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特開2022-97481遺伝子調節システムを有する合成染色体の作成方法及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022097481
(43)【公開日】2022-06-30
(54)【発明の名称】遺伝子調節システムを有する合成染色体の作成方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220623BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z
【審査請求】有
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022055348
(22)【出願日】2022-03-30
(62)【分割の表示】P 2018554010の分割
【原出願日】2017-04-12
(31)【優先権主張番号】62/321,720
(32)【優先日】2016-04-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】518447588
【氏名又は名称】キャリージーンズ バイオエンジニアリング
【氏名又は名称原語表記】ＣａｒｒｙＧｅｎｅｓ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】パーキンス、エドワード
(72)【発明者】
【氏名】グリーン、エイミー
(57)【要約】
【課題】複合的な生物学的発現制御システムを構築可能な方法及び組成物を提供する。
【解決手段】本発明は、受容細胞において合成染色体を用いて複数の遺伝子調節性構成要素の制御下にある複数の遺伝子を送達し、発現させることを可能にする組成物及び方法を包含する。複数の遺伝子制御単位を含むように合成染色体を操作することにより、複合的な生物学的回路を構築することができる。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、受容細胞において合成染色体を用いて複数の遺伝子調節性構成要素の制御下にある複数の遺伝子を送達し、発現させることを可能にする組成物及び方法を包含する。複数の遺伝子制御単位を含むように合成染色体を操作することにより、複合的な生物学的回路を構築することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの部位特異的組込みカセットを有する生物学的回路を含むように操作された哺乳類合成染色体であって、
前記回路が、第１の標的核酸の発現を制御する第１の調節性制御システムを含み、
前記第１の標的核酸から発現される遺伝子産物が、第２の調節性制御システムの発現制御下にある第２の標的核酸の発現を調節する、哺乳類合成染色体。
前記回路が、第１の標的核酸の発現を制御する第１の調節性制御システムを含み、
前記第１の標的核酸から発現される遺伝子産物が、第２の調節性制御システムの発現制御下にある第２の標的核酸の発現を調節する、哺乳類合成染色体。
【請求項2】
前記第１の標的核酸の前記遺伝子産物が、前記第２の標的核酸の転写を誘導する、請求項１に記載の哺乳類合成染色体。
【請求項3】
前記第１の標的核酸の前記遺伝子産物が、前記第２の標的核酸の転写を抑制する、請求項１に記載の哺乳類合成染色体。
【請求項4】
少なくとも第１または第２の遺伝子産物が、転写制御または翻訳制御を介して第３の標的核酸の発現を調節する、請求項１に記載の哺乳類合成染色体。
【請求項5】
（ｉ）前記第１および第２の遺伝子産物の両方が、第３の調節性制御システムを介した前記第３の標的核酸の転写の調節に必要である、または、
（ｉｉ）前記第１または第２の遺伝子産物のいずれかが、前記第３の標的核酸の転写を調節する、
請求項４に記載の哺乳類合成染色体。
（ｉｉ）前記第１または第２の遺伝子産物のいずれかが、前記第３の標的核酸の転写を調節する、
請求項４に記載の哺乳類合成染色体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の分野は、合成染色体を操作して複数の遺伝子調節性構成要素の制御下にある複数の遺伝子の送達を可能にする方法を包含する。
【背景技術】
【0002】
以下の考察では、背景及び導入として特定の物及び方法が記載される。本明細書に含まれるいかなる事項も、先行技術の「承認」と解釈されてはならない。本出願人は、適宜、本明細書で参照されるそれらの物及び方法が適用法規条項に基づく先行技術をなすものではないことを立証する権利を明示的に留保する。
【0003】
植物及び動物の両方の細胞において遺伝子を制御下で発現させるため、幾つもの遺伝子調節制御システムが開発されている。このようなシステムには、テトラサイクリン制御性転写活性化システム（Ｔｅｔ－Ｏｎ／Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州パロアルト）；非特許文献１）、Ｌａｃスイッチ誘導性システム（非特許文献２；非特許文献３；特許文献１）、エクジソン誘導性遺伝子発現システム（非特許文献４）、クマート（ｃｕｍａｔｅ）遺伝子スイッチシステム（非特許文献５）、及びタモキシフェン誘導性遺伝子発現（非特許文献６）などが含まれる。これらの制御システムの目標は、インビトロ実験及びインビボ実験の両方に向けたタンパク質の調節可能な作製である。しかしながら、これらのシステムの個々の適用は本質的に「１回限り（ｏｎｅ－ｏｆｆ）」であり、即ち、単一の制御システム下にある単一の遺伝子では、種々の論理制御機構を備えた複合的な生物学的回路を構築することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】米国特許第４，８３３，０８０号明細書
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】ブジャード（Ｂｕｊａｒｄ）及びゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第８９巻、第１２号、ｐ．５５４７～５５５１、１９９２年
【非特許文献2】ワイボルスキ（Ｗｙｂｏｒｓｋｉ）ら著、エンバイアロンメンタル・アンド・モレキュラー・ミュータジェネシス（Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｏｌ Ｍｕｔａｇｅｎ）、第２８巻、第４号、ｐ．４４７～５８、１９９６年
【非特許文献3】デュクール（ＤｕＣｏｅｕｒ）ら著、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）、第５巻、第３号、ｐ．７０～７２、１９９２年
【非特許文献4】ノー（Ｎｏ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第９３巻、第８号、ｐ．３３４６～３３５１、１９９６年
【非特許文献5】ミュリック（Ｍｕｌｌｉｃｋ）ら著、ビー・エム・シー・バイオテクノロジー（ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第６巻、ｐ．４３、２００６年
【非特許文献6】チャン（Ｚｈａｎｇ）ら著、ヌクレイック・アシッド・リサ－チ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２４巻、ｐ．５４３～５４８、１９９６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
完全に機能的な哺乳類合成染色体を作成可能であるということは、遺伝的障害を細胞ベースで修正し、及び生物学的経路を作製する強力なシステムを意味する。完全に機能的な哺乳類合成染色体は、細菌ベース及びウイルスベースの送達システムと比べて、ペイロードサイズの増加、染色体外に維持されるため宿主細胞破壊の可能性が回避されること、導入された遺伝子の転写サイレンシング及び免疫学的合併症の可能性の回避を含め、幾つかの利点をもたらし、及び哺乳類合成染色体は、その合成染色体を挿入しようとする種から誘導し、それに合わせて作ることができる。合成染色体は複数の部位特異的組込み部位を含むように操作することができ、且つ大型のペイロードを運ぶことができるため、合成染色体は、複数の遺伝子制御システムを載せることのできるポータブルな生物学的回路基板を作り上げる機会を提供する。当該技術分野では、複合的な生物学的発現制御システムを構築可能であることが求められている。本発明は、この必要性に応える方法及び組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本概要は、以下で詳細な説明に更に説明する概念のうちの選ばれた幾つかを簡潔な形で紹介するため提供される。本概要は、特許請求される主題の主要な又は必須の特徴を特定しようと意図するものではなく、また特許請求される主題の範囲を限定するために用いられることを意図するものでもない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性、及び利点は、添付の図面に例示される、且つ添付の特許請求の範囲に定義される態様を含め、以下の記載の詳細な説明から明らかであろう。
【0008】
一部の実施形態において、本発明は、各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも２つの標的核酸によって受容細胞を操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）方法を提供し、この方法は、標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を含む第１の送達ベクターを第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；合成プラットフォーム染色体と第１の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ；第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を発現する合成染色体を含む第２の受容細胞を単離するステップ；第２の受容細胞を成長させるステップ；第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸を含む第２の送達ベクターを第２の受容細胞にトランスフェクトするステップ；合成プラットフォーム染色体と第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸と第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；及び第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸と第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸とを発現する合成染色体を含む第３の受容細胞を単離するステップを含む。
【0009】
この実施形態の一部の態様において、本方法は、第１及び第２の調節性制御システムによって第１及び第２の標的核酸の転写を誘導するステップを更に含む。
本発明の更に他の実施形態は、各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも２つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法を提供し、この方法は、標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を含む第１の送達ベクターを第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、第１の標的核酸の遺伝子産物が第２の標的核酸の転写を調節するステップ；合成プラットフォーム染色体と第１の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ；第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を発現する合成染色体を含む第２の受容細胞を単離するステップ；第２の受容細胞を成長させるステップ；第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸を含む第２の送達ベクターを第２の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、第２の調節性制御システムが第１の標的核酸の遺伝子産物によって調節されるステップ；合成プラットフォーム染色体と第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸と第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸と第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸とを発現する合成染色体を含む第３の受容細胞を単離するステップ；第１の遺伝子産物が作製されるように第１の調節性制御システムによって第１の標的核酸の転写を誘導するステップ；及び第１の遺伝子産物によって第２の標的核酸の転写を調節するステップを含む。
本発明の更に他の実施形態は、各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも２つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法を提供し、この方法は、標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を含む第１の送達ベクターを第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、第１の標的核酸の遺伝子産物が第２の標的核酸の転写を調節するステップ；合成プラットフォーム染色体と第１の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ；第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を発現する合成染色体を含む第２の受容細胞を単離するステップ；第２の受容細胞を成長させるステップ；第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸を含む第２の送達ベクターを第２の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、第２の調節性制御システムが第１の標的核酸の遺伝子産物によって調節されるステップ；合成プラットフォーム染色体と第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸と第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸と第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸とを発現する合成染色体を含む第３の受容細胞を単離するステップ；第１の遺伝子産物が作製されるように第１の調節性制御システムによって第１の標的核酸の転写を誘導するステップ；及び第１の遺伝子産物によって第２の標的核酸の転写を調節するステップを含む。
【0010】
この実施形態の一部の態様では、第１の標的核酸の遺伝子産物が第２の標的核酸の転写を誘導し；及び一部の実施形態では、第１の標的核酸の遺伝子産物が第２の標的核酸の転写を抑制する。
【0011】
本発明の更に他の実施形態は、各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも３つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法を提供し、この方法は、標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を含む第１の送達ベクターを第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、第１の標的核酸の遺伝子産物が第３の標的核酸の転写を調節するステップ；合成プラットフォーム染色体と第１の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ；第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を発現する合成染色体を含む第２の受容細胞を単離するステップ；第２の受容細胞を成長させるステップ；第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸を含む第２の送達ベクターを第２の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、第２の標的核酸の遺伝子産物が第３の標的核酸の転写を調節するステップ；合成プラットフォーム染色体と第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸と第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸と第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸とを発現する合成染色体を含む第３の受容細胞を単離するステップ；第３の受容細胞を成長させるステップ；第３の調節性制御システムの制御下にある第３の標的核酸を含む第３の送達ベクターを第３の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、第１及び第２の標的核酸の遺伝子産物が第３の調節性制御システムによる第３の標的核酸の転写を調節するステップ；合成プラットフォーム染色体と第３の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第３の調節性制御システムの制御下にある第３の標的核酸が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸と第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸と第３の調節性制御システムの制御下にある第３の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；第１及び第２の遺伝子産物が作製されるように第１及び第２の調節性制御システムによって第１及び第２の標的核酸の転写を誘導するステップ；及び第１及び第２の遺伝子産物によって第３の標的核酸の転写を調節するステップを含む。
【0012】
この実施形態の態様では、第１及び第２の遺伝子産物の両方が第３の標的核酸の転写の調節に必要であり；及び他の実施形態では、第１又は第２の遺伝子産物のいずれかが第３の標的核酸の転写を調節する。一部の実施形態では、第３の標的核酸の調節は第３の標的核酸の転写を誘導することであり、及び他の実施形態では、第３の標的核酸の調節は第３の標的核酸の転写を抑制することである。
【0013】
全ての実施形態の特定の態様において、第１及び／又は第２の調節性制御システムは、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、Ｌａｃスイッチ誘導性、エクジソン誘導性、クマート遺伝子スイッチ又はタモキシフェン誘導性システムから選択され得る。
【0014】
加えて、全ての実施形態の態様に、第１；第１及び第２；及び／又は第１、第２及び第３の標的核酸を含む合成染色体；並びに第１；第１及び第２；及び第１、第２及び第３の標的核酸がロードされる合成染色体を含む単離細胞が含まれる。
【0015】
詳細な説明に本発明の上記及び他の態様及び使用を説明する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】図１Ａは、本発明の方法の一実施形態の簡略化した概略図であり、ここでは遺伝子１及び遺伝子２が異なる遺伝子調節制御システムの制御下にある。図１Ｂは、本発明の方法の実施形態の簡略化した概略図であり、ここでは誘導因子が変わると作られる遺伝子産物間の切り換えがある。
【図2】本発明の方法の代替的実施形態の簡略化した概略図であり、ここでは遺伝子１が遺伝子調節制御システムの制御下にあり、遺伝子２の発現が遺伝子１の遺伝子産物によって誘導される。
【図3】本発明の方法の別の代替的実施形態の簡略化した概略図であり、ここでは遺伝子１が遺伝子調節制御システムの制御下にあり、遺伝子２の発現が遺伝子１の遺伝子産物によって抑制される。
