特開 2022-91932 細胞透過性コンジュゲート及びその使用の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022091932

(43)【公開日】2022-06-21

(54)【発明の名称】細胞透過性コンジュゲート及びその使用の方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20220614BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220614BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20220614BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220614BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220614BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220614BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20220614BHJP

   A61P 5/00 20060101ALI20220614BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220614BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20220614BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20220614BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220614BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220614BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220614BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220614BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220614BHJP

【ＦＩ】

C07K16/00 ZNA

C12N5/10

A61K31/712

A61K39/395 Y

A61K47/68

A61P29/00

A61P3/00

A61P5/00

A61P9/00

A61P1/16

A61P1/00

A61P25/00

A61P35/00

A61P43/00 111

A61K48/00

A61P37/02

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022059465

(22)【出願日】2022-03-31

(62)【分割の表示】P 2020120404の分割

【原出願日】2014-08-29

(31)【優先権主張番号】61/871,729

(32)【優先日】2013-08-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/939,993

(32)【優先日】2014-02-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】598004424

【氏名又は名称】シティ・オブ・ホープ

【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ

【住所又は居所原語表記】１５００ Ｅａｓｔ，Ｄｕａｒｔｅ Ｒｏａｄ，Ｄｕａｒｔｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９１０１０－０２６９，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リン・リー

(72)【発明者】

【氏名】ジョン・アーネスト・シャイブリー

(72)【発明者】

【氏名】ピオトル・マレク・スウィデルスキー

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス・ヘルマン

(72)【発明者】

【氏名】ホワ・ユイ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ペプチド及びタンパク質（例えば、抗体）が細胞を透過することができるように改良して、細胞内分子を有効に標的とすることを可能にするためのコンジュゲートを提供する。
【解決手段】細胞透過性コンジュゲートであって、本コンジュゲートは、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格に結合した細胞非透過性タンパク質を含み、このホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格が、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する、細胞透過性コンジュゲートを提供する。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ホスホロチオエート核酸に結合した細胞非透過性タンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートであって、前記ホスホロチオエート核酸は、前記細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する、細胞透過性コンジュゲート。

【請求項2】

前記ホスホロチオエート核酸は、前記細胞非透過性タンパク質に共有結合で結合する、請求項１に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項3】

前記ホスホロチオエート核酸は、前記細胞非透過性タンパク質に非共有結合で結合する、請求項１に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項4】

複数のホスホロチオエート核酸が、前記細胞非透過性タンパク質に結合する、請求項１に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項5】

前記複数のホスホロチオエート核酸のそれぞれは、前記タンパク質に共有結合で結合する、請求項４に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項6】

前記複数のホスホロチオエート核酸のそれぞれは、前記タンパク質に非共有結合で結合する、請求項４に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項7】

前記タンパク質は、共有結合及び非共有結合で結合したホスホロチオエート核酸を含む、請求項４に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項8】

各ホスホロチオエート核酸は、独立して、前記細胞非透過性タンパク質のリジン、アルギニン、システイン、またはヒスチジンに結合する、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項9】

各ホスホロチオエート核酸は、前記タンパク質のシステインに結合する、請求項８に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項10】

各ホスホロチオエート核酸は、独立して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上の核酸残基の長さである、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項11】

各ホスホロチオエート核酸は、独立して、１０～３０残基の長さである、請求項１０に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項12】

前記細胞非透過性タンパク質は、２５ｋＤを上回る分子量を有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項13】

前記細胞非透過性タンパク質は、２５～７５０ｋＤの分子量を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項14】

前記細胞非透過性タンパク質は、抗体である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項15】

前記抗体は、ＩｇＧ抗体である、請求項１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項16】

前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体である、請求項１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項17】

前記抗体は、Ｆｖフラグメントである、請求項１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項18】

前記抗体は、ヒト化抗体である、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項19】

前記細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項20】

前記細胞内標的は、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患、神経障害、及び癌からなる群から選択される疾患の標的である、請求項１９に記載の細胞透過性コンジュゲート

【請求項21】

前記細胞内標的は、シグナル伝達分子または転写因子である、請求項１９または２０に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項22】

前記シグナル伝達分子は、ホスファターゼまたはキナーゼである、請求項２１に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項23】

前記細胞内標的は、癌標的である、請求項２０に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項24】

前記細胞内標的は、ＳＴＡＴ３、エクスポーチン７、Ｈｅｒ２、及びＳｒｃからなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項25】

前記細胞内標的は、リン酸化Ｓｒｃである、請求項１９に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項26】

前記細胞非透過性タンパク質は、前記タンパク質に結合した標識、小分子、または機能性核酸をさらに含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項27】

細胞内標的に結合した、請求項１～２６のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項28】

未結合の細胞非透過性タンパク質を未結合のホスホロチオエート核酸と接触させ、前記未結合のホスホロチオエート核酸が前記未結合の細胞非透過性タンパク質のアミノ酸に共有結合で結合するのを可能にし、それによって結合させて、前記細胞透過性コンジュゲートを形成することによって作製される、請求項１に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項29】

前記ホスホロチオエート核酸は、共有結合反応性部分を含む、請求項２８に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項30】

前記共有結合反応性部分は、前記タンパク質のリジン、アルギニン、システイン、またはヒスチジンと反応する、請求項２９に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項31】

前記共有結合反応性部分は、システインと反応する、請求項２９に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項32】

前記共有結合反応性部分は、ビニルスルホンである、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項33】

未結合の細胞非透過性タンパク質を未結合のホスホロチオエート核酸と接触させ、前記未結合のホスホロチオエート核酸が前記未結合の細胞非透過性タンパク質に結合するのを可能にし、それによって結合させて、前記細胞透過性コンジュゲートを形成することによって作製され、前記未結合のホスホロチオエート核酸が、式－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ_２）ｚ－ＯＨを有する置換基を含み、式中、ｚは、１～１０の整数である、請求項１に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項34】

前記接触は、還元条件下で行われる、請求項２８～３３のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項35】

前記未結合のホスホロチオエート核酸は、前記未結合の細胞非透過性タンパク質がモル過剰である状態で存在する、請求項２８～３３のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。

【請求項36】

請求項１～３５のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲートを含む、細胞。

【請求項37】

請求項１～３５のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。

【請求項38】

１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質をさらに含む、請求項３７に記載の薬学的組成物。

【請求項39】

前記第２の細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合する、請求項３８に記載の薬学的組成物。

【請求項40】

前記第２の細胞非透過性タンパク質は、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の細胞非透過性タンパク質と比較して、前記細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、請求項３９に記載の薬学的組成物。

【請求項41】

前記第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、請求項３９に記載の薬学的組成物。

【請求項42】

前記第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。

【請求項43】

請求項１～３５のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲートまたは請求項３７に記載の薬学的組成物と、使用のための説明書とを含む、キット。

【請求項44】

１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質をさらに含む、請求項４３に記載のキット。

【請求項45】

請求項１～２７のいずれか１項に記載のコンジュゲート及び前記第２の細胞非透過性タンパク質は、別個の容器内にある、請求項４４に記載のキット。

【請求項46】

請求項３７に記載の薬学的組成物及び前記第２の細胞非透過性タンパク質は、別個の容器内にある、請求項４４に記載のキット。

【請求項47】

前記第２の細胞非透過性タンパク質は、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の細胞非透過性タンパク質と比較して、前記細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、請求項４４～４６のいずれか１項に記載のキット。

【請求項48】

前記第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、請求項４４～４６のいずれか１項に記載のキット。

【請求項49】

前記第２の細胞非透過性タンパク質は、前記第２の細胞非透過性タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物として製剤化される、請求項４４～４８のいずれか１項に記載のキット。

【請求項50】

前記第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、請求項４３～４９のいずれか１項に記載のキット。

【請求項51】

細胞非透過性タンパク質を細胞内に送達する方法であって、前記細胞を、請求項１～３５のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲートと接触させることを含む、方法。

【請求項52】

前記細胞非透過性タンパク質は、細胞質内の核タンパク質に結合し、それによって細胞非透過性タンパク質－核タンパク質複合体を形成する、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記細胞非透過性タンパク質－核タンパク質複合体は、前記細胞の核に進入することができない、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

対象における疾患を治療する方法であって、前記対象に、請求項１～３５のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲートの有効量を投与することを含み、前記コンジュゲートの投与により、前記対象における前記疾患を治療する、方法。

【請求項55】

前記対象に、１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質を投与することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記第２の細胞非透過性タンパク質は、請求項１９～２６のいずれか１項に記載のコンジュゲートと比較して、前記細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、請求項５５に記載の方法。

【請求項58】

請求項１～２６のいずれか１項に記載のコンジュゲート及び前記第２の細胞非透過性タンパク質は、同時に投与される、請求項５５～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

請求項１～２６のいずれか１項に記載のコンジュゲート及び前記第２の細胞非透過性タンパク質は、順次投与される、請求項５５～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

前記第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、請求項５５～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

前記対象に第２の治療剤を投与することをさらに含む、請求項５４～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記疾患は、自己免疫疾患、発達障害、炎症性疾患、代謝障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患、神経障害、及び癌からなる群から選択される、請求項５４～６１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記疾患は、癌である、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記コンジュゲートの前記細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合し、前記細胞内標的は、ＳＴＡＴ３、エクスポーチン７、Ｈｅｒ２、またはＳｒｃである、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記コンジュゲートの前記細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合し、前記細胞内標的は、リン酸化Ｓｒｃである、請求項６３に記載の方法。

【請求項66】

前記コンジュゲートの前記細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する抗体であり、前記第２の細胞非透過性タンパク質は、エクスポーチン７に特異的に結合する抗体である、請求項６０に記載の方法。

【請求項67】

前記コンジュゲートの前記細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する抗体であり、前記第２の細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３の別のエピトープに特異的に結合する抗体である、請求項６０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／８７１，７２９号及び２０１４年２月１４日に出願された米国仮出願第６１／９３９，９９３号の優先権を主張し、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦支援による研究開発下でなされた発明に対する権利の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号ＣＡ１２２９７６の下の支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【0003】

抗体は、小分子薬等の他の種類の薬物と比べて、その容易な生成、特異性、及び生体耐性（ｂｉｏ－ｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ）のため、有効な薬物モダリティであることが実証されている。現在の抗体療法では、細胞外分子を標的とすることしかできない。しかしながら、疾患治療及び疾患診断のための多数の重要な標的は、細胞内にある。例えば、最も重要であるが依然として困難な癌療法のための標的には、ＳＴＡＴ３等の多数の転写因子が含まれている。当該技術分野におけるこれら及び他の必要性のための解決策が、本明細書に提供される。

【発明の概要】

【0004】

細胞内分子を標的とするためにはペプチド及びタンパク質（例えば、抗体）を使用することが必要である。しかしながら、ペプチド及びタンパク質（例えば、抗体）が有効な様式で細胞内分子を標的とする能力は、困難であることが実証されている。本明細書全体を通じて記載され、以下の実施例で実証されるように、とりわけ、ペプチド及びタンパク質（例えば、抗体）が細胞を透過することができるようにそれらを改良して、それらが全身投与によってさえも細胞内分子を有効に標的とすることを可能にするための方法が、本明細書に提供される。さらに、この提供される改良された抗体により１つの複合体中の２つの異なるタンパク質が標的とされ得ることが、示される。提供される細胞透過性ペプチド（タンパク質）技術は、種々の細胞内タンパク質（例えば、発癌性タンパク質、細胞内に存在するウイルスタンパク質等）を標的とするために広く使用することができる。

【0005】

とりわけ、細胞透過性コンジュゲートが本明細書に提供される。一態様において、本コンジュゲートは、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格に結合した細胞非透過性タンパク質を含み、このホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格が、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する。他の態様において、本コンジュゲートを含む組成物及びキットが提供される。

【0006】

別の態様において、対象における疾患を治療する方法が提供される。本方法は、対象に、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格に結合した細胞非透過性タンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートの有効量を投与することを含み、このホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格が、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化し、本コンジュゲートの投与は、対象における疾患を治療する。

【0007】

別の態様において、細胞非透過性タンパク質を細胞内に送達する方法が提供される。本方法は、細胞を、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格に結合した細胞非透過性タンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートと接触させることを含み、このホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格が、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1A】ＳＴＡＴ３融合タンパク質またはＳＴＡＴ３／エクスポーチン７複合体の２つの異なる部分を抗体により標的とすることにより、細胞質内にＳＴＡＴ３を保持することを示す。図１Ａは、ＳＴＡＴ３－ＧＦＰが、マウス３Ｔ３／ｖ－Ｓｒｃ細胞においてＳＴＡＴ３－ＧＦＰへのＳＴＡＴ３及びＧＦＰ抗体の細胞内送達により、細胞質内に封じ込められていることを示す画像である。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を添加して核酸を染色した。スケールバー１０μｍ。

【図1B】図１Ｂは、腫瘍溶解物のＳＴＡＴ３またはエクスポーチン７のいずれかの免疫沈降後のウエスタンブロット分析の画像であり、ＳＴＡＴ３がエクスポーチン７と相互作用することを示す。ＰＩＳ：免疫血清前。

【図1C】図１Ｃは、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）技法を用いたＵ２５１細胞における相互作用するＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７のインサイツ局在化の画像である。相互作用事象は、点様の構造として示される。検出抗体によるＳＴＡＴ３認識を妨げるＳＴＡＴ３遮断ペプチドが、対照として使用されていた。選択された領域（破線）が、右下の隅に拡大して示される。スケールバー１０μｍ（左パネル）。

【図1D】図１Ｄは、エクスポーチン７とのＳＴＡＴ３相互作用、ｎ＝４（総シグナル、左）、核と細胞質のシグナル事象、ｎ＝２６（右）の定量的分析のグラフである。スチューデントＴ検定、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。

【図1E】図１Ｅは、ＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７抗体の細胞内送達によりＳＴＡＴ３を細胞質内に封入することを示す画像である。生細胞の共焦点撮像により、ＳＴＡＴ３細胞再分布に対する二重抗体アプローチの効果を示す。スケールバー１０μｍ。

【図2A】ＳＴＡＴ３のリジンアセチル化が、ＳＴＡＴ３の核細胞質輸送及びエクスポーチン７の細胞内局在化を決定することを示す。図２Ａは、ｉＦＬＡＰ生細胞共焦点撮像の画像であり、リジン６８５がＳＴＡＴ３核細胞質間輸送に重要であることを示す。ＣＦＰ及びＹＦＰに融合されたＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ３Ｋ６８５Ｒの細胞内可動性を、数回の細胞質ＹＦＰ退色処理によって時間の関数として追跡した。スケールバー１０μｍ。

【図2B】図２Ｂは、ＳＴＡＴ３Ｋ６８５Ｒが核内保持を受け、ＳＴＡＴ３及びＧＦＰ抗体によって細胞質内に保持されないことを示す画像である。スケールバー１０μｍ。

【図2C】図２Ｃは、ＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化ではなくリジンアセチル化が、エクスポーチン７との相互作用に重要であることを示す、ウエスタンブロットの画像である。

【図2D】図２Ｄは、構成的に活性なＳＴＡＴ３におけるＫ６８５の変異が、ＳＴＡＴ３とエクスポーチン７との間の相互作用を停止させることを示す画像である。ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ３Ｋ６８５Ｒを、Ｕ２５１ヒト腫瘍細胞に過剰発現させ、共沈降実験を全細胞溶解物から行った。

【図2E】図２Ｅは、Ｋ６８５を変異させることにより、エクスポーチン７とのＳＴＡＴ３の相互作用、核移出チェックポイントヌクレオポリン５０及びヌクレオポリン１５３をインビボで減少させることを示す画像である。ＳＴＡＴ３野生型－ＹＦＰまたはＳＴＡＴ３Ｋ６８５Ｒ－ＹＦＰで再構成したＳＴＡＴ３欠損ＭＥＦ細胞を無胸腺ヌードマウスに生着させることによって成長させた腫瘍から調製した溶解物の免疫沈降後のウエスタンブロット分析を示す。

【図2F】図２Ｆは、アセチル化欠損ＳＴＡＴ３Ｋ６８５Ｒがインビボでのエクスポーチン７の核退出を制限することを示す画像である。共焦点顕微鏡画像を示す。核酸をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。スケールバー５０μｍ。

【図2G】図２Ｇは、ＳＴＡＴ３野生型及びＳＴＡＴ３Ｋ６８５Ｒ腫瘍におけるｎ＝６での核内エクスポーチン７（左パネル）及びｎ＝６での核直径（右パネル）の定量化を示すグラフである。＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１。

【図3A】インビボでＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７の複合体を標的とすることが、癌療法に有効であることを示す。図３Ａは、示される抗体処置時のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるマウスＢ１６黒色腫の腫瘍成長動態を示すグラフである。各点は、処置を示す。スチューデントＴ検定、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。

【図3B】図３Ｂは、腫瘍のＳＴＡＴ３とヌクレオポリン５０または１５３との免疫共沈降後のウエスタンブロット分析によって示される、腫瘍におけるＳＴＡＴ３輸送を妨害する二重抗体処置の画像である。

【図3C】図３Ｃは、インビボでの腫瘍、腫瘍血管系、及び増殖活性に対する二重抗体処置の効果を示す、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色の画像ならびに腫瘍微小切片の共焦点画像である。スケールバー１００μｍ。

【図3D】図３Ｄは、ＣＤ３１＋腫瘍血管系（ｎ＝４）及びＫｉ６７＋増殖活性（ｎ＝３）の定量化を示す棒グラフである。スチューデントＴ検定、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。

【図3E】図３Ｅは、示される抗体で処置した腫瘍におけるＳＴＡＴ３標的遺伝子であるＢｃｌ－２及びサイクリンＤ１のタンパク質発現を示すウエスタンブロットの画像である。

【図3F】図３Ｆは、示される抗体によって局所処置した無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスに生着させたヒトＵ８７脳腫瘍の腫瘍成長動態のグラフである。スチューデントＴ検定、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。

【図3G】図３Ｇは、二重抗体アプローチにより処置した腫瘍におけるＳＴＡＴ３ ＤＮＡ結合活性の低下を示す、シス誘導要素（ＳＩＥ）オリゴヌクレオチドを使用したオリゴヌクレオチドプルダウンアッセイ後のウエスタンブロットの画像である。沈降物を、まずＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離させた。

【図3H】図３Ｈは、インビボで腫瘍細胞アポトーシス及び腫瘍血管系の崩壊を効果的に誘導する二重抗体封入アプローチの画像である。上パネル：アネキシンＶシグナルを検出するための生体内多光子撮像。アネキシンＶは、腫瘍撮像直前に全身注射した。ＣＤ３１＋腫瘍血管系の共焦点画像を、下パネルに示す。スケールバー１００μｍ。

【図3I】図３Ｉは、示される抗体によって処置した腫瘍におけるアネキシンＶ＋腫瘍細胞アポトーシス（ｎ＝４）及びＣＤ３１＋腫瘍血管系（ｎ＝７）の定量化を示す棒グラフである。スチューデントＴ検定、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５。

【図4A】ホスホロチオエート化核酸で修飾した細胞透過性ＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７抗体による強力な抗腫瘍効果を示す。図４Ａは、蛍光標識した修飾抗体を使用して、示される時間及び用量での細胞内部移行のフローサイトメトリー分析のグラフである。

【図4B】図４Ｂは、ホスホロチオエート化核酸修飾抗体の細胞内局在化の共焦点顕微鏡分析の画像である。抗体（抗Ｓｔａｔ３－オリゴヌクレオチド－ＦＡＭ及び抗エクスポーチン７－オリゴヌクレオチド－ＴＡＭＲＡ）を、１０μｇ／ｍｌで２時間インキュベートした。スケールバー２０μｍ。

【図4C】図４Ｃは、示されるように１０μｇの合計用量のホスホロチオエート化核酸修飾抗体で１日おきに局所処置したＢ１６黒色腫腫瘍保持マウスの腫瘍体積を示すグラフである。標準偏差（ＳＤ）が示される。スチューデントＴ検定、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。

【図4D】図４Ｄは、１０μｇの合計容量のオリゴヌクレオチド修飾抗体で１日おきに局所または全身処置したか、または未処置で残したＢ１６黒色腫腫瘍保持マウスの腫瘍体積を示すグラフである。標準偏差が示される。スチューデントＴ検定、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。

【図4E】図４Ｅは、示されるように漸減用量の抗体の組み合わせで１日おきに３回ずつ（矢印）全身処置したか、または未処置のまま残したＢ１６黒色腫腫瘍保持マウスの腫瘍体積を示すグラフである。標準偏差が示される。スチューデントＴ検定、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。

【図4F】図４Ｆは、Ｓｔａｔ３活性に関するフローサイトメトリー分析のグラフである。

【図4G】図４Ｇは、細胞アポトーシスに関するフローサイトメトリー分析のグラフである。図４Ｆ及び４Ｇは、修飾抗体によって局所処置した腫瘍から調製した単一細胞の懸濁液を使用した。

【図4H】図４Ｈは、ヌクレオポリン５０（上パネル）またはヌクレオポリン１５３（下パネル）の免疫沈降、続いてＳＴＡＴ３ウエスタンブロットに供して、タンパク質の相互作用を評価した、図４Ｅに関して上述の実験から調製した腫瘍ホモジネートを示す画像である。

【図4I】図４Ｉは、ホスホロチオエート化核酸修飾二重抗体による効果的なＳＴＡＴ３活性遮断を示す、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の画像である。核抽出物は、図４Ｅと同じ腫瘍から単離した。

【図5A】ＳＴＡＴ３がエクスポーチン７と相互作用することを示す。図５Ａは、Ｕ２５１ヒト脳腫瘍細胞由来の全細胞溶解物を使用した免疫共沈降後のウエスタンブロットによって示される、ＳＴＡＴ３とエクスポーチン７との間の相互作用の画像である。ＳＴＡＴ３タンパク質沈降物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離させ、ウエスタンブロットによって分析して、示される種々のエクスポーチンとの相互作用を特定した。全細胞溶解物は、対照（右レーン）として含んだ。

【図5B】図５Ｂは、ＭＥＦ細胞中に発現され、示される濃度及び時間点でエクスポーチン１／Ｃｒｍ１特異的阻害剤、レプトマイシンＢにより処置したＳＴＡＴ３－ＧＦＰ融合タンパク質（上パネル）またはＮＦｋＢサブユニットｐ６５－ＧＦＰ（下パネル）の共焦点顕微鏡画像である。ＬＭＢ処置後のタンパク質の局在化を、共焦点顕微鏡法を用いて評価した。スケールバー１０ｍｍ。

【図6A】それぞれ、ｉＦＬＡＰまたはＦＬＩＰによるＳＴＡＴ３核細胞質間輸送分析を示す。ｖ－Ｓｒｃで形質転換させた線維芽細胞を使用して、連鎖内退色処理実験（ＦＬＡＰ、光退色処理後の蛍光消失）を行ってＳＴＡＴ３の区画代謝回転を判定した。代替として、ｉＦＬＡＰ技法の概略実験設計では、ＦＬＩＰアッセイ設定における細胞質退色処理手順を数回繰り返した際の活性化ＳＴＡＴ３または核ＹＦＰデコイの時空的分布を判定するために使用した目的の領域（ＲＯＩ）全てを示す。図６Ａは、ＳＴＡＴ３－ＹＦＰを発現する１組の３Ｔ３／ｖ－Ｓｒｃ細胞（１つがｉＦＬＡＰをその隣接細胞において行った際に対照として機能する）を示す、共焦点顕微鏡法を用いた画像である。スケール１０μｍ。

【図6B】図６Ｂは、連続的細胞質退色処理及び核ＹＦＰ放出の記録により判定された、３Ｔ３／ｖ－Ｓｒｃ細胞において発現された核ＳＴＡＴ３－ＹＦＰまたはＳＴＡＴ３－Ｋ６８５Ｒ－ＹＦＰの放出シグナルデコイを示すグラフである。取得したＹＦＰ強度は、ＦＬＩＰパラメータを用いて補正し、正規化した。

【図7A】ＳＴＡＴ３－Ｋ６８５Ｒが核内保持を受けることを示す。図７Ａは、Ｓｔａｔ３－野生型－ＹＦＰ及びＳｔａｔ３－Ｋ６８５Ｒ－ＹＦＰを一過的にトランスフェクトし、示される時間点で１０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭにより刺激したＳｔａｔ３欠損ＭＥＦの共焦点顕微鏡画像である。ＳＴＡＴ３－野生型－ＹＦＰ及びＳＴＡＴ３－Ｋ６８５ＲＹＦＰの核内保持を、共焦点顕微鏡法を使用して評価した。スケールバー１０μｍ。

【図7B】図７Ｂは、概略図に示されるように設計された、ジギトニンに基づく蛍光プロテアーゼ保護（ＦＰＰ）アッセイにより分析したＳＴＡＴ３－野生型－ＹＦＰ及びＳＴＡＴ３－Ｋ６８５Ｒ－ＹＦＰの核退出動態を示す概略図である。

【図7C】図７Ｃは、３Ｔ３／ｖ－Ｓｒｃを形質転換した線維芽細胞において発現されたＳＴＡＴ３－野生型－ＹＦＰ（上パネル）またはＳＴＡＴ３－Ｋ６８５Ｒ－ＹＦＰ（下パネル）を示す画像である。生細胞の画像は、示される時間点でのジギトニン投与時に取得した。核ＹＦＰ放出デコイは、強度を色違いでコードした形式で示される（黒色は高強度、白色は低強度）。スケールバー１０μｍ。

