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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022091063
(43)【公開日】2022-06-20
(54)【発明の名称】酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20220613BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220613BHJP
C12Q 1/6841 20180101ALI20220613BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20220613BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220613BHJP
A61K 8/24 20060101ALI20220613BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20220613BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220613BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20220613BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6841 Z
C12Q1/6813 Z
C12Q1/02
A61K8/24
A61Q19/08
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
G01N33/50 P
G01N33/50 Q
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020203774
(22)【出願日】2020-12-08
【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り
(71)【出願人】
【識別番号】397030400
【氏名又は名称】株式会社アンズコーポレーション
(72)【発明者】
【氏名】笹井 晋作
(72)【発明者】
【氏名】清水 暁
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C083
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045CB09
2G045DA14
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA18
4B063QA20
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ53
4B063QQ79
4B063QR06
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR56
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS25
4B063QS33
4B063QS34
4B063QX02
4C083AA122
4C083AB032
4C083AB232
4C083AB242
4C083AB291
4C083AB292
4C083AB432
4C083AC022
4C083AC072
4C083AC102
4C083AC122
4C083AC182
4C083AC242
4C083AC302
4C083AC422
4C083AC432
4C083AD022
4C083AD092
4C083AD512
4C083CC04
4C083CC05
4C083CC12
4C083DD23
4C083DD27
4C083DD31
4C083EE12
(57)【要約】 （修正有）
【課題】酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】酸化ストレスに対して即時的に発現する遺伝子、例えばＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２のうち少なくともいずれかの発現量が低減されることを指標とした、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法である。
【選択図】図７
【解決手段】酸化ストレスに対して即時的に発現する遺伝子、例えばＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２のうち少なくともいずれかの発現量が低減されることを指標とした、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法である。
【選択図】図７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する遺伝子の発現量が低減されることを指標とした、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法。
【請求項2】
酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する前記遺伝子が、ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２のうち少なくともいずれかである、請求項１に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法
【請求項3】
前記酸化ストレスがＲＯＳによるものである、請求項１又は２に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法。
【請求項4】
酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する前記遺伝子の発現において、
酸化ストレス低減物質の候補物質を塗布した培養表皮モデルにおける前記遺伝子の発現量が、
前記候補物質を塗布しなかった培養表皮モデルにおける前記遺伝子の発現量と比較して低減される場合に、
前記候補物質は酸化ストレス低減作用を有すると判定する、
請求項１～３のいずれか１項に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法。
酸化ストレス低減物質の候補物質を塗布した培養表皮モデルにおける前記遺伝子の発現量が、
前記候補物質を塗布しなかった培養表皮モデルにおける前記遺伝子の発現量と比較して低減される場合に、
前記候補物質は酸化ストレス低減作用を有すると判定する、
請求項１～３のいずれか１項に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法により選別された酸化ストレス低減物質を配合する、皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
