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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022095613
(43)【公開日】2022-06-28
(54)【発明の名称】広域中和抗ＨＩＶ－１抗体およびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220621BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220621BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220621BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220621BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220621BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220621BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20220621BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220621BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220621BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20220621BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220621BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220621BHJP
A61K 39/21 20060101ALI20220621BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/10
C07K16/46
A61P43/00 121
A61P31/18
A61K45/00
A61K39/395 D
A61K39/395 S
A61K39/21
【審査請求】有
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022031580
(22)【出願日】2022-03-02
(62)【分割の表示】P 2019536207の分割
【原出願日】2017-12-22
(31)【優先権主張番号】62/444,946
(32)【優先日】2017-01-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/439,339
(32)【優先日】2016-12-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
２．プルロニック
３．ＳＰＡＮ
(71)【出願人】
【識別番号】592054292
【氏名又は名称】ザ ロックフェラー ユニバーシティー
(71)【出願人】
【識別番号】519234464
【氏名又は名称】カルフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】八田国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ヌッセンツヴァイク，ミヒャエル
(72)【発明者】
【氏名】フロイント，ナタリア，ティー．
(72)【発明者】
【氏名】ビョルクマン，パメラ，ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】シャーフ，ルイーズ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】強力な広域中和抗ＨＩＶ－１抗体または抗原結合部分、ならびに該抗体または抗原結合部分を含む医薬組成物を提供する。
【解決手段】いくつかの実施形態において、抗ＨＩＶ－１抗体は、ＮＣ３７およびその抗原結合部分を含み、いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体はＢＧ１およびその抗原結合部分を含み、いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体はＢＧ１８およびその抗原結合部分を含み、いくつかの実施形態では、ＢＧ１８の変異体およびその抗原結合部分を含む、抗ＨＩＶ－１抗体であって、重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が特定の配列を含み、および、軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が特定の配列を含む、単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分、および該抗体または抗原結合部分を含む医薬組成物である。
【選択図】なし
【解決手段】いくつかの実施形態において、抗ＨＩＶ－１抗体は、ＮＣ３７およびその抗原結合部分を含み、いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体はＢＧ１およびその抗原結合部分を含み、いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体はＢＧ１８およびその抗原結合部分を含み、いくつかの実施形態では、ＢＧ１８の変異体およびその抗原結合部分を含む、抗ＨＩＶ－１抗体であって、重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が特定の配列を含み、および、軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が特定の配列を含む、単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分、および該抗体または抗原結合部分を含む医薬組成物である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号１０～１２のそれぞれの配列を含む、および
（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号１４～１６のそれぞれの配列を含む、単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分。
（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号１４～１６のそれぞれの配列を含む、単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項2】
前記重鎖および前記軽鎖が、配列番号９および１３のそれぞれの配列を含む、請求項１に記載の単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項3】
前記抗体がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１または２に記載の単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項4】
前記抗体抗原またはその結合部分が組換え作製される、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項5】
請求項１～４いずれか一項に記載の単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含む、二重特異性抗体。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＨＩＶ－１抗体もしくはその抗原結合部分、または請求項５に記載の二重特異性抗体をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項8】
請求項７に記載のベクターを含む、培養細胞。
【請求項9】
（ｉ）請求項１～４のいずれか一項に記載の第１の抗ＨＩＶ－１抗体もしくはその抗原結合部分、または請求項５に記載の二重特異性抗体と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項10】
前記重鎖および前記軽鎖が、配列番号９および１３のそれぞれの配列を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
第２の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分をさらに含む、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
ＨＩＶ－１感染を治療するための薬剤の製造における、第１の請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＨＩＶ－１抗体もしくはその抗原結合部分、もしくは請求項５に記載の二重特異性抗体、または請求項９～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を含む第１の治療剤の使用。
【請求項13】
前記治療が、第２の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
前記第２の治療剤が、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、エントリー阻害剤または融合阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、および第２の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＨＩＶ－１抗体もしくはその抗原結合部分、または請求項５に記載の二重特異性抗体を含む、ワクチン組成物。
【請求項16】
前記重鎖および前記軽鎖が、配列番号９および１３のそれぞれの配列を含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項17】
ＨＩＶ－１感染を予防するための薬剤の製造における、請求項１５または１６に記載のワクチン組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
Ｉ．連邦政府の資金供与に関する声明
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって与えられた助成金番号ＡＩ１００１４８の下で政府の支援を受けて行われたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって与えられた助成金番号ＡＩ１００１４８の下で政府の支援を受けて行われたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【0002】
ＩＩ．発明の技術分野
本発明の分野は、広域中和抗ＨＩＶ－１抗体（ｂＮａｂ）およびその使用方法である。
本発明の分野は、広域中和抗ＨＩＶ－１抗体（ｂＮａｂ）およびその使用方法である。
【背景技術】
【0003】
ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）は、ヒトに感染するレンチウイルス（レトロウイルス科）である。治療しないままにしておくと、ＨＩＶ感染は時間の経過とともに、免疫系の進行性不全が、生命を脅かす日和見感染症（例えば、トキソプラズマ症）および癌（例えば、カポジ肉腫）を引き起こし、最終的に感染者が死亡する症状である後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に至る。治療をしなければ、初感染後の平均生存期間は合計９～１１年である。ＨＩＶ／ＡＩＤＳは重大な世界規模の健康危機であり、ＣＤＣによればパンデミックと解釈され、２０１４年現在、約３７００万人がＨＩＶに感染しており、同年約１２０万人が死亡している。
【0004】
ＨＩＶは、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２を含む、特徴付けられたいくつかのサブタイプを有する。ＨＩＶ－１の方が悪性度が高く、感染性が高く、世界的に流行しているのに対して、ＨＩＶ－２の方が悪性度が低く、感染性が低く、現時点では西アフリカでのみ流行している。ＨＩＶ－１は、ＨＩＶ感染の大部分の原因であるため、臨床的にいっそう重要な標的となっている。ＨＩＶ－１には、グループＭ、グループＮ、グループＯおよびグループＰを含むいくつかのサブグループがある。グループＭは、「主系統」を表し、ＨＩＶ感染の約９０％を占め、さらにサブタイプＡ～Ｋに分類され、時にサブサブタイプ（Ａ１、Ａ２など）に分割される。高い突然変異率によってもたらされるＨＩＶ－１の著しい多様性は、ＨＩＶを効果的に治療することを困難にする。この問題に対抗するために、研究者らは、広域中和抗体（「ｂＮＡｂ」）として知られるものを開発することを試みている。広域中和抗体は、ＨＩＶの複数のウイルス株、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第２０１４／０３２８８６２号明細書に開示されているものなどの複数のＨＩＶ－１ウイルス株を中和するそれらの能力に関してそのように指定されている。ＨＩＶ－１感染個体のごく一部では、典型的には、循環ウイルス株および抗体が共進化する１～３年の期間にわたって発現するｂＮＡｂが発現する。しかし、これらのｂＮａｂは、典型的には、感受性ウイルス株に対する抗体媒介選択のために、共存する自己由来ウイルスを中和することができない。したがって、ＨＩＶ－１感染に対して高度な効力を示す新規な広域中和抗ＨＩＶ抗体が緊急に必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許第２０１４／０３２８８６２号明細書
【発明の概要】
【0006】
本発明は、複数の強力な広域中和抗ＨＩＶ－１抗体およびその使用方法に関する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は抗ＨＩＶ－１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体は、広域中和抗ＨＩＶ－１抗体（ｂＮａｂ）またはその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体は、ＮＣ３７およびその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体はＢＧ１およびその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体はＢＧ１８およびその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＧ１８の変異体およびその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、ＢＧ１８の変異体は、３５４ＢＧ８、３５４ＢＧ１８、３５４ＢＧ４２、３５４ＢＧ３３、３５４ＢＧ１２９、３５４ＢＧ１８８、３５４ＢＧ４１１および３５４ＢＧ４２６のうちの１つ、またはその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は組換え抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、組換え作製された抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分はヒト抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は二重特異性抗体を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は可変重鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、可変重鎖領域は、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１および８９のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、可変重鎖領域は、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１および８９のうちの１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１および８９のうちの１つ以上は、保存的置換を有する。
【0008】
いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は可変軽鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、可変軽鎖領域は、配列番号５、１３、２１、２９、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５および９３のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、可変軽鎖領域は、配列番号５、１３、２１、２９、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５および９３のうちの１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、配列番号５、１３、２１、２９、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５および９３のうちの１つ以上は、保存的置換を有する。
【0009】
いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、可変重鎖領域内に少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号２～４、１０～１２、１８～２０、２６～２８、３４～３６、４２～４４、５０～５２、５８～６０、６６～６８、７４～７６、８２～８４および９０～９２のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号２～４、１０～１２、１８～２０、２６～２８、３４～３６、４２～４４、５０～５２、５８～６０、６６～６８、７４～７６、８２～８４および９０～９２のうちの１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、配列番号２～４、１０～１２、１８～２０、２６～２８、３４～３６、４２～４４、５０～５２、５８～６０、６６～６８、７４～７６、８２～８４および９０～９２のうちの１つ以上は、保存的置換を有する。
【0010】
いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、可変軽鎖領域内に少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号６～８、１４～１６、２２～２４、３０～３２、３８～４０、４６～４８、５４～５６、６２～６４、７０～７２、７８～８０、８６～８８および９４～９６のうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＤＲは、配列番号６～８、１４～１６、２２～２４、３０～３２、３８～４０、４６～４８、５４～５６、６２～６４、７０～７２、７８～８０、８６～８８および９４～９６のうちの１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、配列番号６～８、１４～１６、２２～２４、３０～３２、３８～４０、４６～４８、５４～５６、６２～６４、７０～７２、７８～８０、８６～８８および９４～９６のうちの１つ以上は、保存的置換を有する。
【0011】
いくつかの実施形態では、本発明は、第１の抗体を含むキットに関する。いくつかの実施形態では、第１の抗体は抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、広域中和抗ＨＩＶ－１抗体（ｂＮａｂ）を含む。いくつかの実施形態では、広域中和抗ＨＩＶ－１抗体は、本発明による任意の抗ＨＩＶ－１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体は、ＨＩＶ－１またはその抗原性断片に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体は結合時にＨＩＶ－１を中和する。いくつかの実施形態では、キットは第２の抗体を含有する。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、ＨＩＶ－１またはその抗原性断片に特異的に結合する抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含む。他の実施形態では、第２の抗体は、第１の抗体またはその抗原結合部分に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗体またはその抗原結合部分は、基質に結合している。いくつかの実施形態では、第２の抗体またはその抗原結合部分は、基質に結合している。いくつかの実施形態では、第１の抗体またはその抗原結合部分は、検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、第２の抗体またはその抗原結合部分は、検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、第１の抗体またはその抗原結合部分および第２の抗体またはその抗原結合部分のうちの少なくとも１つは、検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、検出可能な標識はレポーター分子を含む。いくつかの実施形態では、レポーター分子は蛍光分子を含む。いくつかの実施形態では、レポーターは放射性標識を含む。他の実施形態では、検出可能な標識は酵素を含む。いくつかの実施形態では、キットは酵素のための基質を含む。いくつかの実施形態では、酵素に基質を加えると、検出可能なシグナルが生成される。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、着色された可溶性産物を含む。いくつかの実施形態では、放射性標識はＩ－１２５を含む。いくつかの実施形態では、酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼを含む。いくつかの実施形態では、酵素のための基質はＴＭＢを含む。いくつかの実施形態では、キットは、試料中のＨＩＶ－１またはその抗原性断片を検出することができる。いくつかの実施形態では、キットは、試料中に存在するＨＩＶ－１またはその抗原性断片の量を定量することができる。
【0012】
いくつかの実施形態では、キットはＨＩＶ剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ剤は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、融合阻害剤、ＣＣＲ５アンタゴニスト／エントリー阻害剤、インテグラーゼ鎖転移阻害剤（ＩＮＳＴＩ）およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ剤は単位剤形である。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は単位剤形である。いくつかの実施形態では、単位剤形は単位用量の注射可能形態である。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ剤は、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分と同じ容器に保存される。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ剤は別の容器に保存される。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の追加の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、本発明の任意の抗ＨＩＶ－１抗体を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、ＮＣ３７、ＮＣ１３３、ＮＣ１０２、ＡＣ４０、ＡＣ４１、ＡＣ７２およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、キットは使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の薬学的に許容される担体または保存剤を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中に存在するＨＩＶ－１またはその抗原性断片を検出する方法に関する。いくつかの実施形態では、該方法は、ＨＩＶ－１またはその抗原性断片を含有する試料を得ることを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、試料と、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、ＨＩＶまたはその抗原性断片に対する抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分の特異的結合の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、試料中に存在するＨＩＶ－１またはその抗原性断片の量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、試料は生体試料である。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、本発明の任意の態様による抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分はモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は組換え抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は組換え作製される。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分はヒト抗体を含む。いくつかの実施形態では、特異的結合の存在を検出することは、イムノアッセイによって達成される。いくつかの実施形態では、特異的結合の存在を検出することは、競合イムノアッセイによって達成される。
【0014】
別の実施形態では、本発明は、ＨＩＶ－１感染を有すると個体を診断する方法に関する。いくつかの実施形態では、該方法は、ＨＩＶ－１感染を有するか、ＨＩＶ－１感染を有すると疑われる個体を識別することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、個体からＨＩＶ－１またはその抗原性断片を含有する試料を得ることを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、試料と、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分とを接触させることを含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、本発明の任意の態様による抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、該方法は、ＨＩＶまたはその抗原性断片に対する抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分の特異的結合の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、個体をＨＩＶ－１感染を有すると診断することを含む。いくつかの実施形態では、個体はＡＩＤＳを有すると診断される。いくつかの実施形態では、試料は生体試料である。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分はモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は組換え抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は組換え作製される。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分はヒト抗体を含む。いくつかの実施形態では、特異的結合の存在を検出することは、イムノアッセイによって達成される。いくつかの実施形態では、特異的結合の存在を検出することは、競合イムノアッセイによって達成される。
【0015】