【図8A】リジンＫ６８５に変異を有するＳＴＡＴ３が、そのインビボで内核膜孔複合体（ＮＰＣ）との相互作用を抑制したことを示す。ＳＴＡＴ３欠損ＭＥＦ細胞を、それぞれ、ＳＴＡＴ３野生型またはＳＴＡＴ３Ｋ６８５Ｒで安定に再構成させた。図８Ａは、無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスに生着させたＳＴＡＴ３－野生型またはＳＴＡＴ３－Ｋ６８５Ｒを安定に発現するＭＥＦ細胞系の腫瘍体積のグラフである。

【図8B】図８Ｂは、示されるように（左パネル）核バスケット内でのヌクレオポリン５０（Ｎｕｐ５０）及び１５３（Ｎｕｐ１５３）の位置を強調表示するＮＰＣの概略表示である。エクスポーチン７は、ＳＴＡＴ３が積み荷として認識されると、内部バスケットのヌクレオポリンとの物理的相互作用を媒介することによりＳＴＡＴ３の核退出を促進する（右パネル）。

【図8C】図８Ｃは、間接的免疫蛍光ＳＴＡＴ３及びヌクレオポリンを通じて評価したインビボにおけるＳＴＡＴ３－野生型及びＳＴＡＴ３－Ｋ６８５ＲとＮｕｐ５０（上パネル）及びＮｕｐ１５３（下パネル）との相互作用の共焦点顕微鏡画像である。ＳＴＡＴ３及びヌクレオポリンの二重陽性ピクセルは、二重陽性ピクセルの画像マスクをもたらす照準線機能を用いて生成した。スケールバー１０μｍ。

【図8D】図８Ｄは、Ｎｕｐ５０、ｎ＝３（左パネル）及びＮｕｐ１５３、ｎ＝３（右パネル）との共局在化にあるＳＴＡＴ３－野生型（黒色）とＳＴＡＴ３－Ｋ６８５Ｒ（灰色）とを比較する二重陽性ピクセルの定量化のグラフである。

【図9】エクスポーチン７局在化が正常組織において細胞質に限定されることを示す画像である。示される組織の微小切片の共焦点顕微鏡画像を、間接的免疫蛍光によりエクスポーチン７、ＣＤ３１、及び核酸に関して染色した。エクスポーチン７＋領域（破線）の高倍率拡大図を、それぞれ、右上または右下の隅に示す。スケールバー５０μｍ。

【図10A】二重抗体によってＳＴＡＴ３とエクスポーチン７との複合体を標的とすることにより、インビボにおいてＳＴＡＴ３の輸送及び機能を遮断することを示す。図１０Ａは、非標的化ＩｇＧ対照抗体と比較した、標的化抗体の効率的な細胞質内送達を示す共焦点画像である。共焦点画像は、ＳＴＡＴ３－ＧＦＰを過剰発現するＭＥＦ腫瘍の微小切片のものであり、抗体の負荷及び局在化を示す。標的化抗体の細胞質内局在化を、選択された領域（破線）から拡大して示す（右下の隅）。スケールバー１００μｍ。局所送達した抗体の腎臓クリアランス及び全身分布を示す、組織微小切片の共焦点顕微鏡画像。スケールバー１００μｍ。

【図10B】図１０Ｂは、インビボでの標的化抗体の細胞内送達後にＳＴＡＴ３の核細胞質間輸送の中断を示す、腫瘍溶解物のＳＴＡＴ３及びヌクレオポリン５０の免疫共沈降後のウエスタンブロット分析の画像である。

【図10C】図１０Ｃは、インビボで送達された標的化抗体が、投与後少なくとも２４時間安定であることを示す画像である。非還元条件下におけるＳＤＳＰＡＧＥでのタンパク質分離後のウエスタンブロットにより、ウサギ免疫グロブリンである注射した抗体が示される。

【図11A】人工的な腫瘍モデルにおける二重抗体療法のインビボ効果を示す。ＳＴＡＴ３野生型で安定に再構成しＳＴＡＴ３欠損ＭＥＦ細胞を無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスに生着させ、示されるように処置することにより、腫瘍を成長させた。図１１Ａは、腫瘍成長動態を示すグラフである。

【図11B】図１１Ｂは、対照ならびに抗ＳＴＡＴ３及び抗エクスポーチン７抗体で処置した腫瘍における血管新生因子のタンパク質発現レベルを示すウエスタンブロットの画像である。

【図11C】図１１Ｃは、示される抗体処置の結果としての腫瘍血管系の共焦点画像である。ＣＤ３１＋細胞が示されており（左パネル）、定量化される（右パネル）、ｎ＝６。スチューデントＴ検定、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。スケールバー１０μｍ。

【図11D】図１１Ｄは、二重抗体処置によるアポトーシス促進遺伝子発現の増加を見せたウエスタンブロットを示す画像である。ウエスタンブロットのための溶解物は、示されるように処置した腫瘍から調製した。これらの実験は、少なくとも２回反復され、同様の結果を有した。

【図12A】二重抗体が、インビボで腫瘍において細胞内の細胞質に有効に内部移行されることを示す。図１２Ａは、ウサギ免疫グロブリンに関して染色したＢ１６腫瘍微小切片から評価した、インビボで投与した抗体の局在化を示す共焦点顕微鏡画像である。スケールバー１００μｍ（左パネル）。

【図12B】図１２Ｂは、腫瘍微小切片における視野ごとの平均蛍光強度による腫瘍組織内に保持された抗体の定量化を示すグラフであり、非標的化免疫グロブリン（ＩｇＧ、黒色）、標的化ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体の組み合わせ（灰色）、ｎ＝３である。

【図12C】図１２Ｃは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて成長させ、抗ＳＴＡＴ３／抗エクスポーチン７免疫グロブリンの組み合わせ、非標的化ＩｇＧ対照で１日おきに処置したか、または示されるように未処置のまま残した黒色腫Ｂ１６腫瘍を示すグラフであり、腫瘍成長動態を監視した。スチューデントＴ検定、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。

【図13A】自己送達抗体による細胞内標的の認識を示す。示される時間の間、それぞれホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドで修飾した１０μｇのαＳｔａｔ３（図１３Ａ）またはαエクスポーチン７（図１３Ｂ）抗体で、ヒト神経膠腫Ｕ２５１細胞を処置した。全細胞溶解物を調製し、細胞残屑を取り出した後に、アガロースビーズを添加して、４℃で一晩免疫沈降を誘導した。沈降物を注意深く洗浄し、ウエスタンブロット分析に供して抗体標的認識動態を判定した。

【図13B】自己送達抗体による細胞内標的の認識を示す。示される時間の間、それぞれホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドで修飾した１０μｇのαＳｔａｔ３（図１３Ａ）またはαエクスポーチン７（図１３Ｂ）抗体で、ヒト神経膠腫Ｕ２５１細胞を処置した。全細胞溶解物を調製し、細胞残屑を取り出した後に、アガロースビーズを添加して、４℃で一晩免疫沈降を誘導した。沈降物を注意深く洗浄し、ウエスタンブロット分析に供して抗体標的認識動態を判定した。

【図14】細胞透過性抗体のインビボでの腫瘍内取り込みを示すグラフである。インビボでの腫瘍による、蛍光オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドＦＡＭ）に共役したホスホロチオエート化核酸修飾抗体の細胞内取り込みを、局所投与の２時間後に評価した。マウス黒色腫Ｂ１６腫瘍を解剖し、単一細胞懸濁液をフローサイトメトリー分析用に調製してＦＡＭ（ＦＩＴＣ）＋細胞集団を判定した。腫瘍保持マウスを示される修飾抗体（複数可）で処置し、合計１０μｇの用量のオリゴヌクレオチド修飾抗体を単回処置で与えた。

【図15A】インビボでの腫瘍組織への細胞透過性抗体のホーミング及び生体安定性を示す。図１５Ａは、それぞれ、局所（皮下、上段中央及び右のパネル）または全身（静脈内、下パネル）注射後の蛍光標識したホスホロチオエート化核酸修飾抗体の腫瘍内分布を評価するために行った生体多光子顕微鏡の画像である。蓄積されたオリゴヌクレオチド修飾抗体の点様の位置は、インビトロ研究で見られたものに類似である（図１Ｂ）。ホスホロチオエート化核酸修飾抗体の後眼窩経路（静脈内）を介した全身送達時の腫瘍組織へのホーミングを、投与の２時間後に評価した。腫瘍内での蓄積されたオリゴヌクレオチド修飾抗体（下パネル）の点様焦点の検出。白色の点線の円は、細胞核を示す。スケールバー５０μｍ。

【図15B】図１５Ｂは、最後の全身投与の８日後に判定された、ホスホロチオエート化核酸修飾抗体の腫瘍ホーミング能力及び生体安定性のウエスタンブロット分析を示す画像である。異なる用量のホスホロチオエート化核酸修飾抗体を、１日おきに３回、示されるように注射した。腫瘍を最後の処置の８日後に分析用に採取した。腫瘍ホモジネートを非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ウエスタンブロット検出に供して、腫瘍ＩｇＧ負荷量を評価した。

【図16A】免疫細胞集団中へのホスホロチオエート化核酸修飾細胞透過性抗体の細胞内への内部移行を示す。図１６Ａは、示されるように種々の濃度の蛍光標識したオリゴヌクレオチド修飾αＳｔａｔ３抗体（αＳｔａｔ３オリゴヌクレオチドＦＩＴＣ）で２時間処置した脾臓細胞のフローサイトメトリー分析のグラフであり、免疫細胞集団ＣＤ３＋、ＣＤ１１ｂ＋、及びＢ２２０＋による用量依存性の内部移行が判定された。

【図16B】図１６Ｂは、示される脾臓免疫細胞集団内への１０μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチド修飾抗体（緑色）の細胞内への内部移行の共焦点レーザー走査顕微鏡画像である。核酸をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。微分干渉（ＤＩＣ）を示す。スケールバー、１０μｍ。

【図17A】オリゴヌクレオチド骨格ホスホロチオエート化が、細胞内への抗体送達及び抗原認識に重要であることを示す。ヒト神経膠腫Ｕ２５１細胞を、１０μｇ／ｍｌの蛍光標識したホスホロチオエート化核酸修飾αＳｔａｔ３抗体で示される時間の間処置した。単一細胞の懸濁液を、修飾抗体の取り込みに関してフローサイトメトリーによって分析した。図１７Ａは、骨格のチオエート化を欠くオリゴヌクレオチドと共役させた抗体で処置した細胞（下パネル）と比較した、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド骨格と共役させた抗体で処置した神経膠腫細胞（上パネル）を示すグラフである。共役オリゴヌクレオチドの配列の改変は、抗体の細胞内への内部移行に対してごくわずかな効果を有する。２つの無作為化オリゴヌクレオチド配列を試験した。

【図17B】図１７Ｂは、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド配列の改変が、修飾抗体による抗体認識を変化させないことを示す画像である。Ｕ２５１細胞を、示される修飾を有する１０μｇのαＳｔａｔ３抗体で処置した。全細胞溶解物を調製し、アガロースビーズを添加して、免疫沈降を誘導した。沈降物をウエスタンブロット分析に供して抗体の標的認識を判定した。

【図18】異種移植片ヒト神経膠腫モデルにおいて、修飾ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体による強力な抗腫瘍効果を示すグラフである。ヒト神経膠腫Ｕ２５１細胞（２×１０^６）を、免疫不全ＮＳＧ／ＮＯＤマウスに皮下注射した。腫瘍の直径が平均５ｍｍに達したときに、マウスに、１日おきに１０μｇの示される修飾抗体を局所で処置した。腫瘍体積を１日ごとに評価した。標準偏差が示される。スチューデントＴ検定、＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５。

【図19】式－Ｓ－Ｓ－Ｒを有する部分を有する例示的なホスホロチオエート核酸の構造の概略図である。ホスホロチオエート核酸配列の結合点の例示の目的で、この部分に連結される１つのホスホロチオエート核酸塩基が示される。この事例において、Ｒは、－ＳＳＲをホスホロチオエート核酸の残りに連結させる、ヘキサノールまたはリンカー部分（ホスホジエステルプロピル反復モノマー単位）である。

【図20】ビニルスルホン（ＶＳ）反応性部分とＶＳをホスホロチオエート核酸の残りに連結させるリンカー部分（ホスホジエステルプロピル反復モノマー単位を有する）とを有する例示的なホスホロチオエート核酸の構造を示す。ホスホロチオエート核酸配列の結合点の例示の目的で、この部分に連結される１つのホスホロチオエート核酸塩基が示される。

【図21】式－Ｓ－Ｓ－Ｒの部分を有するホスホロチオエート核酸から、ビニルスルホンを有するホスホロチオエート核酸を合成する例示的な方法を示す概略図である。

【図22】末端リン酸塩（ＰＳ）を有する核酸から、ビニルスルホン反応性部分を有する核酸を合成する例示的な方法を示す概略図である。

【図23A】ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド修飾抗体が内部移行し、細胞内標的を認識することを示す。図２３Ａは、代替的な免疫沈降によって検証された修飾抗体による細胞透過及び標的認識を示すウエスタンブロットの画像である。修飾ＳＴＡＴ３抗体とともにインキュベートした生細胞から調製した全細胞溶解物を、ＳＴＡＴ３に関してプローブするウエスタンブロットによって分析した。

【図23B】図２３Ｂは、オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート化（ＰＳ）が、核酸配列（２つ目のパネル）またはＩｇＧ種（３つ目のパネル）または細胞型（下パネル）に依存することなく修飾ＳＴＡＴ３抗体（上パネル）の細胞内取り込みを促進するのを示すフローサイトメトリー分析のグラフである。

【図23C】図２３Ｃは、図２３Ｂにおけるフローサイトメトリーデータを確認する、代替的なＩＰ後のウエスタンブロットを示すウエスタンブロット画像である。ホスホロチオエート化親オリゴヌクレオチド（レーン２）、非ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド（レーン３）、及びホスホロチオエート化配列スクランブル型親オリゴヌクレオチド（レーン４～６）で修飾したＳＴＡＴ３抗体。

【図23D】図２３Ｄは、蛍光標識したホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド修飾抗体の細胞内分布の共焦点顕微鏡画像である。スケールバーは、それぞれ、２０μｍ及び１０μｍである。

【図23E】図２３Ｅは、マウス３Ｔ３／ｖＳｒｃ細胞による、修飾及び非修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体の細胞内取り込みを示すフローサイトメトリーグラフである。

【図23F】図２３Ｆは、修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体が、その細胞内標的タンパク質ｐ－Ｓｒｃと共局在化することを示す共焦点顕微鏡画像である。下パネルは、示される領域（破線の四角）の拡大図を示す。細胞膜に沿った修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体の細胞内分布は、強度を色違いでコードした形式で示される。スケールバー１０μｍ。

【図23G】図２３Ｇは、修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体または修飾ＩｇＧ抗体とともにインキュベートした３Ｔ３／ｖＳｒｃ細胞において代替的な免疫沈降の後にウエスタンブロットにより修飾抗体ｐ－Ｓｒｃ複合体を検出することを示す、ウエスタンブロットの画像である。オリゴヌクレオチド及びビニルスルホンを通じてオリゴヌクレオチドに結合した抗体を、これらの図の実験に使用した。

【図24】修飾抗体の細胞内活性を示すフローサイトメトリー分析のグラフである。フローサイトメトリー分析は、修飾抗体の細胞内保持のための標的タンパク質の要件を示す。マウス３Ｔ３／ｖＳｒｃ細胞を、修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体または修飾ＩｇＧ抗体（上パネル）とともにインキュベートした。修飾Ｓｔａｔ３抗体（１μｇ／ｍｌ）をＳｔａｔ３＋またはＳｔａｔ３－いずれかのマウスＭＥＦ細胞とともに２時間インキュベートした後、フローサイトメトリー分析を行った（下パネル）。オリゴヌクレオチド及びビニルスルホンを通じてオリゴヌクレオチドに結合した抗体を、これらの図の実験に使用した。

【図25A】細胞透過性ｐ－Ｓｒｃ抗体の抗腫瘍効果を示す。図２５Ａは、示される修飾抗体で１日おきに局所処置した形質転換したマウス３Ｔ３／ｖＳｒｃ細胞によって形成された腫瘍の成長動態を示すグラフである。標準偏差が示され、有意差＊＊）Ｐ≦０．０１、Ｐ≦０．００１。

【図25B】図２５Ｂは、ウエスタンブロットに供し、示されるように、活性化ｐＹ４１６－Ｓｒｃ、活性化ｐＹ７０５－Ｓｔａｔ３、ならびに複数のＳｒｃ下流遺伝子の発現に関してプローブした、示されるように処置した３Ｔ３／ｖＳｒｃ腫瘍のホモジネートにおけるｐ－Ｓｒｃ及びその下流タンパク質の消失を示すウエスタンブロットの画像である。チューブリンをタンパク質負荷対照としてプローブした。

【図25C】図２５Ｃは、修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体が、無胸腺ヌードマウスにおいてヒトＡ２０５８黒色腫の成長を効果的に阻害することを示すグラフである。腫瘍成長動態を評価し、腫瘍を、１日おきに局所処置した。標準偏差が示され、有意差＊＊＊）Ｐ≦０．００１。

【図25D】図２５Ｄは、示されるように処置したＡ２０５８黒色腫腫瘍のホモジネートを非還元条件下でウエスタンブロットに供し、ウサギＩｇＧに関してプローブした、ウエスタンブロットの画像である。チューブリンをタンパク質負荷対照として含んだ。

【図25E】図２５Ｅは、共焦点顕微鏡法と組み合わせた免疫組織化学によって示されるように、修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体処置が、インビボで腫瘍血管系の破壊及び腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こしたことを示す、共焦点顕微鏡画像である。示されるように処置したＡ２０５８黒色腫腫瘍の腫瘍組織切片を、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ＣＤ３１＋腫瘍血管系（上パネル）、及び切断型カスパーゼ３（下パネル）に関して染色した。スケールバー１００μｍ。

【図25F】図２５Ｆは、蛍光シグナルの定量化を示すグラフである。標準偏差が示され、有意差＊＊＊）Ｐ≦０．００１。Ｓ－Ｓ－ヘキサノール基を含有するオリゴヌクレオチドと複合体形成／結合した抗体の混合物を、これらの図の実験に使用した。

【図26A】子宮頸癌におけるＥ６腫瘍性タンパク質を標的化する修飾抗体の抗腫瘍有効性を示す。図２６Ａ及び２６Ｂは、ヒト子宮頸癌成長動態を示すグラフである。ヒトＣａＳｋｉ癌細胞を、無胸腺ヌードマウスに生着させ、示されるように処置なしか、または１日おきに修飾ＩｇＧ対照もしくはＨＰＶ１６／１８ Ｅ６抗体で局所（図２６Ａ）または全身（図２６Ｂ）で処置した。標準偏差が示され、＊）Ｐ≦０．０５、＊＊）Ｐ≦０．０１、＊＊＊）Ｐ≦０．００１。

【図26B】子宮頸癌におけるＥ６腫瘍性タンパク質を標的化する修飾抗体の抗腫瘍有効性を示す。図２６Ａ及び２６Ｂは、ヒト子宮頸癌成長動態を示すグラフである。ヒトＣａＳｋｉ癌細胞を、無胸腺ヌードマウスに生着させ、示されるように処置なしか、または１日おきに修飾ＩｇＧ対照もしくはＨＰＶ１６／１８ Ｅ６抗体で局所（図２６Ａ）または全身（図２６Ｂ）で処置した。標準偏差が示され、＊）Ｐ≦０．０５、＊＊）Ｐ≦０．０１、＊＊＊）Ｐ≦０．００１。

【図26C】図２６Ｃは、修飾Ｅ６抗体によるＣａＳｋｉ腫瘍の破壊を示す顕微鏡画像である。Ｈ＆Ｅによって染色し、明視野顕微鏡法によって分析した画像を示す。スケールバー１００μｍ。

【図26D】図２６Ｄは、修飾Ｅ６抗体で処置したＣａＳｋｉ頸部腫瘍のホモジネートにおけるＦＡＤＤタンパク質レベルの増加を示す、ウエスタンブロットの画像である。アクチンをタンパク質負荷対照としてプローブした。

【図26E】図２６Ｅは、修飾Ｅ６抗体によって処置したＣａＳｋｉ腫瘍におけるカスパーゼ８ ｍＲＮＡの発現の上昇を示すＲＴ－ＰＣＲを示すグラフである。標準偏差が示され、有意差＊＊）Ｐ≦０．０１。

【図26F】図２６Ｆは、修飾Ｅ６抗体のインビボ保持を示すが、対照ＩｇＧ抗体は示されず、腫瘍血管系の消失及び切断型カスパーゼ３の増加をもたらす、免疫染色後の共焦点顕微鏡画像である。示されるように処置したＣａＳｋｉ頸部腫瘍の腫瘍組織切片を、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ＣＤ３１＋腫瘍血管系、及び切断型カスパーゼ３に関して染色した。スケールバー１００μｍ。

【図26G】図２６Ｇは、蛍光シグナルの定量化を示すグラフである。標準偏差が示され、有意差＊＊）Ｐ≦０．０１、＊＊＊）Ｐ≦０．００１。Ｓ－Ｓ－ヘキサノール基を含有するオリゴヌクレオチドが結合した抗体の混合物を、これらの図の実験に使用した。

【図27A】修飾抗体でＳＴＡＴ３を標的とすることを示す。図２７Ａは、インビトロで核蓄積したＳｔａｔ３の細胞質内再配置を誘導する修飾抗体を示す画像である。Ｓｔａｔ３－ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質を発現するマウス３Ｔ３／ｖＳｒｃ細胞を示される抗体で処置した。Ｓｔａｔ３区画内局在化を、共焦点顕微鏡法によって生細胞において分析した。スケールバー１０μｍ。

【図27B】図２７Ｂは、修飾ＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７抗体処置が、強力な抗腫瘍効果を誘導することを示すグラフである。示される抗体処置によるマウスにおけるＢ１６黒色腫の腫瘍成長動態。左パネル：局所注射、中央パネル：局所と対比した全身処置、右パネル：漸減用量での３回の全身処置（矢印）。標準偏差が示され、有意差＊＊）Ｐ≦０．０１、＊＊＊）Ｐ≦０．００１。

【図27C】図２７Ｃは、図２７Ｂの右パネルの腫瘍ホモジネートからの核抽出物を使用してＥＭＳＡによって評価される、修飾ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体での全身処置が、腫瘍におけるＳｔａｔ３ ＤＮＡ結合を抑制したことを示すウエスタンブロットの画像である。

【図27D】図２７Ｄは、全身投与した標的化抗体のインビボでの長期安定性を示すウエスタンブロットの画像である。図２７Ｃの右パネルからの腫瘍ホモジネートを非還元条件下でウエスタンブロットに供し、ウサギ免疫グロブリンに関してプローブした。

【図27E】図２７Ｅは、示される抗体で局所処置した無胸腺ヌードマウスにおけるヒトＵ８７神経膠腫の腫瘍成長動態を示すグラフである。

【図27F】図２７Ｆは、示される抗体で全身処置した無胸腺マウスにおけるヒトＵ８７神経膠腫の腫瘍成長動態を示す。標準偏差が示され、有意差＊）Ｐ≦０．０５、＊＊）Ｐ≦０．０１、＊＊＊）Ｐ≦０．００１。

【図27G】図２７Ｇは、修飾抗体が、標的が存在する腫瘍に蓄積し、抗腫瘍効果を発揮したことを示す画像である。ヒトＵ２５１神経膠腫細胞を生着させた無胸腺ヌードマウスを、示されるように、１日おきに３回局所もしくは全身処置したか、または未処置のまま残した。示される器官（腫瘍）からの組織切片を、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で染色して、修飾抗体を、腫瘍血管系についてはＣＤ３１＋を、及び腫瘍細胞アポトーシスについては切断型カスパーゼ３を検出した。はめこみ図は、示される領域（破線の四角）の拡大図を示す。スケールバー１００μｍ。オリゴヌクレオチド及びビニルスルホンを通じてオリゴヌクレオチドに結合した抗体を、図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃ、２７Ｄ、２７Ｅ、及び２７Ｇの実験に使用した。図２７Ｆについては、ＳＴＡＴ３／Ｅｘｐ７は、オリゴヌクレオチド及びビニルスルホンを通じてオリゴヌクレオチドに結合した抗体であったが、ＳＴＡＴ３Ｒｂ／ＳＴＡＴ３Ｍｓ及びＳＴＡＴ３Ｒｂ／Ｒｂは、Ｓ－Ｓ－ヘキサノール基を含有するオリゴヌクレオチドに結合した抗体の混合物を使用した。

【図28】インビボにおけるホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド（ＦＡＭ陽性）及び送達した抗体の共局在化を示す画像である。ヒトＵ２５１神経膠腫に１日おきに３回局所処置を行った後、腫瘍を解剖した。腫瘍切片を、ＩｇＧウサギ種に対する標識化抗体で染色した。染色した切片を共焦点顕微鏡法によって分析した。差し込み図は、示される領域（白色の四角、破線）の拡大図を示す。スケールバー、５０μｍ。

【図29】示されるように、１０μｇ／ｍｌで２４時間修飾抗体とともにあったマウス３Ｔ３／ｖＳｒｃ細胞を示す画像である。固定細胞をβ－チューブリン及びβ－アクチンに関して染色し、共焦点顕微鏡法によって分析した。各チャネルの放出を右側に別個に示す。スケールバー、５０μｍ。

【図30A】ヒトＵ８７神経膠腫に、１日おきに全身処置を行った。腫瘍切片をフルオレセインに関して染色した。染色した切片を共焦点顕微鏡法によって分析した。スケールバー、５０μｍ（図３０Ａ）。フルオレセイン放出シグナルを定量化した。標準偏差を示す（図３０Ｂ）。

