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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022093333
(43)【公開日】2022-06-23
(54)【発明の名称】グラム陽性菌の形質転換方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/74 20060101AFI20220616BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220616BHJP
【ＦＩ】
C12N15/74 Z ZNA
C12N1/21
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022048676
(22)【出願日】2022-03-24
(62)【分割の表示】P 2019558291の分割
【原出願日】2018-12-07
(31)【優先権主張番号】P 2017235374
(32)【優先日】2017-12-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100118371
【弁理士】
【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】吉田 健一
(57)【要約】
【課題】大きなサイズのＤＮＡをグラム陽性菌の宿主ＤＮＡ中に無傷で導入でき、簡便で効率のよいグラム陽性菌の新規形質転換方法を提供すること。
【解決手段】さらには、所望のＤＮＡセグメントをレシピエント（受容菌）の染色体に蓄積させ、人為的にデザインされた長大なＤＮＡを作成することが可能となる方法、形質転換後の細胞が、自然環境の制御の観点からも問題とならない方法を提供することも目的とする。本発明はＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミドを用いることを特徴とする、接合伝達によるグラム陽性菌の形質転換方法である。上記ヘルパープラスミドは、ｐＬＳ２０ｃａｔからｏｒｉＴ領域を不活化したプラスミドであることが好ましい。
【選択図】なし
【解決手段】さらには、所望のＤＮＡセグメントをレシピエント（受容菌）の染色体に蓄積させ、人為的にデザインされた長大なＤＮＡを作成することが可能となる方法、形質転換後の細胞が、自然環境の制御の観点からも問題とならない方法を提供することも目的とする。本発明はＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミドを用いることを特徴とする、接合伝達によるグラム陽性菌の形質転換方法である。上記ヘルパープラスミドは、ｐＬＳ２０ｃａｔからｏｒｉＴ領域を不活化したプラスミドであることが好ましい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グラム陽性菌の形質転換方法に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、細菌等の形質転換方法としては、組換えプラスミドやＤＮＡ断片を大腸菌等の宿主に導入するコンピテントセル形質転換法（非特許文献１参照）、プロトプラスト形質転換法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が知られている。しかし、このような従来の形質転換方法では、例えば１００ｋｂ以上の大きなサイズのＤＮＡ断片を、宿主ＤＮＡ中に導入することは困難である。
【0003】
大きなサイズのＤＮＡ断片を宿主ＤＮＡ中に導入する方法としては、自然形質転換能力を獲得した枯草菌による接合伝達を用いた方法が知られている。しかし、この方法では枯草菌を、自然形質転換能力が高い細胞へと導く特別な培養条件が必要であることや、形質転換そのものに時間と手間がかかるという不都合がある。さらに、数１００ｋｂを超える大きなサイズのＤＮＡを無傷で宿主ＤＮＡ中に導入することは困難である。
【0004】
一方、納豆菌に由来するプラスミドｐＬＳ２０は、接合伝達によって、枯草菌等のグラム陽性菌細胞から他のグラム陽性菌細胞へと複製移動する能力を有することが知られている。さらにこのｐＬＳ２０は、ドナー中でヘルパープラスミドとして機能し、ドナーが有する他のプラスミドをレシピエントに移動させることができることも明らかになった（非特許文献２及び３参照）。レシピエント側のグラム陽性細菌には他のプラスミドと同時にヘルパープラスミドであるｐＬＳ２０も移動してくるため、他のグラム陽性細菌に対して、ドナーとしてさらに接合伝達を繰り返すことが可能となり、自然環境の制御の観点からは問題ともなり得る（非特許文献４及び５参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】J. Bacterial. 93, 1967 ;1925
【非特許文献2】Ramsay JP, Firth N. Curr OpinMicrobiol. 2017;38:1-9
【非特許文献3】Tanaka T, Kuroda M, Sakaguchi K. JBacteriol. 1977;129:1487-94
【非特許文献4】Davies J, Davies D.， Microbiol MolBiol Rev.2010;74:417-33
【非特許文献5】Berglund, B.， Infect EcolEpidemiol. 2015;5:28564
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
このような状況の中、本発明は、大きなサイズのＤＮＡをグラム陽性菌の宿主ＤＮＡ中に無傷で導入でき、簡便で効率のよいグラム陽性菌の新規形質転換方法を提供することを目的とする。さらには、所望のＤＮＡセグメントをレシピエント（受容菌）の染色体に蓄積させ、人為的にデザインされた長大なＤＮＡを作成することが可能となる方法、形質転換後の細胞が、自然環境の制御の観点からも問題とならない方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ｐＬＳ２０ｃａｔのｏｒｉＴＬＳ２０領域を不活化したｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴをヘルパープラスミドとして使用することで、グラム陽性菌の接合伝達において、ヘルパープラスミド自体はレシピエント（受容菌）側に伝達されず、所望の染色体やプラスミドのみを伝達した形質転換細胞を作成することができることを見出した。本発明の方法によると、得られた形質転換細胞は、ヘルパープラスミドを有していないので、再度同様の方法により、所望の染色体やプラスミドの接合伝達を、レシピエント（受容菌）として受けることが可能となる。したがって、本発明によると、所望のＤＮＡセグメントをレシピエント（受容菌）の染色体に蓄積させ、長大なＤＮＡをデザインして作成することが可能となる。さらに、本発明の方法により得られた形質転換細胞は、ヘルパープラスミドを有していないので、ドナーとしてさらに接合伝達を繰り返すこともないため、自然環境の制御の観点での問題も生じない。また、本発明の方法による形質転換は、ドナー（供与菌）とレシピエント（受容菌）の液体培養液を混合するだけで、迅速かつ簡便に行うことができ、合成生物学的な産業活動において、微生物や培養細胞等の作成に好適に用いられ得る。即ち、本発明の要旨は、以下に示すとおりである。
【0008】
［１］ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミドを用いることを特徴とする、接合伝達によるグラム陽性菌の形質転換方法。
［２］上記ヘルパープラスミドが、ｐＬＳ２０ｃａｔからｏｒｉＴ領域を不活化したプラスミドである、［１］に記載の形質転換方法。
［３］上記接合伝達における供与菌が、上記ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミド、及び上記ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を組み込んだ染色体ＤＮＡ又はプラスミドを有する、［１］又は［２］に記載の形質転換方法。
［４］上記供与菌がグラム陽性菌から成る群より選択される、少なくとも一種である、［３］に記載の形質転換方法。