いくつかの実施形態では、本発明は、それを必要とする個体のＨＩＶ－１感染を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ－１感染を治療する方法は、ＨＩＶ－１感染を有するか、ＨＩＶ－１感染を有すると疑われる個体に、少なくとも１つの抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、広域中和抗ＨＩＶ－１抗体（ｂＮａｂ）またはその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、本発明による任意の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、投与工程の前に、個体をＨＩＶ－１感染を有すると識別する工程を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分はモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体は組換え抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は組換え作製される。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分はヒト抗体を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、少なくとも１つの追加の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分の投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、広域中和抗ＨＩＶ－１抗体（ｂＮａｂ）またはその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、本発明による任意の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、追加の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分はモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、追加の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は組換え抗体を含む。いくつかの実施形態では、追加の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は組換え作製される。いくつかの実施形態では、該方法は、ＨＩＶ剤の投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ剤は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、融合阻害剤、ＣＣＲ５アンタゴニスト／エントリー阻害剤、インテグラーゼ鎖転移阻害剤（ＩＮＳＴＩ）およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、追加の単数もしくは複数の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分および／または単数もしくは複数のＨＩＶ剤と同時投与されてもよい。他の実施形態では、抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合部分は、追加の単数もしくは複数の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分および／または単数もしくは複数のＨＩＶ剤の前に投与される。さらに他の実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、追加の単数もしくは複数の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分および／または単数もしくは複数のＨＩＶ剤の後に投与される。またさらに他の実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、追加の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分および／または単数もしくは複数のＨＩＶ剤の間に投与されてもよい。
【0016】
別の実施形態では、本発明は受動ワクチンに関する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、少なくとも１つの抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、広域中和抗ＨＩＶ－１抗体（ｂＮａｂ）またはその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、本発明による任意の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分はモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は組換え抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は組換え作製される。いくつかの実施形態では、受動ワクチンはアジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態では、受動ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤、保存剤および／または担体をさらに含む。別の実施形態では、本発明は、それを必要とする個体のＨＩＶ－１感染を予防する方法に関する。いくつかの実施形態では、該方法は、本発明の任意の態様による受動ワクチン組成物を個体に投与することを含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、本発明は核酸に関する。いくつかの実施形態では、核酸は、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体の１つ以上の重鎖および／または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、９９、７３、７７、８１、８５、８９および９３のうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は保存的置換を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体の１つ以上のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号２～４、６～８、１０～１２、１４～１６、１８～２０、２２～２４、２６～２８、３０～３２、３４～３６、３８～４０、４２～４４、４６～４８、５０～５２、５４～５６、５８～６０、６２～６４、６６～６８、７０～７２、７４～７６、７８～８０、８２～８４、８６～８８、９０～９２および９４～９６のうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は保存的置換を有する。
【0018】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分のうちの１つ以上の重鎖および／または軽鎖および／またはＣＤＲをコードする１つ以上の核酸配列を含有するベクターまたはベクター系に関する。いくつかの実施形態では、ベクターまたはベクター系は、可変重鎖領域をコードする核酸配列および可変軽鎖領域をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖をコードする核酸配列は、軽鎖をコードする核酸配列と同じベクター上にある。いくつかの実施形態では、可変重鎖領域をコードする核酸配列は、可変軽鎖領域をコードする核酸配列とは異なるベクター上にある。いくつかの実施形態では、ベクターまたはベクター系は単数または複数のプラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターまたはベクター系は単数または複数のファージベクターである。いくつかの実施形態では、ファージベクターはγファージである。いくつかの実施形態では、単数または複数のベクターは単数または複数のコスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターまたはベクター系は、単数または複数の組換え染色体である。いくつかの実施形態では、ベクター系は様々なベクターの組合せである。いくつかの実施形態では、様々な核酸配列の発現が同時に起こり得る。他の実施形態では、様々な核酸配列の発現が別個に誘導可能であり得る。別の実施形態では、本発明は、１つ以上の本発明の抗ＨＩＶ－１抗体の１つ以上の重鎖および／または軽鎖の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする１つ以上の核酸配列を含有するベクターまたはベクター系に関する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1A-C】ドナーＥＢ３５４におけるＨＩＶ－１抗体レパートリーを表す。図１Ａ：２００２年～２０１５年に測定されたウイルス量の値。中和抗体が単離された時点がグラフに示されている。血漿が採取された時点は、下向きの矢印でマークされている。図１Ｂ：ＨＩＶ－１株の集団に対して試験した（（１Ａ）中の矢印によって示された）４つの時点から得られた精製血清ＩｇＧのＴＺＭ－ｂｌアッセイにおけるＩＣ５０値を示すヒートマップ。中和アッセイはいずれも２連で行った。図１Ｃ：上部パネル：ＣＤ１９を用いて予め濃縮したＩｇＧ＋メモリーＢ細胞をＣＤ１９と、３つの非ネイティブＨＩＶ－１ベイト（ｂａｉｔ）、すなわち、２ＣＣコア、ｇｐ１４０ＹＵ２フォールドオン（ｆｏｌｄ－ｏｎ）三量体およびｇｐ１４０９２ＵＧ３７．８＋ｇｐ１４０ＣＺＡ７９０１２（ｇｐ１４０Ａ＋Ｃ）フォールドオン三量体と、１つのネイティブベイトＢＧ５０５．ＳＯＳＩＰ－ＡｖｉＢとを用いて染色した。四角い挿入枠内の集団は選別された単一細胞であった細胞を表し、数字は全ＩｇＧ＋細胞のうちＣＤ１９＋／ベイト＋であった細胞の割合を示す。下部パネル：円グラフは、上部に示された対応するＦＡＣＳプロットからの単一の選別された細胞から増幅された総Ｉｇ配列を表す。円の中央の数字は抗体の総数を表す。空のスライスは、一度だけ出現し、クローン性関連物を有しなかった配列を表す。スライスは、抗体クローンを表し、各クローンの配列数に比例している。アスタリスクでマークしたクローンはｔｉｅｒ ２中和を示したクローンであり、これらは変異体ＮＣ３７、ＢＧ１８およびＢＧ１によって表される。図１Ｄ：上部パネル：モノクローナル抗体ＮＣ３７、ＢＧ１およびＢＧ１８のＴＺＭ－ｂｌアッセイにおけるＩＣ５０値に基づく中和効力を示すヒートマップ。下部パネル：２０１４年に得られたドナーポリクローナルＩｇＧ、ならびにＹＵ２ＷＴ、ＹＵ２Ｎ２８０Ｙ、ＹＵ２ＮＮ３３２ＫおよびＹＵ２ＮＮ１６０Ｋに対するＮＣ３７、ＢＧ１およびＢＧ１８のＴＺＭ－ｂｌアッセイにおけるＩＣ５０値に基づく中和効力。ＴＺＭ－ｂｌアッセイはいずれも２連で行った。図１Ｅ：１２０ Ｔｉｅｒ ２ ＨＩＶ－１シュードウイルスの集団に対して試験された抗体ＮＣ３７、ＢＧ１、ＢＧ１８、および１：１：１の組合せ（「ｃｏｍｂ．」）のＴＺＭ－ｂｌアッセイにおけるＩＣ５０に基づく中和効力のヒートマップ。中和されたウイルス全種の幾何平均とパーセント広域性とを下部パネルに示す。中和アッセイは２連で行った。図１Ｆ：（１Ｅ）の値に基づく範囲曲線。
【図1D-F】ドナーＥＢ３５４におけるＨＩＶ－１抗体レパートリーを表す。図１Ａ：２００２年～２０１５年に測定されたウイルス量の値。中和抗体が単離された時点がグラフに示されている。血漿が採取された時点は、下向きの矢印でマークされている。図１Ｂ：ＨＩＶ－１株の集団に対して試験した（（１Ａ）中の矢印によって示された）４つの時点から得られた精製血清ＩｇＧのＴＺＭ－ｂｌアッセイにおけるＩＣ５０値を示すヒートマップ。中和アッセイはいずれも２連で行った。図１Ｃ：上部パネル：ＣＤ１９を用いて予め濃縮したＩｇＧ＋メモリーＢ細胞をＣＤ１９と、３つの非ネイティブＨＩＶ－１ベイト（ｂａｉｔ）、すなわち、２ＣＣコア、ｇｐ１４０ＹＵ２フォールドオン（ｆｏｌｄ－ｏｎ）三量体およびｇｐ１４０９２ＵＧ３７．８＋ｇｐ１４０ＣＺＡ７９０１２（ｇｐ１４０Ａ＋Ｃ）フォールドオン三量体と、１つのネイティブベイトＢＧ５０５．ＳＯＳＩＰ－ＡｖｉＢとを用いて染色した。四角い挿入枠内の集団は選別された単一細胞であった細胞を表し、数字は全ＩｇＧ＋細胞のうちＣＤ１９＋／ベイト＋であった細胞の割合を示す。下部パネル：円グラフは、上部に示された対応するＦＡＣＳプロットからの単一の選別された細胞から増幅された総Ｉｇ配列を表す。円の中央の数字は抗体の総数を表す。空のスライスは、一度だけ出現し、クローン性関連物を有しなかった配列を表す。スライスは、抗体クローンを表し、各クローンの配列数に比例している。アスタリスクでマークしたクローンはｔｉｅｒ ２中和を示したクローンであり、これらは変異体ＮＣ３７、ＢＧ１８およびＢＧ１によって表される。図１Ｄ：上部パネル：モノクローナル抗体ＮＣ３７、ＢＧ１およびＢＧ１８のＴＺＭ－ｂｌアッセイにおけるＩＣ５０値に基づく中和効力を示すヒートマップ。下部パネル：２０１４年に得られたドナーポリクローナルＩｇＧ、ならびにＹＵ２ＷＴ、ＹＵ２Ｎ２８０Ｙ、ＹＵ２ＮＮ３３２ＫおよびＹＵ２ＮＮ１６０Ｋに対するＮＣ３７、ＢＧ１およびＢＧ１８のＴＺＭ－ｂｌアッセイにおけるＩＣ５０値に基づく中和効力。ＴＺＭ－ｂｌアッセイはいずれも２連で行った。図１Ｅ：１２０ Ｔｉｅｒ ２ ＨＩＶ－１シュードウイルスの集団に対して試験された抗体ＮＣ３７、ＢＧ１、ＢＧ１８、および１：１：１の組合せ（「ｃｏｍｂ．」）のＴＺＭ－ｂｌアッセイにおけるＩＣ５０に基づく中和効力のヒートマップ。中和されたウイルス全種の幾何平均とパーセント広域性とを下部パネルに示す。中和アッセイは２連で行った。図１Ｆ：（１Ｅ）の値に基づく範囲曲線。
【図2A-D】ＢＧ１８ ｂＮａｂの配列および構造分析を表す。図２Ａ：１０－１０７４、ＰＧＴ１２１およびＢＧ１８の重鎖アミノ酸配列のアラインメント。アスタリスクはアラインメントのギャップを示す。矢印は、３つの抗体がいずれもそれぞれの生殖系列遺伝子と比較して変異しているフレームワーク位置を表す。ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を示す。図２Ｂ：１０－１０７４、ＰＧＴ１２１およびＢＧ１８の（Ａ）のような軽鎖配列アラインメント。図２Ｃ：左パネル：１．３Å分解能で解明した際のＢＧ１８ ＦａｂのＶＨ（ダークグレー）ドメインおよびＶＬ（ライトグレー）ドメインのリボン図。中央パネル：ＢＧ１８可変ドメインの表面図。右パネル：ＣＤＲＨ３立体構造は、ループ内の水素結合（破線で示す）によって安定化されている。相互作用残基は棒として示し、ＣＤＲＨ３の残部と近傍ＣＤＲＨ１とはリボン図として示す。図２Ｄ：パネル：ＢＧ１８（紫）、ＰＧＴ１２１（緑）および１０－１０７４（青）可変ドメインの重ね合わせ（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示すリボン図。ＢＧ１８のＣＤＲＨ３は赤で強調されており、ＰＧＴ１２１および１０ー１０７４のＣＤＲＨ３ループはえび茶色である。右パネル：ＶＨの重ね合わせ後のＢＧ１８（薄いピンク）およびＰＧＴ１２１（薄い緑色）のＶＬが示されている。ＣＤＲＬ２ＢＧ１８は結晶中で無秩序であり、破線で示されている。１０－１０７４はＰＧＴ１２１と密接に関連しており、わかりやすくするため省略した。図２Ｅ：ＢＧ１８およびＰＧＴ１２１の表面図。図２Ｆ：ＢＧ１８および１７９ＮＣ７５ Ｆａｂに結合したＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４の単一粒子ＥＭ構造（灰色透明密度（ｇｒａｙ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙ））。ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４、ＢＧ１８ Ｆａｂ、および１７９ＮＣ７５ Ｆａｂ（ＣＨ１０３ Ｆａｂ：ＰＤＢ ４ＪＡＭ）のモデルの座標を、下記の実施例１に記載されるようにＥＭ密度に適合させた。２Ｄクラスの平均を示す。図２Ｇ：１０－１０７４、ＰＧＴ１２２（ＰＤＢ ５ＦＹＪ）、ＰＧＴ１３５（ＰＤＢ ４ＪＭ２）およびＰＧＴ１２８（ＰＤＢ ５ＡＣＯ）のＦａｂに対してＢＧ１８ ＦａｂがとったＢＧ５０５結合の角度の比較。比較を容易にするために、１７９ＮＣ７５ Ｆａｂの密度をＢＧ１８－１７９ＮＣ７５－ＢＧ５０５マップから差し引いた。
【図2E-G】ＢＧ１８ ｂＮａｂの配列および構造分析を表す。図２Ａ：１０－１０７４、ＰＧＴ１２１およびＢＧ１８の重鎖アミノ酸配列のアラインメント。アスタリスクはアラインメントのギャップを示す。矢印は、３つの抗体がいずれもそれぞれの生殖系列遺伝子と比較して変異しているフレームワーク位置を表す。ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を示す。図２Ｂ：１０－１０７４、ＰＧＴ１２１およびＢＧ１８の（Ａ）のような軽鎖配列アラインメント。図２Ｃ：左パネル：１．３Å分解能で解明した際のＢＧ１８ ＦａｂのＶＨ（ダークグレー）ドメインおよびＶＬ（ライトグレー）ドメインのリボン図。中央パネル：ＢＧ１８可変ドメインの表面図。右パネル：ＣＤＲＨ３立体構造は、ループ内の水素結合（破線で示す）によって安定化されている。相互作用残基は棒として示し、ＣＤＲＨ３の残部と近傍ＣＤＲＨ１とはリボン図として示す。図２Ｄ：パネル：ＢＧ１８（紫）、ＰＧＴ１２１（緑）および１０－１０７４（青）可変ドメインの重ね合わせ（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示すリボン図。ＢＧ１８のＣＤＲＨ３は赤で強調されており、ＰＧＴ１２１および１０ー１０７４のＣＤＲＨ３ループはえび茶色である。右パネル：ＶＨの重ね合わせ後のＢＧ１８（薄いピンク）およびＰＧＴ１２１（薄い緑色）のＶＬが示されている。ＣＤＲＬ２ＢＧ１８は結晶中で無秩序であり、破線で示されている。１０－１０７４はＰＧＴ１２１と密接に関連しており、わかりやすくするため省略した。図２Ｅ：ＢＧ１８およびＰＧＴ１２１の表面図。図２Ｆ：ＢＧ１８および１７９ＮＣ７５ Ｆａｂに結合したＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４の単一粒子ＥＭ構造（灰色透明密度（ｇｒａｙ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙ））。ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４、ＢＧ１８ Ｆａｂ、および１７９ＮＣ７５ Ｆａｂ（ＣＨ１０３ Ｆａｂ：ＰＤＢ ４ＪＡＭ）のモデルの座標を、下記の実施例１に記載されるようにＥＭ密度に適合させた。２Ｄクラスの平均を示す。図２Ｇ：１０－１０７４、ＰＧＴ１２２（ＰＤＢ ５ＦＹＪ）、ＰＧＴ１３５（ＰＤＢ ４ＪＭ２）およびＰＧＴ１２８（ＰＤＢ ５ＡＣＯ）のＦａｂに対してＢＧ１８ ＦａｂがとったＢＧ５０５結合の角度の比較。比較を容易にするために、１７９ＮＣ７５ Ｆａｂの密度をＢＧ１８－１７９ＮＣ７５－ＢＧ５０５マップから差し引いた。
【図3A-E】ドナーＥＢ３５４における自己由来のプラズマウイルスを表す。図３Ａ：２００６年、２０１０年、２０１３年および２０１４年に採取されたドナーＥＢ３５４由来の単一ゲノム由来ｅｎｖ遺伝子配列の最尤分子系統樹。赤いアスタリスクは、ブートストラップサポートが９０％以上のクレードを示す。３つの主要な配列群は任意にクラスターＡ、ＢおよびＣと命名されている。３つの三角形は、Ｎ結合型グリコシル化部位が存在しないｅｎｖ配列を示す。破線枠はＶＯＣ培養物を示す。丸括弧内の数字はウイルス性ｅｎｖ ＶＯＣ配列の数を表す。図３Ｂ：２０１０年、２０１３年および２０１４年に得られた血漿ｅｎｖ配列のペアワイズヌクレオチド配列多様性を表す散布プロット。各点は、所与の時点での２つの配列間のペアワイズ遺伝的差異を表す。Ｐ値は、２標本Ｕ統計量ベースのＺ検定を使用して決定し、＊＊＊ｐ＜０．０００５である。図３Ｃ：ＥＢ３５４ ｅｎｖ配列を用いて自己由来シュードウイルスに対するウイルスｅｎｖ遺伝子と同じ時点から精製したＢＧ１８、ＢＧ１、ＮＣ３７および同時期のＩｇＧのＴＺＭ－ｂｌアッセイにおけるＩＣ５０値を示すヒートマップ。星印は、３つの自己由来ｂＮＡｂいずれに対しても耐性のシュードウイルスを示す。抗体３ＢＮＣ１１７（米国特許第２０１４／０３２８８６２号明細書に記載）を対照として用いた。左側の円は、（３Ａ）に示すように、配列が得られた時点に対応する。中和アッセイは２連で行い、少なくとも２回繰り返した。灰色の四角はアッセイが行われなかったことを示す。図３Ｄ：円グラフは、分析した様々な時点での３つの自己由来ｂＮＡｂのそれぞれに対してＥＢ３５４ ｅｎｖ配列を用いた自己由来シュードウイルスの感受性を表す。円の中央の数字は、試験したｅｎｖシュードウイルスの数を表し、様々なスライスはシュードウイルスの数に比例する。ｂＮＡｂは左側に示され、試料が採取された時点はグラフの上に示されている。円の下のバーは、ＰＣＲによって抗体転写物が検出された時点を示す。図３Ｅ：２０１４年および２０１５年に得られたＥＢ３５４ ＣＤ４ Ｔ細胞から得られたＶＯＣに対するＢＧ１８、ＢＧ１、ＮＣ３７および対照ｂＮＡｂ ３ＢＮＣ１１７のＴＺＭ－ｂｌアッセイにおけるＩＣ５０値。
【図4A-C】ＨＩＶＹＵ２感染ｈｕマウスの治療を表す。図４Ａ：ＢＧ１８（上部パネル）またはＮＣ３７（下部パネル）による単独療法の前後の４匹（ＢＧ１８）および５匹（ＮＣ３７）のＨＩＶＹＵ２感染ｈｕマウスにおけるウイルス量の値。グラフ上の灰色の網掛け部分は、ＢＧ１８（上）またはＮＣ３７（下）が投与された期間を示す。太線は各治療実験における幾何平均値を示す。図４Ｂ：ＢＧ１８（上）またはＮＣ３７（下）による治療後２１日目にクローニングされたウイルス由来のｇｐ１２０配列のアミノ酸配列アラインメント。各水平バーは、ＨＩＶ－１ＹＵ２にアラインさせた単一のｇｐ１２０クローンの配列を表す。アミノ酸置換はチェックマークとして示されている。配列が得られたマウスＩＤは垂直バー上に示されている。枠で囲まれた領域の拡大図は、各パネルの右側に示されている。図４Ｃ：野生型ＨＩＶ－１ＹＵ２配列と比較した、ｇｐ１２０におけるＢＧ１８（上）およびＮＣ３７（下）に関する反復突然変異を示す円グラフ。様々なスライスは、突然変異を担持した配列の数に比例する。円の中央にある数字は、クローニングされた配列の総数を表す。ＮＣ３７の白いスライスは、反復突然変異がないことを示している。図４Ｄ：ＢＧ１８＋ＮＣ３７＋ＢＧ１の組合せによる治療前後の７匹のｈｕマウスにおけるウイルス量の値。マウスＴ１およびＴ２は未治療の対照マウスである（白い印）。マウスＴ３～Ｔ７には、ＢＧ１８＋ＮＣ３７＋ＢＧ１の組合せを投与した（黒い印）。網掛け部分は、ｂＮＡｂの組合せが投与された期間を示す。幾何平均の平均は太線で示されており、未治療群については破線で、治療群については実線である。図４Ｅ：０日目（抗体投与前）と比較したウイルス量のＬｏｇ１０の差。アスタリスクは概略値を示す。
【図4D-E】ＨＩＶＹＵ２感染ｈｕマウスの治療を表す。図４Ａ：ＢＧ１８（上部パネル）またはＮＣ３７（下部パネル）による単独療法の前後の４匹（ＢＧ１８）および５匹（ＮＣ３７）のＨＩＶＹＵ２感染ｈｕマウスにおけるウイルス量の値。グラフ上の灰色の網掛け部分は、ＢＧ１８（上）またはＮＣ３７（下）が投与された期間を示す。太線は各治療実験における幾何平均値を示す。図４Ｂ：ＢＧ１８（上）またはＮＣ３７（下）による治療後２１日目にクローニングされたウイルス由来のｇｐ１２０配列のアミノ酸配列アラインメント。各水平バーは、ＨＩＶ－１ＹＵ２にアラインさせた単一のｇｐ１２０クローンの配列を表す。アミノ酸置換はチェックマークとして示されている。配列が得られたマウスＩＤは垂直バー上に示されている。枠で囲まれた領域の拡大図は、各パネルの右側に示されている。図４Ｃ：野生型ＨＩＶ－１ＹＵ２配列と比較した、ｇｐ１２０におけるＢＧ１８（上）およびＮＣ３７（下）に関する反復突然変異を示す円グラフ。様々なスライスは、突然変異を担持した配列の数に比例する。円の中央にある数字は、クローニングされた配列の総数を表す。ＮＣ３７の白いスライスは、反復突然変異がないことを示している。図４Ｄ：ＢＧ１８＋ＮＣ３７＋ＢＧ１の組合せによる治療前後の７匹のｈｕマウスにおけるウイルス量の値。マウスＴ１およびＴ２は未治療の対照マウスである（白い印）。マウスＴ３～Ｔ７には、ＢＧ１８＋ＮＣ３７＋ＢＧ１の組合せを投与した（黒い印）。網掛け部分は、ｂＮＡｂの組合せが投与された期間を示す。幾何平均の平均は太線で示されており、未治療群については破線で、治療群については実線である。図４Ｅ：０日目（抗体投与前）と比較したウイルス量のＬｏｇ１０の差。アスタリスクは概略値を示す。
【図5】競合ＥＬＩＳＡの結果を表す。漸増量の様々な競合抗体の存在下で、ＥＬＩＳＡにおけるＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４に対する結合について各中和抗体（等量）をアッセイした。黒線は、競合がない場合のビオチン化抗体の結合を示す。図５Ａ：ＢＧ１８、図５Ｂ：ＢＧ１。
【図6A-D】ＢＧ１８、ＰＧＴ１２１および１０－１０７４の間の配列比較を表す。図６Ａ：ＰＧＴ１２１、１０－１０７４および９つのＢＧ１８クローン変異体の重鎖の配列のデンドログラム、ならびにそれらの予測される生殖系列。図６Ｂ：重鎖ＣＤＲのアラインメント。ＰＧＴ１２１／１０－１０７４およびＢＧ１８変異体に共通の位置が強調表示されている。図６Ｃ：軽鎖について以外は（６Ａ）と同じ。図６Ｄ：軽鎖ＣＤＲのアラインメント。ＰＧＴ１２１／１０－１０７４およびＢＧ１８変異体に共通の位置が強調表示されている。
【図7】ＢＧ１８の静電位を表す。ＡＰＢＳを用いてＦａｂの静電表面電位を計算し、表面図をＵＣＳＦキメラで表示し、陰影を付けた。予測された結合界面は黒い点線で輪郭を描かれている。Ａｓｎ１３７ｇｐ１２０、Ａｓｎ１５６ｇｐ１２０およびＡｓｎ３３２ｇｐ１２０に結合したｇｐ１２０グリカンのＰＧＴ１２１および１０－１０７４ Ｆａｂ表面上のおおよその占有面積は黒い三角形で示されている。
【図8A-C】ＮＣ３７ Ｆａｂ－ｇｐ１２０複合体構造を表す。図８Ａ：８ＡＮＣ１３４ Ｆａｂ－ｇｐ１２０複合体構造（ＰＤＢ ４ＲＸ４）上に重ね合わせたＮＣ３７ Ｆａｂ－ｇｐ１２０複合体の２．７Å結晶構造は、２つの抗体について同様のｇｐ１２０結合配向を明らかにする。図８Ｂ：Ｆａｂ－ｇｐ１２０界面の拡大図は、８ＡＮＣ１３４ ＣＤＲＨ３と比較したＮＣ３７の伸長ＣＤＲＨ３を示す。図８Ｃ：三量体の１つのプロトマー上に示されたＮＣ３７、８ＡＮＣ１３４およびＮＩＨ４５－４６について予測されたエピトープを有する表面図（ＰＤＢ ４ＴＶＰ）におけるＢＧ５０５三量体構造の側面図。ＮＣ３７の長い方のＣＤＲＨ３は、三量体の隣接プロトマー（薄い灰色）上の比較的大きい接触面積を示唆する。
【図9A-B】合成ＨＩＶ－１ Ｖ３糖ペプチドに結合するＢＧ１８抗体を表す。ビオチンタグ付きＶ３糖ペプチドをネオトラビジン（ｎｅｏｔｒａｖｉｄｉｎ）チップ上に固定化し、ＢＧ８ ＩｇＧを分析物として使用した。図９Ａ：ＢＧ１８と、Ｎ３０１にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。図９Ｂ：ＢＧ１８と、Ｎ３３２にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。図９Ｃ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３０１に２分岐複合型Ｎ－グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。結合は観察されなかった。図９Ｄ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３３２に２分岐複合型Ｎ－グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。結合は観察されなかった。図９Ｅ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３３４にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＡ２４４ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。図９Ｆ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３３４にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＣＡＰ４５ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。
【図9C-D】合成ＨＩＶ－１ Ｖ３糖ペプチドに結合するＢＧ１８抗体を表す。ビオチンタグ付きＶ３糖ペプチドをネオトラビジン（ｎｅｏｔｒａｖｉｄｉｎ）チップ上に固定化し、ＢＧ８ ＩｇＧを分析物として使用した。図９Ａ：ＢＧ１８と、Ｎ３０１にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。図９Ｂ：ＢＧ１８と、Ｎ３３２にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。図９Ｃ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３０１に２分岐複合型Ｎ－グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。結合は観察されなかった。図９Ｄ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３３２に２分岐複合型Ｎ－グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。結合は観察されなかった。図９Ｅ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３３４にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＡ２４４ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。図９Ｆ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３３４にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＣＡＰ４５ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。
