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特開2022-89964小児及び若年成人のデングウイルスに対するワクチンの組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022089964
(43)【公開日】2022-06-16
(54)【発明の名称】小児及び若年成人のデングウイルスに対するワクチンの組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/12 20060101AFI20220609BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220609BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20220609BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20220609BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20220609BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220609BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220609BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220609BHJP
C12N 15/40 20060101ALN20220609BHJP
【ＦＩ】
A61K39/12
A61K35/76
A61K47/10
A61K47/26
A61K47/42
A61P31/14
A61P37/04
A61K9/08
C12N15/40 ZNA
【審査請求】有
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022069423
(22)【出願日】2022-04-20
(62)【分割の表示】P 2018553428の分割
【原出願日】2017-04-13
(31)【優先権主張番号】62/322,167
(32)【優先日】2016-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】514313764
【氏名又は名称】タケダ ワクチン，インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＴＡＫＥＤＡ ＶＡＣＣＩＮＥＳ，ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ウォレス、デレク
(72)【発明者】
【氏名】ボスレゴ、ジョン
(57)【要約】
【課題】２～１７歳の小児又は若年成人、あるいは１～１１歳の小児をデングウイルス感染症に対して治療するための医薬組成物を提供する。
【解決手段】医薬組成物は、弱毒生デング－２ウイルス、デング－２／１キメラ、デング－２／３キメラ、及びデング－２／４キメラを含む四価ワクチン調合物を含む。上記医薬組成物は、第１の用量を０日目に、及び第２の用量を、第１の投与から９０日以内又は３ヵ月後に皮下投与される。医薬組成物中の弱毒生デング－２ウイルスの濃度は、他のデングウイルス血清型のうちの２つ以上のｌｏｇプラーク形成単位（ＰＦＵ）よりも少なくとも２分の１ｌｏｇＰＦＵ低いか、四価ワクチン調合物中のデング－２／３キメラの濃度は、弱毒生デング－２ウイルスよりもＰＦＵで少なくとも２分の１ｌｏｇ高い。
【選択図】図１３Ｂ
【解決手段】医薬組成物は、弱毒生デング－２ウイルス、デング－２／１キメラ、デング－２／３キメラ、及びデング－２／４キメラを含む四価ワクチン調合物を含む。上記医薬組成物は、第１の用量を０日目に、及び第２の用量を、第１の投与から９０日以内又は３ヵ月後に皮下投与される。医薬組成物中の弱毒生デング－２ウイルスの濃度は、他のデングウイルス血清型のうちの２つ以上のｌｏｇプラーク形成単位（ＰＦＵ）よりも少なくとも２分の１ｌｏｇＰＦＵ低いか、四価ワクチン調合物中のデング－２／３キメラの濃度は、弱毒生デング－２ウイルスよりもＰＦＵで少なくとも２分の１ｌｏｇ高い。
【選択図】図１３Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
２～１７歳の小児又は若年成人、あるいは１～１１歳の小児をデングウイルス感染症に対して治療する方法に使用するための、弱毒生デング－２ウイルス、デング－２／１キメラ、デング－２／３キメラ、及びデング－２／４キメラを含む、デングウイルスの４つ全ての血清型を含む四価ワクチン調合物を含む医薬組成物であって、前記方法は、
前記医薬組成物を、前記２～１７歳の小児又は若年成人、あるいは前記１～１１歳の小児に対して皮下投与することを含み、
前記医薬組成物の投与が、前記医薬組成物の第１の用量を０日目に投与すること、及びデングウイルスに対する同じ医薬組成物の第２の用量を、第１の投与から９０日以内又は３か月後に投与することからなり、
前記医薬組成物が、前記２～１７歳の小児又は若年成人、あるいは前記１～１１歳の小児においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導し、
前記医薬組成物中の弱毒生デング－２ウイルスの濃度は、他のデングウイルス血清型のうちの２つ以上のｌｏｇプラーク形成単位（ＰＦＵ）よりも少なくとも２分の１ｌｏｇＰＦＵ低いか、
四価ワクチン調合物中のデング－２／３キメラの濃度は、弱毒生デング－２ウイルスよりもＰＦＵで少なくとも２分の１ｌｏｇ高い、医薬組成物。
前記医薬組成物を、前記２～１７歳の小児又は若年成人、あるいは前記１～１１歳の小児に対して皮下投与することを含み、
前記医薬組成物の投与が、前記医薬組成物の第１の用量を０日目に投与すること、及びデングウイルスに対する同じ医薬組成物の第２の用量を、第１の投与から９０日以内又は３か月後に投与することからなり、
前記医薬組成物が、前記２～１７歳の小児又は若年成人、あるいは前記１～１１歳の小児においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導し、
前記医薬組成物中の弱毒生デング－２ウイルスの濃度は、他のデングウイルス血清型のうちの２つ以上のｌｏｇプラーク形成単位（ＰＦＵ）よりも少なくとも２分の１ｌｏｇＰＦＵ低いか、
四価ワクチン調合物中のデング－２／３キメラの濃度は、弱毒生デング－２ウイルスよりもＰＦＵで少なくとも２分の１ｌｏｇ高い、医薬組成物。
【請求項2】
弱毒生デング－２ウイルスは、ＤＥＮＶ－２ １６６８１から誘導されたＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３変異体の形態にあり、ＮＳ１－５３、５’ＮＣ－５７、及びＮＳ３－２５０における三重突然変異を有し、ＮＳ３タンパク質のアミノ酸２５０位にバリン残基を含み、
各キメラはウイルス骨格として前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムと、前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムのカプシド、プレ膜／膜又はエンベロープをコードする１つ以上の構造タンパク質遺伝子か、あるいはＤＥＮ－１、ＤＥＮ－３又はＤＥＮ－４に由来する１つ又は複数の対応する構造タンパク質遺伝子で置換されているそれらの組合せとを有する、請求項１に記載の医薬組成物。
各キメラはウイルス骨格として前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムと、前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムのカプシド、プレ膜／膜又はエンベロープをコードする１つ以上の構造タンパク質遺伝子か、あるいはＤＥＮ－１、ＤＥＮ－３又はＤＥＮ－４に由来する１つ又は複数の対応する構造タンパク質遺伝子で置換されているそれらの組合せとを有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
デング－２／１キメラは、ＮＳ２Ａタンパク質のアミノ酸１１６位がロイシン残基を有し、ＮＳ２Ｂタンパク質のアミノ酸９２位がアスパラギン酸残基を有するようにさらに２つの突然変異を有し、
弱毒生デング－２ウイルスは、ｐｒＭタンパク質のアミノ酸５２位がグルタミン酸残基を有し、ＮＳ５タンパク質のアミノ酸４１２位がバリン残基を有するようにさらに２つの突然変異を有し、
デング－２／３キメラは、ウイルス骨格として前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムを有し、かつ、野生型ＤＥＮ－３ １６５６２に由来する対応するｐｒＭ－Ｅ遺伝子で置換された前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムのｐｒＭ－Ｅ遺伝子（ｎｔ－４５７～－２３７３）を有し、前記デング－２／３キメラは、前記野生型ＤＥＮ－３ １６５６２に由来する対応するｐｒＭ－Ｅ遺伝子に、Ｅタンパク質のアミノ酸２２３位がセリン残基を含むようにさらに１つの突然変異を有し、
デング－２／４キメラは、ＮＳ２Ａタンパク質のアミノ酸６６位がグリシン残基を含み、ＮＳ２Ａタンパク質のアミノ酸２１位がバリン残基を含むようにさらに２つの突然変異を有し、デング－２／４キメラは、ＮＳ２Ａタンパク質のアミノ酸９９位に関して、アルギニン又はリジン残基を含む混合遺伝子型である、請求項２に記載の医薬組成物。
弱毒生デング－２ウイルスは、ｐｒＭタンパク質のアミノ酸５２位がグルタミン酸残基を有し、ＮＳ５タンパク質のアミノ酸４１２位がバリン残基を有するようにさらに２つの突然変異を有し、
デング－２／３キメラは、ウイルス骨格として前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムを有し、かつ、野生型ＤＥＮ－３ １６５６２に由来する対応するｐｒＭ－Ｅ遺伝子で置換された前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムのｐｒＭ－Ｅ遺伝子（ｎｔ－４５７～－２３７３）を有し、前記デング－２／３キメラは、前記野生型ＤＥＮ－３ １６５６２に由来する対応するｐｒＭ－Ｅ遺伝子に、Ｅタンパク質のアミノ酸２２３位がセリン残基を含むようにさらに１つの突然変異を有し、
デング－２／４キメラは、ＮＳ２Ａタンパク質のアミノ酸６６位がグリシン残基を含み、ＮＳ２Ａタンパク質のアミノ酸２１位がバリン残基を含むようにさらに２つの突然変異を有し、デング－２／４キメラは、ＮＳ２Ａタンパク質のアミノ酸９９位に関して、アルギニン又はリジン残基を含む混合遺伝子型である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
デング－２／１キメラはウイルス骨格として前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムを有し、かつ野生型ＤＥＮ－１ １６００７に由来する対応するｐｒＭ－Ｅ遺伝子で置換された前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムのｐｒＭ－Ｅ遺伝子（ｎｔ－４５７～－２３７９）を有し、
デング－２／３キメラはウイルス骨格として前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムを有し、かつ野生型ＤＥＮ－３ １６５６２に由来する対応するｐｒＭ－Ｅ遺伝子で置換された前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムのｐｒＭ－Ｅ遺伝子（ｎｔ－４５７～－２３７３）を有し、
デング－２／４キメラはウイルス骨格として前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムを有し、かつ野生型ＤＥＮ－４ １０３６に由来する対応するｐｒＭ－Ｅ遺伝子で置換された前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムのｐｒＭ－Ｅ遺伝子（ｎｔ－４５７～－２３７９）を有する、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
デング－２／３キメラはウイルス骨格として前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムを有し、かつ野生型ＤＥＮ－３ １６５６２に由来する対応するｐｒＭ－Ｅ遺伝子で置換された前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムのｐｒＭ－Ｅ遺伝子（ｎｔ－４５７～－２３７３）を有し、
デング－２／４キメラはウイルス骨格として前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムを有し、かつ野生型ＤＥＮ－４ １０３６に由来する対応するｐｒＭ－Ｅ遺伝子で置換された前記ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ゲノムのｐｒＭ－Ｅ遺伝子（ｎｔ－４５７～－２３７９）を有する、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記デング－２／１キメラ：前記弱毒生デング－２ウイルス：前記デング－２／３キメラ：前記デング－２／４キメラの比が、４：４：５：５ｌｏｇプラーク形成単位（ＰＦＵ）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記デング－２／１キメラ：前記弱毒生デング－２ウイルス：前記デング－２／３キメラ：前記デング－２／４キメラの比が、５：４：５：５ｌｏｇＰＦＵである、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
１．０×１０３から５×１０５ＰＦＵまでの濃度を有するデング－２／１キメラ、
１．０×１０３から５×１０５ＰＦＵまでの濃度を有する弱毒生デング－２ウイルス、
５．０×１０３から５×１０５ＰＦＵまでの濃度を有するデング－２／３キメラ、及び
１．０×１０４から５×１０６ＰＦＵまでの濃度を有するデング－２／４キメラの少なくとも１つを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
１．０×１０３から５×１０５ＰＦＵまでの濃度を有する弱毒生デング－２ウイルス、
５．０×１０３から５×１０５ＰＦＵまでの濃度を有するデング－２／３キメラ、及び
１．０×１０４から５×１０６ＰＦＵまでの濃度を有するデング－２／４キメラの少なくとも１つを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
２．５×１０４ＰＦＵのデング－２／１キメラ、
６．３×１０３ＰＦＵの弱毒生デング－２ウイルス、
３．２×１０４ＰＦＵのデング－２／３キメラ、及び
４．０×１０５ＰＦＵのデング－２／４キメラを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
６．３×１０３ＰＦＵの弱毒生デング－２ウイルス、
３．２×１０４ＰＦＵのデング－２／３キメラ、及び
４．０×１０５ＰＦＵのデング－２／４キメラを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
デングウイルスの分解を低減する安定化緩衝液を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記安定化緩衝液が、トレハロース及びアルブミン及び任意選択でポロキサマー４０７を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
ポロキサマー４０７が、０．１から３．０％（ｗ／ｖ）までの濃度を有し、トレハロースが、５．０から５０％（ｗ／ｖ）までの濃度を有し、アルブミンが、０．０１から３．０％（ｗ／ｖ）までの濃度を有する、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記小児又は若年成人が、前記医薬組成物の投与前に、デングウイルスに対して血清陰性又は未感作である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記小児又は若年成人が、前記医薬組成物の投与前に、デングウイルスに対して血清陽性である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書で開示された実施形態は、約１歳から約２０歳までの小児又は若年成人に、４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導するための組成物、方法、及び使用に関する。幾つかの実施形態は、これらに限定されないが、４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導するためのワクチン組成物に、単独で又は組合せのいずれかで使用することができるキメラ及び非キメラフラビウイルスウイルス構築体を含んでいてもよい組成物に関する。ある実施形態では、組成物は、小児及び若年成人のデング感染から保護を向上させるために、デング－１（ＤＥＮ－１）ウイルス、デング－２（ＤＥＮ－２）ウイルス、デング－３（ＤＥＮ－３）ウイルス、及び／又はデング－４（ＤＥＮ－４）ウイルス等の、デングウイルスの１つよりも多くの血清型の構築体を、種々の濃度又は比で含んでいてもよい。他の実施形態は、単一の、二重の、又は他の投与レジメンを使用して、キメラデング構築体及び弱毒生デングウイルスを含んでいてもよいワクチン組成物を投与するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
デング熱は、デングウイルスの感染により引き起こされる蚊媒介性疾患である。デングウイルス感染は、突然の高熱、頭痛、関節及び筋肉痛、悪心、嘔吐、並びに発疹を含む、衰弱性及び疼痛性の症状をもたらす場合がある。現在まで、デングウイルスは、４つの血清型：デング－４（ＤＥＮ－４）と共に、デング－１（ＤＥＮ－１）、デング－２（ＤＥＮ－２）、又はデング－３（ＤＥＮ－３）が特定されている。今後、他のサブタイプが発見される可能性もある（例えば、ＤＥＮ－５）。また、デングウイルス血清型１～４は、デング出血熱（ＤＨＦ）及びデングショック症候群（ＤＳＳ）を引き起こす場合がある。最も重症の場合には、ＤＨＦ及びＤＳＳは、命にかかわる場合がある。デングウイルスは、毎年、５千万～１億例の衰弱性デング熱、５００，０００例のＤＨＦ／ＤＳＳ、及び２０，０００例を超える死亡を引き起こしており、その大部分が小児である。現在まで、デング熱からの保護に有効なワクチン及びこの疾患の薬物治療は存在しない。蚊を防除する努力は、流行地域でのデング熱流行の予防、又はこの疾患の更なる地理的蔓延の予防の効果が得られていない。３５億人がデングウイルス感染により脅かされていると推測される。加えて、デングウイルスは、アジア、中南米、及びカリブ海等の流行地域への旅行者の発熱の主要な原因である。加えて、ＤＨＦ／ＤＳＳは、幾つかのアジア及びラテンアメリカ諸国における小児の重度疾患及び死の主要な原因である。
【0003】
４つのデングウイルス血清型は全て、世界の熱帯地方の至る所で流行しており、世界的中の熱帯地方において、ヒトに対する最も重要な蚊媒介性ウイルス脅威である。デングウイルスは、主にネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）によりヒトに伝染する。１つのデングウイルス血清型による感染は、その血清型による再感染からの保護を生涯にわたってもたらすが、他の３つのデングウイルス血清型の１つによる二次感染を予防しない。実際、１つのデングウイルス血清型による以前の感染は、異なる血清型による二次感染時に、重度疾患（ＤＨＦ／ＤＳＳ）のリスク増加をもたらす。特に小児及び若年成人において有効なワクチンの開発は、この全地球的な疾患を予防及び管理するための重要な手法である。
【発明の概要】
【0004】
本明細書で開示された実施形態は、キメラデングウイルス構築体の組成物、方法、及び使用に関する。幾つかの実施形態では、組成物は、単独で又は弱毒生デングウイルスと組み合わせて、少なくとも１つの他のデングウイルス血清型に由来する構造遺伝子を有する弱毒デングウイルス骨格を有するキメラデングウイルス構築体を含んでいてもよい。他の実施形態は、少なくとも１つの更なるデングウイルス血清型に対する構造エレメントを含む１つ又は複数のキメラデングウイルスと組み合わせた、少なくとも１つの弱毒生ウイルスに関する。他の実施形態は、改変ＤＥＮ－２骨格（例えば、Ｐ１（継代－１）の開始骨格としてのＰＤＫ－５３、及びＰ２、Ｐ３．．．Ｐ８．．．Ｐ１０等と表示されている、継代変異及び選択を使用した改変ＰＤＫ－５３）、及びＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３、又はＤＥＮ－４の１つ又は複数の構造成分を有するキメラデングウイルスの組成物を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、対象に導入すると対象に１つ又は複数のデングウイルスに対する免疫応答を引き起こす免疫原性組成物を生成することができる。したがって、本明細書で企図された構築体を生成及び継代することができ、継代の各々は、薬学的に許容されるワクチン組成物に有用であることが企図される弱毒デングウイルスを提供する。
【0005】
本明細書で開示された実施形態は、約１歳から約４５歳までの小児又は若年成人において、４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導するための組成物、方法、及び使用に関する。現行の製剤は、幼小児には有効ではなく、全年齢群のデング感染に対して有用なデングワクチンの必要性は満たされていない。これらの実施形態によると、本明細書で開示された組成物及び方法は、約１から２０歳まで、約１から１５歳まで、約１から１１歳まで、又は約２から約９歳まで、又は約１から約５歳までの小児に有用である。
【0006】
ある実施形態では、ワクチンに有用なデングウイルス血清型のキメラデングウイルス構築体は、継代８（Ｐ８）弱毒生ウイルス、又は配列番号１、３、５、及び７により特定される核酸配列若しくは配列番号２、４、６、及び８により示されるポリペプチド配列を有するキメラウイルスを含んでいてもよい。本明細書では、本明細書に記載の弱毒生ウイルスのいずれかの継代のいずれかは、示されているデングウイルス血清型（例えば、血清型１～４）に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物に使用することができることが企図される。これらの実施形態によると、Ｐ－８単離弱毒生ウイルスを含む免疫原性組成物を対象に投与し、選択した構築体に応じて、１つ又は複数のデングウイルス血清型に対する免疫原性応答を誘導することができる。加えて、弱毒生ウイルスは、これらキメラウイルスの１つ又は複数と組み合わせてもよい。これは、その後の各細胞継代（例えば、アフリカミドリザルベロ細胞生産、以下：ベロ細胞、又は他の適切な細胞株）で単離／生産される弱毒生ウイルスの各々が企図される。本明細書では、デングウイルスを生産することが可能な任意の細胞株（例えば、ＧＭＰ準拠）が、ウイルス構築体のいずれかを製造規模で継代するのに有用であることが企図されるか、又は本明細書では、必要に応じてデングウイルスに対するワクチン又は免疫原性組成物におけるその後の使用が企図される。
【0007】
他の実施形態では、本明細書で企図された組成物は、ジカウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、又は任意の他のフラビウイルスキメラ構築体及び／又は弱毒生ウイルス等の他のフラビウイルスに対する他の免疫原性組成物と組み合わせることができる。ある実施形態では、複数のフラビウイルスに対して単一の組成部物を使用してもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示された組成物は、ワクチン組成物が、デングウイルス構築体及び弱毒生デングウイルスに限定される場合であっても、ジカウイルスに対する免疫応答を誘導することができる場合がある。
【0008】
ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３、及び／又はＤＥＮ－４の１つ又は複数に対するキメラデングウイルスを、単独で又は弱毒生デングウイルス組成物と組み合わせて含んでいてもよい。
【0009】
他の実施形態では、構築体は、対象に導入されると、ウイルスの弱毒化又は安全性に影響を及ぼさずに増殖又は生産を増加させる適応的突然変異をウイルスの構造又は非構造領域に有する構築体を含んでいてもよい。ある実施形態では、企図されたキメラデングウイルス構築体はいずれも、骨格として使用される特定の突然変異を有する弱毒生ＤＥＮ－２ウイルスであって、他のデングウイルス血清型のｐｒＭ（プレ膜）構造タンパク質及びＥ（エンベロープ）構造タンパク質の１つ又は複数の構造タンパク質を更に含んでいてもよい弱毒生ＤＥＮ－２ ＰＤＫウイルスを含んでいてもよい。加えて、ＤＥＮ－２骨格は、投与時に所定の組成物に対する対象の免疫応答を増強するために、更なる突然変異又は突然変異の復帰突然変異を含んでいてもよい（例えば、キメラデングウイルス２／１、２／３、又は２／４）。
【0010】
幾つかの実施形態では、構造タンパク質遺伝子は、免疫原性を向上させるために、１つ又は２つの復帰突然変異を有するＤＥＮ－２骨格にＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３、又はＤＥＮ－４のｐｒＭ及びＥ遺伝子を含んでいてもよい。例えば、ある実施形態では、デング構築体は、ＤＥＮ－２骨格が、安全であり、免疫応答の誘導に効果的であることが以前に実証されているＤＥＮ－２弱毒生ウイルスから野生型ＤＥＮ－２への１つ又は複数の復帰突然変異（例えば、非コード領域（ＮＣＲ）若しくは非構造領域（ＮＳ１等）に、又はＰ１若しくは他の以前の継代ウイルスに見出されない更なる突然変異）を有する、ＴＤＶ－１－Ａ、ＴＤＶ－２－Ｆ、ＴＤＶ－３－Ｆ、及びＴＤＶ－４－Ｆと称する構築体を含んでいてもよい（実施例セクションを参照）。本出願のＤＥＮ－２弱毒生ウイルスは、最初に使用されたＤＥＮ－２弱毒生ウイルスの改良版である。本明細書で開示された幾つかの実施形態のキメラ構築体は、第２のデングウイルス血清型の１つ又は複数の構造タンパク質を有する改変弱毒ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３骨格を含んでいてもよく、上記構造タンパク質は、キメラ構築体に対する免疫原性応答を増加させるための更なる突然変異を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、弱毒ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３が獲得したある突然変異は、ワクチン安全性及び弱毒化に影響を及ぼさずに、免疫原性の増加、増殖の増加、プラークサイズの増加をもたらすことができ、弱毒生ウイルスの増殖及び／又は複製に影響を及ぼすことができるＰ１構築体とは異なるキメラ構築体を生産するように、対照又は別のアミノ酸へと復帰していてもよい。
【0011】
他の実施形態では、弱毒生ＤＥＮ－２ゲノムを使用して、デングウイルス血清型１（ＤＥＮ－１）、デングウイルス血清型３（ＤＥＮ－３）、及びデングウイルス血清型４（ＤＥＮ－４）のキメラ構築体であって、ＤＥＮ－２ウイルスゲノムの１つ又は複数の構造タンパク質遺伝子が、それぞれＤＥＮ－１、ＤＥＮ－３、又はＤＥＮ－４の１つ又は複数の構造タンパク質遺伝子により置換されていてもよいキメラ構築体を生成することができる。幾つかの実施形態では、構造タンパク質は、第３のデングウイルスのＣ、ｐｒＭ、又はＥタンパク質を含んでいてもよい。ある実施形態では、構造タンパク質遺伝子は、ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－３、又はＤＥＮ－４のｐｒＭ及びＥ遺伝子を含んでいてもよい。これらの実施形態によると、これらキメラウイルスは、親弱毒ＤＥＮ－２の弱毒化表現型を保持しつつ、ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－３、又はＤＥＮ－４の表面抗原を発現することができる。更に、小児及び若年成人のワクチンに有用な本明細書で開示されたキメラ構築体は、弱毒ＤＥＮ－２ウイルスが骨格として使用されている、ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－３、及びＤＥＮ－４の表面抗原を発現するＤＥＮ－４、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－１、及びＤＥＮ－３のキメラ構築体を含んでいてもよい。
【0012】
ある実施形態では、本発明の組成物は、本明細書で開示された単一のキメラデングウイルス構築体、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含んでいてもよい組成物を含んでいてもよい。他の実施形態では、本明細書で開示された組成物は、２つ以上、又は３つ以上のキメラデングウイルス構築体、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含んでいてもよい。これらの実施形態によると、本明細書で企図された１つ又は複数のデングウイルスキメラ構築体は、１つ又は複数の弱毒生デングウイルスと組み合わせることができる。ある実施形態では、弱毒生ウイルスは、ＮＣＲ領域、ＮＳ１領域、又は他の領域における野生型アミノ酸への復帰突然変異により、本明細書で開示された製剤に有用な改良型弱毒生デングウイルス構築体の免疫応答が増加され、ウイルス増殖又は他の改良点が増加されている弱毒生ＤＥＮ－２ウイルスであってもよい。
【0013】
ある実施形態では、共通のＰＤＫ－５３ウイルス特異的遺伝子バックグラウンドが４つのＴＤＶ構築体ウイルスで共有されてもよい弱毒生デングウイルスは、ＤＥＮＶ－２のヌクレオチド５’ＮＣＲ－５７－Ｔ、ＮＳ１－５３－Ａｓｐ、及びＮＳ３－２５０－Ｖａｌの突然変異又は置換を含んでいてもよい。ｃＧＭＰ準拠で製造されるＴＤＶシードの、３つの弱毒化遺伝子座の遺伝子配列、並びにこれらワクチン候補の以前に確立されたｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ弱毒化表現型が、注意深くモニターされている。本明細書では、マスターウイルスシード（ＭＶＳ）並びにデングウイルスワクチン組成物の製造に有用なデングウイルスの他の関連継代を生成するための使用される戦略が開示される。これらＭＶＳは、臨床材料の製造、及び最終的には商業的ワクチンの供給に使用することができる。
【0014】
ある実施形態では、免疫原性組成物は、小児及び若年成人に、少なくとも３つ又は４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導することが可能な三価又は四価製剤を含んでいてもよい。例えば、免疫原性組成物は、４つのデングウイルス血清型の各々のプレマスターウイルスシード構築体、マスターウイルスシード（ＭＶＳ）構築体、ワーキングウイルスシード（ＷＶＳ）構築体、及びバルクウイルスシード（ＢＶＳ）構築体を含んでいてもよい。他の実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号９（プレマスター）、配列番号１１（ＭＶＳ）、配列番号１３（ＷＶＳ）、又は配列番号１５（ＢＶＳ）により表される、改変弱毒生デング－２ウイルス血清型をコードする核酸配列を有する１つ又は複数のポリヌクレオチド；改変弱毒生デング－２ウイルス血清型に由来する非構造タンパク質、及び配列番号１（プレマスター）、配列番号３（ＭＶＳ）、配列番号５（ＷＶＳ）、又は配列番号７（ＢＶＳ）により表される、デング－１ウイルス血清型に由来する構造タンパク質をコードする核酸配列を有するデング－１／デング－２キメラポリヌクレオチド；改変弱毒生デング－２ウイルス血清型に由来する非構造タンパク質、及び配列番号１７（プレマスター）、配列番号１９（ＭＶＳ）、配列番号２１（ＷＶＳ）、又は配列番号２３（ＢＶＳ）により表される、デング－３ウイルス血清型に由来する構造タンパク質をコードする核酸配列を有するデング－３／デング－２キメラポリヌクレオチド；並びに改変弱毒生デング－２ウイルス血清型に由来する非構造タンパク質、及び配列番号２５（プレマスター）、配列番号２７（ＭＶＳ）、配列番号２９（ＷＶＳ）、又は配列番号３１（ＢＶＳ）により表される、デング－４ウイルス血清型に由来する構造タンパク質をコードする核酸配列を有するデング－４／デング－２キメラポリヌクレオチドを含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、小児又は若年成人に、１つ、２つ、３つ、又は４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘発することが可能な免疫原性組成物が開示される。
【0015】
ある実施形態では、免疫原性組成物は、組成物中の改変弱毒生デング－２ウイルス血清型をコードするポリヌクレオチドの濃度比が、デングウイルスポリヌクレオチドの１つ又は複数のｌｏｇＰＦＵよりも、少なくとも２分の１～１ｌｏｇプラーク形成単位（ＰＦＵ）低い製剤を含んでいてもよい。他の実施形態では、免疫原性組成物は、組成物中の改変弱毒生デング－２ウイルス血清型をコードするポリヌクレオチドの濃度比が、ポリヌクレオチドの１つ又は複数のｌｏｇＰＦＵよりも、少なくとも１及び２分の１ｌｏｇプラーク形成単位（ＰＦＵ）低い、又は２若しくは３ｌｏｇプラーク形成単位（ＰＦＵ）以上低い製剤を含んでいてもよい。
【0016】
ある実施形態では、単独の又は他のウイルスワクチンと組み合わされているデングに対する免疫原性組成物は、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの混合物であってもよい。これらの実施形態によると、免疫原性組成物は、ポリヌクレオチドによりコードされる種々のポリペプチドを含むか又は含まずに、本明細書に記載のポリヌクレオチド又は他のフラビウイルスポリヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、ポリペプチドは、配列番号１０（プレマスター）、配列番号１２（ＭＶＳ）、配列番号１４（ＷＶＳ）、又は配列番号１６（ＢＶＳ）により表される、改変弱毒生デング－２ウイルス血清型に対応するポリペプチド；配列番号２（プレマスター）、配列番号４（ＭＶＳ）、配列番号６（ＷＶＳ）、又は配列番号８（ＢＶＳ）により表される、デング－１／デング－２キメラポリヌクレオチドに対応するポリペプチド；配列番号１８（プレマスター）、配列番号２０（ＭＶＳ）、配列番号２２（ＷＶＳ）、又は配列番号２４（ＢＶＳ）により表される、デング－３／デング－２キメラポリヌクレオチドに対応するポリペプチド；及び配列番号２６（プレマスター）、配列番号２８（ＭＶＳ）、配列番号３０（ＷＶＳ）、又は配列番号３２（ＢＶＳ）により表される、デング－４／デング－２キメラポリヌクレオチドに対応するポリペプチドを含んでいてもよい。