［５］上記接合伝達における受容菌が、グラム陽性菌から成る群より選択される、少なくとも一種である、［３］又は［４］に記載の形質転換方法。
［６］上記供与菌及び受容菌が、枯草菌である、［５］に記載の形質転換方法。
［７］グラム陽性菌の形質転換方法であって、
ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミド、及び上記ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を組み込んだ染色体ＤＮＡ又はプラスミドを有する供与菌を調製する工程（１）、及び
上記供与菌から受容菌に対して接合伝達が行われる工程（２）、
を含むことを特徴とする、形質転換方法。
［８］上記接合伝達により得られた形質転換細胞を受容菌として、上記工程（１）及び（２）を繰り返すことにより、所望のＤＮＡセグメントを受容菌の染色体に蓄積させる、［７］に記載の形質転換方法。
［９］ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミド、及び上記ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を組み込んだ染色体ＤＮＡ又はプラスミドを有する、グラム陽性菌。
［１０］接合伝達によるグラム陽性菌の形質転換に用いるための、ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミド。
［２］上記ヘルパープラスミドが、ｐＬＳ２０ｃａｔからｏｒｉＴ領域を不活化したプラスミドである、［１］に記載の形質転換方法。
［３］上記接合伝達における供与菌が、上記ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミド、及び上記ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を組み込んだ染色体ＤＮＡ又はプラスミドを有する、［１］又は［２］に記載の形質転換方法。
［４］上記供与菌がグラム陽性菌から成る群より選択される、少なくとも一種である、［３］に記載の形質転換方法。
［５］上記接合伝達における受容菌が、グラム陽性菌から成る群より選択される、少なくとも一種である、［３］又は［４］に記載の形質転換方法。
［６］上記供与菌及び受容菌が、枯草菌である、［５］に記載の形質転換方法。
［７］グラム陽性菌の形質転換方法であって、
ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミド、及び上記ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を組み込んだ染色体ＤＮＡ又はプラスミドを有する供与菌を調製する工程（１）、及び
上記供与菌から受容菌に対して接合伝達が行われる工程（２）、
を含むことを特徴とする、形質転換方法。
［８］上記接合伝達により得られた形質転換細胞を受容菌として、上記工程（１）及び（２）を繰り返すことにより、所望のＤＮＡセグメントを受容菌の染色体に蓄積させる、［７］に記載の形質転換方法。
［９］ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミド、及び上記ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を組み込んだ染色体ＤＮＡ又はプラスミドを有する、グラム陽性菌。
［１０］接合伝達によるグラム陽性菌の形質転換に用いるための、ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミド。
【発明の効果】
【0009】
本発明のグラム陽性菌の形質転換方法によると、大きなサイズのＤＮＡをレシピエント側に無傷で、かつ短時間で伝達することができる。さらに、ｐＬＳ２０ｃａｔのｏｒｉＴＬＳ２０領域を不活化したｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴをヘルパープラスミドとして使用することで、グラム陽性菌の接合伝達において、ヘルパープラスミド自体はレシピエント側に伝達されず、所望の染色体やプラスミドのみを伝達した形質転換細胞を作成することができる。本発明の方法によると、得られた形質転換細胞は、ヘルパープラスミドを有していないので、再度同様の方法により、所望の染色体やプラスミドの接合伝達を、レシピエント（受容菌）として受けることが可能となる。したがって、本発明によると、所望のＤＮＡセグメントをレシピエント（受容菌）の染色体に蓄積させ、長大なＤＮＡをデザインして作成することが可能となる。さらに、本発明の方法により得られた形質転換細胞は、ヘルパープラスミドを有していないので、ドナーとしてさらに接合伝達を繰り返すこともないため、自然環境の制御の観点での問題も生じない。また、本発明の方法による形質転換は、ドナー（供与菌）とレシピエント（受容菌）の液体培養液を混合するだけで、迅速かつ簡便に行うことができ、合成生物学的な産業活動において、微生物や培養細胞等の作成に好適に用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明のグラム陽性菌の形質転換方法について詳細に説明する。なお、本明細書において、ＤＮＡやベクターの調製等の分子生物学的手法は、特に明記しない限り、当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。
【0012】
＜グラム陽性菌の形質転換方法＞
本発明のグラム陽性菌の形質転換方法は、接合伝達においてＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミドを用いることを特徴とする。
本発明のグラム陽性菌の形質転換方法は、接合伝達においてＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミドを用いることを特徴とする。
【0013】
本発明においてグラム陽性菌とは、グラム染色に陽性の細菌及びその他の菌類を言う。グラム陽性菌は、一般に比較的厚い（１５ｎｍ～８０ｎｍ）細胞壁を持ち、多くは外層にリポ多糖を欠く。またリソチームに感受性が高いものが多い。具体的なグラム陽性菌としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ；枯草菌、炭疽菌、好熱性細菌（ジオバチルス）、セレウス菌、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・プミルス、バチルス・チューリンゲンシス等）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；ブドウ球菌）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；連鎖球菌）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ；乳酸菌等）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）等が挙げられる。本発明において、グラム陽性菌としては、バチルスが好ましく、中でも、枯草菌、炭疽菌、好熱性バチルス属細菌がより好ましく、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓがさらに好ましい。
【0014】
本発明において形質転換とは、グラム陽性菌のゲノムＤＮＡの改変又はグラム陽性菌へのＤＮＡの導入によりもたらされる改変をいい、染色体ＤＮＡの欠失、複製、変異、又は自律複製プラスミドの導入による形質変化全てを含む。導入されたＤＮＡは、染色体に組み込まれて維持、複製されてもよく、プラスミド等のように染色体とは独立して維持、複製されてもよい。ＤＮＡをグラム陽性菌の染色体の特定の部位に組み込む場合には、相同組換え技術を用いてもよい。
【0015】