【図4】本発明の方法の更に別の実施形態の簡略化した概略図であり、ここでは遺伝子１及び遺伝子２が異なる遺伝子調節制御システムの制御下にあり、遺伝子３が遺伝子１及び２の遺伝子産物の組み合わせによって誘導される。
【図5】本発明の方法の更に別の実施形態の簡略化した概略図であり、ここでは遺伝子１及び遺伝子２が異なる遺伝子調節制御システムの制御下にあり、遺伝子３が遺伝子１の遺伝子産物又は遺伝子２の遺伝子産物によって誘導される。
【図6】ＴＥＴ調節因子送達ベクターの簡略化した概略図。
【図7】クマート調節因子送達ベクターの簡略化した概略図。
【図8】合成染色体へのｓｃＦＶ多重調節可能発現ベクターのローディングの簡略化した概略図。
【図9】多重調節可能（ｍｕｌｉｔｒｅｇｕｌａｂｌｅ）ｓｃＦｖ発現送達ベクターの簡略化した概略図。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本明細書に記載される方法は、特に指示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、及び細胞工学技術の従来技術及び記載を用いることもあり、それらは全て当業者の技能の範囲内にある。かかる従来技術には、オリゴヌクレオチド合成、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及びライゲーション、細胞の形質転換及び形質導入、組換えシステムの操作、トランスジェニック動物及び植物の作出、及びヒト遺伝子療法が含まれる。好適な技法の具体的な例示については、本明細書の例を参照することができる。しかしながら、当然ながら、等価な従来手順を用いることもできる。かかる従来技術及び記載は、「ゲノム解析：実験マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ）」、第Ｉ～ＩＶ巻、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら編、１９９９年；「遺伝的変異：実験マニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）ら編、２００７年；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、「分子クローニング：実験マニュアルからの要約プロトコル（Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、２００６年；及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、２００２年（全てコールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）発行）；「タンパク質方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、ボラグ（Ｂｏｌｌａｇ）ら著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９６年；「遺伝子療法用の非ウイルスベクター（Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９９９年；「ウイルスベクター（Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ）」、カプリフト（Ｋａｐｌｉｆｔ）及びローウィ（Ｌｏｅｗｙ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９９５年；「免疫学方法マニュアル（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ）」、レフコビッツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９９７年；「遺伝子療法テクニック、研究室から臨床への応用及び規制（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ Ｆｒｏｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ）」、ミーガ（Ｍｅａｇｅｒ）編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９９年；Ｍ・ジャッカ（Ｍ．Ｇｉａｃｃａ）著、「遺伝子療法（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、２０１０年；「遺伝子療法プロトコル（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、レドゥー（ＬｅＤｏｕｘ）編、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、２００８年；「細胞及び組織培養：バイオテクノロジーにおける実験室手順（Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、ドイル（Ｄｏｙｌｅ）及びグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９８年；「哺乳類染色体エンジニアリング－方法及びプロトコル（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、Ｇ・ハドラツキー（Ｇ．Ｈａｄｌａｃｚｋｙ）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、２０１１年；「基本的幹細胞方法（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、ランツァ（Ｌａｎｚａ）及びクリマンスカヤ（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、２０１１年；「幹細胞療法：臨床供与のクオリティ及び安全性の確保に向けた好機：合同ワークショップ要旨（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｅｎｓｕｒｉｎｇ
ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｆｆｅｒｉｎｇｓ：Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ａ Ｊｏｉｎｔ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）」、ヘルスサイエンス政策委員会（Ｂｏａｒｄ ｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｏｌｉｃｙ）、ナショナル・アカデミー・プレス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ）、２０１４年；「幹細胞生物学の基礎（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、ランツァ（Ｌａｎｚａ）及びアタラ（Ａｔａｌａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、２０１３年；及び「幹細胞ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）」、アタラ（Ａｔａｌａ）及びランツァ（Ｌａｎｚａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、２０１２年（これらは全て、本明細書においてあらゆる目的から全体として参照により援用される）などの標準的な実験マニュアルに見出すことができる。本組成物、研究ツール及び方法を説明する前に、本発明は記載される特定の方法、組成物、標的及び使用に限定されず、従って当然ながら異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の態様を説明するために過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されるべきである。
ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｆｆｅｒｉｎｇｓ：Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ａ Ｊｏｉｎｔ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）」、ヘルスサイエンス政策委員会（Ｂｏａｒｄ ｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｏｌｉｃｙ）、ナショナル・アカデミー・プレス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ）、２０１４年；「幹細胞生物学の基礎（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｓｔｅｍ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、ランツァ（Ｌａｎｚａ）及びアタラ（Ａｔａｌａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、２０１３年；及び「幹細胞ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）」、アタラ（Ａｔａｌａ）及びランツァ（Ｌａｎｚａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、２０１２年（これらは全て、本明細書においてあらゆる目的から全体として参照により援用される）などの標準的な実験マニュアルに見出すことができる。本組成物、研究ツール及び方法を説明する前に、本発明は記載される特定の方法、組成物、標的及び使用に限定されず、従って当然ながら異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の態様を説明するために過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されるべきである。
【0018】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含むことに留意されたい。従って、例えば「組成物（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」と言うとき、それは１つの組成物又は組成物の混合物を指し、及び「アッセイ（ａｎ ａｓｓａｙ）」と言うとき、それは当業者に公知の均等なステップ及び方法への言及を含むなどである。
【0019】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書において言及される全ての刊行物は、その刊行物中で説明されている、且つ本明細書に記載する発明との関連で使用し得る装置、配合及び方法論を説明及び開示する目的で参照により本明細書に援用される。
【0020】
値の範囲が提供される場合、当該の範囲の上限と下限との間にある各中間値及び当該の明記される範囲にある任意の他の明記される値又は中間値が本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、明記される範囲における任意の具体的に除外される限界値を条件として、独立にそのより小さい範囲に含まれ得る。明記される範囲が限界値の両方を含む場合、それらの含まれる限界値のうち一方のみを除く範囲もまた本発明に含まれる。
【0021】
以下の説明においては、本発明のより完全な理解を提供するため多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、当業者には、本明細書を読めば、それらの具体的な詳細の１つ以上がなくても本発明を実施し得ることは明らかであろう。他の場合には、本発明が曖昧になることがないよう、当業者に周知された周知の特徴及び手順は説明していない。
【0022】
定義
明示的に定めない限り、本明細書で使用される用語は、当業者が理解するとおりの平易な且つ通常の意味を有することが意図される。以下の定義は読者が本発明を理解する助けとなることを意図するものであり、具体的に指示されない限り、かかる用語の意味を変更したり、又は他の形で限定したりする意図はない。
明示的に定めない限り、本明細書で使用される用語は、当業者が理解するとおりの平易な且つ通常の意味を有することが意図される。以下の定義は読者が本発明を理解する助けとなることを意図するものであり、具体的に指示されない限り、かかる用語の意味を変更したり、又は他の形で限定したりする意図はない。
【0023】
「結合している」は、本明細書で使用されるとき（例えば、ポリペプチドの核酸結合ドメインに関連して）、ポリペプチドと核酸との間の非共有結合性相互作用を指す。非共有結合性相互作用と言うとき、ポリペプチド及び核酸は「会合している」、「相互作用している」、又は「結合している」と言われる。結合相互作用は概して１０－６Ｍ未満～１０－１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は結合の強度を指し、高い結合親和性ほど、より低いＫｄと関連付けられる。
【0024】
「結合ドメイン」とは、非共有結合的に別の分子に結合可能なポリペプチド又はタンパク質ドメインが意味される。結合ドメインは、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／又はタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。
【0025】
「セントロメア」は、染色体が細胞分裂を通じて娘細胞に分離する能力を付与する任意の核酸配列である。セントロメアは、セントロメアを含有する合成染色体を含め、核酸配列の有糸分裂及び減数分裂を通じた安定な分離をもたらし得る。セントロメアは、必ずしもそれが導入される細胞と同じ種に由来する必要はないが、好ましくはセントロメアは、当該の種の細胞におけるＤＮＡ分離を促進する能力を有する。「二動原体」染色体は、２つのセントロメアを含む染色体である。「以前二動原体であった染色体（ｆｏｒｍｅｒｌｙ ｄｉｃｅｎｔｒｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）」は、二動原体染色体が断片化すると生じる染色体である。「染色体」は、細胞の分裂時に細胞内で複製及び分離する能力を有する核酸分子－及び関連するタンパク質－である。典型的には、染色体は、セントロメア領域、複製起点、テロメア領域及びセントロメア領域とテロメア領域との間にある核酸領域を含む。「アクロセントリック染色体」は、腕の長さが不均等な染色体を指す。
【0026】
「コード配列」又はペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列の制御下に置かれたとき生体内で転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）されてポリペプチドになる核酸分子である。コード配列の境界は、典型的には５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンとによって決まる。
【0027】
用語ＤＮＡ「制御配列」は、まとめて、プロモータ配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、配列内リボソーム進入部位、エンハンサーなどを指し、これらはまとめて受容細胞におけるコード配列の複製、転写及び翻訳を提供する。選択のコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写及び翻訳されることが可能である限り、この種の制御配列が全て存在する必要はない。
【0028】
「内因性染色体」は、合成染色体の作成又は導入前に細胞に見られる染色体を指す。
本明細書で使用されるとき、「ユークロマチン」は、散在性に染色される、典型的には遺伝子を含有するクロマチンを指し、「ヘテロクロマチン」は、通常凝縮したままで、転写的に不活性と考えられるクロマチンを指す。セントロメアを取り囲むヘテロクロマチンの領域には、通常、高度に反復性のＤＮＡ配列（サテライトＤＮＡ）が位置する。
本明細書で使用されるとき、「ユークロマチン」は、散在性に染色される、典型的には遺伝子を含有するクロマチンを指し、「ヘテロクロマチン」は、通常凝縮したままで、転写的に不活性と考えられるクロマチンを指す。セントロメアを取り囲むヘテロクロマチンの領域には、通常、高度に反復性のＤＮＡ配列（サテライトＤＮＡ）が位置する。
【0029】
用語「異種ＤＮＡ」又は「外来ＤＮＡ」（又は「異種ＲＮＡ」又は「外来ＲＮＡ」）は同義的に使用され、天然ではその所在であるゲノムの一部として存在しない、或いはゲノム又は細胞において、それが天然に存在する場合と異なる１つ又は複数の位置に及び／又は量で見られるＤＮＡ又はＲＮＡを指す。異種ＤＮＡの例としては、限定はされないが、１つ又は複数の目的の遺伝子産物をコードするＤＮＡが挙げられる。異種ＤＮＡの他の例としては、限定はされないが、追跡可能なマーカタンパク質をコードするＤＮＡ並びに調節ＤＮＡ配列が挙げられる。
【0030】
用語「誘導因子」は、本明細書で使用されるとき、Ｔｅｔ－Ｏｎシステムにおけるドキシサイクリン、クマートスイッチシステムにおけるクマート、他の天然分子並びに人工的な操作された分子など、遺伝子の転写を直接又は間接的に誘導する任意の生物学的分子を含む。
【0031】
「作動可能に連結された」は、そのように記載される構成要素がその通常の機能を果たすように構成されるエレメントの配置を指す。従って、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、そのコード配列の発現を生じさせる能力を有する。制御配列は、それがコード配列の発現を導く働きをする限り、コード配列に連続している必要はない。従って、例えば、プロモータ配列とコード配列との間に、翻訳はされないが転写はされる介在配列が存在してもよく、それでもなお、そのプロモータ配列はコード配列に「作動可能に連結されている」と見なすことができる。事実、かかる配列は同じ連続するＤＮＡ分子（即ち染色体）上にある必要はなく、それでもなお、調節の変化をもたらす相互作用を有し得る。
【0032】
「プロモータ」又は「プロモータ配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合して、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内低分子若しくは核小体ＲＮＡ又は任意のクラスの任意のＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ又はＩＩＩによって転写される任意の種類のＲＮＡなど、ポリヌクレオチド又はポリペプチドコード配列の転写を開始させる能力を有するＤＮＡ調節領域である。
【0033】
「受容細胞」は、合成染色体、合成プラットフォーム染色体又は所与の一組のＤＮＡエレメントを含むようにバイオエンジニアリングを受けた合成プラットフォーム染色体を作成するための構成要素が入る細胞である。受容細胞のタイプには、限定はされないが、幹細胞、間葉系幹細胞、成人由来幹細胞、Ｔ細胞、免疫細胞、人工多能性幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞、中胚葉、外胚葉及び内胚葉の細胞が含まれ得る。また、腫瘍細胞、細胞培養株、初代細胞、及び生殖細胞も含まれ得る。次に細胞は、例えば、培養する、移植用に調製する、全トランスジェニック動物の作出に使用するなどすることができる。
【0034】
「認識配列」は、タンパク質、ＤＮＡ、又はＲＮＡ分子、又はこれらの組み合わせ（限定はされないが、制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ又はリコンビナーゼなど）が認識して結合する特定のヌクレオチド配列である。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列は、２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として働く）とそれに隣接する８塩基対のコアを含む、ｌｏｘＰと称される３４塩基対配列である（例えば、サウアー（Ｓａｕｅｒ）著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第５巻、ｐ．５２１～５２７、１９９４年を参照のこと）。認識配列の他の例としては、限定はされないが、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ、ａｔｔＲ及びａｔｔＬ並びにその他の、リコンビナーゼ酵素バクテリオファージλインテグラーゼによって認識されるものが挙げられる。ａｔｔＢと称される組換え部位は、２つの９塩基対のコア型Ｉｎｔ結合部位及び７塩基対のオーバラップ領域を含む約３３塩基対配列である；ａｔｔＰは、コア型Ｉｎｔ結合部位及びアーム型Ｉｎｔ結合部位並びに補助タンパク質ＩＨＦ、ＦＩＳ、及びＸｉｓに対する部位を含む約２４０塩基対配列である（例えば、ランディ（Ｌａｎｄｙ）著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第３巻、ｐ．６９９～７０７１、１９９３年を参照のこと）。