【0017】
ある実施形態では、本明細書で開示された免疫原性組成物は、デング－１／デング－２キメラの、改変弱毒生デング－２ウイルス血清型、デング－３／デング－２キメラ、デング－４／デング－２キメラに対する濃度比が４：４：５：５ｌｏｇプラーク形成単位（ＰＦＵ）であることを含む、種々の濃度比のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含んでいてもよい。他の実施形態では、デング－１／デング－２キメラの、改変弱毒生デング－２ウイルス血清型、デング－３／デング－２キメラ、デング－４／デング－２キメラに対する濃度比は、約５：４：５：５ｌｏｇＰＦＵであってもよい。本明細書で企図されている他の比としては、デング－３又はデング－４キメラ及び／又はデング－１の少なくとも１つと比較して、弱毒生デング－２及び／又はデング－１キメラウイルスが低減されている組成が挙げられる。更に他の実施形態では、四価調合比は、約５：３：５：５、３：３：５：５、又はある例では、製剤中により低い弱毒生デング－２若しくは低減された提示又は弱毒生デング－２及びデング－１／デング－２キメラを両方とも有する任意の比であってもよい。
【0018】
他の実施形態では、本明細書で開示された組成物は、本明細書で開示された１つ又は複数の免疫原性組成物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であってもよい。ある実施形態では、医薬組成物は、弱毒生デングウイルス並びに／又は１つ若しくは複数のデング血清型に対するポリヌクレオチド及びポリペプチドを両方とも有するデングキメラで構成されている免疫原性組成物を含んでいてもよい。
【0019】
他の実施形態は、小児及び若年成人のデングウイルス感染に対して有用な、少なくとも１つの本開示の免疫原性組成物と、少なくとも１つの容器を有するキットを含んでいてもよい。
【0020】
ある実施形態は、少なくとも１つ～４つ全てのデングウイルス血清型に対して、小児及び若年成人を免疫するための方法を含む。方法は、本明細書で開示された１つ又は複数の用量の医薬組成物を、対象に投与することを含んでいてもよい。これらの実施形態によると、こうした特徴を有する比は、対象に４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導する弱毒生ウイルス及び／又はキメラを含んでいてもよい。
【0021】
ある実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドに加えて、本明細書で開示されたポリヌクレオチドによりコードされる１つ又は複数のポリペプチドを含む免疫原性組成物を、小児又は若年成人に投与することを含んでいてもよい。方法は、配列番号１０（プレマスター）、配列番号１２（ＭＶＳ）、配列番号１４（ＷＶＳ）、又は配列番号１６（ＢＶＳ）により表されるポリペプチド；配列番号２（プレマスター）、配列番号４（ＭＶＳ）、配列番号６（ＷＶＳ）、又は配列番号８（ＢＶＳ）により表されるポリペプチド；配列番号１８（プレマスター）、配列番号２０（ＭＶＳ）、配列番号２２（ＷＶＳ）、又は配列番号２４（ＢＶＳ）により表されるポリペプチド；及び配列番号２６（プレマスター）、配列番号２８（ＭＶＳ）、配列番号３０（ＷＶＳ）、又は配列番号３２（ＢＶＳ）により表されるポリペプチドの１つ又は複数を含むポリペプチドを含んでいてもよい。ある実施形態では、方法は、本明細書で開示された免疫原性組成物により表される、４つの全てのデングウイルス血清型を有する免疫原性組成物を、約１歳から約２０歳までの範囲の対象に投与し、４つ全てのデングウイルス血清型（四価製剤）に対する免疫応答を対象に誘発することを含んでいてもよい。他の実施形態では、方法は、本明細書で開示された免疫原性組成物を、約１歳から約４５歳までの範囲の対象に投与することを含んでいてもよい。
【0022】
ある実施形態では、方法は、本開示の四価製剤の１つ又は複数の用量を、例えば、皮下、静脈内、皮内、経皮、経口、吸入、膣内、局所、鼻腔内、又は直腸を含む、任意の許容される手段により対象に投与することを含んでいてもよい。これらの実施形態によると、本明細書で開示された製剤は、単一用量で、２用量又はそれよりも多くの用量で、対象に投与することができる。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された免疫原性製剤は、互いに約９０日以内に、互いに約６０日以内に、互いに約３０日以内に、及び互いに約３０日未満以内に投与してもよい。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された免疫原性製剤は、０日目に、及び最初の投与から約３か月後に再び、小児又は若年成人に投与してもよい。
【0023】
ある実施形態では、本明細書で開示された四価製剤は、１つ又は複数の用量の四価組成物を受容した小児及び若年成人の少なくとも６０％において、４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘発することができる。
【0024】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、ある実施形態を更に説明するために含まれている。幾つかの実施形態は、これら図面の１つ又は複数を、単独で又は提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することより、より良好に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】以前に生成された構築体及び野生型デングウイルスと比較した、本発明の例示的なキメラ構築体ＤＥＮ－２／ＤＥＮ－４を反映する例示的なチャートを表す図である。
【図2】弱毒生ＤＥＮ－２骨格（更なる突然変異を有する）及びデング－２構造成分（例えば、ＴＤＶ－１ ＭＶＳ）の代わりに用いられる構成成分としての第２のデングウイルス血清型を使用して種々の応答を比較した例示的なヒストグラムプロットを表す図である。このプロットは、ＴＤＶ ＭＶＳのプラークサイズを示すものである。野生型デングウイルス及び以前に発表されている研究等級ワクチン候補ウイルスが、対照及び比較のために含まれていた。このプロットは、対照デングウイルスキメラ構築体と比較して、デングウイルス構築体の生産が向上したことを示している。
【図3】ＴＤＶ ＭＶＳ（マスターウイルスシード、ここではＤＥＮＶａｘと表示されている）の温度感受性を示す例示的なヒストグラムプロットを表す図である。野生型デングウイルス及び以前に発表されている研究等級ワクチン候補ウイルスが、ＭＶＳ等級との比較のために含まれていた。
【図4】対照と比較した、Ｃ６／３６細胞におけるＴＤＶ（ＤＥＮＶａｘとしても知られている）ＭＶＳのウイルス増殖を表す例示的なヒストグラムプロットを表す図である。野生型デングウイルス及び以前に発表されている研究等級ワクチン候補ウイルスが、ＴＤＶ ＭＶＳ（ここではＤＥＮＶａｘと表示されている）との比較のために含まれていた。
【図5】Ａ～Ｃは、新生仔マウスにおける神経毒性の例示的なプロットを表す図である。１０４ｐｆｕのウイルスでｉｃ負荷したＣＤＣ－ＩＣＲ（ｎ＝７２）及びＴａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲ（ｎ＝３２）新生仔マウスにおける、ｗｔＤＥＮＶ－２ １６６８１ウイルスの神経毒性が要約されている、幾つかの実験をプールした結果（Ａ）。１０４ｐｆｕ（Ｂ）又は１０３ｐｆｕ（Ｃ）の用量を用いてＴａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲマウスで試験した、ＴＤＶ ＭＶＳ（マスターウイルスシード、ここではＤＥＮＶａｘと表示されている）の神経毒性。１つの実験（ｎ＝１６）又は２つのプールした実験（ｎ＝３１又は３２）での１群当たりの試験動物の数が示されている。
【図6】ＴＤＶ ＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳのプラークサイズを示す例示的なヒストグラムを表す図である。ｐｉ９日目に測定したアガロースオーバーレイ下のベロ細胞又はＬＬＣ－ＭＫ２細胞でのウイルスプラークの平均プラーク直径±ＳＤ（エラーバー）。野生型ＤＥＮＶ及び以前に発表されている研究等級ワクチン候補ウイルスが、対照及び比較のために含まれていた。
【図7】大規模製造後でもこのｉｎ ｖｉｔｒｏ弱毒化マーカーが保持されている確認するための、２つのインキュベーション温度における、Ｃ６／３６細胞でのＴＤＶ（ここではＤＥＮＶａｘと表示されている）ＭＳＶ、ＷＶＳ、及びＢＶＳの増殖を示す例示的なヒストグラムプロットを表す図である。ある野生型デングウイルス及び以前に発表されている研究等級ワクチン候補ウイルスが、比較のために含まれていた。
【図8】Ｃ６／３６細胞でのＴＤＶ ＭＶＳ（マスターウイルスシード、ここではＤＥＮＶａｘと表示されている）、ＷＶＳ、及びＢＶＳの増殖制限をプロットした例示的なヒストグラムを表す図である。ｐｉ７日目のＣ６／３６細胞で複製されたウイルスの平均力価±ＳＤ（エラーバー）。ある野生型デングウイルス及び以前に発表されている研究等級ワクチン候補ウイルスが、比較のために含まれていた。
【図9】Ａ～Ｂは、新生仔ＩＣＲマウスでのＴＤＶ ＭＶＳ（マスターウイルスシード、ここではＤＥＮＶａｘと表示されている）の神経毒性データの例示的なグラフを表す図である。（Ａ）１０４ＰＦＵの用量でのウイルスのＩＣ接種。（Ｂ）１０３ＰＦＵの用量でのウイルスのＩＣ接種。
【図10】新しい弱毒生デング－２ウイルスを、以前に生成された弱毒生デング－２ウイルスと比較した例示的なチャートを表す図である。
【図11A】代表的なタンパク質ドメイン及び突然変異部位を含む、本開示の弱毒生デングウイルス及びデング－デングキメラ構築体（ＴＤＶと表示されている）の代表的なダイヤグラムである。
【図11B】本開示の１つの実施形態による、１つの四価製剤の代表的な製剤である。
【図12A】本開示の１つの実施形態による、臨床試験の一部として実施された対象への投薬レジメンの代表的なダイヤグラムである。
【図12B】本開示の１つの実施形態による、臨床試験の一部として実施された対象への投薬レジメンの代表的なダイヤグラムである。
【図13A】本開示の１つの実施形態による、血清陽性対象への四価製剤投与後に中和抗体が応答するマイクロ中和試験（ＭＮＴ）の結果を示す代表な折れ線グラフである。
【図13B】本開示の１つの実施形態による、デング未感作対象への四価製剤投与後に中和抗体が応答するマイクロ中和試験（ＭＮＴ）の結果を示す代表な折れ線グラフである。
【図14】本開示の１つの実施形態による、四価製剤投与後の種々の時点での、４つ全てのデング血清型に血清陽性である臨床試験対象のパーセントを示す代表的な棒グラフである。
【図15】本開示の１つの実施形態による、四価製剤投与後の種々の時点での、４つ全てのデング血清型に血清陽性である臨床試験対象のパーセントを示す代表的な棒グラフである。
【図16】本開示の１つの実施形態による、四価製剤投与後の種々の時点での、４つ全てのデング血清型の医薬組成物を受容する前は未感作であった血清陽性臨床試験対象のパーセントを示す代表的な棒グラフである。
【図17】本開示の１つの実施形態による、４つ全てのデング血清型の医薬組成物を受容した後で複数の血清型に対して血清陽性であった臨床試験対象（小児及び成人）のパーセントを示す代表的な棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0026】
定義
本明細書で使用される場合、「１つの」は、１つ又は１つよりも多くの品目を意味する場合がある。
本明細書で使用される場合、「１つの」は、１つ又は１つよりも多くの品目を意味する場合がある。
【0027】
本明細書で使用される場合、「対象」としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ヒト等の哺乳動物（例えば、小児～成人）、又は飼育若しくは野生の哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、他の家庭ペット（例えば、ハムスター、モルモット、マウス、ラット）、フェレット、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、プレーリードッグ、野生げっ歯動物、若しくは動物園動物。
【0028】
本明細書で使用される場合、用語「ウイルスキメラ」、「キメラウイルス」、「フラビウイルスキメラ」、及び「キメラフラビウイルス」は、デング－２ウイルスのヌクレオチド配列の部分、及びデング－２ウイルスに由来していないか又は異なるフラビウイルスに由来する更なるヌクレオチド配列を含む構築体を意味する場合がある。「デングキメラ」は、少なくとも２つの異なるデングウイルス血清型を含むが、異なるフラビウイルスを含んでいない。したがって、他のデングウイルス又はフラビウイルスの例としては、これらに限定されないが、以下のものを挙げることができる：デング－１ウイルス、デング－３ウイルス、デング－４ウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、及びそれらの任意の組合せに由来する配列。
【0029】
本明細書で使用される場合、「核酸キメラ」は、デングウイルス（例えば、デング－２ウイルス）のヌクレオチド配列の部分を有する核酸、及びそのデングウイルスと由来が同じではない更なるヌクレオチド配列を含む本開示の構築体を意味する場合がある。これらの実施形態によると、本明細書で開示された任意のキメラデング又はフラビウイルスキメラを、核酸キメラの例として認識することができる。
【0030】
本明細書で使用される場合、「弱毒生ウイルス」は、ワクチン又は他の免疫原性組成物に有用な形質を得るために突然変異又は選択された野生型ウイルスを意味する場合があり、この場合、幾つかの形質としては、毒性の低減、安全性、効力、増殖の向上等を挙げることができる。
【0031】
本明細書で使用される場合、「デングウイルス製剤」若しくは「免疫原性組成物」若しくは「ワクチン製剤」又はそれらの医薬製剤は、対象に投与することができ、その対象に１つ又は複数のデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘発することができる、本明細書で開示されたポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの種々の組合せを含むことができる。
【0032】
詳細な説明
以下のセクションでは、種々の実施形態を詳述するために、種々の例示的な組成物及び方法が記載されている。当業者であれば、種々の実施形態の実施は、本明細書で概説されている特定の詳細の全て又は一部でさえ使用する必要はなく、むしろ濃度、時間、及び他の特定の詳細は、日常的な実験作業により変更することができることは明白であろう。幾つかの場合には、周知の方法又は成分は、本明細書には含まれていない。
以下のセクションでは、種々の実施形態を詳述するために、種々の例示的な組成物及び方法が記載されている。当業者であれば、種々の実施形態の実施は、本明細書で概説されている特定の詳細の全て又は一部でさえ使用する必要はなく、むしろ濃度、時間、及び他の特定の詳細は、日常的な実験作業により変更することができることは明白であろう。幾つかの場合には、周知の方法又は成分は、本明細書には含まれていない。
【0033】
本開示の実施形態によると、当技術分野の技術内にある、従来の分子生物学、タンパク質化学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技法を使用することができる。そのような技法は、文献に十分に説明されている。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年を参照）。
【0034】
本明細書で開示された実施形態は、約１歳から約２０歳までの小児又は若年成人等の対象に、１つ又は最大４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導するための組成物、方法、及び使用に関する。他の実施形態は、対象に、１つ又は複数のデングウイルス血清型に対する免疫応答を個々に又は同時に誘導するための組成物、方法、及び使用に関する。これらの実施形態によると、弱毒デングウイルス及び核酸キメラを生成し、本明細書で開示されたワクチン組成物に使用することができる。幾つかの実施形態は、改変又は突然変異デング構築体又はキメラに関する。他の実施形態は、突然変異を導入して、デングウイルスの構造タンパク質のアミノ酸配列を改変し、突然変異がウイルスに対する免疫原性を増加させることに関する。
【0035】
４つ全ての血清型の弱毒生デングウイルスは、細胞培養で野生型ウイルスを継代することにより開発される。これらは、フラビウイルス及び特にデングウイルス感染症及び／又は疾患に対する免疫化の最も有望な弱毒生ワクチン候補の幾つかである。これらワクチン候補は、デング血清型、それらが継代された細胞株、及びそれらが継代された回数の組合せで命名されている。したがって、ＰＤＫ細胞で１３回継代されたデング血清１型野生型ウイルスは、ＤＥＮ－１ ＰＤＫ－１３ウイルスと命名される。他のワクチン候補は、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３、ＤＥＮ－３ ＰＧＭＫ－３０／ＦＲｈＬ－３（例えば、初代ミドリザル腎臓細胞で３０回継代し、その後胎仔アカゲザル肺細胞及びＤＥＮ－４ ＰＤＫ－４８で３回継代する）である。これら４つの候補ワクチンウイルスは、それぞれ、野生型親ＤＥＮ－１ １６００７、ＤＥＮ－２ １６６８１、ＤＥＮ－３ １６５６２、及びＤＥＮ－４ １０３６ウイルスの組織培養継代により導出された。
【0036】
ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ウイルスワクチン候補（以下、ＰＤＫ－５３）は、温度感受性、小さなプラークサイズ、蚊Ｃ６１３６細胞培養での複製減少、完全な状態の蚊における複製減少、乳仔マウスに対する神経毒性の喪失、及びサルにおけるウイルス血症の発症減少を含む、弱毒化に関連する幾つかの測定可能な生物学的マーカーを有する。候補ＰＤＫ－５３ワクチンの臨床試験では、ヒトにおける安全性及び免疫原性が実証されている。更に、ＰＤＫ－５３ワクチンは、ヒトワクチンレシピエントに、デングウイルス特異的Ｔ細胞記憶応答を誘導する。本明細書の幾つかの実施形態には、小児及び若年成人にデングウイルスに対する免疫応答を誘導するための、本明細書で開示されたキメラ構築体に使用される改良型ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３が記載されている。
【0037】
デング－２ウイルス骨格及び別のデングウイルス血清型の少なくとも１つの構造タンパク質を有する免疫原性フラビウイルスキメラは、デングウイルスキメラを調製するために使用することができ、デングウイルスキメラを生成するための方法が記載されている。免疫原性デングウイルスキメラは、デングウイルス血清型ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３、及びＤＥＮ－４等を単独で又は組み合わせた、１つ又は複数の血清型による感染を最小限に抑えるか、阻害するか、又はそれに対して個体を免疫するための免疫原性組成物として、薬学的に許容される担体中に、単独で又は組合せで提供される。組合せの場合、免疫原性デングウイルスキメラを、多価ワクチン（例えば、二価、三価、及び四価）として使用して、フラビウイルスの１つよりも多くの種又は株による感染からの同時保護を付与することができる。ある実施形態では、デングウイルスキメラは、既知のデングウイルス血清型に対する二価、三価、又は四価ワクチンとして有用な免疫原性組成物中で組み合わせることができ、異なるフラビウイルスに由来する１つ又は複数のタンパク質をコードする核酸を包含することにより、他の病原性フラビウイルスに対する免除を付与することができる。
【0038】
幾つかの実施形態では、本明細書で提供された非病原性免疫原性デングウイルスキメラは、弱毒デング－２ウイルス（例えば、ＰＤＫ－５３）又はその等価物の非構造タンパク質遺伝子、及びそれに対する免疫原性が対象で誘導されることになるフラビウイルスの構造タンパク質遺伝子又はそれらの免疫原性部分の１つ又は複数を含む。例えば、幾つかの実施形態は、ウイルス骨格としての弱毒デング－２ウイルスＰＤＫ－５３ゲノム、及び異なるフラビウイルス又は異なるデングウイルス血清型等から保護するための、ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－３、ＤＥＮ－４、又は他のフラビウイルスに由来する１つ又は複数の対応する構造タンパク質遺伝子で置換されている、ＰＤＫ－５３ゲノムのカプシド、プレ膜／膜、若しくはエンベロープ、又はそれらの組合せをコードする１つ又は複数の構造タンパク質遺伝子を有するキメラに関する。これらの実施形態によると、本明細書で開示された核酸キメラは、弱毒デング－２ウイルスの機能的特性を有していてもよく、非病原性であるが、他のフラビウイルスに加えて、ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－３、又はＤＥＮ－４の構造遺伝子産物の抗原性エピトープを発現し、免疫原性である（例えば、対象において遺伝子産物に対する免疫応答を誘導する）。その後、これら構築体は、１回又は複数回から５３回の継代を超えて継代され、１つ又は複数のデングウイルス血清型に対する免疫原性組成物を生成するのに有用な弱毒生ウイルス組成物が生産される（例えば、Ｐ１～Ｐ１０）。
【0039】
別の実施形態では、核酸キメラは、これらに限定されないが、弱毒デング－２ウイルスに由来する非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び単独で又は別のフラビウイルスと組み合わせてデング－４ウイルスに由来する構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を有する核酸キメラであってもよい。他の実施形態では、弱毒デング－２ウイルスは、物理的特性の向上又は免疫原性の増加について選択された、１つ又は複数アミノ酸が野生型アミノ酸に復帰したワクチン株ＰＤＫ－５３であってもよい（実施例を参照）。こうした特定の復帰突然変異は、小児及び若年成人のデングウイルス感染に対するレジメンにおいて、弱毒生デング－２として又は本明細書に記載のキメラ構築体を使用するための望ましい形質を付与する。幾つかの実施形態は、第２のデングウイルスのＣ、ｐｒＭ、又はＥタンパク質の１つ又は複数の構造タンパク質を含む。
【0040】
本明細書で開示された他の実施形態では、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、他の標的とされるデングウイルス血清型との干渉を低減するために、例えば、ＰＤＫ－５３デング－２ゲノムに置換、欠失、又は挿入を含んでいてもよい。こうした改変は、単独で又は本明細書で開示された改変例と組み合わせて、構造及び非構造タンパク質になすことができ、弱毒ウイルスを継代し、１つ又は複数のデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導するための改良型組成物を得ることにより生成することができる。
【0041】
本明細書で開示されたある実施形態は、組換え技法を使用して、例えば、１つの血清型の置換配列を別の血清型骨格に挿入することにより、キメラフラビウイルスを製作するための方法を提供する。本明細書の他の実施形態は、確認された（例えば、安全で有効な）弱毒生キメラウイルスを更なる改良のために継代すること、及び望ましい形質を選択することに関する。ある実施形態では、本明細書で使用される弱毒生デング－２は、表３に示されている１つ又は複数の突然変異を含んでいてもよい。他の実施形態では、本出願のデング－デングキメラは、表３に示されている１つ又は複数の突然変異を含んでいてもよい。更に他の実施形態では、デング－デングキメラは、Ｄｅｎ－２／Ｄｅｎ－１、Ｄｅｎ－２／Ｄｅｎ－３、又はＤｅｎ－２／Ｄｅｎ－４について表３に示されている各キメラの突然変異を全て含んでいてもよい。表３の構築体により表される弱毒生ウイルスを含む医薬組成物が企図される。例えば、表３に示されているデング－デングキメラ及び弱毒生デング－２ウイルスが使用されている一価、二価、三価、又は四価組成物が、本明細書での使用に企図される。
【0042】
ある実施形態では、本明細書で企図された弱毒生ＤＥＮ－２変異体は、単独で又はデング－デングキメラ又はデング－フラビウイルスキメラと組み合わせて投与することができる医薬組成物に製剤化することができる。ある実施形態では、二価、三価、又は四価組成物は、対象への単回適用又は複数回適用で投与することができる。
【0043】
フラビウイルスキメラ
デングウイルス１～４型（ＤＥＮ－１～ＤＥＮ－４）は、蚊媒介性フラビウイルス病原体である。フラビウイルスゲノムは、５’－非コード領域（５’－ＮＣ）、カプシドタンパク質（Ｃ）コード領域、プレ膜／膜タンパク質（ｐｒＭ）コード領域、エンベロープタンパク質（Ｅ）コード領域、非構造タンパク質（ＮＳ１－ＮＳ２Ａ－ＮＳ２Ｂ－ＮＳ３－ＮＳ４Ａ－ＮＳ４Ｂ－ＮＳ５）をコードする領域、及び３’非コード領域（３’ＮＣ）を含む。フラビウイルス構造タンパク質としては、Ｃ、ｐｒＭ、及びＥが挙げられる。非構造タンパク質としてはＮＳ１－ＮＳ５が挙げられる。構造及び非構造タンパク質は、単一のポリタンパク質として翻訳され、細胞プロテアーゼ及びウイルスプロテアーゼによりプロセシングされる。
デングウイルス１～４型（ＤＥＮ－１～ＤＥＮ－４）は、蚊媒介性フラビウイルス病原体である。フラビウイルスゲノムは、５’－非コード領域（５’－ＮＣ）、カプシドタンパク質（Ｃ）コード領域、プレ膜／膜タンパク質（ｐｒＭ）コード領域、エンベロープタンパク質（Ｅ）コード領域、非構造タンパク質（ＮＳ１－ＮＳ２Ａ－ＮＳ２Ｂ－ＮＳ３－ＮＳ４Ａ－ＮＳ４Ｂ－ＮＳ５）をコードする領域、及び３’非コード領域（３’ＮＣ）を含む。フラビウイルス構造タンパク質としては、Ｃ、ｐｒＭ、及びＥが挙げられる。非構造タンパク質としてはＮＳ１－ＮＳ５が挙げられる。構造及び非構造タンパク質は、単一のポリタンパク質として翻訳され、細胞プロテアーゼ及びウイルスプロテアーゼによりプロセシングされる。
【0044】
フラビウイルスキメラは、１つの型又は血清型のデングウイルス又はフラビウイルス科のウイルス種に由来する非構造タンパク質遺伝子を、異なる型又は血清型のデングウイルス又は他のフラビウイルスに由来するタンパク質遺伝子、例えば構造タンパク質遺伝子と融合させることにより形成される構築体であってもよい。他の実施形態では、フラビウイルスキメラ構築体は、１つの型又は血清型のデングウイルス又はフラビウイルス科のウイルス種に由来する非構造タンパク質遺伝子を、他のデングウイルス血清型又は他のフラビウイルスから選択されるポリペプチド又はタンパク質の合成を指図する更なるヌクレオチド配列と融合させることにより形成することができる。他の実施形態では、１つのフラビウイルスから別のものへの配列の置換が企図される。
【0045】
他の実施形態では、デングキメラは、弱毒生デングウイルスの非構造タンパク質遺伝子又はそれらの等価物、及びそれに対する免疫原性が付与されることになるデングウイルス又は他のフラビウイルスの構造タンパク質遺伝子又はそれらの抗原性部分の１つ又は複数を含んでいてもよい。
【0046】
デングキメラの構築に使用される他の好適なデングウイルスは、野生型病原性ＤＥＮ－１ １６００７、ＤＥＮ－２ １６６８１、ＤＥＮ－３ １６５６２、及びＤＥＮ－４ １０３６、並びに弱毒ワクチン株ＤＥＮ－１ ＰＤＫ－１３、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３、ＤＥＮ－３ ＰＭＫ－３０／ＦＲｈＬ－３、及びＤＥＮ－４ ＰＤＫ－４８であってもよい。ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３、及びＤＥＮ－４野生型／弱毒ウイルス対間の遺伝子差異は、ウイルスゲノムによりコードされるアミノ酸配列の変化を伴うことが企図される。
【0047】
幾つかの実施形態では、本明細書に有用なデング－２ウイルスは、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３－Ｖ変異体であって、ゲノムヌクレオチド５２７０位がＡからＴに突然変異しており、ポリタンパク質のアミノ酸１７２５位又はＮＳ３タンパク質のアミノ酸２５０位が、デング－２全長配列のバリン残基を含む変異体を含んでいてもよい。このヌクレオチド突然変異を有していない１つのＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３変異体ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３－Ｅは、この位置がＰＤＫ－５３－Ｖと異なる。ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３－Ｅは、ヌクレオチド５２７０位にＡを有し、ポリペプチド１７２５位、ＮＳ３タンパク質アミノ酸２５０位にグルタミン酸を有する。幾つかの実施形態では、改変ＰＤＫ ５３デング－２は、本明細書で企図されたワクチン組成物での使用により望ましい形質を得るために、これら位置の１つ又は複数の天然配列への復帰突然変異を含んでいてもよい。
【0048】
ある実施形態では、デング－デングキメラとしては、改変骨格、及び他のデングウイルス又は他のフラビウイルスから挿入された構造遺伝子（ｐｒＭ－Ｅ又はＣ－ｐｒＭ－Ｅ）を有するＤＥＮ－２ウイルス特異的感染性クローンを挙げることができる。幾つかの実施形態では、デング－２骨格変異体は、デング－２ １６６８１株（Ｐ）、ＰＤＫ－５３－Ｅ（Ｅ）、又はＰＤＫ－５３－Ｖ（Ｖ）から生成することができる。最後の文字は、親（Ｐ）株若しくはそのワクチン誘導体（Ｖ）に由来するＣ－ｐｒＭ－Ｅ構造遺伝子、又は親（Ｐ）若しくはそのワクチン誘導体（Ｖ１）に由来するｐｒＭ－Ｅ構造遺伝子を示す。例えば、ＤＥＮ－２／１－ＶＰは、ＮＳ３－２５０にバリンを含む弱毒ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３Ｖ骨格、及び野生型ＤＥＮ－１ １６００７に由来するＣ－ｐｒＭ－Ｅ遺伝子を含むキメラを指し；ＤＥＮ－２／１－ＶＶは、デング－１のワクチン株ＤＥＮ－１ ＰＤＫ－１３を有するＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３Ｖ骨格を指し；ＤＥＮ－２／１－ＶＰ１は、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３Ｖ骨格、及び野生型ＤＥＮ－１ １６００７に由来するｐｒＭ－Ｅ遺伝子を指し；ＤＥＮ－２／３－ＶＰ１は、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３Ｖ骨格、及び野生型ＤＥＮ－３ １６５６２に由来するｐｒＭ－Ｅ遺伝子を指し；ＤＥＮ－２／４ＶＰ１は、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３Ｖ骨格、及び野生型ＤＥＮ－４ １０３６に由来するｐｒＭ－Ｅ遺伝子を指す。本明細書で開示された他のキメラは、同様の命名法により示されている。
【0049】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示されたデング－デングキメラは、ＰＤＫ－５３ゲノムのＣ、ｐｒＭ、及びＥタンパク質をコードする構造タンパク質遺伝子が、単独で又はそれらの組み合わせで、デング－１、デング－３、又はデング－４ウイルス、及び任意選択で、異なるフラビウイルス（例えばジカ熱若しくは黄熱病又はそれらの組合せ）又は異なるデングウイルス株等の、それらから保護されることになる別のフラビウイルスに由来する対応する構造タンパク質遺伝子で置換されていてもよい弱毒デング－２ウイルスＰＤＫ－５３ゲノムを骨格として含んでいてもよい。弱毒生デング－２ ＰＤＫ－５３ウイルス株は、ヌクレオチド５２７０位に混合遺伝子型を有する。ウイルス集団の少なからぬ部分（およそ２９％）が、ＮＳ３－２５０－Ｖａｌ突然変異ではなく、野生型ＤＥＮ－２ １６６８１ウイルスに存在する非突然変異ＮＳ３－２５０－Ｇｌｕをコードする。両遺伝子変異体は非病原性であるため、この突然変異は、非病原性キメラには必要ではない場合がある。
【0050】
ある実施形態では、ＮＳ１－５３における単一突然変異、ＮＳ１－５３及び５’ＮＣ－５７における二重突然変異、ＮＳ１－５３及びＮＳ３－２５０における二重突然変異、並びにＮＳ１－５３、５’ＮＣ－５７、及びＮＳ３－２５０における三重突然変異は、ＤＥＮ－２ウイルスの弱毒化をもたらす。したがって、これら遺伝子座にそのような非保存的アミノ酸置換又はヌクレオチド置換を含む任意のデング－２ウイルスのゲノムを、本明細書で開示された改変ＰＤＫ－５３ウイルスを導出すための塩基配列として使用することができる。所望の場合、５’非コード領域のステム／ループ構造のステムにおける別の突然変異は、更なる非病原性表現型安定性を提供することができる。この領域への突然変異導入は、ウイルス複製にとって重要な潜在的二次構造を破壊する。
【0051】
本明細書で開示された突然変異は、これらに限定されないが、目的の細胞株（例えば、ベロ細胞）で継代した後で更なる特徴を有するクローンを選択すること含む、当技術分野で公知の任意の方法により達成することができる。当業者であれば、本明細書に記載の及び当技術分野で周知の病原性スクリーニングアッセイを使用して、病原性骨格構造と非病原性骨格構造とを区別することができる。
【0052】
フラビウイルスキメラの構築
本明細書で開示されたフラビウイルスキメラは、それに対する免疫が望まれている１つのフラビウイルスの構造タンパク質遺伝子の１つ又は複数を、ＰＤＫ－５３デング－２ウイルスゲノム骨格へとスプライスすることにより、又は当技術分野で公知の他の方法により、組換え遺伝子改変を使用して対応するＰＤＫ－５３遺伝子を除去し、それをデング－１、デング－３、又はデング－４ウイルス遺伝子又は当技術分野で公知の他の遺伝子に置換して、生成することができる。
