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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022096815
(43)【公開日】2022-06-30
(54)【発明の名称】抗原ポリペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/195 20060101AFI20220623BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220623BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20220623BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20220623BHJP
【ＦＩ】
C07K14/195 ZNA
G01N33/53 N
G01N33/569 F
C12N15/31
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020210013
(22)【出願日】2020-12-18
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000106324
【氏名又は名称】サンスター株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】安田 多賀子
(72)【発明者】
【氏名】浦川 李花
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA11
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA86
4H045EA50
4H045FA33
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】歯周病原菌に対する抗体との反応性の高い歯周病原菌抗原ポリペプチドの提供。
【解決手段】下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド。
【選択図】なし
【解決手段】下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
【請求項2】
下記の（Ｃ）又は（Ｄ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
【請求項3】
下記の（Ｅ）又は（Ｆ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｆ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
（Ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｆ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
【請求項4】
下記の（Ｇ）又は（Ｈ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｈ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
（Ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｈ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
【請求項5】
下記の（Ｉ）又は（Ｊ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｊ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
（Ｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｊ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
【請求項6】
下記の（Ｋ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｋ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
（Ｋ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
【請求項7】
下記の（Ｌ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｌ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
（Ｌ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
【請求項8】
請求項１～７のいずれかに記載のポリペプチドを含む歯周病原菌抗体価測定用試薬。
【請求項9】
請求項８に記載の歯周病原菌抗体価測定用試薬を含む歯周病原菌抗体価測定用キット。
【請求項10】
生体試料を請求項１～７のいずれかに記載のポリペプチドと接触させることを含む、
該生体試料中の歯周病原菌に対する抗体価を測定する方法。
該生体試料中の歯周病原菌に対する抗体価を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、抗原ポリペプチド及びその応用技術等に関する。
【背景技術】
【0002】
歯周病は、歯周病原菌が歯周組織に感染することによって発症する炎症性疾患である。一般に、歯周病の診断は、歯周ポケット検査、触診・出血検査、動揺度検査、Ｘ線写真検査等の結果を総合して行われているが、これらの検査手法は歯科医師等の経験・技能等に基づいて行われるため、検査結果及び診断結果に差異が生じる可能性があり、客観性に欠くという問題がある。そのため、客観的に歯周病の診断を行う手法の開発が望まれている。
【0003】
