特開 2022-92330 コラーゲン産生促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022092330

(43)【公開日】2022-06-22

(54)【発明の名称】コラーゲン産生促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/31 20060101AFI20220615BHJP

   A61K 8/9789 20170101ALI20220615BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20220615BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220615BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20220615BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220615BHJP

【ＦＩ】

A61K36/31 ZNA

A61K8/9789

A61Q19/08

A61P43/00 107

A23L33/105

C12N15/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】4

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020205092

(22)【出願日】2020-12-10

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】507045904

【氏名又は名称】ヤクルトヘルスフーズ株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504180239

【氏名又は名称】国立大学法人信州大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】大野 智弘

(72)【発明者】

【氏名】片山 茂

【テーマコード（参考）】

4B018

4C083

4C088

【Ｆターム（参考）】

4B018MD48

4B018ME14

4B018MF01

4C083AA111

4C083AA112

4C083CC03

4C083EE12

4C083FF01

4C088AB15

4C088AC01

4C088CA05

4C088CA12

4C088MA52

4C088MA63

4C088NA14

4C088ZA89

(57)【要約】      （修正有）

【課題】安全性が高く、長期に適用可能なコラーゲン産生促進剤を提供する。
【解決手段】ケール由来のエクソソームを有効成分とするコラーゲン産生促進剤、コラーゲン産生促進用食品、皮膚のシワ若しくはタルミ予防又は改善剤、及び皮膚のシワ若しくはタルミ予防又は改善用食品を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ケール由来のエクソソームを有効成分とするコラーゲン産生促進剤。

【請求項2】

ケール由来のエクソソームを有効成分とするコラーゲン産生促進用食品。

【請求項3】

ケール由来のエクソソームを有効成分とする皮膚のシワ若しくはタルミ予防又は改善剤。

【請求項4】

ケール由来のエクソソームを有効成分とする皮膚のシワ若しくはタルミ予防又は改善用食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はコラーゲンの産生を促進するコラーゲン産生促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

シワやタルミといった皮膚の老化の原因は様々あるが、その一つに真皮マトリックス成分量の低下が挙げられる。コラーゲンは真皮マトリックスの主要成分であり、皮膚にハリを与え、タルミなどを抑制する作用があるが、加齢や紫外線の照射によりその量が低下することが知られている（非特許文献１）。コラーゲン量の減少の原因としては、真皮の線維芽細胞によるコラーゲンの産生能の低下が挙げられ、その結果、皮膚のシワやタルミが発生する。

【0003】

そこで、コラーゲン産生を促進する素材を天然物から探索する試みがなされ、植物の抽出物（特許文献１、特許文献２）やその成分（特許文献３）の他、種々の物質にコラーゲン産生促進作用があることがこれまでに報告されている。

【0004】

エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は、脂質二重膜で囲まれた膜小胞で、従来は不要な細胞内成分を外に放出するために機能していると考えられてきたが、近年、免疫細胞や腫瘍細胞をはじめ、多くの細胞がエクソソームを放出し、これが分泌細胞（エクソソーム放出細胞）とその標的細胞（エクソソーム受容細胞）の間で蛋白質や脂質を交換する重要なメッセンジャーとなっていることが解明されつつある。

【0005】

エクソソームには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ、タンパク質、脂質等が含まれ、これらのＲＮＡやタンパク質の組成は、エクソソームを分泌する細胞の種類等によって異なることが知られている。植物にもエクソソームあるいはエクソソーム様の小胞が存在するが、エクソソームが持つ活性や機能は由来によって異なると考えられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０１０－２３５４８２号公報

【特許文献2】特開２０１２－１４８９９１号公報

【特許文献3】特開２０１０－０３０９１１号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】American Journal of Pathology. 2006;168:1861-1868.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、安全性が高く、長期に適用可能なコラーゲン産生促進剤を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者は、多くの天然物の中からコラーゲンの産生を促進する素材を見出すべく検討した結果、ケール由来のエクソソームが線維芽細胞におけるコラーゲン産生を促進する作用があることを見出し、本発明を完成した。