【図9E-F】合成ＨＩＶ－１ Ｖ３糖ペプチドに結合するＢＧ１８抗体を表す。ビオチンタグ付きＶ３糖ペプチドをネオトラビジン（ｎｅｏｔｒａｖｉｄｉｎ）チップ上に固定化し、ＢＧ８ ＩｇＧを分析物として使用した。図９Ａ：ＢＧ１８と、Ｎ３０１にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。図９Ｂ：ＢＧ１８と、Ｎ３３２にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。図９Ｃ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３０１に２分岐複合型Ｎ－グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。結合は観察されなかった。図９Ｄ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３３２に２分岐複合型Ｎ－グリカンを担持するＪＲ－ＦＬ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。結合は観察されなかった。図９Ｅ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３３４にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＡ２４４ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。図９Ｆ：ＢＧ１８ ＩｇＧと、Ｎ３３４にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを担持するＣＡＰ４５ ｍｉｎｉ－Ｖ３糖ペプチドとの間の相互作用。弱い結合が観察された。
【図10】ドナーＥＢ３５４から得られたプラズマウイルスの単一ゲノムｅｎｖ配列決定を表す。図１０Ａ：円グラフは、採取時点ごとに単一ゲノムＰＣＲによって増幅された全ｅｎｖ配列を表す。各時点から得られた配列の総数が円の中央に示され、様々なスライスは配列の数に比例する。図１０Ｂ：２００６年、２０１０年、２０１３年および２０１４年に採取されたドナーＥＢ３５４由来の単一ゲノム由来ｅｎｖ遺伝子配列の最尤分子系統樹。アスタリスクは、ブートストラップサポートが９０％以上のクレードを示す。右側の表は、ＥＢ３５４ ｅｎｖ配列を用いた自己由来シュードウイルスに対するＢＧ１８、ＢＧ１、ＮＣ３７および対照抗体３ＢＮＣ１１７のＴＺＭ－ｂｌアッセイにおけるＴＣＩＤ５０値およびＩＣ５０値を示す。図１０Ｃ：少なくとも１つのｂＮＡｂに感受性であったＥＢ３５４ ｅｎｖ配列を用いたシュードウイルスとは対照的に、３つのｂＮＡｂいずれに対しても耐性であったＥＢ３５４ ｅｎｖを用いたシュードウイルスのＴＣＩＤ５０値の比較。Ｐ値（ｔ検定）＝０．００１６。
【図11A-C】ＢＧ８を用いたＨＩＶＹＵ２感染ｈｕマウスの治療を表す。図１１Ａ：ＢＧ８投与前後の４匹のｈｕマウスにおけるウイルス量の値。グラフ上の灰色の網掛け部分は、抗体が投与された期間を示す。太線は幾何平均値を示す。図１１Ｂ：治療後２１日目にクローニングされたウイルス由来のｇｐ１２０配列のアミノ酸配列アラインメント。各灰色の水平バーは、ＨＩＶ－１ＹＵ２にアラインさせた単一のｇｐ１２０クローンの配列を表す。アミノ酸置換は黒いチェックマークとして示されている。配列が得られたマウスＩＤは、黒い垂直バー上に示されている。枠で囲まれた領域の拡大図は、各パネルの右側に示されている。図１１Ｃ：ＢＧ８治療後の野生型ＨＩＶ－１ＹＵ２配列と比較したｇｐ１２０の反復突然変異を示す円グラフ。円の中央の数字は、クローニングされた配列の総数を表す。スライスは、ｇｐ１２０で最も一定して突然変異している領域を表し、突然変異を担持した配列の数に比例する。
【発明を実施するための形態】
【0020】
Ａ．定義
抗ＨＩＶ－１抗体は、本明細書中に開示されるように、当技術分野では多数の形態のうちの１つをとり得る。抗体は、それらが結合する抗原によって部分的に定義され、したがって、「抗ＨＩＶ－１抗体」は、本明細書に記載のように、ｇｐ１２０および／またはｇｐ１４０内など、ヒト免疫不全ウイルス１（「ＨＩＶ－１」）のウイルスエンベロープ上に見出される少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する任意のそのような抗体である。当技術分野では、抗体とは、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分であることが理解されている。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される。軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。重鎖および軽鎖の両方の可変領域は、フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。４つのＦＷＲ領域は比較的保存されるが、ＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、超可変領域を表し、以下のようにＮＨ２末端からＣＯＯＨ末端に配置される：ＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３、ＦＷＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域が抗原と相互作用する結合ドメインを含有するのに対して、定常領域は、アイソタイプに応じて、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。当技術分野では、モノクローナル抗体および他の抗体を操作し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を作製することが可能であることが知られている。そのような技法は、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域＋フレームワーク領域に、抗体の免疫グロブリン可変領域またはＣＤＲをコードするＤＮＡを導入することを発展させ得る。
抗ＨＩＶ－１抗体は、本明細書中に開示されるように、当技術分野では多数の形態のうちの１つをとり得る。抗体は、それらが結合する抗原によって部分的に定義され、したがって、「抗ＨＩＶ－１抗体」は、本明細書に記載のように、ｇｐ１２０および／またはｇｐ１４０内など、ヒト免疫不全ウイルス１（「ＨＩＶ－１」）のウイルスエンベロープ上に見出される少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する任意のそのような抗体である。当技術分野では、抗体とは、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分であることが理解されている。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される。軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。重鎖および軽鎖の両方の可変領域は、フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。４つのＦＷＲ領域は比較的保存されるが、ＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、超可変領域を表し、以下のようにＮＨ２末端からＣＯＯＨ末端に配置される：ＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３、ＦＷＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域が抗原と相互作用する結合ドメインを含有するのに対して、定常領域は、アイソタイプに応じて、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介し得る。当技術分野では、モノクローナル抗体および他の抗体を操作し、組換えＤＮＡ技術の技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を作製することが可能であることが知られている。そのような技法は、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域＋フレームワーク領域に、抗体の免疫グロブリン可変領域またはＣＤＲをコードするＤＮＡを導入することを発展させ得る。
【0021】
本明細書で使用される用語「抗体」（Ａｂ）は、最も広い意味で使用され、具体的には、天然のものであれ、部分的または全体的に合成的に作製されたものであれ、限定するものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体および多反応性（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｅ）抗体）および抗体断片を含む任意の免疫グロブリンを含み得る。したがって、本明細書内の任意の文脈で使用される用語「抗体」は、限定するものではないが、任意の特異的結合メンバー、免疫グロブリンクラスおよび／またはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ）ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖または関連実体）および（ｓｃＦｖ）２を含むがこれらに限定されない生物学的に関連のある断片またはその特異的結合メンバーを含むことを意味する。
【0022】
本明細書で使用される用語「抗体断片」は、本明細書で概説されるように、当業者には容易に知られ利用可能な技法を使用して得られる抗体断片を含み得る。したがって、上記の「抗体」の定義に加えて、用語「抗体」は、無傷抗体の抗原結合領域または可変領域などの無傷抗体の一部を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質をさらに包含し得る。これらは天然源から誘導することができるか、部分的または全体的に合成的に作製されてもよい。抗体断片の例には、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディならびに直鎖抗体が挙げられる。本明細書で使用される用語「抗原結合部分」、「抗原結合断片」または「Ｆａｂ」は、抗原に結合する抗体上の領域を指し得る。当業者であれば、Ｆａｂが抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの１つの定常の１つの可変ドメインから構成されることを理解するであろう。
【0023】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し得、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量存在する可能性のある天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体およびヒト抗体を含み得る。モノクローナル抗体の作製方法は当技術分野では周知であり、以下に考察されるいくつかの具体例は、ハイブリドーマ技術、例えば、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ技術による組換え抗体作製、トランスジェニックマウスによる作製、および単一Ｂ細胞培養を含む。インビトロまたは細菌系および／または哺乳動物系および／または酵母系のいずれかでＰＣＲ（または類似の技術）によって抗体遺伝子（例えば、プラスミドまたはコスミド）の重鎖および／または軽鎖を増幅することを含む方法は、本発明の範囲内にあると考えられる。
【0024】
本明細書で使用される用語「保存的配列修飾」または「保存的置換」は、本発明の標的エピトープに対するアミノ酸修飾を指し得、これは、エピトープに対する抗ＨＩＶ－１抗体の結合特性に顕著に影響を及ぼすことも、それを変化させることもない。そのような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体が特異的に結合する標的エピトープ、例えば、ＨＩＶ－１のウイルスエンベロープ上のエピトープ、例えば、ｇｐ１２０および／またはｇｐ１４０上のエピトープ内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換することができ、本発明の抗体は、標的エピトープに対して試験することができ、例えば、本明細書に記載されているか、そうでなければ当技術分野で公知の機能的アッセイを使用して試験することができる。
【0025】
用語「生体試料」は、生物（例えば、患者）から、または生物の構成要素（例えば、細胞）から得られた試料を指す。試料は、任意の生物学的組織、細胞または流体であり得る。試料は、ヒト患者などの対象に由来する試料である「臨床試料」であり得る。そのような試料には、限定するものではないが、唾液、痰、血液、血液細胞（例えば、白血球）、体液、洗浄液、膵液、胃液、排泄物、ＣＳＦ、リンパ羊水、血漿、精液、骨髄、および組織または細針生検試料、尿、大便、腹水、および胸水、またはそれらからの細胞、ならびにそれらの任意の組合せが挙げられる。生体試料にはまた、組織学的目的のために採取された凍結切片などの組織の切片が挙げられ得る。生体試料はまた、「患者試料」とも呼ばれ得る。生体試料にはまた、実質的に精製もしくは単離されたタンパク質、膜調製物または細胞培養物が挙げられ得る。
【0026】
用語「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原に結合する２つの異なるモノクローナル抗体の断片から構成される人工免疫グロブリン構築物を指す。限定するものではないが、三機能抗体および化学的に結合したＦａｂを含むいくつかの異なる種類の二重特異性抗体がある。本発明の抗ＨＩＶ－１抗体は、二重特異性抗体を含み得、本発明の１つ以上の異なる抗ＨＩＶ－１抗体を含む１つ以上の異なる抗ＨＩＶ－１抗体の断片、例えば、ＢＧ１８およびＢＧ１、または本発明の１つ以上の抗ＨＩＶ－１抗体および既知の抗ＨＩＶ－１抗体、例えば、ＢＧ１８および３ＢＮＣ１１７（米国特許第２０１４／０３２８８６２号明細書に記載）、または米国特許第８，６３７，０３６号明細書に記載されるＢＧ１８およびＶＲＣ０１を含み得る。二重特異性抗ＨＩＶ ｂＮａｂならびにその作製方法および使用方法は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１６／６４７１３号明細書に記載されている。
【0027】
本明細書で使用される用語「有効量」または「治療有効量」は、治療対象に対して医学的に望ましい結果をもたらすことができる化合物または薬剤の量を指し得る。治療方法は、インビボまたはエクスビボで、単独でまたは他の薬物もしくは療法と組み合わせて実施することができる。治療有効量は、１回以上の投与、適用または投与量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。
【0028】
用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」は、所定の抗原上のエピトープに結合するが他の抗原には結合しない抗体を指し得る。典型的には、抗体は、例えば、所定の抗原、例えば、ＨＩＶ－１のウイルスエンベロープ上のエピトープ、例えば、分析物としてのｇｐ１２０およびリガンドとしての抗体を使用する平衡透析もしくはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴装置における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術、または抗原陽性細胞に対する抗体の結合のスキャッチャード解析によって決定した場合に、約１０－６Ｍ未満、例えば、約１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満またはさらにそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、（ｉｉ）所定の抗原または密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性の少なくとも２倍の親和性で所定の抗原に結合する。
【0029】
本明細書で使用される用語「相同性」は、２つの組成物間の共有構造の存在を指し得る。タンパク質の文脈での用語「相同性」は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチド配列間の重複の量（例えば、百分率で表される）を指し得る。核酸の文脈では、この用語は、２つ以上の核酸配列間の重複の量（例えば、百分率で表される）を指し得る。本明細書で使用される場合、２つの配列間のパーセント（％）相同性は、２つの配列間のパーセント同一性に等しい。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×１００）、これは、２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要がある。２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。そのような相同性は、当技術分野では、局所的アラインメントツールおよび／またはアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴおよび／またはＢＬＡＳＴ ２．０を介してよく表され、ペアワイズアラインメント、マルチプルシーケンスアラインメント法、構造的アラインメント法および／または系統発生分析法を含み得る。
【0030】
本明細書で使用される用語「同時投与」、「同時投与された」および「と組み合わせて」は、対象に対する少なくとも２つの薬剤または療法の投与を指し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤／療法の同時投与は同時である。他の実施形態では、第１の薬剤／療法は第２の薬剤／療法の前に投与される。当業者であれば、使用される様々な製剤／療法の処方および／または投与経路が変わり得ることを理解している。例えば、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体は互いに同時投与されてもよいか、他の抗体、例えば、米国特許第２０１４／０３２８８６２号明細書に開示されている広域中和抗ＨＩＶ抗体などの他の広域中和抗体、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，６３７，０３６号明細書に記載の３ＢＮＣ１１７またはＶＲＣ０１とともに同時投与されてもよいか、場合により、他のＨＩＶ剤と同時投与される。同時投与は、同時に起きてもそうでなくてもよく、例えば、本発明の１つ以上の抗ＨＩＶ－１抗体が、本発明の別の抗ＨＩＶ－１抗体（または他の抗ＨＩＶ抗体もしくは他のＨＩＶ剤）の前または後に投与されてもよいか、同時にまたは実質的に同様の時期に投与されてもよい。当業者であれば、同時投与とは、患者のレジメンの一部として他の化合物および／または療法とともに投与することを記載することを意味するため、時間を限定することを意味しないことを理解するであろう。
【0031】
本明細書で使用される用語「ＨＩＶ剤」は、それ自体では抗ＨＩＶ－１抗体を含まない、ＨＩＶの治療のための療法を指し得る。例えば、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、融合阻害剤、ＣＣＲ５アンタゴニスト／エントリー阻害剤、インテグラーゼ鎖転移阻害剤（ＩＮＳＴＩ）およびそれらの組合せはいずれも、本発明の１つ以上の抗ＨＩＶ－１抗体および／または追加の抗ＨＩＶ－１抗体と同時投与することができる非抗体ベースの治療的処置であるため、「ＨＩＶ剤」と解釈される。当業者であれば、この列挙が網羅的であると解釈されるべきではなく、最新技術が進歩し、追加の治療が利用可能になるにつれて、それらがこの定義の範囲内にあると解釈されることを理解するであろう。
【0032】
本明細書で使用される用語「担体」は、使用される投与量および濃度でそれらに曝露される細胞または哺乳動物に無毒の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を含み得る。多くの場合、生理学的に許容される担体はｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例には、限定するものではないが、ホスフェート、シトレートおよび他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含むがこれに限定されない抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどであるがこれらに限定されないタンパク質；ポリビニルピロリドンなどであるがこれに限定されない親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどであるがこれらに限定されないアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含むがこれらに限定されない他の炭水化物；ＥＤＴＡなどであるがこれに限定されないキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどであるがこれらに限定されない糖アルコール；ナトリウムなどであるがこれに限定されない塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮなどであるがこれに限定されない非イオン界面活性剤；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびにＰＬＵＲＯＮＩＣＳが挙げられる。
【0033】
疾患を「治療すること」または疾患の「治療」という用語は、疾患の徴候または症状を軽減することを目的として、患者（ヒトまたはそれ以外）に１つ以上の薬物を投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。緩和は、疾患の徴候または症状が現れる前、ならびにそれらの出現後に起こり得る。したがって、「治療すること」または「治療」は、疾患を「予防すること」または疾患の「予防」を含む。用語「予防」または「予防すること」は保護的および／または予防的手段を指し、ここで目的は標的の病理学的状態または障害を予防または抑制することである。例えば、免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）による感染の場合、受動的ワクチン接種を介するなどして、ＨＩＶ－１による感染を予防または失速させるために一連の治療が進められる状況では、「予防すること」または「予防すること」が起こり得る。そのような「予防すること」または「予防」はまた、例えば血清反応陽性であるがいかなる症状も示さない（すなわちＡＩＤＳの症状に進行していない）個体にＨＩＶ－１が潜伏感染している場合にも起こり、ここで目的は、活性感染を予防すること、および／または上記ＨＩＶ－１感染患者を治すことである。さらに、「治療すること」または「治療」は、徴候または症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、特に、患者に対してわずかではあるが好ましい効果を有するプロトコルを含む。
【0034】
本明細書で使用される用語「エピトープ」は、抗体またはＴ細胞が結合する抗原の領域、例えば、限定するものではないが、糖タンパク質、例えば、ｇｐ１２０、または糖タンパク質上の領域を含むＨＩＶ－１のウイルスエンベロープの領域を指し得る。「抗原」は、免疫学的反応を誘発するか、その反応の生成物に結合する物質を指す。
【0035】
本明細書で使用される用語「精製された」または「単離された」抗体、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、他のタンパク質、脂質、およびそれが天然に関連している核酸から分離されているペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指し得る。ポリペプチド／タンパク質は、精製された調製物の乾燥重量で少なくとも１０％（すなわち、１０％～１００％の任意の割合、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および９９％）を構成し得る。純度は、任意の適切な標準的方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。本発明に記載の単離されたポリペプチド／タンパク質（例えば、抗ＨＩＶ－１抗体）は、組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。
【0036】
Ｂ．広域中和抗ＨＩＶ－１抗体
本発明は、広域中和抗ＨＩＶ－１抗体（ｂＮａｂ）およびその抗原結合部分に関する。特に、本発明は、いくつかの異なるモノクローナル抗体、ＢＧ１８、ＮＣ３７、およびＢＧ１、限定するものではないがそれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むそれらの抗原結合部分、ならびにそれらの誘導体および変異体に関し、これらはインビボでＨＩＶ－１の広域かつ強力な中和を示す（下記実施例１参照）。したがって、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体は、本明細書中で考察されるように、単独で、または互いに組み合わせて、もしくは他のｂＮａｂと、もしくは他のＨＩＶ治療と組み合わせて、強力な治療的有用性を有する。
本発明は、広域中和抗ＨＩＶ－１抗体（ｂＮａｂ）およびその抗原結合部分に関する。特に、本発明は、いくつかの異なるモノクローナル抗体、ＢＧ１８、ＮＣ３７、およびＢＧ１、限定するものではないがそれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むそれらの抗原結合部分、ならびにそれらの誘導体および変異体に関し、これらはインビボでＨＩＶ－１の広域かつ強力な中和を示す（下記実施例１参照）。したがって、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体は、本明細書中で考察されるように、単独で、または互いに組み合わせて、もしくは他のｂＮａｂと、もしくは他のＨＩＶ治療と組み合わせて、強力な治療的有用性を有する。
【0037】
ＢＧ１８、ＮＣ３７およびＢＧ１のそれぞれは、別個の重複しないエピトープを有する。ＮＣ３７はＣＤ４ｂｓを認識する。ＮＣ３７およびそのクローン変異体は、ＶＨ１－２およびＶＨ１－４６由来の両方のｂＮＡｂの特性を示す。しかし、構造分析は、ＮＣ３７がＥｎｖをＶＨ１－４６型の様式で認識することを示唆している。理論に縛られることを望むものではないが、ＮＣ３７の長いＣＤＲＨ３が三量体上の隣接プロトマーと接触し、それによってそのコアがＣＤ４ｂｓと重複する四級三量体（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｔｒｉｍｅｒ）エピトープを認識することが予測される。
【0038】
ＢＧ１は、自然感染の間に生じるｂＮＡｂの別の高頻度な標的であるＥｎｖのＶ１Ｖ２領域に結合する。ＢＧ１は、クレードＢ感染ドナーから単離されるこのクラスの第１の抗体（ｂＮａｂ）である。その効力は、Ｎ．Ａ．Ｄｏｒｉａ－Ｒｏｓｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔ Ｖ１Ｖ２－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＨＩＶ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５０９， ５５－６２（２０１４）に開示されているもののようなＶＲＣ２６抗体ファミリーのメンバーとほぼ同等であるが、ＰＧ９／１６およびＰＧＤＭ１４００ ｂＮＡｂよりも効力が低い。今日までに単離された他のＶ１Ｖ２ ｂＮＡｂと同様に、ＢＧ１は長く、チロシンに富むＣＤＲＨ３を有する。
【0039】
ＢＧ１８、ＮＣ３７およびＢＧ１のそれぞれの中で最も強力なＢＧ１８は、Ｖ３ループの基部にあるＡｓｎ３３２ｇｐ１２０中心グリカンパッチに対して導かれる。これは、位置Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０、Ａｓｎ３０１ｇｐ１２０、Ａｓｎ３８６ｇｐ１２０、Ａｓｎ３９２ｇｐ１２０、Ａｓｎ１３７ｇｐ１２０、Ａｓｎ１５６ｇｐ１２０で炭水化物を含む高度にグリコシル化された領域である。Ｌ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｂｒｏａｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｏｆ ＨＩＶ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４７７， ４６６－４７０（２０１１）に記載されているＰＧＴ１２１－１２４およびＨ．Ｍｏｕｑｕｅｔら、Ｃｏｍｐｌｅｘ－ｔｙｐｅ Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｐｏｔｅｎｔ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ＨＩＶ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０９， Ｅ３２６８－３２７７（２０１２）に記載されている１０－１０７４など、この部位でタンパク質および炭水化物成分の両方に結合する多数のモノクローナルｂＮＡｂが単離されている。これらのｂＮＡｂはいずれもクレードＡドナーから単離されたものであり、Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０グリカン（１０－１０７４およびＰＧＴ１２４）のみに依存するものと、Ｖ３グリカンパッチ（ＰＧＴ１２１－１２３）で周囲のグリカンとさらに接触するものとにさらに分類することができる。ＢＧ１８およびそのクローン変異体は、それらがＡｓｎ３３２ｇｐ１２０に依存するという点で１０－１０７４に似ているが、ＢＧ１８は発表されている抗Ｖ３ ｂＮＡｂよりも強力であり、クレードＢドナーから最初に単離されたものである。
【0040】