客観的に歯周病の診断を行う手法としては、例えば、歯周病原菌に対する血清中のＩｇＧ抗体価を歯周病の感染度又は重篤度の指標とする方法が報告されており、本発明者らが開発した手法では、歯周病原菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）から単離された特定の１次構造を有するポリペプチド又はその改変ポリペプチド（歯周病原菌抗原ポリペプチド）を用いることにより、多様な免疫型を有する広範囲の患者の歯周病を高い精度で検査することができ、かつ自動化された機器等により高速処理を行うことが可能となる（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特許第６３１０６３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本開示は、歯周病原菌に対する抗体との反応性の高い歯周病原菌抗原ポリペプチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、歯周病原菌抗原ポリペプチドのＮ末端にタグを付加することによって歯周病原菌に対する抗体との反応性が向上することを見出し、さらに改良を重ねた。
【0007】
本開示は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項２．
下記の（Ｃ）又は（Ｄ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項３．
下記の（Ｅ）又は（Ｆ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｆ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項４．
下記の（Ｇ）又は（Ｈ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｈ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項５．
下記の（Ｉ）又は（Ｊ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｊ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項６．
下記の（Ｋ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｋ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項７．
下記の（Ｌ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｌ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項８．
項１～７のいずれかに記載のポリペプチドを含む歯周病原菌抗体価測定用試薬。
項９．
項８に記載の歯周病原菌抗体価測定用試薬を含む歯周病原菌抗体価測定用キット。
項１０．
生体試料を項１～７のいずれかに記載のポリペプチドと接触させることを含む、
生体試料中の歯周病原菌に対する抗体価を測定する方法。
項１．
下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項２．
下記の（Ｃ）又は（Ｄ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項３．
下記の（Ｅ）又は（Ｆ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｆ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項４．
下記の（Ｇ）又は（Ｈ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｈ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項５．
下記の（Ｉ）又は（Ｊ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｊ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項６．
下記の（Ｋ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｋ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項７．
下記の（Ｌ）のポリペプチドの、Ｎ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチド。
（Ｌ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列を有し、かつ抗原性を有するポリペプチド
項８．
項１～７のいずれかに記載のポリペプチドを含む歯周病原菌抗体価測定用試薬。
項９．
項８に記載の歯周病原菌抗体価測定用試薬を含む歯周病原菌抗体価測定用キット。
項１０．
生体試料を項１～７のいずれかに記載のポリペプチドと接触させることを含む、
生体試料中の歯周病原菌に対する抗体価を測定する方法。
【発明の効果】
【0008】
歯周病原菌に対する抗体との反応性の高い歯周病原菌抗原ポリペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】ウェスタンブロットの結果を示す。
【図2】陽性血清又は陰性血清を用いた際のドットブロットの結果を示す。
【図3】ＥＬＩＳＡの測定結果を示す。
【図4】陽性血清又は陰性血清を用いた際のＥＬＩＳＡの測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
【0011】
本開示は、（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ａ）のポリペプチド」と表記することがある。
【0012】
また、本開示は、（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｂ）のポリペプチド」と表記することがある。
【0013】
また、本開示は、（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｃ）のポリペプチド」と表記することがある。
配列番号２に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の２２７～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