【0010】

すなわち、本発明は、以下の１）～４）に係るものである。
１）ケール由来のエクソソームを有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
２）ケール由来のエクソソームを有効成分とするコラーゲン産生促進用食品。
３）ケール由来のエクソソームを有効成分とする皮膚のシワ若しくはタルミ予防又は改善剤。
４）ケール由来のエクソソームを有効成分とする皮膚のシワ若しくはタルミ予防又は改善用食品。

【発明の効果】

【0011】

ケール由来のエクソソームは、ケールから容易に取得可能であり、長期投与又は摂取可能である。したがって、本発明によれば、安全性の高いコラーゲン産生促進剤が提供され、コラーゲンの減少に起因ないし関連する皮膚のシワやタルミの予防又は改善、皮膚の弾力性改善の効果が奏される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ケール由来エクソソームの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察像、エクソソームの粒子数及び粒子径。

【図2】ケール由来エクソソームの皮膚線維芽細胞への取り込み。

【図3】ケール由来エクソソームの皮膚線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン遺伝子発現促進作用。

【図4】ケール由来エクソソームの皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生促進作用。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明において、ケール由来のエクソソームとは、ケールに含まれるエクソソームであって、ケールから得られるエクソソームと同義である。
本発明において、ケールとは、アブラナ科のケール（Brassica oleracea var. acephala）を指すが、ケールの品種は特に限定されない。例えば、ケール変種（Brassica oleracea L.convar. acephala (DC.）Alef. var. sabellica L.）である「ハイパール」（農林水産省品種登録第２０５５５号）の他、ハイクロップ、エステ、エキストラ・カールド・スコッチ等が利用できるが、コラーゲン産生促進作用が強いため、「ハイパール」（農林水産省品種登録第２０５５５号）を利用することが好ましい。また、グルコラファニン又はスルフォラファンの含有量を高めたケールに属する新品種を使用することもできる。また、ブランチング処理がなされたものであってもよい。

【0014】

エクソソームは、膜小胞の一種であり、脂質二重膜で覆われた微粒子であって、脂質、タンパク質、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、及びＤＮＡを含むものである。ケール由来のエクソソームの粒子数は３．０×１０¹⁰～４．０×１０¹²（粉末５ｇあたり），平均粒子径は１１５～２６０ｎｍである。

【0015】

ケールからのエクソソームの調製は、超遠心法、密度勾配遠心法、スクロースクッション法、フィルター法等の公知の方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
例えば、１）ケールの搾汁粉末にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて混合した後，高速冷却遠心分離を用いて，例えば１，２００×ｇ，３，０００×ｇ，１０，０００×ｇのように徐々に回転を早くしながら遠心分離を行い，上清を回収する。２）回収した上清を超遠心機を用いて３０，０００～５０，０００ｒｐｍ，２～２４時間，超遠心分離し、上清を除去することにより粗エクソソーム画分を得る。
次いで、得られた粗エクソソーム画分をイオジキサノール密度勾配遠心分離することにより，エクソソームを単離精製することができる。例えば、チューブ内にイオジキサノールのグラジエント（濃度４０％，２０％，１０％，５％）を作製し、その上に粗エクソソーム画分を添加後，３０，０００～５０，０００ｒｐｍで超遠心分離を行ない、エクソソームの密度（１．１５～１．１９ｇ／ｍＬ）に相当する層を回収して，これをエクソソーム画分とする。さらに，５０，０００～１００，０００ｒｐｍで超遠心分離を行い，沈殿物を精製エクソソームとして得ることができる。

【0016】

本発明で用いられるエクソソームは、精製エクソソーム、粗エクソソーム画分のいずれでも良い。エクソソーム画分は、実質的にエクソソーム又はその溶液もしくは懸濁物であってもよい。また、本発明に用いるエクソソームは、インタクトなものであってもよく、膜小胞構造が一部又は完全に破壊された破砕物であってもよい。