ＢＧ１８は、ＣＤＲＨ３および軽鎖ドメインの驚くほど明確な配向によって、このクラスの以前に特徴付けられたメンバーとは異なる。さらに、ＢＧ１８は、それが比較的短いＣＤＲＨ３を有し、挿入または欠失を有しないという点でこの抗体群の他のメンバーとは異なり、理論に縛られることを望むものではないが、ＢＧ１８様抗体が比較的容易に誘発され得ることを示唆する。ＢＧ１８－Ｅｎｖ複合体の高分解能構造が存在しない場合、ＢＧ１８の比較的短いＣＤＲＨ３がＥｎｖとどのように相互作用するかを予測することは困難である。ＰＧＴ１２２および１０－１０７４ＦａｂとのＥｎｖ複合体の構造試験は、それらがＥｎｖ三量体内のｇｐ１２０プロトマーにほぼ垂直である類似の接近角度をとることを実証する。ＢＧ１８－Ｅｎｖ ＥＭ構造は、詳細な相互作用を解明するのに十分な分解能ではないが、それでもＢＧ１８が異なる角度からＥｎｖに接近し、これが１０－１０７４およびＰＧＴ１２２の接近角度と比較してｇｐ１２０プロモーターに向かって最大４０°シフトしていることを実証する。３５４ＢＧ８、３５４ＢＧ１８、３５４ＢＧ４２、３５４ＢＧ３３、３５４ＢＧ１２９、３５４ＢＧ１８８、３５４ＢＧ４１１および３５４ＢＧ４２６を含むＢＧ１８クローン変異体および誘導体、ならびにそれらの全長配列、重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を以下の表１に示す。ＢＧ１８変異体のデンドログラムを図６に示し、下記の実施例１で考察する。ＢＧ１、ＢＧ２２およびＢＧ４７を含むＢＧ１クローン変異体および誘導体、ならびにそれらの全長配列、重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を以下の表２に示す。
【0041】
【表1-1】
【0042】
【表1-2】
【0043】
【表1-3】
【0044】
【表2】
【0045】
当業者であれば、ほとんどの抗体、例えば、ＮＣ３７、ＢＧ１の全変異体を含むＢＧ１、およびＢＧ１８の全変異体を含むＢＧ１８の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）が、主に、ＣＤＲＨ３が最も独特の特徴を有するパラトープを抗体上に形成することによって抗体の生物学的活性を決定することを理解するであろう。したがって、本発明の抗体は、ＮＣ３７、ＢＧ１およびＢＧ１８の全変異体およびそれらのそれぞれのＣＤＲを含め、ＮＣ３７、そのＣＤＲ、ＢＧ１、そのＣＤＲならびにＢＧ１８およびそのＣＤＲを含み得る。また、当業者であれば、本発明の抗体がＣＤＲを含む保存的置換を含有し得、なお本発明の範囲内にあることを理解するであろう。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、表１および表２に列挙されたＣＤＲを発現する抗体およびその抗原結合部分に関する。
【0046】
例えば、本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１および８９のうちの１つ以上を含むか、配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１および８９のうちの１つ以上とある程度の相同性、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％およびその中の任意の介在範囲の相同性を有する重鎖を有する抗体またはその抗原結合部分に関する。配列番号１、９、１７、２５、３３、４１、４９、５７、６５、７３、８１および８９のうちの１つ以上は、保存的置換を有してもよい。本発明のいくつかの実施形態は、配列番号５、１３、２１、２０、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５および、９３のうちの１つ以上を含むか、配列番号５５、１３、２１、２０、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５および９３のうちの１つ以上とある程度の相同性、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％およびその中の任意の介在範囲の相同性を有する軽鎖を有する抗体またはその抗原結合部分に関する。配列番号５、１３、２１、２０、３７、４５、５３、６１、６９、７７、８５および９３のうちの１つ以上は、保存的置換を有してもよい。
【0047】
ＩｇＧ重鎖は、典型的には約４００～約６００アミノ酸、さらに典型的には４５０～約５５０アミノ酸のサイズである。各重鎖の可変領域は、抗体クラスにかかわらず、典型的には約１００～１４０アミノ酸長、最も典型的には約１１０～１３０アミノ酸である。軽鎖は典型的には約２１０～２２０アミノ酸長、さらに典型的には２１１～２１７アミノ酸長である。軽鎖の可変領域は、典型的には約１００～１２０アミノ酸長である。
【0048】
本発明のいくつかの実施形態は、重鎖内に、配列番号２～４、１０～１２、１８～２０、２６～２８、３４～３６、４２～４４、５０～５２、５８～６０、６６～６８、７４～７６、８２～８４および９０～９２のうちの１つ以上を含むか、配列番号２～４、１０～１２、１８～２０、２６～２８、３４～３６、４２～４４、５０～５２、５８～６０、６６～６８、７４～７６、８２～８４および９０～９２のうちの１つ以上とある程度の相同性、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％およびその中の任意の介在範囲の相同性を有する１つ以上のＣＤＲを有する抗体またはその抗原結合部分に関する。配列番号２～４、１０～１２、１８～２０、２６～２８、３４～３６、４２～４４、５０～５２、５８～６０、６６～６８、７４～７６、８２～８４および９０～９２のうちの１つ以上は、保存的置換を有してもよい。
【0049】
本発明のいくつかの実施形態は、軽鎖内に、配列番号６～８、１４～１６、２２～２４、３０～３２、３８～４０、４６～４８、５４～５６、６２～６４、７０～７２、７８～８０、８６～８８および９４～９６のうちの１つ以上を含むか、配列番号６～８、１４～１６、２２～２４、３０～３２、３８～４０、４６～４８、５４～５６、６２～６４、７０～７２、７８～８０、８６～８８および９４～９６のうちの１つとある程度の相同性、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％およびその中の任意の介在範囲の相同性を有する１つ以上のＣＤＲを有する抗体またはその抗原結合部分に関する。配列番号６～８、１４～１６、２２～２４、３０～３２、３８～４０、４６～４８、５４～５６、６２～６４、７０～７２、７８～８０、８６～８８および９４～９６のうちの１つ以上は、保存的置換を有してもよい。
【0050】
さらに、本発明の抗体は、抗原結合部分、例えば、本発明のｂＮａｂを含むがこれに限定されない異なる個々のｂＮａｂ由来のＣＤＲから構成されてもよい。純粋に例として、操作された誘導体は、任意の変異体を含むＮＣ３７、ＢＧ１またはＢＧ１８のうちの１つに由来する軽鎖と、任意の変異体を含むＮＣ３７、ＢＧ１またはＢＧ１８のうちの１つを含む異なるｂＮａｂ由来の重鎖とを含み得る。または、操作された誘導体は、ＢＧ１８の１つの変異体由来の軽鎖と、ＢＧ１８の別の変異体由来の重鎖とを含み得る。当業者であれば、組換え抗体作製方法が相当数の組換え抗体を可能にし、その各々が本開示の範囲内にあると明白に考えられることを理解するであろう。したがって、本発明のｂＮａｂは、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されているもののような組換えＤＮＡ法によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離され配列決定され得る。単離後、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いで、普通なら免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはミエローマ細胞などの宿主細胞にこれをトランスフェクトし、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体を合成する。また、ＤＮＡは、例えば、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部に免疫グロブリンコード配列を共有結合させることによって修飾してもよい。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインを置換することができるか、本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換してキメラ二価抗体を作製することができる。
【0051】
抗体が、例えば、いかなる血清、上清または他の細胞培養物もしくは関連物質をも実質的に含まないように、組換えまたはその他の方法で作製後、抗ＨＩＶ－１抗体を精製または単離してもよい。抗体精製の方法は当技術分野で公知であり、選択的濃縮または特異的単離法を含み得る。例えば、クラス特異的親和性などの親和性精製を使用してもよい。免疫グロブリンを含む試料タンパク質のサブセットを単離するのを援助するために、最初に分画法を用いてもよい。典型的には、抗原特異的親和性は、抗原に結合する抗体を単離するために適用される。次いで、抗体を、薬学的に許容される抗ＨＩＶ－１抗体組成物を作製するのに役立つ担体、緩衝剤、希釈剤、溶媒および／または保存剤などと組み合わせてもよい。
【0052】
抗体は一価抗体であり得る。一価抗体を調製するための方法は当技術分野で周知である。例えば、一方法は、免疫グロブリン軽鎖および修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、重鎖架橋を防ぐために、一般にＦｃ領域内の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基が、架橋を防ぐために別のアミノ酸残基で置換されるか、欠失される。インビトロ法も一価抗体を調製するのに適している。その断片、特にＦａｂ断片を作製するための抗体の消化は、当技術分野で公知の日常的な技術を使用して達成することができる。
【0053】
ヒトモノクローナル抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができる［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６－９５（１９９１）］。同様に、トランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって、ヒト抗体を作製することができる。惹起後、ヒト抗体産生が観察され、これは遺伝子再配列、集合および抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトに見られるものと非常によく似ている。この手法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、米国特許第５，６２５，１２６号明細書、米国特許第５，６３３，４２５号明細書、米国特許第５，６６１，０１６号明細書および以下の科学刊行物に記載されている：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７９－７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６－８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３６８， ８１２－１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８４５－５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３ ６５－９３（１９９５）。
【0054】
本発明のいくつかの実施形態は、限定するものではないが、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体のＣＤＲ、例えば、任意の変異体およびその抗原結合部分を含むＮＣ３７、ＢＧ１およびＢＧ１８など、可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターおよびベクター系に関する。ベクターは、例えば、必ずしもそうとは限らないがプラスミドであり得る。他の組換えベクターは当技術分野で公知であり、例えば、λファージベクターなどのファージベクター、非複製アデノウイルスベクターなどの他のウイルスベクター、コスミド、および／または人工染色体を含み得る。ベクター系は別個に誘導可能であってもなくてもよく、すなわち、異なるプロモーターおよび／またはリプレッサー要素を有してもよい。ベクター（ベクター系、例えば複数のプラスミドを含む）が本発明の範囲に包含されると考えられる系を含有する限り、ほとんどの操作されたベクターに共通するのは複製起点、マルチクローニング部位および選択マーカーである。所与のペプチド配列から核酸配列を導き出し、それらを最適な系にクローニングすることは、十分に当業者の範囲内である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１、５、９、１３、１７、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７、６１、６５、７３、７７、８１、８５、８９および９３のうちの１つ以上をコードする１つ以上の核酸配列を含有するベクターまたはベクター系に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体のうちの１つ以上の１つ以上の重鎖および／または軽鎖の１つ以上のＣＤＲをコードする１つ以上の核酸配列、例えば、配列番号２～４、６～８、１０～１２、１４～１６、１８～２０、２２～２４、２６～２８、３０～３２、３４～３６、３８～４０、４２～４４、４６～４８、５０～５２、５４～５６、５８～６０、６２～６４、６６～６８、７０～７２、７４～７６、７８～８０、８２～８４、８６～８８、９０～９２および９４～９６ならびにそれらの組合せのうちの１つ以上をコードする単数または複数のヌクレオチド配列を含有するベクターまたはベクター系に関する。重鎖／軽鎖および／またはＣＤＲをコードするこれらのヌクレオチドは、保存的置換を有してもよく、ＣＤＲをコードするものについては、そのような保存的置換とは無関係に、ヌクレオチド配列とある程度（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）の相同性を共有してもよい。本発明のベクターまたはベクター系は、１つ以上の細胞に導入されてもよく（すなわち、細胞はベクターによって「形質転換」される）、そのような手段は当技術分野で公知である。
【0055】
Ｃ．医薬製剤および送達
本発明の一実施形態は、本発明の少なくとも１つの抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含む医薬組成物、ならびにそれを必要とする患者の治療でのそれらの使用方法に関する。患者は、ＨＩＶ－１による潜在感染または活性感染を有し得る。これらの組成物および方法に利用される抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、本発明の任意の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分であり得るが、特に有用なものは、組換え作製されたその変異体および／または操作された誘導体を含むＢＧ１８またはその変異体を含む抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合部分である。
本発明の一実施形態は、本発明の少なくとも１つの抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含む医薬組成物、ならびにそれを必要とする患者の治療でのそれらの使用方法に関する。患者は、ＨＩＶ－１による潜在感染または活性感染を有し得る。これらの組成物および方法に利用される抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、本発明の任意の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分であり得るが、特に有用なものは、組換え作製されたその変異体および／または操作された誘導体を含むＢＧ１８またはその変異体を含む抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合部分である。
【0056】
患者への投与に適した薬学的に許容される抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分組成物は、生物学的活性を維持しながら許容温度範囲内での保存中に最大の安定性も促進する製剤中に有効量の単数または複数の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含有する。医薬組成物はまた、所望の製剤に応じて、薬学的に許容される希釈剤、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容される賦形剤、または動物もしくはヒト投与用の医薬組成物を製剤化するために通常用いられる任意のそのようなビヒクルを含むことができる。希釈剤は、この組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液である。本発明の医薬組成物または製剤に有用な賦形剤の量は、それを必要とする対象に送達された際に抗体を均一に分散させることができるように組成物全体に抗体を均一に分布させるのに役立つ量である。賦形剤は、同時に、高すぎる濃度から起こり得る有害な副作用を最小限に抑えながら、望ましい有益な緩和または治癒効果をもたらす濃度に抗体を希釈するのに役立ち得る。賦形剤はまた、防腐効果も有し得る。したがって、高い生理学的活性を有する抗体に対しては、さらに多くの賦形剤が使用される。他方では、比較的低い生理学的活性を示す任意の活性成分については、さらに少量の賦形剤が使用される。
【0057】
薬学的に許容される組成物は、液体形態または固体形態であり得る。固体製剤は、必ずしもそうとは限らないが一般に凍結乾燥され、単回または複数回投与のいずれかのために投与前に溶液にされる。製剤は、熱変性を避けるために極端な温度またはｐＨにさらされるべきではない。したがって、生物学的に関連のあるｐＨ範囲内で本発明の抗体組成物を製剤化することが不可欠である。特に製剤化と投与との間に長期間保存される液体製剤では、保存中に適切なｐＨ範囲を維持するために緩衝化された溶液が多くの場合必要とされる。典型的には、液体製剤および固体製剤はともに、長期間にわたって安定性を維持するために、低温（通常２～８℃）での保存を必要とする。製剤化された抗体組成物、特に液体製剤は、限定するものではないが、有効濃度（通常＜１％ｗ／ｖ）のベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベンおよび／またはプロピルパラベンなど、保存中にタンパク質分解を防止または最小限に抑えるための静菌剤を含有してもよい。静菌剤は患者によっては禁忌であり得る。したがって、凍結乾燥製剤は、そのような成分を含有するか含有しない溶液中に再構成することができる。凍結防止剤としての糖類（ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびズルシトールなどのポリヒドロキシ炭化水素および／またはスクロース、ラクトース、マルトースまたはトレハロースなどの二糖類を含むが必ずしもこれらに限定されない）、および場合によっては関連塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＬｉＣｌを含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない追加の成分を緩衝化された液体または固体抗体製剤に加えてもよい。そのような抗体製剤、特に長期保存が予定された液体製剤は、非経口注射にも製剤を有用にしながら、２～８℃またはそれ以上の温度で長期安定性を促進するために有用な範囲の総モル浸透圧濃度に依存する。例えば、必ずしもそうとは限らないが、総モル浸透圧濃度（溶液中の分子の総数）の有効範囲は、約２００ｍＯｓ／Ｌ～約８００ｍＯｓ／Ｌであり得る。溶液の総モル浸透圧濃度を適切な範囲内に維持するために、スクロースまたはソルビトールなどの凍結防止剤の量が製剤中の塩の量に応じて決まることは明らかであろう。したがって、塩を含まない製剤は、必ずしもそうとは限らないが、約５％～約２５％のスクロースを含有し得る。
【0058】
あるいは、塩を含まないソルビトールベースの製剤は、必ずしもそうとは限らないが、約３％～約１２％の範囲内でソルビトールを含有し得る。塩を含まない製剤は、有効なモル浸透圧濃度レベルを維持するために、それぞれの凍結防止剤の範囲を増加させることを必要とし得る。これらの製剤はまた、二価カチオン（ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を含むが必ずしもこれらに限定されない）および非３２イオン性界面活性剤（ｎｏｎ－３２ ｉｏｎｉｃ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（例えば必ずしも限定するものではないがポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））、ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ６０（登録商標））、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０（登録商標））およびポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えば限定するものではないがＢｒｉｊ５８（登録商標）、Ｂｒｉｊ３５（登録商標）、ならびにその他、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １１４（登録商標）、ＮＰ４０（登録商標）、Ｓｐａｎ８５および非イオン性界面活性剤のＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズ（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２１））を含有してもよい。静菌剤の考えられる封入を含む、そのような成分の任意の組合せは、本発明の抗体含有製剤を充填するのに有用であり得る。本発明の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分はまた、通常は免疫グロブリン分子の一部ではない追加の化学的部分（例えば、ペグ化）を含有する抗体を表す「化学的誘導体」であり得る。そのような部分は、塩基分子の溶解度、半減期、吸収などを改善し得る。あるいは、これらの部分は、塩基分子の望ましくない副作用を減弱させ得るか、塩基分子の毒性を低下させ得る。
【0059】
インビボ治療のために、本発明の少なくとも１つの抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合部分を含む医薬製剤を患者に投与または提供する。インビボ療法に使用される場合、本発明の抗ＨＩＶ抗体またはその抗原結合部分は、治療有効量（すなわち、下記の実施例１に記載されるように総ウイルス量を排除または減少させる量）で患者に投与される。抗体は、公知の方法、例えば、静脈内投与に従い、例えば、ボーラスとしてか長期にわたる連続注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、経口、局所または吸入経路により、ヒト患者に投与される。抗体またはその抗原結合部分は、可能であれば、標的細胞部位に非経口的に投与するか、静脈内に投与することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、静脈内または皮下投与によって投与される。本発明の治療用組成物は、全身的に、非経口的に、または局所的に患者または対象に投与され得る。疾患に対する治療および改善の成功を評価するための上記のパラメータは、医師によく知られている日常的な手順によって容易に測定可能である。
【0060】
非経口投与の場合、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、薬学的に許容される非経口ビヒクルと組み合わせて、単位用量の注射可能形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化されてもよい。そのようなビヒクルの例には、限定するものではないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。非水性ビヒクルには、限定するものではないが、不揮発性油およびオレイン酸エチルが挙げられる。担体としてリポソームを使用することができる。ビヒクルは、少量の添加剤、例えば、等張性および化学安定性を増強する物質、例えば緩衝剤および保存剤などを含有してもよい。
【0061】
本発明の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、ＨＩＶ－１に対する治療的処置を提供するのに十分な量で、当技術分野で利用可能な任意の方法、戦略および／または組合せで宿主に投与され得る。これらの組成物は、当技術分野で公知の様々な経路、特に、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）投与などの非経口経路を含むがこれらに限定されない非経口経路により個体に提供されてもよく、治療用抗体投与に関する当技術分野ではＩＶ投与が標準である。これらの組成物は、分割または複数回用量として投与されてもよい（すなわち、治療レジームを通して製剤の滅菌状態を維持することによる時間差での抗体の投与）。
【0062】
用量および投与量レジメンは、医師により容易に決定される様々な要素、例えば感染の性質、例えば、その治療指数、患者、および患者の病歴に応じて決まる。一般に、治療有効量の抗体が患者に投与される。いくつかの実施形態では、投与される抗体の量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲内、およびその間の任意の範囲内である。感染の種類および重症度に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約０．１～１５ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体が、例えば、１回以上の分割投与によるか、持続注入による患者への投与のための初期候補投与量である。抗ＨＩＶ－１抗体は、製剤が放出される部位の近くの組織の障害または外傷を最小限に抑えるために、比較的低い容量速度、例えば、必ずしもそうとは限らないが、約０．００１ｍｌ／日～１０ｍｌ／日の容量速度で送達することができる。特定の生物学的製剤に応じて、低用量、例えば、約０．０１μｇ／時または０．１μｇ／時、０．２５μｇ／時、１μｇ／時、一般に最大約２００μｇ／時の速度で製剤が放出され得るか、例えば、約０．００１ｍＬ／日～約１ｍＬ／日の容量速度、例えば、１日当たり０．０１マイクログラムから１日当たり約２０ミリグラムまでの低容量速度で製剤が送達される。投与量は、使用される活性成分（例えば、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分）の効力、バイオアベイラビリティおよび毒性などのいくつかの要因、および対象の要件に応じて決まる。この療法の進行は、従来の方法およびアッセイにより、また医師または他の当業者に公知の基準に基づき、容易に監視される。疾患に対する治療および改善の成功を評価するための上記のパラメータは、医師によく知られている日常的な手順によって容易に測定可能である。
【0063】