生体には、エネルギー産生のために必要な酸化システムと、その酸化システムによる過剰酸化に伴う悪影響を防ぐための抗酸化システムとが備わっており、その恒常性によって生体の健康が維持されている。酸化と抗酸化のバランスが崩れて、酸化が過剰になった状態を酸化ストレスという。
【0003】
皮膚は、最外部に位置する臓器であり、紫外線や大気汚染物質などの様々な刺激に常に曝されている。その刺激の一つである紫外線暴露は皮膚の形態的変化を引き起こすことが知られており、形態的変化は酸化ストレスが重要な役割を果たしていることが明らかにされている。そして、酸化ストレスは活性酸素種（ＲＯＳ）によって惹起されることが知られており、ＲＯＳは、細胞に対してＤＮＡ損傷や細胞死を引き起こすと共に、メラニン生成の亢進や真皮マトリックスの変性を誘導し、皮膚老化を促進することが報告されている（非特許文献１）。
【0004】
皮膚保護及び老化抑制を目的とする皮膚外用剤の開発を行うにあたり、角層表面で生じた刺激がシグナルとして表皮生細胞に伝わった結果、表皮生細胞内で生じる変化については重要な事柄であるが、知見は少なく、明らかになっていない部分が多い。そこで、本発明者らは、表皮生細胞内で生じる変化について明らかにすべく、皮脂の構成成分の一つであるスクアレンに着目した。
【0005】
スクアレンは、ラジカルスカベンジャーとして機能し、酸化ストレスから皮膚を保護する働きをすると考えられている物質である（非特許文献２）。一方で、スクアレンは、紫外線の暴露等により容易に酸化され、過酸化物であるスクアレンペルオキシドを生成することが知られている。スクアレンペルオキシドは、細胞膜にラジカル連鎖反応を引き起こして、結果的にシミやシワの形成を引き起こす原因となることが示唆されている（非特許文献３～５）。しかしながら、スクアレンペルオキシドが角層に接触し、シグナルが表皮生細胞内に伝わった結果、表皮生細胞内で生じる変化については明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｊ．Ｋｒｕｋ， Ｅ．Ｄｕｃｈｎｉｋ， Ａｓｉａｎ Ｐａｃ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．， １５， ５６１－５６８（２０１４）
【非特許文献2】Ｇ．Ｋｅｌｌｙ， Ａｌｔｅｒｎ． Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．４，１，２９－３６（１９９９）
【非特許文献3】Ｔ．Ｕｃｈｉｎｏ， Ｈ．Ｔｏｋｕｎａｇａ， Ｈ．Ｏｎｏｄｅｒａ， Ｍ．Ａｎｄｏ， Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．， ２５，６０５－６１０（２００２）
【非特許文献4】Ｋ．Ｃｈｉｂａ， Ｋ．Ｋａｗａｋａｍｉ， Ｔ．Ｓｏｎｅ， Ｍ．Ｏｎｏｕｅ， Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｓｋｉｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６．２４２－２５１（２００３）
【非特許文献5】Ａ．Ｒｙｕ， Ｋ．Ａｒａｋａｎｅ， Ｃ．Ｋｏｉｄｅ， Ｈ．Ａｒａｉ， Ｔ．Ｎａｇａｎｏ， Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３２，１５０４－１５０９（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
以上のような状況に鑑み、本発明者らは鋭意研究を行い、スクアレンペルオキシドを角層に塗布した結果、表皮生細胞内において、特定遺伝子の発現量が即時的に増加していることを明らかにした。このことは、スクアレンペルオキシドによって引き起こされた酸化ストレスが、特定の遺伝子発現を即時的に増加させることを示している。
【0008】
具体的には、スクアレンに紫外線を照射しスクアレンペルオキシドを発生させることで作製した試料を、３次元培養表皮モデル（以下、ＲＨＥ）の角層側に塗布したとき、特定遺伝子の発現量が表皮生細胞内で即時的に増加していることを明らかにした。本発明者らは、この知見に基づき、当該特定の遺伝子発現の変動を指標にすることで、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法を発明するに至った。
【0009】
本発明は、上記表皮生細胞内で生じる変化について明らかにする過程で見出した、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）
酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する遺伝子の発現量が低減されることを指標とした、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法。
（２）
酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する前記遺伝子が、ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２のうち少なくともいずれかである、（１）に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法
（３）
前記酸化ストレスがＲＯＳによるものである、（１）又は（２）に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法。
（４）
酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する前記遺伝子の発現において、
候補物質を塗布した培養表皮モデルにおける前記遺伝子の発現量が、
前記候補物質を塗布しなかった培養表皮モデルにおける前記遺伝子の発現量と比較して低減されている場合に、
前記候補物質は酸化ストレス低減作用を有すると判定する、
（１）～（３）のいずれか１項に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法。
（５）
（１）～（４）のいずれか１項に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法により選別された酸化ストレス低減物質を配合する、皮膚外用剤。
（１）
酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する遺伝子の発現量が低減されることを指標とした、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法。
（２）
酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する前記遺伝子が、ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２のうち少なくともいずれかである、（１）に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法