本発明において接合伝達とは、異なる形質を持つ細菌を混合培養した時に起こる現象であり、ある細菌（供与菌）の遺伝子の一部が、他の細菌（受容菌）に移ることを指す。接合伝達能力の強度は、供与体の染色体上あるいは供与体が持つプラスミド上の接合伝達に関与する遺伝子によって影響を受ける。接合伝達に関与する遺伝子には、自己伝達性遺伝子及び共役伝達性遺伝子、そしてｏｒｉＴ配列がある。自己伝達性遺伝子がコードするタンパク質は、供与菌・受容菌間の相互作用に関与する。共役伝達性遺伝子がコードするタンパク質はｏｒｉＴ配列にニックを入れる機能、さらに一本鎖となったＤＮＡを安定に運ぶ機能を有する。ｏｒｉＴ配列は、ニックサイトとニックが入るための認識配列から成る。これら３種が共存してはじめて接合伝達が起こる。
【0016】
本発明においてヘルパープラスミドとは、ある遺伝子を目的の菌に移行させようとする場合に、その菌への遺伝子の移行を助けるプラスミドをいい、具体的には、枯草菌におけるｐＬＳ２０等を挙げることができる。ヘルパープラスミドを有する菌を形質転換の際に用いると、自然形質転換と比較して、形質転換効率、手技の簡便さ、それに要する時間効率を著しく向上させることができる。
【0017】
本発明においてＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域とは、ＤＮＡが移動するための開始配列を含む領域をいう。
【0018】
以下に、本発明のグラム陽性菌の形質転換方法を具体的に説明する。すなわち、本発明のグラム陽性菌の形質転換方法は、
工程（１）：ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミド、及び上記ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を組み込んだ染色体ＤＮＡ又はプラスミドを有する供与菌を調製する工程、及び
工程（２）：上記供与菌から受容菌に対して接合伝達が行われる工程
を有する。
工程（１）：ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を不活化したヘルパープラスミド、及び上記ＤＮＡ移動開始点（ｏｒｉＴ）領域を組み込んだ染色体ＤＮＡ又はプラスミドを有する供与菌を調製する工程、及び
工程（２）：上記供与菌から受容菌に対して接合伝達が行われる工程
を有する。
【0019】
本発明のグラム陽性菌の形質転換方法は、必要に応じて、所望のＤＮＡセグメントを受容菌の染色体に蓄積させる工程（３）をさらに含むことが好ましい。
【0020】
［工程（１）］
（レシピエント株（受容菌）の構築工程）
レシピエント株（受容菌）としては、上述のとおり、バチルスを好ましく、中でも枯草菌、炭疽菌、好熱性細菌をより好ましく、枯草菌を更に好ましく用いることができる。これらのレシピエント株（受容菌）には、工程（２）において接合伝達による形質転換の有無を確認できるように、あらかじめ抗生物質耐性遺伝子を導入する。レシピエント株（受容菌）への抗生物質耐性遺伝子の導入は、当業者に従来公知の方法により行うことができる。
（レシピエント株（受容菌）の構築工程）
レシピエント株（受容菌）としては、上述のとおり、バチルスを好ましく、中でも枯草菌、炭疽菌、好熱性細菌をより好ましく、枯草菌を更に好ましく用いることができる。これらのレシピエント株（受容菌）には、工程（２）において接合伝達による形質転換の有無を確認できるように、あらかじめ抗生物質耐性遺伝子を導入する。レシピエント株（受容菌）への抗生物質耐性遺伝子の導入は、当業者に従来公知の方法により行うことができる。
【0021】
例えば、レシピエント株（受容菌）として枯草菌を用いる場合、枯草菌のｃｏｍＫ等の遺伝子を、スペクチノマイシン耐性遺伝子等による置換によって不活性化することにより導入することができる。すなわち、それぞれｃｏｍＫ等の遺伝子の上流及び下流領域に対応する２つのＤＮＡ断片を、枯草菌ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅させる。その際、上流断片及び下流断片に適切なプライマーを設計して用いる。また、ＴＭＯ３１０株等の他の枯草菌株のスペクチノマイシン耐性遺伝子等を含む別のＤＮＡ断片を、適切なプライマーを用いて増幅する。組換えＰＣＲにより、３つの断片を連結し、スペクチノマイシン耐性遺伝子等をｃｏｍＫ等の上流と下流の領域の間に挟み込む。枯草菌に形質転換して組換えＰＣＲ断片をレシピエント株に導入することでスペクチノマイシン等の抗生物質耐性を付与し、本発明においてレシピエント株を改変した新たな枯草菌株を得ることができる。
【0022】
（ｏｒｉＴ領域を不活化させたヘルパープラスミドの構築工程）
ヘルパープラスミドのｏｒｉＴ領域の不活化は、当業者に従来公知の遺伝子操作方法に従って行うことができる。なお、ｏｒｉＴ領域の不活化は、ｏｒｉＴ領域の一部欠失、ｏｒｉＴ領域の全体の欠失、ｏｒｉＴ領域の１若しくは複数の塩基の置換を含む。例えば、ｍａｒｋｅｒ－ｆｒｅｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ等の方法によりｏｒｉＴ領域を欠失させて不活性化することができる。以下に、ヘルパープラスミドとしてｐＬＳ２０ｃａｔを用いる場合の例を説明する。
ヘルパープラスミドのｏｒｉＴ領域の不活化は、当業者に従来公知の遺伝子操作方法に従って行うことができる。なお、ｏｒｉＴ領域の不活化は、ｏｒｉＴ領域の一部欠失、ｏｒｉＴ領域の全体の欠失、ｏｒｉＴ領域の１若しくは複数の塩基の置換を含む。例えば、ｍａｒｋｅｒ－ｆｒｅｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ等の方法によりｏｒｉＴ領域を欠失させて不活性化することができる。以下に、ヘルパープラスミドとしてｐＬＳ２０ｃａｔを用いる場合の例を説明する。
【0023】
ｐＬＳ２０ｃａｔのｏｒｉＴＬＳ２０の上流（フラグメント１）及び下流（フラグメント２）領域に対応する２つのＤＮＡ断片を、ｐＬＳ２０ｃａｔＤＮＡを鋳型として、上流領域のプライマーｏｒｉＴ－ｕＦ／ｏｒｉＴ－ｕＲ及びｏｒｉＴ－ｄＦ／ｏｒｉを用いてＰＣＲにより増幅する。フラグメント１の末端及びフラグメント２の先端は、２２ｂｐについて同一となるため、これらの領域を利用して、形質転換によってｏｒｉＴＬＳ２０領域を欠失させることができる。ｍａｚＦ ｋａｎカセットの別のＤＮＡ断片（フラグメント３）は、プライマーとしてｍａｚＦ－Ｆ／ｍａｚＦ－Ｒを用いてＴＭＯ３１１ ＤＮＡから増幅させる。３つのＰＣＲフラグメントは、ｏｒｉＴ－ｕＦ／ｏｒｉＴ－ｄＲをプライマーとして用いた組換えＰＣＲによって、１－３－２の順序で連結するように設計することができる。次に、組換えＰＣＲ断片をＰＫＳ１１株に形質転換して、カナマイシン耐性を与え、新しい株ＹＮＢ０２２を得ることができる。この株においては、ｐＬＳ２０ｃａｔがｏｒｉＴＬＳ２０領域の二重交差事象を介してＰＣＲ断片を組み込むことによって改変される。ＹＮＢ０２２をカナマイシンを含有するＬＢ液体培地中、３７℃で一晩程度増殖させる。培養液のアリコートを、１ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有する新鮮なＬＢ液体培地中に移し、細胞を３７℃で２時間程度増殖させる。次に、培養液のアリコートを１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢプレート上に広げ、３７℃で一晩程度インキュベートする。ＩＰＴＧの存在下では、ｍａｚＦが発現され、自殺毒素が産生されるため、分子内組換えによりｍａｚＦ ｋａｎカセットを飛び出すことができる細胞のみが生き残ることができるようになる。なお、プレート上に出現するコロニーのうち、カナマイシン感受性コロニーについて配列決定して、ｏｒｉＴＬＳ２０領域が正しく欠失されていることを確認することができる。上記各プライマーは、下記表２に記載のものである。
【0024】
（ドナー株の構築工程）
ドナー株（供与菌）としては、上述のとおり、バチルスを好ましく、中でも枯草菌、炭疽菌、好熱性細菌をより好ましく、枯草菌を更に好ましく用いることができる。本工程において、ドナー株の作成には上記で調製したｏｒｉＴ領域を不活化させたヘルパープラスミドを事前に導入してある枯草菌を用い、その染色体ＤＮＡにヘルパープラスミド由来のｏｒｉＴ領域を組み込む。また、染色体ＤＮＡの代わりに、プラスミドを伝達することもできるが、その場合にはヘルパープラスミド由来のｏｒｉＴ領域を含むプラスミドを、ｏｒｉＴ領域を不活化させたヘルパープラスミドを事前に導入してある枯草菌に導入して工程（２）で使用できるドナー株を調製する。