【0035】
「リコンビナーゼ」は、特定の組換え部位におけるＤＮＡセグメントの交換を触媒する酵素である。インテグラーゼとは、通常はウイルス又はトランスポゾン、並びに恐らくは古代ウイルスにも由来するリコンビナーゼを指す。「組換えタンパク質」には、１つ以上の組換え部位を用いた組換え反応に関与する切出しタンパク質、組込みタンパク質、酵素、補因子及び関連タンパク質が含まれる（ランディ（Ｌａｎｄｙ）著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第３巻、ｐ．６９９～７０７、１９９３年を参照のこと）。本明細書の方法において使用される組換えタンパク質は、プラスミドなど、適切なベクター上の発現カセットを介して細胞に送達することができる。他の実施形態において、組換えタンパク質は、所望の１つ又は複数の核酸の送達に用いられる同じ反応混合物中においてタンパク質の形態で細胞に送達することができる。更に他の実施形態において、リコンビナーゼはまた、細胞にコードし、厳密に制御された誘導性プロモータを用いて必要に応じて発現させてもよい。
【0036】
「リボソームＲＮＡ」（ｒＲＮＡ）は、リボソームの構造の一部を形成してタンパク質合成に関与する特殊なＲＮＡである。リボソームＲＮＡは、真核細胞では複数のコピーで存在する遺伝子の転写によって産生される。ヒト細胞では、一倍体ゲノム当たり約２５０コピーのｒＲＮＡ遺伝子（即ち、ｒＲＮＡをコードする遺伝子）が少なくとも５つの異なる染色体（１３番、１４番、１５番、２１番及び２２番染色体）上にクラスターを成して分散している。ヒト細胞では、高度に保存されたｒＲＮＡ遺伝子の複数のコピーが、一連のタンデムに並んだｒＤＮＡ単位に位置し、ｒＤＮＡ単位は概して約４０～４５ｋｂ長であり、転写領域と、長さ及び配列が様々であり得るスペーサ（即ち遺伝子間スペーサ）ＤＮＡとして知られる非転写領域とを含む。
【0037】
本明細書で使用されるとき、用語「選択可能マーカ」は、細胞、特に本発明の文脈では培養下の細胞に導入される、人為淘汰に好適な形質を付与する遺伝子を指す。一般的用途の選択可能マーカは当業者に周知である。好ましい実施形態において、ヒト合成染色体システムに用いられる選択可能マーカはヒトにおいて非免疫原性でなければならず、限定はされないが、ヒト神経成長因子受容体（米国特許第６，３６５，３７３号明細書に記載されるように、ＭＡｂで検出される）；トランケート型ヒト成長因子受容体（ＭＡｂで検出される）；突然変異型ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ；蛍光ＭＴＸ基質利用可能）；分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ；蛍光基質利用可能）；ヒトチミジル酸シンターゼ（ＴＳ；抗癌剤フルオロデオキシウリジン耐性を付与する）；ヒトグルタチオンＳ－トランスフェラーゼα（ＧＳＴＡ１；グルタチオンを幹細胞選択的アルキル化薬ブスルファンにコンジュゲートする；ＣＤ３４＋細胞における化学保護的選択可能マーカ）；造血幹細胞におけるＣＤ２４細胞表面抗原；Ｎ－ホスホノアセチル（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｃｅｔｙｌ）－Ｌ－アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）に対する耐性を付与するヒトＣＡＤ遺伝子；ヒト多剤耐性１（ＭＤＲ－１；薬剤耐性の増加によって選択可能な、又はＦＡＣＳによってエンリッチされるＰ糖タンパク質表面タンパク質）；ヒトＣＤ２５（ＩＬ－２α；Ｍａｂ－ＦＩＴＣによって検出可能）；メチルグアニン－ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ；カルムスチンによって選択可能）；及びシチジンデアミナーゼ（ＣＤ；Ａｒａ－Ｃによって選択可能）が挙げられる。ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、Ｇ４１８、テトラサイクリンなど、薬物選択可能なマーカもまた利用し得る。加えて、ＦＡＣｓソーティングを用いて任意の蛍光マーカ遺伝子をポジティブ選択に使用してもよく、化学発光マーカ（例えばＨａｌｏｔａｇ）なども同様に使用し得る。
【0038】
「部位特異的組換え」は、単一の核酸分子上の２つの特定の部位間又は２つの異なる分子間で生じる、インテグラーゼ又はリコンビナーゼなどの外因性タンパク質の存在が必要な部位特異的組換えを指す。ある種の部位特異的組換えシステムを用いてＤＮＡを特異的に欠失させ、逆位させ、又は挿入することができ、正確なイベントはそれらの特定の部位の向き、具体的なシステム及びアクセサリータンパク質又は因子の存在によって制御される。加えて、図４に記載されるとおり染色体間でＤＮＡのセグメントを交換することができる（染色体腕の交換）。
【0039】
「合成染色体」（「人工染色体」とも称される）は、異種遺伝子を受け入れてそれを発現させる能力を有する、且つ細胞において内因性染色体と共に安定に複製及び分離する核酸分子、典型的にはＤＮＡである。「哺乳類合成染色体」は、１つ又は複数の活性な哺乳類セントロメアを有する染色体を指す。「ヒト合成染色体」は、ヒト細胞で機能するセントロメアを含み、且つ好ましくはヒト細胞で産生される染色体を指す。例示的な人工染色体については、例えば、米国特許第８，３８９，８０２号明細書；同第７，５２１，２４０号明細書；同第６，０２５，１５５号明細書；同第６，０７７，６９７号明細書；同第５，８９１，６９１号明細書；同第５，８６９，２９４号明細書；同第５，７２１，１１８号明細書；同第５，７１２，１３４号明細書；同第５，６９５，９６７号明細書；及び同第５，２８８，６２５号明細書並びに国際公開第９７／４０１８３号パンフレット及び同第９８／０８９６４号パンフレットを参照のこと。
【0040】
用語「対象」、「個体」又は「患者」は本明細書では同義的に使用されてもよく、哺乳類、及び一部の実施形態ではヒトを指し得る。
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルスコンストラクト、コスミド、細菌人工染色体、Ｐ－１由来人工染色体又は酵母人工染色体など、別のＤＮＡセグメントを付加し得るレプリコンである。一部の例では、ベクターは、組換え部位を含むように操作された１つの内因性染色体から合成染色体に腕を交換する場合のような染色体であってもよい。ベクターは、細胞におけるＤＮＡセグメントの形質導入及び発現に使用される。
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルスコンストラクト、コスミド、細菌人工染色体、Ｐ－１由来人工染色体又は酵母人工染色体など、別のＤＮＡセグメントを付加し得るレプリコンである。一部の例では、ベクターは、組換え部位を含むように操作された１つの内因性染色体から合成染色体に腕を交換する場合のような染色体であってもよい。ベクターは、細胞におけるＤＮＡセグメントの形質導入及び発現に使用される。
【0041】
発明
本発明は、複数の遺伝子調節性制御システムからの複数の遺伝子の送達及び発現を全て単一の合成染色体から可能にする組成物及び方法を包含する。合成染色体はその大きい運搬能力をもって複数の遺伝子産物－及びこれらの複数の遺伝子産物は異なる調節性制御システムの制御下にあってよい－を運搬して発現させることができ、それによりウイルスベース及びプラスミドベースの核酸送達の限界を回避し得る。本発明は、合成プラットフォーム染色体上への複合的調節可能発現システムの構築を可能にする方法及び組成物を提供するものであり、「トップダウン」手法、「ボトムアップ」手法、天然に存在するミニ染色体の操作、及び特定の染色体セグメントのターゲット増幅による誘導性デノボ染色体生成（これらは全て以下に更に詳細に考察する）を含めたあらゆる合成染色体作製方法に適用可能である。
本発明は、複数の遺伝子調節性制御システムからの複数の遺伝子の送達及び発現を全て単一の合成染色体から可能にする組成物及び方法を包含する。合成染色体はその大きい運搬能力をもって複数の遺伝子産物－及びこれらの複数の遺伝子産物は異なる調節性制御システムの制御下にあってよい－を運搬して発現させることができ、それによりウイルスベース及びプラスミドベースの核酸送達の限界を回避し得る。本発明は、合成プラットフォーム染色体上への複合的調節可能発現システムの構築を可能にする方法及び組成物を提供するものであり、「トップダウン」手法、「ボトムアップ」手法、天然に存在するミニ染色体の操作、及び特定の染色体セグメントのターゲット増幅による誘導性デノボ染色体生成（これらは全て以下に更に詳細に考察する）を含めたあらゆる合成染色体作製方法に適用可能である。
【0042】
合成又はＡＣＥプラットフォーム染色体は、種々の細胞ベースのタンパク質作製、遺伝子発現の調整又は治療適用に利用し得る合成染色体である。合成プラットフォーム染色体の生成時、異種核酸のインテグラーゼ介在性部位特異的組込みに必要なユニークなＤＮＡエレメント／配列が合成染色体に取り込まれ、それにより合成染色体の操作が可能となる。合成染色体の作製中にインテグラーゼ標的配列が増幅されるため、合成染色体に多数の部位特異的組換え部位が取り込まれ、それらの部位は、複数の遺伝子調節性制御システムを含む送達ベクターによる合成プラットフォーム染色体の多重ローディングに利用可能である。
【0043】
複数の遺伝子調節性制御システムを有する合成プラットフォーム染色体の例は、Ｔｅｔ－Ｏｎ及びクマートスイッチ遺伝子調節システムの両方を含む合成プラットフォーム染色体である。Ｔｅｔ－Ｏｎ及びクマートスイッチ調節性制御システムは、誘導因子が加わるとこれらの調節性制御システムの制御下にある遺伝子が合成プラットフォーム染色体から発現するように操作され、合成プラットフォーム染色体から発現する；ドキシサイクリンがＴｅｔ－Ｏｎシステムの誘導因子であり、及びクマートがクマートスイッチシステムの誘導因子である。例えば、抗体又は抗体断片などの治療用タンパク質がＴｅｔ－Ｏｎ又はクマートスイッチの制御下となるようにそれらの抗体及び／又は断片を送達ベクターにコードし、合成染色体プラットフォームにロードすることができる。誘導因子ドキシサイクリン及びクマートが両方ともに存在するとき、全ての抗体又は抗体断片が同時に発現する。或いは、Ｔｅｔ－Ｏｎ及びクマートスイッチ－及び制御又はＴｅｔ－Ｏｎ又はクマートスイッチシステム下にある１つ以上の遺伝子－は独立して誘導することができる。本発明のこの実施形態の概略図を図１Ａに示す。図１Ａは、合成染色体上の２つの例示的遺伝子、遺伝子１及び遺伝子２の操作及び発現を示す。遺伝子誘導因子１及び遺伝子誘導因子２の両方が存在するとき、両方の遺伝子産物１及び２が発現する。遺伝子誘導因子１のみが存在するとき、合成染色体から遺伝子産物１のみが産生される。遺伝子誘導因子２のみが存在するとき、合成染色体から遺伝子産物２のみが産生される。図１Ｂは簡略化した概略図であり、ここでは誘導因子１の存在下で遺伝子産物の発現が行われ、誘導因子１の非存在下及び誘導因子２の存在下では合成染色体から遺伝子産物２のみが合成される。
【0044】
合成染色体を使用して遺伝子発現を調節する別の実施形態を図２に示す。図２は、第１の発現遺伝子の遺伝子産物が第２の遺伝子の発現を誘導するシナリオを例示する。図２は、シグナルアウトプットの増幅をもたらす合成染色体上の例示的な生物学的回路を示す。誘導因子１が存在しないとき、遺伝子産物１又は遺伝子産物２のいずれの産生もない。しかしながら、誘導因子１が存在するとき、遺伝子１が転写され、遺伝子産物１が発現し、次には遺伝子産物１が遺伝子２の転写及び翻訳並びに遺伝子産物２の合成を誘導する。この実施形態の使用の一例は、細胞生存の増加をもたらす多重にロードされた遺伝子の協調的発現である。この例示的シナリオでは、多重にロードされた遺伝子が配置されて、腫瘍攻撃に応答して免疫細胞生存の増加をもたらす合成染色体から発現する。腫瘍細胞は種々の手段を用いて認識を免れ、Ｔ細胞機能を低下させる；しかしながら、この攻撃は、細胞周期停止応答を阻害する多重にロードされた因子を共通の調節性制御システムから発現するようにＴ細胞を操作すること；例えば、抗ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）及び抗ＣＴＬＡ－４（中枢Ｔ細胞活性化及び阻害４）など、免疫及び細胞周期チェックポイントタンパク質に対する阻害因子をコードする遺伝子の発現によって回避し得る。従って１つの誘導調節性制御システムから複数の遺伝子産物を産生させて、免疫細胞機能を亢進させることができる。
【0045】
図２に例示する実施形態と対照的に、合成染色体からの第２の遺伝子の発現は、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の遺伝子から産生した第１の遺伝子産物の存在によって抑制されてもよい。図３は生物学的回路の阻害を示し、ここでは誘導因子１の非存在下及び誘導因子２の存在下で遺伝子２が転写され、遺伝子産物２が合成される；しかしながら、誘導因子１及び誘導因子２の存在下では、誘導因子１が遺伝子２の転写及び遺伝子産物２の合成を抑制する。
【0046】
本発明の他の実施形態において、より複雑な「論理」回路が構築される。例えば、２つの遺伝子の発現及び２つの遺伝子産物の産生が第３の遺伝子の発現及び第３の産物の産生につながるような論理的「ＡＮＤ」スイッチを作り上げることができる。図４がこの実施形態を例示する。図４は、誘導因子１又は誘導因子２の存在それ自体は遺伝子３の転写及び遺伝子産物３の合成を誘導するには不十分であるが；しかしながら、誘導因子１と誘導因子２との組み合わせは遺伝子３の転写及び遺伝子産物３の合成を誘導することを示す。
【0047】
更に別の実施形態において、論理的「ＯＲ」スイッチが構築され、それによれば誘導因子１又は誘導因子２の存在が遺伝子１又は遺伝子２の発現、遺伝子産物１又は遺伝子産物２の産生、及び遺伝子３の発現及び遺伝子産物３の産生につながり得る。図５がこの実施形態を例示する。図１～図５に概説する回路及び論理スイッチ（「ＡＮＤ」／「ＯＲ」）は、内因性細胞誘導因子又は細胞内にある追加的な外来ＤＮＡ（例えば、合成染色体と別のベクター）上にコードされた誘導因子と共に機能するように連携し得ることに留意されたい。例えば、腫瘍微小環境で発現させ得る因子（例えば抗腫瘍因子）の発現をドライブするＩＬ－２応答性プロモータなど、組織環境から生じる外因性シグナルに応答するようにプラットフォーム合成染色体上に調節性制御システムを操作してもよい。
【0048】
合成染色体の作製
合成染色体は培養細胞で作成される。一部の実施形態において、操作を受ける、及び／又は合成染色体を産生する細胞は、その合成染色体からの遺伝子又は調節配列が最終的に発現することになる対象（ヒト患者、動物又は植物）に天然に存在する細胞であってもよい。かかる細胞は、個体に特異的な合成染色体作製用に樹立された初代培養細胞株であってもよい。他の実施形態において、操作を受ける、及び／又は合成染色体を産生する細胞は、樹立細胞株からのものである。組織培養用の多種多様な細胞株が当該技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定はされないが、ヒト細胞株、例えば、２９３－Ｔ（胎児由来腎臓）、７２１（メラノーマ）、Ａ２７８０（卵巣）、Ａ１７２（膠芽腫）、Ａ２５３（癌腫）、Ａ４３１（上皮）、Ａ５４９（癌腫）、ＢＣＰ－１（リンパ腫）、ＢＥＡＳ－２Ｂ（肺）、ＢＲ２９３（乳房）、ＢｘＰＣ３（膵癌）、Ｃａｌ－２７（舌）、ＣＯＲ－Ｌ２３（肺）、ＣＯＶ－４３４（卵巣）、ＣＭＬ Ｔ１（白血病）、ＤＵＩ４５（前立腺）、ＤｕＣａＰ（前立腺）、ＦＭ３（リンパ節）、Ｈ１２９９（肺）、Ｈ６９（肺）、ＨＣＡ２（線維芽細胞）、ＨＥＫ０２９３（胎児由来腎臓）、ＨｅＬａ（頸部）、ＨＬ－６０（骨髄芽球）、ＨＭＥＣ（上皮）、ＨＴ－２９（結腸）、ＨＵＶＥＣ（臍帯静脈上皮）、ジャーカット（Ｔ細胞白血病）、ＪＹ（リンパ芽球様）、Ｋ５６２（リンパ芽球様）、ＫＢＭ－７（リンパ芽球様）、Ｋｕ８１２（リンパ芽球様）、ＫＣＬ２２（リンパ芽球様）、ＫＧＩ（リンパ芽球様）、ＫＹＯ１（リンパ芽球様）、ＬＮＣａｐ（前立腺）、Ｍａ－Ｍｅｌ（メラノーマ）、ＭＣＦ－７（乳腺）、ＭＤＦ－１０Ａ（乳腺）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、－４６８及び－４３５（乳房）、ＭＧ６３（骨肉腫）、ＭＯＲ／０．２Ｒ（肺）、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ６（白血球細胞）、ＭＲＣ５（肺）、ＮＣＩ－Ｈ６９（肺）、ＮＡＬＭ－１（末梢血）、ＮＷ－１４５（メラノーマ）、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ（前立腺）、ピア（Ｐｅｅｒ）（白血病）、ラージ（Ｒａｊｉ）（Ｂリンパ腫）、Ｓａｏｓ－２（骨肉腫）、Ｓｆ２１（卵巣）、Ｓｆ９（卵巣）、ＳｉＨａ（子宮頸癌）、ＳＫＢＲ３（乳癌）、ＳＫＯＶ－２（卵巣癌腫）、Ｔ－４７Ｄ（乳腺）、Ｔ８４（肺）、Ｕ３７３（膠芽腫）、Ｕ８７（膠芽腫）、Ｕ９３７（リンパ腫）、ＶＣａＰ（前立腺）、ＷＭ３９（皮膚）、ＷＴ－４９（リンパ芽球様）、ＹＡＲ（Ｂ細胞）、胚細胞株、多能性細胞株、成人由来幹細胞、再プログラム化細胞株、任意の種の汎用動物細胞株又は広義に胎児性の若しくは再プログラム化される細胞、患者自己細胞株が挙げられ、一部の好ましい実施形態では、ＨＴ１０８０ヒト細胞株が利用される。これらの細胞株及び他の細胞株は当業者に公知の種々の供給元から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）を参照）。
合成染色体は培養細胞で作成される。一部の実施形態において、操作を受ける、及び／又は合成染色体を産生する細胞は、その合成染色体からの遺伝子又は調節配列が最終的に発現することになる対象（ヒト患者、動物又は植物）に天然に存在する細胞であってもよい。かかる細胞は、個体に特異的な合成染色体作製用に樹立された初代培養細胞株であってもよい。他の実施形態において、操作を受ける、及び／又は合成染色体を産生する細胞は、樹立細胞株からのものである。組織培養用の多種多様な細胞株が当該技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定はされないが、ヒト細胞株、例えば、２９３－Ｔ（胎児由来腎臓）、７２１（メラノーマ）、Ａ２７８０（卵巣）、Ａ１７２（膠芽腫）、Ａ２５３（癌腫）、Ａ４３１（上皮）、Ａ５４９（癌腫）、ＢＣＰ－１（リンパ腫）、ＢＥＡＳ－２Ｂ（肺）、ＢＲ２９３（乳房）、ＢｘＰＣ３（膵癌）、Ｃａｌ－２７（舌）、ＣＯＲ－Ｌ２３（肺）、ＣＯＶ－４３４（卵巣）、ＣＭＬ Ｔ１（白血病）、ＤＵＩ４５（前立腺）、ＤｕＣａＰ（前立腺）、ＦＭ３（リンパ節）、Ｈ１２９９（肺）、Ｈ６９（肺）、ＨＣＡ２（線維芽細胞）、ＨＥＫ０２９３（胎児由来腎臓）、ＨｅＬａ（頸部）、ＨＬ－６０（骨髄芽球）、ＨＭＥＣ（上皮）、ＨＴ－２９（結腸）、ＨＵＶＥＣ（臍帯静脈上皮）、ジャーカット（Ｔ細胞白血病）、ＪＹ（リンパ芽球様）、Ｋ５６２（リンパ芽球様）、ＫＢＭ－７（リンパ芽球様）、Ｋｕ８１２（リンパ芽球様）、ＫＣＬ２２（リンパ芽球様）、ＫＧＩ（リンパ芽球様）、ＫＹＯ１（リンパ芽球様）、ＬＮＣａｐ（前立腺）、Ｍａ－Ｍｅｌ（メラノーマ）、ＭＣＦ－７（乳腺）、ＭＤＦ－１０Ａ（乳腺）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、－４６８及び－４３５（乳房）、ＭＧ６３（骨肉腫）、ＭＯＲ／０．２Ｒ（肺）、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ６（白血球細胞）、ＭＲＣ５（肺）、ＮＣＩ－Ｈ６９（肺）、ＮＡＬＭ－１（末梢血）、ＮＷ－１４５（メラノーマ）、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ（前立腺）、ピア（Ｐｅｅｒ）（白血病）、ラージ（Ｒａｊｉ）（Ｂリンパ腫）、Ｓａｏｓ－２（骨肉腫）、Ｓｆ２１（卵巣）、Ｓｆ９（卵巣）、ＳｉＨａ（子宮頸癌）、ＳＫＢＲ３（乳癌）、ＳＫＯＶ－２（卵巣癌腫）、Ｔ－４７Ｄ（乳腺）、Ｔ８４（肺）、Ｕ３７３（膠芽腫）、Ｕ８７（膠芽腫）、Ｕ９３７（リンパ腫）、ＶＣａＰ（前立腺）、ＷＭ３９（皮膚）、ＷＴ－４９（リンパ芽球様）、ＹＡＲ（Ｂ細胞）、胚細胞株、多能性細胞株、成人由来幹細胞、再プログラム化細胞株、任意の種の汎用動物細胞株又は広義に胎児性の若しくは再プログラム化される細胞、患者自己細胞株が挙げられ、一部の好ましい実施形態では、ＨＴ１０８０ヒト細胞株が利用される。これらの細胞株及び他の細胞株は当業者に公知の種々の供給元から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）を参照）。