【0017】

本発明のエクソソームは、後記実施例に示すように、正常ヒト皮膚線維芽細胞に取り込まれ、コラーゲン産生を促進する。したがって、ケール由来のエクソソームは、コラーゲン産生促進剤となり、コラーゲン産生促進のために使用できる。
本発明において、コラーゲンの産生促進とは、ヒト皮膚真皮の繊維芽細胞のコラーゲンの産生能、好ましくはＩ型コラーゲンの産生能を促進または改善し、これにより、ヒト皮膚真皮においてコラーゲン量が増大し得ることを意味する。真皮のコラーゲン量を増加させることによって、シワの改善や防止効果が得られ、また、皮膚の弾力性を向上させることができる。したがって、ケール由来のエクソソームは、コラーゲンの減少に起因又は関連する皮膚のシワやタルミの予防又は改善剤にもなり得る。

【0018】

上記コラーゲン産生促進剤は、コラーゲン産生を促進するため、皮膚のシワやタルミを予防又は改善するための医薬品、医薬部外品、化粧品、サプリメント又は食品（コラーゲン産生促進用食品、皮膚のシワ若しくはタルミ予防又は改善用食品）となり、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤となり得る。また、本発明のケール由来のエクソソームは何れも経口摂取した場合に体内に吸収されることから、細胞評価試験の結果と同じ効果を奏すると考えられる。
尚、上記食品には、一般飲食品のほか、コラーゲン産生、皮膚のシワやタルミの予防又は改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性表示食品、特定保健用食品等が包含される。

【0019】

本発明のケール由来のエクソソームを含む上記医薬品（医薬部外品を含む）は、任意の投与形態で投与され得る。投与に際しては、有効成分を経口、直腸内、注射、外用等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。

【0020】

例えば、経口投与製剤としては、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。

【0021】

また、外用剤（化粧品、医薬品および医薬部外品を含む。）の形態としては、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤の他、各種化粧品の形態（例えば、化粧水、乳液、各種クリーム、パック、美容液等の基礎化粧料、シャンプー、リンス、トリートメント、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアクリーム、ヘアミルク等の頭髪用製品、入浴剤等の浴用化粧品、ファンデーション、口紅、マスカラ、アイシャドウ等のメーキャップ化粧品、日焼け止め等）が挙げられる。

【0022】

また、上記外用剤には、必須成分であるケール由来のエクソソームの他に、通常、外用剤に配合される任意成分を配合することができる。このような任意成分としては、界面活性剤、油分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収・散乱剤、粉体、ビタミン類、アミノ酸類、水溶性高分子、発泡剤、顔料、植物抽出物、動物由来成分、海藻抽出物、各種薬剤、添加剤、水等を挙げることができる。

【0023】

また、ケール由来のエクソソームを配合した上記食品の形態は、各種食品組成物の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明のケール由来のエクソソームを単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定化剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。

【0024】

上記の医薬品（医薬部外品を含む）、化粧品及び食品中のケール由来のエクソソームの含有量は、その使用形態により異なるが、通常、エクソソームとして、製剤全質量の０．０１～１０質量％、好ましくは０．１～１質量％である。

【0025】

本発明のケール由来のエクソソームを医薬品、化粧品又は食品として、或いは医薬品や食品に配合して使用する場合の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、エクソソームとして、好ましくは０．１ｍｇ～１００ｇ、より好ましくは１ｍｇ～１０ｇである。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回～数回に分け、数週間～数ヶ月間継続して投与することが好ましい。