（３）
前記酸化ストレスがＲＯＳによるものである、（１）又は（２）に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法。
（４）
酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する前記遺伝子の発現において、
候補物質を塗布した培養表皮モデルにおける前記遺伝子の発現量が、
前記候補物質を塗布しなかった培養表皮モデルにおける前記遺伝子の発現量と比較して低減されている場合に、
前記候補物質は酸化ストレス低減作用を有すると判定する、
（１）～（３）のいずれか１項に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法。
（５）
（１）～（４）のいずれか１項に記載の酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法により選別された酸化ストレス低減物質を配合する、皮膚外用剤。
【発明の効果】
【0011】
本発明により、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】スクアレン及びＵＶ照射スクアレン（１ｈ、３ｈ、６ｈ）のＰＯＶ（ｍｅｑ／ｋｇ）測定結果を示す図である。Ｓｑ：スクアレン、ＵＶ－Ｓｑ（１ｈ、３ｈ、６ｈ）：所定時間（１時間、３時間、６時間）ＵＶを照射したスクアレン。
【図2】スクアレン及びＵＶ照射スクアレン（１ｈ，３ｈ，６ｈ）をＲＨＥに塗布して４時間経過後の表皮生細胞における各ｍＲＮＡの発現量を測定した図である。
【図3】スクアレン及びＵＶ照射スクアレン（１ｈ，３ｈ，６ｈ）をＲＨＥに塗布して４時間経過後の表皮生細胞の生存率を測定した図である。
【図4】ＵＶ照射スクアレン（３ｈ）をＲＨＥに塗布した後における、酸化ストレス及び炎症に関する各ｍＲＮＡの発現量の経時変化を測定した図である。
【図5】ＵＶ照射スクアレン（３ｈ）をＲＨＥに塗布した後における、角化に関する各ｍＲＮＡの発現量の経時変化を測定した図である。
【図6】スクアレン及びＵＶ照射スクアレン（３ｈ）に、ヒドロキシアパタイトを混合した後のＰＯＶ（ｍｅｑ／ｋｇ）測定結果を示す図である。Ｓｑ＋（１％、５％）ＨＡＰ：スクアレンに、所定濃度（１％、５％）のヒドロキシアパタイトを処理した試料。ＵＶ－Ｓｑ（３ｈ）＋（１％、５％）ＨＡＰ：３時間ＵＶを照射したスクアレンに、所定濃度（１％、５％）のヒドロキシアパタイトを処理した試料。
【図7】スクアレン及びＵＶ照射スクアレン（３ｈ）に、ヒドロキシアパタイトを混合した後の上清（反応物）をＲＨＥに塗布して４時間経過後の表皮生細胞における各ｍＲＮＡの発現量を測定した図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下に本発明の実施の形態を説明する。
【0014】
「酸化ストレスに対し即時的に応答する遺伝子の解明」
【0015】
本発明における酸化ストレスとは、酸化と抗酸化のバランスが崩れて酸化が過剰になった状態（以下、酸化過剰状態）のことをいう。酸化過剰状態は、細胞内の活性酸素種（以下、ＲＯＳ）量の増加により引き起こされ、ＲＯＳ量が増加すると、酸化と抗酸化のバランスが崩れ、酸化が過剰になり、例えば、膜脂質の酸化等の細胞損傷が生じる。ここでＲＯＳとしては、例えば、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカル、過酸化物が挙げられる。
【0016】
ＲＯＳ等により酸化過剰状態となった細胞は、ラジカル連鎖反応を引き起こして、例えば、ＤＮＡ損傷、酵素の不活性化、及び膜脂質の酸化等の細胞損傷を生じる。細胞損傷が生じると、細胞内では、損傷を受けたたんぱく質を修復したり、炎症を促進したりするために、様々なたんぱく質が産生される。
【0017】
これまでの報告で、スクアレンの過酸化物であるスクアレンペルオキシドは、膜脂質の酸化を起こし、シミやシワの形成の原因となることが示唆されている。しかしながら、スクアレンペルオキシドが皮膚に接触することで、どの遺伝子が発現されるかは解明されていなかった。
【0018】
そこで本発明者らは、スクアレンペルオキシドをＲＨＥに塗布し、酸化ストレスを発生させ、表皮生細胞内で発現している遺伝子発現量を測定した結果、ヒートショックプロテイン７０、インターロイキン８、シクロオキシゲナーゼ－２、ヘムオキシゲナーゼ１、及びγ-グルタミルシステイン合成酵素をコードするそれぞれの遺伝子の発現量が即時的に増加することを明らかにした。
【0019】
ヒートショックプロテイン７０は、分子シャペロンとして他のたんぱく質を正しく折りたたむことで機能を獲得させる働きをし、損傷を受けた細胞の修復に関与するたんぱく質である。ヒートショックプロテイン７０をコードする遺伝子名はｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ Ａ （Ｈｓｐ７０） ｍｅｍｂｅｒ １Ａであり、遺伝子シンボルはＨＳＰＡ１Ａである。ここで「ヒートショックプロテイン７０をコードする遺伝子の発現量が即時的に増加する」とは、ヒートショックプロテイン７０をコードするＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が、スクアレンペルオキシド非存在下における存在量と比較して、即時的に有意に増加することを意味する。
【0020】
インターロイキン８は、炎症を引き起こすシグナルを伝達する低分子のたんぱく質である。インターロイキン８の分泌は、酸化ストレスによって増加することが知られており、炎症細胞の動員とさらなる炎症の促進を引き起こす働きをする。インターロイキン８をコードする遺伝子名はｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ８であり、遺伝子シンボルはＩＬ－８である。ここで「インターロイキン８をコードする遺伝子の発現量が即時的に増加する」とは、インターロイキン８をコードするＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が、スクアレンペルオキシド非存在下における存在量と比較して、即時的に有意に増加することを意味する。
【0021】
シクロオキシゲナーゼ－２は、アラキドン酸を、プロスタノイドと呼ばれる生理活性物質の一群に代謝する過程に関与する酵素である。シクロオキシゲナーゼ－２は炎症時に発現が誘導され、シクロオキシゲナーゼ－２を介してＰＧＥ２やＰＧＩ２の産生が亢進する。ＰＧＥ２は血管透過性の亢進、血管拡張及び発痛に関与し、ＰＧＩ２は血管拡張及び発痛に関与し、炎症反応をそれぞれ進行させる。シクロオキシゲナーゼ－２をコードする遺伝子名はｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ‐ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２であり、遺伝子シンボルはＰＴＧＳ２である。ここで「シクロオキシゲナーゼ－２をコードする遺伝子の発現量が即時的に増加する」とは、シクロオキシゲナーゼ－２をコードするＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が、スクアレンペルオキシド非存在下における存在量と比較して、即時的に有意に増加することを意味する。