【図30B】ヒトＵ８７神経膠腫に、１日おきに全身処置を行った。腫瘍切片をフルオレセインに関して染色した。染色した切片を共焦点顕微鏡法によって分析した。スケールバー、５０μｍ（図３０Ａ）。フルオレセイン放出シグナルを定量化した。標準偏差を示す（図３０Ｂ）。

【図31A】ヒトＵ８７神経膠腫に、おきに全身処置を行った 腫瘍切片をＣＤ３１＋腫瘍血管系（左パネル）、ｃ－Ｍｙｃ発現（中央パネル）、及び切断型カスパーゼ３によって示される腫瘍細胞アポトーシス（右パネル）に関して染色した。染色した切片を共焦点顕微鏡法によって分析した。スケールバー、それぞれ１００μｍ及び５０μｍ（図３１Ａ）。放出シグナルを定量化した。標準偏差が示され、有意差＊）Ｐ＜０．０５、＊＊）Ｐ＜０．０１、＊＊＊）Ｐ＜０．００１（図３１Ｂ）。

【図31B】ヒトＵ８７神経膠腫に、おきに全身処置を行った 腫瘍切片をＣＤ３１＋腫瘍血管系（左パネル）、ｃ－Ｍｙｃ発現（中央パネル）、及び切断型カスパーゼ３によって示される腫瘍細胞アポトーシス（右パネル）に関して染色した。染色した切片を共焦点顕微鏡法によって分析した。スケールバー、それぞれ１００μｍ及び５０μｍ（図３１Ａ）。放出シグナルを定量化した。標準偏差が示され、有意差＊）Ｐ＜０．０５、＊＊）Ｐ＜０．０１、＊＊＊）Ｐ＜０．００１（図３１Ｂ）。

【図32】ビニルスルホン（ＶＳ）に媒介されるホスホロチオエート化ＤＮＡ２０量体オリゴヌクレオチドまたは未精製ＳＳＲ－オリゴヌクレオチド－抗体コンジュゲート／複合体の結合によって修飾された１０ｍｇ／ｍｌの精製（Ｐ）または未精製（ＵＰ）抗ＳＴＡＴ３ウサギ抗体とともにインキュベートしたヒトＫａｒｐａｓ２９９リンパ腫細胞のフロー細胞分析のグラフである。

【図33A】ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド修飾抗体が細胞に進入し、ＳＴＡＴ３等の細胞内標的を認識することを示す、ウエスタンブロットの画像である。図３３Ａは、１０ｍｇ／ｍｌの、ビニルスルホン（ＶＳ）に媒介されるホスホロチオエート化ＤＮＡ－２０量体－オリゴヌクレオチドを介して修飾された精製（Ｐ）ａＳＴＡＴ３抗体（レーン１）か、または非修飾ａＳＴＡＴ３単独（レーン３）、またはａＳＴＡＴ３とＶＳを介して結合したものと同じである５００ｐｍｏｌ／ｍｌのホスホロチオエート化ＧｐＣ１６６８（レーン４、レーン２は空である）とともにインキュベートしたヒトＵ２５１神経膠腫細胞を示すウエスタンブロットの画像である。

【図33B】図３３Ｂは、ＳＳＲを介して修飾された１０ｍｇ／ｍｌの未精製（ＵＰ）ａＳＴＡＴ３抗体（レーン２）、ビニルスルホン（ＶＳ）に媒介されるホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドの結合により修飾された未精製（ＵＰ）ａＳＴＡＴ３抗体（レーン３）、またはビニルスルホン（ＶＳ）に媒介されるホスホロチオエート化の結合により修飾された精製（Ｐ）ａＳＴＡＴ３抗体（レーン４）とともに、または抗体ＩｇＧ添加なしで（レーン１）インキュベートしたヒトＵ２５１細胞を示すウエスタンブロットの画像である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

「対象」、「患者」、「個体」等の用語は、限定することを意図するものではなく、一般に互換可能である。すなわち、「患者」として記載された個体は、必ずしも所与の疾患を有するわけではなく、医療的助言を求めているだけの場合がある。

【0010】

「対照」または「標準対照」は、試験試料、測定値、または値との比較のための基準、通常は既知の基準として機能する、試料、測定値、または値を指す。例えば、試験試料が所与の疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性自己免疫疾患、癌、感染性疾患、免疫疾患、または他の疾患）を有する疑いのある患者から得られ、既知の正常な（非疾患の）個体（例えば、標準対照対象）と比較され得る。標準対照はまた、所与の疾患を有さない類似の個体（例えば、標準対照対象）、例えば、類似の病歴、同じ年齢、体重等を有する健常な個体の集団（すなわち、標準対照集団）から集めた平均測定値または値を表してもよい。標準対照値はまた、同じ個体から、例えば、疾患発症前の患者から早い段階で取得された試料から得られてもよい。当業者であれば、標準対照が、任意の数のパラメータ（例えば、ＲＮＡレベル、タンパク質レベル、特定の細胞型、特定の体液、特定の組織、滑膜細胞、滑液、滑膜組織、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞等）の評価のために設計され得ることを認識するであろう。

【0011】

当業者であれば、どの標準対照が所与の状況に最も適切であるかを理解し、標準対照値との比較に基づいてデータを分析することができるであろう。標準対照はまた、データの有意性（例えば、統計学的有意性）を決定するのに有益である。例えば、所与のパラメータの値が、標準対照において広範に異なる場合、試験試料における変動性は有意とは見なされないであろう。

【0012】

「用量」及び「投薬量」という用語は、本明細書において互換的に使用される。用量は、各投与時に個体に与えられる活性成分の量を指す。用量は、所与の治療法の通常の用量範囲、投与の頻度、個体のサイズ及び耐容性、状態の重症度、副作用の危険性、ならびに投与経路を含む、多数の要因に応じて多様であり得る。当業者であれば、用量が、上述の要因に応じて、または治療の進み具合に基づいて、変更され得ることを認識するであろう。「剤形」という用語は、医薬品または薬学的組成物の特定の形態を指し、これは、投与の経路に依存する。例えば、剤形は、噴霧、例えば吸入剤のための液体形態、例えば経口送達のための錠剤もしくは液体、または例えば注入のための生理食塩水であり得る。

【0013】

本明細書に使用されるとき、「治療する」及び「予防する」という用語は、発症の何らかの遅延、症状の頻度もしくは重症度の低減、症状の緩和、患者の快適さもしくは機能（例えば、関節機能）の改善、疾患状態の重症度の減少等を指し得る。治療の効果は、所与の治療を受容していない個体もしくは個体集団、または治療の前もしくは休止後の同じ患者と比較され得る。「予防する」という用語は、一般に、患者における所与の疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、感染性疾患、代謝疾患、発達疾患、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、内分泌疾患、神経疾患、もしくは他の疾患）または疾患症状の発症の減少を指す。上に示されるように、予防は、完全（検出可能な症状がない）または部分的であり得、結果として、治療を行わなかった場合に生じるであろうものよりも少ない症状が観察される。

【0014】

本明細書に使用される「治療有効用量または量」は、投与されるものに効果（例えば、疾患の治療または予防）をもたらす用量を意味する。実際の用量及び製剤は、治療の目的に依存することになり、既知の技法を使用して当業者によって確認することができるであろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄｉｔｏｒ（２００３）、及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照されたい）。例えば、所与のパラメータに関して、治療有効量は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、または少なくとも１００％の増加または減少を示すであろう。治療有効性はまた、「～倍」の増加または減少として表すこともできる。例えば、治療有効量は、標準対照の少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、またはそれ以上の効果を有し得る。治療有効用量または量は、疾患の１つ以上の症状を緩和し得る。治療有効用量または量は、それが投与されることに関する効果が、疾患を発症する危険性にある人物を治療することである場合に、疾患または疾患の１つ以上の症状の発症を予防または遅延し得る。

【0015】

「診断」という用語は、疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性自己免疫疾患、癌、感染性疾患、免疫疾患、または他の疾患）が対象に存在する相対的可能性を指す。同様に、「予後」という用語は、ある特定の将来的な結果が、疾患状態に関して、対象に生じ得る相対的可能性を指す。例えば、本発明の文脈では、予後は、個体が疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性自己免疫疾患、癌、感染性疾患、免疫疾患、もしくは他の疾患）を発症するであろう可能性、または疾患の推定重症度（例えば、疾患の持続期間）を指し得る。これらの用語は、医療診断の分野の当業者によって理解されるように、絶対的であることを意図するものではない。

【0016】

本明細書に使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または文法上の同等物は、共有結合で一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。「核酸」という用語には、一本鎖、二本鎖、多重鎖、または分枝鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの類似体（誘導体）が含まれる。「ホスホロチオエート核酸」という用語は、１つ以上のヌクレオチド間結合がホスホロチオエート部分（チオホスフェート）部分を介する核酸を指す。ホスホロチオエート部分は、モノチオホスフェート（－Ｐ（Ｏ）_３（Ｓ）^３－－）またはジチオホスフェート（－Ｐ（Ｏ）_２（Ｓ）_２ ^３－－）であり得る。本明細書に提供される全態様の実施形態において、ホスホロチオエート部分は、モノチオホスフェート（－Ｐ（Ｏ）_３（Ｓ）^３－－）である。すなわち、本明細書に提供される全態様の実施形態において、ホスホロチオエート核酸は、モノチオホスフェート核酸である。実施形態において、ホスホロチオエート核酸のヌクレオシドのうちの１つ以上は、ホスホロチオエート部分（例えば、モノチオホスフェート）部分を通じて連結され、残りのヌクレオシドは、ホスホジエステル部分（－Ｐ（Ｏ）_４ ^３－－）を通じて連結される。実施形態において、ホスホロチオエート核酸のヌクレオシドのうちの１つ以上は、ホスホロチオエート部分（例えば、モノチオホスフェート）部分を通じて連結され、残りのヌクレオシドは、メチルホスホネート結合を通じて連結される。実施形態において、ホスホロチオエート核酸の全てのヌクレオシドは、ホスホロチオエート部分（例えば、モノチオホスフェート）部分を通じて連結される。

【0017】

ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート核酸）は、典型的に、約５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり、最大約１００ヌクレオチドの長さである。ホスホロチオエート核酸はまた、例えば、２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、１０，０００等、より長い長さであってもよい。上述のように、ある特定の実施形態において、本明細書におけるホスホロチオエート核酸は、１つ以上のホスホジエステル結合を含有する。他の実施形態において、ホスホロチオエート核酸は、代替的な骨格（例えば、当該技術分野で既知のホスホジエステルの模倣体または類似体、例えば、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、またはＯ－メチルホスホロアミダイト結合を含む（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。ホスホロチオエート核酸はまた、当該技術分野で既知の１つ以上の核酸類似体モノマー、例えば、ペプチド核酸モノマーもしくはポリマー、ロックド核酸モノマーもしくはポリマー、モルホリノモノマーもしくはポリマー、グリコール核酸モノマーもしくはポリマー、またはトレオース核酸モノマーもしくはポリマーを含み得る。他の類似核酸には、米国特許第５，２３５，０３３号及び同第５，０３４，５０６号、ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ ６及び７，ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎｇｈｕｉ＆Ｃｏｏｋ，ｅｄｓに記載されるものを含む、陽性骨格、非イオン性骨格、及び非リボース骨格を有するものが含まれる。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸もまた、核酸の１つの定義に含まれる。リボース－リン酸骨格の修飾が、種々の理由で、例えば、生理学的環境内またはバイオチップ上のプローブとしてのそのような分子の安定性及び半減期を増加させるために、なされてもよい。天然に存在する核酸及び類似体の混合物を作製することができる、あるいは、異なる核酸類似体と天然に存在する核酸及び類似体の混合物との混合物が作製されてもよい。ホスホロチオエート核酸及びホスホロチオエートポリマー骨格は、直鎖または分枝鎖であり得る。例えば、分枝鎖核酸は、デンドリマー等のより上位な構造を形成するために繰り返し分枝される。

【0018】

本明細書に使用されるとき、「ホスホロチオエートポリマー骨格」は、少なくとも２つのホスホロチオエート結合（例えば、モノチオホスフェート）を有する化学的ポリマーである（例えば、糖サブユニット、環状サブユニット、またはアルキルサブユニットを一緒に連結する）。ホスホロチオエートポリマー骨格は、ホスホロチオエート糖ポリマーであり得、これは、ペントース糖の鎖の１つ以上（または全て）が核酸中に通常存在する塩基（核酸塩基）を欠いている、ホスホロチオエート核酸である。ホスホロチオエートポリマー骨格は、２つ以上のホスホロチオエート結合を含み得る。ホスホロチオエートポリマー骨格は、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上の結合を含み得、最大約１００個のホスホロチオエート結合を含有し得る。ホスホロチオエートポリマー骨格はまた、例えば、２００、３００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、１０，０００等、より多数の結合を含有してもよい。

【0019】

ホスホロチオエート核酸及びホスホロチオエートポリマー骨格は、部分的または完全にホスホロチオエート化され得る。例えば、ホスホロチオエート核酸のヌクレオチド間結合の５０％以上が、ホスホロチオエート結合であってもよい。場合によっては、ホスホロチオエート核酸のヌクレオチド間結合の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が、ホスホロチオエート結合である。場合によっては、ホスホロチオエート核酸のヌクレオチド間結合の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が、ホスホロチオエート結合である。場合によっては、ホスホロチオエート核酸のヌクレオチド間結合の７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が、ホスホロチオエート結合である。場合によっては、ホスホロチオエート核酸のヌクレオチド間結合の９０％、９５％、または９９％が、ホスホロチオエート結合である。実施形態において、残りのヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合である。実施形態において、残りのヌクレオチド間結合は、メチルホスホネート結合である。場合によっては、ホスホロチオエート核酸のヌクレオチド間結合の１００％が、ホスホロチオエート結合である。同様に、ホスホロチオエートポリマー骨格内の糖間結合の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が、ホスホロチオエート結合であり得る。場合によっては、ホスホロチオエートポリマー骨格内の糖間結合の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が、ホスホロチオエート結合であり得る。場合によっては、ホスホロチオエートポリマー骨格内の糖間結合の７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が、ホスホロチオエート結合であり得る。場合によっては、ホスホロチオエートポリマー骨格の糖間結合の９０％、９５％、または９９％が、ホスホロチオエート結合であり得る。実施形態において、残りのヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合である。実施形態において、残りのヌクレオチド間結合は、メチルホスホネート結合である。場合によっては、ホスホロチオエートポリマー骨格の糖間結合の１００％が、ホスホロチオエート結合であり得る。

【0020】

核酸は、非特異的配列を含み得る。本明細書に使用されるとき、「非特異的配列」という用語は、任意の他の核酸配列に相補的となるように設計されていないか、または部分的にのみ相補的である、一連の残基を含有する核酸配列を指す。例として、非特異的核酸配列は、細胞または生物と接触した際に阻害性核酸として機能しない核酸残基の配列である。「阻害性核酸」は、標的核酸（例えば、タンパク質に翻訳可能なｍＲＮＡ）に結合し、標的核酸の転写（例えば、ＤＮＡからｍＲＮＡ）を低減させるか、または標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を低減させるか、または転写産物のスプライシングを改変する（例えば、一本鎖モルホリノオリゴヌクレオチド）ことができる、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似体のポリマー）である。

【0021】

本明細書に提供されるホスホロチオエート核酸及びホスホロチオエートポリマー骨格は、１つ以上の反応性部分、例えば、共有結合反応性部分を含み得る。当該技術分野で既知のポリマーリンカー（図１９及び２０に示されるようなもの、または代替としてポリエチレングリコールリンカーもしくはその同等物）等の任意の適切なリンカーを使用して、反応性部分をホスホロチオエート核酸及びホスホロチオエートポリマー骨格の残りに結合させることができる。リンカーは、実施形態において、本明細書に記載される検出可能な標識を含み得る（すなわち、それに結合され得る）。本明細書に使用されるとき、「共有結合反応性部分」は、本明細書に記載されるように、細胞非透過性タンパク質のアミノ酸と化学的に反応して、共有結合を形成し、したがって、本明細書に提供されるコンジュゲートを形成することができる、化学的部分を指す。

【0022】

「標識化核酸またはオリゴヌクレオチド」は、核酸の存在を、核酸に結合した検出可能な標識の存在の検出により検出することができるように、リンカーもしくは化学結合を通じた共有結合、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、もしくは水素結合を通じた非共有結合のいずれかで、標識に結合したものである。あるいは、１対の結合パートナーの一方が他方（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）に結合する、高親和性相互作用を用いる方法によって、同じ結果を達成することができる。実施形態において、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、本明細書に開示され、当該技術分野において一般に既知であるように、検出可能な標識を含む。

【0023】

「生体試料」または「試料」は、対象または患者から得られたか、またはそれらに由来する材料を指す。生体試料は、生検及び剖検試料、ならびに組織学的目的で取得された凍結切片等の組織切片を含む。そのような試料には、血液及び血液分画もしくは生成物（例えば、血清、血漿、血小板、赤血球等）等の体液、唾液、組織、培養細胞（例えば、初代培養物、外植片、及び形質転換細胞）、糞便、尿、滑液、関節組織、滑膜組織、滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞、免疫細胞、造血細胞、線維芽細胞、マクロファージ、Ｔ細胞等が含まれる。生体試料は、典型的に、例えばチンパンジーもしくはヒト等の霊長類、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類、例えばモルモット、ラット、マウス、ウサギ等の哺乳動物等、または鳥類、爬虫類、または魚類といった真核生物から得られる。

【0024】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指して本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然のアミノ酸ポリマー及び非天然のアミノ酸ポリマーに適用される。

【0025】

「アミノ酸」という用語は、天然及び合成のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸に類似の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然のアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後から修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基を有する化合物、例えば、ホスホセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と類似の様式で機能する化学的化合物を指す。

【0026】

アミノ酸は、それらの広く知られた３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号のいずれかによって、本明細書において言及され得る。ヌクレオチドも同様に、それらの広く許容されている単一文字コードによって言及され得る。

【0027】

「標識」または「検出可能な部分」は、分光光度的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によって検出することができる組成物である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、電子高密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで広く使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに例えば放射標識を標的ペプチドに特異的に反応するペプチドもしくは抗体に組み込むことによって検出可能にすることができるタンパク質または他の実体が挙げられる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏに記載の方法を使用する等、抗体を標識に共役する当該技術分野で既知の任意の適切な方法が、用いられ得る。

【0028】

例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合、「組み換え」という用語は、その細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、実験室手法により修飾されているか、またはその結果であることを示す。したがって、例えば、組み換えタンパク質は、実験室手法によって生成されたタンパク質を含む。組み換えタンパク質は、そのタンパク質の天然（非組み換え）の形態においては見出されないアミノ酸残基を含み得るか、または修飾されている、例えば、標識されているアミノ酸残基を含み得る。

【0029】

核酸の部分に関して使用される場合、「異種」という用語は、その核酸が本来は互いに同じ関係性では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的に、組み換えで生成され、新しい機能性核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列、例えば、１つの源からのプロモータ及び別の源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が本来は互いに同じ関係性では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。

【0030】

「抗体」は、抗原に特異的に結合し、それを認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントに由来するフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらが、それぞれ、免疫グロブリンの分類ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを定義する。典型的には、抗体の抗原結合領域が、結合の特異性及び親和性において最も重要となる。いくつかの実施形態において、抗体または抗体のフラグメントは、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ラクダ等を含む異なる生物に由来し得る。本発明の抗体は、抗体の所望される機能（例えば、グリコシル化、発現、抗原認識、エフェクター機能、抗原結合、特異性等）を改善または調整するように、１つ以上のアミノ酸位において修飾または変異されている抗体を含み得る。

【0031】

例示的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を含む。各四量体は、それぞれが１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）と１つの「重鎖」（約５０～７０ｋＤ）を有する２つの同一なポリペプチド鎖対から構成される。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００～１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖及び重鎖を指す。

【0032】

抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼによる消化によって生成される多数の十分に特徴付けされたフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ－ＣＨ１に接合された軽鎖であるＦａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’２を生成する。Ｆ（ａｂ）’２は、緩やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を切断し、それによってＦ（ａｂ）’２二量体がＦａｂ’モノマーに変換され得る。Ｆａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ ｅｄ．，３ｄ ｅｄ．１９９３）を参照されたい。種々の抗体フラグメントは、インタクトな抗体の消化に関して定義されるが、当業者であれば、そのようなフラグメントが、化学的にか、または組み換えＤＮＡ手法を用いてのいずれかによって、デノボ合成され得ることを理解するであろう。したがって、抗体という用語はまた、本明細書に使用されるとき、完全な抗体の修飾によって生成されたか、または組み換えＤＮＡ手法を用いてデノボ合成された（例えば、一本鎖Ｆｖ）か、またはファージ提示ライブラリを用いて特定された（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照されたい）かのいずれかである、抗体フラグメントも含む。

【0033】

本発明及び本発明による使用に好適な抗体、例えば、組み換え、モノクローナル、またはポリクローナル抗体の調製については、当該技術分野で既知の多数の技法が使用され得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５）、Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，ｐｐ．７７－９６ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）、及びＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．１９８６）を参照されたい）。目的の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子を、ハイブリドーマからクローニングし、これを用いて組み換えモノクローナル抗体を生成することができる。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子ライブラリもまた、ハイブリドーマまたは形質細胞から作製することができる。重鎖及び軽鎖遺伝子産物の無作為な組み合わせにより、異なる抗原特異性を有する大きな抗体集団がもたらされる（例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３ｒｄ ｅｄ．１９９７）を参照されたい）。一本鎖抗体または組み換え抗体の生成のための技法（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）を、本発明のポリペプチドに対する抗体を生成するように適合させることができる。さらに、トランスジェニックマウスまたは他の動物等の他の生物を使用して、ヒト化抗体またはヒト抗体を発現させてもよい（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２－１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）、及びＬｏｎｂｅｒｇ＆Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５）を参照されたい）。あるいは、ファージ提示技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体及び異種Ｆａｂフラグメントを特定してもよい（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）を参照されたい）。抗体はまた、二特異性、すなわち、２つの異なる抗原を認識することができるように作製されてもよい（例えば、国際公開第ＷＯ９３／０８８２９号、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５－３６５９（１９９１）、及びＳｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）を参照されたい）。抗体はまた、異種コンジュゲート、例えば、共有結合で接合した２つの抗体、または免疫毒素であってもよい（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、国際公開第ＷＯ ９１／００３６０号、同第ＷＯ ９２／２００３７３号、及び欧州特許第ＥＰ０３０８９号を参照されたい）。

【0034】

非ヒト抗体をヒト化または霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｉｎｇ）するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，５３０，１０１号、同第５，８５９，２０５号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、同第５，７７７，０８５号、同第６，１８０，３７０号、同第６，２１０，６７１号、及び同第６，３２９，５１１号、国際公開第ＷＯ ８７／０２６７１号、欧州特許出願第０１７３４９４号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２、ならびにＶｅｒｈｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４を参照されたい）。ヒト化抗体はさらに、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３に記載されている。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上のアミノ酸残基が非ヒト源からそこに導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、移入残基と称され、これらは、典型的に、移入可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的に、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を対応するヒト抗体の配列と置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒ及び同僚らの方法に従って行われ得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７（１９８８）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５－９２（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９－４９８（１９９１）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，３１（３）：１６９－２１７（１９９４）を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ないものが、対応する非ヒト種由来の配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基及び可能性としていくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位に由来する残基によって置換されている、ヒト抗体である。例えば、ヒト化免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする第１の配列と、所望される免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第２の配列セットとを含むポリヌクレオチドは、合成で、または適切なｃＤＮＡとゲノムＤＮＡセグメントとを組み合わせることによって、生成することができる。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、種々のヒト細胞から周知の手順に従って単離することができる。

【0035】

「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかもしくは改変されたクラス、エフェクター機能、及び／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい特性を与える完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物等に連結されるように、定常領域またはその一部分が改変、置き換え、または交換されている抗体分子、あるいは（ｂ）可変領域またはその一部分が、異なるかまたは改変された抗原特性を有する可変領域と改変、置き換え、または交換されている、抗体分子である。本発明の好適な抗体及び本発明による使用に好適な抗体には、ヒト化及び／またはキメラモノクローナル抗体が含まれる。

【0036】

治療剤を抗体に共役させるための技法は、周知である（例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３－５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２^ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３－５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５－５０６（１９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９－５８（１９８２）を参照されたい）。

【0037】

抗体に「特異的に（もしくは選択的に）結合する」または「特異的に（もしくは選択的に）免疫反応する」という語句は、タンパク質またはペプチドに言及する際、しばしば、タンパク質または他の生物製剤の異種集団において、タンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定免疫アッセイ条件下において、示される抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、及びより典型的にはバックグラウンドの１０～１００倍で特定のタンパク質に結合する。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性に関して選択された抗体を必要とする。例えば、いくつかのポリクローナル抗体が、選択された抗原と特異的に免疫反応し、他のタンパク質とは免疫反応しないポリクローナル抗体のみを得るために選択され得る。この選択は、他の分子との交差反応する抗体を差し引くことによって達成され得る。種々の免疫アッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用される（例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイの形式及び条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照されたい）。

【0038】

本明細書に使用されるとき、「薬学的に許容される」という用語は、「生理学的に許容される」及び「薬理学的に許容される」と同義に使用される。薬学的組成物は、一般に、緩衝作用及び保管時の防腐のための薬剤を含み、また、投与経路に応じて、適切な送達のための緩衝液及び担体を含み得る。