本明細書で開示されたフラビウイルスキメラは、それに対する免疫が望まれている１つのフラビウイルスの構造タンパク質遺伝子の１つ又は複数を、ＰＤＫ－５３デング－２ウイルスゲノム骨格へとスプライスすることにより、又は当技術分野で公知の他の方法により、組換え遺伝子改変を使用して対応するＰＤＫ－５３遺伝子を除去し、それをデング－１、デング－３、又はデング－４ウイルス遺伝子又は当技術分野で公知の他の遺伝子に置換して、生成することができる。
【0053】
その代わりに、フラビウイルスタンパク質をコードする核酸分子は、配列表に提供されている配列を使用し、公知の核酸合成技法を使用して合成し、適切なベクターに挿入することができる。本明細書で開示された弱毒生ウイルスは、当業者に公知の組換え遺伝子改変技法を使用して生成することができる。
【0054】
他のフラビウイルス又はデングウイルス血清型の構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む好適なキメラウイルス又は核酸キメラは、非病原性を示す上述の弱毒化表現型マーカーについて、それらをスクリーニングすることにより、及び免疫原性についてそれらをスクリーニングすることにより、ワクチンとしての有用性を評価することができる。抗原性及び免疫原性は、フラビウイルス抗体又は免疫反応性血清とのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ反応性を使用し、当業者に公知の日常的なスクリーニング手順を使用して評価することができる。
【0055】
デングウイルスワクチン
ある実施形態では、キメラウイルス及び核酸キメラは、免疫原又はワクチンとして有用な弱毒生ウイルスを提供することができる。幾つかの実施形態は、デング－４ウイルスに対して高い免疫原性を示すが、危険な病原性又は致死性の効果をもたらさないキメラを含む。
ある実施形態では、キメラウイルス及び核酸キメラは、免疫原又はワクチンとして有用な弱毒生ウイルスを提供することができる。幾つかの実施形態は、デング－４ウイルスに対して高い免疫原性を示すが、危険な病原性又は致死性の効果をもたらさないキメラを含む。
【0056】
デングウイルスの１つの血清型に対してのみワクチン接種を受けた小児及び若年成人でのＤＨＦ／ＤＳＳの発症率を低減するために、四価ワクチンは、ウイルスの４つ全ての血清型に対する同時免疫を提供することが必要である。四価ワクチンは、本出願の弱毒生デング－２ウイルスを、多価ワクチンとしての投与に好適な医薬担体中で、本明細書に記載のデング－２／１、デング－２／３、及びデング－２／４キメラ、又は他のデングウイルス構築体と組み合わせることにより生成することができる。
【0057】
ある実施形態では、本開示のキメラウイルス又は核酸キメラは、野生型ウイルス又は弱毒生ウイルスいずれかの構造遺伝子を、弱毒ＤＥＮ－２ウイルス骨格に含んでいてもよい。例えば、デング－２／デング－４キメラは、野生型ＤＥＮ－４ １０３６ウイルスの構造タンパク質遺伝子を発現することができる。
【0058】
ある方法では、本明細書に記載のキメラに使用されるウイルスは、当技術分野で公知の技法を使用して増殖させることができる。その後、増殖中の培養物の生存能及び表現型特徴を評価するために、ウイルスプラーク滴定を実施し、プラークを計数してもよい。野生型ウイルスを継代して培養細胞株とし、弱毒候補開始材料を導出してもよい。
【0059】
ある実施形態では、キメラクローンは、当業者であれば入手可能な種々のデング血清型クローンから構築することができる。また、ウイルス特異的ｃＤＮＡ断片のクローニングを達成することができる。種々のプライマーを用いた逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）により、デングウイルスＲＮＡから構造タンパク質又は非構造タンパク質遺伝子を含むｃＤＮＡ断片を増幅することができる。増幅した断片を、他の中間体クローンの切断部位にクローニングすることができる。その後、中間体キメラデングウイルスクローンを配列決定して、挿入したデングウイルス特異的ｃＤＮＡの正確性を確認することができる。
【0060】
デング血清型ウイルスの構造タンパク質及び／又は非構造タンパク質遺伝子領域をベクターに挿入することにより構築される完全ゲノム長キメラプラスミドは、当業者に周知の組換え技法を使用して得ることができる。
【0061】
ヌクレオチド及びアミノ酸分析
ＤＥＮ－２ １６６８１ウイルスのＮＳ１－５３－Ｇｌｙは、現在までに配列決定されている、ダニ媒介性ウイルスを含むほぼ全てのフラビウイルスで保存されているため、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ワクチンウイルスのＮＳ１－５３突然変異は、このウイルスの弱毒化現型にとって重要な意義を持つ。また、ＤＥＮ－４ワクチンウイルスは、ＮＳ１タンパク質の２５３位にアミノ酸突然変異を含む場合がある。この遺伝子座は、ＤＥＮ－４ ＰＤＫ－４８ワクチンウイルスではＧｌｎからＨｉｓに突然変異しているが、デングウイルスの４つ全ての野生血清型ではＧｌｎである。このＧｌｎ残基は、フラビウイルス属内のデングウイルスに固有である。ＮＳ１タンパク質は、フラビウイルス感染細胞から分泌される糖タンパク質である。ＮＳ１タンパク質は、感染細胞の表面に存在し、ＮＳ１特異的抗体が、ウイルス感染個体の血清に存在する。ＮＳ１タンパク質で免疫された、又はＮＳ１特異的抗体で受動免疫された動物の保護が報告されている。ＮＳ１タンパク質は、初期ウイルスＲＮＡ複製に寄与すると考えられる。
ＤＥＮ－２ １６６８１ウイルスのＮＳ１－５３－Ｇｌｙは、現在までに配列決定されている、ダニ媒介性ウイルスを含むほぼ全てのフラビウイルスで保存されているため、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ワクチンウイルスのＮＳ１－５３突然変異は、このウイルスの弱毒化現型にとって重要な意義を持つ。また、ＤＥＮ－４ワクチンウイルスは、ＮＳ１タンパク質の２５３位にアミノ酸突然変異を含む場合がある。この遺伝子座は、ＤＥＮ－４ ＰＤＫ－４８ワクチンウイルスではＧｌｎからＨｉｓに突然変異しているが、デングウイルスの４つ全ての野生血清型ではＧｌｎである。このＧｌｎ残基は、フラビウイルス属内のデングウイルスに固有である。ＮＳ１タンパク質は、フラビウイルス感染細胞から分泌される糖タンパク質である。ＮＳ１タンパク質は、感染細胞の表面に存在し、ＮＳ１特異的抗体が、ウイルス感染個体の血清に存在する。ＮＳ１タンパク質で免疫された、又はＮＳ１特異的抗体で受動免疫された動物の保護が報告されている。ＮＳ１タンパク質は、初期ウイルスＲＮＡ複製に寄与すると考えられる。
【0062】
ある実施形態では、ＤＥＮ－１、－２、－３、及び－４弱毒株のＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ４Ａ、及びＮＳ４Ｂタンパク質に生じた突然変異は、性質が保存的である。ＤＥＮ－２及びＤＥＮ－４ワクチンウイルスのＮＳ４Ａ－７５及びＮＳ４Ａ－９５突然変異は、それぞれ、デングウイルスでは保存されているが、一般のフラビウイルスでは保存されていないアミノ酸部位で生じた。
【0063】
ＤＥＮ－４、ＤＥＮ－３、又はＤＥＮ－１ウイルスをコードする核酸配列（例えば、構造エレメント）を、プラスミド等のベクターに挿入し（例えば、デング－２骨格に）、生命体内で組換え的に発現させて、組換えデングウイルスペプチド及び／又はポリペプチド及び／又はウイルスを生産することができる。
【0064】
核酸検出法
本明細書に記載のワクチンウイルスの各々の診断に役立つ迅速遺伝子検査が、本開示により提供される。本開示のこの実施形態は、ウイルス血症を発症したワクチン接種ヒトの血清から単離したウイルスの分析を増強し、並びに候補ワクチンウイルスで免疫した非ヒト霊長類のウイルス血症の特徴付けを増強する。
本明細書に記載のワクチンウイルスの各々の診断に役立つ迅速遺伝子検査が、本開示により提供される。本開示のこの実施形態は、ウイルス血症を発症したワクチン接種ヒトの血清から単離したウイルスの分析を増強し、並びに候補ワクチンウイルスで免疫した非ヒト霊長類のウイルス血症の特徴付けを増強する。
【0065】
こうした配列は、下記に記載されているように、逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）を使用することにより、ウイルスゲノムＲＮＡテンプレートから増幅されたｃＤＮＡアンプリコンの検出を報告する役目を果たす診断用ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、並びにｃＤＮＡアンプリコンを増幅するように設計されている順方向及び逆方向アンプライマーを含んでいてもよい。ある場合では、アンプライマーの１つは、アンプライマーの３’－末端にワクチンウイルス特異的突然変異を含むように設計されており、標的部位でのプライマーの伸長、及びその結果としての増幅は、ウイルスＲＮＡテンプレートがその特定の突然変異を含んでいる場合のみ生じることになるため、この試験は、効果的に、ワクチン株に対して更により特異的になる。
【0066】
自動化ＰＣＲに基づく核酸配列検出システム、又は核酸検出の他の公知の技術を使用することができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、試料核酸テンプレートからのＰＣＲ生成アンプリコンのリアルタイム視覚化及び定量化の自動化が可能である高度に特異的で高感度のアッセイである。ＴａｑＭａｎ（登録商標）は、特定の配列の存在又は非存在を決定することができる。このアッセイでは、順方向及び逆方向プライマーは、それぞれ標的突然変異部位の上流及び下流にアニーリングするように設計されている。アンプライマーのいずれかよりも約１０℃高い融解温度を有するように設計されており、ワクチンウイルス特異的ヌクレオチド突然変異又はその相補体を含む特異的検出プローブ（検出しようとするＲＴ／ＰＣＲアンプリコンの鎖に応じて）は、このアッセイの第３のプライマー成分である。
【0067】
ワクチンウイルスゲノムの１つの突然変異遺伝子座を特異的に検出するように設計されたプローブは、プローブの中間にワクチン特異的ヌクレオチドを含むことになる。このプローブは、ウイルスＲＮＡテンプレートがワクチンウイルス特異的である場合、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで検出可能な蛍光をもたらすことになる。しかしながら、野生型ＤＥＮウイルスに由来するゲノムＲＮＡテンプレートは、単一ヌクレオチドミスマッチ（親ウイルスＤＥＮウイルスの場合）又は恐らくは１つよりも多くのミスマッチ（他の野生型ＤＥＮウイルスに生じる場合があるため）のため、プローブハイブリダイゼーションの効率が減少することになり、著しい蛍光をもたらさないであろう。ＤＮＡポリメラーゼは、ミスマッチプローブを切断してリポーター色素を放出するよりも、ＲＴ／ＰＣＲアンプリコンテンプレートに由来するミスマッチプローブを置換する可能性がより高い（ＴａｑＭａｎ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｌｌｅｌｉｃ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）。
【0068】
診断用遺伝子検査の１つの戦略は、分子ビーコンを利用することである。また、分子ビーコン戦略では、アンプリコンをＲＴ／ＰＣＲ増幅するためのプライマーを使用し、プローブ末端にリポーター及びクエンチャー色素を含むプローブによりアンプリコン内の特異的配列が検出される。このアッセイでは、プローブは、ステム－ループ構造を形成する。分子ビーコンアッセイでは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで使用されるものとは異なるクエンチャー及びリポーター色素が使用される。
【0069】
医薬組成物
本明細書の実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏでの医薬品投与に好適な生物学的適合形態の組成物の対象への投与を提供する。「ｉｎ ｖｉｖｏ投与に好適な生物学的適合形態」とは、活性作用剤の治療効果があらゆる毒性効果を上回る投与しようとする活性作用剤（例えば、実施形態の医薬品）の形態を意味する。治療活性量の治療用組成物の投与は、所望の効果を達成するのに必要な用量及び期間で有効な量と定義される。例えば、治療活性量の化合物は、疾患状態、個体の年齢、性別、及び体重、並びに抗体が個体中で所望の応答を誘発する能力等の要因に応じて様々であってもよい。用量レジマ（ｒｅｇｉｍａ）は、最適な治療効果を提供するように調整することができる。
本明細書の実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏでの医薬品投与に好適な生物学的適合形態の組成物の対象への投与を提供する。「ｉｎ ｖｉｖｏ投与に好適な生物学的適合形態」とは、活性作用剤の治療効果があらゆる毒性効果を上回る投与しようとする活性作用剤（例えば、実施形態の医薬品）の形態を意味する。治療活性量の治療用組成物の投与は、所望の効果を達成するのに必要な用量及び期間で有効な量と定義される。例えば、治療活性量の化合物は、疾患状態、個体の年齢、性別、及び体重、並びに抗体が個体中で所望の応答を誘発する能力等の要因に応じて様々であってもよい。用量レジマ（ｒｅｇｉｍａ）は、最適な治療効果を提供するように調整することができる。
【0070】
１つの実施形態では、化合物（例えば、実施形態の弱毒生ウイルス）は、好都合な様式、例えば、皮下、静脈内、経口投与により、吸入、皮内、経皮塗布、膣内塗布、局所塗布、鼻腔内、又は直腸内投与で投与することができる。投与経路に応じて、活性化合物は、保護緩衝液（例えば、アルブミン、及びトレハロース、ポロキサマー４０７／トレハロース／アルブミン（ＦＴＡ））に含まれていてもよい。１つの実施形態では、組成物は、経口投与することができる。別の実施形態では、組成物は、静脈内投与することができる。１つの実施形態では、組成物は、吸入等、鼻腔内投与することができる。更に別の実施形態では、組成物は、無針システム（例えば、Ｐｈａｒｍａｊｅｔ（商標））又は他の皮内投与システムを使用して、皮内投与することができる。
【0071】
ある実施形態では、組成物は、適切な担体又は希釈剤で、小児又は若年成人に投与することができる。ある実施形態では、弱毒生デングウイルスワクチンは、安定化製剤（例えば、アルブミン及びトレハロース；ＦＴＡ、又は弱毒生ウイルスを安定させるための他の製剤）で、小児又は若年成人に投与してもよい。また、「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用される場合、生理食塩水及び水性緩衝溶液等の、希釈剤を含んでいてもよい。弱毒生ウイルス製剤は、その不活化を防止する物質と組み合わせるか、又はその不活化を防止する物質と共に化合物を同時投与することが必要な場合がある。ある実施形態では、弱毒生デングウイルスの１つ又は複数の製剤は、初回用量を小児又は若年成人に皮下又は皮内投与し、その後追加免疫してもよい。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物、並びに油中での分散液を調製することができる。通常の保管及び使用条件下では、こうした調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤、又は他の安定化製剤（例えば、ＦＴＡ、又は弱毒生フラビウイルス又はそのキメラの安定化に有用な他の安定化製剤）を含んでいてもよい。
【0072】
注射使用に好適な医薬組成物は、当技術分野で公知の手段により投与することができる。例えば、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び無菌注射溶液又は分散液での即時調製用の無菌粉末を使用することができる。幾つかの実施形態では、組成物は、無菌であってもよく、注射を容易にするために流動性であってもよい。薬学的に許容される担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動度は、例えば、レシチン等のコーティングを使用することにより、分散液の場合は、必要とされる粒子サイズを維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物の防止は、種々の抗細菌剤若しくは抗真菌剤又は他の作用剤を添加することにより達成することができる。
【0073】
幾つかの実施形態では、溶液は、製剤化すれば、投与製剤と適合する様式で、及び治療上有効量で投与することができる。これらの実施形態によると、製剤は、上記に記載の注射溶液のタイプ等の様々な剤形で容易に投与することができる。ある例では、弱毒生デングウイルス及び／又はキメラは、特定の比、例えば５：４：５：５、４：４：５：５、又は他の比（例えば、所与のデングウイルス血清型のＰＦＵ）を有し、三価又は四価製剤中のデング－３及び／又はデング－４構築体のｐｆｕが、製剤中に存在するデング－１及び／又はデング－２よりも、少なくとも２分の１ｌｏｇ高い製剤で送達してもよい。ある実施形態では、デング－３及びデング－４弱毒生又はキメラは、四価製剤中のデング－１及び／又はデング－２よりも、ｐｆｕ濃度が、少なくとも１ｌｏｇ高い。幾つかの実施形態では、ＤＥＮ２／４キメラは、弱毒生デング－１及び／又は弱毒生デング－２等の他のデングウイルス血清型よりも高い濃度で存在していてもよい。
【0074】
また、ある実施形態では、単一の用量又は複数の用量のデング製剤を、約１歳～約２０歳の小児又は若年成人に投与してもよい。幾つかの実施形態では、小児又は若年成人は、単一用量製剤で治療してもよい。他の実施形態では、小児又は若年成人は、少なくとも２用量の弱毒生デングウイルス製剤で治療してもよい。ある実施形態では、小児又は若年成人は、０日目にデング－デング製剤の組成物を投与し、最初の用量の約３か月以内に追加抗原用量を投与してもよい。ある実施形態では、小児及び若年成人は、デングウイルスに一切接触したことがない未感作対象（血清陰性）である。他の実施形態では、小児及び若年成人は、デングウイルス及び／又はデングウイルス感染に以前に曝されている場合がある（血清陽性）。これらの実施形態によると、血清陰性小児及び／又は血清陰性若年成人は、０日目に治療を受け、その後デングウイルスに対する免疫応答の増加をもたらすために、最初の投与から６か月以内、５か月以内、４か月以内、３か月以内、又はそれ未満に追加免疫を受ける。ある実施形態では、小児は、約２歳～約１７歳の小児であってもよい。他の実施形態では、小児は、２歳～１７歳である。
【0075】
別の実施形態では、経鼻溶液又はスプレー、エアゾール、又は吸入剤を使用して、弱毒生デングウイルス製剤を対象に送達してもよい。ある製剤は、賦形剤、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウム等を含んでいてもよい。
【0076】
医薬組成物は、徐放性製剤又はコーティング等の、体内からの急速な除去から活性成分を保護する担体を用いて調製することができる。そのような担体としては、制御放出製剤を挙げることができ、例えば、これらに限定されないが、マイクロカプセル送達系、及びエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーが公知である。
【0077】
ある実施形態では、弱毒生デング－デングキメラ、弱毒生デングウイルス、又はフラビウイルスキメラの用量範囲は、最初に約１０２から約１０６ＰＦＵまでを投与し、その後任意選択で、必要に応じて３０日以内又は最大１２か月後に少なくとも第２の投与をすることであってもよい。ある実施形態では、対象は、本明細書で開示された一価、二価、三価、又は四価組成物であって、単一組成混合物であるか又は異なるデングウイルス血清型の所定の組成物を有する組成物の二重投与を受けてもよい。
【0078】
任意の特定の小児若しくは若年成人、又は任意の特定の年齢の小児の場合、個々の必要性に応じて、特定の用量レジメンを調整することができることは明白であろう。幾つかの実施形態では、用量レジメンは、２０歳以下の小児、又は約１８歳以下、若しくは約１５歳以下、若しくは約１２歳以下、若しくは約９歳以下、若しくは約６歳以下、若しくは約３歳以下、若しくは約１．５歳以下の小児等の若年対象に適切なように調整される。ある実施形態では、小児は、２歳～１７歳であってもよい。他の実施形態では、小児は、４歳～１６歳であってもよい。
【0079】
ある実施形態では、本明細書で開示された免疫原性組成物は、１つ又は複数の用量で小児又は若年成人に投与することができる。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された免疫原性組成物は、所定の期間内に、単一の用量で又は２つの用量又はそれより多くの用量で対象に投与することができ、所定の期間としては、これらに限定されないが、同じ又は異なる解剖学的位置に、約６か月以内、約１２０日以内、約９０日以内、約８０日以内、約７０日以内、約６０日以内、約５０日以内、約４０日以内、約３０日以内、約２０日以内、約１０日以内、約５日以内、又はそれ未満以内、又は同日の数時間以内若しくは数分以内が挙げられ、或いは同時に投与してもよい。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された免疫原性製剤は、互いに約９０日以内に、互いに約６０日以内に、互いに約３０日以内に、及び互いに約３０日未満以内に投与してもよい。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物は、対象に皮下又は皮内投与してもよい。２か所以上の解剖学的部位での投与は、２か所以上の解剖学的部位での同じ経路による投与、又は２か所の異なる解剖学的部位での２つの異なる経路による投与を含む、投与の任意の組合せを含んでいてもよい。これらの実施形態によると、２か所以上の解剖学的部位としては、身体の異なる四肢又は異なる領域を挙げることができる。ある実施形態では、２つの用量のワクチン組成物を、例えば、０日目に、全てのデング血清型からの保護（例えば、交差保護）をもたらすために、対象の同じ又は複数の解剖学的位置に連続して導入してもよい。ある実施形態では、本明細書で開示された免疫原性組成物は、これらに限定されないが、対象に投与される４つ全ての血清型（例えば、四価製剤）に対する免疫原性反応を誘導する単一の用量を含んでいてもよく、それにより、全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導することが可能である。ある実施形態では、対象は、単一の用量で、４つ全てのデングウイルス血清型に対する適切な免疫応答を誘導することができる単一用量組成物を受容してもよい。他の実施形態では、免疫原性組成物は、他のフラビウイルス（例えば、ジカウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、又は他のウイルス）に対する他の免疫原性剤と組み合わせて、弱毒生デングウイルス血清型を含んでいてもよい。ある実施形態では、本明細書で開示されたデングウイルスに対するワクチンは、他の関連ウイルス感染、例えば、ジカウイルス感染を低減するために使用することができる。
【0080】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示された医薬組成物は、デングウイルスに対する免疫原性組成物を、デングウイルスに対するそのような医薬組成物を受容した小児又は若年成人に、１つ又は複数のデングウイルス血清型に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答又は他の免疫原応答を増強する作用剤（例えば、デングウイルスの１つ又は複数の構造又は非構造成分）と組み合わせることにより、小児又は若年成人における目的製剤の免疫応答を増加させるために使用することができる。
【0081】
局所投与は、治療有効量のセリンプロテアーゼ阻害剤を含有するクリーム、ゲル、リンス等を局所塗布することにより達成される。経皮投与は、セリンプロテアーゼ阻害剤の皮膚透過及び血流への進入を可能にすることができるクリーム、リンス、ゲル等を塗布することにより達成される。加えて、浸透圧ポンプを投与に使用してもよい。必要な用量は、治療されている特定の状態、投与方法、及び体内からの分子のクリアランス速度に応じて様々であろう。
【0082】
他の実施形態は、これらに限定されないが、１つ又は複数の弱毒生ウイルスを、弱毒生ウイルス（例えば、フラビウイルス）の不活化を低減することが可能な組成物と組み合わせることを含む、弱毒生ウイルスの不活化を減少させるための方法に関する。不活化を減少させることができるか又は弱毒生ウイルスを安定化することができるこれら組成物としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：１つ又は複数のタンパク質作用剤；１つ又は複数のサッカリド又はポリオール作用剤；及び任意選択で１つ又は複数のＥＯ－ＰＯブロックコポリマー。
【0083】
ある実施形態では、本明細書で企図された組成物は、部分的に又は完全に脱水又は水和されていてもよい。他の実施形態では、本明細書の医薬又は非医薬組成物での使用が企図される安定化タンパク質作用剤としては、これらに限定されないが、ラクトアルブミン、ヒト血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、他の血清アルブミン、又はアルブミン遺伝子ファミリーメンバーを挙げることができる。サッカリド又はポリオール作用剤としては、これらに限定されないが、モノサッカリド、ジサッカリド、糖アルコール、トレハロース、スクロース、マルトース、イソマルトース、セリビオース（ｃｅｌｌｉｂｉｏｓｅ）、ゲンチオビオース、ラミナリボース（ｌａｍｉｎａｒｉｂｏｓｅ）、キシロビオース、マンノビオース、ラクトース、フルクトース、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、キシリトール、エリトリトール、ラフィノース、アミルス（ａｍｙｌｓｅ）、シクロデキストリン、キトサン、又はセルロースを挙げることができる。ある実施形態では、界面活性剤としては、これらに限定されないが、アルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー（ＥＯ－ＰＯブロックコポリマー）、ポリ（ビニルピロロイドン（ｐｙｒｒｏｌｏｉｄｏｎｅ））、アルキルポリグルコシド（スクロースモノステアレート、ラウリルジグルコシド、又はソルビタンモノラウレレート（ｍｏｎｏｌａｕｒｅａｔｅ）、オクチルグルコシド、及びデシルマルトシド等）、脂肪アルコール（セチルアルコール又はオレリル（ｏｌｅｌｙｌ）アルコール）、又はコカミド（コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、及びコカミドＴＥＡ）等の非イオン性界面活性剤を挙げることができる。
【0084】
他の実施形態では、界面活性剤としては、これらに限定されないが、ポロキサマー４０７（例えば、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７）、ポロキサマー４０７の代わりに又はそれに加えて、ポロキサマー３３５、３３８、若しくは２３８、又はＦ１２７（商標）と同様の特徴を有する他のＥＯ－ＰＯブロックコポリマーを挙げることができる。
【0085】
幾つかの実施形態では、ワクチン組成物は、これらに限定されないが、血清アルブミンである１つ又は複数のタンパク質作用剤；トレハロースである１つ又は複数のサッカリド作用剤；及びＥＯ－ＰＯブロックコポリマー、ポロキサマー４０７、又はより具体的にはプルロニック（登録商標）Ｆ１２７等の１つ又は複数の界面活性ポリマー剤を含んでいてもよい。
【0086】
他の実施形態では、生ウイルスを安定化するための製剤は、１つ又は複数の生菌フラビウイルス、１つ又は複数の炭水化物作用剤、及び１つ又は複数のアミノ酸、又はそれらの塩、エステル、若しくはアミド誘導体を含んでいてもよい。他の実施形態では、本明細書で有用な製剤は、商業使用のために弱毒生フラビウイルスを安定化する。幾つかの実施形態では、組成物は、緩衝液を更に含んでいる。これらの実施形態によると、緩衝液は、これらに限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含んでいてもよい。これらの実施形態によると、緩衝液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、一ナトリウム及び／又は二ナトリウムリン酸塩（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、及びリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）の少なくとも１つを含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、組成物の緩衝液は、２５ｍＭ～２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムを含んでいてもよい。他の実施形態では、本明細書で開示された組成物は、尿素及び／又はＭＳＧ他の好適な作用剤を含んでいてもよい。
【0087】
幾つかの実施形態では、デングウイルス等の弱毒生フラビウイルスは、これらに限定されないが、以下のものを含む製剤中で安定化することができる：０．１％から０．２％（ｗ／ｖ）までの濃度を有する組換えＨＳＡ；及び／又は約４．０％から約６．０％（ｗ／ｖ）までの濃度を有するスクロース；及び／又は約２％から４％（ｗ／ｖ）までの濃度を有するマンニトール；及び／又は約８．０ｍＭから約２２．０ｍＭまでの濃度を有するアラニン；及び／又は約１．０ｍＭから約５．０ｍＭまでの濃度を有するメチオニン；及び／又は約８．０ｍＭから１２．０ｍＭまでの濃度を有するＭＳＧ；及び／又は約０．１％から約０．３％（ｗ／ｖ）までの濃度を有する尿素。ある実施形態では、組成物は、組換えＨＳＡ、トレハロース、マンニトール、アラニン、メチオニン、ＭＳＧ、及び尿素を含んでいてもよい。他の実施形態では、安定化組成物は、約０．１％から約０．２％（ｗ／ｖ）までの濃度のＨＳＡ、約４％から約６％（ｗ／ｖ）までのトレハロース濃度、約２％から約４％（ｗ／ｖ）までのマンニトール濃度を含んでいてもよく、アラニン濃度は、８ｍＭから２２ｍＭまでであり、メチオニン濃度は、１ｍＭから５ｍＭまでであり、ＭＳＧ濃度は、８ｍＭから１２ｍＭまでであり、尿素濃度は、０．１％から０．３％（ｗ／ｖ）までである。弱毒生ウイルスを安定化するためのある製剤は、これらに限定されないが、組換えＨＳＡ、スクロース、アラニン、及び尿素を含んでいてもよい。これらの実施形態によると、ＨＳＡ濃度は、約０．１％から約０．２％（ｗ／ｖ）までであってもよく、スクロース濃度は、約４％から約６％（ｗ／ｖ）までであってもよく、アラニン濃度は、約８．０ｍＭから約２２ｍＭまでであってもよく、尿素濃度は、約０．１％から約０．３％（ｗ／ｖ）までであってもよい。他の安定化製剤は、組換えＨＳＡ、スクロース、メチオニン、及び尿素を含んでいてもよい。組換えＨＳＡ濃度は、約０．１％から０．２％（ｗ／ｖ）までであってもよく、スクロース濃度は、約４．０％から約６．０％（ｗ／ｖ）までであってもよく、メチオニン濃度は、約１．０ｍＭから約５．０ｍＭまでであってもよく、尿素濃度は、約０．１％から約０．３％（ｗ／ｖ）までであってもよい。他の実施形態では、安定化製剤は、組換えＨＳＡ、スクロース、アルギニン、及び尿素を含んでいてもよく、組換えＨＳＡ濃度は、０．１％から０．２％（ｗ／ｖ）までであってもよく、スクロース濃度は、４％から６％（ｗ／ｖ）までであってもよく、アルギニン濃度は、１０ｍＭから５０ｍＭまでであってもよく、尿素濃度は、０．１％から０．３％（ｗ／ｖ）までであってもよい。他の安定化製剤は、組換えＨＳＡ、トレハロース、アルギニン、及び尿素を含んでいてもよく、組換えＨＳＡ濃度は、約０．１％から０．２％（ｗ／ｖ）までであり、トレハロース濃度は、約４％から６％（ｗ／ｖ）まであり、アルギニン濃度は、約１０ｍＭから５０ｍＭまでであり、尿素濃度は、約０．１％から０．３％（ｗ／ｖ）まである。他の実施形態では、安定化組成物は、組換えＨＳＡ、トレハロース、ＭＳＧ、及び尿素を含んでいてもよい。これらの実施形態によると、ＨＳＡ濃度は、約０．１％から約０．２％（ｗ／ｖ）までであってもよく、トレハロース濃度は、約４．０％から約６．０％（ｗ／ｖ）までであってもよく、ＭＳＧ濃度は、８ｍＭから約１２ｍＭまでであり、尿素濃度は、０．１％から０．３％（ｗ／ｖ）までである。
【0088】
本明細書の幾つかの実施形態は、輸送のため又は他の理由のため部分的に又は完全に脱水された弱毒生ウイルス組成物に関する。これらの実施形態によると、組成物は、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上脱水されていてもよい。これらの実施形態によると、ウイルスワクチン組成物は、脱水されていてもよく、薬学的に許容される組成物を小児又は若年成人に投与する前に、任意の公知の安定化組成物に再水和することができる。
【0089】
ある実施形態では、対象は、ヒト、又は獣医学的な及び／若しくは飼育された動物、又は家畜、又は野生動物等の哺乳動物であってもよい。ある実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、２０歳以下のヒト小児等の、若年対象の免疫に有効であってもよい。小児に使用されている現行のデングウイルスワクチン／免疫原性組成物（例えば、デング／黄熱病キメラ）に関する技術水準は、９歳以下の小児では効力及び／又は免疫原性が低いことが報告されているが、本明細書で開示された免疫原性組成物は、約１歳から約１７歳まで、又は約１歳から約９歳若しくはそれよりも年長の小児において、有効な免疫応答を生成することができる。本明細書で開示された免疫原性組成物は、技術水準と比較して、優れた効力及び免疫原性を示す。
【0090】