【0049】
１つ以上の調節性制御システムの制御下にある複数の遺伝子を発現させるための合成染色体の操作は、当該技術分野で用いられている「トップダウン」、「ボトムアップ」、ミニ染色体の操作、及び誘導性デノボ染色体生成方法の全てに適用可能である。合成染色体形成の「ボトムアップ」手法は、細胞介在性デノボ染色体形成と、それに続く、テロメアＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ有り又は無しの、典型的な宿主細胞に適切なセントロメア及び１つ又は複数の選択可能マーカ遺伝子を含むクローニングされたαサテライト配列による許容的細胞株のトランスフェクションに頼るものである。（これらの方法のプロトコル及び詳細な説明については、例えば、ハリントン（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ）ら著、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１５巻、ｐ．３４５～５５、１９９７年；イケノ（Ｉｋｅｎｏ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、第１６巻、ｐ．４３１～３９、１９９８年；マスモト（Ｍａｓｕｍｏｔｏ）ら著、クロモソーマ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）、第１０７巻、ｐ．４０６～１６、１９９８年、エバーソール（Ｅｂｅｒｓｏｌｅ）ら著、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅ．）、第９巻、ｐ．１６２３～３１、２０００年；ヘニング（Ｈｅｎｎｉｎｇ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ ＵＳＡ）、第９６巻、ｐ．５９２～９７、１９９９年；グライムス（Ｇｒｉｍｅｓ）ら著、エンボ・リポーツ（ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．）、第２巻、ｐ．９１０～１４、２００１年；メヒア（Ｍｅｊｉａ）ら著、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、第７９巻、ｐ．２９７～３０４、２００２年；及びグライムス（Ｇｒｉｍｅｓ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第５巻、ｐ．７９８～８０５、２００２年を参照）。酵母人工染色体、細菌人工染色体又はＰ１由来人工染色体ベクターにクローニングされた合成の及び天然に存在するαサテライトアレイが両方ともに、当該技術分野でデノボ合成染色体形成に用いられている。ボトムアップアセンブリの産物は線状又は環状であってもよく、αサテライトＤＮＡベースのセントロメアを有する単純化した及び／又はコンカテマー化した入力ＤＮＡを含み、及び典型的にはサイズが１～１０Ｍｂの範囲である。ボトムアップ由来の合成染色体はまた、合成染色体への標的ＤＮＡ配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列も取り込むように操作される。
【0050】
合成染色体を作製する「トップダウン」手法には、先在している染色体腕のランダム及び／又はターゲットトランケーションの連続ラウンドによって、セントロメア、テロメア、及びＤＮＡ複製起点を含む合成染色体に切り詰めることが関わる。（これらの方法のプロトコル及び詳細な説明については、例えば、ヘラー（Ｈｅｌｌｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ ＵＳＡ）、第９３巻、ｐ．７１２５～３０、１９９６年；サフェリー（Ｓａｆｆｅｒｙ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ ＵＳＡ）、第９８巻、ｐ．５７０５～１０、２００１年；チュウ（Ｃｈｏｏ）著、トレンズ・イン・モレキュラー・メディシン（Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．）、第７巻、ｐ．２３５～３７、２００１年；バーネット（Ｂａｒｎｅｔｔ）ら著、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．）、第２１巻、ｐ．２７～３６、１９９３年；ファー（Ｆａｒｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ ＵＳＡ）、第８８巻、ｐ．７００６～１０、１９９１年；及びカトウ（Ｋａｔｏｈ）ら著、ビオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、第３２１巻、ｐ．２８０～９０、２００４年を参照）。「トップダウン」合成染色体は、最適には天然に存在する発現遺伝子を欠くように構築され、例えば部位特異的ＤＮＡインテグラーゼによって媒介される、トランケート型染色体への標的ＤＮＡ配列の部位特異的組込みを可能にするＤＮＡ配列を含むように操作される。
【0051】
当該技術分野において公知の合成染色体を作製する第３の方法は、天然に存在するミニ染色体の操作である。この作製方法には、典型的には、セントロメア機能を有するがαサテライトＤＮＡ配列は欠いている機能性の、例えばヒト新生セントロメアを含み、且つ非必須ＤＮＡは持たないように操作された染色体の放射線照射誘導性の断片化が関わる。（これらの方法のプロトコル及び詳細な説明については、例えば、オリッシュ（Ａｕｒｉｃｈｅ）ら著、エンボ・リポーツ（ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．）、第２巻、ｐ．１０２～０７、２００１年；モラーリ（Ｍｏｒａｌｌｉ）ら著、サイトジェネティクス・アンド・セル・ジェネティクス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．）、第９４巻、ｐ．１１３～２０、２００１年；及びカリーヌ（Ｃａｒｉｎｅ）ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１５巻、ｐ．４４５～４６０、１９８９年を参照）。合成染色体を生成する他の方法と同様に、操作されたミニ染色体は、標的ＤＮＡ配列の部位特異的組込みを可能にするＤＮＡ配列を含むように操作することができる。
【0052】
合成染色体を作製する第４の好ましい手法には、特定の染色体セグメントのターゲット増幅による誘導性デノボ染色体生成が関わる。この手法には、アクロセントリック染色体に位置する動原体周囲／リボソームＤＮＡ領域の大規模増幅が関わる。増幅は、リボソームＲＮＡなど、染色体の挟動原体領域（ｐｅｒｃｅｎｔｒｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）に特異的な過剰のＤＮＡを、標的ＤＮＡ配列の部位特異的組込みを可能にするＤＮＡ配列（ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲなど）、及び任意選択で選択可能マーカと共に（これらの全てが染色体の挟動原体領域に組み込まれる）コトランスフェクトすることによって惹起される。（これらの方法のプロトコル及び詳細な説明については、例えば、クソンカ（Ｃｓｏｎｋａ）ら著、ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ）、第１１３巻、ｐ．３２０７～１６、２００２年；ハドラツキー（Ｈａｄｌａｃｚｋｙ）ら著、カレント・オピニオン・イン・モレキュラー・セラピューティクス（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第３巻、ｐ．１２５～３２、２００１年；及びリンデンバウム（Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ）及びパーキンス（パーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ））ら著、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．）、第３２巻、第２１号、ｐ．ｅｌ７２、２００４年を参照）。この過程では、コトランスフェクトされたＤＮＡによるアクロセントリック染色体の挟動原体領域へのターゲティングが大規模染色体ＤＮＡ増幅、セントロメア配列の複製／活性化、並びに続く二動原体染色体の切断及び分割を誘導し、その結果、複数の部位特異的組込み部位を含むサテライトＤＮＡベースの合成染色体の「離脱（ｂｒｅａｋ－ｏｆｆ）」がもたらされる。
【0053】
合成プラットフォーム染色体技術の不可欠な部分は、合成染色体に選択の調節性制御システム及び遺伝子を「ロードする」又は置くことを可能にする部位特異的組換えシステムである。本発明の好ましい実施形態において、合成プラットフォーム染色体は、その各々に１つ又は数個の目的遺伝子が挿入され得る複数の部位特異的組換え部位を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ファージＰ１からのＣＲＥリコンビナーゼを使用したＣｒｅ／ｌｏｘ組換えシステム（例えば、サウアー（Ｓａｕｅｒ）著、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第２２５巻、ｐ．８９０～９００、１９９３年及び米国特許第５，６５８，７７２号明細書を参照）；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μエピソームからのＦＬＰリコンビナーゼを使用した酵母のＦＬＰ／ＦＲＴシステム（例えば、コックス（Ｃｏｘ）著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第８０巻、ｐ．４２２３、１９８３年及び米国特許第５，７４４，３３６号明細書を参照）；リゾルベース、例えば、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ（メイザー（Ｍａｅｓｅｒ）ら著、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．）、第２３０巻、ｐ．１７０～１７６、１９９１年）、Ｃｉｎ、Ｈｉｎ、αδ、Ｔｎ３；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｉｎリコンビナーゼ（例えば、エノモト（Ｅｎｏｍｏｔｏ）ら著、ジャーナルジャーナル・オブ・バクテリド（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｄ．）、第６巻、ｐ．６６３～６６８、１９８３年を参照）；ザイゴサッカロミセス・ロウキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）のｐＳＲｌプラスミドのＲ／ＲＳシステム（例えば、アラキ（Ａｒａｋｉ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２２５巻、ｐ．２５～３７、１９９２年を参照）；クルイベロミセス・ドロソフィラリウム（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｉｕｍ）（例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第３１４巻、ｐ．４４７１～４４８１、１９８６年を参照）及びクルイベロミセス・ワルチイ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗａｌｔｉｉ）（例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第１３８巻、ｐ．３３７～３４５、１９９２年を参照）からの部位特異的リコンビナーゼ；及び当業者に公知の他のシステムを含め、任意の公知の組換えシステムを使用することができ；しかしながら、追加的な因子の必要なしに動作する－又は突然変異のおかげで追加的な因子が不要な－組換えシステムが好ましい。一例示的実施形態において、バクテリオファージλインテグラーゼのリコンビナーゼ活性を用いた配列特異的組換えによって核酸を合成プラットフォーム染色体に挿入するための方法が提供される。
【0054】
λファージによってコードされるインテグラーゼ（「Ｉｎｔ」と称される）は、インテグラーゼファミリーのプロトタイプメンバーである。Ｉｎｔは、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ及びａｔｔＬ／ａｔｔＲと称される付着部位の対間の組換えによってファージの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムへの組込み及びそこからの切出しを生じさせる。各ａｔｔ部位は、２つの逆位の９塩基対コアＩｎｔ結合部位、及び野生型ａｔｔ部位と同一の７塩基対オーバラップ領域を含む。Ｉｎｔは、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＦｌｐ－ＦＲＴリコンビナーゼシステムと同様に、組込み及び切出し組換えの間に秩序立った逐次的な対の鎖交換を実行する。Ｉｎｔの天然の標的配列対、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ又はａｔｔＬ及びａｔｔＲは同じ又は異なるＤＮＡ分子に位置し、それぞれ分子内又は分子間組換えをもたらす。例えば、分子内組換えはそれぞれ逆向きのａｔｔＢ及びａｔｔＰ間、又はａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列間で起こり、介在するＤＮＡセグメントの逆位をもたらす。野生型Ｉｎｔは組込み及び切出し組換えに追加的なタンパク質因子を必要とし、及び組込み組換えに負の超らせん形成を必要とするが、突然変異Ｉｎｔタンパク質は、ヒト細胞におけるコトランスフェクションアッセイで分子内組込み及び切出し組換えを実施するのにアクセサリータンパク質は不要であり（ロールバッハ（Ｌｏｒｂａｃｈ）ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２５巻、第２９６号、ｐ．１１７５～１１８１、２０００年を参照）、本発明の方法に好ましい。
【0055】
生合成経路において複数の遺伝子を送達する送達ベクター
複数の調節性制御システム及び複数の遺伝子を合成プラットフォーム染色体に送達又は「ロード」するために使用する送達ベクターの選択は、伝播が所望される細胞のタイプなど、種々の要因に依存することになる。適切な送達ベクターの選択は十分に当業者の技能の範囲内にあり、多くのベクターが市販されている。送達ベクターの調製には、１つ以上の調節性制御システムの制御下にある１つ以上の遺伝子が、典型的にはベクター中の切断された制限酵素部位への遺伝子配列のライゲーションを用いてベクターに挿入される。或いは、所望のヌクレオチド配列は相同組換え又は部位特異的組換えによって挿入してもよい。典型的には相同組換えは、相同性領域をベクターに所望のヌクレオチド配列（例えば、ｃｒｅ－ｌｏｘ、ａｔｔ部位等）に隣接して付加することにより達成される。かかる配列を含む核酸は、例えばオリゴヌクレオチドのライゲーションによるか、又は相同性領域及び所望のヌクレオチド配列の一部分の両方を含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって付加することができる。使用し得る例示的送達ベクターとしては、限定はされないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡに由来するものが挙げられる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、ｐＵＣ１１８、１１９などのプラスミドベクター及びＭ１３ ｍｐ系ベクターを使用してもよい。バクテリオファージベクターとしては、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λｇｔ１８～２３、λＺＡＰ／Ｒ及びＥＭＢＬ系バクテリオファージベクターを挙げることができる。利用し得るコスミドベクターとしては、限定はされないが、ｐＪＢ８、ｐＣＶ１０３、ｐＣＶ１０７、ｐＣＶ１０８、ｐＴＭ、ｐＭＣＳ、ｐＮＮＬ、ｐＨＳＧ２７４、ＣＯＳ２０２、ＣＯＳ２０３、ｐＷＥ１５、ｐＷＥ１６及びシャロミド９系ベクターが挙げられる。更なるベクターとしては、機能性稔性プラスミド（Ｆプラスミド）ベースのバクテリア人工染色体（ｃｈｒｏｍｓｏｍｅ）（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及びＰ１バクテリオファージのＤＮＡに由来するＤＮＡコンストラクトであるＰ１由来人工染色体（ｃｈｒｏｍｓｏｍｅ）（ＰＡＣ）が挙げられる。或いは、及び好ましくは、限定はされないが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来するものを含め、組換えウイルスベクターが操作されてもよい。ＢＡＣベクターは、大量の核酸、即ち複数の遺伝子を担持する能力があるため本発明に好ましい送達ベクターである。或いは、調節性制御システムの制御下にある遺伝子は、複数の送達ベクターを使用した逐次ローディングによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよい；即ち、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の遺伝子が第１の送達ベクターによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよく、第２の調節性制御システムの制御下にある第２の遺伝子が第２の送達ベクターによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよく、以下同様である。２０１６年４月１２日に出願されたパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）及びグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、米国仮特許出願第６２／３２１，７１１号明細書が、単一の選択可能マーカを再利用しながら複数の送達ベクターを使用して合成プラットフォーム染色体に遺伝子を逐次ロードすることについて記載している。