【0039】

本明細書に使用されるとき、「癌」という用語は、白血病、癌腫、及び肉腫を含む、哺乳動物において見出される全ての種類の癌、新生物、または悪性腫瘍を指す。例示的な癌には、脳、胸部、頸部、結腸、頭頸部、肝臓、腎臓、肺、非小細胞肺、黒色腫、中皮腫、卵巣、肉腫、胃、子宮、髄芽細胞腫の癌が挙げられる。さらなる例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前悪性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、泌尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮内膜癌、副腎皮質癌、膵内分泌腺及び膵外分泌腺の新生物、ならびに前立腺癌が挙げられる。

【0040】

「白血病」という用語は、造血器官の進行性悪性疾患を広義に指し、一般には、血液及び骨髄中の白血球及びそれらの前駆体の偏った増殖及び成長を特徴とする。白血病は、一般に、（１）疾患の持続期間及び特徴－急性または慢性、（２）関与する細胞の種類、骨髄系（骨髄性）、リンパ系（リンパ性）、または単球系、ならびに（３）血液中の異常細胞の数の増加または非増加－白血病性または非白血病性（亜白血病性）に基づいて、臨床学的に分類される。Ｐ３８８白血病モデルは、インビボでの抗白血病活性を予測するものとして広く認められている。Ｐ３８８アッセイにおいて陽性反応を示す化合物は、一般に、治療されている白血病の種類に関わらずある程度の抗白血病活性レベルを示すと考えられる。したがって、本出願は、白血病を治療する方法、及び好ましくは、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球血症性白血病、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎児性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛細胞白血病、血芽球性白血病、血芽球細胞白血病、組織球性白血病、幹細胞白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、及び未分化細胞性白血病を治療する方法を含む。

【0041】

「肉腫」という用語は、一般に、胚結合組織のような物質で構成された腫瘍を指し、これは、一般には原線維または同質の物質に埋め込まれた緊密にぎっしり詰まった細胞から構成される。抗新生物性チオール結合ミトコンドリア酸化剤と抗癌剤との組み合わせで治療され得る肉腫には、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪性肉腫、脂肪肉腫、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色肉腫（ｃｈｌｏｒｏｍａ ｓａｒｃｏｍａ）、絨毛癌種、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉細胞肉腫、傍骨性骨肉腫、網状赤血球性肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、及び毛細血管拡張性肉腫が挙げられる。

【0042】

「黒色腫」という用語は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味する。抗新生物性チオール結合ミトコンドリア酸化剤と抗癌剤との組み合わせで治療され得る黒色腫としては、例えば、末端性黒子型黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング・パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、または表在拡大型黒色腫が挙げられる。

【0043】

「癌腫」という用語は、周囲組織に浸潤し、転移を生じる傾向にある上皮細胞に構成される悪性の新成長物を指す。抗新生物性チオール結合ミトコンドリア酸化剤と抗癌剤との組み合わせで治療され得る例示的な癌腫としては、例えば、細葉細胞癌腫、腺房癌腫、線嚢癌腫、腺様嚢胞癌腫、腺腫性癌腫、副腎皮質の癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞癌腫（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｉｃｎｏｍａ）、基底細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌腫、基底扁平細胞癌腫、気管支肺胞上皮癌腫、細気管支癌腫、気管支癌腫、大脳様癌腫、胆管細胞癌腫、絨毛癌腫、膠質癌腫、面皰癌腫、子宮体癌腫、篩状癌腫、鎧状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｎ ｃｕｉｒａｓｓｅ）、皮膚癌腫、円柱癌腫、円柱細胞癌腫、腺管癌腫（ｄｕｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、緻密癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｕｒｕｍ）、胎児性癌腫、脳様癌腫、類上皮癌腫（ｅｐｉｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮アデノイド癌腫、外向性癌腫、潰瘍癌腫、繊維癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｆｉｂｒｏｓｕｍ）、ゼラチン状癌腫（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｎｉ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌腫、巨細胞癌腫、巨大細胞癌腫、腺性癌腫、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫、血液様癌腫、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、硝子様癌腫、副腎様癌種（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、幼児胎児性癌腫、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌腫、上皮内癌腫（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロムペッヘル癌腫（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチツキー細胞癌腫（Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ－ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞癌腫、レンズ状癌腫（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪性癌腫（ｌｉｐｏｍａｔｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ上皮癌腫、髄様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌腫（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌腫、軟癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌腫（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘液性類表皮癌腫（ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液癌腫（ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽頭癌腫、燕麦細胞癌腫、骨化性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）、骨様癌腫、乳頭状癌腫、門脈周囲癌腫、前浸潤癌腫、有棘細胞癌腫、髄質様癌腫、腎臓の腎細胞癌腫、予備細胞癌腫、肉腫様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓａｒｃｏｍａｔｏｄｅｓ）、シュナイダー癌腫、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫、小細胞癌腫、ソラノイド癌腫（ｓｏｌａｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、スフェロイド細胞癌腫（ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、紡錘体細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌腫、扁平上皮細胞癌腫、ストリング癌腫（ｓｔｒｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、血管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌腫、結節癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌腫（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌腫、及び絨毛癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｖｉｌｌｏｓｕｍ）が挙げられる。

【0044】

本明細書に使用されるとき、「転移」、「転移性」、及び「転移癌」という用語は、互換的に使用され得、増殖性疾患または障害、例えば癌の１つの器官または別の非隣接器官または身体部位からの拡大を指す。癌は、起源となる部位、例えば、乳房で発生し、この部位は、原発性腫瘍、例えば、原発性乳癌と称される。原発性腫瘍または起源となる部位におけるいくつかの癌細胞が、局所領域内の周囲の正常な組織に透過及び浸潤する能力、ならびに／またはリンパ系または血管系の壁を透過し、その系を通って体内の他の部位及び組織を循環する能力を取得する。原発性腫瘍の癌細胞から形成される第２の臨床的に検出可能な腫瘍は、転移腫瘍または二次腫瘍と称される。癌細胞が転移する場合、転移腫瘍及びその細胞は、元の腫瘍のものと類似であると推定される。したがって、肺癌が乳房に転移すると、乳房の部位における二次腫瘍は、異常な乳房細胞ではなく、異常な肺細胞からなる。乳房内の二次腫瘍は、転移肺癌と称される。したがって、転移癌という語句は、対象が原発性腫瘍を有するかまたは過去に有しており、かつ１つ以上の二次腫瘍を有する、疾患を指す。非転移癌または転移性でない癌を有する対象という語句は、対象が原発性腫瘍を有するが１つ以上の二次腫瘍は有さない、疾患を指す。例えば、転移肺癌は、原発性肺腫瘍を有するか、またはその病歴を有し、かつ第２の位置または複数の位置、例えば乳房に、１つ以上の二次腫瘍を有する対象における疾患を指す。

【0045】

本明細書に使用されるとき、「自己免疫疾患」は、例えば、対象の体内に通常存在する物質、組織、及び／または細胞に対する、対象の免疫系による改変された免疫反応から生じる疾患または障害を指す。自己免疫疾患には、関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、強皮症、全身性強皮症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、若年発症性糖尿病、真性１型糖尿病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、乾癬、シェーグレン症候群、脈管炎、糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病、クローン病、潰瘍性大腸炎、水疱性類天疱瘡、サルコイドーシス、乾癬、魚鱗癬、グレーブス眼症、炎症性腸疾患、アジソン病、白斑、喘息、及びアレルギー性喘息が挙げられるがこれらに限定されない。

【0046】

本明細書に使用されるとき、「炎症性疾患」は、異常なまたは改変された炎症と関連する疾患または障害を指す。炎症は、病原体、損傷細胞もしくは組織、または刺激物質に応答して、治癒プロセスの一部として免疫系によって開始される生物学的応答である。慢性炎症は、種々の疾患を引き起こし得る。炎症性疾患には、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、喘息、リウマチ性関節炎、移植片拒絶、セリアック病、慢性前立腺炎、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、及び炎症性筋疾患が挙げられるがこれらに限定されない。

【0047】

本明細書に使用されるとき、「代謝障害」は、例えば、炭水化物、アミノ酸、有機酸を含む、種々の分子及び物質の異常な代謝を伴う疾患または障害を指す。代謝障害には、炭水化物代謝の障害、例えばグリコーゲン貯蔵疾患、アミノ酸代謝の障害、例えばフェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、１型グルタル酸血症、尿素回路代謝異常または尿素回路代謝不全、例えばカルバモイルリン酸シンテターゼＩ欠損症、有機酸代謝の障害（有機酸尿）、例えばアルカプトン尿症、脂肪酸酸化及びミトコンドリア代謝の障害、例えば中鎖アシル－コエンザイムＡデヒドロゲナーゼ欠損症、ポルフィリン代謝の障害、例えば急性間欠性ポルフィリン症、プリンまたはピリミジン代謝の障害、例えばレッシュ・ナイハン症候群、ステロイド代謝の障害、例えば先天性リポイド副腎過形成、先天性副腎過形成、ミトコンドリア機能の障害、例えばカーンズ・セイヤー症候群、ペルオキシソーム機能の障害、例えばツェルウェガー症候群、ならびにリソソーム貯蔵障害、例えばゴーシェ病及びニーマン・ピック病が挙げられるがこれらに限定されない。

【0048】

本明細書に使用されるとき、「発達障害」は、言語障害、学習障害、運動障害、及び神経発達障害と関連して、幼児期に発症する疾患または障害を指す。例としては、自閉症スペクトラム障害及び注意欠陥障害が挙げられるがこれらに限定されない。

【0049】

本明細書に使用されるとき、「心血管疾患」は、心臓、血管、またはこれらの両方と関連する疾患を指す。心血管疾患には、冠動脈心疾患、心筋症、高血圧性心疾患、心不全、不整脈、炎症性心疾患、末梢動脈心疾患、脳血管疾患、及び炎症性心疾患が挙げられるがこれらに限定されない。

【0050】

本明細書に使用されるとき、「肝疾患」は、肝臓及び／または肝機能における異常と関連する疾患を指す。肝疾患には、肝炎、アルコール性肝疾患、脂肪肝疾患、肝硬変、バッド・キアリ症候群、ジルベール症候群、及び癌が挙げられるがこれらに限定されない。

【0051】

本明細書に使用されるとき、「腸疾患」という用語は、腸（小腸または大腸）における異常と関連する疾患または障害を指す。腸疾患には、胃腸炎、大腸炎、回腸炎、虫垂炎、小児脂肪便症、クローン病、エンテロウイルス、過敏性腸症候群、及び憩室性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。

【0052】

本明細書に使用されるとき、「内分泌疾患」という用語は、内分泌腺の分泌過少、内分泌腺の分泌過多、及び腫瘍を含む、内分泌系の疾患または障害を指す。内分泌疾患には、アジソン病、糖尿病、コーン症候群、クッシング症候群、グルココルチコイド治療可能アルドステロン症、低血糖症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、甲状腺炎、下垂体機能低下症、性腺機能低下症、及び副甲状腺障害が挙げられるがこれらに限定されない。

【0053】

本明細書に使用されるとき、「神経障害」という用語は、構造的、生化学的、または電気的な異常を含む、身体の神経系の疾患または障害を指す。神経障害には、脳損傷、脳機能不全、脊髄障害、末梢神経障害、脳神経障害、自律神経系障害、発作性障害、運動障害、例えば、パーキンソン病及び多発性硬化症、ならびに中枢神経障害が挙げられるがこれらに限定されない。

【0054】

本明細書に使用されるとき、「感染性疾患」という用語は、宿主対象における病原性物質の感染、存在、及び／または成長と関連する疾患または障害を指す。感染性病原性物質には、ウイルス、細菌、真菌、原虫、多細胞性寄生生物、及び異常なタンパク質、例えば、プリオンが挙げられるがこれらに限定されない。感染性疾患と関連するウイルスには、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デング熱ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、黄熱ウイルス、エボラウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。感染性疾患と関連する細菌には、結核菌、サルモネラ菌種、大腸菌、クラミジア菌種、ブドウ球菌種、枯草菌種、及びシュードモナス菌種が挙げられるがこれらに限定されない。

【0055】

本明細書に使用されるとき、状態、疾患、もしくは障害、または状態、疾患、もしくは障害と関連する症状を「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」またはその「治療」は、臨床結果を含む、有益なまたは所望される結果を得るためのアプローチを指す。有益なまたは所望される臨床結果には、部分的であるか全体的であるかに関わらず、１つ以上の症状または状態の軽減または緩和、状態、障害、または疾患の範囲の縮小、状態、障害、または疾患の安定化、状態、障害、または疾患の発症の予防、状態、障害、または疾患の拡大の予防、状態、障害、または疾患の進行の遅延もしくは緩徐化、状態、障害、または疾患の発症の遅延または緩徐化、状態、障害、または疾患の状態の緩和または改善、ならびに寛解が挙げられ得るがこれらに限定されない。「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」はまた、対象の生存を、治療を行わなかった場合に予測されるものを上回って延長させることを意味し得る。「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」はまた、状態、障害、または疾患の進行を阻害すること、状態、障害、または疾患の進行を一時的に遅延させることを意味し得るが、いくつかの場合には、これは、状態、障害、または疾患の進行を恒久的に停止させることを伴う。本明細書に使用されるとき、治療、治療する（ｔｒｅａｔ）、または治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）という用語は、プロテアーゼの発現を特徴とする疾患もしくは状態の１つ以上の症状の作用、またはプロテアーゼの発現を特徴とする疾患または状態の症状を低減させる方法を指す。したがって、開示される方法において、治療は、確立された疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状の重症度における１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低減を指し得る。例えば、疾患を治療するための方法は、対象における疾患の１つ以上の症状に、対照と比較して１０％低減が存在する場合、治療と見なされる。したがって、低減は、本来のレベルまたは対照のレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％～１００％の任意のパーセントの低減であり得る。治療は、必ずしも、疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状の治癒または完全な除去を指すわけではないことを理解されたい。さらに、本明細書に使用されるとき、減少、低減、または阻害への言及には、対照レベルと比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の変化を含み、そのような用語は、必ずしも完全な排除を含むわけではない。

【0056】

本明細書に使用されるとき、「細胞透過性」または「細胞透過」という用語は、ある分子（例えば、タンパク質）が、有意または有効な量で細胞外環境から細胞内に入る能力を指す。したがって、細胞透過性コンジュゲートは、細胞外環境から膜を通って細胞内に入る分子である。

【0057】

本明細書に使用されるとき、「細胞非透過性」または「細胞非透過」という用語は、ある分子が、有意または有効な量で細胞外環境から細胞内に入ることができないことを指す。したがって、細胞非透過性ペプチドまたはタンパク質は、一般に、細胞外環境から膜を通って細胞内に入り、細胞集団、器官、または生物に対して有意な生物学的作用を達成することができない。この用語は、少数のペプチドまたはタンパク質のうちの１つ以上が細胞に入り得る可能性を排除するものではない。しかしながら、この用語は、一般には細胞外環境から有意な程度で細胞内に入ることができない分子を指す。細胞非透過性分子及び物質の例としては、例えば、高分子量タンパク質等の大型分子が挙げられるがこれに限定されない。ペプチドまたはタンパク質は、当業者に既知の方法を使用して、細胞非透過性であることを判定することができる。例として、ペプチドまたはタンパク質に蛍光標識を行うことができ、このペプチドまたはタンパク質が細胞外環境から細胞内に入る能力を、サイトメトリー分析または共焦点顕微鏡法によってインビトロで判定することができる。いくつかの実施形態において、「細胞非透過性タンパク質」は、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格に結合した同じタンパク質よりも、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０，０００、または１００，０００倍少なく細胞を透過するタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、「細胞非透過性タンパク質」は、測定可能な程には細胞を透過しないタンパク質を指す。

【0058】

本明細書に使用されるとき、「分子量」（Ｍ．Ｗ．）または「分子質量」は、分子中の全ての原子の原子量の合計を指す。分子に関して、高分子量を有する分子は、典型的に、２５ｋＤａ以上の分子量を有する。例として、高分子量のタンパク質は、約２５ｋＤａ～１０００ｋＤａ以上の分子量を有し得る。

【0059】

本明細書に使用されるとき、「細胞内」という用語は、細胞の内部を意味する。本明細書に使用されるとき、「細胞内標的」は、細胞の内部に位置する標的、例えば、核酸、ポリペプチド、または他の分子（例えば、炭水化物）であり、本明細書に提供される細胞非透過性タンパク質が結合する標的である。結合は、直接的または間接的であり得る。場合によっては、細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に選択的に結合する。選択的に結合する、選択的に結合している、または特異的に結合するとは、その物質（例えば、細胞非透過性タンパク質）が、他の物質を部分的または完全に除き、１つの物質（例えば、細胞内標的）に結合していることを指す。結合とは、アッセイ方法のバックグラウンドの少なくとも約１．５倍の検出可能な結合を意味する。選択的または特異的結合に関しては、そのような検出可能な結合が、所与の物質では検出され得るが、対照の物質では検出することができない。代替または追加として、結合の検出は、下流の分子または事象の存在をアッセイすることによって判定することができる。

【0060】

本明細書に使用されるとき、「コンジュゲート」という用語は、原子または分子間の会合を指す。会合は、直接的または間接的であり得る。例えば、核酸とタンパク質との間のコンジュゲートは、直接的、例えば共有結合によるものであってもよく、または間接的、例えば非共有結合（静電相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ハロゲン結合）、ファンデルワールス相互作用（例えば、双極子－双極子、双極子誘起双極子、ロンドン分散）、環集積（π作用）、疎水性相互作用等）によるものであってもよい。場合によっては、コンジュゲートは、求核置換（例えば、アミン及びアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素－炭素及び炭素－ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールズ・アルダー付加）が挙げられるがこれらに限定されない共役化学反応を使用して形成される。これら及び他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６、及びＦｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２に考察されている。実施形態において、ホスホロチオエート核酸及びホスホロチオエート骨格ポリマーは、ホスホロチオエート核酸及びホスホロチオエート骨格ポリマーの構成成分（例えば、モノチオホスフェート）とタンパク質の構成成分（例えば、アミノ酸）との間の非共有結合的化学反応を通じて、タンパク質に非共有結合で結合する。他の実施形態において、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエート骨格ポリマーは、本明細書に記載されるように、１つ以上の反応性部分、例えば、共有結合反応性部分（例えば、ビニルスルホン部分（－Ｓ（Ｏ）_２ＣＨ＝ＣＨ_２）等のアミノ酸反応性部分）を含む。

【0061】

共有結合反応性部分または官能基を含む、本明細書に記載の共役化学反応に使用される有用な反応性部分には、例えば、次のものが挙げられる；
（ａ）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、及び芳香族エステルを含むがこれらに限定されない、カルボキシル基及びその種々の誘導体、
（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒド等に変換され得るヒドロキシル基、
（ｃ）ハロゲン化物が、後に、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオン等の求核基で置き換えられ、それによってハロゲン分子の部位に新しい基の共有結合をもたらすことができる、ハロアルキル基、
（ｄ）例えば、マレイミド基等、ディールズ・アルダー反応に関与し得る求ジエン基、
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、もしくはオキシム等のカルボニル誘導体の形成を介して、またはグリニャール付加もしくはアルキルリチウム付加等の機序を介して後続の誘導体化が可能となるような、アルデヒドまたはケトン基、
（ｆ）後でアミンと反応して、例えば、スルホンアミドを形成するためのハロゲン化スルホニル基、
（ｇ）ジスルフィドへの変換、ハロゲン化アシルとの反応、または金等の金属への結合が可能なチオール基、
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化、または酸化が可能なアミンまたはスルフヒドリル基、
（ｉ）例えば、環付加、アシル化、マイケル付加反応等を受け得るアルケン、
（ｊ）例えば、アミン及びヒドロキシル化合物と反応し得るエポキシド、
（ｋ）核酸合成に有用なホスホラミダイト及び他の標準的な官能基、
（ｌ）金属酸化ケイ素結合、
（ｍ）例えば、リン酸ジエステル結合を形成するための反応性亜リン酸基（例えば、ホスフィン）への金属結合、及び
（ｎ）スルホン、例えば、ビニルスルホン。

【0062】

反応性官能基は、それらが、本明細書に記載されるタンパク質の化学的安定性に関与せず、それを妨げることもないように選択され得る。例として、核酸は、ビニルスルホンまたは他の反応性部分を含み得る。図２１は、Ｓ－Ｓ－Ｒ部分を有する核酸からの、ビニルスルホン反応性部分を有する核酸の形成を示す図であり、式中、Ｒは、－（ＣＨ_２）_６－ＯＨである。図２２は、末端リン酸塩（ＰＳ）を有する核酸からの、ビニルスルホンを有する核酸の形成を示す図である。

【0063】

細胞透過性コンジュゲートが本明細書に提供される。本コンジュゲートは、ホスホロチオエート核酸に結合した細胞非透過性タンパク質を含み、このホスホロチオエート核酸が、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する。場合によっては、各ホスホロチオエート核酸は、非特異的配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞非透過性タンパク質は、ホスホロチオエートポリマー骨格に結合する。したがって、ホスホロチオエートポリマー骨格に結合した細胞非透過性タンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートが本明細書に提供され、このホスホロチオエートポリマー骨格が、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する。上述のように、ポリマー骨格は、このポリマー骨格が核酸配列中に通常存在する塩基を欠くことを除き、核酸配列と同じ構造を含む（すなわち、一緒に連結した２つ以上の糖残基の鎖を含む）。細胞透過性コンジュゲートを含む細胞もまた、提供される。

【0064】

ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、任意の適切な長さのものであり得る。場合によっては、各ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、独立して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上の核酸残基または糖残基の長さである。場合によっては、各ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、独立して、１０～３０残基の長さである。したがって、各核酸またはポリマー骨格の長さは、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上の核酸残基または糖残基の長さであり得る。場合によっては、各ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、独立して、５～５０、１０～５０、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、５～７５、１０～７５、１５～７５、２０～７５、２５～７５、３０～７５、３５～７５、４０～７５、４５～７５、５０～７５、５５～７５、６０～７５、６５～７５、７０～７５、５～１００、１０～１００、１５～１００、２０～１００、２５～１００、３０～１００、３５～１００、４０～１００、４５～１００、５０～１００、５５～１００、６０～１００、６５～１００、７０～１００、７５～１００、８０～１００、８５～１００、９０～１００、９５～１００、またはそれ以上の残基の長さである。場合によっては、各ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、独立して、１０～１５、１０～２０、１０～３０、１０～４０、または１０～５０残基の長さである。

【0065】

場合によっては、あるホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格の長さは、別のホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格とは異なる。例として、２つのホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格が細胞非透過性タンパク質に結合する場合、第１のホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、ある長さ（例えば、２２残基）のものであり得、第２のホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、異なる長さ（例えば、２５残基）のものであり得る。したがって、複数のホスホロチオエート核酸及びホスホロチオエートポリマー骨格が細胞非透過性タンパク質に結合する場合、ホスホロチオエート核酸及びホスホロチオエートポリマー骨格は、いくつかの異なる長さ、例えば、１０～３０残基の範囲の長さを有してもよい。

【0066】

場合によっては、複数のホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格が、細胞非透過性タンパク質に結合する。場合によっては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上のホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格が、タンパク質に結合する。実施形態において、結合は、共有結合である。結合は、非共有結合であってもよい。ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、独立して、細胞非透過性タンパク質のリジン、アルギニン、システイン、またはヒスチジンに結合し得る。場合によっては、各ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、タンパク質のシステインに結合する。場合によっては、タンパク質は、このタンパク質のリジン、アルギニン、システイン、ヒスチジン、またはこれらの組み合わせのうちの１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、または１００％に結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエート骨格を含む。

【0067】

上述のように、核酸、例えば、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）ポリマー骨格は、種々の機序を通じて細胞非透過性タンパク質に結合し得る。ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、細胞非透過性タンパク質に共有結合または非共有結合で結合し得る。場合によっては、複数のホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格がタンパク質に結合する場合、これらの複数のもののそれぞれは、共有結合または非共有結合でタンパク質に結合し得る。場合によっては、タンパク質は、共有結合及び非共有結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格を含む。場合によっては、タンパク質は、共有結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格を含み、非共有結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は含まない。場合によっては、タンパク質は、非共有結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格を含み、共有結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格を含まない。ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格のそれぞれは、細胞非透過性タンパク質へのホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格の結合を促進する、反応性部分、例えば、アミノ酸反応性部分または共有結合反応性部分を含み得る。したがって、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、反応性部分を通じてタンパク質に結合し得る。

【0068】

本明細書に提供される細胞透過性コンジュゲートは、未結合の細胞非透過性タンパク質と未結合のホスホロチオエート核酸または未結合のホスホロチオエートポリマー骨格とを接触させ、未結合のホスホロチオエート核酸または未結合のホスホロチオエートポリマー骨格が未結合の細胞非透過性タンパク質のアミノ酸に共有結合で結合することを可能にし、それによって結合させて、該細胞透過性コンジュゲートを形成することによって作製され得る。細胞透過性コンジュゲートを作製する文脈において使用される「未結合の」という用語の使用は、結合及びコンジュゲートの形成前の細胞非透過性タンパク質、ホスホロチオエート核酸、またはホスホロチオエートポリマー骨格の状態を示すことを意図する。すなわち、「未結合の」という用語は、細胞非透過性タンパク質、ホスホロチオエート核酸、またはホスホロチオエートポリマー骨格が、遊離しており、細胞透過性コンジュゲート内でのそれらの会合した形態と比較して、それらの未結合の状態にあることを示す。

【0069】

実施形態において、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、共有結合反応性部分を含む。上述のように、共有結合反応性部分は、タンパク質のリジン、アルギニン、システイン、またはヒスチジンと（例えば、アミノ酸側鎖と）反応し得る。実施形態において、共有結合反応性部分は、システインと反応する。共有結合反応性部分は、ビニルスルホンであり得る。