本発明の抗ＨＩＶ－１抗体用の送達ビヒクルの具体的な実施形態は、本明細書中で考察され、当技術分野でさらに公知であるようなＰＬＧＡマイクロスフェア、ならびにポリ（エチレン－コ－酢酸ビニル；ＰＥＶＡｃ）を含むポリマーベースの非分解性ビヒクルを含む。さらに、抗体ベースの治療用製品の制御放出および局所送達が、Ｇｒａｉｎｇｅｒら、２００４， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４（７）：１０２９－１０４４）に概説されている。抗体をカプセル化することができる好適なマイクロカプセルにはまた、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメチルメタクリレートマイクロカプセルが挙げられ得る。タンパク質がＰＬＧＡマイクロスフェアに封入されている「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＩＧＦ－１ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」と題されたＰＣＴ公開の国際公開第９９／２４０６１号パンフレットを参照されたい。この参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、マイクロエマルジョンまたはコロイド状薬物送達システム、例えばリポソームおよびアルブミンマイクロスフェアもまた使用され得る。他の好ましい徐放性組成物は、抗体を投与部位に保持するために生体接着剤を使用する。上記のように、徐放性製剤は、その中に抗体が配置される生分解性ポリマーを含み得、これにより、非即時放出がもたらされ得る。非注射用デバイスは、「インプラント」、「薬物デポーインプラント」、「デポーインプラント」、「非注射用デポー」またはそのようないくつかの類似用語として本明細書に記載され得る。一般的なデポーインプラントには、限定するものではないが、固体の生分解性および非生分解性ポリマーデバイス（延伸ポリマーまたは同軸ロッド状デバイスなど）、ならびに同様に当技術分野で公知の多数のポンプシステムが挙げられ得る。注射用デバイスは、ボーラス注射（注射後の薬物の放出および散逸）と、貯蔵リザーバーを注射部位に提供する貯蔵またはデポー注射とに分けられ、生物学的製剤の経時的な徐放を可能にする。抗体の経時的な長時間放出のための適切なリザーバーを提供するために、デポーインプラントが送達部位に外科的に繋留されてもよい。そのようなデバイスは、予め選択された期間にわたって治療のために治療的または予防的に必要とされるような量で薬物製剤を運搬することができる。デポーインプラントはまた、治療期間中の体内プロセス（プロテアーゼなど）による分解から製剤を保護し得る。当技術分野で知られているように、用語「徐放」は、長期間にわたるブロックポリマーマトリックスからのそのような薬剤のゆるやかな（連続的または不連続的）放出を指す。特定のデバイスとは無関係に、組成物の徐放は、抗体の局所的な生物学的有効濃度をもたらす。生物学的製剤の徐放は、製剤に応じて、１日、数日、１週以上の期間にわたるが、１カ月以上、または最大で約６カ月にわたる可能性が最も高い。当技術分野で公知の天然または合成ポリマーは、用途の広い分解動態、安全性、および生体適合性などの特性により、デポーインプラントとして有用であろう。これらのコポリマーは、活性成分の薬物動態を改良し、薬剤を酵素攻撃から保護するとともに、付着または注射の部位で経時的に分解するように操作することができる。当業者であれば、それぞれの製造方法、用いられる触媒、および徐放性デポーインプラントまたはデポー注射の最終分子量を含めて、これらのコポリマーの特性を操作するために、当技術分野には十分な教示があることを理解するであろう。天然ポリマーには、限定するものではないが、タンパク質（例えば、コラーゲン、アルブミンまたはゼラチン）、多糖類（セルロース、デンプン、アルジネート、キチン、キトサン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒアルロン酸）および脂質が挙げられる。生分解性合成ポリマーには、限定するものではないが、様々なポリエステル、Ｌ－グルタミン酸とガンマエチル－Ｌ－グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７－５５６）、ポリラクチド（［ＰＬＡ］；米国特許第３，７７３，９１９号明細書および欧州特許第０５８，４８１号明細書）、ポリ乳酸ポリグリコレート（ＰＬＧＡ）、例えば、上記のように、ポリラクチド－コ－グリコリド（例えば、米国特許第４，７６７，６２８号明細書および米国特許第５，６５４，００８号明細書参照）、ポリグリコリド（ＰＧ）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート、ポリオルトエステル、ポリアスピリン、ポリホスファゲン、ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ＰＶＡ－ｇ－ＰＬＧＡ、ＰＥＧＴ－ＰＢＴコポリマー（ポリアクティブ）、メタクリレート、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＡＡコポリマー、ＰＬＧＡ－ＰＥＯ－ＰＬＧＡ、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）またはそれらの任意の組合せ（例えば、米国特許第６，９９１，６５４号明細書および米国特許出願第２００５０１８７６３１号明細書参照（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７：Ｌａｎｇｅｒ、１９８２、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５参照、非分解性エチレン－酢酸ビニル（例えば、エチレン酢酸ビニルディスクおよびポリ（エチレン－コ－酢酸ビニル））、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えば、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）、ポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号明細書）、ヒアルロン酸ゲル（例えば、米国特許第４，６３６，５２４号明細書参照）、アルギン酸懸濁液、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）などが挙げられ得る。ポリラクチド（ＰＬＡ）およびグリコリドとのそのコポリマー（ＰＬＧＡ）は、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）の商品化がＰＬＡポリマーを利用する最初の非経口徐放性製剤として１９８９年に認可されたことから、当技術分野で周知である。活性成分の徐放を達成するための賦形剤としてＰＬＡおよびＰＬＧＡを利用する製品の追加の例には、Ａｍｉｄｏｘ（ＰＬＡ；歯周病）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ Ｄｅｐｏｔ（ＰＬＧＡ；ｈＧＨを伴う）およびＴｒｅｌｓｔａｒ Ｄｅｐｏｔ（ＰＬＧＡ；前立腺癌）が挙げられる。他の合成ポリマーには、限定するものではないが、ポリ（ｃ－カプロラクトン）、ポリ３－ヒドロキシ酪酸、ポリ（β－リンゴ酸）およびポリ（ジオキサノン）］；ポリ無水物、ポリウレタン（国際公開第２００５／０１３９３６号パンフレット参照）、ポリアミド、シクロデキストラン、ポリオルトエステル、ｎ－ビニルアルコール、ポリエチレンオキシド／ポリエチレンテレフタレート、ポリホスフェート、ポリホスホネート、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレート、ポリエチレングリコール、ポリジヒドロピランおよびポリアセタールが挙げられた。非生分解性デバイスには、限定するものではないが、様々なセルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースアセテートプロピオネート、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）シリコンベースのインプラント（ポリジメチルシロキサン）、アクリルポリマー、（ポリメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシ（エチルメチルアクリレート）、ならびにポリエチレン－コ－（酢酸ビニル）、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、ポロキサミン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル、ポリエチレン－クロロトリフルオロエチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたは「テフロン（商標）」）、スチレンブタジエンゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフェニレンオキシド－ポリスチレン、ポリ－ａ－クロロ－ｐ－キシレン、ポリメチルペンテン、ポリスルホンおよび他の関連する生物学的に安定なポリマーが挙げられる。徐放性デポー製剤に適した担体には、限定するものではないが、マイクロスフェア、フィルム、カプセル、粒子、ゲル、コーティング、マトリックス、ウェーハ、丸剤または他の医薬送達組成物が挙げられる。そのような徐放性製剤の例は上に記載されている。米国特許第６，９５３，５９３号明細書、米国特許第６，９４６，１４６号明細書、米国特許第６，６５６，５０８号明細書、米国特許第６，５４１，０３３号明細書および米国特許第６，４５１，３４６号明細書もまた参照されたい。これらの各内容は参照により本明細書に組み込まれる。剤形は、予め選択された期間にわたって治療のために治療的に必要とされるような量および濃度で薬物製剤を運搬することができなければならず、治療期間中の体内プロセスによる分解から製剤を十分に保護しなければならない。例えば、剤形は、代謝過程からの分解、および漏出、クラッキング、破損または歪みなどのリスクに対して保護するための特性を有する材料から製造された外面によって囲まれ得る。これは、例えば、対象による正常な関節およびその他の運動の結果として、薬物放出デバイス上、または例えば対流性薬物送達デバイス内に及ぼされる物理的力、リザーバー内で生成される圧力に関連した物理的力のために、使用中に受けるであろうストレス下での制御されない様式での剤形内容物の排出を阻止することができる。薬物リザーバーまたは薬物を保持もしくは含有するための他の手段はまた、活性剤製剤との意図されない反応を回避するような材料でなければならず、好ましくは生体適合性である（例えば、剤形が移植される場合、対象の身体または体液に対して実質的に非反応性である）。一般に、抗ＨＩＶ－１抗体は、少なくとも１２時間から少なくとも１週間にわたり個体に投与され、必要に応じて、少なくとも１０、２０、３０、１００日または少なくとも４カ月もしくは少なくとも６カ月、１２カ月、２４カ月以上にわたって薬物を送達するように設計されたインプラントを介する可能性が最も高い。
【0064】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、ＨＩＶ－１のための１つ以上の追加の治療剤と同時投与され得、例えば、１つ以上のＨＩＶ剤（例えば、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、融合阻害剤、ＣＣＲ５アンタゴニスト／エントリー阻害剤、インテグラーゼ鎖転移阻害剤（ＩＮＳＴＩ）およびそれらの組合せ）、および／または本発明の追加の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含むがこれらに限定されない追加の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分と同時投与され得る。下記の実施例１に示すように、ＮＣ１７、ＢＧ１およびＢＧ１８の１：１：１投与は、インビボでウイルス量を減少させるのに有効であった。理論に縛られることを望むものではないが、データはモノクローナルｂＮＡｂおよび非常に低レベルの中和感受性ウイルスがＥＢ３５４に共存することを示し、これは抗体がこの個体のエリートコントロールに寄与することを示唆する。別の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの本発明の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分と薬学的に許容される担体とを含有する受動ワクチンまたは医薬組成物を提供する。一実施形態によれば、ワクチンまたは医薬組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つの抗体と薬学的に許容される賦形剤とを含有する組成物である。ワクチンは、本明細書に記載の特性を有する複数の抗体を任意の組合せで含むことができ、他の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分をさらに含むことができる。受動ワクチンは、当技術分野で公知の１つ以上の薬学的に許容される保存剤、担体および／または賦形剤を含み得る。他の実施形態では、本発明は、ＨＩＶ－１またはその抗原性断片を含有する活性ワクチンまたは医薬組成物を提供する。ＨＩＶ－１を使用する場合、これは弱毒化され得る。ＨＩＶ－１は加熱殺菌され得る。抗原性断片が利用される場合、必須ではないが糖タンパク質ｇｐ１２０を使用することが好ましい場合があるが、糖タンパク質ｇｐ１２０の断片は許容され得る。
【0065】
本組成物は、動物を免疫するための免疫原性組成物に使用され得る。本発明によるそのような免疫原性組成物は、ワクチンの調製に使用され得る。好ましくは、予防用および／または治療用ワクチンが製造される。したがって、本発明の範囲内には、上記のように薬学的に許容される担体および有効量の抗原を含有する免疫原性またはワクチン組成物がある。組成物に使用される担体は、投与方法および投与経路、ならびに標準的な薬務に基づいて選択することができる。組成物はアジュバントも含有することができる。アジュバントの例には、コレラ毒素、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、リポソーム、非メチル化ＤＮＡ（ＣｐＧ）または任意の他の先天性免疫刺激複合体が挙げられる。免疫学的応答をさらに高めるために使用することができる様々なアジュバントは、宿主種に応じて決まり、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールを含む。
【0066】
ワクチン製剤は、それ自体で、または医薬組成物もしくは治療用組成物の形態で対象に投与され得る。本発明の組成物、およびアジュバントは、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、水簸、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって製造され得る。医薬組成物は、本発明の抗原を薬学的に使用可能な調製物に加工するのを容易にする１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または助剤を使用して従来の方法で製剤化され得る。適切な製剤は選択された投与経路に応じて決まる。
【0067】
注射では、ワクチン調製物は、水溶液中、好ましくはハンクス液、リンゲル液、リン酸緩衝食塩水または任意の他の生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化され得る。溶液は、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含有し得る。あるいは、組成物は、使用前に好適なビヒクル、例えば、無菌パイロジェンフリー水を用いて構成するための粉末形態であり得る。
【0068】
投与される組成物の量は、当業者によって決定され得るように、例えば、組成物中の特定の抗原、アジュバントが抗原と同時投与されるかどうか、同時投与されるアジュバントの種類、投与の様式および頻度、ならびに所望の効果（例えば、保護または治療）に応じて決まる。投与のためのワクチン製剤の有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。有効量は、最初にインビトロアッセイから推定することができる。例えば、当技術分野で周知の技術を用いて動物モデルに対してある用量を処方して、免疫応答の誘導を達成することができる。当業者であれば、本明細書に記載の結果に基づいて、あらゆる動物種に対する投与を容易に最適化することができよう。投与量および間隔は個々に調整されてもよい。例えば、ワクチンとして使用される場合、本発明のワクチン製剤は、１～３６週間にわたり約１～３用量で投与されてもよい。ワクチン接種は、状況によっては、特に受動的ワクチン接種の場合、無期限に継続する場合がある。好ましくは、１または２用量を約３週間から約４カ月の間隔で投与し、その後にブースターワクチン接種を定期的に行ってもよい。個々の動物には代替のプロトコルが適切である場合がある。好適な用量は、上記のように投与された場合、少なくとも４～１２カ月間感染から動物を保護するのに十分な、免疫化動物の免疫応答を上昇させることができるワクチン製剤の量である。一般に、用量中に存在する抗原の量は、宿主１ｋｇ当たり約１ｐｇ～約１００ｍｇ、典型的には約１０ｐｇ～約１ｍｇ、好ましくは約１００ｐｇ～約１ｐｇの範囲である。好適な用量範囲は注射経路および対象の大きさによって変わるが、典型的には約０．１ｍＬ～約５ｍＬの範囲である。必要に応じて追加のブースターを投与することができる。
【0069】
Ｄ．キットおよび診断方法
本発明の一実施形態は、試料中に存在するＨＩＶ－１を検出するためのキットに関する。これらのキットは、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分および様々な試薬、例えば、抗ＨＩＶ－１抗体とＨＩＶ－１上に存在するエピトープ、例えばｇｐ１２０および／またはｇｐ１４０、またはそれらの抗原性断片との間の結合の検出を助ける試薬を含み得る。
本発明の一実施形態は、試料中に存在するＨＩＶ－１を検出するためのキットに関する。これらのキットは、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分および様々な試薬、例えば、抗ＨＩＶ－１抗体とＨＩＶ－１上に存在するエピトープ、例えばｇｐ１２０および／またはｇｐ１４０、またはそれらの抗原性断片との間の結合の検出を助ける試薬を含み得る。
【0070】
キットは、イムノアッセイなどのインビトロアッセイ、例えば、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポット）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光法、およびウエスタンブロット分析および／または免疫沈降法を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の他のアッセイであり得る。インビトロアッセイは、競合的であり得るか、サンドイッチアッセイにおけるように間接的であり得るか、抗体捕捉方法であり得る。例えば、直接ＥＬＩＳＡでは、抗原の緩衝溶液、例えば、ＨＩＶ－１もしくはその抗原性断片を含有する試料、またはＨＩＶ－１を含有するか含有すると疑われる生体試料をマイクロタイタープレート、例えば、９６ウェルプレートのウェルに加える。次いで、未反応のタンパク質の溶液、例えば、ウシ血清アルブミンまたはカゼインをウェルに加える。他の一般的な酵素はアルカリホスファターゼまたはβ－Ｄ－ガラクトシダーゼを含むが、他の酵素も考えられ、本発明によって具体化されると解釈されるように、レポーター分子酵素にコンジュゲートした、例えば、必ずしも酵素ではないが西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を加える。次いで、酵素用の基質を加え、これにより検出可能なシグナルをもたらす。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼにＴＭＢを加えると着色生成物が得られ、その場合ＥＬＩＳＡは比色アッセイである。ＥＬＩＳＡは、定性的または定量的なフォーマットで操作され得る。定性的結果は、試料について単純な陽または陰の結果（有または無）を提供する。陽と陰との間のカットオフは分析者によって決定され、統計的であってよい。サンドイッチＥＬＩＳＡは一般に以下のプロトコルに従う。基質、例えばマイクロタイタープレート上に、捕捉抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を結合させる（すなわち、「固定化する」）。次いで、抗原含有試料（すなわち、ＨＩＶ－１またはその抗原性断片を含有する試料を基質に加え、その時点で抗原含有試料が抗ＨＩＶ－１抗体によって捕捉される。その後、基質を洗浄して未結合抗原を除去する。ｇｐ１２０上の異なるエピトープなどのＨＩＶ－１上の異なるエピトープ、またはｇｐ１４０などの異なる抗原上の異なるエピトープに結合する第２の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を加える。第２の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、レポーター分子、例えば酵素に結合するが、レポーター分子は検出可能なシグナルをもたらす任意の分子であり得る。プレートは２回洗浄してもよく、レポーター分子が酵素である場合は、検出可能なシグナルをもたらすＴＭＢなどの基質を加えてもよい（同様に比色アッセイ）。第３の種類の一般的なＥＬＩＳＡは競合ＥＬＩＳＡである。これらの実施形態では、抗原含有試料の存在下で、未標識の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分をインキュベートし、次いでこれを抗原被覆ウェルに加える。プレートを洗浄して未結合抗体を除去する。一次抗体に特異的な二次抗体、例えば、抗ＨＩＶ－１抗体に特異的な二次抗体。二次抗体は、本明細書に記載されるように、酵素（または検出可能なシグナルをもたらし得る任意の他の分子）などのレポーター分子に結合する。一部の競合ＥＬＩＳＡは、標識抗体ではなく標識抗原を利用する。試料中の抗原が少なければ少ないほど、さらに多くの標識抗原が保持され、さらに強力な検出可能なシグナルが生じる。
【0071】
他の形態の一般的なインビトロアッセイには、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。典型的には、既知量の抗原が放射性トレーサー、例えばＩ－１２５に結合するが、９９Ｔｃなどの他のものが使用に適しており、次いでそれを抗原に特異的な既知量の抗体、例えば、抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分と混合する。次いで、未知量の抗原を含有する試料（例えば、ＨＩＶ－１またはその抗原性断片を含有するか含有すると疑われる生体試料）を加える。これは、特異的な結合に対する直接的な競合である。未標識抗原の濃度が増加するにつれて、抗ＨＩＶ－１抗体と標識標準との間の結合は減少し、放射能を測定することによってこれを直接測定することができる。他のアッセイが公知であり、当業者であればそれらの適用性を容易に認識するであろう。
【0072】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中のＨＩＶ－１またはその抗原性断片を検出する方法に関する。そのような方法は、本明細書に記載されるアッセイのいずれか、または当技術分野で公知の他のアッセイを利用し得る。本明細書に記載のアッセイのいくつかは、試料中に存在する抗原の量を定量することができ、したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、試料中、例えば生体試料中に存在するＨＩＶ－１またはその抗原性断片の量を定量する方法に関する。
【0073】
本発明の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含有するアッセイは、診断目的に利用してもしなくてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分の診断的使用方法に関する。本発明の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分の特異性のために、本発明の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含むイムノアッセイは、ＨＩＶ－１の活性感染または潜伏感染を有すると個体を診断するのに十分であり得る。使用される抗体またはその抗原結合部分がＨＩＶ－１に特異的である限り、抗体またはその抗原結合部分はいかなる特定のエピトープにも限定される必要はない。例えば、サンドイッチアッセイでは、第１の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は、ｇｐ１２０上などの第１のエピトープに結合し得、（レポーター分子に結合する）第２の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分は第２のエピトープに結合し得、これらは同じ抗原上に存在してもしなくてもよい。したがって、ＨＩＶ－１またはその抗原性断片の量を検出または定量するために使用されるキットおよび方法は、それらの抗原結合部分を含むＢＧ１８、ＮＣ３７およびＢＧ１を含有し得、本発明の範囲内であると考えられる。または、それらがそのようなキット／方法への組み込みに適している限り、それらの抗原結合部分を含むＢＧ１８、ＮＣ３７およびＢＧ１のいずれか、ならびに他の任意の抗ＨＩＶ－１抗体。試料中に存在するＨＩＶ－１を検出および／または定量する目的で、または診断目的であっても、そのような目的のための有用性を有するために、使用される抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分がＨＩＶ－１を広域に中和することができる必要は必ずしもないことが理解される。
【0074】
Ｅ．均等物
範囲の値が提供される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間にある介在値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在値のそれぞれが、本発明内に包含されると理解される。これらの小さい方の範囲の上限および下限は、独立して小さい方の範囲に含まれ得、同様に本発明内に包含され、記載された範囲内の任意の具体的に除外される限界に従属する。記載された範囲が限界のうち一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界の両方を除く範囲も本発明に含まれる。
範囲の値が提供される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間にある介在値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在値のそれぞれが、本発明内に包含されると理解される。これらの小さい方の範囲の上限および下限は、独立して小さい方の範囲に含まれ得、同様に本発明内に包含され、記載された範囲内の任意の具体的に除外される限界に従属する。記載された範囲が限界のうち一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界の両方を除く範囲も本発明に含まれる。
【0075】
別途定義しない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料も本発明の実施および試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書で言及されるあらゆる刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0076】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の参照対象を含む。
【0077】
用語「約」は、ベースライン値と実質的に異なると当業者によって解釈されないであろう値の範囲を指す。例えば、用語「約」は、記載された値の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以内の値、ならびにそのような記載された値の間に介在する値を指し得る。
【0078】
本明細書に開示された刊行物は、本発明の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書中のいかなるものも、先行発明によるそのような刊行物に本発明が先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行日は実際の刊行日とは異なることがあり、実際の刊行日は独立して確認する必要があることがある。
【0079】
本明細書に引用された各出願および特許、ならびに各出願および特許に引用された各文献または参考文献、特許または非特許文献（発行された各特許の審査中を含む；「出願引用文献」）、およびこれらの出願および特許のいずれかに対応するおよび／またはそれらから優先権を主張するＰＣＴおよび外国出願または特許の各々、および各出願引用文献内で引用または参照された各文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる。さらに一般的には、文献または参考文献は、特許請求の範囲の前の参考文献一覧または文献自体のいずれかで本文に引用されており、これらの文献または参考文献（「本明細書中に引用された参考文献」）の各々、ならびに本明細書中に引用された参考文献の各々に引用された各文献または参考文献（任意の製造業者の仕様書、指示書などを含む）は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0080】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明するのに役立つ。
【0081】
ＶＩＩ．実施例
１．ウイルス血症コントローラー（Ｖｉｒｅｍｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）に見られる強力なＨＩＶ－１広域中和抗体および抗体感受性ウイルスの共存
Ａ．方法
ＨＩＶ－１感染者ＥＢ３５４
ＨＩＶ－１感染長期非進行者３９４例のコホート内で、中和の広域性および効力について上位１％に入ったドナーＥＢ３５４から得られたＩｇＧを精製した。ドナーＥＢ３５４は１９８６年にＨＩＶ－１クレードＢと診断された。ドナーＥＢ３５４は１９９５年から１９９８年の間にジダノシンおよびスタブジンによる治療を受けたが、それ以来抗レトロウイルス療法は受けていない。ドナーＥＢ３５４は、２００２年以降臨床的に頻繁に追跡されてきた（表３：ＨＬＡ Ａ＊０１：０１、２４：０２、Ｂ＊２７：０５、５７：０１、Ｃ＊０１：０２、０６：０２）。ほとんどの個体では、感染直後に株特異的抗体が急速に発現する。この応答は、場合によってはｂＮＡｂを誘発する耐性ウイルス変異体の選択と関連している。ただし、ｂＮＡｂの発現が、共存するｂＮＡｂに対して耐性である自己由来のプラズマウイルスの迅速な選択と関連しているという点で、詳細に試験された個体とＥＢ３５４とは異なる。感受性かつ耐性のウイルス株がｂＮＡｂと共存しているためＥＢ３５４は重要であり、耐性株は、何らかの方法で部分的にしか有効でないか、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって抑制されているため、高レベルのウイルス血症を引き起こすことができない。したがって、ｂＮＡｂ感受性プラズマウイルスはこの個体の免疫圧力を逃れられず、ウイルスが持続するｂＮＡｂ：ウイルスの平衡状態をもたらすが、高レベルのウイルス血症を引き起こすことはできない。ＥＢ３５４は、エリートコントローラーおよびエリートニュートラライザーの両方であるという点で独特である。ＨＩＶ－１エリートコントローラーとは、長年にわたってウイルス量を低く維持する感染者である。これらの個体はウイルスを伝播する可能性が低く、ＡＩＤＳを発症せず長期間生存を維持する。ＨＩＶ－１エリートコントローラーの８５％には、ＨＬＡ対立遺伝子Ｂ５７＊０１および／またはＢ２７＊０５が見られる。これらの対立遺伝子は、ＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害活性の増強と関連している。ウイルス血症進行者（すなわち、高いウイルス量を有する患者）と比較して、エリートコントローラーはｂＮＡｂを発現する可能性が低い。ＥＢ３５４では、感染を部分的に制御している可能性がある堅牢なＣＤ８＋Ｔ細胞応答に関係なく、ｂＮＡｂの発現および親和性成熟を補助するのに十分なＨＩＶ－１複製が見られた。本明細書中で考察されるように、ドナーＥＢ３５４の血清学的中和活性を説明するｂＮＡｂは、いくつかの重複しないエピトープを認識する。