複数の調節性制御システム及び複数の遺伝子を合成プラットフォーム染色体に送達又は「ロード」するために使用する送達ベクターの選択は、伝播が所望される細胞のタイプなど、種々の要因に依存することになる。適切な送達ベクターの選択は十分に当業者の技能の範囲内にあり、多くのベクターが市販されている。送達ベクターの調製には、１つ以上の調節性制御システムの制御下にある１つ以上の遺伝子が、典型的にはベクター中の切断された制限酵素部位への遺伝子配列のライゲーションを用いてベクターに挿入される。或いは、所望のヌクレオチド配列は相同組換え又は部位特異的組換えによって挿入してもよい。典型的には相同組換えは、相同性領域をベクターに所望のヌクレオチド配列（例えば、ｃｒｅ－ｌｏｘ、ａｔｔ部位等）に隣接して付加することにより達成される。かかる配列を含む核酸は、例えばオリゴヌクレオチドのライゲーションによるか、又は相同性領域及び所望のヌクレオチド配列の一部分の両方を含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって付加することができる。使用し得る例示的送達ベクターとしては、限定はされないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡに由来するものが挙げられる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、ｐＵＣ１１８、１１９などのプラスミドベクター及びＭ１３ ｍｐ系ベクターを使用してもよい。バクテリオファージベクターとしては、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λｇｔ１８～２３、λＺＡＰ／Ｒ及びＥＭＢＬ系バクテリオファージベクターを挙げることができる。利用し得るコスミドベクターとしては、限定はされないが、ｐＪＢ８、ｐＣＶ１０３、ｐＣＶ１０７、ｐＣＶ１０８、ｐＴＭ、ｐＭＣＳ、ｐＮＮＬ、ｐＨＳＧ２７４、ＣＯＳ２０２、ＣＯＳ２０３、ｐＷＥ１５、ｐＷＥ１６及びシャロミド９系ベクターが挙げられる。更なるベクターとしては、機能性稔性プラスミド（Ｆプラスミド）ベースのバクテリア人工染色体（ｃｈｒｏｍｓｏｍｅ）（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及びＰ１バクテリオファージのＤＮＡに由来するＤＮＡコンストラクトであるＰ１由来人工染色体（ｃｈｒｏｍｓｏｍｅ）（ＰＡＣ）が挙げられる。或いは、及び好ましくは、限定はされないが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来するものを含め、組換えウイルスベクターが操作されてもよい。ＢＡＣベクターは、大量の核酸、即ち複数の遺伝子を担持する能力があるため本発明に好ましい送達ベクターである。或いは、調節性制御システムの制御下にある遺伝子は、複数の送達ベクターを使用した逐次ローディングによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよい；即ち、第１の調節性制御システムの制御下にある第１の遺伝子が第１の送達ベクターによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよく、第２の調節性制御システムの制御下にある第２の遺伝子が第２の送達ベクターによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよく、以下同様である。２０１６年４月１２日に出願されたパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）及びグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、米国仮特許出願第６２／３２１，７１１号明細書が、単一の選択可能マーカを再利用しながら複数の送達ベクターを使用して合成プラットフォーム染色体に遺伝子を逐次ロードすることについて記載している。
【0056】
送達ベクターを含む細胞の選択を促進するため、発現宿主で作動可能な選択可能マーカが任意選択で存在してもよい。加えて、送達ベクターは追加的なエレメントを含み得る；例えば、送達ベクターが１つ又は２つの複製システムを有してもよく；ひいては送達ベクターを生物に維持する、例えば発現のため哺乳類細胞に、及びクローニング及び増幅のため原核生物宿主に維持することが可能になる。
【0057】
λインテグラーゼ介在性部位特異的組換え－又は任意の他のリコンビナーゼ介在性部位特異的組換え－を用いて、調節性制御下にある遺伝子が送達ベクターから合成プラットフォーム染色体に導入又は「ロード」される。合成プラットフォーム染色体は複数の部位特異的組換え部位を含むため、複数の遺伝子が単一の合成プラットフォーム染色体にロードされ得る。部位特異的組換えに介在するリコンビナーゼは、送達ベクターにリコンビナーゼの遺伝子をコードすることによって細胞に送達されてもよく、又は精製若しくはカプセル化リコンビナーゼタンパク質が標準的な技術を用いて受容細胞に送達されてもよい。複数の遺伝子の各々は、その独自の調節性制御システムの制御下にあってもよく；或いは、複数の遺伝子の発現は、ウイルスベースのエレメント又はヒト配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメント（例えば、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）ら著、トレンド・イン・バイオケミカル・サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．）、第１５巻、ｐ．４７７～８３、１９９０年；及びウマール（Ｏｕｍａｒｄ）ら著、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２０巻、ｐ．２７５５～２７５９、２０００年を参照）又は２Ａ自己切断ペプチド（キム（Ｋｉｍ）ら著、プロス・ワン（ＰＬｏＳ ＯＮＥ）、第６巻、第４号、ｐ．ｅ１８５５６．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１８５５６を参照）によって協調的に調節されてもよい。加えて、標的遺伝子から下流で蛍光マーカ－例えば、緑色、赤色又は青色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ）－に連結されたＩＲＥＳ型エレメント又は２Ａペプチドを使用すると、組み込まれた標的遺伝子を発現する合成プラットフォーム染色体を同定することが可能になる。それに代えて又は加えて、ＰＣＲによる組込みの検出用にプライマーを設計することにより、合成染色体上での部位特異的組換えイベントを迅速にスクリーニングし得る。
【0058】
合成染色体作製細胞への構成要素の送達
合成染色体作製に適切な構成要素及び１つ又は複数の送達ベクターは、当該技術分野において公知の任意の方法により受容細胞に送達することができる。用語のトランスフェクション及び形質転換は、任意のコード配列が実際に発現するか否かに関わらず、外因性核酸、例えば発現ベクターが宿主細胞によって取り込まれることを指す。例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性形質転換、プロトプラスト形質転換（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在性形質転換、電気穿孔、プロトプラスト融合、及びマイクロセル融合を含む）、脂質介在性送達、リポソーム、電気穿孔、ソノポレーション、マイクロインジェクション、パーティクルボンバードメント及び炭化ケイ素ウイスカ介在性形質転換及びこれらの組み合わせ（例えば、パシュコフスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）ら著、エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、第３巻、ｐ．２７１７～２７２２、１９８４年；ポトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）ら著、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１９９巻、ｐ．１６９～１７７、１９８５年；ライヒ（Ｒｅｉｃｈ）ら著、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第４巻、ｐ．１００１～１００４、１９８６年；クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３２７巻、ｐ．７０～７３、１９８７年；米国特許第６，１４３，９４９号明細書；パシュコフスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）ら著、「植物の細胞培養及び体細胞遺伝学（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ）」、第６巻、「植物核遺伝子の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ）」、シェル（Ｓｃｈｅｌｌ）及びバシル（Ｖａｓｉｌ）編、アカデミック・パブリッシャーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９８９年；及びフレーム（Ｆｒａｍｅ）ら著、プラント・ジャーナル（Ｐｌａｎｔ Ｊ．）、第６巻、ｐ．９４１～９４８、１９９４年を参照）；リン酸カルシウムを使用した直接取込み（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第７６巻、ｐ．１３７３～１３７６、１９７９年）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在性ＤＮＡ取込み；リポフェクション（例えば、シュトラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ）著、メソッド・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第５４巻、ｐ．３０７～３２７、１９９６年を参照）；マイクロセル融合（ランバート（Ｌａｍｂｅｒｔ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第８８巻、ｐ．５９０７～５９１１、１９９１年；米国特許第５，３９６，７６７号明細書；ソーフォード（Ｓａｗｆｏｒｄ）ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１３巻、ｐ．２７９～２８４、１９８７年；ダール（Ｄｈａｒ）ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１０巻、ｐ．５４７～５５９、１９８４年；及びマクニール＝キラリー（ＭｃＮｅｉｌｌ－Ｋｉｌｌａｒｙ）ら著、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．ＥｎｚｙｍｏＬ）、第２５４巻、ｐ．１３３～１５２、１９９５年）；脂質介在性担体システム（例えば、テイフェル（Ｔｅｉｆｅｌ）ら著、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第１９巻、ｐ．７９～８０、１９９５年；アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら著、アニュアルズ・オブ・ヘマトロジー（Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．）、第７２巻、ｐ．７３～７９、１９９６年；ホルメン（Ｈｏｌｍｅｎ）ら著、インビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー・アニマル（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．）、第３１巻、ｐ．３４７～３５１、１９９５年；レミー（Ｒｅｍｙ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．）、第５巻、ｐ．６４７～６５４、１９９４年；ル・ボルシュ（Ｌｅ Ｂｏｌｃｈ）ら著、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、第３６巻、ｐ．６６８１～６６８４、１９９５年；及びレフラー（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）ら著、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．ＥｎｚｙｍｏＬ）、第２１７巻、ｐ．５９９～６１８、１９９３年を参照）；又は他の好適な方法による数多くのトランスフェクション方法が当業者に公知である。合成染色体の送達方法はまた、米国特許出願第０９／８１５，９７９号明細書にも記載されている。トランスフェクションの成功は、概して、トランスフェクト細胞内における異種核酸の存在の検出、例えば、異種核酸の何らかの視覚化、選択可能マーカの発現又は宿主細胞内での合成プラットフォーム染色体又は送達ベクターの作動の何らかの指標などによって認識される。本発明の実施において有用な送達方法の説明については、米国特許第５，０１１，７７６号明細書；米国特許第５，７４７，３０８号明細書；米国特許第４，９６６，８４３号明細書；米国特許第５，６２７，０５９号明細書；米国特許第５，６８１，７１３号明細書；キム（Ｋｉｍ）及びエーベルワイン（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）著、アナリティカル・アンド・バイオアナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、第３９７巻、第８号、ｐ．３１７３～３１７８、２０１０年を参照のこと。
合成染色体作製に適切な構成要素及び１つ又は複数の送達ベクターは、当該技術分野において公知の任意の方法により受容細胞に送達することができる。用語のトランスフェクション及び形質転換は、任意のコード配列が実際に発現するか否かに関わらず、外因性核酸、例えば発現ベクターが宿主細胞によって取り込まれることを指す。例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性形質転換、プロトプラスト形質転換（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在性形質転換、電気穿孔、プロトプラスト融合、及びマイクロセル融合を含む）、脂質介在性送達、リポソーム、電気穿孔、ソノポレーション、マイクロインジェクション、パーティクルボンバードメント及び炭化ケイ素ウイスカ介在性形質転換及びこれらの組み合わせ（例えば、パシュコフスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）ら著、エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、第３巻、ｐ．２７１７～２７２２、１９８４年；ポトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）ら著、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１９９巻、ｐ．１６９～１７７、１９８５年；ライヒ（Ｒｅｉｃｈ）ら著、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第４巻、ｐ．１００１～１００４、１９８６年；クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３２７巻、ｐ．７０～７３、１９８７年；米国特許第６，１４３，９４９号明細書；パシュコフスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）ら著、「植物の細胞培養及び体細胞遺伝学（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ
Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ）」、第６巻、「植物核遺伝子の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ）」、シェル（Ｓｃｈｅｌｌ）及びバシル（Ｖａｓｉｌ）編、アカデミック・パブリッシャーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９８９年；及びフレーム（Ｆｒａｍｅ）ら著、プラント・ジャーナル（Ｐｌａｎｔ Ｊ．）、第６巻、ｐ．９４１～９４８、１９９４年を参照）；リン酸カルシウムを使用した直接取込み（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第７６巻、ｐ．１３７３～１３７６、１９７９年）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在性ＤＮＡ取込み；リポフェクション（例えば、シュトラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ）著、メソッド・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第５４巻、ｐ．３０７～３２７、１９９６年を参照）；マイクロセル融合（ランバート（Ｌａｍｂｅｒｔ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第８８巻、ｐ．５９０７～５９１１、１９９１年；米国特許第５，３９６，７６７号明細書；ソーフォード（Ｓａｗｆｏｒｄ）ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１３巻、ｐ．２７９～２８４、１９８７年；ダール（Ｄｈａｒ）ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１０巻、ｐ．５４７～５５９、１９８４年；及びマクニール＝キラリー（ＭｃＮｅｉｌｌ－Ｋｉｌｌａｒｙ）ら著、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．ＥｎｚｙｍｏＬ）、第２５４巻、ｐ．１３３～１５２、１９９５年）；脂質介在性担体システム（例えば、テイフェル（Ｔｅｉｆｅｌ）ら著、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第１９巻、ｐ．７９～８０、１９９５年；アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら著、アニュアルズ・オブ・ヘマトロジー（Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．）、第７２巻、ｐ．７３～７９、１９９６年；ホルメン（Ｈｏｌｍｅｎ）ら著、インビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー・アニマル（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．）、第３１巻、ｐ．３４７～３５１、１９９５年；レミー（Ｒｅｍｙ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．）、第５巻、ｐ．６４７～６５４、１９９４年；ル・ボルシュ（Ｌｅ Ｂｏｌｃｈ）ら著、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、第３６巻、ｐ．６６８１～６６８４、１９９５年；及びレフラー（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）ら著、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．ＥｎｚｙｍｏＬ）、第２１７巻、ｐ．５９９～６１８、１９９３年を参照）；又は他の好適な方法による数多くのトランスフェクション方法が当業者に公知である。合成染色体の送達方法はまた、米国特許出願第０９／８１５，９７９号明細書にも記載されている。トランスフェクションの成功は、概して、トランスフェクト細胞内における異種核酸の存在の検出、例えば、異種核酸の何らかの視覚化、選択可能マーカの発現又は宿主細胞内での合成プラットフォーム染色体又は送達ベクターの作動の何らかの指標などによって認識される。本発明の実施において有用な送達方法の説明については、米国特許第５，０１１，７７６号明細書；米国特許第５，７４７，３０８号明細書；米国特許第４，９６６，８４３号明細書；米国特許第５，６２７，０５９号明細書；米国特許第５，６８１，７１３号明細書；キム（Ｋｉｍ）及びエーベルワイン（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）著、アナリティカル・アンド・バイオアナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、第３９７巻、第８号、ｐ．３１７３～３１７８、２０１０年を参照のこと。
【0059】
受容免疫細胞の視覚化、単離、及びトランスファー
本発明の合成プラットフォーム染色体の作製及びローディングは、様々な方法によってモニタすることができる。リンデンバウム（Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ）及びパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）ら著、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３２巻、第２１号、ｐ．ｅｌ７２、２００４年は、先行技術のテクノロジーを用いた哺乳類サテライトＤＮＡベースの人工染色体発現（ＡＣＥ）システムの作製について記載している。この先行技術のシステムでは、ＰＣＲ生成したプローブ又はニック翻訳を受けたプローブを使用して従来の単色及び二色ＦＩＳＨ分析並びに高分解能ＦＩＳＨが行われた。テロメア配列の検出のため、有糸分裂スプレッドが、市販品から入手されたペプチド核酸プローブとハイブリダイズされた。蛍光顕微鏡法を用いて顕微鏡法が実施された。或いは、２０１６年２月９日に出願されたパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）及びグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、ＰＣＴ／ＵＳ１６／１７１７９号明細書が、２つの標識したタグ：合成プラットフォーム染色体の作製に使用する細胞株内の内因性染色体に特異的な１つの標識タグ、及び作製しようとする合成染色体上の配列に特異的な１つの異なる標識のタグを用いて標準化された蛍光技術による合成染色体形成のリアルタイムモニタリングを可能にする組成物及び方法について記載している。