【0070】

実施形態において、本明細書に提供される細胞透過性コンジュゲートは、未結合の細胞非透過性タンパク質を未結合のホスホロチオエート核酸または未結合のホスホロチオエートポリマー骨格と接触させ、未結合のホスホロチオエート核酸または未結合のホスホロチオエートポリマー骨格が未結合の細胞非透過性タンパク質に結合するのを可能にし、それによって結合させて、細胞透過性コンジュゲートを形成することによって作製することができる。

【0071】

本明細書に提供されるこの実施形態または他の実施形態において、ホスホロチオエート核酸、ホスホロチオエートポリマー骨格、未結合のホスホロチオエート核酸、または未結合のホスホロチオエートポリマー骨格は、式－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｚ－ＯＨを有する置換基を含み得、式中、ｚは、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、１～１０、または１～５の整数である。変数ｚは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。変数ｚは、１、２、３、４、５、６、７、８、または９であり得る。変数ｚは、１、２、３、４、５、６、７、または８であり得る。変数ｚは、１、２、３、４、５、６、または７であり得る。変数ｚは、１、２、３、４、５、または６であり得る。

【0072】

実施形態において、未結合のホスホロチオエート核酸または未結合のホスホロチオエートポリマー骨格を、細胞非透過性タンパク質と接触させる場合、この接触は、還元条件下で行われる。接触はまた、約９．０、８．５、８．０、７．９、７．８、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、７．２、７．１、または７．０未満のｐＨで行われ得る。実施形態において、ｐＨは、８．０未満である。実施形態において、ｐＨは、７．９未満である。実施形態において、ｐＨは、７．８未満である。実施形態において、ｐＨは、７．７未満である。実施形態において、ｐＨは、７．６未満である。実施形態において、ｐＨは、７．５未満である。実施形態において、ｐＨは、７．４未満である。実施形態において、ｐＨは、７．３未満である。実施形態において、ｐＨは、７．２未満である。実施形態において、ｐＨは、７．１未満である。実施形態において、ｐＨは、７．０未満である。実施形態において、接触は、還元条件下及び約８．０未満（例えば、約７．９、７．８、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、７．２、７．１、または７．０）のｐＨで行われる。

【0073】

実施形態において、未結合のホスホロチオエート核酸または未結合のホスホロチオエートポリマー骨格は、未結合の細胞非透過性タンパク質がモル過剰である（例えば、接触の時点で）状態で存在する。モル過剰は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００倍等、約２～１００倍の過剰であり得る。実施形態において、約２～９０、３～８０、４～７０、５～６０、６～５０、７～４０、８～３０、９～３０、１０～３０、１５～２５、または約２０のモル過剰。実施形態において、モル過剰は、約１０、２０、または３０である。実施形態において、モル過剰は、約２０である。実施形態において、モル過剰は、少なくとも約５である。実施形態において、モル過剰は、少なくとも約１０である。実施形態において、モル過剰は、少なくとも約１５である。実施形態において、モル過剰は、少なくとも約２０である。

【0074】

本明細書に提供される任意の態様の実施形態において、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、式Ｓ－Ｓ－Ｒを有する反応性部分を含み、式中、Ｒは保護基である。場合によっては、Ｒは、ヘキサノール（一価置換基）である。本明細書に使用されるとき、ヘキサノールという用語は、式Ｃ_６Ｈ_１３ＯＨを有する化合物を含み、これには、１－ヘキサノール、２－ヘキサノール、３－ヘキサノール、２－メチル－１－ペンタノール、３－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－１－ペンタノール、２－メチル－２－ペンタノール、３－メチル－２－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、２－メチル－３－ペンタノール、３－メチル－３－ペンタノール、２，２－ジメチル－１－ブタノール、２，３－ジメチル－１－ブタノール、３，３－ジメチル－１－ブタノール、２，３－ジメチル－２－ブタノール、３，３－ジメチル－２－ブタノール、及び２－エチル－１－ブタノールが含まれる。場合によっては、Ｒは、１－ヘキサノールである。

【0075】

提供される細胞透過性コンジュゲートは、細胞非透過性タンパク質をホスホロチオエート核酸と接触させ、ホスホロチオエート核酸がタンパク質に結合することを可能にすることによって作製され得る。例として、提供される細胞透過性コンジュゲートは、細胞非透過性タンパク質をホスホロチオエート核酸と接触させ、ホスホロチオエート核酸がタンパク質のアミノ酸に共有結合で結合することを可能にすることによって作製され得る。場合によっては、ホスホロチオエート核酸は、反応性部分を含む。例として、反応性部分は、上述のように、ビニルスルホンまたは式Ｓ－Ｓ－Ｒを有する反応性部分であり得る。場合によっては、Ｒは、ヘキサノール、例えば、１－ヘキサノールである。式Ｓ－Ｓ－Ｒの反応性部分を有する例示的なホスホロチオエート核酸は、図１９に示され、ビニルスルホン反応性部分を有する例示的なホスホロチオエート核酸は、図２０に示される。接触は、場合によっては、還元条件下で行われるが、当業者に既知の他の条件下で行われてもよい。場合によっては、ホスホロチオエート核酸は、細胞非透過性タンパク質がモル過剰である状態で存在する。

【0076】

場合によっては、細胞非透過性タンパク質は、高分子量タンパク質である。細胞非透過性タンパク質は、場合によっては、少なくとも約２５ｋＤ以上の分子量を有する。いくつかの実施形態において、細胞非透過性タンパク質は、少なくとも約２５～少なくとも約７５０ｋＤの分子量を有する。したがって、細胞非透過性タンパク質は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、またはそれ以上のキロダルトン（ｋＤ）の分子量を有し得る。場合によっては、細胞非透過性タンパク質は、少なくとも約２５～１００ｋＤ、少なくとも約２５～１５０ｋＤ、少なくとも約２５～２００ｋＤ、少なくとも約２５～２５０ｋＤ、少なくとも約２５～３００ｋＤ、少なくとも約２５～３５０ｋＤ、少なくとも約２５～４００ｋＤ、少なくとも約２５～４５０ｋＤ、少なくとも約２５～５００ｋＤ、少なくとも約２５～５５０ｋＤ、少なくとも約２５～６００ｋＤ、少なくとも約２５～６５０ｋＤ、少なくとも約２５～７００ｋＤ、または少なくとも約２５～７５０ｋＤの分子量を有する。

【0077】

場合によっては、細胞非透過性タンパク質は、抗体である。上により詳細に記載されるように、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥ抗体等の全長抗体であってもよく、またはそれらのフラグメントであってもよい。場合によっては、抗体は、ＩｇＧ抗体またはそのフラグメントである。場合によっては、抗体は、Ｆｖフラグメントまたはヒト化抗体である。したがって、ホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格に結合した抗体が提供され、このホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格が、細胞内への抗体の送達を強化する。場合によっては、抗体は、治療抗体、すなわち、疾患の治療に使用される抗体である。したがって、１つ以上のホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格に結合した治療抗体であって、細胞内標的に結合する抗体もまた提供される。

【0078】

場合によっては、細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合する。細胞内標的は、細胞内に位置する治療標的または診断標的または他の目的の標的、例えば、例として共焦点顕微鏡法によって撮像される標的または構造、例えばヒストンであり得る。したがって、細胞内標的に結合する細胞透過性コンジュゲートが提供される。場合によっては、細胞内標的は、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患、神経障害、または癌からなる群から選択される疾患の標的である。疾患の標的は、診断標的または治療標的または疾患と関連する他の目的の標的であり得る。癌の例示的な細胞内標的には、ＳＴＡＴ（例えば、ＳＴＡＴ３）、ＮＦκＢ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、Ｍｙｃファミリーメンバー、ステロイドホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体）、ステロイドホルモン受容体のリガンド（例えば、サイクリンＤ１）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、Ｓｒｃファミリーメンバー、Ｒａｓ、Ａｂｌ、ＢＣＲ－Ａｂｌ、ＮＰＭ－Ａｌｋ、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）、ブルトンチロシンキナーゼ（Ｂｒｕｔｕｎ’ｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）（ＢＴＫ）、及びウイルス腫瘍性タンパク質（例えば、ＥＢＶタンパク質またはＨＰＶタンパク質、例えばＥ６及びＥ７）が挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、感染性疾患の細胞内標的は、ウイルスタンパク質またはウイルス転写産物である。したがって、細胞内標的は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、または肝炎ウイルスのウイルスタンパク質またはウイルス転写産物であり得る。場合によっては、細胞内標的は、転写因子、転写エンハンサー、転写リプレッサー、ヒストン、または翻訳後修飾ヒストンを含むがこれらに限定されない、ＤＮＡ結合タンパク質である。場合によっては、細胞内標的は、後成的に修飾されたＤＮＡ、例えば、メチル化またはヒドロキシメチル化シトシン（５ｍＣまたは５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）、及び５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）である。場合によっては、細胞内標的は、核酸、例えば、ＲＮＡ転写産物または核酸である。例えば、細胞内標的は、感染性病原体、例えば、寄生生物、ウイルス、または細菌の核酸であり得る。場合によっては、細胞内標的は、シグナル伝達分子または転写因子である。場合によっては、シグナル伝達分子は、ホスファターゼまたはキナーゼである。場合によっては、細胞内標的は、癌標的であるか、または癌細胞内に位置する。場合によっては、細胞内標的は、ＳＴＡＴ、例えば、ＳＴＡＴ３、またはエクスポーチン７である。場合によっては、細胞非透過性タンパク質は、タンパク質に結合した標識、小分子、または機能性核酸をさらに含む。

【0079】

ホスホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格に結合した細胞非透過性タンパク質を含む、複数の細胞透過性コンジュゲートが提供され、このホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格が、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する。ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、細胞非透過性タンパク質に共有結合または非共有結合で結合する。場合によっては、この複数のものは、共通結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格を含み、非共有結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格を有するタンパク質を含まない。場合によっては、ホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格は、細胞非透過性タンパク質に非共有結合で結合し、この複数のものは、共有結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格を有するタンパク質を含まない。いくつかの実施形態において、この複数のものは、非共有結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格を含むタンパク質のうちの１つ以上、ならびに共有結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格を含むタンパク質のうちの１つ以上１つ以上を含む。したがって、この複数のものは、非共有結合及び共有結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格を含むタンパク質を含み得る。さらに、各コンジュゲートは、非共有結合及び／または共有結合で結合したホスホロチオエート核酸またはホスホロチオエートポリマー骨格を含むタンパク質を含み得る。

【0080】

提供される細胞透過性コンジュゲートのうちの１つ以上を含む細胞が提供され、例えば、細胞は、複数の細胞透過性コンジュゲートを含み得る。場合によっては、コンジュゲートは、細胞内で細胞内標的に結合する。例として、細胞は、１つ以上のホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格に結合した、第１の細胞非透過性タンパク質及び第２の細胞非透過性タンパク質を含み得る。第１及び第２の細胞非透過性タンパク質は、細胞内で細胞内標的に結合し得る。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、第１の細胞非透過性タンパク質と比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する。場合によっては、第１及び／または第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である。したがって、第１及び第２の細胞非透過性タンパク質は、同じタンパク質または異なるタンパク質であり得る。

【0081】

細胞透過性コンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物が、本明細書に提供される。提供される組成物は、場合によっては、製剤化及びインビトロまたはインビボでの投与に好適である。好適な担体及び賦形剤、ならびにそれらの製剤化は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。薬学的に許容される担体とは、生物学的またはその他の点で有害でない材料を意味する、すなわち、この材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことも、それが含有される薬学的組成物の他の構成成分と有害な様式で相互作用することもなく、対象に投与される。対象に投与される場合、担体は、場合によっては、活性成分の分解を最小化させ、対象における有害な副作用を最小化させるように選択される。

【0082】

提供される組成物は、単一の薬剤または１つを上回る薬剤を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、１つ以上のホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格に結合した第２の細胞非透過性タンパク質をさらに含む。したがって、１つ以上のホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格に結合した第１の細胞非透過性タンパク質を含む第１の細胞透過性コンジュゲートと、１つ以上のホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格に結合した第２の細胞非透過性タンパク質を含む第２の細胞透過性コンジュゲートとを含む組成物が本明細書に提供される。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合する。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、第１の細胞非透過性タンパク質と比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する。場合によっては、第１及び／または第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である。第１及び第２の細胞非透過性タンパク質は、同じタンパク質または異なるタンパク質であり得る。

【0083】

投与のための組成物には、一般に、薬学的に許容される担体中、好ましくは水性担体中に溶解された、本明細書に記載される薬剤が含まれるであろう。種々の水性担体、例えば、緩衝食塩水等が使用され得る。これらの溶液は滅菌であり、通常、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来的な周知の滅菌技法によって滅菌され得る。組成物は、生理学的条件を適正にするために、必要に応じて、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、毒性調節剤等といった薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含有し得る。これらの製剤中の活性剤の濃度は、広範に変動し得、主として、選択される特定の投与形式及び対象の必要性に応じて、流体の量、粘度、体重等に基づいて選択されるであろう。

【0084】

遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液が、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に混合した水中で調製され得る。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中、ならびに油中で調製され得る。保管及び使用の通常の条件下において、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために保存剤を含有し得る。

【0085】

薬学的組成物は、鼻腔内または吸入用の溶液またはスプレー、エアロゾル、もしくは吸入剤によって送達されてもよい。鼻腔用溶液は、液滴またはスプレーの形態で鼻道に投与されるように設計された水溶液であり得る。鼻腔用溶液は、多くの点で鼻腔内分泌物に類似するように調製され得る。したがって、鼻腔用溶液は、通常、等張性であり、ｐＨ５．５～６．５を維持するようにわずかに緩衝化される。加えて、眼科用調製物及び適切な薬物安定剤に使用されるものに類似の抗微生物保存剤が、必要に応じて、製剤中に含まれてもよい。様々な市販の鼻腔用調製物が既知であり、例えば、抗生物質及び抗ヒスタミン剤が含まれる。

【0086】

経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の賦形剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤、または粉末の形態をとり得る。いくつかの実施形態において、経口薬学的組成物は、不活性希釈剤もしくは吸収可能な食用担体を含むことになるか、またはそれらは硬もしくは軟ゼラチンカプセルに封入されてもよく、またはそれらは錠剤に圧縮されてもよく、またはそれらは食事に直接組み込まれてもよい。経口治療的投与については、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハ等の形態で使用され得る。このような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有するべきである。組成物及び調製物の割合は、当然ながら、多様であり得、従来的には、単位重量の約２～約７５％、または好ましくは２５～６０％であり得る。そのような組成物中の活性化合物の量は、好適な投薬量を得ることができるようなものである。

【0087】

水溶液中での非経口投与については、例えば、溶液は、好適に緩衝化される必要があり、液体希釈剤がまず十分な食塩水またはグルコースで等張化される。水溶液、具体的には滅菌水性媒体が、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に好適である。例えば、１回の投薬量が、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解され、１０００ｍｌの皮下注入液中に添加されるか、または提案された注入部位に注射され得る。

【0088】

滅菌注射可能溶液は、必要とされる量の活性化合物または構築物を適切な溶媒中に組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、基本的な分散媒を含有する滅菌ビヒクル中に種々の滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。活性成分に加えて追加の所望される成分の粉末をもたらす真空乾燥及び凍結乾燥技法を使用して、滅菌注射可能溶液の再構成のための滅菌粉末を調製してもよい。直接的な注射のための、さらにまたは高度に濃縮された溶液の調製もまた企図される。ＤＭＳＯが、極めて急速な透過のための溶媒として使用され、高濃度の活性成分を小さな領域に送達することができる。

【0089】

化合物の製剤は、単位用量または複数回用量の密封容器、例えば、アンプル及びバイアル中に提示され得る。したがって、組成物は、単位剤形であり得る。このような形態では、調製物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に部分的に分割される。したがって、組成物は、投与の方法に応じて種々の単位投薬形態で投与され得る。例えば、経口投与に好適な単位剤形には、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、及びロゼンジが挙げられるがこれらに限定されない。

【0090】

組成物は、当該技術分野で既知の手順を用いることによって、投与後に迅速な、持続した、または遅延した放出を提供するように製剤化され得る。ある特定の担体が、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度に応じて、より好ましい場合がある。提供される組成物での使用に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に見出すことができる。

【0091】

提供されるコンジュゲート及び／または組成物のうちの１つ以上と、使用のための説明書とを含むキットが、本明細書に提供される。したがって、１つ以上の細胞透過性コンジュゲートまたはこのコンジュゲートを含む薬学的組成物と、使用のための説明書とを含むキットが、提供される。場合によっては、キットは、１つ以上のホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格に結合した第２の細胞非透過性タンパク質をさらに含む。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、別個の容器内にある。場合によっては、キットは、第１の細胞透過性コンジュゲートと第２の細胞透過性コンジュゲートとを含む。場合によっては、第１及び第２の細胞透過性コンジュゲートは、別個の容器内にある。場合によっては、第２の細胞透過性コンジュゲートの第２の細胞非透過性タンパク質は、第１の細胞透過性コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質と比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞非透過性タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物として製剤化される。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である。場合によっては、キットは、疾患の１つ以上の症状を治療または予防するための１つ以上の追加の薬剤を含む。場合によっては、キットは、例えば、シリンジ、針、チューブ、カテーテル、パッチ等といった、組成物を投与するための手段を含む。キットはまた、使用前に滅菌及び／または希釈を必要とする製剤及び／または材料を含んでもよい。

【0092】

細胞非透過性タンパク質を細胞内に送達する方法であって、細胞を細胞透過性コンジュゲートと接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。ホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格に結合した細胞非透過性タンパク質を含む細胞透過性コンジュゲート。ホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格は、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する。場合によっては、細胞非透過性タンパク質は、細胞質内の核タンパク質に結合し、それによって、細胞非透過性タンパク質－核タンパク質複合体を形成する。場合によっては、細胞非透過性タンパク質－核タンパク質複合体は、細胞の核に進入することができない。

【0093】

場合によっては、細胞透過性コンジュゲートは、対象における疾患を診断するために使用される。したがって、対象における疾患を診断する方法であって、対象に、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートまたは細胞透過性コンジュゲートを含む組成物の有効量を投与することを含む、方法が提供される。コンジュゲートの投与により、対象における疾患または疾患の１つ以上の症状を診断する。開示される方法は、バイオマーカー、例えば、疾患の細胞内標的のレベルまたは活性を、試験試料と対照試料とで比較することを伴う。上述のように、対照試料または値は、試験試料との比較のための参照、通常は既知の参照として機能する試料を指す。対照はまた、類似の個体、例えば、類似の病歴、同じ年齢、体重等を有する癌患者または健常な個体の集団から集めた平均値を表してもよい。対照値はまた、同じ個体から、例えば、疾患前または治療前の早い段階で得られた試料から取得されてもよい。また上述のように、診断とは、疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性自己免疫疾患、癌、感染性疾患、免疫疾患、または他の疾患）が対象に存在する相対的可能性を指す。

【0094】

疾患の危険因子の決定に関して、比較する、相関する、及び関連するという用語は、ある個体における危険因子の存在または量（例えば、疾患の細胞内標的の量）を罹患していることが既知の人物、または疾患の危険性にあることが既知の人物、または疾患がないことが既知の人物におけるその存在または量と比較し、アッセイ結果（複数可）に基づいて疾患を有する／発症する可能性の増加または減少を個体に割り当てることを指す。

【0095】

細胞において細胞内標的を検出する方法であって、細胞を細胞透過性コンジュゲートと接触させ、細胞透過性コンジュゲートと細胞内標的との結合を検出することを含み、細胞透過性コンジュゲートが、ホスホロチオエート核酸に結合した細胞非透過性タンパク質を含み、ホスホロチオエート核酸が、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する、方法もまた、本明細書に提供される。細胞は、固定細胞または生細胞であり得る。場合によっては、細胞は、インビトロまたはインビボに位置する。結合は、直接的または間接的に検出することであり得る。多数の方法が、細胞透過性コンジュゲートがその細胞内標的に結合することを検出するために使用され得ることが理解され、企図される。例えば、結合は、細胞透過性コンジュゲートとその細胞内標的との間のカップリングをアッセイすることによって直接的に検出され得る。結合は、例えば、以下に記載されるような免疫共沈降アッセイ、共局在化アッセイ、または蛍光偏光アッセイからなる群からアッセイを選択することによって、判定され得る。これらのアッセイは、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３^ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）、Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４６１：７３５－４４（２００８）、Ｎｉｃｋｅｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ４７（１）：５３－６２（２００９）、及びＺｉｎｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４０（４）：１０１－１１（２００７）を参照されたい。

【0096】

場合によっては、結合は、撮像方法またはシステムによって判定される。したがって、提供される細胞透過性コンジュゲートはまた、細胞内標的レベル及び／または活性を分析するための撮像用途または他の用途で使用されてもよい。例えば、提供される細胞透過性コンジュゲートは、目的の細胞内標的のインビトロまたはインビボでの撮像に使用され得る。場合によっては、細胞透過性コンジュゲートは、生細胞撮像に使用される。例えば、生細胞撮像は、生細胞内での細胞内標的の分布及び／または動態を監視するために使用することができ、また、標的相互作用の監視にも適用できる。例えば、細胞透過性コンジュゲートは、細胞、場合によっては生細胞におけるタンパク質間の相互作用を研究するために、免疫沈降及び免疫共沈降アッセイで使用され得る。場合によっては、細胞透過性コンジュゲートは、フローサイトメトリーによる細胞内標的の分析に使用される。撮像用途において、細胞透過性コンジュゲートは、場合によっては、使用される用途に応じて標識化される。上述のように、標識または検出可能な部分は、分光光度的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によって検出することができる組成物である。有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、電子高密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで広く使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに例えば放射標識を標的ペプチドに特異的に反応するペプチドもしくは抗体に組み込むことによって検出可能にすることができるタンパク質または他の実体が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏに記載の方法を使用する等、抗体を標識に共役する当該技術分野で既知の任意の方法が、用いられ得る。

【0097】

場合によっては、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲート及び細胞透過性コンジュゲートを含む組成物は、予防的及び治療的の両方の治療に有用である。予防的投与については、本明細書に記載される薬剤の治療有効量が、初期発症の前またはその間に（例えば、自己免疫疾患の最初の兆候及び症状時に）投与される。治療的治療は、疾患の診断または発症後に対象に本明細書に記載される薬剤の治療有効量を投与することを伴う。

【0098】

したがって、対象における疾患を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載される細胞透過性コンジュゲートまたは細胞透過性コンジュゲートを含む組成物の有効量を投与することを含む、方法が提供される。コンジュゲートの投与により、対象における疾患または疾患の１つ以上の症状を治療する。

【0099】

場合によっては、治療の方法は、対象に、１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質を投与することをさらに含む。場合によっては、本方法は、ホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格に結合した第１の細胞非透過性タンパク質を含む第１のコンジュゲート及びホスホロチオエート核酸またはポリマー骨格に結合した第２の細胞非透過性タンパク質を含む第２のコンジュゲートの投与を含む。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、第１の細胞非透過性タンパク質と比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する。第１及び第２のコンジュゲートは、同時または順次で投与され得る。場合によっては、第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である。場合によっては、疾患は、自己免疫疾患、発達障害、炎症性疾患、代謝障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患、神経障害、及び癌からなる群から選択される。場合によっては、疾患は、癌である。場合によっては、コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は細胞内標的に結合し、この細胞内標的はＳＴＡＴ３またはエクスポーチン７である。場合によっては、第１の細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する抗体であり、第２の細胞非透過性タンパク質は、エクスポーチン７に特異的に結合する抗体である。場合によっては、コンジュゲートの第１の細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する抗体であり、第２の細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３の別のエピトープに特異的に結合する抗体である。

【0100】

提供される治療方法において、治療されている疾患に好適な追加の治療剤が使用されてもよい。したがって、いくつかの実施形態において、提供される治療方法は、対象に第２の治療剤を投与することをさらに含む。好適な追加の治療剤には、鎮痛剤、麻酔剤、興奮剤、コルチコステロイド、抗コリン作動剤、抗コリンエステラーゼ、抗痙攣薬、抗新生物剤、アロステリック阻害剤、タンパク質同化ステロイド、抗リウマチ剤、精神治療剤、神経遮断剤、抗炎症剤、駆虫薬、抗生物質、抗凝血剤、抗真菌薬、抗ヒスタミン薬、抗ムスカリン剤、抗マイコバクテリア剤、抗原虫剤、抗ウイルス剤、ドーパミン作動薬、血液作用剤、免疫剤、ムスカリン薬、プロテアーゼ阻害剤、ビタミン類、成長因子、及びホルモンが挙げられるがこれらに限定されず、治療剤は、これらからなる群から選択される。薬剤及び投薬量の選択は、治療されている所与の疾患に基づいて当業者によって容易に決定することができる。

【0101】

薬剤または組成物の組み合わせは、同時（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｙ）（例えば、混合物として）、別個であるが同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）（例えば、別個の静脈線を介して）、または順次（例えば、１つの薬剤をまず投与した後、第２の薬剤を投与する）のいずれかで投与され得る。したがって、組み合わせという用語は、２つ以上の薬剤または組成物の同時（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）、または別個の投与を指して使用される。治療過程は、対象の具体的な特徴及び選択された治療の種類に応じて、個体ごとに決定されることが最良である。本明細書に開示されるもの等の治療は、１日１回、１日２回、２週間に１回、１カ月に１回、または治療的に有効な任意の適用可能な基準に基づいて対象に施され得る。治療は、単独で施されてもよく、または本明細書に開示されるかもしくは当該技術分野で既知の任意の他の治療と組み合わせて施されてもよい。追加の治療は、第１の治療と同時に、異なる時間に、または完全に異なる治療スケジュール（例えば、第１の治療は１日１回であり得るが、追加の治療は週１回である）で施されてもよい。

