびＴｅｔ－ＯＮ１－１１Ｆ）を酵母の異なる染色体に統合した（図３Ａ）。得られた株を、それぞれのｓｙｎＰの下流にｇｆｐ遺伝子がクローニングされたプラスミド（ｐｔｅｔＯ７、ｐｐｈｌＯ６、およびｐｌｕｘＯ５）で形質転換した。なお、ｓｙｎＰの５００以上上流のベクター配列に含まれる潜在的なプロモーター配列は削除し、ｐｈｌＯおよびｌｕｘＯの繰り返し数を増加させた。得られた細胞のＧＦＰ蛍光は、それらの同族の誘導剤の存在下でのみ誘導され、１０２以上の因子によって誘導された（図３Ｂ）。これらの合成プロモーターはいずれもストリンジェントであり、すなわち、誘導剤が存在しない場合には低い基底ＴＢＧ発現を示した。
（実施例５：酵母スイッチ変異体のＡＮＤゲートβ－カロテン生合成経路への統合）
酵母では、Ｓ／Ｎ比を向上させた一連の遺伝子スイッチを開発してきたので、これらの構造をパスウェイ・フラックス制御に応用することを試みた。単離された３つのｓＴＡ（ＤＡＰＧ－ＯＮ２－１Ｅ、ＨＳＬ－ＯＮ２－４Ｆ、およびＴｅｔ－ＯＮ１－１１Ｆ）を酵母の異なる染色体に統合した（図３Ａ）。得られた株を、それぞれのｓｙｎＰの下流にｇｆｐ遺伝子がクローニングされたプラスミド（ｐｔｅｔＯ７、ｐｐｈｌＯ６、およびｐｌｕｘＯ５）で形質転換した。なお、ｓｙｎＰの５００以上上流のベクター配列に含まれる潜在的なプロモーター配列は削除し、ｐｈｌＯおよびｌｕｘＯの繰り返し数を増加させた。得られた細胞のＧＦＰ蛍光は、それらの同族の誘導剤の存在下でのみ誘導され、１０２以上の因子によって誘導された（図３Ｂ）。これらの合成プロモーターはいずれもストリンジェントであり、すなわち、誘導剤が存在しない場合には低い基底ＴＢＧ発現を示した。
【0081】
これらのスイッチをβ－カロテン生合成経路の調節因子として利用することで、直交的な調節能を利用することを試みた。そのために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｂｔｓ１ｐを用い、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｏｕｓのＣｒｔＹＢおよびＣｒｔＩタンパク質と組み合わせた３つの酵素の作用による９段階のプロセスでβ－カロテンの合成を行った（図３Ｃ）。
【0082】
３つの遺伝子（ＢＴＳ１、ｃｒｔＹＢ、およびｃｒｔＩ）をすべて発現するプラスミドを構成プロモーターの制御下で酵母を形質転換すると、誘導剤の有無にかかわらず、酵母はβ－カロテンを産生した（図３Ｄ）。ＢＴＳ１とｃｒｔＹＢのプロモーターをそれぞれｐｐｈｌＯ６とｐｔｅｔＯ７で置換した。これらの３つの遺伝子のすべてが発現する必要があったので、β－カロテン産生は、ＤＡＰＧとＤｏｘの両方の存在下でのみ期待された（ＡＮＤ－ゲート制御）。しかし、ｐｔｅｔＯ７プロモーターによる漏出発現は、おそらくＣｒｔＹＢの強力な触媒活性のために、無視できないことが判明し、Ｄｏｘの非存在下では有意な誤った色素沈着をもたらした。この漏出発現は、ｃｒｔＹＢを制御するために使用される遺伝子スイッチをｐｔｅｔＯ７からｐｌｕｘＯ５に変換することによって緩和され、β－カロテン生合成経路はＨＳＬとＤＡＰＧの組み合わせによってＡＮＤゲート制御下に置かれた。この株では、β－カロテンの生合成はＤＡＰＧとＨＳＬの両方の存在下でのみ見られるという、期待されたＡＮＤゲートの挙動が観察された。同様の戦略を、β－カロテン生合成経路をＡＮＤゲート下に配置した株の構築においても採用した。
【0083】