１．ウイルス血症コントローラー（Ｖｉｒｅｍｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）に見られる強力なＨＩＶ－１広域中和抗体および抗体感受性ウイルスの共存
Ａ．方法
ＨＩＶ－１感染者ＥＢ３５４
ＨＩＶ－１感染長期非進行者３９４例のコホート内で、中和の広域性および効力について上位１％に入ったドナーＥＢ３５４から得られたＩｇＧを精製した。ドナーＥＢ３５４は１９８６年にＨＩＶ－１クレードＢと診断された。ドナーＥＢ３５４は１９９５年から１９９８年の間にジダノシンおよびスタブジンによる治療を受けたが、それ以来抗レトロウイルス療法は受けていない。ドナーＥＢ３５４は、２００２年以降臨床的に頻繁に追跡されてきた（表３：ＨＬＡ Ａ＊０１：０１、２４：０２、Ｂ＊２７：０５、５７：０１、Ｃ＊０１：０２、０６：０２）。ほとんどの個体では、感染直後に株特異的抗体が急速に発現する。この応答は、場合によってはｂＮＡｂを誘発する耐性ウイルス変異体の選択と関連している。ただし、ｂＮＡｂの発現が、共存するｂＮＡｂに対して耐性である自己由来のプラズマウイルスの迅速な選択と関連しているという点で、詳細に試験された個体とＥＢ３５４とは異なる。感受性かつ耐性のウイルス株がｂＮＡｂと共存しているためＥＢ３５４は重要であり、耐性株は、何らかの方法で部分的にしか有効でないか、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって抑制されているため、高レベルのウイルス血症を引き起こすことができない。したがって、ｂＮＡｂ感受性プラズマウイルスはこの個体の免疫圧力を逃れられず、ウイルスが持続するｂＮＡｂ：ウイルスの平衡状態をもたらすが、高レベルのウイルス血症を引き起こすことはできない。ＥＢ３５４は、エリートコントローラーおよびエリートニュートラライザーの両方であるという点で独特である。ＨＩＶ－１エリートコントローラーとは、長年にわたってウイルス量を低く維持する感染者である。これらの個体はウイルスを伝播する可能性が低く、ＡＩＤＳを発症せず長期間生存を維持する。ＨＩＶ－１エリートコントローラーの８５％には、ＨＬＡ対立遺伝子Ｂ５７＊０１および／またはＢ２７＊０５が見られる。これらの対立遺伝子は、ＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害活性の増強と関連している。ウイルス血症進行者（すなわち、高いウイルス量を有する患者）と比較して、エリートコントローラーはｂＮＡｂを発現する可能性が低い。ＥＢ３５４では、感染を部分的に制御している可能性がある堅牢なＣＤ８＋Ｔ細胞応答に関係なく、ｂＮＡｂの発現および親和性成熟を補助するのに十分なＨＩＶ－１複製が見られた。本明細書中で考察されるように、ドナーＥＢ３５４の血清学的中和活性を説明するｂＮＡｂは、いくつかの重複しないエピトープを認識する。
【0082】
【表3】
【0083】
Ｂ細胞選別および抗体単離
Ｊ．Ｆ．Ｓｃｈｅｉｄら、Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ ｇｐ１４０ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ３４３， ６５－６７（２００９）に記載されているように、ドナーＥＢ３５４ ＰＢＭＣ由来のベイト＋ＣＤ１９＋ＩｇＧ＋Ｂ細胞の単一細胞選別を行った。抗ＣＤ１９磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）を用いてメモリーＢ細胞を予め濃縮し、以下の４種類のベイトを用いて染色した：ベイトとしてのｇｐ１２０ ２ＣＣコアタンパク質、ｇｐ１４０ＹＵ２、ｇｐ１４０９２ＵＧ３７．８（クレードＡ）＋ｇｐ１４０ＣＺＡ７９０１２（クレードＣ）の１：１混合物およびＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４。レスキュープライマーを使用して重鎖およびＩｇλ遺伝子の両方を増幅し、通常のプライマーをＩｇＫ鎖に使用した。ＰＣＲ産物をいずれも配列決定し、Ｉｇ遺伝子使用、ＣＤＲ３、およびＶＨ／ＶＬ体細胞超変異の数（ＩｇＢＬＡＳＴおよびＩＭＧＴ）について分析した。Ｔ．Ｔｉｌｌｅｒら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９， １１２－１２４（２００８）に以前に記載されているように、精製し消化したＰＣＲ産物をヒトＩｇγ１、ＩｇκまたはＩｇλ発現ベクターにクローニングし、Ｆ．Ｋｌｅｉｎら、Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＨＩＶ－１ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ａｒｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔ ｖｉｒｕｓ ｅｓｃａｐｅ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１１， ２３６１－２３７２（２０１４）に記載されているように、指数関数的に増殖するＨＥＫ ２９３－６Ｅ細胞へのＩｇＨ、ＩｇＫおよびＩｇＬ発現プラスミドの一過性トランスフェクションによって作製した。
Ｊ．Ｆ．Ｓｃｈｅｉｄら、Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ ｇｐ１４０ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ３４３， ６５－６７（２００９）に記載されているように、ドナーＥＢ３５４ ＰＢＭＣ由来のベイト＋ＣＤ１９＋ＩｇＧ＋Ｂ細胞の単一細胞選別を行った。抗ＣＤ１９磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）を用いてメモリーＢ細胞を予め濃縮し、以下の４種類のベイトを用いて染色した：ベイトとしてのｇｐ１２０ ２ＣＣコアタンパク質、ｇｐ１４０ＹＵ２、ｇｐ１４０９２ＵＧ３７．８（クレードＡ）＋ｇｐ１４０ＣＺＡ７９０１２（クレードＣ）の１：１混合物およびＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４。レスキュープライマーを使用して重鎖およびＩｇλ遺伝子の両方を増幅し、通常のプライマーをＩｇＫ鎖に使用した。ＰＣＲ産物をいずれも配列決定し、Ｉｇ遺伝子使用、ＣＤＲ３、およびＶＨ／ＶＬ体細胞超変異の数（ＩｇＢＬＡＳＴおよびＩＭＧＴ）について分析した。Ｔ．Ｔｉｌｌｅｒら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９， １１２－１２４（２００８）に以前に記載されているように、精製し消化したＰＣＲ産物をヒトＩｇγ１、ＩｇκまたはＩｇλ発現ベクターにクローニングし、Ｆ．Ｋｌｅｉｎら、Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＨＩＶ－１ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ａｒｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔ ｖｉｒｕｓ ｅｓｃａｐｅ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１１， ２３６１－２３７２（２０１４）に記載されているように、指数関数的に増殖するＨＥＫ ２９３－６Ｅ細胞へのＩｇＨ、ＩｇＫおよびＩｇＬ発現プラスミドの一過性トランスフェクションによって作製した。
【0084】
中和試験
ルシフェラーゼベースのＴＺＭ．ｂｌ細胞アッセイを用いて、ＨＩＶ－１中和を評価した。要約すると、エンベロープシュードウイルスを単一抗体の５倍連続希釈物とともにインキュベートし、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を保有するＴＺＭ．ｂｌ細胞に適用した。４８時間後、細胞を溶解し、発光を測定した。ＩＣ５０およびＩＣ８０は、相対発光単位（ＲＬＵ）をそれぞれ５０％および８０％減少させる単一抗体濃度を反映する。抗体データベース計算ツールを使用して、範囲曲線を構築した。
ルシフェラーゼベースのＴＺＭ．ｂｌ細胞アッセイを用いて、ＨＩＶ－１中和を評価した。要約すると、エンベロープシュードウイルスを単一抗体の５倍連続希釈物とともにインキュベートし、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を保有するＴＺＭ．ｂｌ細胞に適用した。４８時間後、細胞を溶解し、発光を測定した。ＩＣ５０およびＩＣ８０は、相対発光単位（ＲＬＵ）をそれぞれ５０％および８０％減少させる単一抗体濃度を反映する。抗体データベース計算ツールを使用して、範囲曲線を構築した。
【0085】
結晶化、Ｘ線データ収集および構造決定
Ａｓｎ２６ＨＣをＧｌｎに変異させることによって重鎖位置２６にある潜在的なＮ結合型グリコシル化部位が除去されたＢＧ１８ Ｆａｂの結晶が、野生型ＢＧ１８ Ｆａｂの結晶と比較して優れたサイズおよび形態を示したため、ＢＧ１８Ｎ２６Ｑ Ｆａｂを用いて構造決定を行った。ＢＧ１８Ｎ２６Ｑ Ｆａｂの結晶（空間群Ｐ２１；ａ＝４６．１２Å、ｂ＝７１．０４Å、ｃ＝６９．５４Å；β＝９８．４８°；非対称単位当たり１分子）は、０．２μＬの１８ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液と、０．２ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．５、２６．８％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００および１３．４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８，０００とを２０℃で混合し、２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを補充した母液中で凍結保護し、液体窒素中で急速冷却することによって得られた。１．５：１のタンパク質：リザーバー比で２５０ｎＬの液滴を用いる０．１Ｍ酢酸ナトリウム三水和物ｐＨ４．６および２．０Ｍ硫酸アンモニウムのリザーバーを用いたシッティングドロップでの蒸気拡散により、ＮＣ１０２Ｆａｂ（空間群Ｐ２１２１２１；ａ＝６０．２Å、ｂ＝８２．５Å、ｃ＝１１７．２Å；非対称単位当たり１分子）の結晶を作製した。２５％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを補充した母液中で結晶を凍結保護し、液体窒素中で急速冷却した。１．５：１タンパク質：リザーバー比でタンパク質とリザーバー（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５および２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ１０，０００を含む）とをインキュベートすることによる２５０ｎＬのシッティングドロップでの蒸気拡散により、ＮＣ３７－９３ＴＨ０５７複合体（空間群Ｐ２１２１２１；ａ＝６３．６Å、ｂ＝６７．４Å、ｃ＝２１０．４Å；非対称単位当たり１個の複合体）の結晶を作製した。２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４００を補充した母液中で結晶を凍結保護し、液体窒素中で急速冷却した。
Ａｓｎ２６ＨＣをＧｌｎに変異させることによって重鎖位置２６にある潜在的なＮ結合型グリコシル化部位が除去されたＢＧ１８ Ｆａｂの結晶が、野生型ＢＧ１８ Ｆａｂの結晶と比較して優れたサイズおよび形態を示したため、ＢＧ１８Ｎ２６Ｑ Ｆａｂを用いて構造決定を行った。ＢＧ１８Ｎ２６Ｑ Ｆａｂの結晶（空間群Ｐ２１；ａ＝４６．１２Å、ｂ＝７１．０４Å、ｃ＝６９．５４Å；β＝９８．４８°；非対称単位当たり１分子）は、０．２μＬの１８ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液と、０．２ｍＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．５、２６．８％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００および１３．４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８，０００とを２０℃で混合し、２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを補充した母液中で凍結保護し、液体窒素中で急速冷却することによって得られた。１．５：１のタンパク質：リザーバー比で２５０ｎＬの液滴を用いる０．１Ｍ酢酸ナトリウム三水和物ｐＨ４．６および２．０Ｍ硫酸アンモニウムのリザーバーを用いたシッティングドロップでの蒸気拡散により、ＮＣ１０２Ｆａｂ（空間群Ｐ２１２１２１；ａ＝６０．２Å、ｂ＝８２．５Å、ｃ＝１１７．２Å；非対称単位当たり１分子）の結晶を作製した。２５％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを補充した母液中で結晶を凍結保護し、液体窒素中で急速冷却した。１．５：１タンパク質：リザーバー比でタンパク質とリザーバー（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５および２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ１０，０００を含む）とをインキュベートすることによる２５０ｎＬのシッティングドロップでの蒸気拡散により、ＮＣ３７－９３ＴＨ０５７複合体（空間群Ｐ２１２１２１；ａ＝６３．６Å、ｂ＝６７．４Å、ｃ＝２１０．４Å；非対称単位当たり１個の複合体）の結晶を作製した。２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４００を補充した母液中で結晶を凍結保護し、液体窒素中で急速冷却した。
【0086】
Ｐｉｌａｔｕｓ ６Ｍピクセル検出器（Ｄｅｃｔｒｉｓ）を装備したＳｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ ｂｅａｍｌｉｎｅ １２－２でＸ線回折データを収集した。データの索引付け、統合および拡大縮小にＸＤＳを使用した。ＢＧ１８Ｎ２６Ｑ Ｆａｂの結晶は１．５Åに回折し、検索モデルとしてＣＤＲループを除去した１０－１０７４ Ｆａｂ（ＰＤＢコード４ＦＱ２）ＶＨＶＬとＣＨ１ＣＬとを用いた分子置換によって構造を解明した。ＰｈｅｎｉｘとＣｏｏｔでの手動モデル構築とによる精密化の反復アプローチを使用して構造を精密化した。ＢＧ１８Ｎ２６Ｑ Ｆａｂの最終モデル（Ｒｗｏｒｋ＝１８．０％、Ｒｆｒｅｅ＝１８．９％）は、ラマチャンドランプロットの好ましい領域、許容される領域および許容されない領域それぞれに、９８．３％、１．７％および０％の残基を有した。ＮＣ１０２ Ｆａｂは１．６Åに回折し、検索モデルとしてＣＤＲループを除去したＶＨＶＬを有するＮＩＨ４５－４６のモデル（ＰＤＢコード３Ｕ７Ｗ）とＣＨ１ＣＬとを用いた分子置換によって構造を解明した。ＮＣ１０２ Ｆａｂの最終モデル（Ｒｗｏｒｋ＝１８．０％、Ｒｆｒｅｅ＝２０．０％）は、ラマチャンドランプロットの好ましい領域、許容される領域および許容されない領域それぞれに、９８％、２％および０％の残基を有した。検索モデルとしてＮＣ１０２ ＶＨＶＬ、ＣＨ１ＣＬおよび切断型ｇｐ１２０コア（ＰＤＢ ３Ｕ７Ｙ由来）の検索モデルを使用して、分子置換によってＮＣ３７－９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０複合体構造を解明した。ＮＣ３７－９３ＴＨ０５７複合体の最終モデル（Ｒｗｏｒｋ＝２１．０％、Ｒｆｒｅｅ＝２６．０％）は、ラマチャンドランプロットの好ましい領域、許容される領域および許容されない領域それぞれに、９６％、４％および０％の残基を有した。データ収集および精密化統計を表４に示す。
【0087】
【表4】
【0088】
約４０Åの分解能までの極低温電子トモグラフィー／サブトモグラム平均法によってＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４－ＢＧ１８－１７９ＮＣ７５複合体の構造を解明し、ネガティブ染色された試料から単一粒子ＥＭ構造を解明するための参照構造として使用した。精製したＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４－ＢＧ１８－１７９ＮＣ７５複合体をＴＢＳ中１０μｇ／ｍＬに希釈した直後に、穴あきカーボンサポートフィルム（４００メッシュ、Ｃｕグリッド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ， Ｉｎｃ．））上のグロー放電した極薄Ｃフィルムに３μＬを加えた。グルタルアルデヒド蒸気を用いてグリッド上の試料を架橋し、次いで３％酢酸ウラニルにより染色した。Ｇａｔａｎ Ｕｌｔｒａｓｃａｎ ２ｋ Ｘ ２ｋ ＣＣＤを備えた１２０ｋｅＶで作動するＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２透過型電子顕微鏡を使用してデータを収集した。１画素当たり２．５Åをもたらす１μｍのデフォーカスで４２，０００倍の公称倍率で０．５秒の露光時間を使用して画像を取得した。ＥＭＡＮ２．１でスウォームピッキング（ｓｗａｒｍ ｐｉｃｋｉｎｇ）を使用して合計２５，６３９個の粒子をピッキングし、ＥＭＡＮ２．１を使用してＣＴＦ補正を行った。ＲＥＬＩＯＮを使用して最初の参照のない２Ｄクラスの平均化を行い、全粒子を２５０のクラスに分類した。良好なクラス平均に対応する９，８２７個の粒子を選択し、ＲＥＬＩＯＮで３Ｄ分類を使用してその粒子をさらに分類し、その後、７，９２５個の粒子を精密化のために選択した。３Ｄ分類および精密化のための参照構造を得るために、極低温電子トモグラフィーによって、独立したＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４－ＢＧ１８－１７９ＮＣ７５複合体試料からデータを収集し、Ｓｃｈａｒｆ， Ｌ．ら、Ｂｒｏａｄｌｙ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ８ＡＮＣ１９５ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ Ｃｌｏｓｅｄ ａｎｄ Ｏｐｅｎ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ．Ｃｅｌｌ， ２０１５．１６２（６）：ｐ．１３７９－９０に記載された方法を用いて、４０Åサブトモグラム平均化構造を得た。単一粒子再構成のための参照構造として使用するために、サブトモグラム平均化構造を８０Åにローパスフィルタリングした。ＲＥＬＩＯＮと、単一粒子ＥＭ再構成の分解能推定に推奨されるカットオフ０．１４３のゴールドスタンダードＦＳＣとを使用して、最終的な単一粒子再構成の分解能を計算した（約２５Å）。
【0089】
ＥＭ密度マップの適合
ＵＳＣＦキメラを用いてＥＭ構造を視覚化した。以下の選択肢を有するＵＣＳＦキメラ内のフィット・イン・マップ・ユーティリティ（ｆｉｔ ｉｎ ｍａｐ ｕｔｉｌｉｔｙ）を使用して、結晶構造からの座標をサブトモグラム平均化またはネガティブ染色単一粒子ＥＭ構造に適合させた：リアルタイム相関／平均更新、原子からシミュレートしたマップの使用、分解能２５Å。ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４構造（ＰＤＢ ４ＴＶＰ）を最初に密度に適合させ、次いでＢＧ１８ ＦａｂおよびＣＨ１０３ Ｆａｂ（ＰＤＢ ４ＪＡＭ；１７９ＮＣ７５ Ｆａｂのモデルとして）について個々に対応する密度に適合させた。ＦａｂのＣＨ１－ＣＬドメイン領域は低い密度を示した。
ＵＳＣＦキメラを用いてＥＭ構造を視覚化した。以下の選択肢を有するＵＣＳＦキメラ内のフィット・イン・マップ・ユーティリティ（ｆｉｔ ｉｎ ｍａｐ ｕｔｉｌｉｔｙ）を使用して、結晶構造からの座標をサブトモグラム平均化またはネガティブ染色単一粒子ＥＭ構造に適合させた：リアルタイム相関／平均更新、原子からシミュレートしたマップの使用、分解能２５Å。ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４構造（ＰＤＢ ４ＴＶＰ）を最初に密度に適合させ、次いでＢＧ１８ ＦａｂおよびＣＨ１０３ Ｆａｂ（ＰＤＢ ４ＪＡＭ；１７９ＮＣ７５ Ｆａｂのモデルとして）について個々に対応する密度に適合させた。ＦａｂのＣＨ１－ＣＬドメイン領域は低い密度を示した。
【0090】
構造決定試験のためのタンパク質作製および精製
一過性トランスフェクションによって６×－Ｈｉｓタグ付きＢＧ１８、ＢＧ１８Ｎ２６Ｑ、ＮＣ１０２およびＮＣ３７ ＦａｂをＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞に発現させ、Ｎｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、トランスフェクトした細胞上清から精製した。切断されたＨｉｓタグ付き９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０コアタンパク質をバキュロウイルス感染昆虫細胞内で産生させ、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、記載されているように精製した（Ｄｉｓｋｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１１；Ｄｉｓｋｉｎら、ＮＳＭＢ ２０１０）。結晶化試験の前に、精製ＮＣ３７および９３ＴＨ０５７タンパク質を同時インキュベートし（２：１モル比のＦａｂ対ｇｐ１２０コア）、ｇｐ１２０タンパク質１ｍｇ当たり５ｋＵのエンドグリコシダーゼＨを用いて２５℃で３時間処理した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって、エンドグリコシダーゼＨ処理複合体を精製した。
一過性トランスフェクションによって６×－Ｈｉｓタグ付きＢＧ１８、ＢＧ１８Ｎ２６Ｑ、ＮＣ１０２およびＮＣ３７ ＦａｂをＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞に発現させ、Ｎｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、トランスフェクトした細胞上清から精製した。切断されたＨｉｓタグ付き９３ＴＨ０５７ ｇｐ１２０コアタンパク質をバキュロウイルス感染昆虫細胞内で産生させ、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、記載されているように精製した（Ｄｉｓｋｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１１；Ｄｉｓｋｉｎら、ＮＳＭＢ ２０１０）。結晶化試験の前に、精製ＮＣ３７および９３ＴＨ０５７タンパク質を同時インキュベートし（２：１モル比のＦａｂ対ｇｐ１２０コア）、ｇｐ１２０タンパク質１ｍｇ当たり５ｋＵのエンドグリコシダーゼＨを用いて２５℃で３時間処理した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって、エンドグリコシダーゼＨ処理複合体を精製した。
【0091】
Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｒ．Ｗ．ら、Ａ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｌｅａｖｅｄ， ｓｏｌｕｂｌｅ ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ ｔｒｉｍｅｒ， ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４ ｇｐ１４０， ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｏｒ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｎｏｎ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ， ２０１３．９（９）：ｐ．ｅ１００３６１８に記載されているように、ＥＭ試験用の可溶性ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４三量体を構築した。５μＭのキフネンシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて処理したＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞を、４：１の比でＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４および可溶性フューリンをコードするプラスミドを用いて同時トランスフェクトした。２Ｇ１２ ＩｇＧモノマーをＮＨＳ活性化セファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合させることによって作製された２Ｇ１２免疫親和性カラムを使用して、細胞上清からＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４タンパク質を回収した。３Ｍ ＭｇＣｌ２を用いてタンパク質を溶出した後、直ちに緩衝液をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７．４（５０ｍＭ ＮａＣｌ）に交換した。Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いてＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＳＥＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて三量体をさらに精製した。
【0092】
自己由来ウイルス
製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎキットを用いて、患者の血漿からＨＩＶ－１ ｅｎｖ遺伝子ＨＩＶ－１－ＲＮＡの単一ゲノム配列決定（ＳＧＳ）を抽出した。抽出したＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅおよびＨＩＶ－１特異的プライマーｅｎｖＢ３ｏｕｔを用いてＥｎｖ特異的ｃＤＮＡ合成に供した。
製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎキットを用いて、患者の血漿からＨＩＶ－１ ｅｎｖ遺伝子ＨＩＶ－１－ＲＮＡの単一ゲノム配列決定（ＳＧＳ）を抽出した。抽出したＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅおよびＨＩＶ－１特異的プライマーｅｎｖＢ３ｏｕｔを用いてＥｎｖ特異的ｃＤＮＡ合成に供した。
【0093】
ｅｎｖＢ５ｏｕｔ：５’－ＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧ－３’（配列番号９７）
ｅｎｖＢ３ｏｕｔ：５’－ＴＴＧＣＴＡＣＴＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＣＣＡＴＧＴ－３’（配列番号９８）
ｅｎｖＢ５ｉｎ：５’－ＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧ－３’（配列番号９９）
ｅｎｖＢ３ｉｎ：５’－ＧＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＣＴＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣ－３’（配列番号１００）。
ｅｎｖＢ３ｏｕｔ：５’－ＴＴＧＣＴＡＣＴＴＧＴＧＡＴＴＧＣＴＣＣＡＴＧＴ－３’（配列番号９８）
ｅｎｖＢ５ｉｎ：５’－ＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧ－３’（配列番号９９）
ｅｎｖＢ３ｉｎ：５’－ＧＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＣＴＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣ－３’（配列番号１００）。
【0094】
第１ラウンドのＰＣＲは、１×Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰおよび０．５単位のＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑを含有する２０μＬの容量で、プライマーｅｎｖＢ５ｏｕｔおよびｅｎｖＢ３ｏｕｔの各々を０．２μＭ用いて行った。第２ラウンドのＰＣＲは、１μＬのＰＣＲ １ならびに０．２μＭのｅｎｖＢ５ｉｎおよびｅｎｖＢ３ｉｎのプライマーを用いて行った。ＰＣＲ条件は、４５サイクルおよび５８℃の上昇させたアニーリング温度を除いてＰＣＲ－１と同じであった。ＰＣＲ－２産物は、１％９６ウェルＥ－Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて確認した。３０％未満の増幅効率を有するＰＣＲからのバンドをライブラリー調製に供し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡサンプル調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて配列決定した。Ｊ． Ｌ．Ｋｉｒｃｈｈｅｒｒら、Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｅｎｖ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４３， １０４－１１１（２００７）に記載のプロトコルに従って、ＣＭＶ－Ｅｎｖ発現カセットを作製した。６ウェルプレート中で５００ｎｇのＣＭＶ－ｅｎｖをｐＳＧ３Δｅｎｖとともに２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、４８時間後に上清を回収した。いずれのプラスミドも発現前に配列確認した。ＴＺＭ－ｂｌアッセイによる中和試験に上清を供した。