【0102】

本明細書に提供される方法によると、対象に、本明細書に提供される薬剤のうちの１つ以上の有効量が投与される。有効量及び有効投薬量という用語は、互換的に使用される。有効量という用語は、所望される生理学的応答（例えば、炎症の低減）をもたらすのに必要な任意の量として定義される。薬剤を投与するための有効量及びスケジュールは、当業者によって経験的に決定され得る。投与のための投薬量範囲は、疾患または障害の１つ以上の症状が影響を受ける（例えば、低減または遅延される）、所望の効果をもたらすのに十分に大きなものである。投薬量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等といった実質的な有害な副作用を引き起こすほど大きくあるべきではない。一般に、投薬量は、年齢、状態、性別、疾患の種類、疾患もしくは障害の程度、投与の経路、または他の薬物がレジメンに含まれるかどうかによって変動することになり、また、当業者によって決定され得る。投薬量は、何らかの禁忌が生じた場合には、個々の医師によって調節され得る。投薬量は変動し得、１日１回以上の用量の投与が１日または数日間施されてもよい。所与のクラスの医薬品の適切な投薬量についての指針は、文献において見出すことができる。例えば、所与のパラメータについて、有効量は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、または少なくとも１００％の増加または減少を示すであろう。有効性は、「～倍」の増加または減少として表すこともできる。例えば、治療有効量は、対照よりも少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍、またはそれ以上の効果を有し得る。実際の用量及び製剤は、治療の目的に依存することになり、既知の技法を使用して当業者によって確認することができるであろう（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１－３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄｉｔｏｒ（２００３）、及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照されたい）。

【0103】

開示される方法及び組成物に使用され得る、それらと併せて使用され得る、それらの調製に使用され得る、またはそれらの生成物である、材料、組成物、及び構成成分が、開示される。これら及び他の材料は本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示されるとき、これらの化合物のそれぞれの様々な個別及び集合的な組み合わせ及び置換の具体的な参照は明示的に開示されない場合があるが、それぞれが、具体的に本明細書に企図され、記載されることを理解されたい。例えば、ある方法が開示及び考察され、その方法を含めていくつかの分子になされ得るいくつかの修飾が考察される場合、その方法のありとあらゆる組み合わせ及び置換、ならびに可能性のある修飾は、そうでないことが具体的に示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に企図され、開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法におけるステップを含むがこれらに限定されない、本開示の全態様に適用される。したがって、行われ得る様々な追加のステップが存在する場合、これらのステップのそれぞれは、開示される方法の任意の具体的な方法ステップまたは方法ステップの組み合わせで行われてもよいこと、ならびにそれぞれのそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットが具体的に企図され、また開示されると見なされるべきであることが理解される。

【0104】

本明細書に引用される刊行物及びそれらが引用される材料は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0105】

いくつかの実施形態について記載してきた。それでもなお、種々の修正がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態が特許請求の範囲に含まれる。

【実施例0106】

実施例１．細胞透過性抗体による核転写因子ＳＴＡＴ３の不活性化。

【0107】

以下により詳細に記載されるように、抗体により１つのタンパク質の２つの異なる部分または１つの複合体内の２つのタンパク質を同時に標的化することによって、核タンパク質を細胞質内に保持することが、本明細書に示される。エクスポーチン７は、ＳＴＡＴ３の核細胞質間輸送を媒介する必須タンパク質として特定された。ＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７抗体の細胞内送達が、ＳＴＡＴ３の核細胞質間輸送を防止し、ＳＴＡＴ３を細胞質内に閉じ込める。インビトロ及びインビボでの抗体の効率的な細胞透過を可能にするための技術が開発された。具体的には、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを抗体に結合させることにより、効率的な抗体の細胞への内部移行及び標的認識を可能にする。修飾されたＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体の局所及び全身のいずれの送達も、種々のモデルにおいて、腫瘍内でのＳＴＡＴ３活性を効果的に阻害し、腫瘍細胞のアポトーシス及び腫瘍退縮をもたらした。この技術により、抗体が、核転写因子を含む細胞内分子を標的とすることが可能となる。

【0108】

材料及び方法

【0109】

生細胞でのＳＴＡＴ３－ＧＦＰの局所化を、ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて撮像及び分析し、ｉＦＬＡＰ画像化をもたらす退色処理実験を、記載のように行った（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １２０：３２４９－３２６１（２００７））。簡単に言うと、ＳＴＡＴ３－ＣＦＰ－ＹＦＰ融合タンパク質のＹＦＰ及びＣＦＰの放出シグナルを、同等に増幅させた。λ＝５１４ｎｍのレーザー線を用いて、融合タンパク質のＹＦＰ部分を数回にわたって退色処理し、中断して画像を取得した。取得後の手順では、アルゴリズム／＝１－／_ＹＦＰ／／_ＣＦＰを収集した画像に適用し、時間の関数としてＳＴＡＴ３－ＣＦＰ－ＹＦＰの空間分布を得た。前述のように、間接的免疫蛍光のプロトコルを使用して、腫瘍切片を染色した（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０：７４５５－７４６４（２０１０））。

【0110】

ＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－４８２，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）、エクスポーチン７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－９８６３９，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）、またはＧＦＰ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）に対する抗体の細胞培養物における送達は、製造業者の指示に従って脂質担体系（ＧｅｎＬａｎｔｉｓ，ＢＰ５０９６０４，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて達成した。合計用量１０μｇの脂質担体との複合体中の免疫グロブリン（ＧｅｎＬａｎｔｉｓ，ＢＰ５０９６０４，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７に対するオリゴヌクレオチド修飾抗体を、それぞれ、各治療のために投与した。

【0111】

オリゴヌクレオチドの抗体への共役。オリゴヌクレオチド（２００～３００ｎｍｏｌ）を、３０モル過剰のＴＣＥＰ（４００μＬ、５ｍＭ ＴＥＡＡ、ｐＨ６．８）によってアルゴン下において室温で２時間還元させ、逆相クロマトグラフィー（ＰＲＰ１、３０分間にわたる５ｍＭ ＴＥＡＡから９５％ＭｅＯＨへの線形勾配）によって精製した。チオール保護基の除去を質量分析法（ＬＴＱ ＦＴ，Ｔｈｅｒｍｏ）によって確認した後、凍結乾燥させた。還元されたオリゴヌクレオチドを０．５ｍＬの水／ＤＭＳＯ（４：１）中に再溶解させ、２５倍過剰のビニルスルホンを添加し、ｐＨを８．５に調節し、アルゴン下において室温で３時間反応させ、逆相ＨＰＬＣ（上述の通り）によって精製し、質量分析法によって正しい生成物を確認し、試料を凍結乾燥させた。ポリクローナルＩｇＧ（１．６ｍｇ、４８時間ＰＢＳ中で透析）を、アルゴン下において３７℃で２時間ＰＢＳ中の３０モル過剰のＴＣＥＰで還元させた。過剰なＴＣＥＰを除去した後（Ｚｅｂａスピンカラム、Ｔｈｅｒｍｏ、２，０００ｒｐｍで２分間）、還元された抗体を、アルゴン下においてｐＨ７．５で一晩、２０モル過剰のＶＳ－オリゴヌクレオチドと反応させた。オリゴヌクレオチドと抗体との共役が成功したことを、ＩＥＦゲル電気泳動（ｐＨ３～９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）により未共役抗体と共役抗体とを比較して確認した。

【0112】

生細胞の撮像及び免疫蛍光。ＳＴＡＴ３－ＧＦＰまたはＳＴＡＴ３－ＣＦＰ－ＹＦＰを過剰発現する細胞を、ガラス底の細胞培養皿（ＭａｔＴｅｋ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）において成長させた。ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、サーモスタット制御及びＣＯ_２制御条件下における生細胞中のＳＴＡＴ３の局在化を分析した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１００ｎｇ／ｍｌで用いて核酸を染色した。細胞内に送達された抗体を、Ｚｅｎｏｎ標識化技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用して可視化させた。ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}の核内保持を可視化するように、ＦＰＰアッセイ（Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃ．１：２７６－９（２００６））を適合させた。簡単に言うと、ＳＴＡＴ３－ＧＦＰまたはＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}－ＧＦＰ発現細胞を、ＫＨＭ緩衝液（１１０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中の２０μｍのジギトニンで処置して、細胞膜の外側を透過処理した。生細胞におけるＳＴＡＴ３－ＧＦＰまたはＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}－ＧＦＰの核退出を、共焦点顕微鏡法によって経時的に監視した。レプトマイシンＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）処置時のＳＴＡＴ３－ＧＦＰまたはＮＦκＢサブユニットｐ６５－ＧＦＰの局在化を、間接的免疫蛍光によって評価した。ＳＴＡＴ３－ＧＦＰまたはｐ６５－ＧＦＰを発現するカバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上で成長させた細胞を、２％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中に溶解、ｐＨ７．４）で固定し、ＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）封入剤で封入した。腫瘍及び正常組織からの微小切片を、前述のように間接的免疫蛍光を用いて染色した（Ｋｕｊａｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１８：３３６７－３３７７（２００８））。簡単に言うと、切片を、１０％ヤギ血清及び２．５％マウス血清でブロッキングし、ＰＢＳですすぎ、１００ｎｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するブロッキング溶液中で１：５０に希釈したエクスポーチン７、ヌクレオポリン５０、ヌクレオポリン１５３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）、Ｋｉ６７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ－１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に対する抗体とともにインキュベートした。スライドをＰＢＳ中ですすぎ（それぞれ５分間で３回）、適切な二次蛍光抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳですすぎ、Ｍｏｗｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で封入した。切片をＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析した。インビボで送達された抗体を、ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に共役した抗ウサギＩｇＧを用いて可視化した。

【0113】

蛍光放出シグナルの定量化。核内に存在するタンパク質を、細胞核における平均蛍光強度によって定量化した（Ｈｏｅｃｈｓｔ＋）。完全な核集積を１に対して正規化した（１００％）。平均蛍光強度、ＣＤ３１＋血管系の長さ等の組織構造、視野内の二重陽性ピクセルの画像マスク、または蛍光シグナル密度を、それぞれ、Ｚｅｉｓｓ撮像ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｍａｇｅ－Ｐｒｏ ６．３（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて定量化した。ＳＴＡＴ３－ＧＦＰまたはＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}－ＧＦＰの核デコイを、前述のようにＦＬＩＰ（光退色処理での蛍光消失）パラメータの適合によって判定した（Ｒａｂｕｔ ａｎｄ Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇ，“Ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｔｏ Ｓｔｕｄｙ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ．Ｉｎ：Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．１０１－１２６（２００４））。ＦＬＩＰとは対称的に、目的の領域（ＲＯＩ）を、図６Ａ及び６Ｂに概略的に示されるように組織化させた。簡単に言うと、取得したシグナルを、バックグラウンド（ＢＧ）を差し引いた後にＲＯＩ１／ＲＯＩ２によって補正し（図６Ａ及び６Ｂ）ｅ－ｔ／ｘを用いて正規化した（式中、ｔは、時間であり、ｘは隣接する対照細胞（ＲＯＩ２）の蛍光シグナルである）。退色処理前の時間点における放出強度を、１に対して正規化した。

【0114】

生体内多光子顕微鏡法（ＩＶＭＰＭ）。メラノーマＢ１６腫瘍を保持するＣ５７ＢＬ／６マウスに、イソフルラン／酸素で麻酔を行った後、１０μｇのアネキシン－Ｖ－ＦＩＴＣ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）を静脈内（後眼窩経路を介した）注射した。注射直後に、マウスを手術により切開し、腫瘍組織をＩＶＭＰＭに曝露したが、これは、Ｕｌｔｉｍａ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒａｉｒｉｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）を用いて行った。フルオレセインコンジュゲートの撮像のために、励起波長をλ＝８９０ｎｍに設定した。フルオレセインに最適化された帯域通過フィルタ（ＢＰ λ＝５２５／５０ｎｍ）を検出に使用した。細胞外マトリックスのシグナルが励起波長λ＝８９０ｎｍでの二次調波発生により得られ、これをＢＰ λ＝４６０／５０ｎｍで検出した。

【0115】

タンパク質相互作用のインサイツ局在化。ヒトＵ２５１脳腫瘍細胞を、ガラスチャンバスライドシステム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で成長させ、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）手順を、製造業者の指示に従って行った（ＯＬＩＮＫ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。使用した検出抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（ＳＴＡＴ３、カタログ番号ｓｃ－４８２）及びＡｃｒｉｓ（エクスポーチン７、カタログ番号ＡＰ１６２０１ＰＵ－Ｎ）から購入した。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から購入したＳＴＡＴ３遮断ペプチドを、０．０１ｍｇ／ｍｌで使用した。

【0116】

オリゴヌクレオチドプルダウンアッセイ。ＳＴＡＴ３ ＤＮＡ結合活性を判定するために、無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスにおいて成長させたＵ８７腫瘍から単離した核抽出物を用いて、オリゴヌクレオチドプルダウンアッセイを行った。腫瘍組織を均質化した後、（ｉ）１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＫＣｌを含有する低張緩衝液Ａと、（ｉｉ）２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、４２０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２５％グリセロールを含有する高塩濃度緩衝液Ｃとの組み合わせを使用して、核抽出物を単離した。プロテアーゼ阻害剤０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４を、新たに添加した。ビオチニル化したオリゴヌクレオチド５’－ＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＣＣＧＴＡＡＡＴＣＣＣＴＡＡＧＣＴ－３’（配列番号１）（顕著なＳＴＡＴ３結合部位を有するシス誘導要素ＳＩＥ）を、室温で２時間、結合緩衝液（１２ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９、１２％グリセロール、４ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．９、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ；新たに：１ｍＭ ＤＴＴ、０．１μｇ／μｌポリ（ｄＩ：ｄＣ）、０．５μｇ／ μｌ ＢＳＡ）中において４００μｇの核抽出物とともにインキュベートした。試料当たり５０μｌで使用したストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）は、１ｍｌの結合緩衝液で３回予備洗浄し、磁気スタンドに収集し、上清を除去した。ストレプトアビジン磁気ビーズを、１００μｇ ＢＳＡ、１０μｇポリ（ｄＩ：ｄＣ）、１０μｇ ｓｓＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡを［１０μｇ／μｌ］で使用）を含有する５０μｌのブロッキング緩衝液中、室温で３０分間ブロッキングした後、室温で２時間試料とともにインキュベートした。沈降物を磁気スタンドに収集し、結合緩衝液を用いて３回洗浄し、４０μｌの４倍還元タンパク質試料緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ）中に再懸濁させた。タンパク質－沈降物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって電気泳動で分離させた。初回クリアランス後の上清を回収し、核タンパク質を電気泳動で分離させて、負荷対照のタンパク質移入を評価した。

【0117】

オリゴヌクレオチドの抗体への共役。次のＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を合成して、抗体に結合させた：
抗体との共役に使用したオリゴヌクレオチド配列：
ホスホチオエート化／５ＴｈｉｏＭＣ６－Ｄ／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＦＡＭ／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ（配列番号２）
非ホスホチオエート化／５ＴｈｉｏＭＣ６－Ｄ／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＦＡＭ／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３）
ホスホチオエート化ランダム１／５ＴｈｉｏＭＣ６－Ｄ／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＦＡＭ／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ（配列番号４）
ホスホチオエート化ランダム２／５ＴｈｉｏＭＣ６－Ｄ／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＦＡＭ／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ（配列番号５）
Ｔ チミジン、Ａ アデニン、Ｇ グアニン、Ｃ シトシン、（＊）はホスホロチオエート化を示す。５ＴｈｉｏＭＣ６－Ｄ、１－Ｏ－ジメトキシトリチル－ヘキシル－ジスルフィド、１’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト（Ｔｈｉｏｌ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ Ｓ－Ｓ）；ｉＳｐＣ３、Ｃ３ ３－（４，４’－ジメトキシトリチルオキシ）－プロピル－１－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト（Ｓｐａｃｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）；ｉＦＡＭ、２－ジメトキシトリチルオキシメチル－６－（３’，６’－ジピバロイルフルオレセイン－６－イル－カルボキサミド）－ヘキシル－１－Ｏ－［（２－シアノ－エチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト（６－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ－アミダイト）（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）。

【0118】

免疫ブロッティング及び免疫沈降。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ－４０、１ｍＭ ＮａＦ、１５％グリセロール、及び２０ｍＭ β－グリセロールホスフェートを含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液を使用して、全細胞溶解物または腫瘍細胞ホモジネートを調製した。プロテアーゼ阻害剤カクテルを、新たに溶解緩衝液に添加した（Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、カタログ番号０４６９３１２４００１、Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。レスベラトロール（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を、示される時間、１０μＭの準最適濃度でインビトロにおいて使用した。正規化したタンパク質量を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動分離に供し、ウエスタンブロットのためにニトロセルロース上に移し、続いて、エクスポーチン１、２、５、７、ＳＴＡＴ３、ＶＥＧＦ、ヌクレオポリン５０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）、リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）、アセチル化ＳＴＡＴ３（Ｌｙｓ６８５）、切断型ＰＡＲＰ１、切断型カスパーゼ３、Ｂｃｌ－２、サイクリンＤ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、アンジオポエチン１、エクスポーチンＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、エクスポーチン４（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ／Ａｂｃａｍ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、エクスポーチン６（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、及びβ－アクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に対する抗体を使用して免疫検出を行った。免疫沈降については、ヒトＵ２５１脳腫瘍細胞の全細胞溶解物または全腫瘍ホモジネートを、試料１つ当たり１ｍｇの合計濃度で、プロテインＧアガロースビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した示される抗体を使用して除去した。標的化しないウサギ免疫グロブリン（Ａｂｃａｍ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を対照として含んだ。正規化したタンパク質量を、ビーズに結合した抗体とともに４℃で振動させながら１６時間インキュベートし、氷冷ＰＢＳを使用して４℃で３回洗浄し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。

【0119】

マウス及び細胞培養物。全ての動物を、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓにおいて病原体不含室で維持した。動物の使用手順は、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒのＢｅｃｋｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの組織委員会によって承認された。皮下腫瘍チャレンジについては、無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（ＮＣＩ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）に、ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}を安定に発現する５×１０^６個のＭＥＦ細胞または１０^６個のＵ８７ヒト脳腫瘍細胞を側腹部に注射した。同系モデルにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、１０^５個のＢ１６黒色腫細胞を皮下注射した。腫瘍が直径５～７ｍｍに達した後、抗体処置を１日おきに施した。線維芽細胞である３Ｔ３／ｖ－Ｓｒｃ細胞、ＭＥＦ細胞、及びヒトＵ８７脳腫瘍細胞を、１０％の熱不活性化ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するＤＭＥＭ中に維持した。マウス黒色腫Ｂ１６細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地で成長させた。ＳＴＡＴ３構築物を安定に発現する細胞系を確立するために、ＳＴＡＴ３欠損ＭＥＦ細胞に、ＳＴＡＴ３－ＹＦＰまたはＳＴＡＴ３Ｋ６８５－ＹＦＰをトランスフェクトした後、Ｆｌｐ－Ｉｎプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を行った。再構成されたＭＥＦ細胞を、続いて、ＹＦＰ＋に関してフローサイトメトリーにより分類して、純度を９５％を上回って改善した。

【0120】

結果及び考察

【0121】

図面及び本明細書に記載される方法の結果を、以下により詳細に考察する。簡単に言うと、図１～３は、細胞透過性抗体が、ＳＴＡＴ３等の核転写因子に結合し得ることを図示する。図５～１２は、さらに、核タンパク質（例えば、ＳＴＡＴ３）及び核タンパク質と相互作用するタンパク質（例えば、エクスポーチン７）に対する２つの細胞透過性抗体を使用することで、どのようにして核タンパク質（例えば、ＳＴＡＴ３）の活性を遮断することができるかを図示する。図１３～１８は、核酸配列ではなくホスホロチオエート化が、ホスホロチオエート核酸修飾抗体の細胞透過を可能にし、インビボ及びインビトロでの標的認識及び標的タンパク質機能の不活性化を可能にするために重要であることを示す。

【0122】

活性化ＳＴＡＴ３は多くが核内に封じ込められるが、ＳＴＡＴ３は細胞質に輸送されて再活性化される。球形粒子の拡散特性により、分子量の増加は、タンパク質の区画的蓄積のバランスを崩し得る。したがって、２つの抗体を使用して核タンパク質または追加の相互作用するタンパク質の２つの別個の部分を認識することで、大型で安定した複合体を形成し、それによって核タンパク質（複数可）が細胞質内で区画的に蓄積するのに好都合なようにバランスを傾けることができると仮定した。この仮説を試験するために、脂質担体を使用して、ＳＴＡＴ３及びＧＦＰタンパク質に対する第１の抗体を、ＳＴＡＴ３を永続的に活性化させるｖ－Ｓｒｃにより形質転換されたＳＴＡＴ３－ＧＦＰ発現３Ｔ３細胞に送達した。２つの抗体が脂質担体に促進されて細胞内に送達したとき、ＳＴＡＴ３－ＧＦＰ融合タンパク質は、主に細胞質内に封入されることがわかった（図１Ａ）。

【0123】

生理学的にＳＴＡＴ３を標的とするためのこのアプローチを拡張するために、細胞質内でＳＴＡＴ３と相互作用する内在性タンパク質を特定し、それによって、ＳＴＡＴ３／ＧＦＰの２抗体処置によって示されるものと同じ原理に基づいて、細胞質内にＳＴＡＴ３を封入することを可能にした。ＳＴＡＴ３を細胞質内に輸送するエクスポーチン（複数可）は、ＳＴＡＴ３と比較的安定した複合体を形成し得ると考えられた。したがって、ＳＴＡＴ３の細胞質内への輸送に関与する重要なエクスポーチン（複数可）を特定しようと試みた。エクスポーチン１がＳＴＡＴ１及びある程度はＳＴＡＴ３の核細胞質間輸送にも関与することが、示されている（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ ａｎｄ Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：５５３－９（２００３）、Ｒｅｉｃｈ ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：６０２－１２（２００６）、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｏ Ｊ．２１：１７５４－６３（２００２））。ＳＴＡＴ３抗体での免疫沈降に続いて種々のエクスポーチンに対する抗体を用いたウエスタンブロット分析により、エクスポーチン７がＳＴＡＴ３に関連していることが示された（図１Ｂ及び図５Ａ）。エクスポーチン７のＳＴＡＴ３との特異的な関与を、さらに確認した（図５Ｂ）。エクスポーチン１はまた、高濃度でのＣｒｍ１特異的阻害剤での長期処置によって示されるように、細胞質内へのＳＴＡＴ３の輸送に何らかの検出可能な活性を有した（図５Ｂ）。細胞質内でのＳＴＡＴ３とエクスポート７との間の相互作用が、Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）（Ｏｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）技法（図１Ｃ及び１Ｄ）によってさらに示された。ＧＦＰ抗体をエクスポーチン７抗体と置換することにより、ＳＴＡＴ３－ＧＦＰの細胞質内蓄積が達成された（図１Ｅ）。

【0124】

エクスポーチン７は、基質を区別するためにカーゴタンパク質のリジン含有モチーフを認識することが示されているため、リジン６８５でのＳＴＡＴ３のアセチル化がＳＴＡＴ３の細胞質内輸送に重要であるかどうかを試験した。ＳＴＡＴ３野生型及びＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}の核細胞質間輸送を、ｉＦＬＡＰ生細胞共焦点顕微鏡法によって評価した。これらの分析からの結果は、ＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}輸送が、核内保持に起因して大幅に低減されたことを示した（図２Ａ、２Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃ）。ＳＴＡＴ３をリジンＫ６８５において変異させるか、細胞をレスベラトロールで処置するかのいずれか（ＳＴＡＴ３アセチル化を阻害することができる）によって、ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７相互作用に関するアセチル化の要件が提示された（図２Ｃ及び２Ｄ）。

【0125】

インビボにおいてエクスポーチン７に媒介される、細胞質内へのＳＴＡＴ３の核退出を遮断する影響を、ＳＴＡＴ３野生型またはＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}のいずれかを過剰発現するマウスＳｔａｔ３－ｎｕｌｌ胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いてさらに試験した。腫瘍成長動態は、ＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}発現ＭＥＦの腫瘍原性能の実質的な減少を示す（図８Ａ）。エクスポーチン７とＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}との間の相互作用における同時の低減が検出された（図２Ｅ）。さらに、エクスポーチン７に媒介される、ＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}とヌクレオポリンとの間、具体的にはＮＰＣの核細胞質ＦＧリッチ反復Ｎｕｐ５０とＮｕｐ１５３との間の相互作用（核から細胞質へのタンパク質の移動を促進すると見られる）が、大幅に減少した（図２Ｅ、８Ｃ、及び８Ｄ）。核退出におけるアセチル化ＳＴＡＴ３の重要な役割をさらに裏付けると、ＳＴＡＴ３^{Ｋ６８５Ｒ}発現ＭＥＦは、核内におけるエクスポーチン７の蓄積を示し、これは、核直径の実質的な増加と関連し（図２Ｆ及び２Ｇ）、タンパク質の核移出の効果的な阻害を示す。これは、エクスポーチン７が主に細胞質内に見られる正常な器官／組織における細胞とは明確に対照的である（図９）。