【0022】
ヘムオキシゲナーゼ１は、ヘムを、ビルベルジンと一酸化炭素と遊離鉄に分解する酵素である。ビルベルジンは更にビリルビンに分解される。ヘム分解により産生されるビルベルジンとビリルビンには強力な抗酸化作用があり、酸化ストレスなどによる細胞障害を抑制する。また、一酸化炭素は、抹消循環の還流圧を調節する。ヘムオキシゲナーゼ１をコードする遺伝子名はｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ １であり、遺伝子シンボルはＨＭＯＸ１である。ここで「ヘムオキシゲナーゼ１をコードする遺伝子の発現量が即時的に増加する」とは、ヘムオキシゲナーゼ１をコードするＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が、スクアレンペルオキシド非存在下における存在量と比較して、即時的に有意に増加することを意味する。
【0023】
γ-グルタミルシステイン合成酵素は、グルタチオン合成の律速反応を触媒する酵素である。グルタチオンは、細胞内に高濃度に存在する抗酸化物質で、活性酸素やフリーラジカルから細胞を守る役割を担う。γ-グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子名はｇｌｕｔａｍａｔｅ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｉｇａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔであり、遺伝子シンボルはＧＣＬＣである。ここで「γ-グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子の発現量が即時的に増加する」とは、γ-グルタミルシステイン合成酵素をコードするＤＮＡから転写されるｍＲＮＡの細胞中での存在量が、スクアレンペルオキシド非存在下における存在量と比較して、即時的に有意に増加することを意味する。
【0024】
「酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法」
上述したように、本発明者らによって、酸化ストレスにより即時的に発現する遺伝子が明らかにされた。本発明は、当該明らかにされた事実を応用したものであり、酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する遺伝子の発現量が低減されることを指標として、酸化ストレス低減物質を選別するためのスクリーニング方法である。
上述したように、本発明者らによって、酸化ストレスにより即時的に発現する遺伝子が明らかにされた。本発明は、当該明らかにされた事実を応用したものであり、酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する遺伝子の発現量が低減されることを指標として、酸化ストレス低減物質を選別するためのスクリーニング方法である。
【0025】
具体的には、酸化ストレスに対して即時的に発現量が増加する遺伝子の発現において、酸化ストレス低減物質の候補物質を塗布した培養表皮モデルにおける遺伝子の発現量が、候補物質を塗布しなかった培養表皮モデルにおける遺伝子の発現量と比較して低減される場合に、候補物質は酸化ストレス低減作用を有すると判定する、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法である。
【0026】
より具体的には、酸化ストレス低減物質の候補物質をＲＯＳと共に培養表皮モデルに塗布したとき即時的に発現する遺伝子（ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１及びＧＣＬＣのうち少なくともいずれかの遺伝子）の発現量が、ＲＯＳを培養表皮モデルに塗布したとき即時的に発現する遺伝子（ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１及びＧＣＬＣのうち少なくともいずれかの遺伝子）の発現量と比較して、低減されていることを指標として、候補物質は酸化ストレス低減作用を有すると判定する、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法である。
【0027】
本発明において、表皮生細胞に酸化ストレスを引き起こすものであれば特に限定されず、そのようなものとして、例えば、ＲＯＳを用いることができ、好ましくは過酸化物であり、より好ましくは過酸化脂質であり、更に好ましくはスクアレンの過酸化物であるスクアレンペルオキシドである。
【0028】
本発明のスクリーニング方法に用いる培養表皮モデルとしては、同様の効果を奏するものであれば特に限定されない。そのようなものとして、例えば、ヒト正常表皮細胞を重層培養したＲＨＥを用いればよく、ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ（ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング）、ＥＰＩ－２００（クラボウ）、ＥＰＩＳＫＩＮ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ）等を使用することができる。細胞培養等の条件に関しても、通常の培養条件のほか、本発明のスクリーニング方法の実行を妨げない培養条件であれば、特段の限定なく適用することができる。
【0029】
本発明における遺伝子の発現量の評価方法としては、遺伝子の発現量が変動していることを判定できれば特に限定されず、例えば、ｍＲＮＡの発現量を測定する方法だけでなく、遺伝子発現産物であるたんぱく質量を指標として評価することとしてもよい。
【0030】
培養表皮モデルから遺伝子やたんぱく質を抽出する方法は、公知の方法を用いればよい。例えば、遺伝子の抽出であればＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）などが使用でき、抽出された全ＲＮＡは必要に応じて更にｍＲＮＡのみに精製しても良い。
【0031】
本発明における遺伝子発現量の確認方法は、公知の方法を用いればよい。例えば、遺伝子の発現量を転写産物としてのｍＲＮＡの量として測定する場合には、公知の遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い、当該分野で特定遺伝子の発現を検知測定するために知られた手法、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ等、当該分野で知られた任意の解析方法を用いることができる。
【0032】