１つの例示的な方法では、示されている４つ全てのデングウイルス血清型（例えば、四価製剤）を有する、本明細書で開示された免疫原性組成物であって、対象において４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘発することができる組成物を、対象に投与してもよい。ある実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、本明細書で開示された種々のデングウイルス血清型構築体又は弱毒生デングウイルスのポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの組合せを含んでいてもよい。他の実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号９（プレマスター）、配列番号１１（ＭＶＳ）、配列番号１３（ＷＶＳ）、又は配列番号１５（ＢＶＳ）により表される、改変弱毒生デング－２ウイルス血清型をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド；配列番号１（プレマスター）、配列番号３（ＭＶＳ）、配列番号５（ＷＶＳ）、又は配列番号７（ＢＶＳ）により表される、改変弱毒生デング－２ウイルス血清型に由来する非構造タンパク質及びデング－１ウイルス血清型に由来する構造タンパク質をコードする核酸配列を有するデング－１／デング－２キメラポリヌクレオチド；配列番号１７（プレマスター）、配列番号１９（ＭＶＳ）、配列番号２１（ＷＶＳ）、又は配列番号２３（ＢＶＳ）により表される、改変弱毒生デング－２ウイルス血清型に由来する非構造タンパク質及びデング－３ウイルス血清型に由来する構造タンパク質をコードする核酸配列を有するデング－３／デング－２キメラポリヌクレオチド；及び配列番号２５（プレマスター）、配列番号２７（ＭＶＳ）、配列番号２９（ＷＶＳ）、又は配列番号３１（ＢＶＳ）により表される、改変弱毒生デング－２ウイルス血清型に由来する非構造タンパク質及びデング－４ウイルス血清型に由来する構造タンパク質をコードする核酸配列を有するデング－４／デング－２キメラポリヌクレオチドを含んでいてもよい。これらポリヌクレオチドは、それらがコードする種々のポリペプチドを伴って又は伴わずに含まれていてもよい。ある実施形態では、本明細書で開示された免疫原性組成物は、配列番号１０（プレマスター）、配列番号１２（ＭＶＳ）、配列番号１４（ＷＶＳ）、又は配列番号１６（ＢＶＳ）により表される、改変弱毒生デング－２ウイルス血清型に対応する１つ又は複数のポリペプチド；配列番号２（プレマスター）、配列番号４（ＭＶＳ）、配列番号６（ＷＶＳ）、又は配列番号８（ＢＶＳ）により表される、デング－１／デング－２キメラポリヌクレオチドに対応する１つ又は複数のポリペプチド；配列番号１８（プレマスター）、配列番号２０（ＭＶＳ）、配列番号２２（ＷＶＳ）、又は配列番号２４（ＢＶＳ）により表される、デング－３／デング－２キメラポリヌクレオチドに対応する１つ又は複数のポリペプチド；及び／又は配列番号２６（プレマスター）、配列番号２８（ＭＶＳ）、配列番号３０（ＷＶＳ）、又は配列番号３２（ＢＶＳ）により表される、デング－４／デング－２キメラポリヌクレオチドに対応する１つ又は複数のポリペプチドを含んでいてもよい。
【0091】
本明細書で開示された種々のポリヌクレオチド及びポリペプチド（例えば、ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、ＴＤＶ－３、及びＴＤＶ－４）の濃度は、ほぼ同じであってもよく、又はあるデングウイルス血清型は、１つ又は複数の血清型の必要性又は流行に応じて、他のものよりも多くの量で免疫原性組成物中に存在していてもよい。これらの実施形態によると、種々の濃度又は比は、図１１Ａ～図１１Ｂに示されているように、互いと比較したｌｏｇＰＦＵ濃度として表すことができる。例えば、ＴＤＶ－１の、ＴＤＶ－２、ＴＤＶ－３、ＴＤＶ－４に対する比に基づく濃度を、本明細書で開示された免疫原性組成物の種々の四価製剤に適用することができる。濃度としては、これらに限定されないが、以下のものを挙げることができる：３：３：３：３、４：４：４：４、５：５：５：５、５：１：５：５、３：２：３：３、４：２：４：４、５：３：５：５、４：３：４：４、５：４：５：５、４：４：５：５のｌｏｇＰＦＵ濃度、又は当業者であれば本開示に基づき容易に認識されると考えられるような、例えば、製剤中に存在する血清型の数、所定の応答、及び所望の効果に応じた、デングウイルス血清型のいずれかの任意の濃度比。
【0092】
ある実施形態では、４つ全てのデングウイルス血清型に対するよりバランスのとれた免疫応答を誘導し、ウイルス干渉を低減するために、弱毒生デング－２ウイルスの濃度は、免疫原性組成物中の他のデングウイルス血清型の１つ又は複数よりも、０．５、１、１．５、２、２．５、３、又は４ｌｏｇＰＦＵ低くてもよい。現行のデングウイルスワクチン／免疫原性組成物に関する技術水準は、デング－２ウイルスに対する効力及び／又は免疫原性がより低いことが報告されているが、本明細書で開示された免疫原性組成物は、たとえ弱毒生デング－２ウイルスが、他のデングウイルス血清型よりも、少なくとも１ｌｏｇＰＦＵ低くてもよい場合でも、６０％よりも多くの、ある場合には約８５％の対象に、デング－２を含む４つ全てのデングウイルス血清型に対する有効な免疫応答をもたらすことができる製剤を提供する（例えば、図１５～図１６を参照）。本開示の免疫原性組成物は、技術水準と比較して、２０歳以下の対象に対して優れた効力及び免疫原性を示し、全ての年齢で、４つ全てのデングウイルス血清型に対するよりバランスのとれた免疫応答を提供する。ある実施形態では、１つ又は複数の用量の弱毒生ワクチンを投与した後、ある製剤の効力を経時的に分析するために、血清転換率を評価してもよい。
【0093】
ある実施形態では、デングウイルスに対する免疫原性組成物は、約１．０×１０３から約５×１０５ＰＦＵまでの濃度を有するデング－１／デング－２キメラ；約１．０×１０３から約５×１０５ＰＦＵまでの濃度を有する弱毒生デング－２；約５．０×１０３から約５×１０５ＰＦＵまでの濃度を有するデング－３／デング－２キメラ；及び／又は約１．０×１０４から約５×１０６ＰＦＵまでの濃度を有するデング－４／デング－２キメラの１つ又は複数を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、四価製剤は、三価又は四価製剤中のデング－１／デング－２キメラ及び弱毒生デング－２よりも、少なくとも２分の１～１ｌｏｇ高い濃度のデング－３／デング－２キメラを含んでいてもよく、デング－４／デング－２は、三価又は四価製剤中のデング－１／デング－２キメラ及び弱毒生デング－２よりも、少なくとも２分の１～１ｌｏｇ高い濃度であってもよい。ある実施形態では、本明細書で企図された二価、三価、又は四価製剤中のデング－３／デング－２及びデング－４／デング－２キメラの濃度は同じであってもよく、又はデング－４／デング－２キメラ濃度は、デング－３／デング－４よりも高くてもよい。幾つかの実施形態では、本明細書で開示された組成物及び方法により治療される対象は、例えば、対象の場所及び旅行計画に応じて、年２回、年１回、１８か月に１回、又は類似レジメンで治療することができる。ある実施形態では、デングウイルスに対する免疫原性組成物は、約２．０×１０４ＰＦＵの濃度を有するデング－１／デング－２キメラ；約５．０×１０３ＰＦＵの濃度を有する弱毒生デング－２；約１×１０５ＰＦＵの濃度を有するデング－３／デング－２キメラ；及び／又は約３．０×１０５ＰＦＵの濃度を有するデング－４／デング－２キメラの１つ又は複数を含んでいてもよい。
【0094】
ある実施形態では、本明細書で開示された組成物を受容する小児又は若年成人は、デング感染又は他のフラビウイルス感染に関連する任意の症状又は徴候の発症について、ある期間にわたって評価することができる。例えば、小児又は若年成人は、デング熱又はデング感染に関連する他の症状若しくは徴候の発症について評価することができる。
【0095】
治療方法
本開示の１つの実施形態では、方法は、本明細書で企図された弱毒生及び／又はキメラウイルス構築体の一価、二価、三価、又は四価製剤を使用した、デングウイルス血清型に対する免疫応答の誘導を提供する。
本開示の１つの実施形態では、方法は、本明細書で企図された弱毒生及び／又はキメラウイルス構築体の一価、二価、三価、又は四価製剤を使用した、デングウイルス血清型に対する免疫応答の誘導を提供する。
【0096】
本開示の実施形態は、以下の非限定的な例により更に説明されるが、それらは、本開示の範囲に限定を加えるものとは、いかなる点でも解釈されるべきではない。むしろ、本明細書を読んだ後、当業者であれば自明であり得る、種々の他の実施形態、改変、及びそれらの等価物を、本開示の趣旨又は添付の特許請求の範囲から逸脱せずになし得うることが明白に理解されるべきである。
【0097】
実施例
以下の実施例は、本明細書に示されているある実施形態を説明するために含まれている。当業者であれば、以下の実施例で開示された技法が、本明細書で開示された実施において良好に機能することが発見された技法であり、したがってその実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができることを理解するはずである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示された特定の実施形態に数多くの変更をなすことができ、それでも依然として本明細書の趣旨及び範囲から逸脱せずに類似の又は同様の結果を得ることができることを認識するはずである。
以下の実施例は、本明細書に示されているある実施形態を説明するために含まれている。当業者であれば、以下の実施例で開示された技法が、本明細書で開示された実施において良好に機能することが発見された技法であり、したがってその実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができることを理解するはずである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示された特定の実施形態に数多くの変更をなすことができ、それでも依然として本明細書の趣旨及び範囲から逸脱せずに類似の又は同様の結果を得ることができることを認識するはずである。
【0098】
実施例１
幾つかの例示的な方法では、本明細書において「マスターウイルスシード（ＭＶＳ）」と呼ばれるものを生成するために使用された組成物が開示される。そうした組成物は、ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３、及びＤＥＮ－４等の１つ又は複数の弱毒生デングウイルスから導出することができる。ある方法では、組成物は、これらに限定されないが、ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、ＴＤＶ－３、及びＴＤＶ－４と呼ばれる、本明細書で開示された特定の構築体を含む１つ又は複数の弱毒生デングウイルスから導出することができる（例えば、以前にはＤＥＮＶａｘと表示されている）。他の例示的な方法では、こうした組成物を生成及び特徴付けるために使用される戦略が提供される。更なる他の実施形態では、四価デングウイルス製剤、並びにそうした製剤の遺伝子及び表現型の特徴付けが提供される。こうした構築体を使用して、１歳から２０歳までの小児又は若年成人を治療するために有用な免疫原性組成物を生成することができる。
幾つかの例示的な方法では、本明細書において「マスターウイルスシード（ＭＶＳ）」と呼ばれるものを生成するために使用された組成物が開示される。そうした組成物は、ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３、及びＤＥＮ－４等の１つ又は複数の弱毒生デングウイルスから導出することができる。ある方法では、組成物は、これらに限定されないが、ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、ＴＤＶ－３、及びＴＤＶ－４と呼ばれる、本明細書で開示された特定の構築体を含む１つ又は複数の弱毒生デングウイルスから導出することができる（例えば、以前にはＤＥＮＶａｘと表示されている）。他の例示的な方法では、こうした組成物を生成及び特徴付けるために使用される戦略が提供される。更なる他の実施形態では、四価デングウイルス製剤、並びにそうした製剤の遺伝子及び表現型の特徴付けが提供される。こうした構築体を使用して、１歳から２０歳までの小児又は若年成人を治療するために有用な免疫原性組成物を生成することができる。
【0099】
プレマスターＴＤＶウイルスの生産及び分析
デングウイルス（例えば、ＴＤＶ）の連続増幅及び精製等の、ある手順を実施して、プレマスターデングウイルスシードを生成した。まず、全長組換えＴＤＶ ｃＤＮＡから転写されたウイルスＲＮＡを、生産認定細胞（例えば、ベロ細胞）にトランスフェクションすることによりＴＤＶウイルスを再導出して、Ｐ１（継代１）ウイルスシードを得た。その後、デング－１～デング－４の各々に由来する４つのＰ１ウイルスを増幅し、プラークを精製して、候補プレマスターワクチンＰ７シードを得た（表１を参照）。ある試験を実施して、デングウイルスの継代を分析した。例えば、全長ゲノム配列決定により、Ｐ２（継代２）シードウイルスの４つ全てが、それらの相同性前駆体である研究由来で研究等級の候補ワクチンウイルスと遺伝子的に同一であることが示された。元のプラーク表現型もＰ２ウイルスで保持されていた。デングウイルスの各血清型（例えば、ＴＤＶ１～４）毎に、６つのプラーク精製ウイルス（Ｐ３ Ａ～Ｆ）をＰ２シードから単離した。単離したプラークを、更に２回、直接プラーク精製した。各ウイルスの３回目のプラーク精製（Ｐ５）を、ベロ細胞で２回増幅して（Ｐ６ Ａ～Ｆ及びＰ７ Ａ～Ｆ）、潜在的プレマスターＰ７ ＴＤＶシード（表１）を生産した。
デングウイルス（例えば、ＴＤＶ）の連続増幅及び精製等の、ある手順を実施して、プレマスターデングウイルスシードを生成した。まず、全長組換えＴＤＶ ｃＤＮＡから転写されたウイルスＲＮＡを、生産認定細胞（例えば、ベロ細胞）にトランスフェクションすることによりＴＤＶウイルスを再導出して、Ｐ１（継代１）ウイルスシードを得た。その後、デング－１～デング－４の各々に由来する４つのＰ１ウイルスを増幅し、プラークを精製して、候補プレマスターワクチンＰ７シードを得た（表１を参照）。ある試験を実施して、デングウイルスの継代を分析した。例えば、全長ゲノム配列決定により、Ｐ２（継代２）シードウイルスの４つ全てが、それらの相同性前駆体である研究由来で研究等級の候補ワクチンウイルスと遺伝子的に同一であることが示された。元のプラーク表現型もＰ２ウイルスで保持されていた。デングウイルスの各血清型（例えば、ＴＤＶ１～４）毎に、６つのプラーク精製ウイルス（Ｐ３ Ａ～Ｆ）をＰ２シードから単離した。単離したプラークを、更に２回、直接プラーク精製した。各ウイルスの３回目のプラーク精製（Ｐ５）を、ベロ細胞で２回増幅して（Ｐ６ Ａ～Ｆ及びＰ７ Ａ～Ｆ）、潜在的プレマスターＰ７ ＴＤＶシード（表１）を生産した。
【0100】
【表1】
【0101】
Ｐ７シードのゲノム配列及びプラーク表現型の分析等の、幾つかの試験を更に実施して、Ｐ７ ＴＤＶシードを特徴付け、Ｐ２シードと比較した（表２）。Ｐ７ウイルスのプラーク表現型は、概してＰ２シードと類似していた。幾つかの例示的な実験では、ウイルス力価をモニターした。ウイルス力価は、５つのウイルスを除き、Ｐ７シードのほとんどで、６．０ｌｏｇ ｐｆｕ／ｍｌを超える値に達した。ベロ細胞で１０回以上連続継代した後の６０個よりも多くの候補ワクチンウイルスシードをゲノム配列決定したところ、ＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ－５３遺伝ベクターの３つの主要弱毒化決定因子のうちＮＳ１－５３及びＮＳ３－２５０には復帰突然変異事象がないことが特定された。これは、候補ワクチンウイルスシードにおいて、これら２つの遺伝子座が非常に安定していることを示唆する。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより、５’ＮＣＲ－５７遺伝子座の復帰突然変異率を正確に測定するために、高感度ミスマッチ増幅アッセイ（ＴａｑＭＡＭＡ）を開発した。幾つかの研究では、Ｐ７シードの２４個全ての５’ＮＣＲ－５７復帰突然変異率を、ＴａｑＭＡＭＡで測定した。アッセイにおける各ウイルスの入力ウイルスＲＮＡの濃度に応じて、ＴａｑＭＡＭＡの検出限界は、０．０１％～０．０７％復帰突然変異の範囲であった。これは、コンセンサスゲノム配列分析により検出可能な１０～３０％復帰突然変異感度限界よりもはるかに高感度である。得られたデータによると、２４個のＰ７ウイルスのうち１５個が、最小限の又は検出不能な復帰突然変異を示し（＜０．０７％）、１つのウイルス（ＴＤＶ－３Ｄ）が、ほとんど１００％の復帰突然変異を示し、８つのウイルス（例えば、ＴＤＶ－１、１つのＴＤＶ－２、２つのＴＤＶ－３、及び４つのＴＤＶ－４）が、０．０８％から１２．８５％までの範囲の部分的復帰変異を示した（表２）。ＴａｑＭＡＭＡでの測定により低レベルの５’ＮＣＲ５７復帰突然変異を示した２４個のＰ７ウイルスのうちの１６個について、全長ゲノム配列決定を実施した。配列決定したウイルスは全て、他の２つのＴＤＶ弱毒化決定因子（ＮＳ１－５３、ＮＳ３－２５０）を維持し、全てが、元の遺伝子改変された組換えｃＤＮＡクローンには存在していなかった更なる突然変異を獲得した（表２）。１つの例示的な目標ワクチン組成物では、ＴＤＶ－１－Ａ、ＴＤＶ－２－Ｆ、ＴＤＶ－３－Ｆ、及びＴＤＶ－４－Ｆを、各血清型の目標プレマスターシードとして選択した。これは、それらの遺伝子型及びプラーク表現型が、元の設計されたワクチン組換え体と最も緊密に類似していたからである。ＴＤＶ－１－Ａ、ＴＤＶ－２－Ｆ、及びＴＤＶ－４－Ｆは、２つの非同義突然変異を有し、ＴＤＶ－３－Ｆは、１つの非同義突然変異を有していた。この証拠は、これら４つのプレマスターシードで観察されたこれら更なる突然変異が、安全性の懸念又はウイルスに対する免疫原性の変更を引き起こさないことを示唆する。これらプレマスターシードを更に増幅して、ＭＶＳを生成した（Ｐ８と表示されているマスターシード、表１）。
【0102】
本明細書で提供された例示的な方法を使用して、純粋な供給源としてのクローンｃＤＮＡプラスミドから、ｉｎ－ｖｉｔｒｏで転写されたウイルスＲＮＡを精製し、ワクチン認定ベロ細胞にトランスフェクトして、ワクチンウイルスを生成した。最適な純度及び遺伝子安定性を有するワクチンシードが確実に製造されるように、連続プラーク精製及び全長ゲノム配列分析を、製造手順に組み込んだ。ＴＤＶの各血清型毎に６つのクローンウイルスを、潜在的プレマスターシードとして調製した。ＴａｑＭＡＭＡ及び完全ゲノム配列決定を含むゲノム分析、並びにウイルスプラーク表現型の特徴付けによりプレマスターシードを選択して、各血清型（血清型１～４）のマスターウイルスシード生産に向かって前進した。選択したプレマスターシードは、５’ＮＣＲ－５７遺伝子座での復帰突然変異が検出不能であり（＜０．０１％又は＜０．０７％）、それらのゲノムに１つ又は２つのアミノ酸置換を有し、以前に観察された小プラーク表現型を保持していた。
【0103】
【表2】
【0104】
実施例２
別の例示的な方法では、マスターウイルスシード、ワーキングウイルスシード、及びバルクウイルスシードの組成物、並びにそれらの遺伝子及び表現型の特徴付けが記載される。これら組成物は、臨床材料を製造するため、及び最終的には商業的ワクチンを供給するために提供される。ワクチンシードの組成物が、臨床試験材料を製造するための最適な安全性及び遺伝子安定性を確実に有するように、連続プラーク精製及び全長ゲノム配列分析を製造手順に組み込んだ。
別の例示的な方法では、マスターウイルスシード、ワーキングウイルスシード、及びバルクウイルスシードの組成物、並びにそれらの遺伝子及び表現型の特徴付けが記載される。これら組成物は、臨床材料を製造するため、及び最終的には商業的ワクチンを供給するために提供される。ワクチンシードの組成物が、臨床試験材料を製造するための最適な安全性及び遺伝子安定性を確実に有するように、連続プラーク精製及び全長ゲノム配列分析を製造手順に組み込んだ。
【0105】
ＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳの生産及び製造品質管理
幾つかの研究では、４つのＴＤＶのＭＶＳを、認定ベロ細胞でプレマスターＰ７シードを増幅することにより生産した。他の研究では、ＭＶＳを使用して、セルファクトリー（ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ）で大量のＷＶＳを製作した。更に、ＴＤＶのＢＶＳストックをＷＶＳから増幅し、ヒト臨床試験に使用した。製品出荷の品質管理は、ＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳの全てを、同一性、感染力価、不稔性、マイコプラズマ、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ外来性因子に関して試験することを含む、幾つかの例示的な方法で実施した。シードは全て、血清型特異的ＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用したウイルス同定試験に合格し、その血清型に対応する陽性増幅を示し、異種性血清型には陰性を示した（データ非表示）。ＭＶＳ、ＷＶＳ、又はＢＶＳストックでは、検出可能なマイコプラズマ又は外来性因子は検出されなかった。
幾つかの研究では、４つのＴＤＶのＭＶＳを、認定ベロ細胞でプレマスターＰ７シードを増幅することにより生産した。他の研究では、ＭＶＳを使用して、セルファクトリー（ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ）で大量のＷＶＳを製作した。更に、ＴＤＶのＢＶＳストックをＷＶＳから増幅し、ヒト臨床試験に使用した。製品出荷の品質管理は、ＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳの全てを、同一性、感染力価、不稔性、マイコプラズマ、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ外来性因子に関して試験することを含む、幾つかの例示的な方法で実施した。シードは全て、血清型特異的ＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用したウイルス同定試験に合格し、その血清型に対応する陽性増幅を示し、異種性血清型には陰性を示した（データ非表示）。ＭＶＳ、ＷＶＳ、又はＢＶＳストックでは、検出可能なマイコプラズマ又は外来性因子は検出されなかった。
【0106】
１つの例示的な方法では、示されている４つ全てのデングウイルス血清型（例えば、四価製剤）を有する、本明細書で開示された免疫原性組成物であって、小児又は若年成人において４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘発することができる組成物を、小児又は若年成人に投与してもよい。
【0107】
ＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳの遺伝子分析
ある例示的な方法では、選択したプレＭＶＳ（Ｐ７）からＭＶＳを生成した後、上記で選択した株を生産し、それぞれのウイルスＲＮＡを再び配列決定した。全長ゲノム配列決定により、ＴＤＶ－１のＭＶＳは、そのプレマスターシードと同一であったが、ＷＶＳ及びその後のＢＶＳは、Ｅ－４８３及びＮＳ４Ｂ－１０８に２つの更なる置換を獲得したことが明らかになった（表２及び表３を参照）。Ｅ－４８３でのＡｌａ置換は、ＭＶＳでは遺伝子型の一部であったが、ＢＶＳでは最も有力な遺伝子型になった。ＴＤＶ－２及びＴＤＶ－３は、それらのそれぞれのプレマスターシードと同一であった（表２及び表３）。ＴＤＶ－２ ＭＶＳは、そのプレマスターシードと同一であった。ＷＶＳ及びＢＶＳは、ＮＳ４Ａ－３６及びＮＳ４Ｂ－１１１に２つの更なる突然変異を持していた。両突然変異は、ＷＶＳでは部分的であり、ＢＶＳでは主要な遺伝子型であった。ＴＤＶ－３のＭＶＳも、プレマスターシードと同一であった。しかしながら、ＷＶＳ及びＢＶＳは、ＮＳ４Ａ－２３に更なるアミノ酸置換を含んでいた。ＴＤＶ－４ ＭＶＳは、ＭＶＳの生産中に、遺伝子座ＮＳ２Ａ－９９に更なるアミノ酸置換（ＬｙｓからＬｙｓ／Ａｒｇ混合遺伝子型への）を獲得した（表３）。そのＷＶＳ及びＢＶＳは、ＮＳ２Ａ－９９ Ｌｙｓ／Ａｒｇ混合遺伝子型を保持し、ＢＶＳは、追加のＮＳ４Ｂ－２３８ Ｓｅｒ／Ｐｈｅ混合遺伝子型を有していた。また、コンセンサス配列結果は、ＭＶＳ、ＢＶ、並びにＷＶＳが、５’ＮＣＲ－５７、ＮＳ１－５３、及びＮＳ３－２５０遺伝子座に３つの弱毒化遺伝的決定因子を保持することを確認した。ＴａｑＭＡＭＡによる最小安定弱毒化遺伝子座の分析は、５’ＮＣＲ－５７復帰突然変異率が、ＭＶＳでは＜０．７％～０．１３％であり、ＷＶＳでは≦０．０７％であり、ＢＶＳでは＜０．０７～０．２１％であることを示した。５’ＮＣＲ－５７遺伝子座における３％復帰突然変異を、ワクチンロット受け入れの最大許容率とみなした（表３）。
ある例示的な方法では、選択したプレＭＶＳ（Ｐ７）からＭＶＳを生成した後、上記で選択した株を生産し、それぞれのウイルスＲＮＡを再び配列決定した。全長ゲノム配列決定により、ＴＤＶ－１のＭＶＳは、そのプレマスターシードと同一であったが、ＷＶＳ及びその後のＢＶＳは、Ｅ－４８３及びＮＳ４Ｂ－１０８に２つの更なる置換を獲得したことが明らかになった（表２及び表３を参照）。Ｅ－４８３でのＡｌａ置換は、ＭＶＳでは遺伝子型の一部であったが、ＢＶＳでは最も有力な遺伝子型になった。ＴＤＶ－２及びＴＤＶ－３は、それらのそれぞれのプレマスターシードと同一であった（表２及び表３）。ＴＤＶ－２ ＭＶＳは、そのプレマスターシードと同一であった。ＷＶＳ及びＢＶＳは、ＮＳ４Ａ－３６及びＮＳ４Ｂ－１１１に２つの更なる突然変異を持していた。両突然変異は、ＷＶＳでは部分的であり、ＢＶＳでは主要な遺伝子型であった。ＴＤＶ－３のＭＶＳも、プレマスターシードと同一であった。しかしながら、ＷＶＳ及びＢＶＳは、ＮＳ４Ａ－２３に更なるアミノ酸置換を含んでいた。ＴＤＶ－４ ＭＶＳは、ＭＶＳの生産中に、遺伝子座ＮＳ２Ａ－９９に更なるアミノ酸置換（ＬｙｓからＬｙｓ／Ａｒｇ混合遺伝子型への）を獲得した（表３）。そのＷＶＳ及びＢＶＳは、ＮＳ２Ａ－９９ Ｌｙｓ／Ａｒｇ混合遺伝子型を保持し、ＢＶＳは、追加のＮＳ４Ｂ－２３８ Ｓｅｒ／Ｐｈｅ混合遺伝子型を有していた。また、コンセンサス配列結果は、ＭＶＳ、ＢＶ、並びにＷＶＳが、５’ＮＣＲ－５７、ＮＳ１－５３、及びＮＳ３－２５０遺伝子座に３つの弱毒化遺伝的決定因子を保持することを確認した。ＴａｑＭＡＭＡによる最小安定弱毒化遺伝子座の分析は、５’ＮＣＲ－５７復帰突然変異率が、ＭＶＳでは＜０．７％～０．１３％であり、ＷＶＳでは≦０．０７％であり、ＢＶＳでは＜０．０７～０．２１％であることを示した。５’ＮＣＲ－５７遺伝子座における３％復帰突然変異を、ワクチンロット受け入れの最大許容率とみなした（表３）。
【0108】
【表3】
【0109】
全長ゲノム配列分析により、ＴＤＶ－４ ＭＶＳには更なるアミノ酸突然変異が発生したが、他の３つのＴＤＶ ＭＶＳロットは、それらのプレマスターシードのコンセンサスゲノム配列を保持したことが明らかになった。Ｐ１シードからプレマスター（Ｐ７）シードまでは、１つ又は２つの非同義突然変異が、所与のシードに生じたに過ぎなかった。Ｐ１からＭＶＳ（Ｐ８）シードまでには、２～７つのヌクレオチド置換が、任意の所与のＴＤＶシードで特定され、これら置換のうち２～３つがアミノ酸変化をもたらしたに過ぎなかった。ＭＶＳのサイレント突然変異はいずれも、ウイルス複製に影響を及ぼし得る５’又は３’ＮＣＲ内ではなかった。保存的変化ではないのは、ＴＤＶ－２のｐｒＭ－５２ Ｌｙｓ－Ｇｌｕの変化、及びＴＤＶ－４のＮＳ２Ａ－６６ Ａｓｐ－Ｇｌｙ置換のみである。ＴＤＶ－４のＮＳ２Ａ－６６突然変異は、ＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ－５３の非構造骨格部分にある。ＮＳ２Ａ－６６遺伝子座は、ＤＥＮＶ－２の種々の株では、通常はＡｓｐであるが、ＤＥＮＶ－４の場合、通常はＧｌｙである。ＴＤＶ－４におけるＡｓｐからＧｌｙへの変化は、ベロ細胞におけるＴＤＶ－４の適応性に関連すると考えられる。ＴＤＶ－２ ｐｒＭ－５２突然変異は、成熟ウイルス粒子から切断されるｐｒＭのＣ末端部分に存在する。幾つかの例示的な方法では、表現型特徴付けを実施して、ＭＶＳシードにおける突然変異がいずれもワクチンの弱毒化表現型を著しくは変更しなかったことを確認した。
【0110】
ＴＤＶウイルスは、製造プロセス中、高い遺伝子安定性を示した。５’ＮＣＲ、ＮＳ１－５３、及びＮＳ３－２５０に位置する３つの画定されているＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ－５３弱毒化遺伝子座は、プレマスター株からバルクワクチン調製物へのＴＤＶの連続継代に際し、コンセンサスゲノム配列の安定を維持した。５’ＮＣＲ－５７遺伝子座の高高感度ＴａｑＭＡＭＡは、デングウイルス血清型のＭＶＳ、ＷＶＳ（Ｐ９／ワーキング）、及びＢＶＳ（ワクチンのバルクウイルスシード）における復帰突然変異が最小限であるか又は検出不能であることを示した。ＴＤＶ ＢＶＳ調製物（Ｐ１０等価物）の５’ＮＣＲ－５７復帰突然変異率は、ベロ細胞での１０連続継代後に研究等級ワクチン候補で発生した５’ＮＣＲ－５７復帰突然変異率よりも著しく低かった（４～７４％復帰突然変異）。本明細書で提供されたＴＤＶシードの大規模製造戦略は、候補ワクチンウイルスに弱毒化マーカーを保持する遺伝子的に安定したワクチンシードをもたらした。
【0111】
ＴＤＶウイルス構築体は全て、安定化緩衝液で保管することができる（例えば、ＦＴＡ、ポロキサマー４０７ Ｆ１２７（商標）（０.０１％～約３．０％ｗ／ｖ）、及び約５％～約５０％（ｗ／ｖ）トレハロース）、及び約０．０１％～約３．０％アルブミン（例えば、ｒＨＳＡ））。
【0112】
安全性及びｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性
この例では、例示的な組成物が、皮下注射後に安全であり、本質的に、免疫不活性であることが示される。マウスで試験するための４つの異なる例示的な組成物を、以下のように選択した（データ非表示）。
この例では、例示的な組成物が、皮下注射後に安全であり、本質的に、免疫不活性であることが示される。マウスで試験するための４つの異なる例示的な組成物を、以下のように選択した（データ非表示）。
【0113】
製剤１：１５％トレハロース、２％Ｆ－１２７、１％ｒＨＳＡ
製剤２：１５％トレハロース、２％Ｆ－１２７、１％ｒＨＳＡ、１ｍＭ ＣａＣｌ２／０．５ｍＭ ＭｇＳＯ４
製剤３：１５％トレハロース、２％Ｆ－１２７、１％ｒＨＳＡ、０．５％キトサン
製剤４：２２．５％トレハロース、３％Ｆ－１２７、１．５％ｒＨＳＡ
製剤５：ＰＢＳ
ＴＤＶ ＭＶＳのプラーク表現型
１つの例示的な方法では、ＴＤＶ ＭＶＳのプラーク表現型を、野生型デングウイルス及びベロ細胞でのそれらの相同性研究等級キメラウイルスと比較した（図２）。ＴＤＶ－１、－２、及び－３のＭＶＳは全て、それらの野生型相同体よりも著しく小さく、ベロ細胞でのそれらの相同性研究等級ウイルスと非常に類似した（差は０．４ｍｍ以内）プラークを生成した。また、ＴＤＶ－４ ＭＶＳは、野生型ＤＥＮＶ－４よりも著しく小さかったが、元の実験室由来Ｄ２／４－Ｖキメラよりもわずかに大きかった（差は０．９ｍｍ）。
製剤２：１５％トレハロース、２％Ｆ－１２７、１％ｒＨＳＡ、１ｍＭ ＣａＣｌ２／０．５ｍＭ ＭｇＳＯ４
製剤３：１５％トレハロース、２％Ｆ－１２７、１％ｒＨＳＡ、０．５％キトサン
製剤４：２２．５％トレハロース、３％Ｆ－１２７、１．５％ｒＨＳＡ
製剤５：ＰＢＳ
ＴＤＶ ＭＶＳのプラーク表現型
１つの例示的な方法では、ＴＤＶ ＭＶＳのプラーク表現型を、野生型デングウイルス及びベロ細胞でのそれらの相同性研究等級キメラウイルスと比較した（図２）。ＴＤＶ－１、－２、及び－３のＭＶＳは全て、それらの野生型相同体よりも著しく小さく、ベロ細胞でのそれらの相同性研究等級ウイルスと非常に類似した（差は０．４ｍｍ以内）プラークを生成した。また、ＴＤＶ－４ ＭＶＳは、野生型ＤＥＮＶ－４よりも著しく小さかったが、元の実験室由来Ｄ２／４－Ｖキメラよりもわずかに大きかった（差は０．９ｍｍ）。
【0114】
図２には、対照野生型ウイルス及び研究等級ワクチン候補ウイルスと対比させた、ＴＤＶ ＭＶＳのプラークサイズを示す例示的なヒストグラムが示されている。ｐｉ９日目に測定したアガロースオーバーレイ下のベロ細胞でのウイルスプラークの平均プラーク直径（ｍｍ）±ＳＤ（エラーバー）。黒色バーにより表されている野生型ＤＥＮウイルス、及び白色バーにより表されている以前に発表されている研究等級ワクチン候補ウイルスは、対照及び灰色バーにより表されているＴＤＶマスターワクチンシードとの比較のために含まれていた。
【0115】
ＴＤＶ ＭＶＳの温度感受性
別の例示的な方法では、ＴＤＶ ＭＶＳの温度感受性をベロ細胞で試験し、それらの相同性野生型及び元の研究等級キメラワクチンウイルスと比較した。野生型（ＷＴ）ＤＥＮＶ－３ １６５６２は、温度感受性ではなかった。ｗｔデングウイルス血清型１及びデングウイルス血清型－４は、３９℃で中程度の温度感受性を示した（力価は、３７℃よりも３９℃で、およそ１．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ低かった。図３）。ＷＴデングウイルス血清型－２ １６６８１は、試験したＷＴデングウイルスの中で最も温度感受性であり、３９℃で１００分の１の力価低下を示した。ＴＤＶ－１、－２、及び－３は、それらの元の相同性研究等級キメラワクチンウイルスと同程度に温度感受性であった（図２）。これらＴＤＶ株の場合、３９℃における力価は、２．０～３．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ低下した。ＴＤＶ－４も温度感受性であり、力価は５分の１低減を示した。しかしながら、元の研究等級Ｄ２／４－Ｖの力価は、約１０分の１低減を示した。最終安定化ＴＤＶ－４ ＭＶＳは、デングウイルスの熱安定性を増強することが以前に実証されていたポロキサマー４０７、Ｆ１２７（商標）（及びこれら製剤を安定化するための他の作用剤（ＦＴＡ又は二価製剤、アルブミン、及びトレハロース））を含んでいた。ＴＤＶ－４ ＭＶＳにおけるＦ１２７（商標）の存在が、ベロ培養アッセイにおいてウイルスが顕著な温度感受性をあまり示さないことに寄付した可能性があった。別の実験では、Ｆ１２７（商標）の非存在下で、ＭＶＳ由来ＴＤＶ－４株の温度感受性を更に評価した。この株からポロキサマー４０７、Ｆ１２７（商標）を除去するために、ウイルスＲＮＡを、ＴＤＶ－４バルクウイルス調製物から単離し、ベロ細胞にトランスフェクトした。このＴＤＶ－４ウイルスは、ポロキサマー４０７、Ｆ１２７（商標）の非存在下では、感染後３日目に、Ｄ２／４ Ｖ研究株（力価は、１．５ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ低減した）と同様に温度感受性であると思われた（図３）。