ドナー株（供与菌）としては、上述のとおり、バチルスを好ましく、中でも枯草菌、炭疽菌、好熱性細菌をより好ましく、枯草菌を更に好ましく用いることができる。本工程において、ドナー株の作成には上記で調製したｏｒｉＴ領域を不活化させたヘルパープラスミドを事前に導入してある枯草菌を用い、その染色体ＤＮＡにヘルパープラスミド由来のｏｒｉＴ領域を組み込む。また、染色体ＤＮＡの代わりに、プラスミドを伝達することもできるが、その場合にはヘルパープラスミド由来のｏｒｉＴ領域を含むプラスミドを、ｏｒｉＴ領域を不活化させたヘルパープラスミドを事前に導入してある枯草菌に導入して工程（２）で使用できるドナー株を調製する。
【0025】
ドナー株の染色体ＤＮＡにヘルパープラスミド由来のｏｒｉＴ領域を組み込む方法は、当業者に従来公知の遺伝子操作の方法に従って行うことができる。以下に、ヘルパープラスミドとしてｐＬＳ２０ｃａｔを用いて、ドナー株としての枯草菌ＹＮＢ０６０を構築する場合を一例として、本工程を説明する。
【0026】
すなわち、プライマーｙｈｆＭ－ｕＦ／ｙｈｆＭ－ｕＲ１（上流について）及びｙｈｆＭ－ｄＦ／ｙｈｆＭ－ｄＲ（下流について）を用いて、ｙｈｆＭの上流（フラグメント１）及び下流（フラグメント４）領域に対応する２つの断片を枯草菌１６８株ＤＮＡから増幅する。ｏｒｉＴＬＳ２０を含むフラグメント２を、プライマーｏｒｉＴ－Ｆ／ｏｒｉＴ－Ｒを用い、ｐＬＳ２０ｃａｔを鋳型として増幅する。さらに、プライマーｅｒｍ－Ｆ１／ｅｒｍ－Ｒを用いて、プラスミドｐＭｕｔｉｎ２を鋳型とし、エリスロマイシン耐性遺伝子を有するフラグメント３を増幅する。フラグメント１～４をプライマーｙｈｆＭ－ｕＦ／ｙｈｆＭ－ｄＲを用いた組換えＰＣＲにより１－２－３－４の順序で連結する。菌株ＴＭＯ３１１（ａｐｒＥ：：ｋａｎ）を組換えＰＣＲ断片で形質転換し、エリスロマイシン及びカナマイシンの両方に耐性のコロニーを選択し、ドナー株（ＹＮＢ０６０）とすることができる。
【0027】
［工程（２）］
本工程においては、上記ドナー株からレシピエント株に対して接合伝達が行われる。ドナー株及びレシピエント株を、それぞれ適切な抗生物質を含有するＬＢ液体培地中、１８０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩程度培養する。各培養物を、抗生物質を含まない新鮮なＬＢ培地中、ＯＤ６００が０．０５程度となる細胞密度に希釈し、１８０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートする。ＯＤ６００が０．５～０．７に達したとき、５００μＬのドナー及びレシピエント培養物を１．５ｍＬのマイクロチューブ中で混合し、３７℃で２分～２時間、好ましくは５分～１時間、より好ましくは１０分～３０分、さらに好ましくは１５分間程度放置する。従来は数時間以上を要した接合伝達の工程が、本発明の方法によると、１５分程度でも十分な伝達を達成することができる。混合物を連続希釈し、抗生物質の様々な組み合わせを含むＬＢプレート上に広げて、コロニーを一晩増殖させる。それらのそれぞれのプレートにおいて、接合伝達による形質転換効率を算出するために、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定し、形質転換されたＣＦＵ／総レシピエントのＣＦＵ×１０６（ｐｐｍ）を求める。
本工程においては、上記ドナー株からレシピエント株に対して接合伝達が行われる。ドナー株及びレシピエント株を、それぞれ適切な抗生物質を含有するＬＢ液体培地中、１８０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩程度培養する。各培養物を、抗生物質を含まない新鮮なＬＢ培地中、ＯＤ６００が０．０５程度となる細胞密度に希釈し、１８０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートする。ＯＤ６００が０．５～０．７に達したとき、５００μＬのドナー及びレシピエント培養物を１．５ｍＬのマイクロチューブ中で混合し、３７℃で２分～２時間、好ましくは５分～１時間、より好ましくは１０分～３０分、さらに好ましくは１５分間程度放置する。従来は数時間以上を要した接合伝達の工程が、本発明の方法によると、１５分程度でも十分な伝達を達成することができる。混合物を連続希釈し、抗生物質の様々な組み合わせを含むＬＢプレート上に広げて、コロニーを一晩増殖させる。それらのそれぞれのプレートにおいて、接合伝達による形質転換効率を算出するために、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定し、形質転換されたＣＦＵ／総レシピエントのＣＦＵ×１０６（ｐｐｍ）を求める。
【0028】
［工程（３）］
本工程においては、所望のＤＮＡセグメントを受容菌の染色体に蓄積させる。具体的には、上記工程（２）の接合伝達により得られた形質転換細胞を受容菌として、上記工程（１）及び（２）を繰り返すことにより、所望のＤＮＡセグメントを受容菌の染色体に蓄積させることができる。
本工程においては、所望のＤＮＡセグメントを受容菌の染色体に蓄積させる。具体的には、上記工程（２）の接合伝達により得られた形質転換細胞を受容菌として、上記工程（１）及び（２）を繰り返すことにより、所望のＤＮＡセグメントを受容菌の染色体に蓄積させることができる。
【0029】
本発明の形質転換方法において、ドナー株とレシピエント株が異種となる場合には、接合伝達されるＤＮＡが、レシピエント株内で制限酵素等により分解される場合がある。そのような場合には、上記工程（１）において、ドナー株中で、レシピエント株内と同様のＤＮＡ修飾（メチル化修飾等）が行われるように、あらかじめドナー株にメチル化酵素を導入する形質転換を行うことが考えられる。例えば、レシピエント株として好熱性細菌（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ；ＧＫ）を用いる場合、特開２０１１－２１１９６８号公報に開示された方法を採用することができる。具体的には、ＧＫへのプラスミド伝達ドナーには、ＤＮＡメチラーゼの付与、及びｒａｐ遺伝子発現の強制増強のための遺伝子操作を施すことにより効率をさらに向上させることができる。また、ＧＫに伝達するプラスミド（ｐＧＫ１）は、例えばｐＧＲ１６Ｂに、ＧＫで複製するためのｏｒｉと、ＧＫでの選抜に必要な高温に耐えるカナマイシン耐性遺伝子ＫｍＲ（ＴＫ１０１）等を付加したものを用いることができる。
【実施例0030】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【0031】
［実施例１］枯草菌の形質転換方法
１．細菌株及び培養条件
本研究に使用した細菌株及びプラスミドを下記表１に示した。また、ＰＣＲプライマーとして使用した合成オリゴヌクレオチドを下記表２に示した（配列番号１～３３）。細菌株はＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で、３７℃の条件下増殖させ使用した。必要に応じて、培地には抗生物質（クロラムフェニコール ５μｇ／ｍＬ、エリスロマイシン １μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシン １００μｇ／ｍＬ及びカナマイシン １０μｇ／ｍＬの）を添加した。
１．細菌株及び培養条件
本研究に使用した細菌株及びプラスミドを下記表１に示した。また、ＰＣＲプライマーとして使用した合成オリゴヌクレオチドを下記表２に示した（配列番号１～３３）。細菌株はＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で、３７℃の条件下増殖させ使用した。必要に応じて、培地には抗生物質（クロラムフェニコール ５μｇ／ｍＬ、エリスロマイシン １μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシン １００μｇ／ｍＬ及びカナマイシン １０μｇ／ｍＬの）を添加した。
【0032】
【表1】
【0033】
【表2】
【0034】
２．レシピエント株の構築