【実施例0026】

製造例 ケール由来エクソソームの調製
（１）密度勾配超遠心分離法によるエクソソームの単離
ケール（ブランチング済み，品種：ハイクロップ）およびグルコラファニン高含有ケール（ブランチング済み、品種：ハイパール、以下，「ＧＥＫ」という）の搾汁粉末５．０ｇを遠沈管にそれぞれ量り取り，リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０ｍＬを加えた。搾汁粉末とＰＢＳをよく混合した後，高速冷却遠心分離機（ｈｉｍａｃ ＣＲ２１Ｎ，ｈｉｍａｃ社）を用いて，１，２００×ｇ，４℃で２０分間，３，０００×ｇ，４℃で２０分間，１０，０００×ｇ，４℃で１時間，徐々に回転を早くしながら遠心分離を行い，上清を回収した。回収した上清を０．４５μｍフィルターでろ過後，超遠心機用遠心チューブ（１３ＰＥＴ ＴＵＢＥ，ｈｉｍａｃ社）に１０ｍＬずつ分注した。遠心チューブをスイング型ローター（Ｐ４０ＳＴ，ｈｉｍａｃ社）に取り付け，超遠心機（ｈｉｍａｃ ＣＰ７５β，ｈｉｍａｃ社）を用いて３０，０００ｒｐｍ，４℃で２時間，超遠心分離を行った。上清を捨て，沈殿に５００μＬのＰＢＳを添加し，粗エクソソーム画分とした。次に，Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（６０％イオジキサノール，Ａｂｂｏｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＳ社）を用いたイオジキサノール密度勾配遠心分離により，エクソソームを単離した。遠心チューブの底から，イオジキサノール濃度４０％，２０％，１０％，５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ希釈液を層状に重ねチューブ内にイオジキサノールのグラジエントを作製した。その上に粗エクソソーム画分５００μＬを添加後，３０，０００ｒｐｍ，４℃で１８時間，超遠心分離を行った。上から１ｍＬずつ回収し，エクソソームの密度が１．１５～１．１９ｇ／ｍＬであることを指標に，この密度に相当する層を回収して，これをエクソソーム画分とした。さらに，５５，０００ｒｐｍ，４℃で２時間，超遠心分離を行い，得られた沈殿に５００μＬのＰＢＳを添加し，これを精製エクソソームとした。エクソソームは小分けして，実験に使用するまで－８０℃で保存した。

【0027】

（２）ナノサイト解析によるエクソソームの粒子濃度および粒子径の測定
エクソソームの粒子濃度および粒子径はナノサイト解析により測定した。ナノサイト解析は富士フィルム和光純薬株式会社に委託した。
図１に示すように、ケール由来エクソソームの粒子数は３．９×１０^１２（粉末５ｇあたり），平均粒子径は２００±１．１ｎｍで，ＧＥＫ由来エクソソームの粒子数は１．９×１０^１１（粉末５ｇあたり），平均粒子径は１７６±２．１ｎｍであった。

【0028】

（３）透過電子顕微鏡(TEM)による観察
エクソソーム溶液５００μＬに固定のため２５％グルタルアルデヒドを終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように加え，４℃で一晩静置した。超遠心分離用１．５ｍＬマイクロチューブに移し，超遠心機（ｈｉｍａｃ ＣＰ７５β， ｈｉｍａｃ社）を用いて５５，０００ｒｐｍ，４℃で２時間超遠心分離し，上清を除いた。沈殿物に無水エタノールを５０μＬ加え，エクソソームを洗浄した後，遠心分離エバポレーター（ＣＶＥ－３０００， ＥＹＥＬＡ社）を用いてエタノールを除去した。ＰＢＳ ２０μＬを加えてよく混合し，ＴＥＭ観察用の試料とした。この試料をＣａｒｂｏｎ／Ｆｏｒｍｖａｒ ｆｉｌｍ ｃｏａｔｅｄ ＴＥＭ ｇｒｉｄｓ（ＡＬＬＩＡＮＣＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に５μＬ滴下し，１０分間静置した。添加試料を除去し，１％（ｗ／ｖ）ホスホタングステン酸溶液を５μＬ滴下した。すぐに除去した後，よく乾燥させてＴＥＭ観察用グリッドを作製した。透過電子顕微鏡はＪＥＭ－１４００（日本電子株式会社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用し，操作手順は付属の説明書に従って観察した。観察像を図１に示す。