【0095】
Ｅｎｖグリコール変異ウイルスのＴＺＭ－ｂｌアッセイ
Ｌｉ， Ｍ．ら、Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｂ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ－ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ２００５．７９（１６）：ｐ．１０１０８－２５に記載されているように、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）にＨＩＶ－１ Ｅｎｖ発現プラスミドと、ｐＳＧ３ΔＥｎｖと呼ばれるＥｎｖ欠損ゲノムバックボーンプラスミド（Ｅｎｖ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ）とをトランスフェクトすることによってシュードウイルスを作製した。中和アッセイで使用するために、シュードウイルスをトランスフェクションの７２時間後に回収した。上記のＬｉらに記載されているように、単一ラウンドの複製シュードウイルスアッセイとＴＺＭ－Ｂｌ標的細胞とを使用して中和活性を評価した。要約すると、ＴＺＭ－ｂｌ細胞を９６ウェル平底プレートに播種した。このプレートにシュードウイルスを加え、これを抗体の連続希釈物とともに３７℃で１時間プレインキュベートした。感染の７２時間後に、溶解およびＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ ＴＭルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加時にルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を定量した。ＩＣ５０値を決定するために、非線形回帰により用量反応曲線を適合させた。
Ｌｉ， Ｍ．ら、Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖ ｃｌｏｎｅｓ ｆｒｏｍ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｂ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ－ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ２００５．７９（１６）：ｐ．１０１０８－２５に記載されているように、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）にＨＩＶ－１ Ｅｎｖ発現プラスミドと、ｐＳＧ３ΔＥｎｖと呼ばれるＥｎｖ欠損ゲノムバックボーンプラスミド（Ｅｎｖ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ）とをトランスフェクトすることによってシュードウイルスを作製した。中和アッセイで使用するために、シュードウイルスをトランスフェクションの７２時間後に回収した。上記のＬｉらに記載されているように、単一ラウンドの複製シュードウイルスアッセイとＴＺＭ－Ｂｌ標的細胞とを使用して中和活性を評価した。要約すると、ＴＺＭ－ｂｌ細胞を９６ウェル平底プレートに播種した。このプレートにシュードウイルスを加え、これを抗体の連続希釈物とともに３７℃で１時間プレインキュベートした。感染の７２時間後に、溶解およびＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ ＴＭルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加時にルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を定量した。ＩＣ５０値を決定するために、非線形回帰により用量反応曲線を適合させた。
【0096】
ＨＩＶ－１ Ｖ３糖ペプチドの合成
Ａｍｉｎ， Ｍ．Ｎ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｇｌｙｃａｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＨＩＶ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， ２０１３．９（８）：ｐ．５２１－６に記載の手順に従って、標的糖ペプチドを作製するために、ＧｌｃＮＡｃ－ペプチド前駆体の自動固相ペプチド合成およびその後のＧｌｃＮＡｃ－ペプチドの酵素的糖転移反応からなる化学酵素的方法を用いて、いくつかのＨＩＶ－１株に由来するＶ３糖ペプチドの合成を達成した。２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるＳＰＲにより、ビオチン化合成糖ペプチドとＢＧ１８およびＢＧ８ ＩｇＧ抗体との相互作用を評価した。２００応答単位（ＲＵ）が達成されるまで、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、Ｐ２０界面活性剤０．０５％ｖ／ｖ、ｐＨ７．４）中のニュートラアビジン被覆ＣＭ５センサーチップ上にビオチン化糖ペプチドを固定化した。ＢＧ１８（またはＢＧ８）を、ＢＳ－Ｐ緩衝液中で４μＭから始めて２倍の系列希釈の濃度で流速４０μＬ／分で１８０秒間注入した。次いで、流速４０μＬ／分でＢＳ－Ｐ緩衝液を１２１０秒間注入して解離させた。流速５０μＬ／分で３Ｍ ＭｇＣｌ２を３分間注入してから、流速５０μＬ／分でＨＢＳ－Ｐ緩衝液を５分間注入することによって再生を行った。
Ａｍｉｎ， Ｍ．Ｎ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｇｌｙｃａｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＨＩＶ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， ２０１３．９（８）：ｐ．５２１－６に記載の手順に従って、標的糖ペプチドを作製するために、ＧｌｃＮＡｃ－ペプチド前駆体の自動固相ペプチド合成およびその後のＧｌｃＮＡｃ－ペプチドの酵素的糖転移反応からなる化学酵素的方法を用いて、いくつかのＨＩＶ－１株に由来するＶ３糖ペプチドの合成を達成した。２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるＳＰＲにより、ビオチン化合成糖ペプチドとＢＧ１８およびＢＧ８ ＩｇＧ抗体との相互作用を評価した。２００応答単位（ＲＵ）が達成されるまで、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、Ｐ２０界面活性剤０．０５％ｖ／ｖ、ｐＨ７．４）中のニュートラアビジン被覆ＣＭ５センサーチップ上にビオチン化糖ペプチドを固定化した。ＢＧ１８（またはＢＧ８）を、ＢＳ－Ｐ緩衝液中で４μＭから始めて２倍の系列希釈の濃度で流速４０μＬ／分で１８０秒間注入した。次いで、流速４０μＬ／分でＢＳ－Ｐ緩衝液を１２１０秒間注入して解離させた。流速５０μＬ／分で３Ｍ ＭｇＣｌ２を３分間注入してから、流速５０μＬ／分でＨＢＳ－Ｐ緩衝液を５分間注入することによって再生を行った。
【0097】
インビボマウスモデル
週２回、３週間にわたって各抗体１ｍｇを皮下（ｓ．ｃ．）投与することにより、ヒト化ＮＯＤ Ｒａｇ１－／－Ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を治療し、合計６回の抗体注射を実施した。同じドナー由来のヒト細胞により対照ｈｕマウスを再構成し、ＨＩＶ－１ＹＵ２に感染させたが、抗体により治療はしなかった。プラズマウイルス量を毎週測定した。Ｆ．Ｋｌｅｉｎら、ＨＩＶ ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４９２， １１８－１２２（２０１２）に記載されているように、リバウンドウイルスを有するマウス由来のｇｐ１２０配列を得た。
週２回、３週間にわたって各抗体１ｍｇを皮下（ｓ．ｃ．）投与することにより、ヒト化ＮＯＤ Ｒａｇ１－／－Ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を治療し、合計６回の抗体注射を実施した。同じドナー由来のヒト細胞により対照ｈｕマウスを再構成し、ＨＩＶ－１ＹＵ２に感染させたが、抗体により治療はしなかった。プラズマウイルス量を毎週測定した。Ｆ．Ｋｌｅｉｎら、ＨＩＶ ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４９２， １１８－１２２（２０１２）に記載されているように、リバウンドウイルスを有するマウス由来のｇｐ１２０配列を得た。
【0098】
ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬの精製２ＣＣコア、ｇｐ１２０．ＹＵ２（野生型または変異体）またはｇｐ１４０．ＹＵ２フォールドオン三量体により、高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を一晩コーティングした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で６回洗浄した後、２％ＢＳＡ、１μＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ（「ブロッキング緩衝液」）を用いてプレートを２時間ブロックし、次いで、初期濃度４μｇ／ｍＬからＰＢＳ中７連続１：４希釈物として加えたＩｇＧとともに１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、ヤギＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（ブロッキング緩衝液中０．８μｇ／ｍＬ）とともに１時間インキュベートし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）発色基質（ＡＢＴＳ溶液；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートすることによってプレートを発色させた。競合ＥＬＩＳＡでは、０．５μｇ／ｍＬのＢＧ５０５．ＳＯＳＩＰ．６６４によりプレートをコーティングし、洗浄し、ブロッキング緩衝液を用いて２時間ブロッキングし、次いで、初期濃度３２μｇ／ｍＬからＰＢＳ中７連続１：４希釈物として加えたＩｇＧとともに、４μｇ／ｍＬの一定濃度のビオチン化抗体の存在下で１時間インキュベートした。次いで、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）（ブロッキング緩衝液中１μｇ／ｍＬ）を用いてプレートを発色させた。
ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬの精製２ＣＣコア、ｇｐ１２０．ＹＵ２（野生型または変異体）またはｇｐ１４０．ＹＵ２フォールドオン三量体により、高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を一晩コーティングした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で６回洗浄した後、２％ＢＳＡ、１μＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ（「ブロッキング緩衝液」）を用いてプレートを２時間ブロックし、次いで、初期濃度４μｇ／ｍＬからＰＢＳ中７連続１：４希釈物として加えたＩｇＧとともに１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、ヤギＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（ブロッキング緩衝液中０．８μｇ／ｍＬ）とともに１時間インキュベートし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）発色基質（ＡＢＴＳ溶液；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートすることによってプレートを発色させた。競合ＥＬＩＳＡでは、０．５μｇ／ｍＬのＢＧ５０５．ＳＯＳＩＰ．６６４によりプレートをコーティングし、洗浄し、ブロッキング緩衝液を用いて２時間ブロッキングし、次いで、初期濃度３２μｇ／ｍＬからＰＢＳ中７連続１：４希釈物として加えたＩｇＧとともに、４μｇ／ｍＬの一定濃度のビオチン化抗体の存在下で１時間インキュベートした。次いで、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）（ブロッキング緩衝液中１μｇ／ｍＬ）を用いてプレートを発色させた。
【0099】
Ｄ７３２４エピトープタグを有するＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４三量体（ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４－Ｄ７３２４）を使用するＥＬＩＳＡでは、Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｒ．Ｗ．ら、Ａ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｌｅａｖｅｄ， ｓｏｌｕｂｌｅ ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ ｔｒｉｍｅｒ， ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４ ｇｐ１４０， ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｏｒ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｎｏｎ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ， ２０１３．９（９）：ｐ．ｅ１００３６１８に記載されているように、５μｇ／ｍＬのＤ７３２４抗体によりプレートを一晩コーティングし、次いで洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬの三量体とともにインキュベートした。さらに洗浄した後、初期濃度４μｇ／ｍＬからＰＢＳ中７連続１：４希釈物としてＩｇＧを１時間かけて加えた。上記のように、ヤギＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体とのインキュベーションによってエンドポイントを作成した。実験はいずれも少なくとも３回行った。
【0100】
ＣＭＶ－Ｅｎｖウイルスの作製
確立されたプロトコルに従って、ＣＭＶ－ｅｎｖ発現カセットを作製した（５２）。要約すると、以下のプライマーを用いてｐｃＤＮＡ ３．１Ｄ／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ発現ベクターからＣＭＶプロモーターを増幅した：
ＣＭＶｅｎｖ：５’－ＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴ－３’（配列番号１０１）および
ＣＭＶｅｎｖ１Ａ ５’－ＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣＴＡＡＧＣＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＣＴＣ－３’（配列番号１０２）。
確立されたプロトコルに従って、ＣＭＶ－ｅｎｖ発現カセットを作製した（５２）。要約すると、以下のプライマーを用いてｐｃＤＮＡ ３．１Ｄ／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ発現ベクターからＣＭＶプロモーターを増幅した：
ＣＭＶｅｎｖ：５’－ＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴ－３’（配列番号１０１）および
ＣＭＶｅｎｖ１Ａ ５’－ＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣＴＡＡＧＣＣＧＧＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＣＴＣ－３’（配列番号１０２）。
【0101】
Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＰＣＲおよびＧｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用いてＰＣＲ産物を精製した。以下のプライマーを用いて、１μｌの第１ラウンドのＰＣＲ産物を増幅した：
ｅｎｖ１ＡＴＯＰＯ ５’－ＣＡＣＣＧＧＣＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡ－３ ’（配列番号１０３）および
Ｒｅｖ１９ ５’－ＡＣＴＴＴＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＧＣＣＡＣＣＣＡＴ－３’（配列番号１０４）（１×Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５単位のＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑおよび０．２μＭの各プライマーを含有する２０μＬ容量中）。サイクル条件は、９４℃、２分；（９４℃、１５秒；５５℃ ３０秒； ６８℃、４分）×３５；６８℃、１０分であった。０．７％アガロースゲルを用いた分析によりｅｎｖの存在を確認し、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用いて産物を精製した。次いで、プライマーＣＭＶｅｎｖおよびＲｅｖ１９を用いて、１０ｎｇのエンベロープおよび０．５ｎｇのＣＭＶを３連でオーバーラップＰＣＲに供した。全反応容量６は、１×Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２μＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１単位のＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑおよび０．４μＭの各プライマーを含有する５０μＬであった。ＰＣＲは、９４℃、２分間；（９４℃、３０秒；６０℃ ３０秒；６８℃、４分）×２５；６８℃、１０分で行った。６ウェルプレート中で５００ｎｇのＣＭＶ－ｅｎｖをｐＳＧ３Δｅｎｖとともに２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、４８時間後に上清を回収した。上記のように、ＴＺＭ－ｂｌによる中和試験に上清を供した。
ｅｎｖ１ＡＴＯＰＯ ５’－ＣＡＣＣＧＧＣＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡ－３ ’（配列番号１０３）および
Ｒｅｖ１９ ５’－ＡＣＴＴＴＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＧＣＣＡＣＣＣＡＴ－３’（配列番号１０４）（１×Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５単位のＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑおよび０．２μＭの各プライマーを含有する２０μＬ容量中）。サイクル条件は、９４℃、２分；（９４℃、１５秒；５５℃ ３０秒； ６８℃、４分）×３５；６８℃、１０分であった。０．７％アガロースゲルを用いた分析によりｅｎｖの存在を確認し、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを用いて産物を精製した。次いで、プライマーＣＭＶｅｎｖおよびＲｅｖ１９を用いて、１０ｎｇのエンベロープおよび０．５ｎｇのＣＭＶを３連でオーバーラップＰＣＲに供した。全反応容量６は、１×Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２μＭ ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１単位のＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑおよび０．４μＭの各プライマーを含有する５０μＬであった。ＰＣＲは、９４℃、２分間；（９４℃、３０秒；６０℃ ３０秒；６８℃、４分）×２５；６８℃、１０分で行った。６ウェルプレート中で５００ｎｇのＣＭＶ－ｅｎｖをｐＳＧ３Δｅｎｖとともに２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、４８時間後に上清を回収した。上記のように、ＴＺＭ－ｂｌによる中和試験に上清を供した。
【0102】
培養ウイルス（ＶＯＡ）
ｖａｎ ’ｔ Ｗｏｕｔら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｏｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ， ２００８． ３（３）：ｐ．３６３－７０に記載されているように、患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と健常ドナーＰＢＭＣとの共培養によって、ドナーＥＢ３５４由来のウイルスを得た。ロックフェラー大学の試験プロトコルＭＮＵ－０６２８の下で、白血球除去によって患者から健常ドナーＰＢＭＣを得た。１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシンおよびＰＨＡを１μｇ／ｍＬ含有するＩＭＤＭ中、１ｍＬ当たり５×１０６細胞の密度で３７℃および５％ＣＯ２で健常ドナーＰＢＭＣを２～３日間予備刺激した。次いで、刺激したドナーＰＢＭＣ ６×１０６個を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および５μｇ／ｍＬのポリブレンを含有するＩＭＤＭに移し、５～１０×１０６個のＥＢ３５４ ＰＢＭＣと３７℃および５％ＣＯ２で共培養した。培地を毎週交換し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ｐ２４ Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により培養上清中のｐ２４の存在を定量した。上清１ｍＬ当たり１ｎｇのｐ２４を超える培養物を凍結し、－８０℃で保存した。上記のプロトコルに従ってＴＺＭ－ｂｌ中和アッセイを用いて、組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ５０）の決定と、その後の様々な広域中和抗体および自己由来血清ＩｇＧに対する自己由来ウイルスの感受性に関する試験とを行った。中和アッセイはいずれも２連で行った。
ｖａｎ ’ｔ Ｗｏｕｔら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｏｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ， ２００８． ３（３）：ｐ．３６３－７０に記載されているように、患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と健常ドナーＰＢＭＣとの共培養によって、ドナーＥＢ３５４由来のウイルスを得た。ロックフェラー大学の試験プロトコルＭＮＵ－０６２８の下で、白血球除去によって患者から健常ドナーＰＢＭＣを得た。１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシンおよびＰＨＡを１μｇ／ｍＬ含有するＩＭＤＭ中、１ｍＬ当たり５×１０６細胞の密度で３７℃および５％ＣＯ２で健常ドナーＰＢＭＣを２～３日間予備刺激した。次いで、刺激したドナーＰＢＭＣ ６×１０６個を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および５μｇ／ｍＬのポリブレンを含有するＩＭＤＭに移し、５～１０×１０６個のＥＢ３５４ ＰＢＭＣと３７℃および５％ＣＯ２で共培養した。培地を毎週交換し、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ｐ２４ Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により培養上清中のｐ２４の存在を定量した。上清１ｍＬ当たり１ｎｇのｐ２４を超える培養物を凍結し、－８０℃で保存した。上記のプロトコルに従ってＴＺＭ－ｂｌ中和アッセイを用いて、組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ５０）の決定と、その後の様々な広域中和抗体および自己由来血清ＩｇＧに対する自己由来ウイルスの感受性に関する試験とを行った。中和アッセイはいずれも２連で行った。
【0103】
ＨＩＶ－１ＹＵ２エンベロープ変異体
製造業者の仕様書（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（ｍｕｌｔｉ－）ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いて、野生型ＨＩＶ－１ＹＵ２エンベロープに一重、二重および三重の突然変異を導入した。
製造業者の仕様書（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（ｍｕｌｔｉ－）ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いて、野生型ＨＩＶ－１ＹＵ２エンベロープに一重、二重および三重の突然変異を導入した。
【0104】
ウイルス進化の分析
ＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン２．１１）を使用して、またはＧｅｎｅｉｏｕｓ（バージョン８．１．６）配列分析ソフトウェアを使用する手動アラインメントによって、ｅｎｖヌクレオチド配列のアラインメントを生成した。明確にアラインさせることができなかった領域は、系統発生分析および多様性計算のために除去した。ｊＭｏｄｅｌＴｅｓｔを用いて、最尤系統発生分析のための進化モデルクラスを選択した。モデルパラメータ値および系統発生の結合推定とともにＰｈｙＭＬ（バージョン３）を使用して、最尤分子系統樹を生成した。ＤＩＶＥＩＮ ｗｅｂｔｏｏｌの２標本Ｕ統計量検定を使用して、標本間のペアワイズ遺伝的多様性を比較した。
ＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン２．１１）を使用して、またはＧｅｎｅｉｏｕｓ（バージョン８．１．６）配列分析ソフトウェアを使用する手動アラインメントによって、ｅｎｖヌクレオチド配列のアラインメントを生成した。明確にアラインさせることができなかった領域は、系統発生分析および多様性計算のために除去した。ｊＭｏｄｅｌＴｅｓｔを用いて、最尤系統発生分析のための進化モデルクラスを選択した。モデルパラメータ値および系統発生の結合推定とともにＰｈｙＭＬ（バージョン３）を使用して、最尤分子系統樹を生成した。ＤＩＶＥＩＮ ｗｅｂｔｏｏｌの２標本Ｕ統計量検定を使用して、標本間のペアワイズ遺伝的多様性を比較した。
【0105】
ＭｉＳｅｑ ｅｎｖ配列の生物情報学的処理
Ｃｕｔａｄａｐｔ ｖ１．８．３を用いて配列アダプターを除去した。各ウイルスに対するリードアセンブリは３つの工程で行った。まず、Ｓｐａｄｅｓ ｖ３．６．１を使用してデノボアセンブリを実行し、長いコンティグファイルを作成した。続いて、２５５ｂｐよりも長いコンティグをＨＩＶエンベロープ参照配列にアラインし、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ８を用いてコンセンサス配列を生成した。最後に、ギャップを埋めるためにコンセンサス配列にリードを再アラインし、最終コンセンサスを生成した。二重ピークを有する配列（任意の残基に対するカットオフコンセンサス同一性＜７５％）は、下流分析から省略した。
Ｃｕｔａｄａｐｔ ｖ１．８．３を用いて配列アダプターを除去した。各ウイルスに対するリードアセンブリは３つの工程で行った。まず、Ｓｐａｄｅｓ ｖ３．６．１を使用してデノボアセンブリを実行し、長いコンティグファイルを作成した。続いて、２５５ｂｐよりも長いコンティグをＨＩＶエンベロープ参照配列にアラインし、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ８を用いてコンセンサス配列を生成した。最後に、ギャップを埋めるためにコンセンサス配列にリードを再アラインし、最終コンセンサスを生成した。二重ピークを有する配列（任意の残基に対するカットオフコンセンサス同一性＜７５％）は、下流分析から省略した。
【0106】
統計分析
マン－ホイットニー検定によって統計的差異を分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを分析に使用し、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１および＊＊＊ｐ≦０．００１でデータを有意と見なした。
マン－ホイットニー検定によって統計的差異を分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを分析に使用し、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１および＊＊＊ｐ≦０．００１でデータを有意と見なした。
【0107】
Ｂ．結果
複数のｂＮＡｂ