枯草菌１６８株のｃｏｍＫ遺伝子を、スペクチノマイシン耐性遺伝子による置換によって不活性化した。すなわち、それぞれｃｏｍＫの上流及び下流領域に対応する２つのＤＮＡ断片を、枯草菌１６８株のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅させた。プライマーとしては、上流の断片についてはｃｏｍＫ－ｕＦ／ｃｏｍＫ－ｕＲ、下流の断片についてはｃｏｍＫ－ｄＦ／ｃｏｍＫ－ｄＲを用いた。また、ＴＭＯ３１０株のスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む別のＤＮＡ断片を、プライマーｓｐｃ－Ｆ／ｓｐｃ－Ｒを用いて増幅した。ｃｏｍＫ－ｕＦ／ｃｏｍＫ－ｄＲを用いた組換えＰＣＲにより、３つの断片を連結し、スペクチノマイシン耐性遺伝子をｃｏｍＫの上流と下流の領域の間に挟み込んだ。組換えＰＣＲ断片を導入して枯草菌１６８株をスペクチノマイシン耐性に形質転換し、この研究においてレシピエント株として使用する新たな枯草菌株ＹＮＢ００１（ｃｏｍＫ：：ｓｐｃ）を得た。
枯草菌１６８株のｃｏｍＫ遺伝子を、スペクチノマイシン耐性遺伝子による置換によって不活性化した。すなわち、それぞれｃｏｍＫの上流及び下流領域に対応する２つのＤＮＡ断片を、枯草菌１６８株のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅させた。プライマーとしては、上流の断片についてはｃｏｍＫ－ｕＦ／ｃｏｍＫ－ｕＲ、下流の断片についてはｃｏｍＫ－ｄＦ／ｃｏｍＫ－ｄＲを用いた。また、ＴＭＯ３１０株のスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む別のＤＮＡ断片を、プライマーｓｐｃ－Ｆ／ｓｐｃ－Ｒを用いて増幅した。ｃｏｍＫ－ｕＦ／ｃｏｍＫ－ｄＲを用いた組換えＰＣＲにより、３つの断片を連結し、スペクチノマイシン耐性遺伝子をｃｏｍＫの上流と下流の領域の間に挟み込んだ。組換えＰＣＲ断片を導入して枯草菌１６８株をスペクチノマイシン耐性に形質転換し、この研究においてレシピエント株として使用する新たな枯草菌株ＹＮＢ００１（ｃｏｍＫ：：ｓｐｃ）を得た。
【0035】
３．ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴの構築
ｐＬＳ２０ｃａｔのｏｒｉＴＬＳ２０領域は、ｍａｒｋｅｒ－ｆｒｅｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎによって不活性化した。すなわち、ｏｒｉＴＬＳ２０の上流（フラグメント１）及び下流（フラグメント２）領域に対応する２つのＤＮＡ断片を、ｐＬＳ２０ｃａｔＤＮＡを鋳型として、上流領域のプライマーｏｒｉＴ－ｕＦ／ｏｒｉＴ－ｕＲ及びｏｒｉＴ－ｄＦ／ｏｒｉを用いてＰＣＲにより増幅した。フラグメント１の末端及びフラグメント２の先端は、３０ｂｐについて同一であったので、これらの領域を利用して、形質転換によってｏｒｉＴＬＳ２０領域を欠失させた。ｍａｚＦ ｋａｎカセットの別のＤＮＡ断片（フラグメント３）は、プライマーとしてｍａｚＦ－Ｆ／ｍａｚＦ－Ｒを用いてＴＭＯ３１１ ＤＮＡから増幅させた。３つのＰＣＲフラグメントは、ｏｒｉＴ－ｕＦ／ｏｒｉＴ－ｄＲをプライマーとして用いた組換えＰＣＲによって、１－３－２の順序で連結するように設計した。組換えＰＣＲ断片を導入してＰＫＳ１１株をカナマイシン耐性に形質転換して、新たに株ＹＮＢ０２２を得た。この株においては、ｐＬＳ２０ｃａｔがｏｒｉＴＬＳ２０領域の二重交差事象を介してＰＣＲ断片を組み込むことによって改変された。ＹＮＢ０２２を、カナマイシンを含有するＬＢ液体培地中、３７℃で一晩増殖させた。培養液のアリコートを、１ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有する新たなＬＢ液体培地中に移し、細胞を３７℃で２時間増殖させた。次に、培養液のアリコートを１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢプレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。ＩＰＴＧの存在下では、ｍａｚＦが発現され、自殺毒素が産生されるため、分子内組換えによりｍａｚＦ ｋａｎカセットを飛び出すことができる細胞のみが生き残ることができた。プレート上に出現するコロニーのうち、カナマイシン感受性コロニーについて配列決定して、ｏｒｉＴＬＳ２０領域が正しく欠失されていることを確認した。得られたプラスミドをｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴと命名した。このプラスミドの構造を図１に示す。また、遺伝子配列を配列表に配列番号３４として示した。
ｐＬＳ２０ｃａｔのｏｒｉＴＬＳ２０領域は、ｍａｒｋｅｒ－ｆｒｅｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎによって不活性化した。すなわち、ｏｒｉＴＬＳ２０の上流（フラグメント１）及び下流（フラグメント２）領域に対応する２つのＤＮＡ断片を、ｐＬＳ２０ｃａｔＤＮＡを鋳型として、上流領域のプライマーｏｒｉＴ－ｕＦ／ｏｒｉＴ－ｕＲ及びｏｒｉＴ－ｄＦ／ｏｒｉを用いてＰＣＲにより増幅した。フラグメント１の末端及びフラグメント２の先端は、３０ｂｐについて同一であったので、これらの領域を利用して、形質転換によってｏｒｉＴＬＳ２０領域を欠失させた。ｍａｚＦ ｋａｎカセットの別のＤＮＡ断片（フラグメント３）は、プライマーとしてｍａｚＦ－Ｆ／ｍａｚＦ－Ｒを用いてＴＭＯ３１１ ＤＮＡから増幅させた。３つのＰＣＲフラグメントは、ｏｒｉＴ－ｕＦ／ｏｒｉＴ－ｄＲをプライマーとして用いた組換えＰＣＲによって、１－３－２の順序で連結するように設計した。組換えＰＣＲ断片を導入してＰＫＳ１１株をカナマイシン耐性に形質転換して、新たに株ＹＮＢ０２２を得た。この株においては、ｐＬＳ２０ｃａｔがｏｒｉＴＬＳ２０領域の二重交差事象を介してＰＣＲ断片を組み込むことによって改変された。ＹＮＢ０２２を、カナマイシンを含有するＬＢ液体培地中、３７℃で一晩増殖させた。培養液のアリコートを、１ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有する新たなＬＢ液体培地中に移し、細胞を３７℃で２時間増殖させた。次に、培養液のアリコートを１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢプレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。ＩＰＴＧの存在下では、ｍａｚＦが発現され、自殺毒素が産生されるため、分子内組換えによりｍａｚＦ ｋａｎカセットを飛び出すことができる細胞のみが生き残ることができた。プレート上に出現するコロニーのうち、カナマイシン感受性コロニーについて配列決定して、ｏｒｉＴＬＳ２０領域が正しく欠失されていることを確認した。得られたプラスミドをｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴと命名した。このプラスミドの構造を図１に示す。また、遺伝子配列を配列表に配列番号３４として示した。
【0036】
４．ドナー株の構築
ドナー株ＹＮＢ０６０は、以下のように構築した（図２）。プライマーｙｈｆＭ－ｕＦ／ｙｈｆＭ－ｕＲ１（上流について）及びｙｈｆＭ－ｄＦ／ｙｈｆＭ－ｄＲ（下流について）を用いて、ｙｈｆＭの上流（フラグメント１）及び下流（フラグメント４）領域に対応する２つの断片を１６８ＤＮＡから増幅した。ｏｒｉＴＬＳ２０を含むフラグメント２を、プライマーｏｒｉＴ－Ｆ／ｏｒｉＴ－Ｒを用い、ｐＬＳ２０ｃａｔを鋳型として増幅した。さらに、プライマーｅｒｍ－Ｆ１／ｅｒｍ－Ｒを用いて、プラスミドｐＭｕｔｉｎ２を鋳型とし、エリスロマイシン耐性遺伝子を有するフラグメント３を増幅した。フラグメント１～４をプライマーｙｈｆＭ－ｕＦ／ｙｈｆＭ－ｄＲを用いた組換えＰＣＲにより１－２－３－４の順序で連結した。この組換えＰＣＲ断片を導入して菌株ＴＭＯ３１１（ａｐｒＥ：：ｋａｎ）をエリスロマイシン及びカナマイシンの両方に耐性を持つように形質転換して、コロニーを選択した。得られた菌株をＹＮＢ０６０と命名した。この菌株は、ｏｒｉＴＬＳ２０にエリスロマイシンマーカーを、同じ染色体上でお互いから６．６ｋｂ離れて位置するｙｈｆＭ及びａｐｒＥ遺伝子座の両方にカナマイシンマーカーを有している。さらに、ｏｒｉＴＬＳ２０の複製方向は、６．６ｋｂ下流に位置するカナマイシンマーカーに向かっている。