配列番号２に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の２２７～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
【0014】
また、本開示は、（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｄ）のポリペプチド」と表記することがある。
【0015】
また、本開示は、（Ｅ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｅ）のポリペプチド」と表記することがある。
配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の５８０～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の５８０～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
【0016】
また、本開示は、（Ｆ）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｆ）のポリペプチド」と表記することがある。
【0017】
また、本開示は、（Ｇ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｇ）のポリペプチド」と表記することがある。
配列番号４に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の４０４～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
配列番号４に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の４０４～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
【0018】
また、本開示は、（Ｈ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｈ）のポリペプチド」と表記することがある。
【0019】
また、本開示は、（Ｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｉ）のポリペプチド」と表記することがある。
配列番号５に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の２４～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
配列番号５に示すアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の２４～８６０番目のアミノ酸配列に相当する。
【0020】
また、本開示は、（Ｊ）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｊ）のポリペプチド」と表記することがある。
【0021】
また、本開示は、（Ｋ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｋ）のポリペプチド」と表記することがある。
【0022】
また、本開示は、（Ｌ）配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをも包含する。本明細書において、当該ポリペプチドを、「（Ｌ）のポリペプチド」と表記することがある。
【0023】
（Ｂ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号１に示すアミノ酸配列において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。
【0024】
アミノ酸の欠失、置換、又は付加などの変異を特定のアミノ酸配列に加える技術は当該技術分野において公知であり、任意の手法を用いて行うことができる。例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法、ランダム突然変異導入法等を利用して行うことができる。
【0025】
（Ｂ）のポリペプチドは、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
【0026】
アミノ酸配列の同一性は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルトのパラメータを用いることにより、算出することができる。
【0027】
（Ｄ）のポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号２に示すアミノ酸配列において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。
【0028】
（Ｄ）のポリペプチドは、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
【0029】
また、（Ｄ）のポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のＮ末端側に２２６個以上のアミノ酸の付加を有しないポリペプチドであってもよい。換言すれば、（Ｄ）のポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のＮ末端側にアミノ酸の付加を有する場合、当該付加されたアミノ酸の個数が１～２２５個のポリペプチドであってもよい。当該アミノ酸の個数の上限又は下限は、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、又は２２０個であってもよい。より具体的には、例えば、２～２２０個であってもよい。
【0030】
（Ｆ）のポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号３に示すアミノ酸配列において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。
【0031】