別の例示的な方法では、ＴＤＶ ＭＶＳの温度感受性をベロ細胞で試験し、それらの相同性野生型及び元の研究等級キメラワクチンウイルスと比較した。野生型（ＷＴ）ＤＥＮＶ－３ １６５６２は、温度感受性ではなかった。ｗｔデングウイルス血清型１及びデングウイルス血清型－４は、３９℃で中程度の温度感受性を示した（力価は、３７℃よりも３９℃で、およそ１．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ低かった。図３）。ＷＴデングウイルス血清型－２ １６６８１は、試験したＷＴデングウイルスの中で最も温度感受性であり、３９℃で１００分の１の力価低下を示した。ＴＤＶ－１、－２、及び－３は、それらの元の相同性研究等級キメラワクチンウイルスと同程度に温度感受性であった（図２）。これらＴＤＶ株の場合、３９℃における力価は、２．０～３．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ低下した。ＴＤＶ－４も温度感受性であり、力価は５分の１低減を示した。しかしながら、元の研究等級Ｄ２／４－Ｖの力価は、約１０分の１低減を示した。最終安定化ＴＤＶ－４ ＭＶＳは、デングウイルスの熱安定性を増強することが以前に実証されていたポロキサマー４０７、Ｆ１２７（商標）（及びこれら製剤を安定化するための他の作用剤（ＦＴＡ又は二価製剤、アルブミン、及びトレハロース））を含んでいた。ＴＤＶ－４ ＭＶＳにおけるＦ１２７（商標）の存在が、ベロ培養アッセイにおいてウイルスが顕著な温度感受性をあまり示さないことに寄付した可能性があった。別の実験では、Ｆ１２７（商標）の非存在下で、ＭＶＳ由来ＴＤＶ－４株の温度感受性を更に評価した。この株からポロキサマー４０７、Ｆ１２７（商標）を除去するために、ウイルスＲＮＡを、ＴＤＶ－４バルクウイルス調製物から単離し、ベロ細胞にトランスフェクトした。このＴＤＶ－４ウイルスは、ポロキサマー４０７、Ｆ１２７（商標）の非存在下では、感染後３日目に、Ｄ２／４ Ｖ研究株（力価は、１．５ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ低減した）と同様に温度感受性であると思われた（図３）。
【0116】
図３には、ＴＤＶ ＭＶＳの温度感受性を示す例示的なヒストグラムが示されている。野生型デングウイルス及び以前に発表されている研究等級のワクチン候補ウイルスが、比較のために含まれていた。ＴＤＶ－４ ＭＶＳは、このアッセイでは、ウイルスの温度感受性結果を曖昧にしてしまう可能性のある更なるポロキサマー４０７、Ｆ１２７（商標）を含んでいた。Ｆ１２７（商標）の非存在下での代用ＴＤＶ－４を分析する別の実験も含まれていた。３７℃又は３９℃においてベロ細胞で複製されたウイルスの平均力価±ＳＤ（エラーバー）。
【0117】
蚊Ｃ６／３６細胞でのＴＤＶ ＭＶＳ複製
幾つかの例示的な方法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ弱毒化表現型が保持されること確認するために、ＴＤＶ ＭＶＳをＣ６／３６細胞で増殖した。これは、研究等級キメラワクチンウイルスが、こうした蚊細胞で骨格ＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ５３ウイルスの弱毒化表現型を保持したことが知られているためである。ｗｔデングウイルスと比較して、ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、及びＴＤＶ－４ ＭＶＳは、感染後（ｐｉ）６日目に、Ｃ６／３６細胞で著しい増殖低減を示した（少なくとも３ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ低減）（図４）。ＴＤＶ－３ ＭＳＶも、ｗｔＤＥＮＶ－３ １６５６２と比較して、増殖低減を示したが、低減は、それほど顕著ではなかった（１～２ ｌｏｇ１０ ｐｆｕ／ｍｌ低減）。しかしながら、ＴＤＶ－３シードロットのＣ６／３６力価は、元の研究等級キメラＤ２／３－ＶワクチンウイルスのＣ６／３６力価と類似していた（差は、１ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ）。
幾つかの例示的な方法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ弱毒化表現型が保持されること確認するために、ＴＤＶ ＭＶＳをＣ６／３６細胞で増殖した。これは、研究等級キメラワクチンウイルスが、こうした蚊細胞で骨格ＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ５３ウイルスの弱毒化表現型を保持したことが知られているためである。ｗｔデングウイルスと比較して、ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、及びＴＤＶ－４ ＭＶＳは、感染後（ｐｉ）６日目に、Ｃ６／３６細胞で著しい増殖低減を示した（少なくとも３ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ低減）（図４）。ＴＤＶ－３ ＭＳＶも、ｗｔＤＥＮＶ－３ １６５６２と比較して、増殖低減を示したが、低減は、それほど顕著ではなかった（１～２ ｌｏｇ１０ ｐｆｕ／ｍｌ低減）。しかしながら、ＴＤＶ－３シードロットのＣ６／３６力価は、元の研究等級キメラＤ２／３－ＶワクチンウイルスのＣ６／３６力価と類似していた（差は、１ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ）。
【0118】
図４には、ｗｔデングウイルス（黒色バー）及び研究等級ワクチンウイルス（白色バー）と比較した、Ｃ６／３６細胞でのＴＤＶ ＭＶＳ（灰色バー）の増殖制限をプロットした例示的なヒストグラムが示されている。ｐｉ６日目での、Ｃ６／３６細胞で複製されたウイルスの平均力価±ＳＤ（エラーバー）。
【0119】
蚊全体におけるウイルス感染率、播種率、及び伝染率
幾つかの例示的な方法では、ＴＤＶの感染率及び播種率を、それらの親ｗｔデングウイルスと比較した。ある例示的な実験では、ネッタイシマカ（Ａｅ．ａｅｇｙｐｔｉ）で経口感染実験を実施した。感染性血液餌を逆滴定してウイルス力価を測定した。親デングウイルスと各血清型のＴＤＶとで類似していた血液餌力価による実験（差は、１ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ未満）のみを、比較のために表４に含めた。ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、及び研究等級Ｄ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒは、経口給餌では蚊に感染しなかった。これは、それらの親ウイルスＤＥＮＶ－１ １６００７（４４％感染）及びＤＥＮＶ－２ １６６８１（４３．３％感染）と有意に異なる結果である（ｐ＜０．０００１）。蚊は、ＴＤＶ－１及び－２では感染しなかったため、これら２つのワクチンウイルスに対する播種の懸念はほとんどなかった。ＴＤＶ－４は、経口給餌で幾つかの蚊を感染させたが（５５匹中２匹）が、感染率は、その親野生型ウイルスＤＥＮＶ－４ １０３６（５０匹中８匹）よりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。ＴＤＶ－３は、５．２±０．０２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌの血液餌ウイルス力価による２つの実験では蚊を感染させなかった（表４）。６．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌの血液餌ウイルス力価による別の実験では、３０匹の蚊のうちの１匹の蚊のみが感染した（データ非表示）。しかしながら、野生型デングウイルス－３ １６５６２も、５．２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌでは非常に低い感染率（８％）を示した。より高い６．２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌの血液餌力価による別の実験でも、この率は増加しなかった（３％、３０匹の蚊のうち１匹が陽性、データ非表示）。野生型（ＷＴ）デングウイルス－３及びデングウイルス－４は、野生型デングウイルス－１及びデングウイルス－２よりも、有意に低い感染率を示したが、感染蚊での平均ウイルス力価は、類似していた（３．１～３．９ｌｏｇ１０ｐｆｕ／蚊）。対照的に、２匹の感染蚊のＴＤＶ－４力価は、両方とも最小限であった（０．７ｌｏｇ１０ｐｆｕ／蚊）。これは、野生型デングウイルス血清型－４ １０３６により感染蚊の力価の１，０００分の１であった（３．９±１．５ｐｆｕ／蚊）。
幾つかの例示的な方法では、ＴＤＶの感染率及び播種率を、それらの親ｗｔデングウイルスと比較した。ある例示的な実験では、ネッタイシマカ（Ａｅ．ａｅｇｙｐｔｉ）で経口感染実験を実施した。感染性血液餌を逆滴定してウイルス力価を測定した。親デングウイルスと各血清型のＴＤＶとで類似していた血液餌力価による実験（差は、１ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ未満）のみを、比較のために表４に含めた。ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、及び研究等級Ｄ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒは、経口給餌では蚊に感染しなかった。これは、それらの親ウイルスＤＥＮＶ－１ １６００７（４４％感染）及びＤＥＮＶ－２ １６６８１（４３．３％感染）と有意に異なる結果である（ｐ＜０．０００１）。蚊は、ＴＤＶ－１及び－２では感染しなかったため、これら２つのワクチンウイルスに対する播種の懸念はほとんどなかった。ＴＤＶ－４は、経口給餌で幾つかの蚊を感染させたが（５５匹中２匹）が、感染率は、その親野生型ウイルスＤＥＮＶ－４ １０３６（５０匹中８匹）よりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。ＴＤＶ－３は、５．２±０．０２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌの血液餌ウイルス力価による２つの実験では蚊を感染させなかった（表４）。６．０ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌの血液餌ウイルス力価による別の実験では、３０匹の蚊のうちの１匹の蚊のみが感染した（データ非表示）。しかしながら、野生型デングウイルス－３ １６５６２も、５．２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌでは非常に低い感染率（８％）を示した。より高い６．２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌの血液餌力価による別の実験でも、この率は増加しなかった（３％、３０匹の蚊のうち１匹が陽性、データ非表示）。野生型（ＷＴ）デングウイルス－３及びデングウイルス－４は、野生型デングウイルス－１及びデングウイルス－２よりも、有意に低い感染率を示したが、感染蚊での平均ウイルス力価は、類似していた（３．１～３．９ｌｏｇ１０ｐｆｕ／蚊）。対照的に、２匹の感染蚊のＴＤＶ－４力価は、両方とも最小限であった（０．７ｌｏｇ１０ｐｆｕ／蚊）。これは、野生型デングウイルス血清型－４ １０３６により感染蚊の力価の１，０００分の１であった（３．９±１．５ｐｆｕ／蚊）。
【0120】
感染したこれらの蚊については、ウイルスが脚部に存在したか否かを決定することにより、中腸からの播種を評価することができた。４つの親ＤＥＮＶは、３６．３％～６２．５％の範囲の播種率をもたらした。脚部の平均ウイルス力価（単位はｌｏｇ１０ｐｆｕ）は、０．９±０．３～２．２±０．７であった（陰性試料は除く）。２匹のＴＤＶ－４感染蚊はいずれも、脚部へのウイルス播種をもたらさなかった（表４）。脚部では播種ウイルスが検出可能であったものの、経口感染蚊の唾液では、４つのｗｔデングウイルスはいずれも検出不能であった。これは、経口給餌条件では、これらＤＥＮＶの伝染率を測定するのに十分な感度を示さない場合があることを示唆する。したがって、その後、他の例示的な方法では、直接ＩＴ接種による非常にストリンジェントな人為的蚊感染を実施した（表４）。ＴＤＶ－４を除いて全てのウイルス（ｗｔ及びＴＤＶ）が、ＩＴ接種したネッタイシマカの１００％感染を達成した。ＴＤＶ－４接種物は、他の３つのウイルス接種物よりもわずかに低いウイルス力価を示したが、これは、接種した蚊の７０％の感染に成功したに留まっている。ＩＴ接種により達成された高い体内感染率にも関わらず、４つ全てのＴＤＶウイルスは、ｗｔデングウイルスと比較して（４３～８７％、表４）、有意に低いか（ｐ＜０．００５）又は検出不能な伝染率（０～１０％）を示した。ＴＤＶウイルスは、経口給餌後に感染及び播種をほとんど又は全く示さなかった。非常にストリンジェントなＩＴ結果により、ネッタイシマカにおけるこれらＴＤＶウイルスの伝染能力が最小限であることが確認された。
【0121】
【表4】
【0122】
ベクターコンピテンスは、弱毒生フラビウイルスワクチンウイルスの重要な安全性要素である。以前には、研究等級ＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒウイルス及びｗｔ復帰突然変異誘導体がネッタイシマカで試験され、ＮＳ１－５３－Ａｓｐ弱毒化突然変異が、蚊複製を損なう最も有力な決定因子であることが判明した。ＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ－５３ワクチンの他の２つの主要弱毒化遺伝子座、ヌクレオチド５’ＮＣＲ－５７－Ｔ及びＮＳ３－２５０－Ｖａｌも、蚊における複製に対してある程度の阻害効果を示し、したがって蚊ベクターコンピテンスの更なる重複した制限をもたらした。本明細書に記載の幾つかの例示的な方法を使用して、４つ全てのＴＤＶ株の、蚊経口及びＩＴ感染並びに複製を試験した。ＴＤＶ－１、－２、及び－３は、経口感染ではネッタイシマカ蚊を一切感染させなかった（表４）。ＴＤＶ－４は、経口曝露した蚊のわずか３．６％しか感染させなかった。これは、ｗｔＤＥＮＶ－４感染蚊よりも低い蚊体内複製平均力価を有するｗｔＤＥＮＶ－４よりも著しく低いレベルであった。驚くべきことに、ＴＤＶ－４は、感染蚊の脚部で検出された。これは、ＴＤＶ－４が経口感染後に蚊中腸から播種することができなかったことを示唆した。ＴＤＶ－１、－２、及び－４の感染率は全て、それらの野生型相当物よりも有意に低かったが、ＴＤＶ－３とＷＴ ＤＥＮＶ－３ １６５６２との差は、両ウイルスの感染率が非常に低かったため有意ではなかった。同じタイ国Ｍａｅ Ｓｏｔ県で採取されたネッタイシマカで評価したＤＥＮＶの他の野生型株と比較して、ＴＤＶの遺伝子改変に使用した親野生型デングウイルス株は、経口感染による感染率及び播種率がより低いように見えた。黄熱病（ＹＦ）１７Ｄワクチンに基づくＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ－ＤＥＮワクチンの遺伝子改変に使用されたｗｔＤＥＮＶ－１ ＰＵＯ３５９、ＤＥＮＶ－２ ＰＵＯ２１８、ＤＥＮＶ－３ ＰａＨ８８１／８８、及びＤＥＮＶ－４ １２８８は、４７～７７％の範囲の感染率を示した。対照的に、ＹＦ １７Ｄワクチンは、ネッタイシマカを感染させることができなかった。ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ株は、こうした高度に感染性のｗｔＤＥＮＶに由来するｐｒＭ－Ｅを含んでいたが、それらのＹＦ １７Ｄ複製性骨格の蚊弱毒化表現型を保持している。また、本明細書で提供された結果は、ＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ－５３骨格の蚊弱毒化が、ＴＤＶ株で維持されたことを示した。加えて、本明細書に記載の組成物に含まれる構築体中に、より低い蚊感染性を有するｗｔデングウイルス株を使用することにより、更なる安全性特徴が提供される。
【0123】
１つの例示的な方法では、経口感染結果は、ＴＤＶの蚊感染性及び播種能力が最小限であったことを示す。加えて、より感受性でストリンジェントなＩＴ感染実験を実施して、ＴＤＶがネッタイシマカにより伝染する能力を更に分析した。ＩＴ結果は、それらのｗｔ相当物と比較して、４つ全てのＴＤＶウイルスの蚊伝染能力が検出不能又は最小限であったことを示した。ＴＤＶ伝染は、理論的には、（１）蚊中腸を感染させるのに十分なウイルス血症力価を有するベクターがワクチン被接種体に給餌される場合、（２）ウイルスが、中腸上皮で複製可能であり、その後中腸に播種することができる場合、及び（３）播種ウイルスが、唾液腺で複製することができ、伝染に十分なウイルスを唾液中に放出する場合にのみ生じ得る。蚊の感染に必要なヒトウイルス血症の閾値は十分には確立されていないが、ヒトウイルス血症は、天然ｗｔＤＥＮＶ感染後に１０６～１０８蚊感染用量５０（ＭＩＤ５０）／ｍｌであり得る。このＭＩＤ５０は、希釈したヒト血漿を用いた蚊の直接ＩＴ接種に基づいていた。非ヒト霊長類でのＴＤＶの分析は、ＴＤＶ免疫化後のウイルス血症力価が、非常に低く（２．４ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ未満）、２～７日間継続していたことを示した。ウイルス血症レベルが低く、ＴＤＶの蚊感染能力、播種能力、及び伝染能力が低いことを考慮すると、これらワクチンウイルスが、自然界で蚊により伝染され、ウイルス血症を引き起こす可能性は低い。
【0124】
したがって、１つ、２つ、３つ、又は４つ全てのデングウイルス血清型に対する安全で有効なワクチンを生成するための組成物に、血清型（Ｐ１～Ｐ１０）のいずれかの継代のいずれかを使用することができることが提案される。
【0125】
乳仔マウスでの神経毒性
元の研究等級ワクチンウイルスは、ＤＶＢＤ／ＣＤＣにて自家維持した新生仔ＩＣＲマウスでは、神経毒性が高度に弱毒化されていた。これらマウスは全て、１０４ｐｆｕの各ワクチンウイルスによるｉｃ（大脳内）負荷を生き残った。その一方で、ｗｔデングウイルス血清型－２ １６６８１ウイルスは、種々の実験において、これらＣＤＣ－ＩＣＲマウスに６２．５％～１００％の死亡率をもたらした。幾つかの実験では、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ社から得た市販のＩＣＲマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲ）を使用して、新生仔マウスでの神経毒性を研究した。新生仔Ｔａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲマウスは、以前のＣＤＣ－ＩＣＲマウスよりも、デングウイルス血清型－２感染に有意により感受性であったことが観察された。図５Ａには、ＣＤＣ－ＩＣＲコロニー及び１０４ｐｆｕのウイルスでｉｃ負荷したＴａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲ新生仔マウスでのｗｔデングウイルス血清型－２ １６６８１の神経毒性が要約されている。Ｔａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲマウス（３２匹のマウスで１００％の死亡率、平均生存期間は８．３±０．５日）は、以前のＣＤＣ－ＩＣＲマウス（７２匹のマウスで９１％の致死率、平均生存期間は１４．６±２．３日）よりも、ｉｃデングウイルス血清型－２ １６６８１負荷により感受性であった。
元の研究等級ワクチンウイルスは、ＤＶＢＤ／ＣＤＣにて自家維持した新生仔ＩＣＲマウスでは、神経毒性が高度に弱毒化されていた。これらマウスは全て、１０４ｐｆｕの各ワクチンウイルスによるｉｃ（大脳内）負荷を生き残った。その一方で、ｗｔデングウイルス血清型－２ １６６８１ウイルスは、種々の実験において、これらＣＤＣ－ＩＣＲマウスに６２．５％～１００％の死亡率をもたらした。幾つかの実験では、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ社から得た市販のＩＣＲマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲ）を使用して、新生仔マウスでの神経毒性を研究した。新生仔Ｔａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲマウスは、以前のＣＤＣ－ＩＣＲマウスよりも、デングウイルス血清型－２感染に有意により感受性であったことが観察された。図５Ａには、ＣＤＣ－ＩＣＲコロニー及び１０４ｐｆｕのウイルスでｉｃ負荷したＴａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲ新生仔マウスでのｗｔデングウイルス血清型－２ １６６８１の神経毒性が要約されている。Ｔａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲマウス（３２匹のマウスで１００％の死亡率、平均生存期間は８．３±０．５日）は、以前のＣＤＣ－ＩＣＲマウス（７２匹のマウスで９１％の致死率、平均生存期間は１４．６±２．３日）よりも、ｉｃデングウイルス血清型－２ １６６８１負荷により感受性であった。
【0126】
他の例示的な方法では、ＴＤＶ ＭＶＳの神経毒性を評価するために、まず、Ｔａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲマウスを、１つ（ｎ＝１６）又は２つの（ｎ＝３１～３２）実験において、およそ１０４ｐｆｕの用量のｗｔデングウイルス血清型－２ １６６８１、Ｄ２ ＰＤＫ－５３ ＶＶ４５Ｒ、Ｄ２／３－Ｖ、又はＴＤＶ １～４ウイルスでｉｃ（脳内）負荷した（図５Ｂ）。この用量では、Ｄ２／３－Ｖ研究等級ウイルス、並びにＴＤＶ－１及びＴＤＶ－３ ＭＶＳは、十分に弱毒化された神経毒性表現型を示した（病気又は死亡が無い）。予想通り、ｗｔデングウイルス血清型－２は、「致死性」であることが判明し、平均マウス生存期間（ＡＳＴ）は８．３±０．８日であった。これらデングウイルス血清型－２－感受性Ｔａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲマウスでは、Ｄ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒ研究等級ウイルスは、８１．３％の死亡率をもたらした。ＴＤＶ－２ ＭＶＳ及びＴＤＶ－４ ＭＶＳは、Ｔａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲでは一様に致死性であり、それぞれ９．８±１．７、１０．２±１．４、及び１１．３±０．４日のＡＳＴ値を示した。
【0127】
幾つかの例示的な方法では、ｗｔデングウイルス血清型－２ １６６８１ウイルスの神経毒性を、１０分の１の低用量にて、Ｄ２ ＰＤＫ－５３ ＶＶ４５Ｒ、ＴＤＶ－２ ＭＶＳ、及びＴＤＶ－４ ＭＶＳ、並びにＤ２／４－Ｖ研究等級ウイルスと比較した（１０３ｐｆｕ、図５Ｃ）。ｗｔデングウイルス血清型－２は、このより低い負荷用量では、一様に致死性の神経毒性表現型を保持し、ＡＳＴは９．０±１．４日であった。他の４つのウイルスは中程度の神経毒性表現型を示し、神経毒性の程度は、血清型特異的であった。Ｄ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒウイルス及びその同系統ＴＤＶ－２ ＭＶＳは有意な弱毒化を示した（それぞれ、生存率が３２．３％でＡＳＴが１３．１±３．８日、及び生存率が３１．２％でＡＳＴが１０．５±３．４日）。ＴＤＶ－４ ＭＶＳ及び研究等級Ｄ２／４－Ｖウイルスは両方とも、神経毒性が高度に弱毒化された（それぞれ、生存率が８１．３％でＡＳＴが１８．８±５．８日、及び生存率１００％）。こうした結果は、ＴＤＶ－１及び－３のＭＶＳは、神経毒性の完全な弱毒化を示したが、ＴＤＶ－２及び－４ ＭＶＳロットは、それらの相同性研究等級ウイルスワクチン候補と緊密に類似する弱毒化表現型を保持していたことを示唆した。
【0128】
図５Ａ～図５Ｃには、ｗｔデングウイルス血清型－２及び様々な弱毒デングウイルスを含む種々の組成物で試験した新生仔マウスでの神経毒性を示す例示的なグラフが示されている。１０４ｐｆｕのウイルスでｉｃ負荷したＣＤＣ－ＩＣＲ（ｎ＝７２）及びＴａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲ（ｎ＝３２）新生仔マウスにおける、ｗｔＤＥＮＶ－２ １６６８１ウイルスの神経毒性が要約されている、多数の実験をプールした結果（Ａ）。１０４ｐｆｕ（Ｂ）又は１０３ｐｆｕ（Ｃ）の用量を用いてＴａｃｏｎｉｃ（登録商標）－ＩＣＲマウスで試験した、ＴＤＶ ＭＶＳの神経毒性。１つの実験（ｎ＝１６）又は２つのプールした実験（ｎ＝３１又は３２）での１群当たりの試験動物の数が示されている。
【0129】
ＷＶＳ及びＢＶＳのプラーク表現型
ＭＶＳ、ｗｔデングウイルス、及びそれらの相同性実験室由来研究等級キメラを用いたある研究をベロ細胞で実施して、ＷＶＳ及びＢＶＳのプラーク表現型を比較した（図６）。平均プラークサイズを、各ワクチンウイルスの１０個のプラークから、しかしながら低減した数のｗｔＤＥＮＶ－１、－３、及び－４から算出したＴＤＶ－１、－２、及び－３のＭＶＳウイルスは全て、それらのｗｔ相同体よりも著しく小さく、ベロ細胞でのそれらの相同性研究等級ウイルスと非常に類似した（差は０．４ｍｍ以内）プラークを生成した。また、ＴＤＶ－４ ＭＶＳは、ｗｔＤＥＮＶ－４よりも著しく小さかったが、元の実験室由来Ｄ２／４－Ｖキメラよりもわずかに大きかった（０．９ｍｍ）。ＴＤＶ－２を除いて、ＴＤＶ－１、－３、及び－４のＷＶＳ及びＢＶＳの全てが、それらのｗｔ相同体から生成されたものよりも著しく小さなプラークサイズを保持した。ＴＤＶ－２ ＷＶＳ及びＢＶＳは、ベロ細胞でのｗｔＤＥＮＶ－２ウイルスのプラークと類似したプラークを生成したが、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞で試験すると、ＴＤＶ－２で製造したシードは全て、ｗｔＤＥＮＶ－２（１．４±０．４）よりも若干小さく、実験室由来Ｄ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒ（１．０±０．３）と類似したプラークを生成した（図６）。
ＭＶＳ、ｗｔデングウイルス、及びそれらの相同性実験室由来研究等級キメラを用いたある研究をベロ細胞で実施して、ＷＶＳ及びＢＶＳのプラーク表現型を比較した（図６）。平均プラークサイズを、各ワクチンウイルスの１０個のプラークから、しかしながら低減した数のｗｔＤＥＮＶ－１、－３、及び－４から算出したＴＤＶ－１、－２、及び－３のＭＶＳウイルスは全て、それらのｗｔ相同体よりも著しく小さく、ベロ細胞でのそれらの相同性研究等級ウイルスと非常に類似した（差は０．４ｍｍ以内）プラークを生成した。また、ＴＤＶ－４ ＭＶＳは、ｗｔＤＥＮＶ－４よりも著しく小さかったが、元の実験室由来Ｄ２／４－Ｖキメラよりもわずかに大きかった（０．９ｍｍ）。ＴＤＶ－２を除いて、ＴＤＶ－１、－３、及び－４のＷＶＳ及びＢＶＳの全てが、それらのｗｔ相同体から生成されたものよりも著しく小さなプラークサイズを保持した。ＴＤＶ－２ ＷＶＳ及びＢＶＳは、ベロ細胞でのｗｔＤＥＮＶ－２ウイルスのプラークと類似したプラークを生成したが、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞で試験すると、ＴＤＶ－２で製造したシードは全て、ｗｔＤＥＮＶ－２（１．４±０．４）よりも若干小さく、実験室由来Ｄ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒ（１．０±０．３）と類似したプラークを生成した（図６）。
【0130】
小プラーク表現型、温度感受性、蚊細胞での複製低減、蚊による感染／播種／伝染の低減、及び新生仔ＩＣＲでの神経毒性低減を含む、ＭＶＳストックの組成物のウイルス弱毒化の表現型マーカーの評価を査定した。結果は、ＴＤＶの全てが、元の研究等級ワクチンウイルスに類似した、予想通りの弱毒化表現型を保持していたことを示した。弱毒化の原因である突然変異が、ＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶの全てで保存されていることを考慮すると、弱毒化表現型は、ヒト臨床試験のために製造される物質で保持されると予想することができる。
【0131】
図６には、ＴＤＶ ＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳのプラークサイズを示す例示的なヒストグラムが示されている。ｐｉ９日目に測定したアガロースオーバーレイ下のベロ細胞又はＬＬＣ－ＭＫ２細胞でのウイルスプラークの平均プラーク直径±ＳＤ（エラーバー）。野生型ＤＥＮＶ及び以前に発表されている研究等級ワクチン候補ウイルスが、対照及び比較のために含まれていた。
【0132】
蚊Ｃ６／３６細胞でのウイルス複製
以前の研究では、研究等級ＰＤＫ－５３に基づくキメラワクチンウイルスは、Ｃ６／３６細胞では、骨格ＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ５３ウイルスの弱毒型表現型を保持したことが示された。幾つかの例示的な方法では、大規模製造後にこのｉｎ ｖｉｔｒｏ弱毒化マーカーが保持されることを確認するために、ＴＤＶ ＭＳＶ、ＷＶＳ、及びＢＶＳを、Ｃ６／３６細胞で増殖した。野生型デングウイルスと比較して、製造されたシードは、ＴＤＶ－３を除いて、Ｃ６／３６細胞でｐｉ６日目に顕著な増殖低減（少なくとも３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ低減）を示した（図７）。ＴＤＶ－３シードも、ｗｔＤＥＮＶ－３ １６５６２と比較して、増殖低減を示したが、低減は、それほど顕著ではなかった（１～２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ低減）。しかしながら、ＴＤＶ－３シードロットの力価は、元の研究等級キメラＤ２／３－Ｖワクチンウイルスと類似していた（差は、１ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ以内）。
以前の研究では、研究等級ＰＤＫ－５３に基づくキメラワクチンウイルスは、Ｃ６／３６細胞では、骨格ＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ５３ウイルスの弱毒型表現型を保持したことが示された。幾つかの例示的な方法では、大規模製造後にこのｉｎ ｖｉｔｒｏ弱毒化マーカーが保持されることを確認するために、ＴＤＶ ＭＳＶ、ＷＶＳ、及びＢＶＳを、Ｃ６／３６細胞で増殖した。野生型デングウイルスと比較して、製造されたシードは、ＴＤＶ－３を除いて、Ｃ６／３６細胞でｐｉ６日目に顕著な増殖低減（少なくとも３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌ低減）を示した（図７）。ＴＤＶ－３シードも、ｗｔＤＥＮＶ－３ １６５６２と比較して、増殖低減を示したが、低減は、それほど顕著ではなかった（１～２ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ低減）。しかしながら、ＴＤＶ－３シードロットの力価は、元の研究等級キメラＤ２／３－Ｖワクチンウイルスと類似していた（差は、１ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ以内）。
【0133】
図８には、Ｃ６／３６細胞でのＴＤＶ ＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳの増殖制限をプロットした例示的なヒストグラムが示されている。ｐｉ７日目のＣ６／３６細胞で複製されたウイルスの平均力価±ＳＤ（エラーバー）。ｗｔデングウイルス及び以前に発表されている研究等級のワクチン候補ウイルスが、比較のために含まれていた。
【0134】
乳仔マウスでの神経毒性
更なる実験を実施して、新生仔ＩＣＲマウスでの神経毒性を分析した。１０４ＰＦＵの頭蓋内用量では、ｗｔＤＥＮＶ－２ １６６８１及びＤ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒの生存率は、ＩＣＲマウスでは、それぞれ０％及び１８．８％であったが（図９Ａ）、ＣＤＣ ＩＣＲマウスでは、ｗｔＤＥＮＶ－２ １６６８１が約２０％であり、Ｄ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒが１００％であった。この研究では、ＴＤＶ－１及びＴＤＶ－３ ＭＶＳは、マウスでは１０４ＰＦＵの用量で弱毒化されたが（１００％生存）、ＴＤＶ－２及びＴＤＶ－４のＭＶＳは、１０４ＰＦＵを超える用量では１００％死亡率を引き起こした（図５Ａ）。しかしながら、１０３ＰＦＵの用量のウイルスで試験すると、ＴＤＶ－２（３１．３％生存）及びＴＤＶ－４（８１．３％生存）は、野生型デングウイルス血清型－２ １６６８１（０％生存）と比べて神経毒性の低減を示し、それらの生存率は、それぞれ研究等級ワクチン候補Ｄ２ ＰＫＤ－５３－ＶＶ４５Ｒ（３２．３％）及びＤ２／４－Ｖ（１００％）に類似していた（図９Ｂ）。この研究には、比較のための野生型ＤＥＮＶ－１、－３、又は－４は含まれていなかったが、以前の研究では、野生型ＤＥＮＶ－１ １６００７は、ｉｃ経路によるＣＤＣ－ＩＣＲマウスでは弱毒化されたが、野生型ＤＥＮＶ－３ １６５６２及びＤＥＮＶ－４ １０３６は両方とも、ＣＤＣ－ＩＣＲマウスでは高度に病原性であった（０％生存）ことが示されていた。これら３つの野生型ＤＥＮＶは、より感受性のＴａｃｏｎｉｃ（登録商標）ＩＣＲマウスと類似した又はより高い病原性を示す可能性が高い。したがって、それらの相同性ＴＤＶ ＭＶＳと比較するために、これら野生型デングウイルスを含めても、役に立つ情報はもたらされないと考えられた。この研究は、４つ全てのＴＤＶ ＭＶＳ及び元の実験室由来候補ワクチンウイルスが、野生型ｃＤＥＮＶ－２ １６６８１と比べて、同等のマウス弱毒化表現型を示すことを示した。