本発明の合成プラットフォーム染色体の作製及びローディングは、様々な方法によってモニタすることができる。リンデンバウム（Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ）及びパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）ら著、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３２巻、第２１号、ｐ．ｅｌ７２、２００４年は、先行技術のテクノロジーを用いた哺乳類サテライトＤＮＡベースの人工染色体発現（ＡＣＥ）システムの作製について記載している。この先行技術のシステムでは、ＰＣＲ生成したプローブ又はニック翻訳を受けたプローブを使用して従来の単色及び二色ＦＩＳＨ分析並びに高分解能ＦＩＳＨが行われた。テロメア配列の検出のため、有糸分裂スプレッドが、市販品から入手されたペプチド核酸プローブとハイブリダイズされた。蛍光顕微鏡法を用いて顕微鏡法が実施された。或いは、２０１６年２月９日に出願されたパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）及びグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、ＰＣＴ／ＵＳ１６／１７１７９号明細書が、２つの標識したタグ：合成プラットフォーム染色体の作製に使用する細胞株内の内因性染色体に特異的な１つの標識タグ、及び作製しようとする合成染色体上の配列に特異的な１つの異なる標識のタグを用いて標準化された蛍光技術による合成染色体形成のリアルタイムモニタリングを可能にする組成物及び方法について記載している。
【0060】
合成染色体の単離及びトランスファーには、典型的には、微小核細胞融合（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＭＭＣＴ）技術又は色素依存的染色体染色と、続くフローサイトメトリーベースのソーティングが関わる。ＭＭＣＴ技術では、ドナー細胞が化学的に誘導されてその染色体が多核化され、続いて微小細胞にパッケージングされ、最終的に受容細胞に融合される。合成染色体が受容細胞にトランスファーされたことの確認は、薬物選択及びＦＩＳＨによって確かめられる、トランスファーされた染色体のインタクトな送達により行われる。或いは、フローサイトメトリーベースのトランスファーを用いてもよい。フローサイトメトリーベースのトランスファーについては、有糸分裂を停止させた染色体が単離され、ＤＮＡ特異的色素で染色され、及びサイズ及び異なる色素染色に基づきフローソーティングされる。フローソーティングされた染色体は、次に標準的なＤＮＡトランスフェクション技術によって受容細胞に送達され、インタクトな染色体の送達がＦＩＳＨによって判定される。更に別の代替例では、２０１６年２月９日に出願されたパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）及びグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、ＰＣＴ／ＵＳ１６／１７１７９号明細書に記載される合成染色体作製の視覚化及びモニタリングに加え、合成染色体タグを使用してフローサイトメトリーによって合成染色体作製細胞から合成染色体を単離し、並びに受容細胞への合成染色体のトランスファーをモニタすることができる。
【0061】
（実施例）
実施例１：サテライトＤＮＡベースの人工染色体のデノボ作成
合成染色体（ｃｈｒｏｍｏｍｓｏｍｅ）のデノボ作製のため、外因性ＤＮＡ配列をＨＴ１０８０合成染色体生成細胞株に導入し、それがアクロセントリック染色体のセントロメア周辺ヘテロクロマチン領域に組み込まれると、アクロセントリック染色体の短腕（ｒＤＮＡ／セントロメア領域）の大規模増幅が惹起された。増幅イベントの間にセントロメアが複製されて２つの活性セントロメアを有する二動原体染色体になった。続く有糸分裂イベントによって二動原体染色体の切断及び分離が起こり、主にサテライト反復配列を含む約２０～１２０Ｍｂサイズの離脱につながり、そこには増幅されたｒＤＮＡコピーも含み得る共増幅されたトランスフェクト導入遺伝子のサブドメインが含まれた。新規に作成された合成染色体は、内因性染色体タグ及びＨＴ１０８０合成染色体生成細胞株内に操作された合成染色体タグを用いた蛍光染色体ペイント（又はＦＩＳＨ）の観察によってバリデートされる。
実施例１：サテライトＤＮＡベースの人工染色体のデノボ作成
合成染色体（ｃｈｒｏｍｏｍｓｏｍｅ）のデノボ作製のため、外因性ＤＮＡ配列をＨＴ１０８０合成染色体生成細胞株に導入し、それがアクロセントリック染色体のセントロメア周辺ヘテロクロマチン領域に組み込まれると、アクロセントリック染色体の短腕（ｒＤＮＡ／セントロメア領域）の大規模増幅が惹起された。増幅イベントの間にセントロメアが複製されて２つの活性セントロメアを有する二動原体染色体になった。続く有糸分裂イベントによって二動原体染色体の切断及び分離が起こり、主にサテライト反復配列を含む約２０～１２０Ｍｂサイズの離脱につながり、そこには増幅されたｒＤＮＡコピーも含み得る共増幅されたトランスフェクト導入遺伝子のサブドメインが含まれた。新規に作成された合成染色体は、内因性染色体タグ及びＨＴ１０８０合成染色体生成細胞株内に操作された合成染色体タグを用いた蛍光染色体ペイント（又はＦＩＳＨ）の観察によってバリデートされる。
【0062】
トランスフェクションの前日、ＨＴ１０８０合成染色体生成細胞株の細胞を約２．０～８．０×１０４接着細胞密度となるように２４ウェル組織培養ディッシュに分け、外来ＤＮＡを含むベクターを精製し（例えば、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）エンドフリー・プラスミド・マキシキット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ）を使用）、線状化し、及びトランスフェクション用にベクターの濃度を決定した。培養ＨＴ１０８０細胞は、トランスフェクション前に３～５時間フィードした。標準的なトランスフェクション試薬、例えば、サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のビアフェクト（Ｖｉａｆｅｃｔ）、又はインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のリン酸カルシウムトランスフェクションキットを使用したＨＴ１０８０細胞のトランスフェクションには、２４ウェルセミコンフルエント組織培養ディッシュ当たり２２５ｎｇのｐＳＴＶ２８ＨｕｒＤＮＡベクター及び１２．５ｎｇ ｐ１５Ａ７２４８ｌａｃＥＦ１ａｔｔＰＰｕｒｏベクターを使用した。ｐＳＴＶ２８ＨｕｒＤＮＡベクターはリボソームＤＮＡ配列を含む。ｐ１５Ａ７２４８ｌａｃＥＦ１ａｔｔＰＰｕｒｏベクターは、部位特異的組換えシステムの構成要素、ＬａｃＯリピート並びにアンピシリン及びピューロマイシン耐性遺伝子を含む。細胞をトランスフェクション後１～３日間維持した時点でそれらをトリプシン処理し、１０ｃｍディッシュにリプレーティングした。プレーティング時又はプレーティングの１～３日後に１０ｃｍディッシュに選択培地を加えた。２～３日おきに培地を交換しながら選択的条件を１０～２１日間維持した。コロニーが直径２～３ｍｍに達したところで抗生物質耐性クローンをピックした。十分に離れているコロニーが好ましかった。クローニングシリンダ及びトリプシンを使用して細胞を剥がし取り、２４ウェルプレートに移して増殖させた。
【0063】
実施例２：ＴＥＴリプレッサー及びクマートリプレッサー送達ベクターの作成
合成プラットフォーム染色体に取り込まれる調節可能なプロモータシステムの一実施形態は、ＴＥＴ－ＯＮ、ドキシサイクリン誘導性発現システム（クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））である。ｐＡＰＰ５００ベクターを骨格送達ベクターとして使用してＴＥＴ－ＯＮ転写調節因子を合成染色体に挿入した。端的には、ｐＥＦ１α－Ｔｅｔ３Ｇ転写調節因子を制限消化（ＢｓｒＧＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）によって単離し、次に５’末端を埋め、ＥｃｏＲＶで消化したｐＡＰＰ５００にライゲートした。得られたプラスミドベクター（ｐＡＰＰ５１０；図６：ｐＡｐｐ５９０には、以下のエレメントが存在する：ＳＶ４０＼ポリＡ／シグナル＝ＳＶ４０ポリＡ；ａｔｔＢ、ＡｔｔＬ＿Ｚｅｏ＝部位特異的組換え部位；ヒト／ＥＦ１ａ／Ｐｒ＝プロモータ；Ｔｅｔ－Ｏｎ／３Ｇ＝転写調節因子；ｆ１起点＝複製起点；ＺｅｏＲ＝ゼオシン耐性）は、合成プラットフォーム染色体へのターゲティング用のａｔｔＢ組換え部位の後ろにコードされたプロモータレスゼオシン耐性マーカ遺伝子、及びＴＥＴ－ＯＮ転写調節因子を含む。
合成プラットフォーム染色体に取り込まれる調節可能なプロモータシステムの一実施形態は、ＴＥＴ－ＯＮ、ドキシサイクリン誘導性発現システム（クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））である。ｐＡＰＰ５００ベクターを骨格送達ベクターとして使用してＴＥＴ－ＯＮ転写調節因子を合成染色体に挿入した。端的には、ｐＥＦ１α－Ｔｅｔ３Ｇ転写調節因子を制限消化（ＢｓｒＧＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）によって単離し、次に５’末端を埋め、ＥｃｏＲＶで消化したｐＡＰＰ５００にライゲートした。得られたプラスミドベクター（ｐＡＰＰ５１０；図６：ｐＡｐｐ５９０には、以下のエレメントが存在する：ＳＶ４０＼ポリＡ／シグナル＝ＳＶ４０ポリＡ；ａｔｔＢ、ＡｔｔＬ＿Ｚｅｏ＝部位特異的組換え部位；ヒト／ＥＦ１ａ／Ｐｒ＝プロモータ；Ｔｅｔ－Ｏｎ／３Ｇ＝転写調節因子；ｆ１起点＝複製起点；ＺｅｏＲ＝ゼオシン耐性）は、合成プラットフォーム染色体へのターゲティング用のａｔｔＢ組換え部位の後ろにコードされたプロモータレスゼオシン耐性マーカ遺伝子、及びＴＥＴ－ＯＮ転写調節因子を含む。
【0064】
複数の調節可能な抗癌抗体断片の産生の「原理証明」として、ＴＥＴ－ＯＮを含む合成プラットフォーム染色体に第２の調節可能遺伝子発現システム（クマートＯＮ）を組み込む。クマートＯＮ転写調節因子（ＣｙｍＲ）をｐＡＰＰ５７０にクローニングした。ｐＡＰＰ５７０は、ａｔｔＢ組換え部位の後ろにコードされたプロモータレスハイグロマイシン耐性マーカ遺伝子を含む。端的には、クマートＯＮ転写調節因子を含むｐＵＣＭＡＲ１ＣｙｍＲをＳａｌＩで消化し、次にクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理して５’末端を埋め、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで消化してクレノウ処理したｐＡＰＰ５７０にライゲートした。得られたプラスミドベクター（ｐＡＰＰ５９０；図７：ｐＡｐｐ５９０には、以下のエレメントが存在する：ＳＶ４０＼ポリＡ／シグナル＝ＳＶ４０ポリＡ；ａｔｔＢ＝部位特異的組換え部位；ＥＦ１Ａ１配列＝プロモータ；ＡｍｐＲ、ＨｙｇＲ、ＣｙｍＲ＝薬剤耐性遺伝子；ｏｒｉ＝複製起点；ＨＡタグ＝ヒトインフルエンザ（ｉｎｆｌｕｃｅｎｚａ）赤血球凝集素エピトープタグ；ｂＧＨポリＡ及び３’ＵＴＲポーズ＝ポリＡ；ＭＡＲ＝マトリックス付着領域））は、合成プラットフォーム染色体へのターゲティング用のａｔｔＢ組換え部位の後ろにコードされたプロモータレスハイグロマイシン耐性マーカ遺伝子及びクマートＯＮ転写調節因子を含む。
【0065】
実施例３：合成染色体へのＴＥＴ－ＯＮ及びクマートＯＮ転写調節因子のローディング
ｐＡＰＰ５１０及びｐＡＰＰ５９０ベクターを送達ベクターとして使用して、それぞれＴＥＴ－ＯＮ転写調節因子及びクマートＯＮ転写調節因子を合成染色体に逐次的に挿入する。０日目、合成染色体（ｈＳｙｎＣ）を含有する受容細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）を２４ウェルディッシュの１ウェル当たり約４Ｅ４細胞で播種し、ウェルが１日目に約７０％コンフルエントになる。適切な培地（例えば、ＨＴ１０８０についてＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ３）中において細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。１日目、製造者の指示に従い（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ）、プラス（Ｐｌｕｓ）試薬含有）、送達ベクター（例えば、ｐＡＰＰ５１０）及び組換えタンパク質をコードするプラスミド（例えばｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ）の両方をＨＴ１０８０細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションはデュプリケートで実施して、薬物選択の比較及び直接的な細胞ソーティングを行うことができるようにする。リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ）をオプティメム（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）；トランスフェクトする２４ウェルディッシュの各ウェルにつき１．５μｌ ＬＴＸ／５０μｌ オプティメム（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ））に希釈し、オプティメム（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）中５０μｌの希釈ＬＴＸに２５０ｎｇ ＤＮＡ（例えば１２５ｎｇ ｐＡＰＰ５１０プラスミド及び１２５ｎｇ ｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ／ウェル）を加える。各約５０μｌ ＤＮＡ－ＬＴＸ－オプティメム（Ｏｐｔｉ＿ＭＥＭ）試料に０．２５μｌのプラス（ＰＬＵＳ）試薬を加え、各試料を室温で５分間インキュベートする。次に、この５分間のインキュベーション中に、０日目にプレーティングした細胞から培地を取り除き、新鮮培地を使用して培地を交換する。この細胞にＤＮＡ－脂質複合体を加えて、適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｐＡＰＰ５１０及びｐＡＰＰ５９０ベクターを送達ベクターとして使用して、それぞれＴＥＴ－ＯＮ転写調節因子及びクマートＯＮ転写調節因子を合成染色体に逐次的に挿入する。０日目、合成染色体（ｈＳｙｎＣ）を含有する受容細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）を２４ウェルディッシュの１ウェル当たり約４Ｅ４細胞で播種し、ウェルが１日目に約７０％コンフルエントになる。適切な培地（例えば、ＨＴ１０８０についてＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ３）中において細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。１日目、製造者の指示に従い（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ）、プラス（Ｐｌｕｓ）試薬含有）、送達ベクター（例えば、ｐＡＰＰ５１０）及び組換えタンパク質をコードするプラスミド（例えばｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ）の両方をＨＴ１０８０細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションはデュプリケートで実施して、薬物選択の比較及び直接的な細胞ソーティングを行うことができるようにする。リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ）をオプティメム（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）；トランスフェクトする２４ウェルディッシュの各ウェルにつき１．５μｌ ＬＴＸ／５０μｌ オプティメム（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ））に希釈し、オプティメム（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）中５０μｌの希釈ＬＴＸに２５０ｎｇ ＤＮＡ（例えば１２５ｎｇ ｐＡＰＰ５１０プラスミド及び１２５ｎｇ ｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ／ウェル）を加える。各約５０μｌ ＤＮＡ－ＬＴＸ－オプティメム（Ｏｐｔｉ＿ＭＥＭ）試料に０．２５μｌのプラス（ＰＬＵＳ）試薬を加え、各試料を室温で５分間インキュベートする。次に、この５分間のインキュベーション中に、０日目にプレーティングした細胞から培地を取り除き、新鮮培地を使用して培地を交換する。この細胞にＤＮＡ－脂質複合体を加えて、適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
【0066】
２～２４日目、薬物選択を実施する。デュプリケート２４ウェルのウェルのうちの１つからの細胞をトリプシン処理し、薬物選択（例えば、１００μｇ／ｍｌのゼオシン）を含む新鮮培地が入った１０ｃｍディッシュに移す。次に細胞を適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、コロニー形成に関してモニタする。培地は約７２時間毎に交換する。個別コロニーが形成されたら（約１０日）、各コロニーをガラスシリンダによって単離し、トリプシン処理して、２４ウェルディッシュのウェルに移す。次に、クローンを低温貯蔵下に置いてＰＣＲ分析用のゲノムＤＮＡを単離するのに十分な細胞が利用可能になるまで、これらの「クローン」を培養下で増殖させる（約２週間；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウィザードＳＶ（Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ）ゲノムＤＮＡ精製）。
【0067】
目的の遺伝子／ＤＮＡエレメントを含有する送達ベクターの組込みは、適切なＰＣＲプライマーを使用した合成染色体と送達ベクター（ｐＡＰＰ５１０）との間の組換え部位にわたるユニークなＰＣＲ産物の産生によって同定される。試験ゲノムＤＮＡ試料と併せて、水と宿主ゲノムＤＮＡ（例えばＨＴ１０８０）との陰性対照ＰＣＲ反応を実施する。
【0068】
合成染色体に正しくロードされたＴＥＴ－ＯＮ転写調節因子を含む候補クローンを同定した後、ＴＥＴ－ＯＮ転写調節因子がＴＲＥ－ｔｉｇｈｔプロモータ（ＴｅｔＰ）の制御下にある分泌型ルシフェラーゼの発現を制御する能力を評価する試験を実施する。ドキシサイクリン（ＴＥＴ－ＯＮ誘導因子）を含まない培地で低いルシフェラーゼ発現及びドキシサイクリンの存在下で高発現を示す候補クローンを長期低温貯蔵下に置く。「Ａ１」と命名される最良の候補クローンをクマートＯＮ転写調節因子の送達に選択する。このシステムは、合成プラットフォーム染色体にあるときＴＥＴ－ＯＮプロモータの調節性制御下にある一過性にトランスフェクトしたルシフェラーゼ遺伝子レポータのロバストなドキシサイクリン依存性の誘導を実証する。
【0069】