（Ｆ）のポリペプチドは、例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
【0032】
（Ｈ）のポリペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号４に示すアミノ酸配列において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。
【0033】
（Ｈ）のポリペプチドは、例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
【0034】
（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号５に示すアミノ酸配列において、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。
【0035】
（Ｊ）のポリペプチドは、例えば、配列番号５に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。同一性は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってもよい。
【0036】
また、（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列のＮ末端側に２３個以上のアミノ酸の付加を有しないポリペプチドであってもよい。換言すれば、（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号５に示すアミノ酸配列のＮ末端側にアミノ酸の付加を有する場合、当該付加されたアミノ酸の個数が１～２２個のポリペプチドであってもよい。当該アミノ酸の個数の上限又は下限は、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又は２１個であってもよい。より具体的には、例えば、２～２１個であってもよい。
【0037】
（Ｋ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。（Ｋ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位のアミノ酸配列のＮ末端側、又はＣ末端側に１個若しくは２個以上のアミノ酸が付加されていてもよい。付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、６００個、５５０個、５００個、４５０個、４００個、３５０個、３００個、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。
【0038】
（Ｌ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。（Ｌ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位のアミノ酸配列のＮ末端側、又はＣ末端側に１個若しくは２個以上のアミノ酸が付加されていてもよい。付加されたアミノ酸の個数の上限は、例えば、７００個、６５０個、６００個、５５０個、５００個、４５０個、４００個、３５０個、３００個、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個であってもよい。
【0039】
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、及び（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位に相当するアミノ酸配列における、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数が、０～５０個のポリペプチドであることが好ましい。当該範囲の上限又は下限は、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、又は４９個であってもよい。より具体的には、例えば、１～４９個であってもよい。また、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、及び（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第５８０位～第８６０位に相当するアミノ酸配列が保存されていてもよい。
【0040】
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、及び（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位に相当するアミノ酸配列における、欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸の個数が、０～９個のポリペプチドであることが好ましい。当該範囲の上限又は下限は、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、又は８個であってもよい。より具体的には、例えば、１～８個であってもよい。また、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、及び（Ｊ）のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列の第６９８位～第７１８位に相当するアミノ酸配列が保存されていてもよい。
【0041】
本開示のポリペプチドは、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｊ）、（Ｋ）及び（Ｌ）のポリペプチドのＮ末端側にＧＳＴタグが付加されておりかつＣ末端側にはタグが付加されていない構造を有するポリペプチドである。本明細書において、これらのポリペプチドを総称して、「本開示のポリペプチド」と表記することがある。
【0042】
タグを付加する方法としては、特に限定されず、慣用の方法および反応条件を採用することができる。
【0043】
（Ｂ）のポリペプチド、（Ｄ）のポリペプチド、（Ｆ）のポリペプチド、（Ｈ）のポリペプチド、（Ｊ）のポリペプチド、（Ｋ）及び（Ｌ）のポリペプチドは、抗原性を有することが好ましい。
【0044】