また、遺伝子の発現変動を判定するための別の方法として、遺伝子の発現産物であるたんぱく質量を定量する場合には、公知の遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い、当該分野で特定のたんぱく質量を検知するために知られた手法、例えばウェスタンブロッティング、各種の免疫組織学的方法等、当該技術分野で知られた任意の解析方法を用いることができる。
【0033】
ここで、「酸化ストレス低減物質の候補物質をＲＯＳと共に培養表皮モデルに塗布」とは、「当該候補物質とＲＯＳとを共に培養表皮モデルに塗布」することだけを意図しておらず、「当該候補物質とＲＯＳとを混合したものを培養表皮モデルに塗布」するものを含み、「当該候補物質とＲＯＳとの反応物を培養表皮モデルに塗布」するものを含み、「当該候補物質を培養表皮モデルに塗布した後にＲＯＳを更に塗布する」ものを含み、「ＲＯＳを培養表皮モデルに塗布した後に当該候補物質を更に塗布する」ものを含む。また、これらの方法に限定されず、酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法として適用できる方法であれば、任意の方法を用いることができる。
【0034】
ここで、「即時的」とは、過酸化物への接触後６時間以内に起こることを意味する。「即時的に発現する遺伝子」とは、ＲＯＳが培養表皮モデルに塗布された後６時間以内に発現する遺伝子を意味する。「即時的に発現する遺伝子」は、即時的に発現する遺伝子であれば、特に限定するものではないが、ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１及びＧＣＬＣのうち少なくともいずれかの遺伝子であることが好ましく、更に好ましくはＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２のうち少なくともいずれかの遺伝子であることが好ましい。本発明におけるスクリーニング方法は、即時的に発現する遺伝子を対象としているため、試験開始から判定終了までを迅速に行うことができ、候補物質の選定にかかる時間を短くすることができるという有利な効果を奏する。
【0035】
更に、「遺伝子の発現量が低減される」とは、当該候補物質をＲＯＳと共に培養表皮モデルに塗布したときと、ＲＯＳを培養表皮モデルに塗布したときと、を比較した際にその遺伝子発現量が低減されていればよい。低減の程度は求める効果の度合いによって適宜設定することができる。また、「遺伝子の発現量が低減される」とは、測定値として低減されていれば特に限定するものではないが、試験の一般的なバラツキを考慮して統計的に有意に低減されていることが好ましい。「たんぱく質の発現量」を測定する場合も、同様に考えることができる。
【0036】
本発明において、「指標とする」とは、即時的に発現する遺伝子の変化量を指標とするという趣旨であり、「変化量」における「変化」とは、発現量の増加、減少、変動しない場合も含む趣旨である。その他に、「たんぱく質の発現量」を指標にする場合も、同様に考えることができる。
【0037】
「酸化ストレス低減物質」
本発明における「酸化ストレス低減物質」とは、酸化過剰状態となることを防止し、又は酸化過剰状態を低減若しくは減少させる物質のことをいう。「酸化ストレス低減物質の候補物質」とは、酸化ストレス低減効果を奏すると考えられる、酸化ストレス低減物質の候補となる物質のことをいう。酸化ストレス低減物質及び酸化ストレス低減物質の候補物質としては、特に制限はなく、動植物由来エキス、菌類の培養物又はこれらの酵素処理物、化合物、又はその誘導体等であっても候補物質として用いることができ、液状のほか、粉末状、ジェル状等であっても差し支えない。また、そのままでは培地に溶解しない場合は、界面活性剤等の可溶化剤を適宜使用することにより溶解させることで候補物質として用いることができる。更に、抽出の方法も特に限定されない。添加濃度については、エキス等候補物質を添加してから２４時間後に明らかに細胞が死滅していなければどの濃度でも問題ない。また、候補物質と培養表皮モデルとを共存させる方法としては、候補物質を培養表皮モデルの培地側に添加する方法、角層側に添加する方法等が挙げられる。
本発明における「酸化ストレス低減物質」とは、酸化過剰状態となることを防止し、又は酸化過剰状態を低減若しくは減少させる物質のことをいう。「酸化ストレス低減物質の候補物質」とは、酸化ストレス低減効果を奏すると考えられる、酸化ストレス低減物質の候補となる物質のことをいう。酸化ストレス低減物質及び酸化ストレス低減物質の候補物質としては、特に制限はなく、動植物由来エキス、菌類の培養物又はこれらの酵素処理物、化合物、又はその誘導体等であっても候補物質として用いることができ、液状のほか、粉末状、ジェル状等であっても差し支えない。また、そのままでは培地に溶解しない場合は、界面活性剤等の可溶化剤を適宜使用することにより溶解させることで候補物質として用いることができる。更に、抽出の方法も特に限定されない。添加濃度については、エキス等候補物質を添加してから２４時間後に明らかに細胞が死滅していなければどの濃度でも問題ない。また、候補物質と培養表皮モデルとを共存させる方法としては、候補物質を培養表皮モデルの培地側に添加する方法、角層側に添加する方法等が挙げられる。
【0038】
本発明におけるスクリーニング方法により選別された酸化ストレス低減物質は、酸化過剰状態となることを防止し、又は酸化過剰状態を低減する効果を奏する。より具体的には、ＤＮＡ損傷、酵素の不活性化及び膜脂質の酸化等の細胞損傷を防止し、低減し、又は減少する効果を奏する。細胞損傷の防止等ができると、損傷を受けたたんぱく質を修復したり、炎症を促進したりする様々なたんぱく質の発現量を抑制するという効果を奏する。更には、ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１及びＧＣＬＣのうち少なくともいずれかの遺伝子発現量を抑制するこという効果を奏する。
【0039】
要するに、本発明における酸化ストレス低減物質を肌に塗布することで、被投与部位において、酸化過剰状態を防止し、低減し、又は減少させることができ、それに伴う細胞損傷を防止等することができ、ひいては、たんぱく質の修復及び炎症促進等を行うたんぱく質の発現量を抑制することができ、更にはＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１及びＧＣＬＣのうち少なくともいずれかの遺伝子発現量を抑制することができる。
【0040】
また、本発明における酸化ストレス低減物質は、酸化過剰状態を改善して通常の状態に戻す効果のみならず、通常の状態から更に優れた状態にする効果をも有する。またさらに、本発明に係る酸化ストレス低減物質は、酸化過剰状態を予防する効果も奏するため、酸化過剰状態とはなっていないものの、酸化過剰状態となる可能性がある場合にあらかじめ塗布しておくことで酸化過剰状態となることを防ぐことができる。
【0041】
また、本発明における酸化ストレス低減物質は、本発明の効果を損なわない範囲で皮膚に適用できるように製剤化したものでもよい。