図３に新たに開発した遺伝子スイッチを用いたＦＰＰからβ－カロテンへのフラックス制御を示した。図３Ａでは、カロテノイド生合成のＡＮＤゲート制御に用いた酵母株を示す。ＤＡＰＧ－ＯＮ２－１Ｅ、ＨＳＬ－ＯＮ２－４Ｆ、およびＴｅｔ－ＯＮＫ８Ｎ，Ｌ１３１Ｌスイッチで使用するためのｓＴＡを発現する３つのプラスミドを染色体統合した。各ｓｙｎＰの下流の遺伝子（ｐｐｈｌＯ６、ｐｔｅｔＯ７、およびｐｌｕｘＯ５）は、対応する誘導剤（それぞれ、ＤＡＰＧ、Ｄｏｘ、およびＨＳＬ）の存在下でのみ発現した。図３Ｂに、Ｄｏｘ、ＤＡＰＧ、およびＨＳＬを用いた直交ＧＦＰ発現制御をフローサイトメトリーで測定した結果を示す。図３Ｃにβ－カロテンへの合成経路を示す。ＦＰＰはファルネシル二リン酸を、ＧＧＰＰはゲラニルゲラニル二リン酸を示す。図３Ｄに、定常的なβ－カロテン生合成とＡＮＤゲート制御によるβ－カロテン生合成の模式図を示した。左図に示す組み合わせで構成的プロモーターまたはｓｙｎＰ（ｐｐｈｌＯ６、ｐｔｅｔＯ７、およびｐｌｕｘＯ５）の制御下で（ＢＴＳ１、ｃｒｔＹＢ、およびｃｒｔＩ）を発現する酵母株（右図）の細胞ペレットを示す。これらの菌株を、異なる組み合わせの誘導剤（Ｄｏｘ、ＤＡＰＧ、およびＨＳＬ）を含む液体培地に接種し、３０℃で２４時間培養した。誘導剤の濃度は、ＤＡＰＧ（３μＭ）、ＨＳＬ（３μＭ）、およびＤｏｘ（１０μｇ／ｍＬ）であった。
（実施例６：ピキア酵母での遺伝子スイッチの開発）
本実施例ではピキア酵母を用いて遺伝子スイッチを開発した。具体的には、図６Ａに示すとおり、ＤＡＰＧ応答性細菌リプレッサー（ＰｈｌＦ）をＶＰ４８活性化ドメインおよび核局在化シグナル（ＮＬＳ）と融合させて人工の転写活性化因子（ｒＰｈｌＴＡ）を生成し、ＧＡＰプロモータとＡＯＸ１ターミネータの間にクローニングした。またＰｈｌＦのオペレーター（ｐｈｌＯ）を１個あるいはタンデムに１８個つなげたものを、ＡＯＸ１ ｃｏｒｅプロモータに融合させ、合成プロモーター（ｐｐｈｌＯ１およびｐｐｈｌＯ１８）を作製し、ＥＧＦＰ遺伝子の上流にクローニングした。ＥＧＦＰの下流にはＡＯＸ１ターミネータを配置した。以上のｒＰｈｌＴＡの発現カセットと人工プロモータカセットを、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ ＣＢＳ ７４３５株の Ｔ３８４７３とＡＲＧ４座位に組み込んだ（図６Ａ）。
（実施例６：ピキア酵母での遺伝子スイッチの開発）
本実施例ではピキア酵母を用いて遺伝子スイッチを開発した。具体的には、図６Ａに示すとおり、ＤＡＰＧ応答性細菌リプレッサー（ＰｈｌＦ）をＶＰ４８活性化ドメインおよび核局在化シグナル（ＮＬＳ）と融合させて人工の転写活性化因子（ｒＰｈｌＴＡ）を生成し、ＧＡＰプロモータとＡＯＸ１ターミネータの間にクローニングした。またＰｈｌＦのオペレーター（ｐｈｌＯ）を１個あるいはタンデムに１８個つなげたものを、ＡＯＸ１ ｃｏｒｅプロモータに融合させ、合成プロモーター（ｐｐｈｌＯ１およびｐｐｈｌＯ１８）を作製し、ＥＧＦＰ遺伝子の上流にクローニングした。ＥＧＦＰの下流にはＡＯＸ１ターミネータを配置した。以上のｒＰｈｌＴＡの発現カセットと人工プロモータカセットを、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ ＣＢＳ ７４３５株の Ｔ３８４７３とＡＲＧ４座位に組み込んだ（図６Ａ）。
【0084】
その結果、図６Ｂに示すとおり、ｒＰｈｌＴＡをＡＲＧ４座位，人工プロモータｐｐｈｌＯ１またはｐｐｈｌＯ１８を含むＥＧＦＰカセットをＴ３８４７３座位に組み込んだ場合において，それぞれおよそ６００および３０００倍のＳ／Ｎ比を示した。これは従来の天然のプロモータの性能と匹敵し、さらに培地成分（主に糖源）の制約がなく、また従来の低性能の人工プロモータと比較して極めて高いＳ／Ｎ比を示すことがわかった。
【0085】
図６Ｃに示すとおり、ｒＰｈｌＴＡをＴ３８４７３座位、人工プロモータｐｐｈｌＯ１またはｐｐｈｌＯ１８を含むＥＧＦＰカセットをＴ３８４７３座位に組み込んだ場合では、ＤＡＰＧ ０μＭのときのＧＦＰ発現が大きく増加し、Ｓ／Ｎ比がお（約１．６ｋｂｐ）または部分（１ｋｂｐ）よそ７および３００倍にまで低下した。
【0086】