本明細書において、「抗原性を有する」とは、歯周病原菌に対する抗体と、抗原抗体反応することを意味する。抗体としては、例えば、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体等のイムノグロブリン抗体が挙げられ、イムノグロブリン抗体のいずれかと抗原抗体反応すればよい。中でもＩｇＧ抗体が好ましい。
【0045】
抗原性は、ＥＬＩＳＡ法により評価することができる。より具体的には、後述する実施例に示すように、抗原性を評価するポリペプチドを抗原、歯周病原菌に対する抗体を含む歯周病患者の陽性血清を１次抗体として、これらの抗原抗体反応がＥＬＩＳＡ法により検出された場合には、当該ポリペプチドは抗原性を有すると判断される。
【0046】
本開示のポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、又は５に示すアミノ酸配列の情報に基づいて、一般的なタンパク質の化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することができる。また、上述したポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用して、遺伝子工学的な手法で製造することができる。
【0047】
本開示のポリペプチドは、さらに、標識物質を有していてもよい。標識物質としては、例えば、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ビオチン、金コロイド、ラテックスビーズなどが挙げられる。
【0048】
本開示は、本開示のポリペプチドを含む歯周病原菌抗体価測定用試薬をも包含する。本明細書において、当該試薬を、「本開示の試薬」と表記することがある。
【0049】
本開示の試薬は、本開示のポリペプチドの他、他の成分を含有してもよい。他の成分としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ Ｂｕｆｆｅｒなどの溶媒；カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤；亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤などが挙げられる。
【0050】
本開示は、本開示のポリペプチドを含む歯周病原菌抗体価測定用試薬を含む歯周病原菌抗体価測定キットをも包含する。本明細書において、当該キットを、「本開示のキット」と表記することがある。
【0051】
当該キットには、本開示の試薬の他、必要に応じてその他の試薬、器具等が含まれていてもよい。例えば、ブロッキング液、洗浄液、標識物質を含む抗体、基質液（発色・蛍光・発光）などが挙げられる。また、当該キットは、本開示の試薬の他、ブロッキング液、洗浄液、標識物質を含む抗体、基質液（発色・蛍光・発光）などを含む部材（メンブレン等）等を含むものであってもよい。
【0052】
本開示は、生体試料を本開示のポリペプチドと接触させることを含む、該生体試料中の歯周病原菌に対する抗体価を測定する方法をも包含する。本明細書において、当該測定方法を、「本開示の測定方法」と表記することがある。
【0053】
生体試料としては、特に限定されず、例えば、歯周病原菌に対する抗体（例えば、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体等）を含み得る試料が挙げられる。採取の容易さ、取扱い易さ等の観点からは、生体試料としては、血液、唾液、歯肉溝滲出液、糞便、涙液、鼻腔ぬぐい液、又は羊水が好ましい。また、歯周病原菌に対する抗体を含み得る試料としては、肝臓などの臓器を用いることもできる。
血液を生体試料として用いる場合には、血漿又は血清がより好ましく、血清がさらにより好ましい。血漿を生体試料として用いる場合には、ろ紙や血漿分離機等により分離された血漿であってもよい。なお、対象から採取した生体試料を保存する方法、条件等については特に制限されず、常法に従って行うことができる。
血液を生体試料として用いる場合には、血漿又は血清がより好ましく、血清がさらにより好ましい。血漿を生体試料として用いる場合には、ろ紙や血漿分離機等により分離された血漿であってもよい。なお、対象から採取した生体試料を保存する方法、条件等については特に制限されず、常法に従って行うことができる。
【0054】
生体試料を採取される対象としては、ヒトのみならず、歯周病原菌の感染が起こり得る生体であれば特に制限されず、非ヒト哺乳動物であってもよい。ヒトとしては特に制限されず、健常者であってもよく、歯周病に罹患したヒト（歯周病患者）であってもよく、歯周病の罹患が疑われるヒトであってもよい。歯周病または歯周病原菌との関連性のある疾患（例えば、関節リウマチ、心疾患、動脈硬化性疾患、糖尿病、認知症、非アルコール性脂肪肝（NASH/NAFLD）、肥満、早産など）を有するヒトやその疑いがあるヒトであってもよい。また、非ヒト哺乳動物としては、ペット、家畜、実験動物等として飼育される哺乳動物が例示される。例えば、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ、リャマ等が挙げられる。
【0055】
対象から生体試料を採取する方法としては特に制限されず、常法に従って行えばよい。また、採取した生体試料は、そのまま用いてもよく、凍結乾燥等して保存した後、当該凍結乾燥物を後述する適当な溶媒に溶解して用いてもよく、また、採取した生体試料を、そのまま冷凍保存した後、あるいは後述する適当な溶媒に溶解する等して冷凍保存した後、使用時に解凍して用いてもよい。
【0056】
生体試料を溶解させる溶媒としては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ Ｂｕｆｆｅｒなどが挙げられる。これらの溶媒は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤；亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤などを含むものであってもよい。
【0057】
本開示の測定方法によれば、本開示のポリペプチドと生体試料とを接触させることにより、生体試料中に存在する歯周病原菌に対する抗体（例えば、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体等）を、本開示のポリペプチドとの抗原抗体反応を利用して検出することができる。