ＴＥＴ－ＯＮ転写調節因子を含むＡ１細胞株にクマートＯＮ転写調節因子を送達する。０日目、予めＴＥＴ－ＯＮ転写調節因子をロードした合成染色体（ｈＳｙｎＣ）を含有する受容細胞株（例えば、ＨＴ１０８０－Ａ１）を２４ウェルディッシュの１ウェル当たり約４Ｅ４細胞で播種し、ウェルが１日目に約７０％コンフルエントになる。適切な培地（例えば、ＨＴ１０８０についてＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ３）中において細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。１日目、製造者の指示に従い（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ）、プラス（Ｐｌｕｓ）試薬含有）、送達ベクター（例えば、ｐＡＰＰ５９０）及び組換えタンパク質をコードするプラスミド（例えばｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ）の両方をＨＴ１０８０－Ａ１細胞株にトランスフェクトする。トランスフェクションはデュプリケートで実施して、薬物選択の比較及び直接的な細胞ソーティングを行うことができるようにする。リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ）をオプティメム（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）；トランスフェクトする２４ウェルディッシュの各ウェルにつき１．５μｌ ＬＴＸ／５０μｌ オプティメム（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ））に希釈し、オプティメム（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）中５０μｌの希釈ＬＴＸに２５０ｎｇ ＤＮＡ（例えば１２５ｎｇ ｐＡＰＰ５９０プラスミド及び１２５ｎｇ ｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ／ウェル）を加える。各約５０μｌ ＤＮＡ－ＬＴＸ－オプティメム（Ｏｐｔｉ＿ＭＥＭ）試料に０．２５μｌのプラス（ＰＬＵＳ）試薬を加え、各試料を室温で５分間インキュベートする。次に、この５分間のインキュベーション中に、０日目にプレーティングした細胞から培地を取り除き、新鮮培地を使用して培地を交換する。この細胞にＤＮＡ－脂質複合体を加えて、適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
【0070】
２～２４日目、薬物選択を実施する。デュプリケート２４ウェルのウェルのうちの１つからの細胞をトリプシン処理し、薬物選択（例えば、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン）を含む新鮮培地が入った１０ｃｍディッシュに移す。次に細胞を適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、コロニー形成に関してモニタする。培地は約７２時間毎に交換する。個別コロニーが形成されたら（約１０日）、各コロニーをガラスシリンダによって単離し、トリプシン処理して、２４ウェルディッシュのウェルに移す。次に、クローンを低温貯蔵下に置いてＰＣＲ分析用のゲノムＤＮＡを単離するのに十分な細胞が利用可能になるまで、これらの「クローン」を培養下で増殖させる（約２週間；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウィザードＳＶ（Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ）ゲノムＤＮＡ精製）。
【0071】
目的の遺伝子／ＤＮＡエレメントを含有する送達ベクターの組込みは、適切なＰＣＲプライマーを使用した合成染色体と送達ベクター（ｐＡＰＰ５９０）との間の組換え部位にわたるユニークなＰＣＲ産物の産生によって同定される。試験ゲノムＤＮＡ試料と併せて、水と宿主ゲノムＤＮＡ（例えばＡ１）との陰性対照ＰＣＲ反応を実施する。
【0072】
合成染色体に正しくロードされたクマートＯＮ転写調節因子を含む候補クローンを同定した後、クマートＯＮ転写調節因子がクマート応答性プロモータ（ＣＭＶ＋ＣｕＯプロモータ）の制御下にある分泌型ルシフェラーゼの発現を制御する能力を評価する試験を実施した。クマート（クマートＯＮ誘導因子）を含まない培地で低いルシフェラーゼ発現及びクマートの存在下で高発現を示す候補クローンを長期低温貯蔵下に置くことになる。
【0073】
実施例４：２つの別個の誘導性プロモータシステムからの複数のｓｃＦｖ断片の発現
臨床経験が示すところによれば、癌療法及び感染症に対しては、概して単剤治療よりもマルチターゲット手法が優れている。その柔軟性及びロバスト性に基づき、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、癌及び感染症の治療の新規治療モダリティに関係があるとされている。従って、バイオエンジニアリングを受けたＭＳＣ、又は他の更なる幹細胞集団には、有効な治療法がない癌及び感染症に対する新規対抗手段として特別な有用性がある。更に、幹細胞ベースの療法によって送達される治療的因子の局所送達により、特に毒性薬剤の全身送達に関連する薬理学的制約を回避し得る。複数の調節可能な治療的因子を送達するように操作された合成プラットフォーム染色体の組み合わせは、種々の疾患状態を標的化するように調整し得る治療手法として多大な可能性を有する。
臨床経験が示すところによれば、癌療法及び感染症に対しては、概して単剤治療よりもマルチターゲット手法が優れている。その柔軟性及びロバスト性に基づき、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、癌及び感染症の治療の新規治療モダリティに関係があるとされている。従って、バイオエンジニアリングを受けたＭＳＣ、又は他の更なる幹細胞集団には、有効な治療法がない癌及び感染症に対する新規対抗手段として特別な有用性がある。更に、幹細胞ベースの療法によって送達される治療的因子の局所送達により、特に毒性薬剤の全身送達に関連する薬理学的制約を回避し得る。複数の調節可能な治療的因子を送達するように操作された合成プラットフォーム染色体の組み合わせは、種々の疾患状態を標的化するように調整し得る治療手法として多大な可能性を有する。
【0074】
一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）タンパク質は、細胞増殖抑制性／細胞傷害性バイオ薬剤のターゲット送達に魅力的な治療剤である。ｓｃＦｖは、抗体ＶＨ及びＶＬドメインで構成された小型の抗原結合タンパク質であり、腫瘍床を精緻に標的化してそこに侵入することができ、又は感染症病原体を標的化することができる。ｓｃＦｖはサイズが小さいため、免疫毒素ベースの遺伝子療法用の細胞傷害性タンパク質との融合に適している。幾つもの選択の腫瘍マーカ（ｍａｋｅｒ）ｓｃＦｖを利用して、インビトロ及びインビボの両方における合成プラットフォーム染色体からの複数のｓｃＦｖの調節可能な産生を実証する。
【0075】
Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２；図８のｓｃＦｖ１）、ベイシジン（ｂａｓｉｇｅｎ）（図８のｓｃＦｖ２）、ｃ－ｋｉｔ（図８のｓｃＦｖ３）、及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ；図８のｓｃＦｖ４）を標的とする４つのｓｃＦｖ ＤＮＡクローンを発現させる。これらのクローンは４つとも全て、適切な商業的供給業者（ソース・バイオサイエンス社（Ｓｏｕｒｃｅ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、アドジーン（Ａｄｄｇｅｎｅ））から入手する。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅し、ルシフェラーゼレポータコンストラクト（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））で各々のＮ末端融合を行う。ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２は分泌型ガウシアルシフェラーゼレポータに融合し、ｓｃＦｖ３及びｓｃＦｖ４は分泌型ウミホタルルシフェラーゼレポータに融合する。これらの２個の超高感度分泌型ルシフェラーゼレポータを利用すると、各ルシフェラーゼが独自の基質を利用するため（即ち一方のルシフェラーゼの検出を所与の試料中の他方の存在によるいかなる交差反応性もなく測定することができる）、デュアルアッセイフォーマットで発現をモニタすることが可能になる。ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２をクローニングし、ＴＥＴ－ＯＮプロモータ（図８のＴｅｔＰ）の制御下に置く。複数の調節可能な発現のため、クマートスイッチＯＮシステム（システム・バイオサイエンシーズ社（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）から市販されているシステム）もまた利用する。ＴＥＴ－ＯＮシステムと同様に、クマートスイッチＯｎシステムは、Ｃｙｍリプレッサー（ｃｙｍＲ；当初はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に由来した）がＣＭＶ５プロモータの下流のクマートオペレータ部位に結合して転写を遮断することにより機能する。クマートの存在下では抑制が緩和され、転写が可能になる。クマートスイッチＯＮシステムはインビトロ適用に広く用いられており、ＴＥＴ－ＯＮシステムのパフォーマンスと同等である。ｓｃＦｖ３及びｓｃＦｖ４ ＣＬｕｃ融合物はクマートスイッチＯｎプロモータの制御下に置く。ポリアデニル化シグナル及び強力な転写終結配列を全てのｓｃＦｖ発現カセットの下流に置く。
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、アドジーン（Ａｄｄｇｅｎｅ））から入手する。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅し、ルシフェラーゼレポータコンストラクト（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ））で各々のＮ末端融合を行う。ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２は分泌型ガウシアルシフェラーゼレポータに融合し、ｓｃＦｖ３及びｓｃＦｖ４は分泌型ウミホタルルシフェラーゼレポータに融合する。これらの２個の超高感度分泌型ルシフェラーゼレポータを利用すると、各ルシフェラーゼが独自の基質を利用するため（即ち一方のルシフェラーゼの検出を所与の試料中の他方の存在によるいかなる交差反応性もなく測定することができる）、デュアルアッセイフォーマットで発現をモニタすることが可能になる。ｓｃＦｖ１及びｓｃＦｖ２をクローニングし、ＴＥＴ－ＯＮプロモータ（図８のＴｅｔＰ）の制御下に置く。複数の調節可能な発現のため、クマートスイッチＯＮシステム（システム・バイオサイエンシーズ社（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）から市販されているシステム）もまた利用する。ＴＥＴ－ＯＮシステムと同様に、クマートスイッチＯｎシステムは、Ｃｙｍリプレッサー（ｃｙｍＲ；当初はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に由来した）がＣＭＶ５プロモータの下流のクマートオペレータ部位に結合して転写を遮断することにより機能する。クマートの存在下では抑制が緩和され、転写が可能になる。クマートスイッチＯＮシステムはインビトロ適用に広く用いられており、ＴＥＴ－ＯＮシステムのパフォーマンスと同等である。ｓｃＦｖ３及びｓｃＦｖ４ ＣＬｕｃ融合物はクマートスイッチＯｎプロモータの制御下に置く。ポリアデニル化シグナル及び強力な転写終結配列を全てのｓｃＦｖ発現カセットの下流に置く。
【0076】
ｓｃＦｖ発現カセットはＢＡＣ由来ｐＡＰＰ送達ベクターにタンデムでクローニングし、各発現カセットはマトリックス付着領域によって分離して最適な発現を促進し、及びあるカセットから別のカセットへの転写リードスルーを阻止する（図８の網掛けの四角）。ＢＡＣ由来ｐＡＰＰ送達ベクターは、ＧＦＰ－（図８のＢＳＲ）融合タンパク質カセットの上流にａｔｔＢ組換え配列を含むように改修される。ＧＦＰ－ＢＳＲ融合物の操作されたイントロンの範囲内に細菌性Ｅ２ＣＫプロモータが存在するため、細菌においてブラストサイジン耐性を選択可能である。更に、ＧＦＰ－ＢＳＲカセットの両側にｌｏｘ部位が隣接するため、ＧＦＰ－ＢＳＲ選択可能マーカを再利用することが可能である。このベクター、ｓｃＦｖ多重調節可能発現ＢＡＣは、全てのｓｃＦＶ発現カセットを含み、サイズが約２１Ｋｂｐである（ｐＢＬｏＶｅＬ－ＴＳＳ＿ＤｕａｌＥｘｐ＿ｓｃＦｖ；図９：ＢＬｏＶｅＬ－ＴＳＳ＿Ｄｕａｌ Ｅｘｐには、以下のエレメントが存在する：ｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、及びｓｏｐＣ＝プラスミド分割タンパク質；ＳＶ４０ｐＡｎ、Ｂ－グロビンポリＡｎ＝ポリＡ；ＴＴＳ＝転写終結シグナル；ａｔｔＢ＝部位特異的組換え部位；ｌｏｘ＝部位特異的組換え部位；ｅＧＦＰ＝蛍光タンパク質；Ｂｓｒ＝ブラストサイジン耐性遺伝子；ｒｅｐＥ＝複製開始部位；Ｏｒｉ２＝複製起点；ＣｍＲ＝クロラムフェニコール耐性遺伝子；ポリＡｎ＝ポリＡ；Ｈｅｒ ２ ｓｃＦｖ、ｃ－ｋｉｔ ｓｃＦｖ、ＣＥＡ ｓｃＦｖ＝一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）タンパク質；Ｔｅｔ応答性プロモータ又はＣＭＶ＋ＣｕＯプロモータ＝誘導性プロモータ））。
【0077】
λインテグラーゼ介在性組換えによってｓｃＦｖ発現ＢＡＣを合成プラットフォーム染色体に操作する。この発現ＢＡＣの１つの更なる特徴は、ａｔｔＢ配列に対して５’側に置かれる強力な転写終結シグナル（ＴＴＳ；図８の黒色の丸）の存在である。ＴＴＳの存在は、このエレメントが、合成プラットフォーム染色体上にないＧＦＰ＋細胞の存在をもたらすＧＦＰカセットを通じた偽の転写を防ぐかどうかについて、試験される。ＴＴＳの存在によってＧＦＰ遺伝子を通じた偽の転写が阻止された場合、より高い割合のＧＦＰ＋細胞が合成プラットフォーム染色体上における発現ＢＡＣの部位特異的組換えを反映するはずである。これが観察された場合、トランスフェクション後４８～７２時間でＧＦＰ＋細胞をフローサイトメトリー／セルソーティングによってシングルセルクローニングし、これにより合成プラットフォーム染色体が操作された細胞を得る際の薬物選択の必要性が回避される。これは潜在的に所望の合成プラットフォーム染色体クローンを得る際の１～３週間の時間の節約となり、操作効率が高くなる。
【0078】
クローンの増殖後、合成プラットフォーム染色体に発現ＢＡＣが置かれていることの確認は、ａｔｔＲ／ａｔｔＬ組換えジャンクションの存在に関するＰＣＲによって達成する。合成プラットフォーム染色体送達ベクターによるプラットフォーム染色体の操作に関する先行研究から、クローンが同定されると、合成プラットフォーム染色体上に置かれた標的ベクターの数の分布があるように見えることが観察されている。コピー数解析によれば、合成プラットフォーム染色体上に送達ベクターのシングルコピーを含むクローンもあれば、約１０コピーを持つものも、及び２０コピーを超える送達ベクターを持つものもある。ｑＰＣＲ分析を用いて、ｓｃＦｖ発現ＢＡＣのシングルコピーを含む合成プラットフォーム染色体操作クローン（２１ＫｂｐのＤＮＡの追加）、約１０コピーを含むクローン（２１０ＫｂｐのＤＮＡの追加）、及び２０コピーより多いｓｃＦｖ発現ＢＡＣを含むクローン（＞４２０ＫｂｐのＤＮＡ；それぞれ「低」、「中」、及び「高」と称される）のコピー数解析を行う。
【0079】
実施例５：ｓｃＦｖ産生のインビトロ試験
代表的な低、中、及び高コピー合成プラットフォーム染色体クローンをマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）Ｄ１ ＭＳＣ株にトランスファーし、インタクトな合成染色体操作プラットフォームの送達をＦＩＳＨ分析によって確認する。この時点で、合成プラットフォーム染色体操作細胞株は選択のｓｃＦｖの調節された産生に関してインビトロで試験する。低、中、及び高の細胞株の各々について、４つの条件下で分泌型ｓｃＦｖ産生レベルを試験する：１）ドキシサイクリン無し、クマート無し、２）ドキシサイクリン有り、クマート有り、３）ドキシサイクリン無し、クマート有り、及び４）ドキシサイクリン有り、クマート無し。ガウシア及びウミホタルルシフェラーゼアッセイシステムを製造者の指示に従い使用して（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．））、試料中におけるｓｃＦｖ－ＧＬｕｃ及びｓｃＦｖ－ＣＬｕｃの両方の融合物を測定する。試料は、誘導シグナル（ドキシサイクリン及び／又はクマート又は媒体のみ）の添加に関して時間ゼロで試験し、後続の試料は６時間、１２時間、２４時間、及び４８時間の時点でアッセイする。４８時間の時点で細胞を回収してＲＮＡを単離し、ユニークに発現した各ｓｃＦｖの存在又は非存在を、Ｈｅｒ２（ｓｃＦｖ１）、ベイシジン（ｂａｓｉｇｅｎ）（ｓｃＦｖ２）、ｃ－ｋｉｔ（ｓｃＦｖ３）、及びＣＥＡ（ｓｃＦｖ４）に特異的なプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって決定する。
代表的な低、中、及び高コピー合成プラットフォーム染色体クローンをマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）Ｄ１ ＭＳＣ株にトランスファーし、インタクトな合成染色体操作プラットフォームの送達をＦＩＳＨ分析によって確認する。この時点で、合成プラットフォーム染色体操作細胞株は選択のｓｃＦｖの調節された産生に関してインビトロで試験する。低、中、及び高の細胞株の各々について、４つの条件下で分泌型ｓｃＦｖ産生レベルを試験する：１）ドキシサイクリン無し、クマート無し、２）ドキシサイクリン有り、クマート有り、３）ドキシサイクリン無し、クマート有り、及び４）ドキシサイクリン有り、クマート無し。ガウシア及びウミホタルルシフェラーゼアッセイシステムを製造者の指示に従い使用して（ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．））、試料中におけるｓｃＦｖ－ＧＬｕｃ及びｓｃＦｖ－ＣＬｕｃの両方の融合物を測定する。試料は、誘導シグナル（ドキシサイクリン及び／又はクマート又は媒体のみ）の添加に関して時間ゼロで試験し、後続の試料は６時間、１２時間、２４時間、及び４８時間の時点でアッセイする。４８時間の時点で細胞を回収してＲＮＡを単離し、ユニークに発現した各ｓｃＦｖの存在又は非存在を、Ｈｅｒ２（ｓｃＦｖ１）、ベイシジン（ｂａｓｉｇｅｎ）（ｓｃＦｖ２）、ｃ－ｋｉｔ（ｓｃＦｖ３）、及びＣＥＡ（ｓｃＦｖ４）に特異的なプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって決定する。
【0080】
実施例６：ｓｃＦｖ産生のインビボ試験
ｓｃＦｖ産生をインビボで決定するため、低、中又は高コピーのいずれかのｓｃＦｖ発現カセットを有する合成プラットフォーム染色体を含む１×１０７細胞を６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部に皮下注射する。インビトロ試験と同様に、低、中、及び高の細胞株を注射したマウスの各々について４つの条件下で分泌型ｓｃＦｖ産生レベルを試験する：１）ドキシサイクリン無し、クマート無し、２）ドキシサイクリン有り、クマート有り、３）ドキシサイクリン無し、クマート有り、及び４）ドキシサイクリン有り、クマート無し。合計４８匹のマウスを利用してｓｃＦｖ産生をモニタする（各試験群につき４匹のマウス×４つの試験条件×３つのｓｃＦｖコピーレベル）。細胞の皮下注射後、マウスに誘導因子のｉ．ｐ．ボーラス（１ｍｇドキシサイクリン及び／又は１５０ｍｇクマート、又は媒体対照）を投与する。移植の約６時間後、ＩＶＩＳ（インビボイメージングシステム；パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．））を利用して、ルシフェラーゼを生じる合成プラットフォーム染色体操作Ｄ１ ＭＳＣの存在に関してマウスをイメージングし、尾静脈採血試料を上記に記載したとおりルシフェラーゼ活性に関して試験する。１、３、７、１０及び１４日目に更なる試料を採取し、試験する。各時点について、血液試料は当該日の誘導因子（又は媒体対照）ｉ．ｐ．投与６時間後に採取する。