【0126】

ＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７抗体がＳＴＡＴ３活性をインビボで阻害する能力を、核細胞質間輸送を遮断することによってＭＥＦにおいて試験した。これらの実験からの結果を、図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、及び１１Ｄに示す。エクスポーチン７／ＳＴＡＴ３に対する抗体での腫瘍保持マウスの処置は、腫瘍において強力な抗体の細胞内取り込み（図１０Ａ及び１２Ａ）ならびに有意な腫瘍成長の阻害（図３Ａ、１１Ａ、及び１２Ｂ）をもたらした。ＩｇＧ対照抗体と組み合わせたＳＴＡＴ３またはエクスポーチン７のいずれかでの単独抗体処置は、わずかに腫瘍成長を阻害したにすぎなかった（図３Ａ）。さらに、２つの抗体での処置は、エクスポーチン７に媒介されるＳＴＡＴ３のＮｕｐ１５３及びＮｕｐ５０との相互作用の妨害を伴った（図３Ｂ）。ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体での腫瘍保持マウスの処置は、腫瘍血管系及び腫瘍増殖を有意に妨害し（図３Ｃ及び３Ｄ）、腫瘍細胞の生存に関与するＳＴＡＴ３下流遺伝子の発現及び増殖を阻害することができた（図３Ｅ）が、いずれか１つの抗体単独ではそうすることができなかった。２つの抗体での処置の有効性を、ヒト異種移植片腫瘍モデルにおいても試験した。ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体でのヒトＵ８７神経膠腫腫瘍保持マウスの処置は、腫瘍成長を有意に低減させ（図３Ｆ）、ＳＴＡＴ３のそのＤＮＡ部位への結合を防止することができた（図３Ｇ）。腫瘍成長の阻害は、アポトーシスを起こす腫瘍細胞の実質的な増加及び生体多光子顕微鏡法によって可視化される腫瘍血管系の低減と関連していた（図３Ｈ及び３Ｉ）。

【0127】

結果は、これまでのところ、ＳＴＡＴ３等の転写因子が抗体により標的化され得ること実証している。しかしながら、細胞内への抗体の送達は脂質担体に依存していた。効率的な細胞内タンパク質の標的化のために抗体及びタンパク質が細胞内に透過できるようにする方法は、わからないままである。この目的のために、ある技術を開発した。具体的には、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドを抗体に結合させて、それらが細胞を透過し、目的とする分子を標的とすることができるようにすることを試みた。ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドをＳＴＡＴ３またはエクスポーチン７ポリクローナルＩｇＧ抗体に結合させることにより、時間依存的かつ用量依存的な様式でインビトロにおいて細胞の細胞質内への抗体の効率的な細胞内部移行をもたらした（図４Ａ及び４Ｂ）。注目すべきことに、２つの修飾抗体実体の同時送達が実証された（図４Ｂ、右パネル）。さらなる特徴付けにより、細胞質内での修飾抗体の目的とされる標的認識が明らかとなった（図１３Ａ及び１３Ｂ）。さらに、蛍光標識したホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド修飾抗体が、局所投与及び全身投与のいずれの際にも、腫瘍内に検出された（図１４及び１５Ａ）。インタクトなオリゴヌクレオチド修飾抗体が、最後の全身処置の８日後に腫瘍組織において確認され（図１５Ｂ）、修飾抗体の強力な生体安定性が示された。癌細胞を透過することに加えて、オリゴヌクレオチド修飾抗体は、免疫細胞にも進入することができる（図１６Ａ及び１６Ｂ）。抗体に結合されたオリゴヌクレオチドの配列特異性ではなく、ＤＮＡ骨格のホスホロチオエート化が、細胞取り込み及びそれに続く標的／抗原認識に重要である（図１７Ａ及び１７Ｂ）。

【0128】

ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド修飾抗体の抗腫瘍効力を評価するために、ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体を、メラノーマＢ１６腫瘍保持マウス、ならびにヒトＵ２５１神経膠腫保持免疫不全マウスに局所投与した。未処置マウス及び単一の抗体で処置したマウスと比較して、両方のモデルにおける腫瘍成長動態は、修飾ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体の組み合わせを受容したマウスにおいて有意に低減され（図４Ｃ及び１８）、これは、ＳＴＡＴ３活性の劇的な減少（図４Ｆ）及びアポトーシス細胞死の増加（図４Ｇ）を伴った。

【0129】

修飾ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体の抗腫瘍効力を、全身投与により試験した。修飾ＳＴＡＴ３／エクスポーチン抗体の全身送達もまた、腫瘍成長に対して非常に劇的な抗腫瘍効果を示した（図４Ｄ）。ホスホロチオエート化ヌクレオチド修飾抗体は、効率的に腫瘍組織に到達し、それに浸透し、抗腫瘍機能を発揮した（図１５Ａ）。次いで、組み合わせ抗体処置の抗腫瘍効力を、１回の処置当たり合計で２．５μｇの抗体までの漸減用量で全身に与えて評価した。ＳＴＡＴ３のヌクレオポリン５０及び１５３との相互作用の低減（図４Ｇ）によって示されるように、たった３回の処置の後に全身処置を中止したときに、強力な抗腫瘍効果が継続され（図４Ｅ）、これはＳＴＡＴ３の区画的代謝回転の阻害を伴った。さらに、修飾ＳＴＡＴ３／エクスポーチン抗体での腫瘍保持マウスの全身処置は、腫瘍におけるＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合能力を効果的に低下させた（図４Ｈ）。

【0130】

細胞内分子を標的とするために抗体を使用する必要性には、説得力がある。抗体が癌細胞内に拡散してインビボで目的のタンパク質を遮断することができることが報告されているが、分子機序は提供されておらず、癌細胞による抗体の取り込みはＢ細胞によって媒介されるものであると推測された。抗体がそれら自体で透過性となるようにそれを修飾し、それらが全身投与によってさえも細胞内分子を効果的に標的とすることを可能にするための手法が、本明細書に記載されている。抗体により１つのタンパク質の２つの異なる部分または１つの複合体内の２つのタンパク質を標的とすることによって、転写因子の再活性化に必要とされる核細胞質間輸送を低減することができるという直接的な実験による証拠を提供する。ＳＴＡＴ３に加えて、核タンパク質は抗体により標的とすることが不可能であると見られており、細胞透過性抗体技術を広く使用して、種々の細胞内タンパク質（例えば、発癌性タンパク質及び細胞内に存在するウイルスタンパク質）を標的とすることが可能である。

【0131】

実施例２．有効な細胞透過性タンパク質送達技術
本実施例において、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドでの抗体の修飾により、それらが細胞に透過し、そこで目的とされる細胞内標的抗原／分子に結合することを可能にすることが実証された。さらに、修飾抗体が細胞内標的を特異的に検出する能力が生細胞においてフローサイトメトリー及び共焦点顕微鏡法により示され、同様にタンパク質をその天然の形態で検出する能力がウエスタンブロットにより示された。さらに、そのような修飾抗体を使用して、細胞内チロシンキナーゼ（ホスホ－Ｓｒｃ）、細胞内／核内ウイルスタンパク質（ＨＰＶ１６／１８ Ｅ６タンパク質）、ならびに転写因子（ＳＴＡＴ３）の活性を効果的に遮断することができることが実証された。

【0132】

材料及び方法
生細胞内におけるＳＴＡＴ３－ＧＦＰの局在化を、ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて撮像及び分析し、ｉＦＬＡＰ画像化をもたらす退色処理実験を行った（Ｈｅｒｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１２０：３２４９－３２６１（２００７））。簡単に言うと、ＳＴＡＴ３－ＣＦＰ－ＹＦＰ融合タンパク質のＹＦＰ及びＣＦＰの放出シグナルを、同等に増幅させた。λ＝５１４ｎｍのレーザー線を用いて、融合タンパク質のＹＦＰ部分を数回にわたって退色処理し、中断して画像を取得した。取得後の手順では、アルゴリズム／＝１－／_ＹＦＰ／／_ＣＦＰを収集した画像に適用し、時間の関数としてＳＴＡＴ３－ＣＦＰ－ＹＦＰの空間分布を得た。前述のように、間接的免疫蛍光のプロトコルを使用して、腫瘍切片を染色した（Ｈｅｒｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７０：７４５５－７４６４（２０１０））。

【0133】

細胞培養物におけるＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－４８２）、エクスポーチン７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－９８６３９）、またはＧＦＰ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）に対する抗体の送達は、製造業者の指示に従って脂質担体系（ＧｅｎＬａｎｔｉｓ，ＢＰ５０９６０４）を用いて達成した。インビボにおいて、合計用量１０μｇの、脂質担体との複合体中の免疫グロブリン（ＧｅｎＬａｎｔｉｓ，ＢＰ５０９６０４）またはＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７に対するオリゴヌクレオチド修飾抗体を、それぞれ、各処置のために送達した。

【0134】

オリゴヌクレオチドの抗体への共役。抗体との共役に使用したオリゴヌクレオチド配列：
ホスホチオエート化Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ（配列番号２）
非ホスホチオエート化ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号３）
ホスホチオエート化スクランブル１（ｓｃｒ１）Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ（配列番号６）
ホスホチオエート化スクランブル２（ｓｃｒ２）Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ（配列番号５）
ホスホチオエート化スクランブル３（ｓｃｒ３）Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ（配列番号７）
Ｔ チミジン、Ａ アデニン、Ｇ グアニン、Ｃ シトシン、（＊）はホスホロチオエート化を示す。
オリゴヌクレオチド（２００～３００ｎｍｏｌ）を、３０モル過剰のＴＣＥＰ（４００μＬ、５ｍＭ ＴＥＡＡ、ｐＨ６．８）によってアルゴン下において室温（ＲＴ）で２時間還元させ、逆相クロマトグラフィー（ＰＲＰ１、３０分間にわたる５ｍＭ ＴＥＡＡから９５％ＭｅＯＨへの線形勾配）によって精製した。チオール保護基の除去を質量分析法（ＬＴＱ ＦＴ，Ｔｈｅｒｍｏ）によって確認した後、凍結乾燥させた。還元されたオリゴヌクレオチドを０．５ｍＬの水／ＤＭＳＯ（４：１）中に再溶解させ、２５倍過剰のビニルスルホンを添加し、ｐＨを８．５に調節し、アルゴン下において室温で３時間反応させ、逆相ＨＰＬＣ（上述の通り）によって精製し、質量分析法によって正しい生成物を確認し、試料を凍結乾燥させた（ＶＳ－オリゴヌクレオチド）。代替的には、オルゴヌクレオチドをチオール保護基の除去には供さず、次のようにさらに処理した（ＳＳＲ－オリゴヌクレオチド）。ポリクローナルＩｇＧ（１．６ｍｇ、４８時間ＰＢＳ中で透析）を、アルゴン下において３７℃で２時間ＰＢＳ中の３０モル過剰のＴＣＥＰで還元させた。過剰なＴＣＥＰを除去した後（Ｚｅｂａスピンカラム、Ｔｈｅｒｍｏ、２，０００ｒｐｍで２分間）、還元された抗体を、アルゴン下においてｐＨ７．５で一晩、２０モル過剰のＶＳ－オリゴヌクレオチドまたはＳＳＲ－オリゴヌクレオチドと反応させた。オリゴヌクレオチドと抗体との共役が成功したことを、ＩＥＦゲル電気泳動（ｐＨ３～９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により未共役抗体と共役抗体とを比較して確認した。

【0135】

結果及び考察
修飾抗体の細胞透過及び標的認識。ＳＴＡＴ３ ＩｇＧ抗体をホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドで修飾することにより、インビトロで生細胞における抗体の細胞内部移行及び意図される標的／抗原認識をもたらした（図２３Ａ）。これは、代替的な免疫沈降を用いて、すなわち、修飾抗体を生細胞に添加してそれらをその天然の形態で標的に結合させた後、細胞を溶解させ、アガロースビーズで沈降させた後に電気泳動することにより、抗体－標的複合体の検出によって裏付けられる。抗体及びホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドがインビボで共局在化されることが確認された（図２８）。フローサイトメトリー分析及びウエスタンブロットの両方によって裏付けられるように、異なるオリゴヌクレオチドのＤＮＡ骨格ホスホロチオエート化により、抗体の細胞内取り込み及びそれに続く標的／抗原認識を達成できることが、さらに示された（図２３Ｂ、２３Ｃ）。さらに、エクスポーチン７抗体のホスホロチオエート化修飾により、抗体の内部移行が促進されたこと（図２３Ｂ）、及び修飾抗体の内部移行が特定の細胞型に限定されなかったこと（図２３Ｂ）が示された。修飾ＳＴＡＴ３抗体が細胞膜を透過できること、及びＥＥＡ－１＋エンドソーム区画の外側に存在し得ることもまた、共焦点撮像によって実証された。加えて、修飾ＳＴＡＴ３抗体はまた、核区画にも進入することができた（図２３Ｄ）。

【0136】

ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドで修飾したホスホ－Ｓｒｃ（ｐ－Ｓｒｃ）抗体を、さらに詳細に特徴付けした。修飾及び非修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体の細胞透過能力を、フローサイトメトリー分析を使用して比較した（図２３Ｅ）。加えて、蛍光シグナルの低い細胞の共焦点画像化により、修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体がｐ－Ｓｒｃと共局在化していたことが示された（図２３Ｆ）。さらに、抗体を生細胞に添加した後に細胞溶解物を調製するという固有の免疫沈降、続くウエスタンブロットにより、修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体が細胞内に内部移行し、それらの意図される標的に結合することができたことを確認した（図２３Ｇ）。

【0137】

細胞透過性抗体の細胞内保持には標的が必要である。これまでのところ、データは、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド修飾抗体が細胞を透過できることを示している。蛍光標識した修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体が、ｖ－Ｓｒｃをトランスフェクトした３Ｔ３線維芽細胞におけるフローサイトメトリーによって容易に検出可能であったが、標識修飾ＩｇＧ対照抗体はそうでなかったことが示された（図２４、上パネル）。Ｓｔａｔ３ありまたはなしでマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用することにより、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド修飾Ｓｔａｔ３抗体の保持にはＳｔａｔ３タンパク質が必要であったことが、フローサイトメトリー分析によって示された（図２４、下パネル）。

【0138】

修飾抗ホスホＳｒｃ抗体による強力な抗腫瘍効果。次いで、インビボにおける抗腫瘍効果を、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドによって修飾した種々の抗体に関して評価した。ｖ－Ｓｒｃによって形質転換した３Ｔ３細胞を、免疫応答性の同系マウスに埋め込んだ。同量の修飾ＩｇＧまたは修飾抗ｐ－Ｓｒｃ抗体（マウス１匹当たり１０μｇ）を腫瘍に注射した。腫瘍の成長曲線は、未処置のものと修飾ＩｇＧ抗体で処置したものとの間では類似であったが、修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体を受容した腫瘍では有意に緩徐であった（図２５Ａ）。次いで、未処置または修飾対照抗体もしくは修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体を受容した腫瘍由来のホモジネートを調製した後、ウエスタンブロット分析を行って、修飾抗体のその標的及び標的下流遺伝子に対するインビボでの効果を評価した。そのような分析からの結果は、インビボにおいて修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体はリン酸化Ｓｒｃ及びその下流標的であるリン酸化Ｓｔａｔ３（図２５Ｂ、左パネル）、ならびに他の既知のｐ－Ｓｒｃ下流標的であるＦＡＫ、β－アクチン、及びＥ－カドヘリン（図２５Ｂ、右パネル）を効果的に阻害することができたことを示す。細胞アクチンフィラメント構造における活性化Ｓｒｃの役割は、既知である。修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体はまた、腫瘍細胞アクチンフィラメント構造も阻害することができ（図２９）、これは細胞移動及び腫瘍浸潤において役割を果たす。

【0139】

ヒト黒色腫Ａ２０５８腫瘍細胞の生存及び成長は、ｐ－Ｓｒｃ依存性であるため、修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体のインビボでの効果を、Ａ２０５８異種移植片腫瘍モデルにおいてさらに評価した。３Ｔ３ ｖ－Ｓｒｃマウス腫瘍モデルにおいて見られるように、ヒト黒色腫腫瘍を修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体で処置することにより、マウスにおける腫瘍成長が有意に阻害された（図２５Ｃ）。対照群及び試験群の両方に由来する腫瘍から調製したホモジネートを用いたウエスタンブロットは、修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体がインビボにおいて腫瘍内に保持されたが、結合する標的タンパク質を持たない修飾ＩｇＧ抗体は保持されなかったことを示した（図２５Ｄ）。さらに、腫瘍切片の顕微鏡分析により、修飾ｐ－Ｓｒｃ抗体のみが腫瘍内に保持されたが、修飾ＩｇＧ抗体は保持されなかったことを示した（図２５Ｅ上パネル）。標的抗体の保持は、腫瘍血管系の消失（図２５Ｅ上パネル）、ならびに腫瘍アポトーシスの増加（図２５Ｅ下パネル）と関連していた。対照腫瘍と標的抗体で処置した腫瘍との間の抗体の腫瘍保持、腫瘍細胞のアポトーシス、及び腫瘍血管系の消失における差は、有意であった（図２５Ｆ）。

【0140】

修飾抗ＨＰＶ Ｅ６抗体は腫瘍成長を阻害する。いくつかの細胞内ウイルスタンパク質は、癌等の疾患の治療の良好な標的である。例えば、ＨＰＶ１６／１８ Ｅ６及びＥ７タンパク質は、大部分の子宮頸癌及び頭頸部癌において細胞の形質転換及び悪性度にとって重要な周知の腫瘍性タンパク質である。しかしながら、それらの発癌活性を遮断するのに有効な薬物は存在しない。したがって、ＨＰＶ１６／１８ Ｅ６に対するモノクローナル抗体を修飾することにより、Ｅ６の機能及び腫瘍成長を遮断する有効な阻害剤がもたらされるかどうかを試験した。Ｅ６（Ｅ７も同様）タンパク質は非常に小さいため、抗体がタンパク質全体を「飲み込み」、それによってその機能を遮断することができると推論した。ヒトＣａＳｋｉ子宮頸癌細胞を皮下に注射して、ヌードマウスに腫瘍を形成させた。腫瘍が平均して直径およそ５ｍｍに達したときに、同量の修飾ＩｇＧ抗体または抗Ｅ６抗体（マウス１匹当たり１０μｇ）を腫瘍に注射した。修飾ＩｇＧ抗体で処置した腫瘍は未処置腫瘍と同じように成長したが、修飾Ｅ６抗体を注射したものは、２つの対照群と比較して有意な成長遅延を有した（図２６Ａ）。全身投与した修飾Ｅ６モノクローナル抗体の抗腫瘍作用もまた試験した。全身送達した修飾Ｅ６抗体のＣａＳｋｉ腫瘍成長に対する阻害効果が観察された（図２６Ｂ）。Ｈ＆Ｅ染色は、修飾Ｅ６抗体での全身及び局所の両処置が、腫瘍組織に対して破壊性効果を有したことを示した（図２６Ｃ）。インビボ実験からの腫瘍を用いたウエスタンブロット分析及びリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（図２６Ａ及び２６Ｂ）により、Ｆａｓ受容体のメンバーをプロカスパーゼと架橋させて細胞死を誘導するための複合体を形成するＦＡＤＤ遺伝子、ならびにカスパーゼ８遺伝子の上方調節性発現が示された（図２６Ｄ及び２６Ｅ）。ＣａＳｋｉ腫瘍切片（図２６Ａと同じ腫瘍）の共焦点顕微鏡分析により、修飾ＩｇＧ抗体ではなく修飾Ｅ６抗体のみが、処置腫瘍において容易に検出可能であったことが示された（図２６Ｆ、上パネル）。修飾抗Ｅ６抗体による腫瘍の処置はまた、ＣＤ３１陽性の低減によって示されるように、腫瘍血管系の破壊ももたらした（図２６Ｆ、上パネル）。同じ腫瘍組織を使用して、切断型カスパーゼ３タンパク質のレベルが上昇したことがさらに示された（図２６Ｆ、下パネル）。

【0141】

細胞透過性抗体によるインビボでのＳＴＡＴ３の標的化。抗体によるＳＴＡＴ３活性の遮断を評価した。しかしながら、Ｓｒｃチロシンキナーゼ分子表面上に曝露されるＳｒｃのリン酸化部位とは異なり、ＳＴＡＴ３の主要なチロシンリン酸化及びアセチル化部位は、折り畳まれたＳＴＡＴ３分子内でのそれらの位置に起因して、アクセスすることが困難である。活性化されたＳＴＡＴ３は多くが核内に封じ込められるが、ＳＴＡＴ３は細胞質に輸送されて再活性化される。球形粒子の拡散特性により、分子量の増加は、タンパク質の区画的蓄積のバランスを崩し得る。したがって、２つの抗体を使用してＳＴＡＴ３または別の相互作用するタンパク質の２つの別個の部分を認識することで、大型で安定した複合体を形成し、それによって活性化ＳＴＡＴ３が細胞質内で区画的に蓄積するのに好都合なようにバランスを傾けることができると仮定した。共焦点顕微鏡分析により、ＳＴＡＴ３の異なる部位を認識する２つの修飾ＳＴＡＴ３抗体が、ＳＴＡＴ３－ｍＣｈｅｒｒｙで一過的にトランスフェクトして一部の細胞が核内にＳＴＡＴ３－ｍＣｈｅｒｒｙを有することを可能にした３Ｔ３ｖ－Ｓｒｃ細胞におけるＳＴＡＴ３タンパク質の細胞内蓄積の増加を促進したことが示された（図２７Ａ）。ウサギ抗ＳＴＡＴ３抗体及び抗ウサギ抗体での同じ細胞の処置もまた、ＳＴＡＴ３タンパク質の細胞質内蓄積の増加をもたらした（図２７Ａ）。しかしながら、細胞質内にＳＴＡＴ３タンパク質を封入するための二重抗体の最も有効な組み合わせは、ＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７であった（図２７Ａ）。エクスポーチン７は、ＳＴＡＴ３の核細胞質間輸送にとって重要であることが示されている（Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０：７４５５－７４６４（２０１０））。

【0142】

ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７の二重抗体が細胞質内にＳＴＡＴ３を保持するのに最も有効であったため（図２７Ａ）、またＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７の相互作用にはＳＴＡＴ３６８５アセチル化が必要であり、ＳＴＡＴ３のアセチル化が腫瘍において広く見られることがわかったため、腫瘍原性の修飾ＳＴＡＴ３ 及びエクスポーチン７をインビボでの腫瘍処置に使用した。実際に、確立されたＢ１６マウス黒色腫を修飾ＳＴＡＴ３及びエクスポーチン７の両方で処置することにより、有意な腫瘍成長の遅延がもたらされたが、いずれの修飾抗体も単独ではそれをもたらさなかった（図２７Ｂ、左パネル）。修飾ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体の局所及び全身の両方の注射により、Ｂ１６黒色腫の腫瘍成長が効果的に阻害された（図２７Ｂ、中央パネル）。修飾ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体の全身注射が、１回の処置当たり２．５μｇという低用量ですら腫瘍成長を効果的に阻害し、全身処置をたった３回の処置後に中止した場合にも強力な抗腫瘍作用が継続されたことが、さらに示された（図２７Ｂ右パネル）。全身抗体処置はまた、ＳＴＡＴ３－ＤＮＡ結合を測定することによって評価されるように、腫瘍ＳＴＡＴ３活性を阻害した（図２７Ｃ）。加えて、全身に送達された修飾ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体は、最後の治療の８日後ですら腫瘍内に保持された（図２７Ｄ）。

【0143】

ヒト神経膠腫異種移植片モデルにおいて修飾ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体の抗腫瘍効力を試験した。確立されたヒトＵ８７神経膠腫保持マウスへの修飾ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体の局所処置及び全身投与のいずれも、有効な抗腫瘍効果をもたらした（図２７Ｅ、上パネル）。さらに、ＳＴＡＴ３の別個の部位を認識する２つの修飾ＳＴＡＴ３抗体を全身投与することの抗腫瘍効果、ならびに修飾抗ＳＴＡＴ３抗体（ウサギ）及び抗ウサギ抗体のものを、ＳＴＡＴ３／エクスポーチン７及び他の対照抗体とともに評価した（図２７Ｅ下パネル）。この一連の実験の抗腫瘍効果は、腫瘍における抗体の検出（図３０Ａ、３０Ｂ）ならびに腫瘍血管系の破壊、ＳＴＡＴ３下流発癌性遺伝子ｃ－Ｍｙｃの阻害、及びアポトーシスを起こす切断型カスパーゼ３の増加（図３１Ａ、３１Ｂ）と関連していた。ヒトＵ２５１神経膠腫腫瘍保持マウスにおける修飾抗体の組織分布を評価するために、局所腫瘍周囲注射及び全身注射の両方によりＳＴＡＴ３／エクスポーチン７抗体を投与した。抗体注射の２４時間後に、腫瘍に加えて複数の器官からの組織を共焦点顕微鏡分析用に調製して、蛍光標識した抗体ならびにＣＤ３１及び切断型カスパーゼ３の存在を検出し、血管系及び腫瘍細胞のアポトーシスに対するこれらの抗体の作用を評価した。この一連の実験から生成したデータは、最後の注射（局所及び全身の両方）の２４時間後に、修飾抗体が腫瘍中で最も顕著であり、腫瘍血管系を破壊し、アポトーシスを誘導することを示した（図２７Ｆ）。

【0144】

これらの研究は、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドでの抗体の修飾により、抗体が細胞膜を透過できるようになることを実証する。さらに、標的タンパク質への結合は、標的化抗体の細胞内保持を促進し、それらが細胞から退出することを効率的に阻止すると見られる。本明細書に提示された結果は、抗体の細胞内送達に関する有効性を示すにすぎないが、この技術プラットフォームは、種々のタンパク質／酵素の細胞透過を可能にすることにも適用できるはずである。