ドナー株ＹＮＢ０６０は、以下のように構築した（図２）。プライマーｙｈｆＭ－ｕＦ／ｙｈｆＭ－ｕＲ１（上流について）及びｙｈｆＭ－ｄＦ／ｙｈｆＭ－ｄＲ（下流について）を用いて、ｙｈｆＭの上流（フラグメント１）及び下流（フラグメント４）領域に対応する２つの断片を１６８ＤＮＡから増幅した。ｏｒｉＴＬＳ２０を含むフラグメント２を、プライマーｏｒｉＴ－Ｆ／ｏｒｉＴ－Ｒを用い、ｐＬＳ２０ｃａｔを鋳型として増幅した。さらに、プライマーｅｒｍ－Ｆ１／ｅｒｍ－Ｒを用いて、プラスミドｐＭｕｔｉｎ２を鋳型とし、エリスロマイシン耐性遺伝子を有するフラグメント３を増幅した。フラグメント１～４をプライマーｙｈｆＭ－ｕＦ／ｙｈｆＭ－ｄＲを用いた組換えＰＣＲにより１－２－３－４の順序で連結した。この組換えＰＣＲ断片を導入して菌株ＴＭＯ３１１（ａｐｒＥ：：ｋａｎ）をエリスロマイシン及びカナマイシンの両方に耐性を持つように形質転換して、コロニーを選択した。得られた菌株をＹＮＢ０６０と命名した。この菌株は、ｏｒｉＴＬＳ２０にエリスロマイシンマーカーを、同じ染色体上でお互いから６．６ｋｂ離れて位置するｙｈｆＭ及びａｐｒＥ遺伝子座の両方にカナマイシンマーカーを有している。さらに、ｏｒｉＴＬＳ２０の複製方向は、６．６ｋｂ下流に位置するカナマイシンマーカーに向かっている。
【0037】
別の菌株、ＹＮＢ０６１も上記と同様に構築した。ｙｈｆＭの２つのフラグメント（上流及び下流領域）を、プライマーｙｈｆＭ－ｕＦ／ｙｈｆＭ－ｕＲ２及びｙｈｆＭ－ｄＦ／ｙｈｆＭ－ｄＲをそれぞれ用いて増幅した。プライマーｏｒｉＴ－Ｆ／ｏｒｉＴ－Ｒ及びｅｒｍ－Ｆ２／ｅｒｍ－Ｒをそれぞれ用いて、ｏｒｉＴＬＳ２０断片（フラグメント２）及びエリスロマイシン耐性断片（フラグメント３）を増幅した。４つの断片を、プライマーｙｈｆＭ－ｕＦ／ｙｈｆＭ－ｄＲを用いた組換えＰＣＲによって連結した。この組換えＰＣＲ断片を導入してＴＭＮ３１１株をエリスロマイシン耐性に形質転換してコロニーを選択し、ＹＮＢ０６１を得た。ＹＮＢ０６０とは対照的に、ＹＮＢ０６１では、ｙｈｆＭ遺伝子座上のｏｒｉＴＬＳ２０の複製方向は、ａｐｒＥ遺伝子座上のカナマイシンマーカーとは反対方向に向いていた。
【0038】
さらに別の菌株としてＹＮＢ０６９、ＹＮＢ０６２、及びＹＮＢ０９７を、上記と同様に構築した（図２）。ＹＮＢ０６９については、プライマーとしてｙｈｆＫ－ｕＦ／ｙｈｆＫ－ｕＲ１及びｙｈｆＫ－ｄＦ／ｙｈｆＫ－ｄＲ（表２）を用いて、１６８ＤＮＡから、ｙｈｆＫの上流（フラグメント１）及び下流（フラグメント４）領域の２つの断片をそれぞれ増幅した。ＹＮＢ０６２について、プライマーとしてｙｈｆＣ－ｕＦ／ｙｈｆＣ－ｕＲ１及びｙｈｆＣ－ｄＦ／ｙｈｆＣ－ｄＲを用いて、ｙｈｆＣの上流及び下流領域の２つの断片をそれぞれ増幅した。ＹＮＢ０９７について、プライマーとしてｙｈｃＴ－ｕＦ／ｙｈｃＴ－ｕＲ１及びｙｈｃＴ－ｄＦ／ｙｈｃＴ－ｄＲを用いて、ｙｈｃＴの上流及び下流領域の２つの断片をそれぞれ増幅した。ｏｒｉＴＬＳ２０フラグメント（フラグメント２）及びエリスロマイシン耐性フラグメント（フラグメント３）は、ＹＮＢ０６０構築について上記で使用したものと同じであった。それぞれの場合について、ＹＮＢ０６９のプライマーｙｈｆＫ－ｕＦ／ｙｈｆＫ－ｄＲ、ＹＮＢ０６２のプライマーｙｈｆＣ－ｕＦ／ｙｈｆＣ－ｄＲ、及びＹＮＢ０９７のプライマーｙｈｃＴ－ｕＦ／ｙｈｃＴ－ｄＲを用い、４つのフラグメントを組換えＰＣＲによって連結した。組換えＰＣＲ断片の各々でＴＭＯ３１１（ａｐｒＥ：：ｋａｎ）を形質転換し、エリスロマイシン及びカナマイシンの両方に耐性であるコロニーを選択した。得られた菌株はＹＮＢ０６９、ＹＮＢ０６２及びＹＮＢ０９７と命名された。これら全ては、ｙｈｆＫ、ｙｈｆＣ及びｙｈｃＴ遺伝子座において、エリスロマイシンマーカーと共にｏｒｉＴＬＳ２０を有している。そして染色体上でａｐｒＥ遺伝子座のカナマイシンマーカーからそれぞれ９．５、１６．４及び１１３ｋｂ離れて位置している。さらに、これらの菌株すべてにおいて、ｏｒｉＴＬＳ２０の複製の方向は、カナマイシンマーカーに対して順方向であった。
【0039】
上記で得られたＹＮＢ０６０、ＹＮＢ０６１、ＹＮＢ０６９、ＹＮＢ０６２、ＹＮＢ０９７から、常法に従って染色体ＤＮＡを抽出し、ｐＬＳ２０ｃａｔを有する１６８株（ＰＫＳ１１）又はｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを持つＹＮＢ０２６に導入することにより、以下の実験で用いるドナー株を得た。ｐＬＳ２０ｃａｔを有する株として、ＹＮＢ０６５、ＹＮＢ０６６、ＹＮＢ０７１、ＹＮＢ０６７、ＹＮＢ０９９を、また、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを有する株として、ＹＮＢ０９１、ＹＮＢ０９５、ＹＮＢ０９２、ＹＮＢ０９４、ＹＮＢ１００を得た。
【0040】
５．ＤＮＡの接合伝達
ＤＮＡの接合伝達は、液体培地中で行った。すなわち、ドナー及びレシピエント株を、それぞれ適切な抗生物質を含有する５ｍＬのＬＢ液体培地中、１８０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩培養した。各培養物を、抗生物質を含まない５ｍＬの新鮮なＬＢ培地中、ＯＤ６００が０．０５となる細胞密度に希釈し、１８０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートした。ＯＤ６００が０．５～０．７に達したとき、５００μＬのドナー及びレシピエント培養物を１．５ｍＬのマイクロチューブ中で混合し、３７℃で１５分間放置した。混合物を連続希釈し、抗生物質の様々な組み合わせを含むＬＢプレート上に広げて、コロニーを一晩増殖させた。それらのそれぞれのプレートにおいて、接合伝達（トランスコンジュゲート）による形質転換効率を算出するために、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定し、形質転換されたＣＦＵ／総レシピエントのＣＦＵ×１０６（ｐｐｍ）を求めた。
ＤＮＡの接合伝達は、液体培地中で行った。すなわち、ドナー及びレシピエント株を、それぞれ適切な抗生物質を含有する５ｍＬのＬＢ液体培地中、１８０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩培養した。各培養物を、抗生物質を含まない５ｍＬの新鮮なＬＢ培地中、ＯＤ６００が０．０５となる細胞密度に希釈し、１８０ｒｐｍで振とうしながら３７℃でインキュベートした。ＯＤ６００が０．５～０．７に達したとき、５００μＬのドナー及びレシピエント培養物を１．５ｍＬのマイクロチューブ中で混合し、３７℃で１５分間放置した。混合物を連続希釈し、抗生物質の様々な組み合わせを含むＬＢプレート上に広げて、コロニーを一晩増殖させた。それらのそれぞれのプレートにおいて、接合伝達（トランスコンジュゲート）による形質転換効率を算出するために、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定し、形質転換されたＣＦＵ／総レシピエントのＣＦＵ×１０６（ｐｐｍ）を求めた。
【0041】
６．結果
上記の実験の結果、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴ（ｏｒｉＴを欠失させたプラスミド）自体はレシピエント株へ移動することはできなくなるが、共存しているｏｒｉＴＬＳ２０を備えるプラスミドや染色体ＤＮＡをレシピエント株に移動させる能力は維持していることがわかった。以下に詳細に説明する。
上記の実験の結果、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴ（ｏｒｉＴを欠失させたプラスミド）自体はレシピエント株へ移動することはできなくなるが、共存しているｏｒｉＴＬＳ２０を備えるプラスミドや染色体ＤＮＡをレシピエント株に移動させる能力は維持していることがわかった。以下に詳細に説明する。
【0042】
（プラスミドの移動実験）