【0042】
「皮膚外用剤」
本発明における皮膚外用剤とは、医薬品類、医薬部外品類、化粧品類等に、酸化ストレス低減物質を配合し、製剤化したもののことをいう。
本発明における皮膚外用剤とは、医薬品類、医薬部外品類、化粧品類等に、酸化ストレス低減物質を配合し、製剤化したもののことをいう。
【0043】
皮膚外用剤の剤形としては、酸化ストレス低減物質の効果を損なわない範囲内であれば特に限定されず、任意の剤形とすることができる。剤形の種類としては、特に限定されないが、例えば、軟膏剤、ジェル剤、ゲル剤、クリーム、パック剤、シップ剤、乳液、ローション剤、化粧水、パウダーなどの半固形物や液体あるいは固形物等があげられる。
【0044】
本発明の皮膚外用剤には、酸化ストレス低減物質の効果を損なわない範囲であれば特に限定されず、医薬品類、医薬部外品類、化粧品類等の分野において通常用いられる添加成分を適宜配合することができる。添加成分としては特に限定されず、例えば、精製水、油性成分、界面活性剤、乳化剤、低級アルコール、高級アルコール、多価アルコール、水溶性高分子、粘度調整剤、ゲル化剤、保湿剤、殺菌剤、抗炎症剤、鎮痛剤、抗真菌剤、角質軟化剥離剤、皮膚着色剤、ホルモン剤、紫外線吸収剤、汗防臭剤、ビタミン剤、血流促進剤（血管拡張剤、血行促進剤）、生薬、ｐＨ調整剤、金属イオン封鎖剤、パール化剤、天然香料、合成香料、色素、顔料、酸化防止剤、防腐剤、及び香油等が挙げられる。
【実施例0045】
以下、実施例を示してより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0046】
「酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法」
酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法は、以下の方法で行った。
酸化ストレス低減物質のスクリーニング方法は、以下の方法で行った。
【0047】
１．方法
１－１．試験試料
酸化ストレス低減物質の候補物質の一例として、太平化学産業株式会社の「板状ＨＡＰ」を用いた。
スクアレンは富士フイルム和光純薬株式会社製の「スクアレン」を用いた。
ＵＶ照射スクアレンは、ＵＶ（２８５－４００ｎｍ、６０Ｗ／ｍ２）をスクアレンに、所定の時間照射することにより得た。
ヒドロキシアパタイト処理ＵＶ照射スクアレンは、ヒドロキシアパタイトとＵＶ照射スクアレンとを混合し、所定時間反応させた後、遠心分離機で分離させ、上清（反応物）を分取することで得た。
１－１．試験試料
酸化ストレス低減物質の候補物質の一例として、太平化学産業株式会社の「板状ＨＡＰ」を用いた。
スクアレンは富士フイルム和光純薬株式会社製の「スクアレン」を用いた。
ＵＶ照射スクアレンは、ＵＶ（２８５－４００ｎｍ、６０Ｗ／ｍ２）をスクアレンに、所定の時間照射することにより得た。
ヒドロキシアパタイト処理ＵＶ照射スクアレンは、ヒドロキシアパタイトとＵＶ照射スクアレンとを混合し、所定時間反応させた後、遠心分離機で分離させ、上清（反応物）を分取することで得た。
【0048】
１－２．過酸化物価（ＰＯＶ）の測定
「食品、添加物等の規格基準（昭和３４年厚生省告示第３７０号）における第１食品、即席めん類、４．過酸化物の測定法」に従い試験を行った。すなわち、酢酸－クロロホルム混液に試料を溶解させ、飽和ヨウ化カリウムを加えた。その後、デンプン溶液を加えて、チオ硫酸ナトリウム液で滴定してＰＯＶを測定した。
「食品、添加物等の規格基準（昭和３４年厚生省告示第３７０号）における第１食品、即席めん類、４．過酸化物の測定法」に従い試験を行った。すなわち、酢酸－クロロホルム混液に試料を溶解させ、飽和ヨウ化カリウムを加えた。その後、デンプン溶液を加えて、チオ硫酸ナトリウム液で滴定してＰＯＶを測定した。
【0049】
１－３．ヒト３次元培養表皮モデル（ＲＨＥ）の培養と細胞生存率
ＲＨＥは、ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社製のＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ ２４を用いた。試験は当該メーカーの説明書に従い行った。当該メーカーから入手したＲＨＥを培養培地に移し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。次に、ＲＨＥの角層側に試料を塗布し、３７℃、５％ＣＯ２下で１時間培養した。その後、角層上の試料を除去し、更に３時間培養して続く解析に用いた。細胞生存率はＭＴＴアッセイによって求めた。
ＲＨＥは、ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社製のＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ ２４を用いた。試験は当該メーカーの説明書に従い行った。当該メーカーから入手したＲＨＥを培養培地に移し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。次に、ＲＨＥの角層側に試料を塗布し、３７℃、５％ＣＯ２下で１時間培養した。その後、角層上の試料を除去し、更に３時間培養して続く解析に用いた。細胞生存率はＭＴＴアッセイによって求めた。
【0050】
１－４．定量的ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＨＥ組織を、セルカルチャーインサートから、メルカプトエタノールを添加したＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）に移した。当該ＲＨＥ組織を粉砕し、上清をフェノール－クロロホルム混液で精製した。さらにＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて合成した。定量的ＰＣＲは、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて行った。相対発現量は、△△Ｃｔ法によって求め、ＧＡＰＤＨにより補正した。
ＲＨＥ組織を、セルカルチャーインサートから、メルカプトエタノールを添加したＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）に移した。当該ＲＨＥ組織を粉砕し、上清をフェノール－クロロホルム混液で精製した。さらにＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて合成した。定量的ＰＣＲは、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて行った。相対発現量は、△△Ｃｔ法によって求め、ＧＡＰＤＨにより補正した。
【0051】
２．結果
２－１．ＵＶ照射スクアレンによる酸化ストレスの誘導
スクアレンにＵＶを照射することでスクアレンペルオキシドが生成されたことを確認するために、ＵＶをスクアレンに１時間、３時間、６時間とそれぞれ照射し、ＰＯＶの測定を行った（図１）。その結果、ＵＶ照射時間が長いほどＰＯＶは増加していた。このことは、スクアレンペルオキシドはＵＶ照射時間に依存して増加することを示している。