ＡＲＧ４遺伝子の全部（約１．６ｋｂｐ）または部分（１ｋｂｐ）を、人工プロモータｐｐｈｌＯ１またはｐｐｈｌＯ１８の上流にクローニングすると、図６Ｄに示すとおり、ＤＡＰＧ ０μＭのときの発現量のＧＦＰ発現のみが低下し、ｐｐｈｌＯ１を用いた場合において、Ｓ／Ｎ比が３００倍に回復した。このことから、人工プロモータの上流に１ｋｂｐ以上の配列を挿入しておくことが、導入されるゲノム上の座位に依らず高いＳ／Ｎ比を実現するために必要であることがわかった。図６Ｅに示すとおり、同様の効果はｐｈｌＯのコピー数を４８に増やし、ｐｈｌＯのタンデムリピート全体で約１．６ｋｂｐにまで伸ばしたときにも確認され、３０００倍を超えるＳ／Ｎ比を示すことがわかった。
【0087】
ピキア酵母を含む酵母用の遺伝子スイッチは、人工の転写活性化因子だけでなく、ＶＰ１６の代わりに転写抑制モチーフ、例えばＭｘｉ１（転写抑制因子）を融合することで、制御様式を反転することができる。
【0088】
ピキア酵母用の遺伝子スイッチでは、人工プロモータとして、ＧＡＬ１ｃｏｒｅを用いるよりも、ＡＯＸ１ｃｏｒｅやＤＡＳ１ｃｏｒｅを用いたほうが効率よく遺伝子の発現を制御することができる。ピキア酵母においては、ＧＡＬ１ｃｏｒｅを用いた人工プロモーターは活性が極めて低く、ピキア酵母由来のＡＯＸ１やＤＡＳ１（強力なメタノール誘導プロモーター）やＧＡＰなどのコアプロモーターに変えることでＯＮ（遺伝子発現誘導）の際の値が極めて大きくなる。
【0089】
また上記のとおり、ｐｈｌＯのコピー数を４８に増やした場合には高いＳ／Ｎ比を達成している一方で、１、６、１２、１８、２４コピーでも応答性は高い。ＯＮ（遺伝子発現誘導）の際の最大の発現量は大きく変わらないものの、ｐｈｌＯのコピー数が増えるにつれて、漏出発現が大きく低減することがわかった（図６Ｂ、図６Ｅ、図７）。これはプロモーター上流のＤＮＡの長さが漏出発現の低減に影響している可能性がある。上流からの何等かの転写が漏出発現の原因となっており、上流からの距離が遠くなるとその影響が低減され、漏出発現が減少していると考えられる。このような上流配列に起因する漏出発現については、上流配列を変更したり、または上流からの距離を遠くさせるなどによって、漏出発現のほぼない人工プロモーターを開発することができる。
【0090】
また、ｐｈｌＯタンデムコピー（４８コピー）の代わりに、ＡＲＧ４をオペレーター配列の上流に置いても同じように漏出発現が極めて小さくなる。これはＡＲＧ４がｉｎｓｕｌａｔｏｒとして機能していると考えられる。ＡＲＧ４を１０００ｂｐくらいまで削ってもｉｎｓｕｌａｔｏｒとして機能する。ｐｈｌＯ１でも６００倍程度のＳ／Ｎ比を達成することができる（図６Ｃ、図６Ｄ）。オペレーターのコピー数を増やして配列を長くしても同じように漏出発現が低減することから、上流からの距離の長さが影響していると考えられる。
【0091】
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【0092】
本開示の遺伝子スイッチは、有用タンパク質の大量生産や毒性を示すタンパク質などの発現制御、代謝化合物の簡易的な濃度測定などに利用できる。これにより、バイオ医薬品や産業酵素の生産性を大きく高めたり、菌株構築の時間を圧倒的に短縮させることができ、高度な代謝や遺伝子ネットワーク制御を行うことができる。そのため、特に代謝工学や合成生物学分野において産業応用が期待される。
【配列表フリーテキスト】
【0093】
配列番号１：ＤＡＰＧ応答型の転写因子（ＰｈｌＦ）のアミノ酸配列
配列番号２：Ｄ－ｃａｍｐｈｏｒ応答型またはＢｏｒｎｅｏｌ応答型の転写因子（ＣａｍＲ）のアミノ酸配列
配列番号３：ＨＳＬ応答型の転写因子（ＬｕｘＲ）のアミノ酸配列
配列番号４：Ｄｏｘ応答型の転写因子（ＴｅｔＲ）のアミノ酸配列
配列番号５：転写因子（ＰｈｌＦ）の核酸配列
配列番号２：Ｄ－ｃａｍｐｈｏｒ応答型またはＢｏｒｎｅｏｌ応答型の転写因子（ＣａｍＲ）のアミノ酸配列
配列番号３：ＨＳＬ応答型の転写因子（ＬｕｘＲ）のアミノ酸配列
配列番号４：Ｄｏｘ応答型の転写因子（ＴｅｔＲ）のアミノ酸配列
配列番号５：転写因子（ＰｈｌＦ）の核酸配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】