プラスミドの移動実験の結果を図３に示す。なお、図３中、ＣＳ（黒のカラム）はクロラムフェニコール耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）、ＥＳ（グレーのカラム）はエリスロマイシン耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）、ＣＥＳ（白のカラム）は、クロラムフェニコール耐性及びエリスロマイシン耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）を示している。また、ＮＤは検出限界以下（＜０．０１ｐｐｍ）であること、＊は実験を行っていないことを示している。
プラスミドの移動実験の結果を図３に示す。なお、図３中、ＣＳ（黒のカラム）はクロラムフェニコール耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）、ＥＳ（グレーのカラム）はエリスロマイシン耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）、ＣＥＳ（白のカラム）は、クロラムフェニコール耐性及びエリスロマイシン耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）を示している。また、ＮＤは検出限界以下（＜０．０１ｐｐｍ）であること、＊は実験を行っていないことを示している。
【0043】
図３に示すとおり、ｐＬＳ２０ｃａｔは、ドナー株であるＰＫＳ１１（ｐＬＳ２０ｃａｔを有する１６８株）またはＧＲ１３８（ｐＬＳ２０ｃａｔ及びｐＧＲ１６Ｂを有する１６８株）からレシピエント株へ伝達され、クロラムフェニコール耐性を獲得した多くのレシピエント細胞（２，５００ｐｐｍ以上）が得られた。また、ヘルパープラスミドであるｐＬＳ２０ｃａｔと移動プラスミドであるｐＧＲ１６Ｂ（ｏｒｉＴＬＳ２０及びエリスロマイシン耐性遺伝子を有する）を備えるドナー株ＧＲ１３８は、レシピエント株にエリスロマイシン耐性を付与したことから、ｐＬＳ２０ｃａｔは、ｏｒｉＴＬＳ２０を有する移動プラスミドｐＧＲ１６Ｂの伝達を仲介できることもわかった（図３）。なお、上記の実験において、ドナー株ＧＲ１３８がレシピエント細胞約１，０００ｐｐｍにエリスロマイシン耐性を付与したことから、ヘルパーｐＬＳ２０ｃａｔが、移動プラスミドｐＧＲ１６Ｂよりもレシピエント細胞の形質転換においてほぼ２倍効率的であり得るといえる。さらに、約１００ｐｐｍのレシピエント細胞がエリスロマイシン及びクロラムフェニコールの両方に耐性を示したことから（図３）、ｐＧＲ１６Ｂを受け入れたトランス接合体の約１０％がｐＬＳ２０ｃａｔを獲得した可能性があることが示唆された。
【0044】
ｐＬＳ２０ｃａｔを有する細菌は、ｐＬＳ２０ｃａｔ媒介性遺伝伝達を受け入れないため、ｐＬＳ２０ｃａｔを受け入れた形質転換体は、同じ接合伝達系を用いて再び形質転換することができないことが知られている。他方、上記実験で示したとおり、ｐＬＳ２０ｃａｔを保有する細胞は、ｐＬＳ２０ｃａｔそれ自体だけでなくｐＧＲ１６Ｂも他の株にさらに移すことができた。もし、これらのトランス接合体が環境中に放出されると、抗生物質耐性遺伝子が他の細菌細胞に広がり、新たな抗生物質耐性菌が出現する可能性が考えられた。
【0045】
そこで我々は上述した方法により、ｐＬＳ２０ｃａｔの自己伝達を避けるため、ｐＬＳ２０ｃａｔのｏｒｉＴＬＳ２０をノックアウトしてｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴの構築を行った。予想どおり、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを備えるドナー株であるＹＮＢ０２６は、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴをまったく伝達しなかったが、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴとｐＧＲ１６Ｂを備えるＹＮＢ０３１は、ｐＧＲ１６Ｂのみを伝達してレシピエント株にエリスロマイシン耐性を付与することができた（図３）。さらに、ｐＧＲ１６Ｂの伝達効率は、ｐＬＳ２０ｃａｔがヘルパープラスミドである場合もｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴがヘルパープラスミドである場合も、ほぼ同じであった。これらの結果は、ｐＧＲ１６ＢのｐＬＳ２０ｃａｔ依存性移動が、ヘルパープラスミド、ｐＬＳ２０ｃａｔの自己移動性を必要としないことを示している。さらに、ｐＬＳ２０ｃａｔにおけるｏｒｉＴのノックアウトは、共存するｐＧＲ１６Ｂの伝達効率に影響を与えなかった。
【0046】
（染色体ＤＮＡの移動実験）
次に我々は、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴがｏｒｉＴＬＳ２０領域の状態に依存して、染色体ＤＮＡの伝達を媒介することができるか否かを確認した。結果を図４に示す。なお、図４中、ＣＳ（黒のカラム）はクロラムフェニコール耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）、ＫＳ（グレーのカラム）はカナマイシン耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）、ＣＫＳ（白のカラム）は、クロラムフェニコール耐性及びカナロマイシン耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）を示している。また、ＮＤは検出限界以下（＜０．０１ｐｐｍ）であることを示している。
次に我々は、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴがｏｒｉＴＬＳ２０領域の状態に依存して、染色体ＤＮＡの伝達を媒介することができるか否かを確認した。結果を図４に示す。なお、図４中、ＣＳ（黒のカラム）はクロラムフェニコール耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）、ＫＳ（グレーのカラム）はカナマイシン耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）、ＣＫＳ（白のカラム）は、クロラムフェニコール耐性及びカナロマイシン耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）を示している。また、ＮＤは検出限界以下（＜０．０１ｐｐｍ）であることを示している。
【0047】
ＹＮＢ０６０及びＹＮＢ０６１のドナー染色体において、ａｐｒＥ遺伝子座におけるカナマイシン耐性遺伝子の６．６ｋｂ上流のｙｈｆＭ遺伝子座に、ｏｒｉＴＬＳ２０を導入した。ｏｒｉＴＬＳ２０の複製方向は、株ＹＮＢ０６０及びＹＮ０Ｂ６１においてそれぞれカナマイシン耐性遺伝子に対して順方向及び逆方向であった。ｐＬＳ２０ｃａｔ又はｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴをヘルパープラスミドとしてドナーに導入した新しい株、（１）ＹＮＢ０６５（ＹＮＢ０６０にｐＬＳ２０ｃａｔを導入）、（２）ＹＮＢ０６６（ＹＮＢ０６１にｐＬＳ２０ｃａｔを導入）、（３）ＹＮＢ０９１（ＹＮＢ０６０にｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを導入）、及び（４）ＹＮＢ０９５（ＹＮＢ０６１にｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを導入）を作成した。一方、レシピエント株ＹＮＢ００１においては、ナチュラルコンピテンスに必須となる転写因子をコードするｃｏｍＫを不活性化し、ナチュラルコンピテンスを完全に消失させた（データは示さず）。
【0048】
ＹＮＢ０６５とＹＮＢ０６６の両方のｐＬＳ２０ｃａｔは、レシピエント細胞の２，３００ｐｐｍ以上にクロラムフェニコール耐性を付与した。一方カナマイシン耐性の付与については、ＹＮＢ０６５はレシピエント細胞の１ｐｐｍのみにカナマイシン耐性を付与できたのに対して、ＹＮＢ０６６はカナマイシン耐性を全く与えなかった（図４）。これらの結果は、ｏｒｉＴＬＳ２０複製の方向がカナマイシン耐性遺伝子に対して順方向である場合、ｐＬＳ２０ｃａｔがｏｒｉＴＬＳ２０の６．６ｋｂ下流に位置するカナマイシン耐性遺伝子を伝達し得ることを示す。ここで、レシピエントはナチュラルコンピテンスを有していなかったので、カナマイシン耐性の獲得は接合伝達のみに依存していたといえる。他方、ＹＮＢ０６５はレシピエント細胞（レシピエント細胞の約１ｐｐｍ）に対して、カナマイシン耐性だけでなくクロラムフェニコール耐性を付与した（図４）。この結果は、大きな染色体ＤＮＡを導入されカナマイシン耐性となったレシピエント細胞の大部分が、さらにヘルパープラスミドｐＬＳ２０ｃａｔを獲得できることを示唆している。