２－１．ＵＶ照射スクアレンによる酸化ストレスの誘導
スクアレンにＵＶを照射することでスクアレンペルオキシドが生成されたことを確認するために、ＵＶをスクアレンに１時間、３時間、６時間とそれぞれ照射し、ＰＯＶの測定を行った（図１）。その結果、ＵＶ照射時間が長いほどＰＯＶは増加していた。このことは、スクアレンペルオキシドはＵＶ照射時間に依存して増加することを示している。
【0052】
また、ＵＶを１時間、３時間、６時間とそれぞれ照射した試料を、ＲＨＥに塗布して４時間後のｍＲＮＡ発現量について測定した（図２）。その結果、ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２のｍＲＮＡ発現量が、ＵＶ照射時間が長いほど、増加されていることが明らかとなった。その他に、ＨＭＯＸ１及びＧＣＬＣのｍＲＮＡの発現量もまた、ＵＶ照射時間が長いほど、増加していた。
【0053】
続いて、ＵＶを１時間、３時間、６時間とそれぞれ照射した試料を、ＲＨＥに塗布
して４時間後の細胞生存率について算出した（図３）。ＵＶをスクアレンに１時間、３時間、６時間とそれぞれ照射した試料を、ＲＨＥの角層側に塗布し、１時間経過後、角層上の試料を除去し、更に３時間培養したものをＭＴＴアッセイにより細胞生存率を測定したとき、細胞生存率はほぼ違いがなかった。
して４時間後の細胞生存率について算出した（図３）。ＵＶをスクアレンに１時間、３時間、６時間とそれぞれ照射した試料を、ＲＨＥの角層側に塗布し、１時間経過後、角層上の試料を除去し、更に３時間培養したものをＭＴＴアッセイにより細胞生存率を測定したとき、細胞生存率はほぼ違いがなかった。
【0054】
２－２．ＵＶ照射スクアレンを塗布した後のｍＲＮＡ発現量の経時変化
ＵＶ照射スクアレン（３時間照射）をＲＨＥに塗布した後における、酸化ストレス及び炎症に関するｍＲＮＡ発現量について調べた（図４）。その結果、ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２のｍＲＮＡ発現量が著しく増加していた。特にＨＳＰＡ１Ａ及びＩＬ－８のｍＲＮＡでは、ＵＶ照射スクアレン（３時間照射）を塗布してから２時間後に最も高く発現していた。また、ＰＴＧＳ２のｍＲＮＡの発現量は、時間が経過しても増え続けていた。さらに、ＨＭＯＸ１及びＧＣＬＣのｍＲＮＡ発現量についても、添加後４時間経過しても増加していた。
ＵＶ照射スクアレン（３時間照射）をＲＨＥに塗布した後における、酸化ストレス及び炎症に関するｍＲＮＡ発現量について調べた（図４）。その結果、ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２のｍＲＮＡ発現量が著しく増加していた。特にＨＳＰＡ１Ａ及びＩＬ－８のｍＲＮＡでは、ＵＶ照射スクアレン（３時間照射）を塗布してから２時間後に最も高く発現していた。また、ＰＴＧＳ２のｍＲＮＡの発現量は、時間が経過しても増え続けていた。さらに、ＨＭＯＸ１及びＧＣＬＣのｍＲＮＡ発現量についても、添加後４時間経過しても増加していた。
【0055】
ＵＶ照射スクアレン（３時間照射）をＲＨＥに塗布した後における、角化に関するｍＲＮＡ発現量について調べた（図５）。角化に関する遺伝子（遺伝子シンボル：ＡＢＣＡ１２、ＧＢＡ、ＯＣＬＮ、ＳＰＩＮＫ５、ＫＲＴ５及びＫＲＴ１４）発現量については、スクアレンペルオキシドを角層に塗布後、減少していく傾向があった。
【0056】
２－３．ヒドロキシアパタイトによるＵＶ照射スクアレンを原因とする酸化ストレスの低減
続いて、これまでの試験で、酸化ストレスにより変動が著しいことが判明した遺伝子群（ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２）を酸化ストレスの指標（以下、指標遺伝子群という。）として用い、スクアレンペルオキシドによる酸化ストレスをヒドロキシアパタイトが低減させるかどうかを調べた。まずＰＯＶについて調査したところ、ヒドロキシアパタイト処理ＵＶ照射スクアレンは、ＵＶ照射スクアレンと比較して、ＰＯＶが著しく低下していた（図６）。また、ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２のｍＲＮＡ発現量においても、ヒドロキシアパタイト処理ＵＶ照射スクアレンは、ＵＶ照射スクアレンと比較して、発現量が減少していた（図７）。
続いて、これまでの試験で、酸化ストレスにより変動が著しいことが判明した遺伝子群（ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２）を酸化ストレスの指標（以下、指標遺伝子群という。）として用い、スクアレンペルオキシドによる酸化ストレスをヒドロキシアパタイトが低減させるかどうかを調べた。まずＰＯＶについて調査したところ、ヒドロキシアパタイト処理ＵＶ照射スクアレンは、ＵＶ照射スクアレンと比較して、ＰＯＶが著しく低下していた（図６）。また、ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、及びＰＴＧＳ２のｍＲＮＡ発現量においても、ヒドロキシアパタイト処理ＵＶ照射スクアレンは、ＵＶ照射スクアレンと比較して、発現量が減少していた（図７）。
【0057】
３．考察
はじめに、ＵＶ（２８５－４００ｎｍ，６０Ｗ／ｍ２）をスクアレンに照射したところ、スクアレンペルオキシドが生成されていることを確認した。スクアレン中のスクアレンペルオキシドの生成量は、ＵＶ照射時間が長いほど、多くなることが確認できた。
はじめに、ＵＶ（２８５－４００ｎｍ，６０Ｗ／ｍ２）をスクアレンに照射したところ、スクアレンペルオキシドが生成されていることを確認した。スクアレン中のスクアレンペルオキシドの生成量は、ＵＶ照射時間が長いほど、多くなることが確認できた。
【0058】
次に、ＵＶ照射スクアレン（３時間照射）をＲＨＥの角層側に塗布したものを分析したところ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＩＬ－８、ＰＴＧＳ２、ＨＭＯＸ１及びＧＣＬＣのｍＲＮＡ発現量が増加することが判明した。
【0059】
ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＭＯＸ１、及びＧＣＬＣは、酸化ストレスにより発現が誘導されることが知られている遺伝子である。今回の試験で、これらの遺伝子の誘導が確認できたということは、スクアレンペルオキシドが角層に接触することで角層を通じてシグナルが伝達され、表皮生細胞内で酸化ストレスにより細胞障害が生じたので、細胞障害を修復するために増加したものと考えられる。
【0060】
次にＩＬ－８及びＰＴＧＳ２は、炎症に関与する遺伝子である。今回の試験で、これらの遺伝子の誘導が確認できたということは、スクアレンペルオキシドが角層に接触することで角層を通じてシグナルが伝達され、表皮生細胞内の代謝物により皮膚に対して炎症が生じる可能性を示している。