【0058】
本開示の測定方法は、さらに、生体試料を本開示のポリペプチドと接触させることにより生じる生体試料中に存在する歯周病原菌に対する抗体と本開示のポリペプチドとの抗原抗体反応物（抗体及び本開示のポリペプチドを含む複合体）を検出する工程を含んでいてもよい。
【0059】
抗原抗体反応物を検出する方法は、特に限定されず、慣用の方法および反応条件を採用することができる。例えば、当該抗原抗体反応物に、標識物質を含む抗イムノグロブリン抗体（例えば、抗ＩｇＧ抗体等）を接触させ当該標識物質を検出する方法や、本開示のポリペプチドが標識物質を含む場合、当該標識物質を検出する方法などが挙げられる。
【0060】
本開示の測定方法は、必要に応じて、例えば、抗原の固相への固定化工程、洗浄工程、ブロッキング工程、基質反応工程などを含んでいてもよい。これらは、慣用の方法および反応条件を採用することができる。
【0061】
本開示の測定方法は、ＥＬＩＳＡ法やドットブロット法、イムノクロマト法などの免疫学的手法が好ましく用いられる。
【0062】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
【0063】
また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例0064】
本開示の内容を以下の実験例を用いて具体的に説明する。しかし、本開示はこれらに何ら限定されるものではない。下記において、特に言及する場合を除いて、実験は大気圧及び常温条件下で行っている。また特に言及する場合を除いて、「％」は「重量％」を意味する。
【0065】
実験例１：SDS-PAGEとウェスタンブロット
N末端側あるいはC末端側にGSTタグが付いた35Nタンパク質（配列番号１）をSDS-PAGEに付した。タグの付加場所が異なる二つのタンパク質を同じ濃度に調整し、熱変性させた後、2枚のポリアクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行なった。メンブレンに転写し、それぞれ抗GST抗体と陽性血清でウエスタンブロットを行った。転写したメンブレンを5%スキムミルクを含むTBSにてブロッキングした。3%スキムミルクを含むTBS によって2,500－5,000倍に希釈した抗体溶液（抗GSTポリクロ―ナル抗体（Bethyl社）または陽性血清（歯周病患者の血清））を添加し、室温にて2時間反応させた。0.05%(v/v) Tween20を含むTBSにて3回洗浄した後、3%スキムミルクを含むTBS によって5,000倍に希釈したHRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体反応液（MILLIPORE）またはHRP結合ヤギ抗ヒトIgG抗体反応液を添加し、室温で1時間反応させた。3回洗浄した後、4-Methyl-1 Naphtol 発色溶液を加え、室温で30分間反応させた。ImageQuant LAS4000 mini(GEヘルスケア)を用いてメンブレンの画像をスキャンし、各バンドのシグナル値を求めた。それぞれ、N末端側にGSTタグが付いた35Nタンパク質のバンド強度を100としたときの相対値を図１に示す。
N末端側あるいはC末端側にGSTタグが付いた35Nタンパク質（配列番号１）をSDS-PAGEに付した。タグの付加場所が異なる二つのタンパク質を同じ濃度に調整し、熱変性させた後、2枚のポリアクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行なった。メンブレンに転写し、それぞれ抗GST抗体と陽性血清でウエスタンブロットを行った。転写したメンブレンを5%スキムミルクを含むTBSにてブロッキングした。3%スキムミルクを含むTBS によって2,500－5,000倍に希釈した抗体溶液（抗GSTポリクロ―ナル抗体（Bethyl社）または陽性血清（歯周病患者の血清））を添加し、室温にて2時間反応させた。0.05%(v/v) Tween20を含むTBSにて3回洗浄した後、3%スキムミルクを含むTBS によって5,000倍に希釈したHRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体反応液（MILLIPORE）またはHRP結合ヤギ抗ヒトIgG抗体反応液を添加し、室温で1時間反応させた。3回洗浄した後、4-Methyl-1 Naphtol 発色溶液を加え、室温で30分間反応させた。ImageQuant LAS4000 mini(GEヘルスケア)を用いてメンブレンの画像をスキャンし、各バンドのシグナル値を求めた。それぞれ、N末端側にGSTタグが付いた35Nタンパク質のバンド強度を100としたときの相対値を図１に示す。
【0066】
図１に示す通り、抗GST抗体を用いた場合の反応性は同程度であるにもかかわらず、陽性血清（歯周病患者の血清）を用いた場合には、C末端側にGSTタグが付いた35Nタンパク質と比較して、N末端側にGSTタグが付いた35Nタンパク質は反応性が高いことが分かった。
【0067】
実験例２：ドットブロット
N末端にHisタグあるいはGSTタグのついた35Nタンパク質をドットブロットに付した。35N（GSTタグ）のタンパク質の量は50ngとし、35N（Hisタグ）のタンパク質は同等のモル数となるよう調製した。ドットブロットした後、ブロッキング溶液（Takara Western BloT blocking buffer）で振とうした後、Tween20(0.05％(v/v))を含むTBSで振とうした。5,000倍に希釈した陽性血清（歯周病患者の血清）あるいは陰性血清（健常者の血清）を添加し、4℃で一晩振とうした。Tween20(0.05％(v/v))を含むTBSで洗浄した後、80,000倍に希釈した、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG抗体反応液（MILLIPORE）を添加し室温で1時間反応させた。Tween20(0.05％(v/v))を含むTBSで洗浄した後、HRP検出試薬のPierce ECL substrate (Thermo Fisher)を添加した。ImageQuant LAS4000 mini(GEヘルスケア)を用いてメンブレンの画像をスキャンし、ドットのシグナル値を求めた。なお、陽性血清及び陰性血清については、由来の異なる２種の血清を用いた。バンド強度を図２に示す。