【0049】
ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴがヘルパープラスミドとしてＹＮＢ０６０に導入されたＹＮＢ０９１と、ＹＮＢ０６１に導入されたＹＮＢ０９５を用いた実験では、レシピエント細胞がクロラムフェニコール耐性を獲得することはなく、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴが自己可動性を喪失していることが確認できた（図４）。一方、より重要なことに、ＹＮＢ０９１をドナー細胞として使用した場合、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴはｐＬＳ２０ｃａｔと同様の効率とｏｒｉＴＬＳ２０配向依存的に、レシピエント細胞にカナマイシン耐性を付与した。この結果は、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴが、移動プラスミドを移入するだけでなく、染色体ＤＮＡを移入する際にも元のヘルパープラスミドｐＬＳ２０ｃａｔと同様に効率的にヘルパー活性を発揮できることを明らかにしている。ＹＮＢ０９５はレシピエントにカナマイシン耐性を付与しなかったので、ＤＮＡ移入は順方向のｏｒｉＴＬＳ２０に依存することが確認された。
【0050】
次に我々は、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴが伝達を媒介できる染色体ＤＮＡの長さを確認する実験を行った。その結果を図５に示す。なお、図５中、ＣＳ（黒のカラム）はクロラムフェニコール耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）、ＫＳ（グレーのカラム）はカナマイシン耐性を獲得した細胞濃度（ｐｐｍ）を示している。また、ＮＤは検出限界以下（＜０．０１ｐｐｍ）であることを示している。
【0051】
ｏｒｉＴＬＳ２０及びカナマイシンマーカーとの間の距離は、菌株ＹＮＢ０６９、ＹＮＢ０６２、及びＹＮＢ０９７について、それぞれ９．５ｋｂ、１６．４ｋｂ、１１３ｋｂである。これらの菌株の全てにおいて、ｏｒｉＴＬＳ２０の複製の方向は、カナマイシン耐性遺伝子に対して順方向であった。ＹＮＢ０７１（ＹＮＢ０６９にｐＬＳ２０ｃａｔを導入）、ＹＮＢ０６７（ＹＮＢ０６２にｐＬＳ２０ｃａｔを導入）、ＹＮＢ０９９（ＹＮＢ０９７にｐＬＳ２０ｃａｔを導入）、ＹＮＢ０９２（ＹＮＢ０６９にｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを導入）、ＹＮＢ０９４（ＹＮＢ０６２にｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを導入）、及びＹＮＢ１００（ＹＮＢ０９７にｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを導入）を含む。ｐＬＳ２０ｃａｔを有する全てのドナーは６００ｐｐｍを超えるレシピエント細胞にクロラムフェニコール耐性を付与したが、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを有する他のドナーはクロラムフェニコール耐性を全く与えなかった（図５）。しかしながら、さらに重要なことに、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを有する全ての株は、レシピエント細胞の０．５－１０．０ｐｐｍに対してカナマイシン耐性を付与することができた（図５）。効率はドナーとしてのＹＮＢ０９１で達成された効率とほぼ同等であり、移入できるＤＮＡの長さとしては、少なくとも１１３ｋｂまで可能であることが示された。さらに、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴは、染色体ＤＮＡのより長いセグメントを移すときにｐＬＳ２０ｃａｔと同様の効率を示した（図５）。これらの結果はまた、ｐＬＳ２０ｃａｔ自身の移動性が、染色体ＤＮＡのより長いセグメントを伝達するためのヘルパー機能のためには必要ではなかったことを示している。
【0052】
［実施例２］ＧＫ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）の形質転換方法
レシピエント株として好熱性細菌（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ；ＧＫ）を用いる実験を行った。実験方法は、特開２０１１－２１１９６８号公報に開示された方法を採用した。具体的には、ＧＫへのプラスミド伝達ドナーには、ＤＮＡメチラーゼの付与、及びｒａｐ遺伝子発現の強制増強のための遺伝子操作を施した。また、ＧＫに伝達するプラスミドｐＧＫ１は、ｐＧＲ１６Ｂに、ＧＫで複製するためのｏｒｉと、ＧＫでの選抜に必要な高温に耐えるカナマイシン耐性遺伝子ＫｍＲ（ＴＫ１０１）を付加したものを用いた。接合伝達の際に、ヘルパープラスミドとして、ｐＬＳ２０ｃａｔとｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを使用した場合のｐＧＫ１伝達効率を測定した。その結果、図６に示すとおり、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを使用した方が、ｐＬＳ２０ｃａｔより高い効率でｐＧＫ１を伝達できることがわかった。
レシピエント株として好熱性細菌（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ；ＧＫ）を用いる実験を行った。実験方法は、特開２０１１－２１１９６８号公報に開示された方法を採用した。具体的には、ＧＫへのプラスミド伝達ドナーには、ＤＮＡメチラーゼの付与、及びｒａｐ遺伝子発現の強制増強のための遺伝子操作を施した。また、ＧＫに伝達するプラスミドｐＧＫ１は、ｐＧＲ１６Ｂに、ＧＫで複製するためのｏｒｉと、ＧＫでの選抜に必要な高温に耐えるカナマイシン耐性遺伝子ＫｍＲ（ＴＫ１０１）を付加したものを用いた。接合伝達の際に、ヘルパープラスミドとして、ｐＬＳ２０ｃａｔとｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを使用した場合のｐＧＫ１伝達効率を測定した。その結果、図６に示すとおり、ｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴを使用した方が、ｐＬＳ２０ｃａｔより高い効率でｐＧＫ１を伝達できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【0053】
本発明のグラム陽性菌の形質転換方法によると、大きなサイズのＤＮＡをレシピエント側に伝達することができる。さらに、ｐＬＳ２０ｃａｔのｏｒｉＴＬＳ２０領域を不活化したｐＬＳ２０ｃａｔΔｏｒｉＴをヘルパープラスミドとして使用することで、グラム陽性菌の接合伝達において、ヘルパープラスミド自体はレシピエント側に伝達されず、所望の染色体やプラスミドのみを伝達した形質転換細胞を作成することができる。本発明の方法によると、得られた形質転換細胞は、ヘルパープラスミドを有していないので、再度同様の方法により、所望の染色体やプラスミドの接合伝達をレシピエント（受容菌）として受けることが可能となる。したがって、本発明によると、所望のＤＮＡセグメントをレシピエント（受容菌）の染色体に蓄積させ、巨大なＤＮＡをデザインして作成することが可能となる。また、本発明の方法による形質転換は、ドナー（供与菌）とレシピエント（受容菌）の液体培養液を混合するだけで、迅速かつ簡便に行うことができ、合成生物学的な産業活動において、微生物や培養細胞等の作成に好適に用いられ得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】