【0061】
ここで、ＰＧＥ２は、メラノサイトの樹状突起を形成させ、メラニンの合成を促進させることが知られている。また、インターロイキン８は、真皮のエラスターゼ活性を促進して、エラスチン繊維を変性させ、シワの形成に関与することが示唆されている。これまで、スクアレンペルオキシドを皮膚に塗布することによって、色素沈着やシワの形成などの変化を示すことが知られているが、これはスクアレンペルオキシドによって誘導される表皮細胞由来の因子が皮膚の形態的な変化に関与していることが推測される。
【0062】
更に、角化に関する遺伝子（ＡＢＣＡ１２、ＧＢＡ、ＯＣＬＮ、ＳＰＩＮＫ５、ＫＲＴ５及びＫＲＴ１４）発現については、スクアレンペルオキシドを角層に塗布後、減少していく傾向があった。この傾向は、スクアレンペルオキシドは、皮膚の代謝バランスを狂わせ、角化異常を起こしたりバリア機能を低下させたりすることを示している。この発見は、とりわけ、スキンケアにおいて、スクアレンペルオキシドにより誘発される酸化ストレスを減らすことが重要であることを示している。
【0063】
上記のことから、発明者らは引き続き、皮膚上で発生したスクアレンペルオキシドを選択的に吸着することで、酸化ストレスを低減させることができるかどうかについて、追加試験を行った。指標遺伝子群を用いて、過酸化物を選択的に吸着する基質であるヒドロキシアパタイトが、ＵＶ照射スクアレンにより誘発される酸化ストレスを減らすことができるかどうか調査した。その結果、ヒドロキシアパタイト処理ＵＶ照射スクアレンでは、ＰＯＶが減少していた。このことは、ＵＶ照射スクアレン中のスクアレンペルオキシドが、ヒドロキシアパタイトに選択的に吸着されたことを示す。ヒドロキシアパタイトは、化粧料で広く使われ、これまでも過酸化脂質に対して選択的な吸着を示すことが知られている。発明者らが行った実験も先の報告に類似する結果が得られた。さらに、このヒドロキシアパタイト処理ＵＶ照射スクアレンをＲＨＥに塗布したときの指標遺伝子群のｍＲＮＡ発現量は、ＵＶ照射スクアレンをＲＨＥに塗布したときの指標遺伝子群のｍＲＮＡ発現量と比較したとき、抑えられていた。これらの発見は、ヒドロキシアパタイトによるスクアレンペルオキシドの選択的な吸着により、スクアレンペルオキシドが誘発する酸化ストレスを効果的に低減させることができることを示す。
【0064】
本研究では、皮脂の構成成分の一つであるスクアレンに着目し、角層にスクアレンペルオキシドを塗布することにより、表皮生細胞で発現されるｍＲＮＡ量の変動について調べた。その結果、酸化ストレスや炎症に関する遺伝子に変動がみられた。このことは、スクアレンペルオキシドが、皮膚における酸化ストレスの要因となっている可能性を示した。さらに、これらの結果は、酸化ストレスを低減する素材のスクリーニングといった、角層からシグナルが伝わった結果、表皮生細胞に伝わる酸化ストレスのモデル試験系として応用することができると考えられる。
【0065】
以下に、本発明におけるスクリーニング方法により見出された酸化ストレス低減物質を皮膚外用剤に適用した場合の処方例を挙げる。酸化ストレス低減物質の例示としてヒドロキシアパタイトを使用した。なお、各処方例の製法は常法による。
＜処方例１＞化粧水
（成分名） （質量％）
ヒドロキシアパタイト ０．１
グリセリン ５．０
１，３ブチレングリコール ５．０
トリメチルグリシン ３．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．０） ０．５
エタノール ２．０
クエン酸 ０．１
クエン酸ナトリウム ０．１
防腐剤 適量
＜処方例１＞化粧水
（成分名） （質量％）
ヒドロキシアパタイト ０．１
グリセリン ５．０
１，３ブチレングリコール ５．０
トリメチルグリシン ３．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．０） ０．５
エタノール ２．０
クエン酸 ０．１
クエン酸ナトリウム ０．１
防腐剤 適量
【0066】
＜処方例２＞化粧用クリーム
（成分名） （質量％）
ヒドロキシアパタイト １．０
シア脂 ２．０
ホホバ油 １．０
ステアリルアルコール ５．０
スクワラン １０．０
自己乳化型グリセリルモノステアレート ３．０
ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．０） １．０
１，３ブチレングリコール ５．０
グリセリン ５．０
水酸化ナトリウム ０．３
香料 ０．１
防腐剤・酸化防止剤 適量
精製水 残部
（成分名） （質量％）
ヒドロキシアパタイト １．０
シア脂 ２．０
ホホバ油 １．０
ステアリルアルコール ５．０
スクワラン １０．０
自己乳化型グリセリルモノステアレート ３．０
ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．０） １．０
１，３ブチレングリコール ５．０
グリセリン ５．０
水酸化ナトリウム ０．３
香料 ０．１
防腐剤・酸化防止剤 適量
精製水 残部
【0067】
＜処方例３＞乳液
（成分名） （質量％）
ヒドロキシアパタイト ５．０
スクワラン ５．０
ホホバ油 ０．３
自己乳化型グリセリルモノステアレート １．０
ステアリン酸 ０．１
カルボキシビニルポリマー ０．１
グリセリン １．５
水酸化ナトリウム 適量
エタノール ７．０
香料 ０．１
防腐剤・酸化防止剤 適量
精製水 残部
（成分名） （質量％）
ヒドロキシアパタイト ５．０
スクワラン ５．０
ホホバ油 ０．３
自己乳化型グリセリルモノステアレート １．０
ステアリン酸 ０．１
カルボキシビニルポリマー ０．１
グリセリン １．５
水酸化ナトリウム 適量
エタノール ７．０
香料 ０．１
防腐剤・酸化防止剤 適量
精製水 残部
【0068】
＜処方例４＞ファンデーション
（成分名） （質量％）
ヒドロキシアパタイト １０．０
ステアリン酸グリセリル １．０
ステアリン酸 ４．０
ベヘニルアルコール １．０
セタノール ０．５
液状ラノリン ２．０
スクワラン ４．０
水添ポリデセン ４．０
酸化チタン ８．０
タルク ４．０
ベンガラ １．０
黄酸化鉄 ０．５
黒酸化鉄 ０．２
香料 ０．１
防腐剤・酸化防止剤 適量
精製水 残部
（成分名） （質量％）
ヒドロキシアパタイト １０．０
ステアリン酸グリセリル １．０
ステアリン酸 ４．０
ベヘニルアルコール １．０
セタノール ０．５
液状ラノリン ２．０
スクワラン ４．０
水添ポリデセン ４．０
酸化チタン ８．０
タルク ４．０
ベンガラ １．０
黄酸化鉄 ０．５
黒酸化鉄 ０．２
香料 ０．１
防腐剤・酸化防止剤 適量
精製水 残部
【0069】
以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これら実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその省略、置き換え、変更などは、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