更なる実験を実施して、新生仔ＩＣＲマウスでの神経毒性を分析した。１０４ＰＦＵの頭蓋内用量では、ｗｔＤＥＮＶ－２ １６６８１及びＤ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒの生存率は、ＩＣＲマウスでは、それぞれ０％及び１８．８％であったが（図９Ａ）、ＣＤＣ ＩＣＲマウスでは、ｗｔＤＥＮＶ－２ １６６８１が約２０％であり、Ｄ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒが１００％であった。この研究では、ＴＤＶ－１及びＴＤＶ－３ ＭＶＳは、マウスでは１０４ＰＦＵの用量で弱毒化されたが（１００％生存）、ＴＤＶ－２及びＴＤＶ－４のＭＶＳは、１０４ＰＦＵを超える用量では１００％死亡率を引き起こした（図５Ａ）。しかしながら、１０３ＰＦＵの用量のウイルスで試験すると、ＴＤＶ－２（３１．３％生存）及びＴＤＶ－４（８１．３％生存）は、野生型デングウイルス血清型－２ １６６８１（０％生存）と比べて神経毒性の低減を示し、それらの生存率は、それぞれ研究等級ワクチン候補Ｄ２ ＰＫＤ－５３－ＶＶ４５Ｒ（３２．３％）及びＤ２／４－Ｖ（１００％）に類似していた（図９Ｂ）。この研究には、比較のための野生型ＤＥＮＶ－１、－３、又は－４は含まれていなかったが、以前の研究では、野生型ＤＥＮＶ－１ １６００７は、ｉｃ経路によるＣＤＣ－ＩＣＲマウスでは弱毒化されたが、野生型ＤＥＮＶ－３ １６５６２及びＤＥＮＶ－４ １０３６は両方とも、ＣＤＣ－ＩＣＲマウスでは高度に病原性であった（０％生存）ことが示されていた。これら３つの野生型ＤＥＮＶは、より感受性のＴａｃｏｎｉｃ（登録商標）ＩＣＲマウスと類似した又はより高い病原性を示す可能性が高い。したがって、それらの相同性ＴＤＶ ＭＶＳと比較するために、これら野生型デングウイルスを含めても、役に立つ情報はもたらされないと考えられた。この研究は、４つ全てのＴＤＶ ＭＶＳ及び元の実験室由来候補ワクチンウイルスが、野生型ｃＤＥＮＶ－２ １６６８１と比べて、同等のマウス弱毒化表現型を示すことを示した。
【0135】
図９Ａ～図９Ｂには、新生仔ＩＣＲマウスでのＴＤＶ ＭＶＳの神経毒性データの例示的なグラフが示されている。（Ａ）１０４ＰＦＵの用量でのウイルスのＩＣ接種。（Ｂ）１０３ＰＦＵの用量でのウイルスのＩＣ接種
ＴＤＶのシードロットは全て、同一性、不稔性、及び望ましくない作用剤の不含有について試験した。全長ゲノム配列分析により、ＴＤＶ－４ ＭＶＳには１つの追加のアミノ酸突然変異が発生したが、他の３つのＴＤＶ ＭＶＳは、それらのプレマスターシードのコンセンサスゲノム配列を保持したことが明らかになった。ＷＶＳロットでは、ＴＤＶ－３は、追加のアミノ酸突然変異を獲得し、他の３つの血清型は、それらのプレマスターシードに比べて、２つの追加のアミノ酸置換を蓄積させた。４つ全てのＢＶＳロットのゲノム配列は、それらのＷＶＳロットと同一であった。全体的に、Ｐ２シードからプレマスター（Ｐ７）シードまででは、１つ又は２つの非サイレント突然変異が、所与のシードに生じたに過ぎなかった。プレマスターとＢＣＳ（Ｐ１０）シードとの間には、１～２つのヌクレオチド置換が観察されたに過ぎず、それらは全て、単一のヌクレオチド変化を除いて、ＮＳ２Ａ、４Ａ、又は４Ｂで生じ、残基Ｅ－４８３に、保存されたグリシン及びアラニンをもたらした。Ｐ２からＢＶＳ（Ｐ１０）シードまででは、合計で３～８つのヌクレオチド置換が、任意の所与のＴＤＶシードで特定され、これら置換のうち２～４つがアミノ酸変化をもたらしたに過ぎなかった。ＭＶＳのサイレント突然変異はいずれも、ウイルス複製に影響を及ぼし得る５’－又は３’－ＮＣＲ内ではなかった。こうした結果は、ＴＤＶウイルスが、製造中、遺伝子的に高度に安定していたことを示唆する。５’ＮＣＲ、ＮＳ１－５３、及びＮＳ３－２５０に位置する３つの画定されているＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ－５３弱毒化遺伝子座は、ＢＶＳストックを生成するためのＴＤＶの連続継代に際し、コンセンサスゲノム配列の不変化を維持した。５’－ＮＣＲ－５７遺伝子座の高高感度ＴａｑＭＡＭＡは、ＴＤＶのＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳでの復帰突然変異が最小限であるか又は検出不能であった。最も高い復帰突然変異率は０．２１％であり、ＴＤＶ－２ ＢＶＳで特定された。Ｐ１０等価ＢＶＳの復帰突然変異率（＜０．０７％～０．２１％）は、ベロ細胞の連続継代後に他のワクチン候補で発生した復帰突然変異率よりも有意に低かった（Ｐ１０までに４～７４％復帰突然変異）。これは、ＴＤＶシードを大規模製造するためのこの戦略が、候補ワクチンウイルスの遺伝子安定性及び弱毒化マーカーの保持を維持することに成功していることを示唆する。
ＴＤＶのシードロットは全て、同一性、不稔性、及び望ましくない作用剤の不含有について試験した。全長ゲノム配列分析により、ＴＤＶ－４ ＭＶＳには１つの追加のアミノ酸突然変異が発生したが、他の３つのＴＤＶ ＭＶＳは、それらのプレマスターシードのコンセンサスゲノム配列を保持したことが明らかになった。ＷＶＳロットでは、ＴＤＶ－３は、追加のアミノ酸突然変異を獲得し、他の３つの血清型は、それらのプレマスターシードに比べて、２つの追加のアミノ酸置換を蓄積させた。４つ全てのＢＶＳロットのゲノム配列は、それらのＷＶＳロットと同一であった。全体的に、Ｐ２シードからプレマスター（Ｐ７）シードまででは、１つ又は２つの非サイレント突然変異が、所与のシードに生じたに過ぎなかった。プレマスターとＢＣＳ（Ｐ１０）シードとの間には、１～２つのヌクレオチド置換が観察されたに過ぎず、それらは全て、単一のヌクレオチド変化を除いて、ＮＳ２Ａ、４Ａ、又は４Ｂで生じ、残基Ｅ－４８３に、保存されたグリシン及びアラニンをもたらした。Ｐ２からＢＶＳ（Ｐ１０）シードまででは、合計で３～８つのヌクレオチド置換が、任意の所与のＴＤＶシードで特定され、これら置換のうち２～４つがアミノ酸変化をもたらしたに過ぎなかった。ＭＶＳのサイレント突然変異はいずれも、ウイルス複製に影響を及ぼし得る５’－又は３’－ＮＣＲ内ではなかった。こうした結果は、ＴＤＶウイルスが、製造中、遺伝子的に高度に安定していたことを示唆する。５’ＮＣＲ、ＮＳ１－５３、及びＮＳ３－２５０に位置する３つの画定されているＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ－５３弱毒化遺伝子座は、ＢＶＳストックを生成するためのＴＤＶの連続継代に際し、コンセンサスゲノム配列の不変化を維持した。５’－ＮＣＲ－５７遺伝子座の高高感度ＴａｑＭＡＭＡは、ＴＤＶのＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳでの復帰突然変異が最小限であるか又は検出不能であった。最も高い復帰突然変異率は０．２１％であり、ＴＤＶ－２ ＢＶＳで特定された。Ｐ１０等価ＢＶＳの復帰突然変異率（＜０．０７％～０．２１％）は、ベロ細胞の連続継代後に他のワクチン候補で発生した復帰突然変異率よりも有意に低かった（Ｐ１０までに４～７４％復帰突然変異）。これは、ＴＤＶシードを大規模製造するためのこの戦略が、候補ワクチンウイルスの遺伝子安定性及び弱毒化マーカーの保持を維持することに成功していることを示唆する。
【0136】
本明細書で開示されたＭＶＳストックは、将来的にＷＶＳ及びＢＶＳロットの製造に使用されることになるため、小プラーク表現型、温度感受性、蚊細胞での複製低減、蚊全体における感染／播種／伝染の低減、及び新生仔ＩＣＲマウスでの神経毒性低減を含む、ウイルス弱毒化表現型の完全な項目の評価を、全てのＭＶＳ又はそれらの等価代用ストックで実施した。ＷＶＳ及びＢＶＳストックの場合、それらの弱毒化を確認するために、プラークサイズ、蚊細胞での感染性も実施した。結果は、ＴＤＶの４つの血清型のＭＶＳストック全てが、小さなプラーク、Ｃ６／３６細胞での複製低減、及びマウス神経毒性の低減等の、元の実験室ワクチンウイルスと類似した、予想通りの弱毒化表現型を保持した（図６、８、及び９）。ＴＤＶ－４を除いて、ＴＤＶの他のＭＶＳストックは全て、図３及び７に示されるように、３９℃でＴＳであった。
【0137】
ＷＶＳ及びＢＶＳストックの２つの弱毒化表現型、小さなプラーク及びＣ６／３６細胞での複製制限を分析し、確認した。ＭＶＳとＢＶＳとの間の遺伝子変化は非常にわずかしかないため、それらは、ＭＶＳとしての弱毒化表現型を保持することが予想された。本報告書に記載の実験に加えて、Ａｇ１２９マウス及び非ヒト霊長類における、製造されたＴＤＶの安全性及び免疫原性を試験した。
【0138】
本明細書では、ｃＧＭＰに基づくＴＤＶ ＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳストックの製造を実証するための例示的な方法が提供される。ＢＶＳストックを使用して、現在ヒト臨床試験で評価中の四価ＴＤＶを製剤化した。幾つかの例示的な方法では、製造されたＭＶＳの遺伝子安定性及び安全性を最適化するための独特な製造戦略が提供された。ＴＤＶの主な弱毒化遺伝子座は、以前に十分に特徴付けられているため、非常に高感度であり定量化可能なＳＮＰアッセイであるＴａｑＭＡＭＡを開発して、ゲノム配列及びＴａｑＭＡＭＡを統合し、ＭＶＳを製作するために最適なプレマスターシードを特定した。ＭＶＳの遺伝子及び表現型の特徴を十分に分析して、これらウイルスが、ワクチンの安全性用の望ましい弱毒化を保持していたことを確認した。これは、プレマスターからＢＶＳストックを製造するまでの全ての過程にわたって、全ての主要弱毒化遺伝遺伝子座を効率的に分析することができる唯一の弱毒生ウイルスワクチンであり得る。本明細書で提供された結果は、戦略的に設計された弱毒化生ワクチンが、ワクチン安全性の点で有利であることを例証した。
【0139】
実施例３
別の例示的な方法では、構築体は、デング－２血清型の非構造タンパク質ドメイン及びデング－１（ＴＤＶ－１）、デング－３（ＴＤＶ－３）、又はデング－４（ＴＤＶ－４）血清型のいずれか１つに由来する構造タンパク質をコードする１つ又は複数の構築体に加えて、弱毒生デング－２血清型（ＴＤＶ－２）に基づく改変弱毒生デングウイルスを含んでいてもよい。加えて、本明細書で開示された免疫原性組成物中の個々の構築体は、互いと比較したｌｏｇＰＦＵのＰＦＵに基づく比又は濃度で製剤化することができる。例えば、免疫原性組成物は、図１１Ｂに示されているように、ＴＤＶ－１が、約２×１０４ＰＦＵの濃度で存在し、ＴＤＶ－２が、約５×１０４ＰＦＵの濃度で存在し、ＴＤＶ－３が、約１×１０５ＰＦＵの濃度で存在し、ＴＤＶ－４が、３×１０５ＰＦＵの濃度で存在するように製剤化することができる。また、免疫原性製剤中の異なるデング血清型構築体の相対濃度は、図１１Ｂに示されているように、ＴＤＶ－１：ＴＤＶ－２：ＴＤＶ－３：ＴＤＶ－４の比に対応する約４：４：５：５等の、ＰＦＵのｌｏｇ数に基づく比として表すことができる。幾つかの実施形態では、比は、約５：４：５：５であってもよく、並びに１つ又は複数の弱毒生デングウイルス血清型が、他のデングウイルス血清型と比較してより高いか又はより低い他の所定の比であってもよい。１つの例では、ＴＤＶ－２の相対濃度を、ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－３、及びＴＤＶ－４と比較して低減してもよく、これは、４つ全てのデング血清型を対象に投与すると、より良好なバランスのとれた応答を示す免疫原性組成物をもたらすことができる。例えば、ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、ＴＤＶ－３、及びＴＤＶ－４は、４つ全てのデングウイルス血清型（弱毒生デング－２、並びにデングウイルス－１、－３、及び－４のキメラ）に対する中和抗体を含んでいてもよく、デング－２を骨格として使用することにより、デング非構造タンパク質に対する多機能性及び交差反応性ＣＢ８＋Ｔ細胞応答を誘導することができる。
別の例示的な方法では、構築体は、デング－２血清型の非構造タンパク質ドメイン及びデング－１（ＴＤＶ－１）、デング－３（ＴＤＶ－３）、又はデング－４（ＴＤＶ－４）血清型のいずれか１つに由来する構造タンパク質をコードする１つ又は複数の構築体に加えて、弱毒生デング－２血清型（ＴＤＶ－２）に基づく改変弱毒生デングウイルスを含んでいてもよい。加えて、本明細書で開示された免疫原性組成物中の個々の構築体は、互いと比較したｌｏｇＰＦＵのＰＦＵに基づく比又は濃度で製剤化することができる。例えば、免疫原性組成物は、図１１Ｂに示されているように、ＴＤＶ－１が、約２×１０４ＰＦＵの濃度で存在し、ＴＤＶ－２が、約５×１０４ＰＦＵの濃度で存在し、ＴＤＶ－３が、約１×１０５ＰＦＵの濃度で存在し、ＴＤＶ－４が、３×１０５ＰＦＵの濃度で存在するように製剤化することができる。また、免疫原性製剤中の異なるデング血清型構築体の相対濃度は、図１１Ｂに示されているように、ＴＤＶ－１：ＴＤＶ－２：ＴＤＶ－３：ＴＤＶ－４の比に対応する約４：４：５：５等の、ＰＦＵのｌｏｇ数に基づく比として表すことができる。幾つかの実施形態では、比は、約５：４：５：５であってもよく、並びに１つ又は複数の弱毒生デングウイルス血清型が、他のデングウイルス血清型と比較してより高いか又はより低い他の所定の比であってもよい。１つの例では、ＴＤＶ－２の相対濃度を、ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－３、及びＴＤＶ－４と比較して低減してもよく、これは、４つ全てのデング血清型を対象に投与すると、より良好なバランスのとれた応答を示す免疫原性組成物をもたらすことができる。例えば、ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、ＴＤＶ－３、及びＴＤＶ－４は、４つ全てのデングウイルス血清型（弱毒生デング－２、並びにデングウイルス－１、－３、及び－４のキメラ）に対する中和抗体を含んでいてもよく、デング－２を骨格として使用することにより、デング非構造タンパク質に対する多機能性及び交差反応性ＣＢ８＋Ｔ細胞応答を誘導することができる。
【0140】
本明細書で開示されたデング免疫原性組成物の効力及び耐容性を小児で試験するために（歴史的に、デングウイルスに対して効果的に免疫することが困難な集団であり、以前のワクチンは、この集団、特に９歳以下の小児ではうまく機能していない）、別の例示的な方法では、２パート形式の無作為化二重盲検プラセボ対照臨床試験を実施した。パート１は、年齢降下様式で実施され、２１～４５歳（ｎ＝３８）の対象、１２～２０歳（ｎ＝３６）の対象、６～１１歳（ｎ＝３８）の対象、及び１．５～５歳（ｎ＝３６）の対象に、４つ全ての構築体、ＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、ＴＤＶ－３、及びＴＤＶ－４を含むデングワクチン組成物の用量を投与した（図１２Ａ）。パートＩＩは、パートＩの延長として、１．５～１１歳の健康な小児対象（ｎ＝２１１）で実施した（図１２Ｂ）。０日目にワクチン用量を投与し、組織試料（例えば、血液試料）を、０日目に及び治験全体にわたって種々の時点で対象から採取して、ウイルス血症、免疫原性、及び全体的な安全性を試験した（図１２Ａ～１２Ｂ）。パートＩの場合、無作為化用量のワクチン及びプラセボを、約２：１のワクチン対プラセボ比で投与した。パートＩＩの場合、無作為化用量のワクチン及びプラセボを、約３：１のワクチン対プラセボ比で投与した。免疫原性組成物には、ＴＤＶ－１が、約２×１０４ＰＦＵの濃度で存在し、ＴＤＶ－２が、約５×１０４ＰＦＵ濃度で存在し、ＴＤＶ－３が、約１×１０５ＰＦＵの濃度で存在し、ＴＤＶ－４が、約３×１０５ＰＦＵの濃度で存在していた。
【0141】
別の方法では、本明細書で開示されたデングに対する免疫原性組成物の小児における耐容性を調査するために、有害事象（ＡＥ）の発生率を調査した（データ非表示）。注射部位での疼痛、そう痒、及び紅斑、並びに浮腫の発生率を、ＴＤＶ投与及びプラセボ投与間で決定した（自己申告）。種々のＡＥを、ＴＤＶ（ｎ＝２４９）又はプラセボ（ｎ＝１１１）の第１の投与後の１４日以内に、及びＴＤＶ（ｎ＝２４９）又はプラセボ（ｎ＝１１１）の第２の投与後の１４日以内に調査した。全体として、研究対象には重症のワクチン関連ＡＥは報告されず、血液化学的又は血液学的特徴に著しい変化はなかった。これは、本開示のデングワクチン組成物が小児において十分に耐容性であったことを示す。（データ非表示）
別の例示的な方法では、小児における本開示の免疫原性組成物の効力を試験するために、マイクロ中和試験を使用して、ＴＤＶワクチン組成物を注射した後で対象により産生される中和抗体の存在を、注射後７２０日までの種々の時点で測定した。図１３Ａ～１３Ｂに示されているように、ＴＤＶワクチン投与は、対象の初期免疫状態に関わらず、７２０日目まで持続した中和抗体応答を誘発した（図１３Ａに示されているベースラインで血清陽性；図１３Ｂに示されているベースラインでデング未感作）。Ｄｅｎｖ－１抗体レベルは、黒抜き菱形印の短い点線により表されており、Ｄｅｎｖ－２抗体レベルは、黒抜き四角印の実線により表されており、Ｄｅｎｖ－３抗体レベルは、黒抜き三角印の長い点線により表されており、Ｄｅｎｖ－４抗体レベルは、Ｘ印の点線により表されている。０日目及び９０日目に対応する用量は、上向きの黒抜き矢印により示されている。
別の例示的な方法では、小児における本開示の免疫原性組成物の効力を試験するために、マイクロ中和試験を使用して、ＴＤＶワクチン組成物を注射した後で対象により産生される中和抗体の存在を、注射後７２０日までの種々の時点で測定した。図１３Ａ～１３Ｂに示されているように、ＴＤＶワクチン投与は、対象の初期免疫状態に関わらず、７２０日目まで持続した中和抗体応答を誘発した（図１３Ａに示されているベースラインで血清陽性；図１３Ｂに示されているベースラインでデング未感作）。Ｄｅｎｖ－１抗体レベルは、黒抜き菱形印の短い点線により表されており、Ｄｅｎｖ－２抗体レベルは、黒抜き四角印の実線により表されており、Ｄｅｎｖ－３抗体レベルは、黒抜き三角印の長い点線により表されており、Ｄｅｎｖ－４抗体レベルは、Ｘ印の点線により表されている。０日目及び９０日目に対応する用量は、上向きの黒抜き矢印により示されている。
【0142】
別の例では、デング免疫原性組成物が、初期免疫状態に関わらず小児に四価応答を誘発することができるか否かを試験するために、研究対象の血液陽性を、ＴＤＶワクチン組成物を注射した後で注射後７２０日以内の種々の時点で測定した。図１４に示されているように、約６０％よりも多くの研究対象が、試験した注射後時点の全てにおいて、全てのデング血清型に対して血清陽性であった。約８０％よりも多くの対象が、試験した注射後時点の全てにおいて、デング血清型の３つ以上に対して血清陽性であった。また、ほぼ１００％の対象が、試験した注射後時点の全てにおいて、デング血清型の２つ以上に対して血清陽性であった。０、２８、９０、及び１２０日目のデータは、臨床試験のパートＩ及びＩＩ（ｎ＝２４９）から得たが、１８０、３６０、及び７２０日目のデータは、臨床試験のパートＩ（ｎ＝９０）から得た。血液陽性は、ＭＮＴ５０力価≧１０であるとした。
【0143】
別の例示的な方法では、試験を実施して、本明細書で開示されたデングに対する免疫原性組成物が、ベースラインで血清陰性であった（デング未感作）小児に、４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘発することができたか否かを決定した。図１５に示されているように、約４０％よりも多くの研究対象が、試験した注射後時点の全てにおいて、全てのデング血清型に対して血清陽性であった。約６０％よりも多くの対象が、試験した注射後時点の全てにおいて、デング血清型の３つ以上に対して血清陽性であった。また、ほぼ１００％の対象が、試験した注射後時点の全てにおいて、デング血清型の２つ以上に対して血清陽性であった。０、２８、９０、及び１２０日目のデータは、臨床試験のパートＩ及びＩＩ（ｎ＝１３３）から得たが、１８０、３６０、及び７２０日目のデータは、臨床試験のパートＩ（ｎ＝４０）から得た。血液陽性は、ＭＮＴ５０力価≧１０であるとした。なお、本明細書で開示された四価組成物は、投与後７２０日まで持続することができる、４つ全てのデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導することが可能である。
【0144】
実施例４
１つの方法では、参加者は、以下の通り登録された。１７９４人が、０月目及び３月目に２つの用量のＴＤＶ（ｎ＝２００；群１）；０月目に１つの用量（ｎ＝３９８；群２）；０月目に１つの用量及び１２か月目に追加免疫（ｎ＝９９８；群３）；又はプラセボ（ｎ＝１９８；群４）のいずれかを皮下に受容した。ＴＤＶは、全てのＤＥＮＶ対して中和抗体を誘発させた。誘発は、１月目でピークに達し、６月目に依然としてベースラインを超えていた。群１～４の６月目のＧＭＴ（９５％ＣＩ）は、それぞれ以下の通りであった：ＤＥＮＶ－１では、４８９（３２１、７４６）、４３４（３０６、６１５）、５３２（３８４、７３８）、６２（３２、１２０）；ＤＥＮＶ－２では、１５６５（１１４５、２１４０）、１６３８（１２８６、２０８８）、１２８８（１０３１、１６１０）、８６（４４、１６９）；ＤＥＮＶ－３では、１６０（１０４、２４８）、１５１（１０６、２１４）、１７３（１２４、２４０）、４０（２３、７１）；及びＤＥＮＶ－４では、１１７（７９、１７５）、１１０（８０、１４９）、９３（６９、１２５）、２４（１５、３８）。初期血清陰性参加者では、２つの用量のＴＤＶは、１つの用量よりも高い、ＤＥＮＶ－３及び－４に対する平均ＧＭＴ及び血清転換率を誘発させ、６月目の四価血清転換率は、１つの用量のＴＤＶ後の６７．６％に対して、８５．０％であった。
１つの方法では、参加者は、以下の通り登録された。１７９４人が、０月目及び３月目に２つの用量のＴＤＶ（ｎ＝２００；群１）；０月目に１つの用量（ｎ＝３９８；群２）；０月目に１つの用量及び１２か月目に追加免疫（ｎ＝９９８；群３）；又はプラセボ（ｎ＝１９８；群４）のいずれかを皮下に受容した。ＴＤＶは、全てのＤＥＮＶ対して中和抗体を誘発させた。誘発は、１月目でピークに達し、６月目に依然としてベースラインを超えていた。群１～４の６月目のＧＭＴ（９５％ＣＩ）は、それぞれ以下の通りであった：ＤＥＮＶ－１では、４８９（３２１、７４６）、４３４（３０６、６１５）、５３２（３８４、７３８）、６２（３２、１２０）；ＤＥＮＶ－２では、１５６５（１１４５、２１４０）、１６３８（１２８６、２０８８）、１２８８（１０３１、１６１０）、８６（４４、１６９）；ＤＥＮＶ－３では、１６０（１０４、２４８）、１５１（１０６、２１４）、１７３（１２４、２４０）、４０（２３、７１）；及びＤＥＮＶ－４では、１１７（７９、１７５）、１１０（８０、１４９）、９３（６９、１２５）、２４（１５、３８）。初期血清陰性参加者では、２つの用量のＴＤＶは、１つの用量よりも高い、ＤＥＮＶ－３及び－４に対する平均ＧＭＴ及び血清転換率を誘発させ、６月目の四価血清転換率は、１つの用量のＴＤＶ後の６７．６％に対して、８５．０％であった。
【0145】
研究設計及び参加者
これらの研究は、パナマ、フィリピン、及びドミニカ共和国の３つの病院／クリニックで実施された多施設無作為二重盲検プラセボ対照試験であった。健康な２～１７歳の参加者が登録され、適格性が評価され、その後１：２：５：１の比に無作為化され、０月目及び３月目に２つの用量（群１）；０月目に１つの用量（群２）；０月目に１つの用量及び１２月目に追加免疫（群３）；又はプラセボ（群４）のいずれでＴＤＶを受容した。１：２：５：１の無作為化比は、第３相開発でこの用量レジメンを使用する可能性を支持するため、１用量スケジュールでの追加免疫を用いた又は用いないデータを提供するように選択した。２用量スケジュール（０月目－３月目）の安全性及び免疫原性は、ＴＤＶに関する以前の研究で確立されており、この群（群１）は、より大きな１つの１用量群（群２及び群３）と比較するために使用した。
これらの研究は、パナマ、フィリピン、及びドミニカ共和国の３つの病院／クリニックで実施された多施設無作為二重盲検プラセボ対照試験であった。健康な２～１７歳の参加者が登録され、適格性が評価され、その後１：２：５：１の比に無作為化され、０月目及び３月目に２つの用量（群１）；０月目に１つの用量（群２）；０月目に１つの用量及び１２月目に追加免疫（群３）；又はプラセボ（群４）のいずれでＴＤＶを受容した。１：２：５：１の無作為化比は、第３相開発でこの用量レジメンを使用する可能性を支持するため、１用量スケジュールでの追加免疫を用いた又は用いないデータを提供するように選択した。２用量スケジュール（０月目－３月目）の安全性及び免疫原性は、ＴＤＶに関する以前の研究で確立されており、この群（群１）は、より大きな１つの１用量群（群２及び群３）と比較するために使用した。
【0146】
手順
ＴＤＶの血清型組成物は、凍結乾燥製剤中、それぞれ、２．５×１０４、６．３×１０３、３．２×１０４、及び４．０×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、ＴＤＶ－３、及びＴＤＶ－４であった。プラセボは、リン酸緩衝生理食塩水であった。投与時にＴＤＶを注射用水に再構成し、０．５ｍＬのＴＤＶ又はプラセボのいずれかを皮下注射した（例えば、三角筋部）。試料は、以前に安定化製剤で凍結乾燥されていた。
ＴＤＶの血清型組成物は、凍結乾燥製剤中、それぞれ、２．５×１０４、６．３×１０３、３．２×１０４、及び４．０×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＴＤＶ－１、ＴＤＶ－２、ＴＤＶ－３、及びＴＤＶ－４であった。プラセボは、リン酸緩衝生理食塩水であった。投与時にＴＤＶを注射用水に再構成し、０．５ｍＬのＴＤＶ又はプラセボのいずれかを皮下注射した（例えば、三角筋部）。試料は、以前に安定化製剤で凍結乾燥されていた。
【0147】
中和抗体を測定するための血液試料を、研究治療投与前の０月目及び３月目並びに１月目及び６月目に、免疫原性サブセットの参加者から採取し、中央分析室で分析した。
１つのエンドポイントは、マイクロ中和試験［ＭＮＴ５０］を使用して、１月目、３月目、及び６月目での４つのＤＥＮＶ血清型の各々に対する中和抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）により表される免疫原性であった。第２の免疫原性エンドポイントは、１月目、３月目、及び６月目での４つのＤＥＮＶ血清型の各々に対する血液陽性率であった（ＭＮＴ５０による血液陽性は、中和力価の逆数≧１０と規定した）。免疫原性エンドポイントは、主要なプロトコール違反をしておらず、有効な投与前及び投与後の血液試料が入手可能であった免疫原性サブセットの参加者を全て含んでいたパープロトコルセット（ＰＰＳ）について要約した。
１つのエンドポイントは、マイクロ中和試験［ＭＮＴ５０］を使用して、１月目、３月目、及び６月目での４つのＤＥＮＶ血清型の各々に対する中和抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）により表される免疫原性であった。第２の免疫原性エンドポイントは、１月目、３月目、及び６月目での４つのＤＥＮＶ血清型の各々に対する血液陽性率であった（ＭＮＴ５０による血液陽性は、中和力価の逆数≧１０と規定した）。免疫原性エンドポイントは、主要なプロトコール違反をしておらず、有効な投与前及び投与後の血液試料が入手可能であった免疫原性サブセットの参加者を全て含んでいたパープロトコルセット（ＰＰＳ）について要約した。
【0148】
統計分析
この治験は、主として記述的であるように設計されており、正式な帰無仮説の検定に基づいていなかった。したがって、試料サイズは、正式な統計的検出力の計算に基づいて決定されていなかった。計画試料サイズは、参加者が１８００人であれば（免疫原性サブセットは６００人）、単一用量の投与後の免疫応答の持続性及び追加免疫用量の効果を評価するために合理的な人数の参加者が提供され、およそ２００００人の参加者での第３相有効性治験を支持するための適切な安全性データベースを提供すると仮定した。
この治験は、主として記述的であるように設計されており、正式な帰無仮説の検定に基づいていなかった。したがって、試料サイズは、正式な統計的検出力の計算に基づいて決定されていなかった。計画試料サイズは、参加者が１８００人であれば（免疫原性サブセットは６００人）、単一用量の投与後の免疫応答の持続性及び追加免疫用量の効果を評価するために合理的な人数の参加者が提供され、およそ２００００人の参加者での第３相有効性治験を支持するための適切な安全性データベースを提供すると仮定した。
【0149】
ベースラインでの、並びに１月目、３月目、及び６月目での血液陽性率及びデング中和抗体のＧＭＴを、４つのＴＤＶ血清型の各々について個々に、９５％信頼区間（ＣＩ）と共に算出した。少なくとも二価、三価、及び四価の血液陽性を有する参加者のパーセントを、各研究来院時に群毎にまとめた。これらのデータは、ベースラインデング血清型状態によっても示された。血液陽性は、≧１のＤＥＮＶ血清型についてＭＮＴ５０の逆数が≧１０であることと規定した。安全性データは、記述的に要約し、非自発的ＡＥは年齢で分けて記載した（＜６歳及び≧６歳）。
【0150】
６月目には、１７４３人の参加者が、計画レジメンを受けていた。研究参加者の平均年齢は、７．３歳であった（データ非表示）。ＰＰＳ（免疫原性サブセット）の人口統計データは、２～５歳の割合が、安全性セットよりもＰＰＳでより少ないことを除いて、概して、安全性セットの人口統計データを反映していた。ＰＰＳにおいてベースラインにて任意のＤＥＮＶに対して血清陽性であった参加者の割合は、研究群間で類似していた（全体で５４．７％；範囲５１．２～５７．４％）。ＴＤＶは、ワクチン接種を受けた参加者に、４つ全てのデング血清型に対する中和抗体を誘発した。最も高いレベルのデング中和抗体は、ＤＥＮＶ－２に対して観察され（図２）、その次がＤＥＮＶ－１に対するものであり、より低いレベルが、ＤＥＮＶ－３及びＤＥＮＶ－４に対して観察された。各血清型のＧＭＴは１月目にピークに達し、６月目（１８０日目）でも依然としてベースラインを超えていた。群１～４の６月目のＧＭＴ（９５％ＣＩ）は、それぞれ、ＤＥＮＶ－１：４８９（３２１、７４６）、４３４（３０６、６１５）、５３２（３８４、７３８）、６２（３２、１２０）；ＤＥＮＶ－２：１５６５（１１４５、２１４０）、１６３８（１２８６、２０８８）、１２８８（１０３１、１６１０）、８６（４４、１６９）；ＤＥＮＶ－３：１６０（１０４、２４８）、１５１（１０６、２１４）、１７３（１２４、２４０）、４０（２３、７１）；及びＤＥＮＶ－４：１１７（７９、１７５）、１１０（８０、１４９）、９３（６９、１２５）、２４（１５、３８）であった。ベースラインで血清反応陰であった参加者では、２用量スケジュールは、群２及び群３の参加者に投与された単一用量よりも、６月目でより高いＤＥＮ－３及びＤＥＮ－４ＧＭＴ（群１）を誘発したが、ＣＩは重複していた（データ非表示）。ベースラインで血清陽性であった参加者では、ＧＭＴ応答は、全てのＴＤＶ群で類似していた（データ非表示）。
【0151】
ＴＤＶワクチン接種を受けた参加者での個々のＤＥＮＶに対する血液陽性率は、１月目までに全ての研究群で８７．３～１００％に増加し、６月目でも各ＤＥＮＶで依然として高いままであった（８５．０～１００％；図３、左パネル）。ベースラインで血清陰性であった参加者では、２用量スケジュールは、１用量スケジュール（ＤＥＮＶ－３で８５．７％及び８５．３％並びにＤＥＮＶ－４では８１．４％の及び６９．３％、データ非表示）よりも、６月目でＤＥＮＶ－３（９７．５％）及びＤＥＮＶ－４（８７．５％）に対してより高い血液陽性率をもたらした。しかしながら、９５％ＣＩは重複していた。
【0152】
ベースラインでは、全体として参加者の４４．７％が、ＤＥＮＶに対して四価血液陽性であった。１月目までに、８０％よりも多くのＴＤＶワクチン接種参加者が、各研究群で四価血液陽性を示し、９６％以上が、少なくとも三価血液陽性を示した（データ非表示）。多価血液陽性率は、６月目で維持されていた。６か月率は、２用量ＴＤＶ後でわずかにより高かった（データ非表示）。ベースライン血清陰性参加者では、６か月四価血液陽性率は、１用量を受容した参加者よりも（群２及び群３で、７０％及び６５．３％）、２用量を受容した参加者でより高かったが（群１で８５％）、９５％ＣＩは重複していた。
【0153】
全体として、１４０２人の参加者が、１用量のＴＤＶを受容し、１９４人が２用量を受容した。３２人の参加者により報告された４０例のＳＡＥ（つまり、安全性セットの１．８％）はいずれも、研究ワクチン又は手順と関連していなかった。３例のＳＡＥが、研究離脱に至った（食品着色剤に対するアレルギー反応、免疫性血小板減少紫斑病、及び急性糸球体腎炎）。研究ワクチン及び手順と無関係な１例の死亡が、６か月分析カットオフ後に生じた（肺炎、肺結核症、及び敗血症性ショックによる）。２例の妊娠が、研究中断に至ったが、その後、参加者は正常に出産し、新生児は健康であった。
【0154】
ＴＤＶとプラセボとの間には、第１の用量と第２の用量を比べても、又はベースラインでの血清陽性と比べても、自発的ＡＥ率に大きな差はなく、ほとんどが、研究ワクチンと無関係であった（表３）。全体として、免疫原性サブセットの５６２人の参加者のうちの１５人（２．７％）が、ワクチンと関連した自発的ＡＥを報告した。非自発的ＡＥは、参加者の１８６人のうち１６１人（８６．６％）で軽度であった。ベースライン血清陽性参加者では、２５０人中５人（２．０％）及び４５人中０人（０％）が、それぞれ第１及び第２のＴＤＶ注射後に、ワクチン接種関連自発的ＡＥを報告した。それに対して、プラセボを受容した参加者では、４７人中１人（２．１％）及び２５２人中２人（０．８％）であった。初期血清陽性参加者では、２０２人中４人（２．０％）及び４２人中１人（２．４％）が、それぞれ第１及び第２のＴＤＶ注射後に、ワクチン接種関連自発的ＡＥを報告した。それに対して、プラセボを受容した参加者では、４３人中０人（０％）及び２０３人中２人（１．０％）であった。
【0155】
ワクチン接種後の血液陽性は、それがワクチン接種に対する測定可能な応答の証拠を提供するという点で、ワクチン性能の重要な尺度であり得る。無論、保護との相関性が存在しないと、どの程度の強度の応答が保護に必要であるかを定めることは可能ではない。しかしながら、体液性免疫及び細胞性免疫を生成し、以前にデングに曝露されていない個体であっても、個体の大多数に全てのデング血清型に対する測定可能な血清転換を示すワクチンは、大規模ワクチン有効性治験での評価に好適であり、小児及び若年成人のデングウイルスに対する有効なワクチンである可能性が高いことを示唆する。この治験のために選択された用量スケジュールは、初期血清陰性対象の大部分に多価応答を生成するはずである。
【0156】
この例示的な大規模研究では、第２相コホートは、２か所のデング流行地域（アジア及びラテンアメリカ）から集められた。第２相コホートは、ＴＤＶでワクチン接種を受けることになる現実世界の集団に近似している。１用量のＴＤＶと３か月の間隔をあけて投与される２用量ＴＤＶとの比較を評価するため、この第１の研究では、誘導された体液性免疫原性は、最初の用量後の６か月間ロバストなままであり、初期血清陰性ワクチン被接種者ではほんのわずかに低減したが、第２の用量の投与は、こうした減少の緩和（例えば、ＤＥＮＶ－４）及びワクチン接種に免疫学的に応答する対象割合の増加（例えば、ＤＥＮＶ－３）を支援したことが示された。ＴＤＶをワクチン接種した１５９６人の参加者では、新しい安全性の懸念は、６か月間出現しなかった。ＴＤＶは、ワクチン接種時のデング血清型状態に関わらず、２歳からの小児及び若年成人で安全であり、良好に耐容性であることが確認された。