N末端にHisタグあるいはGSTタグのついた35Nタンパク質をドットブロットに付した。35N（GSTタグ）のタンパク質の量は50ngとし、35N（Hisタグ）のタンパク質は同等のモル数となるよう調製した。ドットブロットした後、ブロッキング溶液（Takara Western BloT blocking buffer）で振とうした後、Tween20(0.05％(v/v))を含むTBSで振とうした。5,000倍に希釈した陽性血清（歯周病患者の血清）あるいは陰性血清（健常者の血清）を添加し、4℃で一晩振とうした。Tween20(0.05％(v/v))を含むTBSで洗浄した後、80,000倍に希釈した、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG抗体反応液（MILLIPORE）を添加し室温で1時間反応させた。Tween20(0.05％(v/v))を含むTBSで洗浄した後、HRP検出試薬のPierce ECL substrate (Thermo Fisher)を添加した。ImageQuant LAS4000 mini(GEヘルスケア)を用いてメンブレンの画像をスキャンし、ドットのシグナル値を求めた。なお、陽性血清及び陰性血清については、由来の異なる２種の血清を用いた。バンド強度を図２に示す。
【0068】
図２に示す通り、いずれの陽性血清を用いた場合でも、Hisタグを用いた場合と比較して、GSTタグを用いた場合に、反応性が高いことが分かった。
【0069】
実験例３：ELISA
以下の4種の抗原タンパク質をELISAに付した。なお、抗原タンパク質としては、各配列番号に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドについて、Ｎ末端側にＧＳＴタグを有し、Ｃ末端側にはタグを含まないもの（No.9、11、13、15）及びＮ末端側にＧＳＴタグを有し、かつＣ末端側にＳＢＰタグを有するもの（No.10、12、14、16）を使用した。
No. 9、10（配列番号２）（35Nにおける227～860番目のアミノ酸に相当）
No. 11、12（配列番号３）（35Nにおける580～860番目のアミノ酸に相当）
No. 13、14（配列番号４）（35Nにおける404～860番目のアミノ酸に相当）
No. 15、16（配列番号５）（35Nにおける24～860番目のアミノ酸に相当）
以下の4種の抗原タンパク質をELISAに付した。なお、抗原タンパク質としては、各配列番号に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドについて、Ｎ末端側にＧＳＴタグを有し、Ｃ末端側にはタグを含まないもの（No.9、11、13、15）及びＮ末端側にＧＳＴタグを有し、かつＣ末端側にＳＢＰタグを有するもの（No.10、12、14、16）を使用した。
No. 9、10（配列番号２）（35Nにおける227～860番目のアミノ酸に相当）
No. 11、12（配列番号３）（35Nにおける580～860番目のアミノ酸に相当）
No. 13、14（配列番号４）（35Nにおける404～860番目のアミノ酸に相当）
No. 15、16（配列番号５）（35Nにおける24～860番目のアミノ酸に相当）
【0070】
抗原タンパク質の量は35Nを0.5ng/100μlに調製した場合と同等のモル数となるように調製した。
【0071】
Glutathione を固相した96wellプレートをTween20（0.1%(v/v)）を含むPBSにて3回洗浄した後、調製したタンパク溶液100μlを添加し室温で1時間反応させた。Tween20（0.1%）を含むPBSにて3回洗浄した後、620倍に希釈した陽性血清を100μl添加し室温で1時間反応させた。Tween20（0.1%(v/v)）を含むPBSにて3回洗浄した後、2000倍に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、HRP）結合ヤギ抗ヒトIgG抗体反応液（MILLIPORE）を100ｍμl添加し室温で反応させた。Tween20（0.1%(v/v)）を含むPBSにて3回洗浄した後、発色基質のABTS150μlを添加し、室温で反応させた後、プレートリーダーを用いて405nmの吸光度を測定した。結果を図３に示す。
【0072】
図３に示す通り、いずれの抗原タンパク質を用いた場合でも、Ｎ末端側にＧＳＴタグを有し、かつＣ末端側にＳＢＰタグを有するものと比較して、Ｎ末端側にＧＳＴタグを有し、Ｃ末端側にはタグを含まないものを用いた場合に、陽性血清との反応性が高いことが分かった。
【0073】
実験例４：ELISA
実験例３と同様の方法により、以下の3種の抗原タンパク質をELISAに付した。なお、いずれの抗原タンパク質もＮ末端側にＧＳＴタグを有し、Ｃ末端側にはタグを含まないものを使用した。
35N（配列番号１）
No. 4（配列番号６）（35Nにおける31～697番目のアミノ酸に相当）
No. 18（配列番号７）（35Nにおける719～860番目のアミノ酸に相当）
また、陽性血清（歯周病患者の血清）に代えて、陰性血清（健常者の血清）を用いて、同様にELISAに供し、吸光度を測定した。結果を図４に示す。
実験例３と同様の方法により、以下の3種の抗原タンパク質をELISAに付した。なお、いずれの抗原タンパク質もＮ末端側にＧＳＴタグを有し、Ｃ末端側にはタグを含まないものを使用した。
35N（配列番号１）
No. 4（配列番号６）（35Nにおける31～697番目のアミノ酸に相当）
No. 18（配列番号７）（35Nにおける719～860番目のアミノ酸に相当）
また、陽性血清（歯周病患者の血清）に代えて、陰性血清（健常者の血清）を用いて、同様にELISAに供し、吸光度を測定した。結果を図４に示す。
【0074】
No. 4（配列番号６）のタンパク質は、陽性血清との反応性が低く、No. 18（配列番号７）のタンパク質は、陰性血清とも反応していることが示唆された。以上のことから、No. 7、No. 8のタンパク質に共通する配列（35N（配列番号１）における580～860）の中でも、特に35Nにおける698～718配列にエピトープが含まれることが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】