【0145】

インビトロ及びインビボでの結果には、ポリクローナル及びモノクローナルの両方の抗体の使用が含まれる。モノクローナル抗体は現在診療所で使用される唯一のものであり、純粋であるという利点を有するが、ポリクローナル抗体は、それらが抗原／標的の複数のエピトープを認識する能力に起因して、より良好な有効性を有する。ポリクローナル抗体が臨床使用にも好適であるかどうかについては、さらなる検討が待たれ、またさらなる調査を要する。現在のところ、ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドを抗体と結合させるためには２つの異なるアプローチが使用されている。いずれにせよ、現行の研究により、困難であると見なされるものを含む細胞内分子を標的とするために抗体等の巨大分子を現在は使用できるという原理を実証した。

【0146】

実施例３．ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド修飾抗体は細胞に進入し、細胞内標的を認識する。
核酸は、種々の手段で抗体等のタンパク質に結合され得る。活性に対する結合の作用を調査するために、細胞を、ビニルスルホン反応性部分を介してまたはＳ－Ｓ－ヘキサノール反応性部分を通じてホスホロチオエート化核酸に結合した抗体とともにインキュベートした。抗体を、実施例２の方法に概説されるように調製した。αＳＴＡＴ３－ＶＳ－オリゴヌクレオチドＰについては、この抗体は、ＶＳ－オリゴヌクレオチド（αＳＴＡＴ３－ＶＳ－オリゴヌクレオチドＵＰ）と反応させた抗体をＨＰＬＣにより精製することによって調製した。Ｐは、精製されたことを表し、ＵＰは未精製であることを表す。

【0147】

ヒトＫａｒｐａｓ２９９リンパ腫細胞を、ビニルスルホン（ＶＳ）に媒介されるホスホロチオエート化ＤＮＡ－２０量体－オリゴヌクレオチドまたは未精製ＳＳＲ－オリゴヌクレオチド－抗体コンジュゲート／複合体の結合によって修飾された１０μｇ／ｍｌの精製（Ｐ）または未精製（ＵＰ）ａＳＴＡＴ３ウサギ抗体とともに２時間インキュベートした。細胞を固定し、透過処理を行った後、ウサギＩｇＧ種を細胞内染色し、細胞を、ゲーティングによって示されるようにフローサイトメトリーを介してウサギＩｇＧ含量に関して分析した。結果を図３２に示す。具体的には、結果は、異なる化学的手段によりホスホロチオエート化核酸に結合した抗体により、細胞内送達を達成することができることを示す。

【0148】

送達及び認識を確認するために、ヒトＵ２５１神経膠腫細胞を、ビニルスルホン（ＶＳ）に媒介されるホスホロチオエート化ＤＮＡ－２０量体－オリゴヌクレオチドを介して修飾されたもの（レーン１）もしくは非修飾ａＳＴＡＴ３単独（レーン３）のいずれかである１０μｇ／ｍｌの精製（Ｐ）ａＳＴＡＴ３抗体、またはａＳＴＡＴ３及びＶＳを介して結合したものと同じである５００ｐｍｏｌ／ｍｌのホスホロチオエート化ＧｐＣ１６６８（レーン４、レーン２は空）とともに、２時間インキュベートした。全細胞溶解物を調製し、細胞残屑を取り出した後に、アガロースビーズに結合したプロテインＧを添加し、４℃で一晩インキュベートした後、ウエスタンブロット手順を行った。結果を図３３Ａに示す。

【0149】

ヒトＵ２５１細胞を、ＳＳＲを介して修飾された１０μｇ／ｍｌの未精製（ＵＰ）ａＳＴＡＴ３抗体（レーン２）、ビニルスルホン（ＶＳ）に媒介されるホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドの結合により修飾された未精製（ＵＰ）ａＳＴＡＴ３抗体（レーン３）、またはビニルスルホン（ＶＳ）に媒介されるホスホロチオエート化の結合により修飾された精製（Ｐ）ａＳＴＡＴ３抗体（レーン４）とともに、または抗体ＩｇＧ添加なしで（レーン１）２時間インキュベートした。全細胞溶解物を調製し、細胞残屑を取り出した後に、アガロースビーズに結合したプロテインＧを添加し、４℃で一晩インキュベートした後、ウエスタンブロット手順を行った。結果を図３３Ｂに示す。

【0150】

図３３Ａ及び３３Ｂは、ビニルスルホン反応性部分を介して結合されたホスホロチオエート化核酸を有する抗体集団が、細胞に進入し、細胞内標的を認識することができることを示す。さらに、図面は、異なる化学的結合、例えば、Ｓ－Ｓ－ヘキサノールを介して結合されたホスホロチオエート化核酸を有する抗体集団もまた、細胞内送達及び標的認識をもたらすことを示す。

【0151】

実施形態
実施形態Ｐ１．ホスホロチオエート核酸に結合した細胞非透過性タンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートであって、ホスホロチオエート核酸は、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する、細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２．複数のホスホロチオエート核酸が細胞非透過性タンパク質に結合する、実施形態１に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ３．１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上のホスホロチオエート核酸がタンパク質に結合する、実施形態２に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ４．各ホスホロチオエート核酸は、独立して、細胞非透過性タンパク質のリジン、アルギニン、システイン、またはヒスチジンに結合する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ５．各ホスホロチオエート核酸は、タンパク質のリジンに結合する、実施形態４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ６．該タンパク質は、タンパク質のリジン、アルギニン、システイン、ヒスチジン、またはこれらの組み合わせのうちの１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、または１００％に結合したホスホロチオエート核酸を含む、実施形態４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ７．各ホスホロチオエート核酸は、独立して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のアミノ酸残基の長さである、実施形態１～６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ８．各ホスホロチオエート核酸は、独立して、１０～３０残基の長さである、実施形態７に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ９．各ホスホロチオエート核酸は、タンパク質に共有結合で結合する、実施形態１～８のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ１０．各ホスホロチオエート核酸は、非特異性配列を含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ１１．細胞非透過性タンパク質は、高分子量タンパク質である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ１２．細胞非透過性タンパク質は、２５ｋＤを上回る分子量を有する、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ１３．細胞非透過性タンパク質は、２５～７５０ｋＤの分子量を有する、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ１４．細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ１５．抗体は、ＩｇＧ抗体である、実施形態１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ１６．抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体である、実施形態１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ１７．抗体は、Ｆｖフラグメントである、実施形態１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ１８．抗体は、ヒト化抗体である、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ１９．細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２０．細胞内標的は、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患、神経障害、及び癌からなる群から選択される疾患の標的である、実施形態１９に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２１．細胞内標的は、シグナル伝達分子または転写因子である、実施形態１９または２０に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２２．シグナル伝達分子は、ホスファターゼまたはキナーゼである、実施形態２１に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２３．細胞内標的は、癌標的である、実施形態２０に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２４．細胞内標的は、ＳＴＡＴ３である、実施形態１９に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２５．細胞内標的は、エクスポーチン７である、実施形態１９に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２６．細胞非透過性タンパク質は、タンパク質に結合した標識、小分子、または機能性核酸をさらに含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２７．細胞内標的に結合した、実施形態１～２６にいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２８．実施形態１～２６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートを含む、細胞。
実施形態Ｐ２９．実施形態１～２６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
実施形態Ｐ３０．１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質をさらに含む、実施形態２９に記載の組成物。
実施形態Ｐ３１．第２の細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合する、実施形態３０に記載の組成物。
実施形態Ｐ３２．第２の細胞非透過性タンパク質は、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載の細胞非透過性タンパク質と比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、実施形態３１に記載の組成物。
実施形態Ｐ３３．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、実施形態３１に記載の組成物。
実施形態Ｐ３４．第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態３０～３３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｐ３５．実施形態１～２６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートまたは実施形態２９に記載の薬学的組成物と、使用のための説明書と、を含む、キット。
実施形態Ｐ３６．１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質をさらに含む、実施形態３５に記載のキット。
実施形態Ｐ３７．実施形態１～２６のいずれか１つに記載のコンジュゲート及び第２の細胞非透過性タンパク質は、別個の容器内にある、実施形態３６に記載のキット。
実施形態Ｐ３８．実施形態２９に記載の薬学的組成物及び第２の細胞非透過性タンパク質は、別個の容器内にある、実施形態３６に記載のキット。
実施形態Ｐ３９．第２の細胞非透過性タンパク質は、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載の細胞非透過性タンパク質と比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載のキット。
実施形態Ｐ４０．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載のキット。
実施形態Ｐ４１．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞非透過性タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物として製剤化される、実施形態３６～４０のいずれか１つに記載のキット。
実施形態Ｐ４２．第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態３５～４１のいずれか１つに記載のキット。
実施形態Ｐ４３．細胞非透過性タンパク質を細胞内に送達する方法であって、細胞を、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートと接触させることを含む、方法。
実施形態Ｐ４４．細胞非透過性タンパク質は、細胞質内の核タンパク質に結合し、それによって細胞非透過性タンパク質－核タンパク質複合体を形成する、実施形態４３に記載の方法。
実施形態Ｐ４５．細胞非透過性タンパク質－核タンパク質複合体は、細胞の核に進入することができない、実施形態４４に記載の方法。
実施形態Ｐ４６．対象における疾患を治療する方法であって、対象に、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートの有効量を投与することを含み、コンジュゲートの投与により、対象における疾患を治療する、方法。
実施形態Ｐ４７．対象に、１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質を投与することをさらに含む、実施形態４６に記載の方法。
実施形態Ｐ４８．第２の細胞非透過性タンパク質は、実施形態１９～２６のいずれか１つに記載のコンジュゲートと比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、実施形態４７に記載の方法。
実施形態Ｐ４９．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、実施形態４７に記載の方法。
実施形態Ｐ５０．実施形態１～２６のいずれか１つに記載のコンジュゲート及び第２の細胞非透過性タンパク質は、同時に投与される、実施形態４７～４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ５１．実施形態１～２６のいずれか１つに記載のコンジュゲート及び第２の細胞非透過性タンパク質は順次投与される、実施形態４７～４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ５２．第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態４７～５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ５３．第２の治療剤を対象に投与することをさらに含む、実施形態４６～５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ５４．疾患は、自己免疫疾患、発達障害、炎症性疾患、代謝障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患、神経障害、及び癌からなる群から選択される、実施形態４６～５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ５５．疾患は、癌である、実施形態実施形態５４に記載の方法。
実施形態Ｐ５６．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合し、この細胞内標的はＳＴＡＴ３である、実施形態５５に記載の方法。
実施形態Ｐ５７．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合し、この細胞内標的はエクスポーチン７である、実施形態５５に記載の方法。
実施形態Ｐ５８．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する抗体であり、第２の細胞非透過性タンパク質は、エクスポーチン７に特異的に結合する抗体である、実施形態５２に記載の方法。
実施形態Ｐ５９．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する抗体であり、第２の細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３の別のエピトープに特異的に結合する抗体である、実施形態５２に記載の方法。
実施形態Ｐ２ １．ホスホロチオエート核酸に結合した細胞非透過性タンパク質を含む、細胞透過性コンジュゲートであって、ホスホロチオエート核酸は、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する、細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ２．複数のホスホロチオエート核酸が、細胞非透過性タンパク質に結合する、実施形態１に記載の細胞透過性コンジュゲート
実施形態Ｐ２ ３．１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上のホスホロチオエート核酸がタンパク質に結合する、実施形態２に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ４．各ホスホロチオエート核酸は、独立して、細胞非透過性タンパク質のリジン、アルギニン、システイン、またはヒスチジンに結合する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ５．各ホスホロチオエート核酸は、タンパク質のリジンに結合する、実施形態４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ６．該タンパク質は、タンパク質のリジン、アルギニン、システイン、ヒスチジン、またはこれらの組み合わせのうちの１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、または１００％に結合したホスホロチオエート核酸を含む、実施形態４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ７．各ホスホロチオエート核酸は、独立して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のアミノ酸残基の長さである、実施形態１～６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ８．各ホスホロチオエート核酸は、独立して、１０～３０残基の長さである、実施形態７に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ９．各ホスホロチオエート核酸は、タンパク質に共有結合で結合する、実施形態１～８のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ １０．各ホスホロチオエート核酸は、非特異性配列を含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ １１．細胞非透過性タンパク質は、高分子量タンパク質である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ １２．細胞非透過性タンパク質は、２５ｋＤを上回る分子量を有する、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ １３．細胞非透過性タンパク質は、２５～７５０ｋＤの分子量を有する、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ １４．細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ １５．抗体は、ＩｇＧ抗体である、実施形態１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ １６．抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体である、実施形態１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ １７．抗体は、Ｆｖフラグメントである、実施形態１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ １８．抗体は、ヒト化抗体である、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ １９．細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ２０．細胞内標的は、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患、神経障害、及び癌からなる群から選択される疾患の標的である、実施形態１９に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ２１．細胞内標的は、シグナル伝達分子または転写因子である、実施形態１９または２０に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ２２．シグナル伝達分子は、ホスファターゼまたはキナーゼである、実施形態２１に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ２３．細胞内標的は、癌標的である、実施形態２０に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ２４．細胞内標的は、ＳＴＡＴ３、エクスポーチン７、Ｈｅｒ２、及びＳｒｃからなる群から選択される、実施形態１９に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ２５．細胞内標的は、リン酸化Ｓｒｃである、実施形態１９に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ２６．細胞非透過性タンパク質は、タンパク質に結合した標識、小分子、または機能性核酸をさらに含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ２７．細胞内標的に結合した、実施形態１～２６にいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態Ｐ２ ２８．実施形態１～２６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートを含む、細胞。
実施形態Ｐ２ ２９．実施形態１～２６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
実施形態Ｐ２ ３０．１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質をさらに含む、実施形態２９に記載の組成物。
実施形態Ｐ２ ３１．第２の細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合する、実施形態３０に記載の組成物。
実施形態Ｐ２ ３２．第２の細胞非透過性タンパク質は、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載の細胞非透過性タンパク質と比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、実施形態３１に記載の組成物。
実施形態Ｐ２ ３３．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、実施形態３１に記載の組成物。
実施形態Ｐ２ ３４．第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態３０～３３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｐ２ ３５．実施形態１～２６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートまたは実施形態２９に記載の薬学的組成物と、使用のための説明書と、を含む、キット。
実施形態Ｐ２ ３６．１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質をさらに含む、実施形態３５に記載のキット。
実施形態Ｐ２ ３７．実施形態１～２６のいずれか１つに記載のコンジュゲート及び第２の細胞非透過性タンパク質は、別個の容器内にある、実施形態３６に記載のキット。
実施形態Ｐ２ ３８．実施形態２９に記載の薬学的組成物及び第２の細胞非透過性タンパク質は、別個の容器内にある、実施形態３６に記載のキット。
実施形態Ｐ２ ３９．第２の細胞非透過性タンパク質は、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載の細胞非透過性タンパク質と比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載のキット。
実施形態Ｐ２ ４０．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載のキット。
実施形態Ｐ２ ４１．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞非透過性タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物として製剤化される、実施形態３６～４０のいずれか１つに記載のキット。
実施形態Ｐ２ ４２．第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態３５～４１のいずれか１つに記載のキット。
実施形態Ｐ２ ４３．細胞非透過性タンパク質を細胞内に送達する方法であって、細胞を、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートと接触させることを含む、方法。
実施形態Ｐ２ ４４．細胞非透過性タンパク質は、細胞質内の核タンパク質に結合し、それによって細胞非透過性タンパク質－核タンパク質複合体を形成する、実施形態４３に記載の方法。
実施形態Ｐ２ ４５．細胞非透過性タンパク質－核タンパク質複合体は、細胞の核に進入することができない、実施形態４４に記載の方法。
実施形態Ｐ２ ４６．対象における疾患を治療する方法であって、対象に、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートの有効量を投与することを含み、コンジュゲートの投与により、対象における疾患を治療する、方法。
実施形態Ｐ２ ４７．対象に、１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質を投与することをさらに含む、実施形態４６に記載の方法。
実施形態Ｐ２ ４８．第２の細胞非透過性タンパク質は、実施形態１９～２６のいずれか１つに記載のコンジュゲートと比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、実施形態４７に記載の方法。
実施形態Ｐ２ ４９．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、実施形態４７に記載の方法。
実施形態Ｐ２ ５０．実施形態１～２６のいずれか１つに記載のコンジュゲート及び第２の細胞非透過性タンパク質は、同時に投与される、実施形態４７～４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ２ ５１．実施形態１～２６のいずれか１つに記載のコンジュゲート及び第２の細胞非透過性タンパク質は順次投与される、実施形態４７～４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ２ ５２．第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態４７～５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ２ ５３．第２の治療剤を対象に投与することをさらに含む、実施形態４６～５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ２ ５４．疾患は、自己免疫疾患、発達障害、炎症性疾患、代謝障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患、神経障害、及び癌からなる群から選択される、実施形態４６～５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｐ２ ５５．疾患は、癌である、実施形態実施形態５４に記載の方法。
実施形態Ｐ２ ５６．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合し、この細胞内標的は、ＳＴＡＴ３、エクスポーチン７、Ｈｅｒ２、またはＳｒｃである、実施形態５５に記載の方法。
実施形態Ｐ２ ５７．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合し、この細胞内標的は、リン酸化Ｓｒｃである、実施形態５５に記載の方法。
実施形態Ｐ２ ５８．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する抗体であり、第２の細胞非透過性タンパク質は、エクスポーチン７に特異的に結合する抗体である、実施形態５２に記載の方法。
実施形態Ｐ２ ５９．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する抗体であり、第２の細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３の別のエピトープに特異的に結合する抗体である、実施形態５２に記載の方法。
実施形態１．ホスホロチオエート核酸に結合した細胞非透過性タンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートであって、ホスホロチオエート核酸は、細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する、細胞透過性コンジュゲート。
実施形態２．ホスホロチオエート核酸は、細胞非透過性タンパク質に共有結合で結合する、実施形態１に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態３．ホスホロチオエート核酸は、細胞非透過性タンパク質に非共有結合で結合する、実施形態１に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態４．複数のホスホロチオエート核酸が細胞非透過性タンパク質に結合する、実施形態１に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態５．複数のホスホロチオエート核酸のそれぞれが、タンパク質に共有結合で結合する、実施形態４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態６．複数のホスホロチオエート核酸のそれぞれが、タンパク質に非共有結合で結合する、実施形態４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態７．タンパク質は、共有結合及び非共有結合で結合したホスホロチオエート核酸を含む、実施形態４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態８．各ホスホロチオエート核酸は、独立して、細胞非透過性タンパク質のリジン、アルギニン、システイン、またはヒスチジンに結合する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態９．各ホスホロチオエート核酸は、タンパク質のシステインに結合する、実施形態８に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態１０．各ホスホロチオエート核酸は、独立して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上のアミノ酸残基の長さである、実施形態１～９のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態１１．各ホスホロチオエート核酸は、独立して、１０～３０残基の長さである、実施形態１０に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態１２．細胞非透過性タンパク質は、２５ｋＤを上回る分子量を有する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態１３．細胞非透過性タンパク質は、２５～７５０ｋＤの分子量を有する、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態１４．細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態１５．抗体は、ＩｇＧ抗体である、実施形態１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態１６．抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ抗体である、実施形態１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態１７．抗体は、Ｆｖフラグメントである、実施形態１４に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態１８．抗体は、ヒト化抗体である、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態１９．細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態２０．細胞内標的は、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患、神経障害、及び癌からなる群から選択される疾患の標的である、実施形態１９に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態２１．細胞内標的は、シグナル伝達分子または転写因子である、実施形態１９または２０に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態２２．シグナル伝達分子は、ホスファターゼまたはキナーゼである、実施形態２１に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態２３．細胞内標的は、癌標的である、実施形態２０に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態２４．細胞内標的は、ＳＴＡＴ３、エクスポーチン７、Ｈｅｒ２、及びＳｒｃからなる群から選択される、実施形態１９に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態２５．細胞内標的は、リン酸化Ｓｒｃである、実施形態１９に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態２６．細胞非透過性タンパク質は、タンパク質に結合した標識、小分子、または機能性核酸をさらに含む、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態２７．細胞内標的に結合した、実施形態１～２６にいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態２８．未結合の細胞非透過性タンパク質を未結合のホスホロチオエート核酸と接触させ、未結合のホスホロチオエート核酸が未結合の細胞非透過性タンパク質のアミノ酸に共有結合で結合するのを可能にし、それによって結合させて、細胞透過性コンジュゲートを形成することによって作製される、実施形態１に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態２９．ホスホロチオエート核酸は、共有結合反応性部分を含む、実施形態２８に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態３０．共有結合反応性部分は、タンパク質のリジン、アルギニン、システイン、またはヒスチジンと反応する、実施形態２９に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態３１．共有結合反応性部分は、システインと反応する、実施形態２９に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態３２．共有結合反応性部分は、ビニルスルホンである、実施形態２８～３１のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態３３．未結合の細胞非透過性タンパク質を未結合のホスホロチオエート核酸と接触させ、未結合のホスホロチオエート核酸が未結合の細胞非透過性タンパク質に結合するのを可能にし、それによって結合させて、細胞透過性コンジュゲートを形成することによって作製され、未結合のホスホロチオエート核酸が、式－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２）ｚ－ＯＨを有する置換基を含み、式中、ｚは、１～１０の整数である、実施形態１に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態３４．接触は、還元条件下で行われる、実施形態２８～３３のいずれか１項に記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態３５．未結合のホスホロチオエート核酸は、未結合の細胞非透過性タンパク質がモル過剰である状態で存在する、実施形態２８～３３のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲート。
実施形態３６．実施形態１～３５のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートを含む、細胞。
実施形態３７．実施形態１～３５のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
実施形態３８．１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質をさらに含む、実施形態３７に記載の薬学的組成物。
実施形態３９．第２の細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合する、実施形態３８に記載の薬学的組成物。
実施形態４０．第２の細胞非透過性タンパク質は、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載の細胞非透過性タンパク質と比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、実施形態３９に記載の薬学的組成物。
実施形態４１．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、実施形態３９に記載の薬学的組成物。
実施形態４２．第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態３８～４１のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
実施形態４３．実施形態１～３５のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートまたは実施形態３７に記載の薬学的組成物と、使用のための説明書と、を含む、キット。
実施形態４４．１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質をさらに含む、実施形態４３に記載のキット。
実施形態４５．実施形態１～２７のいずれか１つに記載のコンジュゲート及び第２の細胞非透過性タンパク質は、別個の容器内にある、実施形態４４に記載のキット。
実施形態４６．実施形態３７に記載の薬学的組成物及び第２の細胞非透過性タンパク質は、別個の容器内にある、実施形態４４に記載のキット。
実施形態４７．第２の細胞非透過性タンパク質は、実施形態１９～２５のいずれか１つに記載の細胞非透過性タンパク質と比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載のキット。
実施形態４８．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載のキット。
実施形態４９．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞非透過性タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物として製剤化される、実施形態４４～４８のいずれか１つに記載のキット。
実施形態５０．第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態４３～４９のいずれか１つに記載のキット。
実施形態５１．細胞非透過性タンパク質を細胞内に送達する方法であって、細胞を、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートと接触させることを含む、方法。
実施形態５２．細胞非透過性タンパク質は、細胞質内の核タンパク質に結合し、それによって細胞非透過性タンパク質－核タンパク質複合体を形成する、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３．細胞非透過性タンパク質－核タンパク質複合体は、細胞の核に進入することができない、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４．対象における疾患を治療する方法であって、対象に、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の細胞透過性コンジュゲートの有効量を投与することを含み、コンジュゲートの投与により、対象における疾患を治療する、方法。
実施形態５５．対象に、１つ以上のホスホロチオエート核酸に結合した第２の細胞非透過性タンパク質を投与することをさらに含む、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５６．第２の細胞非透過性タンパク質は、実施形態１９～２６のいずれか１つに記載のコンジュゲートと比較して、細胞内標的上の異なるエピトープに結合する、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．第２の細胞非透過性タンパク質は、第２の細胞内標的に結合する、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５８．実施形態１～２６のいずれか１つに記載のコンジュゲート及び第２の細胞非透過性タンパク質は、同時に投与される、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９．実施形態１～２６のいずれか１つに記載のコンジュゲート及び第２の細胞非透過性タンパク質は順次投与される、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０．第２の細胞非透過性タンパク質は、抗体である、実施形態５５～５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１．第２の治療剤を対象に投与することをさらに含む、実施形態５４～６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６２．疾患は、自己免疫疾患、発達障害、炎症性疾患、代謝障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患、神経障害、及び癌からなる群から選択される、実施形態５４～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３．疾患は、癌である、実施形態実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合し、この細胞内標的は、ＳＴＡＴ３、エクスポーチン７、Ｈｅｒ２、またはＳｒｃである、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、細胞内標的に結合し、この細胞内標的は、リン酸化Ｓｒｃである、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６６．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する抗体であり、第２の細胞非透過性タンパク質は、エクスポーチン７に特異的に結合する抗体である、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６７．コンジュゲートの細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３に特異的に結合する抗体であり、第２の細胞非透過性タンパク質は、ＳＴＡＴ３の別のエピトープに特異的に結合する抗体である、実施形態６０に記載の方法。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図23E】

【図23F】

【図23G】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図25E】

【図25F】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図26E】

【図26F】

【図26G】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図27D】

【図27E】

【図27F】

【図27G】

【図28】

【図29】

【図30A】

【図30B】

【図31A】

【図31B】

【図32】

【図33A】

【図33B】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2022-04-26

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

ホスホロチオエート核酸に結合した細胞非透過性タンパク質を含む細胞透過性コンジュゲートであって、前記ホスホロチオエート核酸は、前記細胞非透過性タンパク質の細胞内送達を強化する、細胞透過性コンジュゲート。