【0157】
フラビウイルスキメラの他のワクチンが、幾つかの地域で認可されたが、それらは、９歳未満の小児には承認されていない。こうしたフラビウイルスキメラは、ＤＥＮＶ－１及び－２に対して３５～５０％の血清型特異的保護を誘導し、デング未感作レシピエントでの効力はより低かった。したがって、以前のデング曝露及び感染血清型に関わらず、全ての年齢のレシピエント、特に９歳未満のレシピエントで、４つ全てのＤＥＮＶ血清型に対して安全で有効であるワクチンに対する必要性が依然として存在する。ＴＤＶの有望な第２相結果は、ワクチン接種時のデング血液陽性に関わらず、幅広い年齢層にわたる（特に小児での）ＴＤＶの使用を支持するために設計された研究での、２用量スケジュールの第３相評価の開始を支持する。
【0158】
材料及び方法
ウイルス及び細胞
ＤＥＮＶ－１ １６００７、ＤＥＮＶ－２ １６６８１、ＤＥＮＶ－３ １６５６２、及びＤＥＮＶ－４ １０３４は、野生型（ｗｔ）ＤＥＮＶ対照としての役目を果たした。それらは、４つの組換えＴＤＶワクチン候補の親遺伝子型ウイルスであった。Ｄ２／１－Ｖ、Ｄ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒ、Ｄ２／３－Ｖ、及びＤ２／４－Ｖと表示されているＴＤＶ前駆研究等級ウイルスは、以前に調製及び特徴付けられていた。ワクチン生産用のマスター及びワーキングセルバンク製作のために使用したベロ（アフリカミドリザル腎臓）細胞は、ワクチン製造のために世界保健機構（ＷＨＯ）により特徴付けられているアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）ＣＣＬ８１細胞株に由来した（ＷＣＢ－ベロ細胞）。
ウイルス及び細胞
ＤＥＮＶ－１ １６００７、ＤＥＮＶ－２ １６６８１、ＤＥＮＶ－３ １６５６２、及びＤＥＮＶ－４ １０３４は、野生型（ｗｔ）ＤＥＮＶ対照としての役目を果たした。それらは、４つの組換えＴＤＶワクチン候補の親遺伝子型ウイルスであった。Ｄ２／１－Ｖ、Ｄ２ ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒ、Ｄ２／３－Ｖ、及びＤ２／４－Ｖと表示されているＴＤＶ前駆研究等級ウイルスは、以前に調製及び特徴付けられていた。ワクチン生産用のマスター及びワーキングセルバンク製作のために使用したベロ（アフリカミドリザル腎臓）細胞は、ワクチン製造のために世界保健機構（ＷＨＯ）により特徴付けられているアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）ＣＣＬ８１細胞株に由来した（ＷＣＢ－ベロ細胞）。
【0159】
ｃＤＮＡクローンに由来する組換え生ＴＤＶウイルスの導出
ｃＧＭＰ生産条件下で候補ワクチンウイルスを再導出するために、以前に遺伝子改変されたＤＥＮＶ感染性ｃＤＮＡクローン、ｐＤ２－ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒ、ｐＤ２／１－Ｖ、ｐＤ２／４－Ｖ、及び完全ゲノム長ウイルスｃＤＮＡを含むｉｎ ｖｉｔｒｏライゲーションｐＤ２／３－Ｖを使用して、新たなウイルスＲＮＡ転写物をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により以前に記載されているように製作した。簡潔に述べると、ＸｂａＩで線形化したＤＥＮＶゲノムｃＤＮＡを、プロテイナーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させてあらゆる残留タンパク質を除去し、その後転写の前に無ＲＮａｓｅのＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液に懸濁した。製造業者の推奨プロトコールに従ってＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７高収率転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を実施した。ＲＮＡ Ａ－ｃａｐ類似体、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）を、２時間の転写反応中に組み込んで、５’－末端Ａ－ｃａｐをＲＮＡ転写物に付加した。その後、試料をＤＮａｓｅＩで処理して、テンプレートｃＤＮＡを消化し、その後、低ｐＨフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行って、残留ＤＮＡ及びタンパク質を除去した。無ＲＮａｓｅ水に懸濁した精製ＲＮＡ転写物を、２０μｌアリコートに分配し、細胞をトランスフェクションする準備ができるまで、－８０℃で保管した。ＲＮＡ転写物の完全性及び濃度は、アガロースゲル電気泳動法により分析した。各２０μｌアリコートは、エレクトロポレーションにより０．４～１×１０７個の生産認定ベロ細胞のトランスフェクションを可能にするのに十分なゲノム長ウイルスＲＮＡを含むと推定した。
ｃＧＭＰ生産条件下で候補ワクチンウイルスを再導出するために、以前に遺伝子改変されたＤＥＮＶ感染性ｃＤＮＡクローン、ｐＤ２－ＰＤＫ－５３－ＶＶ４５Ｒ、ｐＤ２／１－Ｖ、ｐＤ２／４－Ｖ、及び完全ゲノム長ウイルスｃＤＮＡを含むｉｎ ｖｉｔｒｏライゲーションｐＤ２／３－Ｖを使用して、新たなウイルスＲＮＡ転写物をｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により以前に記載されているように製作した。簡潔に述べると、ＸｂａＩで線形化したＤＥＮＶゲノムｃＤＮＡを、プロテイナーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させてあらゆる残留タンパク質を除去し、その後転写の前に無ＲＮａｓｅのＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液に懸濁した。製造業者の推奨プロトコールに従ってＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７高収率転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を実施した。ＲＮＡ Ａ－ｃａｐ類似体、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）を、２時間の転写反応中に組み込んで、５’－末端Ａ－ｃａｐをＲＮＡ転写物に付加した。その後、試料をＤＮａｓｅＩで処理して、テンプレートｃＤＮＡを消化し、その後、低ｐＨフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行って、残留ＤＮＡ及びタンパク質を除去した。無ＲＮａｓｅ水に懸濁した精製ＲＮＡ転写物を、２０μｌアリコートに分配し、細胞をトランスフェクションする準備ができるまで、－８０℃で保管した。ＲＮＡ転写物の完全性及び濃度は、アガロースゲル電気泳動法により分析した。各２０μｌアリコートは、エレクトロポレーションにより０．４～１×１０７個の生産認定ベロ細胞のトランスフェクションを可能にするのに十分なゲノム長ウイルスＲＮＡを含むと推定した。
【0160】
ＷＣＢ－ベロ細胞への各ＲＮＡ転写物のトランスフェクションは、Ｓｈａｎｔｈａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ社のｃＧＭＰ施設で実施された。ＴＤＶ ＲＮＡ転写物を解凍し、４００μｌのベロ細胞懸濁液（１×１０７細胞／ｍｌ）と混合し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌトータルシステム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）によるエレクトロポレーション用の予め冷却しておいた無菌エレクトロポレーションキュベット（４ｍｍギャップ）に移した。各試料を、２５０Ｖ／∞ Ｏｈｍｓ／５００μＦで１回パルスし、室温で１０～１５分間インキュベートし、３０ｍｌの細胞増殖培地（１０％ＦＢＳを有するＭＥＭ）を含有する７５ｃｍ２フラスコに移し、３６℃±１℃、５％ＣＯ２で６～１１日間インキュベートした。培地を回収し、遠心分離により清澄化し、安定化させ、小アリコートにして－６０℃未満で保管した。トランスフェクションで得られた候補ワクチンストック（継代レベル１はＰ１と命名した）のウイルス力価を、ベロ細胞でのプラーク滴定アッセイにより決定し、ＴＤＶシードの更なる増殖に使用した。
【0161】
ＴＤＶウイルスシードの製造
Ｐ１ウイルスシードを使用して、製造ロットの最適な遺伝子安定性及び安全性を保証するように設計された戦略により、ＴＤＶプレマスター、マスター、ワーキング、及びバルクウイルスシードロットを増殖した。この戦略は、３回の連続プラーク精製、並びに継続的なシード生産に最適なクローンウイルス集団を選択するための種々の継代レベルでのウイルス遺伝子分析を含んでいた（表１）。簡潔に述べると、トランスフェクト細胞から回収したＰ１シードを、０．００１のＭＯＩでベロ細胞に感染させることにより１回増幅して、Ｐ２シードを生成した。Ｐ２シードストックのアリコートを、プラーク形態及び完全ウイルスゲノム配列決定により評価した。遺伝子的に確認したＰ２ストックを、下記のプラーク滴定セクションに記載されているように、オーバーレイ培地を有するベロ細胞単層にプレーティングして、十分に単離されたプラークを生成した。ニュートラルレッドで視覚化した後、ワクチンウイルスの４つの血清型の各々から６つの個々のプラークを単離し（プラーククローンＡ～Ｆ）、０．５ｍｌの培地に混合した（継代Ｐ３）。６つのプラーク懸濁液の各々を２回の更なるラウンドのプラーク精製にかけ、それぞれ、継代Ｐ４及びＰ５で２回及び３回プラーク精製したウイルスシードを得た。Ｐ５ウイルスを、２連続ベロ継代により増幅して、Ｐ７シードストックを生産した。
Ｐ１ウイルスシードを使用して、製造ロットの最適な遺伝子安定性及び安全性を保証するように設計された戦略により、ＴＤＶプレマスター、マスター、ワーキング、及びバルクウイルスシードロットを増殖した。この戦略は、３回の連続プラーク精製、並びに継続的なシード生産に最適なクローンウイルス集団を選択するための種々の継代レベルでのウイルス遺伝子分析を含んでいた（表１）。簡潔に述べると、トランスフェクト細胞から回収したＰ１シードを、０．００１のＭＯＩでベロ細胞に感染させることにより１回増幅して、Ｐ２シードを生成した。Ｐ２シードストックのアリコートを、プラーク形態及び完全ウイルスゲノム配列決定により評価した。遺伝子的に確認したＰ２ストックを、下記のプラーク滴定セクションに記載されているように、オーバーレイ培地を有するベロ細胞単層にプレーティングして、十分に単離されたプラークを生成した。ニュートラルレッドで視覚化した後、ワクチンウイルスの４つの血清型の各々から６つの個々のプラークを単離し（プラーククローンＡ～Ｆ）、０．５ｍｌの培地に混合した（継代Ｐ３）。６つのプラーク懸濁液の各々を２回の更なるラウンドのプラーク精製にかけ、それぞれ、継代Ｐ４及びＰ５で２回及び３回プラーク精製したウイルスシードを得た。Ｐ５ウイルスを、２連続ベロ継代により増幅して、Ｐ７シードストックを生産した。
【0162】
スポット配列決定及び／又は以前に開示されたＴａｑｍａｎ（登録商標）に基づくミスマッチ増幅突然変異アッセイ（ＴａｑＭＡＭＡ）並びにプラーク表現型分析を使用した、３つの主要ＴＤＶ弱毒化遺伝子座の遺伝子分析を実施して、２４個のＰ７シード全てをスクリーニングした。その後、適切な初期特徴を有するシードを、全長ゲノム配列決定により更に特徴付けた。こうした分析の結果、各ＴＤＶ血清型の６つ（クローンＡ～Ｆ）Ｐ７シードのうちの１つを、ＤＥＮＶ－２ ＰＤＫ－５３弱毒化突然変異の存在、最小限のゲノム配列変更、及び予想通りのプラーク表現型に基づいて選択して、プレマスターシードとした。各選択したプレマスターシードを、ベロ細胞の複数の１７５ｃｍ２フラスコ中、０．００１のＭＯＩでウイルスを１回継代することにより増殖して、マスターウイルスシード（ＭＶＳ又はＰ８）とした。ＴＤＶ－４ ＭＶＳを除き、マスターウイルスシードは、感染後（ｐｉ）８～１０日で回収した。ＭＶＳストックを、感染後（ｐｉ）６～１０日で回収し、遠心分離により清澄化し、スクロース／ホスフェート／グルタメート溶液（それぞれ、終濃度７．５％のスクロース、３．４ｍＭのリン酸二水素カリウム、７．２ｍＭのリン酸二カリウム、５．４ｍＭのグルタミン酸一ナトリウム）及び０．９５～１．９０％のＦＢＳ（終濃度）を添加することにより安定化した。ＴＤＶ－４ ＭＶＳは、その収率を最適化するために異なる方法で調製した。簡潔に述べると、複数の細胞フラスコを、ＤＥＮＶウイルス熱安定性を増強することが実証されている０．１％のＦ－１２７（商標）、ポロキサマー４０７（他のＥＯ－ＰＯブロックコポリマーが評価されており、ここで代わりに使用してもよい。付与特許を参照）の存在下にて、０．００１のＭＯＩでＴＤＶ－４プレマスターシードに感染させた。感染培地をｐｉ６～１０日で回収し、１７％のＦＢＳ（終濃度）で安定化し、プールし、凍結した。４つ全てのＴＤＶ ＭＶＳストックを、１ｍｌのアリコートとして－６０℃未満で保管した。
【0163】
ＴＤＶワーキングウイルスシード（ＷＶＳ）は、０．００１のＭＯＩにてＭＶＳをベロ細胞培養中で１回継代することにより調製した。この手順は、多層セルファクトリー（６３６０ｃｍ２）で培養したこと以外は、ＭＶＳの生産と同様であった。ＷＶＳストックを１０μＭ及び０．４５μＭフィルターでろ過し、ＭＶＳに使用したものと同じ安定化剤で安定化し、３０ｍｌのＰＥＴＧボトル又は２．０ｍｌのクライオバイアルにアリコートし、－６０℃未満で保管した。
【0164】
ある方法では、コンフルエントベロ細胞の複数のセルファクトリー（各々６３６０ｃｍ２）を、０．００１のＭＯＩを達成するように希釈した９０ｍＬのＷＶＳで感染させることにより、バルクウイルスシード（ＢＶＳ）を調製した。ＷＶＳ接種物の希釈に使用した培地は、無血清の０．１％Ｆ－１２７（商標）を含んでいた。１．５時間の吸着後、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、８００ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地を各セルファクトリーに添加し、ファクトリーを、５（±０．５）％ＣＯ２中３６（±１）℃でインキュベートした。４日間のインキュベーション後、培地の小アリコートを、無菌試験のために収集した。ウイルスを、ｐｉ５日目～１０日目に回収し、０．４５ｕｍ孔径フィルターによるろ過で直ちに清澄化し、１Ｌの各清澄化ウイルスプールを、５００ｍｌの３×ＦＴＡ緩衝液（ＰＢＳ中の終濃度が１５％のトレハロース、１．０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７（商標）ポロキサマー４０７、０．１％のヒトアルブミンＵＳＰ、ｐＨ７．４）を添加することにより安定化した。安定化ウイルスを、１ＬのＰＥＴＧボトルに分配し、その後プールして品質管理試験を行うために、－６０℃未満で凍結保管した。１０５ＰＦＵ／ｍｌを超えるウイルス力価及び許容可能な残留ＤＮＡレベルを有する全ての安定化ウイルス回収物を、３２℃の水浴で急速解凍し、無菌的にプール及び混合した。各プールした１価ＢＶＳを、ラベル付きＰＥＴＧ容器に分配し、更なる使用まで－６０未満で保管した。
【0165】
製造製品品質管理
ＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳシードを、同一性、不稔性、及び検出可能な外来性因子に関して試験した。各ワクチンストックの同一性は、ＴＤＶ血清型特異的プライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲにより確認した。増幅したｃＤＮＡ断片は、４つのＴＤＶ血清型の各々の特定を可能にするＥ／ＮＳ１キメラ接合部位を含んでいた。各シードを、４つ全ての血清型特異的ＲＴ－ＰＣＲ反応で試験して、ウイルス同一性、及び異種性ＴＤＶ血清型の交差汚染がないことを確認した。無菌試験は、ＵＳＰ７１（米国薬局方、セクション７１）に従って実施した。マイコプラズマ試験を実施した。
ＭＶＳ、ＷＶＳ、及びＢＶＳシードを、同一性、不稔性、及び検出可能な外来性因子に関して試験した。各ワクチンストックの同一性は、ＴＤＶ血清型特異的プライマーを用いたＲＴ－ＰＣＲにより確認した。増幅したｃＤＮＡ断片は、４つのＴＤＶ血清型の各々の特定を可能にするＥ／ＮＳ１キメラ接合部位を含んでいた。各シードを、４つ全ての血清型特異的ＲＴ－ＰＣＲ反応で試験して、ウイルス同一性、及び異種性ＴＤＶ血清型の交差汚染がないことを確認した。無菌試験は、ＵＳＰ７１（米国薬局方、セクション７１）に従って実施した。マイコプラズマ試験を実施した。
【0166】
以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏウイルス汚染試験は全て、シードの製造中に収集した未清澄化で未安定化のＴＤＶ回収物を使用して実施した。回収した感染性培地を、まず、３６±１℃で１時間、ＤＥＮＶウサギポリクローナル抗血清（Ｉｎｖｉｒａｇｅｎ社）で中和して、ＤＥＮＶを不活化した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、中和したシードを、２５ｃｍ２フラスコ中で、３つの指標細胞株、ＭＲＣ５、ＶＥＲＯ、及びＭＡ１０４に接種した。エコーウイルス（ＣＰＥ対照）又はムンプスウイルス（赤血球吸着対照）を、それぞれ陽性ＣＰＥ又は赤血球吸着対照として使用した。細胞は全て、合計１４日間にわたってＣＰＥを毎日モニターした。１４日間の終わりに、培養上清を取り除き、１０ｍＬのモルモット赤血球細胞（ＲＢＣ）溶液（３ｍＬの０．５％モルモットＲＢＣリン酸緩衝生理食塩水溶液を、細胞増殖培地で１０ｍＬにしたもの）と取り替えた。その後、フラスコを５±３℃で３０分間インキュベートし、その後室温で３０分間インキュベートした。単層をＰＢＳで洗浄し、赤血球吸着を示すＲＢＣのあらゆる星形凝集塊の存在を１０×の拡大率で観察した。
【0167】
外因性因子のｉｎ ｖｉｖｏ試験を、乳仔マウス、離乳後マウス、及びモルモットで実施した。乳仔マウスに、０．１ｍｌ又は０．０１ｍｌ（各用量群１０匹マウス）のＤＥＮＶ抗血清中和シード試料を腹腔内（ｉｐ）注射で接種した。同様に、１０匹の離乳後マウスに、０．５ｍｌ又は０．０３ｍｌの試料を各々ｉｐ接種した。モルモット（５匹／群）には、各々５．０ｍＬをｉｐ接種した。乳仔マウスは、接種後合計１４日間にわたって、病的状態及び死亡を毎日観察した。離乳後マウスは、接種後合計２８日間にわたって観察し、モルモットは、接種後合計４２日間にわたって観察した。被試験物質は、接種動物の≧８０％が観察期間全体にわたって健康を維持した場合、許容基準を満たした。
【0168】
また、汚染物質のｉｎ ｖｉｖｏ実験を、有胚ニワトリ卵で実施した。全ての試料について、１０個の有胚雌ニワトリ卵（９日齢）の尿膜腔液に、各々０．５ｍＬのＤＥＮＶ抗血清中和試料を接種し、３５℃で３日間インキュベートした。これら１０個の卵から尿膜腔液を回収し、プールし、１０個の新たな有胚卵の尿膜腔液（１０～１１日齢；０．５ｍＬ／卵）に継代し、更に３日間３５℃でインキュベートした。同様に、各試料について、１０個の有胚卵（６～７日齢）に、各々卵１個当たり０．５ｍＬ（ＴＤＶ－２ １価ＢＶＳ）又は卵１個当たり０．２５ｍＬ（ＤＶ－１、ＴＤＶ－３、及びＴＤＶ－４ ＢＶＳ）を卵黄嚢への注射により接種し、９日間３５℃でインキュベートした。これら１０個の卵から卵黄嚢を回収し、プールし、１０％懸濁液を、１０個の新たな有胚卵（６～７日齢；０．５ｍＬ／卵）の卵黄嚢に継代し、更に９日間３５℃でインキュベートした。尿膜腔液に接種した卵（初期及び継代接種物の両方）を、３日間インキュベーションした後、生存能について観察した。尿膜腔液の両プールは、４℃及び２５℃で、ニワトリ、モルモット、及びヒトＯ型赤血球を使用して、赤血球凝集活性を試験した。卵黄嚢に接種した卵（初期及び継代接種物の両方）を、９日間インキュベーションした後、生存能について観察した。
【0169】
ウイルスプラーク試験及びイムノフォーカスアッセイ
ウイルス力価は、ベロ細胞を使用して、プラークアッセイ又はイムノフォーカスアッセイにより分析した。プラークアッセイは、以前に記載されているように、コンフルエントベロ細胞の６ウエルプレートにて二重アガロースオーバーレイで実施した。それらは、ＴＤＶシードのプラーク表現型を評価するためにも使用した。正確に比較するために、全てのウイルスのプラークサイズは、同じ実験で測定及び比較した。ｐｉ９日目にニュートラルレッドにより視覚化した後、各ウイルスについて最大１０個の十分に単離されたプラークを測定して、平均プラークサイズを算出した。ｗｔＤＥＮＶ－１、－３、及び－４の場合、より少数のプラークしか測定されなかった。それらはプラークサイズがより大きく、１０個の十分に分離されたプラークの測定が可能ではないことが多かった。
ウイルス力価は、ベロ細胞を使用して、プラークアッセイ又はイムノフォーカスアッセイにより分析した。プラークアッセイは、以前に記載されているように、コンフルエントベロ細胞の６ウエルプレートにて二重アガロースオーバーレイで実施した。それらは、ＴＤＶシードのプラーク表現型を評価するためにも使用した。正確に比較するために、全てのウイルスのプラークサイズは、同じ実験で測定及び比較した。ｐｉ９日目にニュートラルレッドにより視覚化した後、各ウイルスについて最大１０個の十分に単離されたプラークを測定して、平均プラークサイズを算出した。ｗｔＤＥＮＶ－１、－３、及び－４の場合、より少数のプラークしか測定されなかった。それらはプラークサイズがより大きく、１０個の十分に分離されたプラークの測定が可能ではないことが多かった。
【0170】
四価ＴＤＶは、４つ全てのＤＥＮＶ血清型を含むため、ＤＥＮＶ血清型特異的なイムノフォーカスアッセイを開発して、四価製剤中の各ＴＤＶ成分を定量化した。各々個々のＴＤＶ ＭＶＳのイムノフォーカスアッセイを、プラークアッセイと比較して、ウイルス滴定結果が２つのアッセイ間で同等であることを確認した。イムノフォーカスアッセイは、系列希釈したウイルスで感染させたコンフルエントベロ細胞の６ウエルプレートで実施した。細胞を、０．７％の高粘度カルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ社）を含むバランス塩培地（ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｍｅｄｉｕｍ）（ＢＳＳ／ＹＥ－ＬＡＨ培地）でオーバーレイし、５％ＣＯ２を用いて３７℃で７日間インキュベートした。オーバーレイを除去した後、細胞シートをＰＢＳで３回洗浄し、冷却した８０％アセトンで３０分間－２０℃にて固定し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中に２．５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むブロッキング緩衝液で３０分間３７℃でブロッキングした。ブロッキングした細胞を、ブロッキング緩衝液で希釈したＤＥＮＶ血清型特異的ＭＡｂ、１Ｆ１（ＤＥＮＶ－１）、３Ｈ５（ＤＥＮＶ－２）、８Ａ－１（ＤＥＮＶ－３）、又は１Ｈ１０（ＤＥＮＶ－４）と共に、３７℃で１時間又は４℃で一晩インキュベートし、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）で３回洗浄し、アルカリホスファターゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた親和性純度のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と共に３７℃で４５～６０分間インキュベートした。プレートを３回洗浄してから、適切な基質、アルカリホスファターゼの場合は１－Ｓｔｅｐ ＮＢＴ／ＢＣＩＰ ｐｌｕｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（Ｐｉｅｒｃｅ社）又はＨＲＰの場合はＶｅｃｔｏｒ－ＶＩＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ社）を、発色のために添加した。フォーカスが完全に出現したら、水ですすぐことにより発色を停止させた。染色したイムノフォーカスを、直接視覚化し、ライトボックスで計数した。
【0171】
遺伝子配列
ＭＶＳ及びＷＶＳの全長ゲノムを配列決定した（以下を参照）。簡潔に述べると、ウイルスＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用することによりＴＤＶシードから抽出し、ゲノム全体を網羅する重複ｃＤＮＡ断片を、Ｔｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して増幅した。増幅したｃＤＮＡ断片をゲルで精製してから、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、順方向及び逆方向プライマーを両方とも用いて配列決定した。配列反応物は、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ精製キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して不純物を除去し、ＤＶＢＤ／ＣＤＣで３１３０ｘｌ遺伝子アナライザーにかけた（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）。Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ＳｅｑＭａｎソフトウェア（ＤＮＡＳｔａｒ社）を、ゲノム分析及び比較に使用した。
ＭＶＳ及びＷＶＳの全長ゲノムを配列決定した（以下を参照）。簡潔に述べると、ウイルスＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用することによりＴＤＶシードから抽出し、ゲノム全体を網羅する重複ｃＤＮＡ断片を、Ｔｉｔａｎ Ｏｎｅ Ｔｕｂｅ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して増幅した。増幅したｃＤＮＡ断片をゲルで精製してから、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、順方向及び逆方向プライマーを両方とも用いて配列決定した。配列反応物は、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ精製キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して不純物を除去し、ＤＶＢＤ／ＣＤＣで３１３０ｘｌ遺伝子アナライザーにかけた（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）。Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ＳｅｑＭａｎソフトウェア（ＤＮＡＳｔａｒ社）を、ゲノム分析及び比較に使用した。
【0172】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）に基づくミスマッチ増幅突然変異アッセイ（ＴａｑＭＡＭＡ）
ＴａｑＭＡＭＡは、弱毒化の５’ＮＣ－５７遺伝子座における復帰突然変異レベルのより詳細な評価を可能にするために開発された高感度定量性一塩基多型アッセイであり、この研究のために更に最適化した。ＭＶＳ及びＷＶＳから抽出したウイルスＲＮＡを、ｗｔ又はワクチン５’ＮＣ－５７領域に特異的なプライマー／Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブの両セットを用いたＴａｑＭＡＭＡにより分析した。ＤＥＮＶ－２ ｗｔ及びワクチン配列を検出するために使用した順方向プライマーは、それぞれＤ２－４１－ＧＣ及びＤ２－４０－ＴＴであった。各順方向プライマーの３’末端ヌクレオチドは、各ウイルスの特異的５’ＮＣＲ－５７ヌクレオチドと一致していたが、各プライマーの３’末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドは、ミスマッチ効果を増強するためにＤＥＮＶ－２ウイルスゲノム配列とは異なっていた。逆方向プライマーＣＤ－２０７及びＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブＣＤ－１６９Ｆは、ｗｔセット及びワクチンセットの両方で同一であった。プライマー及びプローブの配列並びにサイクル条件は、以前に記載されていた。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを、５μｌのウイルスＲＮＡテンプレート、０．４ｕＭの各プライマー、及び０．２ｕＭのプローブを含む２５μｌ反応物中で、ＢｉｏＲａｄ ｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ（プローブ用）キットを使用して、ｉＱ５又はＣＦＸ－９５システム（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて実施した。各ｗｔ特異的及びワクチン特異的アッセイの三重複反応を、各試料で実施した。ゲノムコピー数を、各ウイルス遺伝子型毎に作成した標準曲線と対比させて決定した。標準ＲＮＡは、各遺伝子型に特異的なｃＤＮＡのｎｔ１～２６７０を含むプラスミドに由来する転写物であった。加えて、全ての実験で交差反応性が最小限であることを保証するために、異種性遺伝子型プライマー／プローブセットを用いて各標準ＲＮＡを試験することにより、アッセイの特異性を確認した。結果は、復帰突然変異を示すウイルスゲノムのパーセントとして報告した。以前には、このアッセイの入力ＲＮＡレベルが、より高い交差反応性バックグラウンドにより制限されていたため、元の検出感度は、約０．１％の復帰突然変異であった（識別能力）。それ以降、このアッセイは、改良型のリアルタイムＰＣＲ装置及び反応キットを使用して更に最適化されており、交差反応性バックグラウンドは、非常に高いレベルのＲＮＡテンプレート入力でも（７～８ｌｏｇ１０コピー）かなり減少した。この最適化は、０．０１～０．０７％復帰突然変異までと、著しい検出感度の向上をもたらした。
ＴａｑＭＡＭＡは、弱毒化の５’ＮＣ－５７遺伝子座における復帰突然変異レベルのより詳細な評価を可能にするために開発された高感度定量性一塩基多型アッセイであり、この研究のために更に最適化した。ＭＶＳ及びＷＶＳから抽出したウイルスＲＮＡを、ｗｔ又はワクチン５’ＮＣ－５７領域に特異的なプライマー／Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブの両セットを用いたＴａｑＭＡＭＡにより分析した。ＤＥＮＶ－２ ｗｔ及びワクチン配列を検出するために使用した順方向プライマーは、それぞれＤ２－４１－ＧＣ及びＤ２－４０－ＴＴであった。各順方向プライマーの３’末端ヌクレオチドは、各ウイルスの特異的５’ＮＣＲ－５７ヌクレオチドと一致していたが、各プライマーの３’末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドは、ミスマッチ効果を増強するためにＤＥＮＶ－２ウイルスゲノム配列とは異なっていた。逆方向プライマーＣＤ－２０７及びＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブＣＤ－１６９Ｆは、ｗｔセット及びワクチンセットの両方で同一であった。プライマー及びプローブの配列並びにサイクル条件は、以前に記載されていた。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを、５μｌのウイルスＲＮＡテンプレート、０．４ｕＭの各プライマー、及び０．２ｕＭのプローブを含む２５μｌ反応物中で、ＢｉｏＲａｄ ｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ（プローブ用）キットを使用して、ｉＱ５又はＣＦＸ－９５システム（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて実施した。各ｗｔ特異的及びワクチン特異的アッセイの三重複反応を、各試料で実施した。ゲノムコピー数を、各ウイルス遺伝子型毎に作成した標準曲線と対比させて決定した。標準ＲＮＡは、各遺伝子型に特異的なｃＤＮＡのｎｔ１～２６７０を含むプラスミドに由来する転写物であった。加えて、全ての実験で交差反応性が最小限であることを保証するために、異種性遺伝子型プライマー／プローブセットを用いて各標準ＲＮＡを試験することにより、アッセイの特異性を確認した。結果は、復帰突然変異を示すウイルスゲノムのパーセントとして報告した。以前には、このアッセイの入力ＲＮＡレベルが、より高い交差反応性バックグラウンドにより制限されていたため、元の検出感度は、約０．１％の復帰突然変異であった（識別能力）。それ以降、このアッセイは、改良型のリアルタイムＰＣＲ装置及び反応キットを使用して更に最適化されており、交差反応性バックグラウンドは、非常に高いレベルのＲＮＡテンプレート入力でも（７～８ｌｏｇ１０コピー）かなり減少した。この最適化は、０．０１～０．０７％復帰突然変異までと、著しい検出感度の向上をもたらした。
【0173】
蚊Ｃ６／３６細胞でのウイルス複製及び哺乳動物ベロ細胞での温度感受性
４つのＴＤＶ ＭＶＳストック及びｗｔＤＥＮＶ－１、－２、－３、及び－４ウイルスの複製表現型を、Ｃ６／３６蚊細胞（ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ））で評価した。６ウエルプレートで増殖したＣ６／３６細胞を、０．００１のＭＯＩで各ウイルスに二重重複で感染させ、２８℃の５％ＣＯ２インキュベーターにて、２％ＦＢＳを含む４ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭ培地でインキュベートした。各ウイルスの培養上清の小アリコートを、ｐｉ６日目に収集し、４０％のＦＢＳを含む等容積の培地と混合し、ウイルスプラーク滴定の準備ができるまで、－８０℃で保管した。
４つのＴＤＶ ＭＶＳストック及びｗｔＤＥＮＶ－１、－２、－３、及び－４ウイルスの複製表現型を、Ｃ６／３６蚊細胞（ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ））で評価した。６ウエルプレートで増殖したＣ６／３６細胞を、０．００１のＭＯＩで各ウイルスに二重重複で感染させ、２８℃の５％ＣＯ２インキュベーターにて、２％ＦＢＳを含む４ｍｌ／ウェルのＤＭＥＭ培地でインキュベートした。各ウイルスの培養上清の小アリコートを、ｐｉ６日目に収集し、４０％のＦＢＳを含む等容積の培地と混合し、ウイルスプラーク滴定の準備ができるまで、－８０℃で保管した。