ＨＩＶ－１感染長期非進行者３９４例のコホート内で、中和の広域性および効力について上位１％に入ったドナーＥＢ３５４から得られたＩｇＧを精製した。このドナーは１９８６年にＨＩＶ－１クレードＢと診断された。ＥＢ３５４は１９９５年から１９９８年の間にジダノシンおよびスタブジンによる治療を受けたが、それ以来抗レトロウイルス療法は受けていない。２００２年に、ＥＢ３５４のウイルス量は＜４００コピー／ｍＬであり、ＣＤ４およびＣＤ８の数はそれぞれ９５４および１０４６細胞／ｍｍ３であった。ＥＢ３５４は、２００２年から２００６年の間にウイルス血症に３つの実証されたピークを有した（図１Ａ）。ウイルス量が＜４００コピー／ｍｌであった２００６年に、血清学的中和効力および広域性が最初に評価された（図１Ａおよび図１Ｂならびに表３）。中和活性は２０１０年まで増大し、その時以来広域かつ強力なままである（図１Ｂ）。ＨＬＡタイピングでは、ＨＬＡ Ａ＊０１：０１、２４：０２、Ｂ＊２７：０５、５７：０１、Ｃ＊０１：０２、０６：０２が明らかにされた（表３）。
複数のｂＮＡｂ
ＨＩＶ－１感染長期非進行者３９４例のコホート内で、中和の広域性および効力について上位１％に入ったドナーＥＢ３５４から得られたＩｇＧを精製した。このドナーは１９８６年にＨＩＶ－１クレードＢと診断された。ＥＢ３５４は１９９５年から１９９８年の間にジダノシンおよびスタブジンによる治療を受けたが、それ以来抗レトロウイルス療法は受けていない。２００２年に、ＥＢ３５４のウイルス量は＜４００コピー／ｍＬであり、ＣＤ４およびＣＤ８の数はそれぞれ９５４および１０４６細胞／ｍｍ３であった。ＥＢ３５４は、２００２年から２００６年の間にウイルス血症に３つの実証されたピークを有した（図１Ａ）。ウイルス量が＜４００コピー／ｍｌであった２００６年に、血清学的中和効力および広域性が最初に評価された（図１Ａおよび図１Ｂならびに表３）。中和活性は２０１０年まで増大し、その時以来広域かつ強力なままである（図１Ｂ）。ＨＬＡタイピングでは、ＨＬＡ Ａ＊０１：０１、２４：０２、Ｂ＊２７：０５、５７：０１、Ｃ＊０１：０２、０６：０２が明らかにされた（表３）。
【0108】
この対象の血清学的活性を説明する抗体を単離するために、以下の４種類のＨＩＶ－１ベイトを用いて単一細胞を選別した；２ＣＣコア、ｇｐ１４０ＹＵ２、ｇｐ１４０９２ＵＧ３７．８（クレードＡ）＋ｇｐ１４０ＣＺＡ７９０１２（クレードＣ）の１：１混合物およびＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４（図１Ｃ）。合計２４１対の重鎖および軽鎖を単離し、そのうち１５２の抗体が２２の異なるクローンを形成した。３つのクローン由来の抗体は、ｔｉｅｒ ２中和活性を示した（図１Ｃおよび表１３）。２０１０年～２０１５年に得られた血清ＩｇＧと比較した場合、抗体ＢＧ１８によって例示されるようなクローンに属する抗体（図１Ｃ）は、ほとんどの血清学的活性を再現した（図１Ｄ）。抗体ＮＣ３７および抗体ＢＧ１によって例示される他の２つの中和クローンに属する抗体（図１Ｃ）は、それほど強力ではなかったが、ＢＧ１８の活性を補完した（図１Ｄ）。
【0109】
３つの中和クローンにおける抗体の結合部位をマッピングするために、Ｅｎｖにおいてエピトープ特異的点突然変異を保有するＨＩＶ－１ＹＵ２変異体を用いてＴＺＭ－ｂｌアッセイを行った。ポリクローナルＩｇＧは変異体に対して測定可能な感受性の変化を示さなかったが、抗体ＢＧ１８はＹＵ２Ｎ３３２Ｋ（グリカン－Ｖ３）に感受性であり、抗体ＢＧ１はＹＵ２Ｎ１６０Ｋ（Ｖ１Ｖ２）に感受性であり、抗体ＮＣ３７はＹＵ２Ｎ２８０Ｙ（ＣＤ４ｂｓ）に感受性であった（図１Ｄ）。中和結果と一致して、ＥＬＩＳＡによるＢＧ１８結合は、ＰＧＴ１２１および１０－１０７４によって競合的に阻害された。ＢＧ１結合はＰＧＴ１４５によって減少した（図５）。
【0110】
ＢＧ１８は、１１８のウイルス集団（図１Ｅ、表５）中の６４％のウイルスを０．０３μｇ／ｍｌの幾何平均ＩＣ５０で中和し、その広域性は同等であったが、ＰＧＴ１２１または１０－１０７４のいずれかよりも強力であった（図１Ｆ、表５～表１０）。抗体ＮＣ３７およびＢＧ１は、それぞれ０．３μｇ／ｍＬおよび０．６７μｇ／ｍＬの幾何平均ＩＣ５０ならびに３３％および３７％の広域性を示した。（図１Ｅおよび図１Ｆ、表６および表７）。３つのｂＮＡｂの１：１：１混合物は、１１８のウイルス集団中の８１％のウイルスを０．１３０μｇ／ｍＬの幾何平均ＩＣ５０で中和し、相加効果を示した（図１Ｅ、表１１）。
【0111】
【表5-1】
【0112】
【表5-2】
【0113】
【表5-3】
【0114】
【表5-4】
【0115】
【表6-1】
【0116】
【表6-2】
【0117】
【表6-3】
【0118】
【表6-4】
【0119】
【表7-1】
【0120】
【表7-2】
【0121】
【表7-3】
【0122】
【表7-4】
【0123】
【表8-1】
【0124】
【表8-2】
【0125】
【表8-3】
【0126】
【表8-4】
【0127】
【表9-1】
【0128】
【表9-2】
【0129】
【表9-3】
【0130】
【表9-4】
【0131】
【表10-1】
【0132】
【表10-2】
【0133】
【表10-3】
【0134】
【表10-4】
【0135】
【表11-1】
【0136】
【表11-2】
【0137】
【表11-3】
【0138】
【表11-4】
【0139】
ＢＧ１８
アミノ酸レベルでは、ＢＧ１８は、ともにＶＨ４－５９生殖系列前駆体から生じる１０－１０７４およびＰＧＴ１２１の重鎖とそれぞれ６３％および６２％同一である。ＢＧ１８は、密接に関連した（９０．８％の同一性）生殖系列遺伝子ＶＨ４－４から生じる（図６Ａ）。ＰＧＴ１２１、１０－１０７４およびＢＧ１８ならびにそのクローン変異体の重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアラインメントは、ＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ２との間に高度な類似性を示す。ＢＧ１８のＣＤＲＨ３は、ＰＧＴ１２１／１０－１０７４よりも３残基短い（２１対２４残基；図２Ａおよび図６Ｂ）。さらに、ＢＧ１８は、ＰＧＴ１２１ファミリーに共通のフレームワーク領域内に７つの突然変異のうち６つを共有するが（図２Ａ）、ＰＧＴ１２１／１０－１０７４のメンバーとは異なり、いかなる挿入または欠失も含有しない。
アミノ酸レベルでは、ＢＧ１８は、ともにＶＨ４－５９生殖系列前駆体から生じる１０－１０７４およびＰＧＴ１２１の重鎖とそれぞれ６３％および６２％同一である。ＢＧ１８は、密接に関連した（９０．８％の同一性）生殖系列遺伝子ＶＨ４－４から生じる（図６Ａ）。ＰＧＴ１２１、１０－１０７４およびＢＧ１８ならびにそのクローン変異体の重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアラインメントは、ＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ２との間に高度な類似性を示す。ＢＧ１８のＣＤＲＨ３は、ＰＧＴ１２１／１０－１０７４よりも３残基短い（２１対２４残基；図２Ａおよび図６Ｂ）。さらに、ＢＧ１８は、ＰＧＴ１２１ファミリーに共通のフレームワーク領域内に７つの突然変異のうち６つを共有するが（図２Ａ）、ＰＧＴ１２１／１０－１０７４のメンバーとは異なり、いかなる挿入または欠失も含有しない。
【0140】
ＢＧ１８は、ＶＬ遺伝子セグメントＶＬ２－２５を用い、ＰＧＴ１２１および１０－１０７４によってそれぞれ用いられるＶＬ３－２１遺伝子セグメントに対して、アミノ酸配列レベルで４６％および５０％の同一性のみで関連している（図２Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｄ）。さらに、ＢＧ１８およびその変異体の軽鎖は１０－１０７４およびＰＧＴ１２１よりもわずかに変異しているが、重鎖として挿入または欠失を含有しない。したがって、ＢＧ１８およびそのクローン変異体は、先に単離されたＰＧＴ１２１／１０－１０７４クラスの抗体と類似の重鎖を示すが、異なる軽鎖を示す。
【0141】
ＢＧ１８ Ｆａｂの１．３Å分解能の結晶構造から、他のＣＤＲよりも約１１Å突出したＣＤＲＨ３を除いて、ＣＤＲループがコンパクトな結合部位を形成し、主に疎水性残基からなる先端を示すことが明らかにされた（図２Ｃ）。ＣＤＲＨ３は、完全に伸長する代わりに、ＣＤＲＨ３残基Ｇｌｙ１００ａＨＣ、Ｖａｌ１００ｂＨＣ、Ｖａｌ１００ｃＨＣ、Ｇｌｙ１００ｅＨＣおよびＧｌｕ１００ｆＨＣの間の水素結合によって安定化された立体構造でそれ自体の上に折り返される（図２Ｃ）。ＣＤＲＬ２の構造は無秩序であり、ＣＤＲＬ２が未結合抗体では複数の立体構造をとることができることを示唆している。未結合ＢＧ１８、ＰＧＴ１２１（ＰＤＢ ４ＦＱ１）および１０－１０７４ Ｆａｂ（ＰＤＢ ４ＦＱ２）構造の重ね合わせから、それらのＶＨドメインが、ＢＧ１８のＶＨドメイン上に位置するがＰＧＴ１２１および１０－１０７４ Ｆａｂ構造のＶＬよりも著しく傾いているＣＤＲＨ３を除いて、密接に整列していたことが明らかにされた（図２Ｄ）。ＢＧ１８およびＰＧＴ１２１軽鎖に関する低い配列同一性と一致して（図２Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｄ）、整列したＶＬドメイン（それぞれＢＧ１８－ＰＧＴ１２１およびＢＧ１８－１０－１０７４の重ね合わせでは、軽鎖の比較において９３または９２のＣα原子を重ね合わせることについて３．１Åの平均二乗偏差が見出された）は、すべてのＣＤＲＬループの配向に差があることを示した（図２Ｄ）。これらの差にもかかわらず、ＢＧ１８では、ＰＧＴ１２１および１０－１０７４のＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３との間の裂け目も見られる（図２Ｅ）。この裂け目を裏打ちする残基は、グリコシル化ＰＧＴ１２１ Ｆａｂ構造中の複合型Ｎ－グリカンと相互作用し、ＰＧＴ１２２－ＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ複合体構造（ＰＤＢ ４ＴＶＰ）中のＡｓｎ１３７ｇｐ１２０に結合したＮ－グリカンと相互作用する。ＢＧ１８はＣＤＲＨ３とＣＤＲＬ１／ＣＤＲＬ３との間に第２の裂け目を示し、これらはそれらの抗体の軽鎖上のＣＤＲＨ３の位置のためにＰＧＴ１２１およびそのクローン性関連物では形成することができない（図２Ｅ）。これらの構造的相違に加えて、ＢＧ１８ ＶＨ－ＶＬドメインの静電表面電位は、ＰＧＴ１２１および１０－１０７４の表面電位と比較して、正に帯電したパッチの異なる分布を示す（図７）。まとめると、これらの結果は、ＰＧＴ１２１関連ｂＮＡｂによる認識と比較した、ＥｎｖのＢＧ１８認識における相違と一致する。
【0142】
ＢＧ１８がどのようにＥｎｖを認識するかを検討するために、ＢＧ１８由来のＦａｂおよびＣＤ４ｂｓ ｂＮＡｂ １７９ＮＣ７５と複合体を形成したＢＧ５０５ ＳＯＳＩＰ．６６４三量体の約２５Å分解能のネガティブ染色単一粒子電子顕微鏡（ＥＭ）構造を解明した。ＢＧ１８ Ｆａｂ結晶構造からＥＭマップへの座標の適合により（図２Ｆ）、接近角度とＢＧ１８および他のＡｓｎ３３２ｇｐ１２０－Ｖ３ ｂＮＡｂの潜在的なＥｎｖ相互作用との間の比較が可能になった（図２Ｇ）。ＰＧＴ１２２（ＰＧＴ１２１の変異体）および１０－１０７４と同様に、ＢＧ１８のＣＤＲＨ３は、Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０グリカン、およびｇｐ１２０の３２４ＧＤＩＲ３２７モチーフと相互作用すると予測される。しかし、ＰＧＴ１２２および１０－１０７４が、Ｅｎｖを結合するための類似の接近角度を示すのに対して、ＢＧ１８は、ＰＧＴ１２２およびＰＧＴ１２４に対して３４～４１°だけシフトした異なる角度でＥｎｖ三量体と接触する（図２Ｇ）。
【0143】
特定のＮ結合型グリコシル化部位を欠失したＨＩＶ－１シュードウイルスの集団に対する中和についてＢＧ１８を評価した。結果は、Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０を除いて、Ｖ３ループの基部にあるいずれのグリカンも中和活性に影響を及ぼさなかったことを示した（表１２）。これらのデータと一致して、ＢＧ１８は、位置Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０でオリゴマンノースＮ－グリカンを含有する合成Ｖ３糖ペプチドに優先的に結合し、この位置に結合した複合型Ｎ－グリカンを含有する糖ペプチド、またはｇｐ１２０内の他の潜在的なＮ結合型グリコシル化部位には結合しなかった（図９）。これらのデータは、ＢＧ１８認識特性がＰＧＴ１２１よりも１０－１０７４に類似していることを示唆している。
【0144】
【表12-1】
【0145】
【表12-2】
【0146】
ＮＣ３７
ｇｐ１２０コアに結合したＮＣ３７ Ｆａｂの２．７Å分解能の結晶構造（図１Ｃ）は、ＮＣ３７がＣＤ４ｂｓを認識することを証明した（図８Ａおよび図８Ｂ）。ＮＣ３７ファミリーの一部のメンバーはＶＨ１－２に整列し、他のメンバーはＶＨ１－４６に整列したため、配列のみに基づいて、ＮＣ３７のＶＨがＶＨ１－２またはＶＨ１－４６生殖系列遺伝子に由来していたかどうかを決定することは当初困難であった（表１３）。しかし、構造比較から、ＮＣ３７がＶＨ１－４６由来抗体８ＡＮＣ１３１／１３４と同様の配向および結合角度をとることが明らかにされた（図８Ａおよび図８Ｂ）。結果として、ＮＣ３７がその軽鎖を用いてループＤ残基Ａｓｎ２８０ｇｐ１２０と接触するのに対して、ＶＨ１－２由来抗体、例えばＮＩＨ４５－４６はそれらの重鎖を用いてＡｓｎ２８０ｇｐ１２０と接触する。ＮＣ３７のＣＤＲＨ３は、ｇｐ１２０内部ドメインに向かって伸長し、ＣＤＲＨ３残基Ｔｙｒ１００ＧＨＣとｇｐ１２０内部ドメイン残基Ｌｙｓ９７ｇｐ１２０およびＧｌｕ１０２ｇｐ１２０との間に接触を形成する。ＮＣ３７ Ｆａｂ－ｇｐ１２０複合体をＳＯＳＩＰ三量体構造に重ね合わせると、ＮＣ３７ ＣＤＲＨ３がＥｎｖ三量体内の隣接プロトマーと接触することが示唆される（図８Ｃ）。
ｇｐ１２０コアに結合したＮＣ３７ Ｆａｂの２．７Å分解能の結晶構造（図１Ｃ）は、ＮＣ３７がＣＤ４ｂｓを認識することを証明した（図８Ａおよび図８Ｂ）。ＮＣ３７ファミリーの一部のメンバーはＶＨ１－２に整列し、他のメンバーはＶＨ１－４６に整列したため、配列のみに基づいて、ＮＣ３７のＶＨがＶＨ１－２またはＶＨ１－４６生殖系列遺伝子に由来していたかどうかを決定することは当初困難であった（表１３）。しかし、構造比較から、ＮＣ３７がＶＨ１－４６由来抗体８ＡＮＣ１３１／１３４と同様の配向および結合角度をとることが明らかにされた（図８Ａおよび図８Ｂ）。結果として、ＮＣ３７がその軽鎖を用いてループＤ残基Ａｓｎ２８０ｇｐ１２０と接触するのに対して、ＶＨ１－２由来抗体、例えばＮＩＨ４５－４６はそれらの重鎖を用いてＡｓｎ２８０ｇｐ１２０と接触する。ＮＣ３７のＣＤＲＨ３は、ｇｐ１２０内部ドメインに向かって伸長し、ＣＤＲＨ３残基Ｔｙｒ１００ＧＨＣとｇｐ１２０内部ドメイン残基Ｌｙｓ９７ｇｐ１２０およびＧｌｕ１０２ｇｐ１２０との間に接触を形成する。ＮＣ３７ Ｆａｂ－ｇｐ１２０複合体をＳＯＳＩＰ三量体構造に重ね合わせると、ＮＣ３７ ＣＤＲＨ３がＥｎｖ三量体内の隣接プロトマーと接触することが示唆される（図８Ｃ）。
【0147】
ＮＣ３７が２０１０年に単離されたのに対して、ＢＧ１およびＢＧ１８は２０１４年に採取されたＰＢＭＣから単離された。ＢＧ１およびＢＧ１８に特異的なＰＣＲプライマーを用いて、２０１０年および２０１３年から利用可能なＰＢＭＣを検討した。ＢＧ１転写物が両時点で検出されたのに対して、ＢＧ１８は２０１３年に最初に検出された。これは、ＢＧ１８が２０１０年から２０１３年の間に出現したのに対して、ＢＧ１およびＮＣ３７はそれ以前に発現したことを示している。
【0148】
自己由来中和
自己由来ウイルスに対する３つのｂＮＡｂの効果を検討するために、２００６年～２０１５年の間の５つの異なる時点（２００６年、２０１０年、２０１３年、２０１４年および２０１５年）に得られた単一ゲノム配列決定（ＳＧＳ）によって、循環プラズマウイルス由来の個々のｅｎｖ遺伝子をクローニングした。３７個のみの機能的インフレーム転写物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎ－ｆｒａｍｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）が回収されたが、これは一つには、全時点での４００コピー／ｍＬ未満のウイルス量の値によるものである。さらに、２０１５年から回収された配列はいずれも非機能的であった（図１０）。３７個の機能的配列は、以下の３つのクラスターを形成した－残りの配列と約１５％異なる２００６年に得られた１つの配列を含有するクラスターＡ、４つの時点すべてからの配列を含有する最大のクラスターであるクラスターＢ、およびいずれも２０１４年に得られた３つの配列を含有するクラスターＣ（図３Ａ）。２０１４年に出現した配列の新しいクラスターと一致して、２０１３年から２０１４年の間にウイルス多様性の増加が見られた（図３Ｂ）。
自己由来ウイルスに対する３つのｂＮＡｂの効果を検討するために、２００６年～２０１５年の間の５つの異なる時点（２００６年、２０１０年、２０１３年、２０１４年および２０１５年）に得られた単一ゲノム配列決定（ＳＧＳ）によって、循環プラズマウイルス由来の個々のｅｎｖ遺伝子をクローニングした。３７個のみの機能的インフレーム転写物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎ－ｆｒａｍｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）が回収されたが、これは一つには、全時点での４００コピー／ｍＬ未満のウイルス量の値によるものである。さらに、２０１５年から回収された配列はいずれも非機能的であった（図１０）。３７個の機能的配列は、以下の３つのクラスターを形成した－残りの配列と約１５％異なる２００６年に得られた１つの配列を含有するクラスターＡ、４つの時点すべてからの配列を含有する最大のクラスターであるクラスターＢ、およびいずれも２０１４年に得られた３つの配列を含有するクラスターＣ（図３Ａ）。２０１４年に出現した配列の新しいクラスターと一致して、２０１３年から２０１４年の間にウイルス多様性の増加が見られた（図３Ｂ）。
【0149】
クラスターＣ中の３つの配列がいずれもＡｓｎ３３２ｇｐ１２０にあるＮ結合型グリコシル化部位を変化させる突然変異を含有していたのに対して、他の３４の配列はＡｓｎ３３２ｇｐ１２０に完全なＮ結合型グリコシル化部位を有した（図３Ａ）。さらに、クラスターＣ中の３つの配列はいずれも、他の３４の配列には見られなかったＡｓｐ２８２ｇｐ１２０残基を有した。２８２ｇｐ１２０位は、ロスアラモスデータベース内の全ＨＩＶ－１配列の９４．４％においてＬｙｓを保有し、この位置にあるＡｓｐはＣＤ４ｂｓ抗体に対する耐性と関連する。
【0150】
３つの自己由来ｂＮＡｂに対する機能的Ｅｎｖの感受性を決定するために、シュードウイルスを作製し、ＴＺＭ－ｂｌアッセイで試験した。首尾よく作製された３５のシュードウイルスのうち、４つのみが３つすべてのｂＮＡｂに対して耐性であった。これらは、２０１４年に得られた血漿中および２０１３年に得られた血漿中に見出されたクラスターＣ由来のＥｎｖであった（図３Ｃおよび図１０）。残りの３１のシュードウイルス（全シュードウイルスの８８．５％）は、３つのｂＮＡｂのうちの少なくとも１つに感受性であった。さらに、２００６年、２０１０年および２０１４年に得られたシュードウイルスを、ウイルスのｅｎｖ遺伝子と同じ時点から単離した同時血清ＩｇＧに対するそれらの感受性について試験した（２０１３年に得られた血漿ＩｇＧはこのアッセイには利用できなかった）。結果は、試験した２２のウイルスのうち１９が、同時期のＩｇＧによってなお中和されていたことを示した（図３Ｃおよび図１０）。
【0151】
ＢＧ１８およびＮＣ３７感受性ウイルス、ならびに同時ＩｇＧに感受性のウイルスが、ＢＧ１８およびＮＣ３７が単離された時を含めて、分析したあらゆる時点で見出された（図３Ｄ）。対照的に、２００６年に得られた１つのウイルスを除いて、ほとんどの株はＢＧ１に対して耐性であった。これは、ドナーＥＢ３５４の自己由来ウイルスの大部分はＢＧ１から逃がれたが、ＢＧ１８およびＮＣ３７抗体から逃がれることはできなかったことを示唆し、したがって、ＢＧ１８およびＮＣ３７の広域性および効力を示している。
【0152】
２０１５年に得られた血漿試料からウイルス配列を得ることは不可能であったが、５つのＥＢ３５４ ＣＤ４＋ウイルス増殖培養物（ＶＯＣ）のうち２つからウイルスを増殖させることは可能であった。いずれの場合にも、ｐ２４ ＥＬＩＳＡによって測定されるように、培養物がウイルスに対して陽性になるのに５週間超かかった。両方の２０１５年の増殖培養物由来のＳＧＳ配列は、クラスターＣ由来の配列と密接に密集しており、Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０にＮ結合型グリコシル化部位を欠いていた（図３Ａ）。さらに、配列はいずれもＡｓｐ２８２ｇｐ１２０を示した。これらの知見と一致して、２０１５年に得られた培養上清は、ＴＺＭ－ｂｌアッセイでは３つすべてのｂＮＡｂに対して耐性であった（図３Ｅ）。
【0153】
ＢＧ１８、ＮＣ３７およびＢＧ１のインビボ有効性
ＢＧ１８またはＮＣ３７が独立してインビボでＨＩＶ－１に選択的圧力をかけることができるかどうかを決定するために、ヒト化マウス（ｈｕマウス）をＨＩＶ－１ＹＵ２に感染させ、確立された感染を治療した。ＢＧ１は、ＨＩＶ－１ＹＵ２に対して低い活性を示したため（ＩＣ５０＝１５．８μｇ／ｍＬ）、その後の併用治療実験にのみ使用し、単独療法実験には使用しなかった。１０－１０７４と同様に、それほど強力ではないが依然として有効なクローン変異体であるＢＧ１８またはＢＧ８の投与は、ウイルス量の急速な減少（平均１．５ｌｏｇ１０）、その後のリバウンドウイルス血症と関連していた（図４Ａ、図１１および図１２）。リバウンドウイルス配列はいずれも、Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０のＮ結合型グリコシル化部位を変化させた変異を含有していた（図４Ｂおよび図４Ｃ）。ＮＣ３７による単独療法もウイルス血症を一過性に抑制したが、ウイルス量の減少の大きさは、ＢＧ１８を用いた場合よりも顕著ではなく、平均０．５ｌｏｇ１０であった（図４Ａおよび図１２）。これは、ＢＧ１８およびＮＣ３７がＨＩＶを治療するのに有効であり、ＢＧ１８が最も顕著な効果を有することを示している。ＮＣ３７リバウンドウイルスＥｎｖ配列の大部分は、ＣＤ４ｂｓ抗体に対する耐性と関連するＲ４５６Ｋ突然変異を示した（図４Ｂおよび図４Ｃ）。これはさらに、ｈｕマウスでは、ＢＧ１８およびＮＣ３７がインビボでＨＩＶ－１ＹＵ２抗体耐性変異体を選択することができることを示している。
ＢＧ１８またはＮＣ３７が独立してインビボでＨＩＶ－１に選択的圧力をかけることができるかどうかを決定するために、ヒト化マウス（ｈｕマウス）をＨＩＶ－１ＹＵ２に感染させ、確立された感染を治療した。ＢＧ１は、ＨＩＶ－１ＹＵ２に対して低い活性を示したため（ＩＣ５０＝１５．８μｇ／ｍＬ）、その後の併用治療実験にのみ使用し、単独療法実験には使用しなかった。１０－１０７４と同様に、それほど強力ではないが依然として有効なクローン変異体であるＢＧ１８またはＢＧ８の投与は、ウイルス量の急速な減少（平均１．５ｌｏｇ１０）、その後のリバウンドウイルス血症と関連していた（図４Ａ、図１１および図１２）。リバウンドウイルス配列はいずれも、Ａｓｎ３３２ｇｐ１２０のＮ結合型グリコシル化部位を変化させた変異を含有していた（図４Ｂおよび図４Ｃ）。ＮＣ３７による単独療法もウイルス血症を一過性に抑制したが、ウイルス量の減少の大きさは、ＢＧ１８を用いた場合よりも顕著ではなく、平均０．５ｌｏｇ１０であった（図４Ａおよび図１２）。これは、ＢＧ１８およびＮＣ３７がＨＩＶを治療するのに有効であり、ＢＧ１８が最も顕著な効果を有することを示している。ＮＣ３７リバウンドウイルスＥｎｖ配列の大部分は、ＣＤ４ｂｓ抗体に対する耐性と関連するＲ４５６Ｋ突然変異を示した（図４Ｂおよび図４Ｃ）。これはさらに、ｈｕマウスでは、ＢＧ１８およびＮＣ３７がインビボでＨＩＶ－１ＹＵ２抗体耐性変異体を選択することができることを示している。
【0154】
抗体を組み合わせることにより、ｈｕマウスのＨＩＶ－１ＹＵ２感染を制御することができる。ＢＧ１８、ＮＣ３７およびＢＧ１の組合せがウイルス血症を抑制できるかどうかを決定するために、３つのｂＮＡｂ（ＢＧ１８、ＮＣ３７およびＢＧ１）の１：１：１の組合せを用いて、ＨＩＶ－１ＹＵ２感染ｈｕマウス５匹を治療した。３つのｂＮＡｂの投与直後に、全動物のウイルス量は平均１．７４Ｌｏｇ１０減少し、驚くべきことに、４／５のマウスでは３週間後に実質的に検出不可能なウイルス量が示された（図４Ｄおよび図４Ｅ）。ウイルス血症は１匹のマウスＴ６でのみリバウンドし、治療を中止した後わずか３週間で起こった。残りの４匹のマウスでは、治療終了４週間後であってもウイルス血症が抑制されたか、ウイルス血症が検出不可能であることが顕著に示され続けた（図４Ｄおよび図４Ｅ）。これは、ＮＣ３７、ＢＧ１および特にＢＧ１８を個々にではあるが特に組み合わせて適用するかどうかにかかわらず、これらがインビボでのＨＩＶ－１の持続的抑制および中和において強力であることを示している。
【0155】
【表13】
【0156】
前述の実施例および好ましい実施形態の説明は、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものとしてではなく、例示として解釈されるべきである。容易に理解されるように、特許請求の範囲に記載される本発明から逸脱することなく、上記に記載された特徴の多数の変形例および組合せを利用することができる。そのような変形例は本発明の範囲からの逸脱と見なされるものではなく、そのような変形例はいずれも下記の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。本明細書に引用された参考文献はいずれも、参照によりその全体が組み込まれる。
【図1A-C】
【図1D-F】
【図2A-D】
【図2E-G】
【図3A-E】
【図4A-C】
【図4D-E】
【図5】
【図6A-D】
【図7】
【図8A-C】
【図9A-B】
【図9C-D】
【図9E-F】
【図10】
【図11A-C】
【図12A】
【図12B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-03-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３が、配列番号２～４のそれぞれの配列を含む、および
（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号６～８のそれぞれの配列を含む、単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分。
（ｉｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３が、配列番号６～８のそれぞれの配列を含む、単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項2】
前記重鎖および前記軽鎖が、配列番号１および５のそれぞれの配列を含む、請求項１に記載の単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項3】
前記抗体がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１または２に記載の単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項4】
前記抗体抗原またはその結合部分が組換え作製される、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項5】
請求項１～４いずれか一項に記載の単離された抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分を含む、二重特異性抗体。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＨＩＶ－１抗体もしくはその抗原結合部分、または請求項５に記載の二重特異性抗体をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項8】
請求項７に記載のベクターを含む、培養細胞。
【請求項9】
（ｉ）請求項１～４のいずれか一項に記載の第１の抗ＨＩＶ－１抗体もしくはその抗原結合部分、または請求項５に記載の二重特異性抗体と、（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項10】
前記重鎖および前記軽鎖が、配列番号１および５のそれぞれの配列を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
第２の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分をさらに含む、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
ＨＩＶ－１感染を治療するための薬剤の製造における、第１の請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＨＩＶ－１抗体もしくはその抗原結合部分、もしくは請求項５に記載の二重特異性抗体、または請求項９～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を含む第１の治療剤の使用。
【請求項13】
前記治療が、第２の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
前記第２の治療剤が、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、エントリー阻害剤または融合阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、および第２の抗ＨＩＶ－１抗体またはその抗原結合部分からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＨＩＶ－１抗体もしくはその抗原結合部分、または請求項５に記載の二重特異性抗体を含む、ワクチン組成物。
【請求項16】
前記重鎖および前記軽鎖が、配列番号１および５のそれぞれの配列を含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項17】
ＨＩＶ－１感染を予防するための薬剤の製造における、請求項１５または１６に記載のワクチン組成物の使用。