【0029】

実施例１ ヒト皮膚線維芽細胞へのエクソソームの取り込み評価
ヒト皮膚線維芽細胞ＮＢ１ＲＧＢは理化学研究所バイオリソース研究センター細胞材料開発室から入手した。ＮＢ１ＲＧＢを終濃度５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように２４ｗｅｌｌプレートに各ｗｅｌｌ ０．４ｍＬずつ播種し，１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ－αで２４時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後，１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ－αに置換した。さらに，ＤＮＡに結合する試薬であるＤＡＰＩ（コスモバイオ社）を添加したサンプル（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｖｙｂｒａｎｔ^TM ＤｉＩ Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）で標識したＧＥＫ由来エクソソーム（終濃度５×１０^７粒子／ｍＬ）およびＤＡＰＩ（コスモバイオ社）を添加したサンプル（ＧＥＫ由来エクソソーム）、Ｖｙｂｒａｎｔ^TM ＤｉＩ Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）で標識したケール由来エクソソーム（終濃度５×１０^７粒子／ｍＬ）およびＤＡＰＩ（コスモバイオ社）を添加したサンプル（ケール由来エクソソーム）を作成した。３時間培養後，蛍光顕微鏡ＥＶＯＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）で蛍光観察した（ＤｉＩ：励起波長５５０ｎｍ，蛍光波長５６５ｎｍ）（ＤＡＰＩ：励起波長３６０ｎｍ，蛍光波長４６０ｎｍ）。
図２に示すように、ＧＥＫ由来エクソソームおよびケール由来エクソソームがヒト皮膚線維芽細胞に取り込まれていることが確認された。

【0030】

実施例２ リアルタイムＰＣＲ法を用いたＩ型コラーゲン遺伝子の発現解析
ＮＢ１ＲＧＢを終濃度２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１２ｗｅｌｌプレートに各１ｍＬ／ｗｅｌｌ播種し，１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ－αで２４時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後，ＦＢＳを含まないＭＥＭ－αに置換し，血清飢餓状態で２４時間培養した。その後，ケール由来エクソソームについてはエクソソームを終濃度が、１×１０^８粒子／ｍＬとなるように調製した培地を添加し、ＧＥＫ由来エクソソームについてはエクソソームを終濃度で、１×１０^７、２．５×１０^７粒子／ｍＬとなるように調製した培地を添加し，ＣＯ_２インキュベーター内で１２時間培養した。なお，すべての細胞培養はＣＯ_２インキュベーターで３７℃，ＣＯ_２濃度５％の条件で行った。培地を除去した細胞をＰＢＳで洗浄し，ＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）１ｍＬを加えた。ＲＮＡの抽出は，ＴＲＩｚｏｌの付属説明書に従って行った。

【0031】

抽出したＲＮＡの濃度および純度はＮａｎｏＤｒｏｐ^ＴＭ Ｌｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて測定した。核酸の純度を示すＡ２８０に対するＡ２６０の比（Ａ２６０／Ａ２８０）が１．８～２．１であることを確認し，ｃＤＮＡ合成を行った。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡを６５℃で５分間インキュベーションし，氷上で急冷を行った。ｃＤＮＡ合成にはＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用した。ＲＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ １．５μｇに対してｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒを含む４×ＤＮ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ６μＬおよびＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒを加えて総量２４μＬとした。均一になるようによく撹拌し，３７℃で５分間インキュベーションしてＤＮａｓｅ反応を行った。反応後の溶液を再び氷上に移し，５×ＲＴ Ｍａｔｅｒ Ｍｉｘ II ６μＬを加えて，均一になるようによく撹拌した。その後，３７℃で１５分間，５０℃で５分間，９８℃で５分間インキュベートすることにより逆転写反応を行い，ｃＤＮＡを合成した。

【0032】

Ｉ型コラーゲン遺伝子ｃｏｌ１ａ１の発現量はリアルタイムＰＣＲ法により定量した。反応溶液の組成はｃＤＮＡを超純水で１０倍希釈した溶液２μＬ，ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社） １０μＬ，プライマー溶液（１０μｍｏｌ／μＬ）をＦｏｒｗａｒｄ，Ｒｅｖｅｒｓｅそれぞれ０．４μＬおよび超純水７．２μＬとして全量２０μＬとなるように調製した。反応条件はプレインキュベートを９５℃で１分間行った後，２ｓｔｅｐ ＰＣＲ（９５℃，５秒および６０℃，３０秒）を４０サイクル行った。ハウスキーピング遺伝子である１８Ｓ ｒＲＮＡを内部標準として各遺伝子発現量を比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）により解析した。