【0174】
温度感受性は、ｐｉ５日目の６ウエルプレートでのベロ細胞のウイルス増殖を３９℃と３７℃とで比較することにより実施した。細胞を、３７℃にて０．００１のＭＯＩで各ウイルスに四重重複で感染させた。ウイルス吸着後、感染培養を、一方（重複プレート）は３７℃に設定し、他方は３９℃に設定した２つの別々の５％ＣＯ２インキュベーター中にて、４ｍｌ／ウェルの２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地でインキュベートした。培養上清のアリコート（５０μｌ）を、ｐｉ５日目に収集し、４０％のＦＢＳを含む等容積の培地と混合し、ウイルスプラーク滴定の準備ができるまで、－８０℃で保管した。インキュベーター温度は、ＮＩＳＴトレーサブル工場較正温度計（－１～５１℃；ＥＲＴＣＯ社）で較正した。
【0175】
蚊感染、播種、及び伝染
研究に使用したネッタイシマカは、タイ国Ｍａｅ Ｓｏｔ（１６’Ｎ、３３’Ｅ）付近の村に由来する２００２年に樹立されたコロニーに由来していた。幼虫から羽化させた後、成体蚊を、１６：８（明：暗）光周期で２８℃にて、１０％スクロース溶液を自由摂取させて維持した。５～１１日齢の雌蚊を、感染性血液給餌又は胸腔内（ＩＴ）接種に使用した。新たに培養したＴＤＶ及びｗｔＤＥＮＶのアリコートを、回収後直ちに使用して（凍結解凍サイクルを用いずに）、以下に示されているような経口感染用のウイルス血液餌を製作した。残りのウイルス上清をＦＢＳで補完して、終濃度を２０％にし、アリコートを、将来のウイルスプラーク滴定及びＩＴ接種実験のために－８０℃で保管した。こうした実験のために新たに調製したＴＤＶシードを、プレマスターシードからベロ細胞で増幅し、ＴＤＶ ＭＶＳ等価物とみなした。
研究に使用したネッタイシマカは、タイ国Ｍａｅ Ｓｏｔ（１６’Ｎ、３３’Ｅ）付近の村に由来する２００２年に樹立されたコロニーに由来していた。幼虫から羽化させた後、成体蚊を、１６：８（明：暗）光周期で２８℃にて、１０％スクロース溶液を自由摂取させて維持した。５～１１日齢の雌蚊を、感染性血液給餌又は胸腔内（ＩＴ）接種に使用した。新たに培養したＴＤＶ及びｗｔＤＥＮＶのアリコートを、回収後直ちに使用して（凍結解凍サイクルを用いずに）、以下に示されているような経口感染用のウイルス血液餌を製作した。残りのウイルス上清をＦＢＳで補完して、終濃度を２０％にし、アリコートを、将来のウイルスプラーク滴定及びＩＴ接種実験のために－８０℃で保管した。こうした実験のために新たに調製したＴＤＶシードを、プレマスターシードからベロ細胞で増幅し、ＴＤＶ ＭＶＳ等価物とみなした。
【0176】
感染性血液餌は、経口感染させた日に、新たなウイルスを、脱線維素（ｄｅｆｒｉｂｒｉｎａｔｅｄ）ニワトリ血液（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ社）と１：１の比で混合することにより調製した。蚊を、一晩糖飢餓させた後、Ｈｅｍｏｔｅｋ膜給餌システム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ社）を使用し、１時間にわたって、ウイルス：血液混合物を与えた。血液餌の５０μｌアリコートを、ウイルス用量の逆滴定のために－８０℃で保持した。十分に吸血させた雌を、寒冷麻酔下で選別し、紙箱に入れて、１０％スクロース溶液を自由摂取させた。紙箱は、１６：８時間（明：暗）の光周期で２８℃に設置した。１４日後に、各ウイルス群の２５～３０匹の蚊を、トリエチルアミン（Ｆｌｙｎａｐ（登録商標）、Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｏｍｐａｎｙ社）に曝すことにより麻酔し、１本の後肢を切除し、１０％ＦＢＳ及び５％ペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ、１００Ｕ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ）を有する０．５ｍｌのＤＭＥＭに入れた。麻酔した蚊の鼻に、２．５％ＦＢＳ及び２５％スクロース溶液を含有する毛細管を挿入することにより、唾液を収集した。少なくとも１５分間、蚊に唾液を出させ、ＤＭＥＭを含有する別々のチューブに、毛細管及び本体を入れた。蚊本体、脚部、及び唾液を、感染性ウイルスを滴定及びアッセイするまで、－８０℃で保管した。ＩＴ接種では、蚊に寒冷麻酔をかけ、０．３４μｌ接種物中のおよそ５０ｐｆｕのウイルスを接種した。接種した蚊は、上記に記載のものと同じ条件で７日間保管した。その後、蚊に麻酔をかけ、それらの唾液及び本体を、上記に記載のように収集した。試料は、更なる処理まで－８０℃で保管した。
【0177】
ウイルス滴定のための試料を処理するために、本体及び脚部試料を、ミキサーミルを使用して、銅コーティングＢＢ（Ｃｒｏｓｓｍａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ニューヨーク州）と共に２４サイクル／秒で４分間ホモジナイズし、その後３，０００×ｇで３分間遠心分離することにより清澄化した。唾液試料を、３，０００×ｇで３分間遠心分離して、毛細管から流体を排出させた。本体ホモジネート及び脚部ホモジネート並びに唾液試料の１０倍希釈物を、プラークアッセイにより感染性ウイルスの存在に関して試験した。本体、脚部、及び唾液の結果は、それぞれ感染率、播種率、及び伝染率を決定するために使用した。
【0178】
マウス神経毒性
計画妊娠雌ＩＣＲマウス（Ｔｉｍｅｄ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｆｅｍａｌｅ ＩＣＲ ｍｉｃｅ）を、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ社から取得し、毎日数回モニターして、同腹仔のおよその誕生時期を決定した。所与の実験で、誕生のおよそ１２～２４時間後に、１ウイルス当たり２つの同腹群の８匹の仔（ｎ＝１６）に、２０μｌの希釈液中１０３～１０４ｐｆｕのウイルスを、３０ゲージ針を使用して頭蓋内（ｉｃ）接種により負荷した。負荷後、動物を、少なくとも３２日間にわたって少なくとも１日３回モニターした。病気の最初の徴候（被毛粗剛、背中の湾曲、体重減少、異常運動、麻痺、又は傾眠）が見られたら、イソフルランガスで致死麻酔をかけてから頸椎脱臼させることにより動物を安楽死させた。感染後の安楽死日は、動物の「病気／病的状態までの時間」又は「生存期間」に相当した。動物実験は、ＤＶＢＤ／ＣＤＣのＩＡＣＵＣ認可の動物プロトコールに従って実施した。
計画妊娠雌ＩＣＲマウス（Ｔｉｍｅｄ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｆｅｍａｌｅ ＩＣＲ ｍｉｃｅ）を、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓ社から取得し、毎日数回モニターして、同腹仔のおよその誕生時期を決定した。所与の実験で、誕生のおよそ１２～２４時間後に、１ウイルス当たり２つの同腹群の８匹の仔（ｎ＝１６）に、２０μｌの希釈液中１０３～１０４ｐｆｕのウイルスを、３０ゲージ針を使用して頭蓋内（ｉｃ）接種により負荷した。負荷後、動物を、少なくとも３２日間にわたって少なくとも１日３回モニターした。病気の最初の徴候（被毛粗剛、背中の湾曲、体重減少、異常運動、麻痺、又は傾眠）が見られたら、イソフルランガスで致死麻酔をかけてから頸椎脱臼させることにより動物を安楽死させた。感染後の安楽死日は、動物の「病気／病的状態までの時間」又は「生存期間」に相当した。動物実験は、ＤＶＢＤ／ＣＤＣのＩＡＣＵＣ認可の動物プロトコールに従って実施した。
【0179】
マスターシードウイルスの導出
ＴＤＶ－１マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
キメラウイルスゲノムのヌクレオチド配列及び翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列が、本明細書で提供される。例えば、ＴＤＶ－１ポリヌクレオチド配列としては、配列番号１、３、５、及び７により表されるものが挙げられ、ＴＤＶ－１ポリペプチド配列としては、配列番号２、４、６、及び８により表されるものが挙げられる。ｐｒＭ－Ｅ遺伝子のほとんど（ｎｔ４５７～－２３７９、下線部）は、野生型（ｗｔ）ＤＥＮ－１ １６００７ウイルス特異的であり、残りのゲノムは、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ウイルス特異的である。ｗｔウイルス（Ｄ１ １６００７又はＤ２ １６６８１）と異なる全ての遺伝子改変された置換、並びにＭＶＳで検出された追加の突然変異（遺伝子改変されたｃＤＮＡクローンからの変化）には印が付けられている。
ＴＤＶ－１マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
キメラウイルスゲノムのヌクレオチド配列及び翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列が、本明細書で提供される。例えば、ＴＤＶ－１ポリヌクレオチド配列としては、配列番号１、３、５、及び７により表されるものが挙げられ、ＴＤＶ－１ポリペプチド配列としては、配列番号２、４、６、及び８により表されるものが挙げられる。ｐｒＭ－Ｅ遺伝子のほとんど（ｎｔ４５７～－２３７９、下線部）は、野生型（ｗｔ）ＤＥＮ－１ １６００７ウイルス特異的であり、残りのゲノムは、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ウイルス特異的である。ｗｔウイルス（Ｄ１ １６００７又はＤ２ １６６８１）と異なる全ての遺伝子改変された置換、並びにＭＶＳで検出された追加の突然変異（遺伝子改変されたｃＤＮＡクローンからの変化）には印が付けられている。
【0180】
ゲノム及びタンパク質に含まれていた置換：
Ｄ１（ｐｒＭ－Ｅ）とＤ２骨格との接合部位：
ａ． ＭｌｕＩ（ｎｔ４５１～４５６）：遺伝子改変されたサイレント突然変異、ｎｔ－４５３ ＡからＧ
ｂ． ＮｇｏＭＩＶ（ｎｔ２３８０～２３８５）：遺伝子改変された突然変異、ｎｔ－２３８１／２３８２ ＴＧからＣＣ（Ｅ－４８２ ＶａｌからＡｌａへの変化をもたらした）
Ｄ２ ＰＤＫ－５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）：全て太字
ａ． ５’非コード領域（ＮＣＲ）－５７（ｎｔ－５７ ＣからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｂ． ＮＳ１－５３ ＧｌｙからＡｓｐ（ｎｔ－２５７９ ＧからＡ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｃ． ＮＳ２Ａ－１８１ ＬｅｕからＰｈｅ（ｎｔ－４０１８ ＣからＴ）
ｄ． ＮＳ３－２５０ ＧｌｕからＶａｌ（ｎｔ－５２７０ ＡからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｅ． ｎｔ－５５４７（ＮＳ３遺伝子）ＴからＣのサイレント突然変異
ｆ． ＮＳ４Ａ－７５ ＧｌｙからＡｌａ（ｎｔ－６５９９ ＧからＣ）
＊ＰＤＫ－５３のｎｔ－８５７１ ＣからＴのサイレント突然変異は、ワクチンウイルスでは遺伝子改変されていない。
Ｄ１（ｐｒＭ－Ｅ）とＤ２骨格との接合部位：
ａ． ＭｌｕＩ（ｎｔ４５１～４５６）：遺伝子改変されたサイレント突然変異、ｎｔ－４５３ ＡからＧ
ｂ． ＮｇｏＭＩＶ（ｎｔ２３８０～２３８５）：遺伝子改変された突然変異、ｎｔ－２３８１／２３８２ ＴＧからＣＣ（Ｅ－４８２ ＶａｌからＡｌａへの変化をもたらした）
Ｄ２ ＰＤＫ－５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）：全て太字
ａ． ５’非コード領域（ＮＣＲ）－５７（ｎｔ－５７ ＣからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｂ． ＮＳ１－５３ ＧｌｙからＡｓｐ（ｎｔ－２５７９ ＧからＡ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｃ． ＮＳ２Ａ－１８１ ＬｅｕからＰｈｅ（ｎｔ－４０１８ ＣからＴ）
ｄ． ＮＳ３－２５０ ＧｌｕからＶａｌ（ｎｔ－５２７０ ＡからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｅ． ｎｔ－５５４７（ＮＳ３遺伝子）ＴからＣのサイレント突然変異
ｆ． ＮＳ４Ａ－７５ ＧｌｙからＡｌａ（ｎｔ－６５９９ ＧからＣ）
＊ＰＤＫ－５３のｎｔ－８５７１ ＣからＴのサイレント突然変異は、ワクチンウイルスでは遺伝子改変されていない。
【0181】
ＤＥＮ－１ ｐｒＭ－Ｅ（ｗｔＤ１ １６００７からの変化）
ａ． 天然ＸｂａＩ部位を除去するために遺伝子改変されたｎｔ－１５７５ ＴからＣのサイレント突然変異
ワクチンシードに見出された更なる置換（元のクローンと０．０３％ｎｔ異なる）
ＴＤＶ－２マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
ａ． ＮＳ２Ａ－１１６ ＩｌｅからＬｅｕ（ｎｔ－３８２３ ＡからＣ、太字）
ｂ． ＮＳ２Ｂ－９２ ＧｌｕからＡｓｐ（ｎｔ－４４０７ ＡからＴ、太字）
ｃ． ｎｔ－７３１１ ＡからＧのサイレント突然変異（太字）
キメラウイルスゲノムのヌクレオチド配列及び翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列が、本明細書で提供される。例えば、ＴＤＶ－２ポリヌクレオチド配列としては、配列番号９、１１、１３、及び１５により表されるものが挙げられ、ＴＤＶ－２ポリペプチド配列としては、配列番号１０、１２、１４、及び１６により表されるものが挙げられる。遺伝子改変されたウイルスは、Ｄ２ ＰＤＫ－５３ウイルスに基づく。野生型ＤＥＮ－２ １６６８１ウイルス（また、ＰＤＫ－５３の親ウイルス）と異なる全ての遺伝子改変された置換、並びにＭＶＳで検出された追加の突然変異（遺伝子改変されたｃＤＮＡクローンからの変化）には印が付けられている。
ａ． 天然ＸｂａＩ部位を除去するために遺伝子改変されたｎｔ－１５７５ ＴからＣのサイレント突然変異
ワクチンシードに見出された更なる置換（元のクローンと０．０３％ｎｔ異なる）
ＴＤＶ－２マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
ａ． ＮＳ２Ａ－１１６ ＩｌｅからＬｅｕ（ｎｔ－３８２３ ＡからＣ、太字）
ｂ． ＮＳ２Ｂ－９２ ＧｌｕからＡｓｐ（ｎｔ－４４０７ ＡからＴ、太字）
ｃ． ｎｔ－７３１１ ＡからＧのサイレント突然変異（太字）
キメラウイルスゲノムのヌクレオチド配列及び翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列が、本明細書で提供される。例えば、ＴＤＶ－２ポリヌクレオチド配列としては、配列番号９、１１、１３、及び１５により表されるものが挙げられ、ＴＤＶ－２ポリペプチド配列としては、配列番号１０、１２、１４、及び１６により表されるものが挙げられる。遺伝子改変されたウイルスは、Ｄ２ ＰＤＫ－５３ウイルスに基づく。野生型ＤＥＮ－２ １６６８１ウイルス（また、ＰＤＫ－５３の親ウイルス）と異なる全ての遺伝子改変された置換、並びにＭＶＳで検出された追加の突然変異（遺伝子改変されたｃＤＮＡクローンからの変化）には印が付けられている。
【0182】
ゲノム及びタンパク質に含まれていた置換：
Ｄ２ ＰＤＫ－５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）：全て太字
ａ． ５’非コード領域（ＮＣＲ）－５７（ｎｔ－５７ ＣからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｂ． ｐｒＭ－２９ ＡｓｐからＶａｌ（ｎｔ－５２４ ＡからＴ）
ｃ． ｎｔ－２０５５ ＣからＴ（Ｅ遺伝子）サイレント突然変異
ｄ． ＮＳ１－５３ ＧｌｙからＡｓｐ（ｎｔ－２５７９ ＧからＡ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｅ． ＮＳ２Ａ－１８１ ＬｅｕからＰｈｅ（ｎｔ－４０１８ ＣからＴ）
ｆ． ＮＳ３－２５０ ＧｌｕからＶａｌ（ｎｔ－５２７０ ＡからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｇ． ｎｔ－５５４７（ＮＳ３遺伝子）ＴからＣのサイレント突然変異
ｈ． ＮＳ４Ａ－７５ ＧｌｙからＡｌａ（ｎｔ－６５９９ ＧからＣ）
＊ＰＤＫ－５３のｎｔ－８５７１ ＣからＴのサイレント突然変異は、ワクチンウイルスでは遺伝子改変されていない。
Ｄ２ ＰＤＫ－５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）：全て太字
ａ． ５’非コード領域（ＮＣＲ）－５７（ｎｔ－５７ ＣからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｂ． ｐｒＭ－２９ ＡｓｐからＶａｌ（ｎｔ－５２４ ＡからＴ）
ｃ． ｎｔ－２０５５ ＣからＴ（Ｅ遺伝子）サイレント突然変異
ｄ． ＮＳ１－５３ ＧｌｙからＡｓｐ（ｎｔ－２５７９ ＧからＡ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｅ． ＮＳ２Ａ－１８１ ＬｅｕからＰｈｅ（ｎｔ－４０１８ ＣからＴ）
ｆ． ＮＳ３－２５０ ＧｌｕからＶａｌ（ｎｔ－５２７０ ＡからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｇ． ｎｔ－５５４７（ＮＳ３遺伝子）ＴからＣのサイレント突然変異
ｈ． ＮＳ４Ａ－７５ ＧｌｙからＡｌａ（ｎｔ－６５９９ ＧからＣ）
＊ＰＤＫ－５３のｎｔ－８５７１ ＣからＴのサイレント突然変異は、ワクチンウイルスでは遺伝子改変されていない。
【0183】
遺伝子改変されたクローンマーカー（サイレント突然変異）：
ａ． ｎｔ－９００ ＴからＣのサイレント突然変異：感染性クローンマーカー
ワクチンシードに見出された更なる置換（元のクローンと０．０２％ｎｔ異なる）
ａ． ｐｒＭ－５２ ＬｙｓからＧｌｕ（ｎｔ－５９２ ＡからＧ）、太字
ｂ． ＮＳ５－４１２ ＩｌｅからＶａｌ（ｎｔ－８８０３ ＡからＧ）、太字
ＴＤＶ－３マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
キメラウイルスゲノムのヌクレオチド配列及び翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列が、本明細書で提供される。例えば、ＴＤＶ－３ポリヌクレオチド配列としては、配列番号１７、１９、２１、及び２３により表されるものが挙げられ、ＴＤＶ－３ポリペプチド配列としては、配列番号１８、２０、２２、及び２４により表されるものが挙げられる。ｐｒＭ－Ｅ遺伝子のほとんど（ｎｔ－４５７～－２３７３、下線部）は、野生型（ｗｔ）ＤＥＮ－３ １６５６２ウイルス特異的であり、残りのヌクレオチド配列は、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ウイルス特異的である。ＤＥＮ－３ウイルスのＥタンパク質は、ＤＥＮ－２のＥタンパク質よりもアミノ酸が２つ少ない。したがって、ＮｇｏＭＩＶから始まるｎｔ位置は、元のＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ ｎｔ位置よりも６つのｎｔだけ少ない。ｗｔウイルス（ＤＥＮ－３ １６５６２又はＤＥＮ－２ １６６８１）と異なる全ての遺伝子改変された置換、並びに追加の突然変異（遺伝子改変されたｃＤＮＡクローンからの変化）には印が付けられている。
ａ． ｎｔ－９００ ＴからＣのサイレント突然変異：感染性クローンマーカー
ワクチンシードに見出された更なる置換（元のクローンと０．０２％ｎｔ異なる）
ａ． ｐｒＭ－５２ ＬｙｓからＧｌｕ（ｎｔ－５９２ ＡからＧ）、太字
ｂ． ＮＳ５－４１２ ＩｌｅからＶａｌ（ｎｔ－８８０３ ＡからＧ）、太字
ＴＤＶ－３マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
キメラウイルスゲノムのヌクレオチド配列及び翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列が、本明細書で提供される。例えば、ＴＤＶ－３ポリヌクレオチド配列としては、配列番号１７、１９、２１、及び２３により表されるものが挙げられ、ＴＤＶ－３ポリペプチド配列としては、配列番号１８、２０、２２、及び２４により表されるものが挙げられる。ｐｒＭ－Ｅ遺伝子のほとんど（ｎｔ－４５７～－２３７３、下線部）は、野生型（ｗｔ）ＤＥＮ－３ １６５６２ウイルス特異的であり、残りのヌクレオチド配列は、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ウイルス特異的である。ＤＥＮ－３ウイルスのＥタンパク質は、ＤＥＮ－２のＥタンパク質よりもアミノ酸が２つ少ない。したがって、ＮｇｏＭＩＶから始まるｎｔ位置は、元のＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ ｎｔ位置よりも６つのｎｔだけ少ない。ｗｔウイルス（ＤＥＮ－３ １６５６２又はＤＥＮ－２ １６６８１）と異なる全ての遺伝子改変された置換、並びに追加の突然変異（遺伝子改変されたｃＤＮＡクローンからの変化）には印が付けられている。
【0184】
ゲノム及びタンパク質に含まれていた置換：
接合部位：
ａ． ＭｌｕＩ（ｎｔ４５１～４５６）：遺伝子改変されたサイレント突然変異、ｎｔ－４５３ ＡからＧ
ｂ． ＮｇｏＭＩＶ（ｎｔ２３７４～２３７９）：遺伝子改変された突然変異、ｎｔ－２３７５／２３７６ ＴＧからＣＣ（Ｅ－４８０ ＶａｌからＡｌａへの変化をもたらした）
Ｄ２ ＰＤＫ－５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）：太字
ａ． ５’非コード領域（ＮＣＲ）－５７（ｎｔ－５７ ＣからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｂ． ＮＳ１－５３ ＧｌｙからＡｓｐ（ｎｔ－２５７３ ＧからＡ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｃ． ＮＳ２Ａ－１８１ ＬｅｕからＰｈｅ（ｎｔ－４０１２ ＣからＴ）
ｄ． ＮＳ３－２５０ ＧｌｕからＶａｌ（ｎｔ－５２６４ ＡからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｅ． ｎｔ－５５４１（ＮＳ３遺伝子）ＴからＣのサイレント突然変異
ｆ． ＮＳ４Ａ－７５ ＧｌｙからＡｌａ（ｎｔ－６５９３ ＧからＣ）
＊ＰＤＫ－５３のｎｔ－８５６５ ＣからＴのサイレント突然変異は、ワクチンウイルスでは遺伝子改変されていない。
接合部位：
ａ． ＭｌｕＩ（ｎｔ４５１～４５６）：遺伝子改変されたサイレント突然変異、ｎｔ－４５３ ＡからＧ
ｂ． ＮｇｏＭＩＶ（ｎｔ２３７４～２３７９）：遺伝子改変された突然変異、ｎｔ－２３７５／２３７６ ＴＧからＣＣ（Ｅ－４８０ ＶａｌからＡｌａへの変化をもたらした）
Ｄ２ ＰＤＫ－５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）：太字
ａ． ５’非コード領域（ＮＣＲ）－５７（ｎｔ－５７ ＣからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｂ． ＮＳ１－５３ ＧｌｙからＡｓｐ（ｎｔ－２５７３ ＧからＡ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｃ． ＮＳ２Ａ－１８１ ＬｅｕからＰｈｅ（ｎｔ－４０１２ ＣからＴ）
ｄ． ＮＳ３－２５０ ＧｌｕからＶａｌ（ｎｔ－５２６４ ＡからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｅ． ｎｔ－５５４１（ＮＳ３遺伝子）ＴからＣのサイレント突然変異
ｆ． ＮＳ４Ａ－７５ ＧｌｙからＡｌａ（ｎｔ－６５９３ ＧからＣ）
＊ＰＤＫ－５３のｎｔ－８５６５ ＣからＴのサイレント突然変異は、ワクチンウイルスでは遺伝子改変されていない。
【0185】
ＤＥＮ－３ ｐｒＭ－Ｅの遺伝子改変された突然変異（ｗｔＤ３ １６５６２からの変化）
ａ． 遺伝子改変されたｎｔ－５５２ ＣからＴへのサイレント突然変異：クローンマーカー
ｂ． 培養で効率的に複製するための遺伝子改変されたＥ－３４５ ＨｉｓからＬｅｕ（ｎｔ－１９７０ ＡからＴ）
ワクチンシードに見出された更なる置換（元のクローンと０．０２％ｎｔ異なる）
ａ． Ｅ－２２３ ＴｈｒからＳｅｒへの突然変異（ｎｔ－１６０３ ＡからＴ、太字）
ｂ． ｎｔ－７６２０ ＡからＧのサイレント突然変異（太字）
ＴＤＶ－４マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
キメラウイルスゲノムのヌクレオチド配列及び翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列が、本明細書で提供される。例えば、ＴＤＶ－４ポリヌクレオチド配列としては、配列番号２５、２７、２９、及び３１により表されるものが挙げられ、ＴＤＶ－４ポリペプチド配列としては、配列番号２６、２８、３０、及び３２により表されるものが挙げられる。ｐｒＭ－Ｅ遺伝子のほとんど（ｎｔ－４５７～－２３７９、下線部）は、野生型（ｗｔ）ＤＥＮ－４ １０３６ウイルス特異的であり、残りのヌクレオチド配列は、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ウイルス特異的である。ｗｔウイルス（ＤＥＮ－３ １６５６２又はＤＥＮ－２ １６６８１）と異なる全ての遺伝子改変された置換、並びに追加の突然変異（遺伝子改変されたｃＤＮＡクローンからの変化）には印が付けられている。
ａ． 遺伝子改変されたｎｔ－５５２ ＣからＴへのサイレント突然変異：クローンマーカー
ｂ． 培養で効率的に複製するための遺伝子改変されたＥ－３４５ ＨｉｓからＬｅｕ（ｎｔ－１９７０ ＡからＴ）
ワクチンシードに見出された更なる置換（元のクローンと０．０２％ｎｔ異なる）
ａ． Ｅ－２２３ ＴｈｒからＳｅｒへの突然変異（ｎｔ－１６０３ ＡからＴ、太字）
ｂ． ｎｔ－７６２０ ＡからＧのサイレント突然変異（太字）
ＴＤＶ－４マスターウイルスシード（ＭＶＳ）
キメラウイルスゲノムのヌクレオチド配列及び翻訳されたタンパク質の推定アミノ酸配列が、本明細書で提供される。例えば、ＴＤＶ－４ポリヌクレオチド配列としては、配列番号２５、２７、２９、及び３１により表されるものが挙げられ、ＴＤＶ－４ポリペプチド配列としては、配列番号２６、２８、３０、及び３２により表されるものが挙げられる。ｐｒＭ－Ｅ遺伝子のほとんど（ｎｔ－４５７～－２３７９、下線部）は、野生型（ｗｔ）ＤＥＮ－４ １０３６ウイルス特異的であり、残りのヌクレオチド配列は、ＤＥＮ－２ ＰＤＫ－５３ウイルス特異的である。ｗｔウイルス（ＤＥＮ－３ １６５６２又はＤＥＮ－２ １６６８１）と異なる全ての遺伝子改変された置換、並びに追加の突然変異（遺伝子改変されたｃＤＮＡクローンからの変化）には印が付けられている。
【0186】
ゲノム及びタンパク質に含まれていた置換：
接合部位：
ａ． ＭｌｕＩ（ｎｔ４５１～４５６）：遺伝子改変されたサイレント突然変異、ｎｔ－４５３ ＡからＧ
ｂ． ＮｇｏＭＩＶ（ｎｔ２３８０～２３８５）：遺伝子改変された突然変異、ｎｔ－２３８１／２３８２ ＴＧからＣＣ（Ｅ－４８０ ＶａｌからＡｌａへの変化をもたらした）
Ｄ２ ＰＤＫ－５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）
ａ． ５’非コード領域（ＮＣＲ）－５７（ｎｔ－５７ ＣからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｂ． ＮＳ１－５３ ＧｌｙからＡｓｐ（ｎｔ－２５７９ ＧからＡ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｃ． ＮＳ２Ａ－１８１ ＬｅｕからＰｈｅ（ｎｔ－４０１８ ＣからＴ、太字）
ｄ． ＮＳ３－２５０ ＧｌｕからＶａｌ（ｎｔ－５２７０ ＡからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｅ． ｎｔ－５５４７（ＮＳ３遺伝子）ＴからＣのサイレント突然変異（太字）
ｆ． ＮＳ４Ａ－７５ ＧｌｙからＡｌａ（ｎｔ－６５９９ ＧからＣ、太字）
＊ＰＤＫ－５３のｎｔ－８５７１ ＣからＴのサイレント突然変異は、ワクチンウイルスでは遺伝子改変されていない。
接合部位：
ａ． ＭｌｕＩ（ｎｔ４５１～４５６）：遺伝子改変されたサイレント突然変異、ｎｔ－４５３ ＡからＧ
ｂ． ＮｇｏＭＩＶ（ｎｔ２３８０～２３８５）：遺伝子改変された突然変異、ｎｔ－２３８１／２３８２ ＴＧからＣＣ（Ｅ－４８０ ＶａｌからＡｌａへの変化をもたらした）
Ｄ２ ＰＤＫ－５３ウイルス骨格（ｗｔＤ２ １６６８１からの変化）
ａ． ５’非コード領域（ＮＣＲ）－５７（ｎｔ－５７ ＣからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｂ． ＮＳ１－５３ ＧｌｙからＡｓｐ（ｎｔ－２５７９ ＧからＡ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｃ． ＮＳ２Ａ－１８１ ＬｅｕからＰｈｅ（ｎｔ－４０１８ ＣからＴ、太字）
ｄ． ＮＳ３－２５０ ＧｌｕからＶａｌ（ｎｔ－５２７０ ＡからＴ）：主要弱毒化遺伝子座（赤色）
ｅ． ｎｔ－５５４７（ＮＳ３遺伝子）ＴからＣのサイレント突然変異（太字）
ｆ． ＮＳ４Ａ－７５ ＧｌｙからＡｌａ（ｎｔ－６５９９ ＧからＣ、太字）
＊ＰＤＫ－５３のｎｔ－８５７１ ＣからＴのサイレント突然変異は、ワクチンウイルスでは遺伝子改変されていない。
【0187】
ｃＤＮＡクローンの遺伝子改変された置換
ａ． 遺伝子改変されたＣ－１００ ＡｒｇからＳｅｒ（ｎｔ－３９６ ＡからＣ）：培養でのウイルス複製を向上させることができる
ｂ． 遺伝子改変されたｎｔ－１４０１ ＡからＧのサイレント突然変異
ｃ． 遺伝子改変されたＥ－３６４ ＡｌａからＶａｌ（ｎｔ－２０２７ ＣからＴ）：培養でのウイルス複製を向上させることができる
ｄ． 遺伝子改変されたＥ－４４７ ＭｅｔからＬｅｕ（ｎｔ－２２７５ ＡからＣ）：培養でのウイルス複製を向上させることができる
ワクチンシードに見出された更なる置換（元のクローンとは０．０６％ｎｔ異なる）
ａ． ｎｔ－２２５（Ｃ遺伝子）ＡからＧのサイレント突然変異（太字）
ｂ． ＮＳ２Ａ－６６ ＡｓｐからＧｌｙ（ｎｔ－３６７４ ＡからＧ）突然変異（太字）
ｃ． ＮＳ２Ａ－９９ ＬｙｓからＬｙｓ／Ａｒｇミックス（ｎｔ－３７７３ ＡからＡ／Ｇミックス、太字）
ｄ． ｎｔ－５５９１ ＣからＴ（ＮＳ３遺伝子）サイレント突然変異（太字）
ｅ． ＮＳ４Ａ－２１ ＡｌａからＶａｌ（ｎｔ－６４３７ ＣからＴ、太字）
ｆ． ｎｔ－７０２６ ＴからＣ／Ｔミックスのサイレント突然変異（太字）
ｇ． ｎｔ－９７５０ ＡからＣのサイレント突然変異（太字）
本明細書で開示及び特許請求された組成物及び方法は全て、本開示に照らして、過度の実験作業を行わずに製作及び実施することができる。組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点で記載されているが、当業者であれば、本明細書に記載の組成物及び方法に、並びに方法のステップ又はステップの順番に、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱せずに変異を適用することができることを理解するであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある作用剤を、本明細書に記載の作用剤の代わりに用いることができ、その場合でも同じ又は同様の結果が達成され得ることが理解されるであろう。当業者に明白なそのような類似の代用物及び改変は全て、添付の特許請求の範囲により規定されている本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあるとみなされる。
ａ． 遺伝子改変されたＣ－１００ ＡｒｇからＳｅｒ（ｎｔ－３９６ ＡからＣ）：培養でのウイルス複製を向上させることができる
ｂ． 遺伝子改変されたｎｔ－１４０１ ＡからＧのサイレント突然変異
ｃ． 遺伝子改変されたＥ－３６４ ＡｌａからＶａｌ（ｎｔ－２０２７ ＣからＴ）：培養でのウイルス複製を向上させることができる
ｄ． 遺伝子改変されたＥ－４４７ ＭｅｔからＬｅｕ（ｎｔ－２２７５ ＡからＣ）：培養でのウイルス複製を向上させることができる
ワクチンシードに見出された更なる置換（元のクローンとは０．０６％ｎｔ異なる）
ａ． ｎｔ－２２５（Ｃ遺伝子）ＡからＧのサイレント突然変異（太字）
ｂ． ＮＳ２Ａ－６６ ＡｓｐからＧｌｙ（ｎｔ－３６７４ ＡからＧ）突然変異（太字）
ｃ． ＮＳ２Ａ－９９ ＬｙｓからＬｙｓ／Ａｒｇミックス（ｎｔ－３７７３ ＡからＡ／Ｇミックス、太字）
ｄ． ｎｔ－５５９１ ＣからＴ（ＮＳ３遺伝子）サイレント突然変異（太字）
ｅ． ＮＳ４Ａ－２１ ＡｌａからＶａｌ（ｎｔ－６４３７ ＣからＴ、太字）
ｆ． ｎｔ－７０２６ ＴからＣ／Ｔミックスのサイレント突然変異（太字）
ｇ． ｎｔ－９７５０ ＡからＣのサイレント突然変異（太字）
本明細書で開示及び特許請求された組成物及び方法は全て、本開示に照らして、過度の実験作業を行わずに製作及び実施することができる。組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点で記載されているが、当業者であれば、本明細書に記載の組成物及び方法に、並びに方法のステップ又はステップの順番に、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱せずに変異を適用することができることを理解するであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある作用剤を、本明細書に記載の作用剤の代わりに用いることができ、その場合でも同じ又は同様の結果が達成され得ることが理解されるであろう。当業者に明白なそのような類似の代用物及び改変は全て、添付の特許請求の範囲により規定されている本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあるとみなされる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】