【0033】

【表1】

【0034】

図３に示すように、Ｉ型コラーゲン遺伝子ｃｏｌ１ａ１の発現を解析したところ，ケール，ＧＥＫともにエクソソームの添加によりｃｏｌ１ａ１の遺伝子発現量が顕著に増加することが示された。

【0035】

実施例３ ヒト皮膚線維芽細胞を用いたコラーゲン産生能の評価
ＮＢ１ＲＧＢを終濃度２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１２ｗｅｌｌプレートに各ｗｅｌｌ １ｍＬずつ播種し，１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ－αで２４時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後，ＦＢＳを含まないＭＥＭ－αに置換し，血清飢餓状態で２４時間培養した。さらに，エクソソーム（終濃度１×１０^７～２×１０^８粒子／ｍＬ）を添加後，１８時間培養した細胞から培地を除去し，ＰＢＳで２回洗浄を行った。このとき，コラーゲン産生促進作用が報告されているＴＧＦ－β（終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）をポジティブコントロールとして，コラーゲン減少の誘発が報告されているＨ_２Ｏ_２（終濃度１ｍＭ）をネガティブコントロールとして使用した。ＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を８０μＬ添加し，回収した細胞液を１．５ｍＬマイクロチューブに移し，３０秒間ボルテックスミキサーで混和した後，１２，０００×ｇ，４℃で１０分間，遠心分離して上清を回収した。１０％ ２－メルカプトエタノールを含有するＳＤＳサンプルバッファーを加えて混合した後，１００℃で５分間インキュベートし，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用の試料とした。コラーゲンの発現解析は、以下に示すようにウエスタンブロッティング法により行った。

【0036】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用試料を各レーンのタンパク質濃度が２０μｇとなるようにＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥには，１０％アクリルアミドを含有した分離ゲルと５％アクリルアミドを含有した濃縮ゲルを用いた。電気泳動は１００Ｖ，１００ｍＡで１２０分間行った。電気泳動後，ゲルを転写溶液に１０分間浸け，セミドライ式転写装置（ＡＴＴＯ社）を使用して，３０Ｖ，１．５ｍＡ／ｃｍ^２，９０分間の条件でＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ社）に転写した。タンパク質が転写されたＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴ（０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）で５分間，３回洗浄して，ブロッキングを行った。ブロッキング剤には３％（ｗ／ｖ）スキムミルク／ＰＢＳＴを用い，室温で５分間２回，浸透させた。一次抗体として，Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ＣＯＬＩポリクロナール抗体（２，０００倍希釈， Ａｂｃａｍ社）またはＭｏｕｓｅ ａｎｔｉ－β－ａｃｔｉｎモノクロナール抗体ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１０，０００倍希釈，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて４℃で一晩振盪して反応させた。コラーゲン検出の二次抗体として，Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ抗体（４，０００倍希釈，Ｂｉｏ Ｒａｄ社）を用いて，１時間振盪させながら反応させた。最後に，化学発光イメージャー ＥＺ－Ｃａｐｔｕｒｅ ＭＧ（ＡＴＴＯ社）で撮影し，ソフトウェア Ｉｍａｇｅ Ｊにより目的タンパク質の定量を行った。

【0037】

図４に示すように、ポジティブコントロールのＴＧＦ－βではコラーゲンの増加，ネガティブコントロールのＨ_２Ｏ_２ではコラーゲンの低下が認められた。これに対して，ケール，ＧＥＫともにエクソソームの添加によりコラーゲン産生が顕著に増加することが示され、ケールよりもＧＥＫがコラーゲン産生促進効果が高かった。

【0038】

以上の結果より、ケールおよびＧＥＫ由来エクソソームはヒト皮膚皮膚線維芽細胞においてコラーゲン産生促進作用を発揮することが明らかになった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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