ｓｃＦｖ産生をインビボで決定するため、低、中又は高コピーのいずれかのｓｃＦｖ発現カセットを有する合成プラットフォーム染色体を含む１×１０７細胞を６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの側腹部に皮下注射する。インビトロ試験と同様に、低、中、及び高の細胞株を注射したマウスの各々について４つの条件下で分泌型ｓｃＦｖ産生レベルを試験する：１）ドキシサイクリン無し、クマート無し、２）ドキシサイクリン有り、クマート有り、３）ドキシサイクリン無し、クマート有り、及び４）ドキシサイクリン有り、クマート無し。合計４８匹のマウスを利用してｓｃＦｖ産生をモニタする（各試験群につき４匹のマウス×４つの試験条件×３つのｓｃＦｖコピーレベル）。細胞の皮下注射後、マウスに誘導因子のｉ．ｐ．ボーラス（１ｍｇドキシサイクリン及び／又は１５０ｍｇクマート、又は媒体対照）を投与する。移植の約６時間後、ＩＶＩＳ（インビボイメージングシステム；パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．））を利用して、ルシフェラーゼを生じる合成プラットフォーム染色体操作Ｄ１ ＭＳＣの存在に関してマウスをイメージングし、尾静脈採血試料を上記に記載したとおりルシフェラーゼ活性に関して試験する。１、３、７、１０及び１４日目に更なる試料を採取し、試験する。各時点について、血液試料は当該日の誘導因子（又は媒体対照）ｉ．ｐ．投与６時間後に採取する。
【0081】
上記は単に本発明の原理を例示するに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載又は図示されないものの本発明の原理を具体化し、且つその趣旨及び範囲内に含まれる様々な変形例を考案可能であることが理解されるであろう。更に、本明細書に記載される例及び条件付きの文言は全て、主として、本発明の原理及び本発明者らが当該技術分野の拡大に寄与する概念についての読者の理解の助けとなることを意図し、かかる具体的に記載される例及び条件に限定されないものと解釈されなければならない。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態並びにその具体的な例を記載する本明細書における記述は全て、その構造的均等物及び機能的均等物の両方を包含することが意図される。加えて、かかる均等物は、現在公知の均等物、及び将来開発される均等物、即ち構造に関わらず同じ機能を果たす開発される任意の要素の両方を含むことが意図される。従って本発明の範囲が、本明細書に図示及び記載される例示的実施形態に限定されることは意図されない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲によって具体化される。以下の特許請求の範囲においては、用語「手段」が使用されない限り、そこに記載されるいかなる特徴又は要素も、米国特許法第１１２条第１６段落に準ずるミーンズ・プラス・ファンクション限定と解釈されてはならない。
（付記）
上記実施形態及び変更例から把握できる技術的思想について記載する。
［項目１］
各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも２つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法であって、
標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；
複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；
第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を含む第１の送達ベクターを前記第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第１の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する前記合成染色体を含む第２の受容細胞を単離するステップ；
前記第２の受容細胞を成長させるステップ；
第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸を含む第２の送達ベクターを前記第２の受容細胞にトランスフェクトするステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；及び
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する前記合成染色体を含む第３の受容細胞を単離するステップ
を含む方法。
［項目２］
前記第１及び第２の調節性制御システムが、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、Ｌａｃスイッチ誘導性、エクジソン誘導性、クマート遺伝子スイッチ又はタモキシフェン誘導性システムから選択される、項目１に記載の方法。
［項目３］
前記第１及び第２の調節性制御システムによって前記第１及び第２の標的核酸の転写を誘導するステップを更に含む、項目１に記載の方法。
［項目４］
項目１に記載の単離された第２の受容細胞。
［項目５］
項目１に記載の単離された第３の受容細胞。
［項目６］
項目１に記載の単離された第２の受容細胞からの合成染色体。
［項目７］
項目１に記載の単離された第３の受容細胞からの合成染色体。
［項目８］
各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも２つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法であって、
標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；
複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；
第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を含む第１の送達ベクターを前記第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、前記第１の標的核酸の遺伝子産物が第２の標的核酸の転写を調節するステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第１の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する前記合成染色体を含む第２の受容細胞を単離するステップ；
前記第２の受容細胞を成長させるステップ；
第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸を含む第２の送達ベクターを前記第２の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、前記第２の調節性制御システムが前記第１の標的核酸の前記遺伝子産物によって調節されるステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する前記合成染色体を含む第３の受容細胞を単離するステップ；
前記第１の遺伝子産物が作製されるように前記第１の調節性制御システムによって前記第１の標的核酸の転写を誘導するステップ；及び
前記第１の遺伝子産物によって前記第２の標的核酸の転写を調節するステップ
を含む方法。
［項目９］
前記第１の標的核酸の前記遺伝子産物が前記第２の標的核酸の転写を誘導する、項目８に記載の方法。
［項目１０］
前記第１の標的核酸の前記遺伝子産物が前記第２の標的核酸の転写を抑制する、項目８に記載の方法。
［項目１１］
前記第１の調節性制御システムが、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、Ｌａｃスイッチ誘導性、エクジソン誘導性、クマート遺伝子スイッチ又はタモキシフェン誘導性システムから選択される、項目８に記載の方法。
［項目１２］
項目８に記載の単離された第２の受容細胞。
［項目１３］
項目８に記載の単離された第３の受容細胞。
［項目１４］
項目８に記載の単離された第２の受容細胞からの合成染色体。
［項目１５］
項目８に記載の単離された第３の受容細胞からの合成染色体。
［項目１６］
各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも３つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法であって、
標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；
複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；
第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を含む第１の送達ベクターを前記第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、前記第１の標的核酸の遺伝子産物が第３の標的核酸の転写を調節するステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第１の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する前記合成染色体を含む第２の受容細胞を単離するステップ；
前記第２の受容細胞を成長させるステップ；
第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸を含む第２の送達ベクターを前記第２の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、前記第２の標的核酸の遺伝子産物が第３の標的核酸の転写を調節するステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する前記合成染色体を含む第３の受容細胞を単離するステップ；
前記第３の受容細胞を成長させるステップ；
第３の調節性制御システムの制御下にある第３の標的核酸を含む第３の送達ベクターを前記第３の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、前記第１及び第２の標的核酸の前記遺伝子産物が前記第３の調節性制御システムによる前記第３の標的核酸の転写を調節するステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第３の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第３の調節性制御システムの制御下にある前記第３の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸と前記第３の調節性制御システムの制御下にある前記第３の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１及び第２の遺伝子産物が作製されるように前記第１及び第２の調節性制御システムによって前記第１及び第２の標的核酸の転写を誘導するステップ；及び
前記第１及び第２の遺伝子産物によって前記第３の標的核酸の転写を調節するステップを含む方法。
［項目１７］
前記第１及び第２の遺伝子産物の両方が前記第３の標的核酸の転写の調節に必要である、項目１６に記載の方法。
［項目１８］
前記第１又は前記第２の遺伝子産物のいずれかが前記第３の標的核酸の転写を調節する、項目１６に記載の方法。
［項目１９］
前記第３の標的核酸の調節が前記第３の標的核酸の転写を誘導することである、項目１６に記載の方法。
［項目２０］
前記第３の標的核酸の調節が前記第３の標的核酸の転写を抑制することである、項目１６に記載の方法。
［項目２１］
前記第１及び第２の調節性制御システムが、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、Ｌａｃスイッチ誘導性、エクジソン誘導性、クマート遺伝子スイッチ又はタモキシフェン誘導性システムから選択される、項目１６に記載の方法。
［項目２２］
項目１６に記載の単離された第２の受容細胞。
［項目２３］
項目１６に記載の単離された第３の受容細胞。
［項目２４］
項目１６に記載の単離された第２の受容細胞からの合成染色体。
［項目２５］
項目１６に記載の単離された第３の受容細胞からの合成染色体。
［項目２６］
前記第１、第２及び第３の標的核酸を含む合成染色体を含む第４の受容細胞を単離するステップを更に含む、項目１６に記載の方法。
［項目２７］
項目２４に記載の単離された第４の受容細胞。
［項目２８］
項目１６に記載の単離された第４の受容細胞からの合成染色体。
（付記）
上記実施形態及び変更例から把握できる技術的思想について記載する。
［項目１］
各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも２つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法であって、
標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；
複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；
第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を含む第１の送達ベクターを前記第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第１の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する前記合成染色体を含む第２の受容細胞を単離するステップ；
前記第２の受容細胞を成長させるステップ；
第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸を含む第２の送達ベクターを前記第２の受容細胞にトランスフェクトするステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；及び
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する前記合成染色体を含む第３の受容細胞を単離するステップ
を含む方法。
［項目２］
前記第１及び第２の調節性制御システムが、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、Ｌａｃスイッチ誘導性、エクジソン誘導性、クマート遺伝子スイッチ又はタモキシフェン誘導性システムから選択される、項目１に記載の方法。
［項目３］
前記第１及び第２の調節性制御システムによって前記第１及び第２の標的核酸の転写を誘導するステップを更に含む、項目１に記載の方法。
［項目４］
項目１に記載の単離された第２の受容細胞。
［項目５］
項目１に記載の単離された第３の受容細胞。
［項目６］
項目１に記載の単離された第２の受容細胞からの合成染色体。
［項目７］
項目１に記載の単離された第３の受容細胞からの合成染色体。
［項目８］
各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも２つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法であって、
標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；
複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；
第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を含む第１の送達ベクターを前記第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、前記第１の標的核酸の遺伝子産物が第２の標的核酸の転写を調節するステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第１の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する前記合成染色体を含む第２の受容細胞を単離するステップ；
前記第２の受容細胞を成長させるステップ；
第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸を含む第２の送達ベクターを前記第２の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、前記第２の調節性制御システムが前記第１の標的核酸の前記遺伝子産物によって調節されるステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する前記合成染色体を含む第３の受容細胞を単離するステップ；
前記第１の遺伝子産物が作製されるように前記第１の調節性制御システムによって前記第１の標的核酸の転写を誘導するステップ；及び
前記第１の遺伝子産物によって前記第２の標的核酸の転写を調節するステップ
を含む方法。
［項目９］
前記第１の標的核酸の前記遺伝子産物が前記第２の標的核酸の転写を誘導する、項目８に記載の方法。
［項目１０］
前記第１の標的核酸の前記遺伝子産物が前記第２の標的核酸の転写を抑制する、項目８に記載の方法。
［項目１１］
前記第１の調節性制御システムが、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、Ｌａｃスイッチ誘導性、エクジソン誘導性、クマート遺伝子スイッチ又はタモキシフェン誘導性システムから選択される、項目８に記載の方法。
［項目１２］
項目８に記載の単離された第２の受容細胞。
［項目１３］
項目８に記載の単離された第３の受容細胞。
［項目１４］
項目８に記載の単離された第２の受容細胞からの合成染色体。
［項目１５］
項目８に記載の単離された第３の受容細胞からの合成染色体。
［項目１６］
各々が調節性制御システムの制御下にある少なくとも３つの標的核酸によって受容細胞を操作する方法であって、
標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップ；
複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；
第１の調節性制御システムの制御下にある第１の標的核酸を含む第１の送達ベクターを前記第１の受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、前記第１の標的核酸の遺伝子産物が第３の標的核酸の転写を調節するステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第１の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸を発現する前記合成染色体を含む第２の受容細胞を単離するステップ；
前記第２の受容細胞を成長させるステップ；
第２の調節性制御システムの制御下にある第２の標的核酸を含む第２の送達ベクターを前記第２の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、前記第２の標的核酸の遺伝子産物が第３の標的核酸の転写を調節するステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸とを発現する前記合成染色体を含む第３の受容細胞を単離するステップ；
前記第３の受容細胞を成長させるステップ；
第３の調節性制御システムの制御下にある第３の標的核酸を含む第３の送達ベクターを前記第３の受容細胞にトランスフェクトするステップであって、前記第１及び第２の標的核酸の前記遺伝子産物が前記第３の調節性制御システムによる前記第３の標的核酸の転写を調節するステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第３の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、前記第３の調節性制御システムの制御下にある前記第３の標的核酸が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第１の調節性制御システムの制御下にある前記第１の標的核酸と前記第２の調節性制御システムの制御下にある前記第２の標的核酸と前記第３の調節性制御システムの制御下にある前記第３の標的核酸とを発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記第１及び第２の遺伝子産物が作製されるように前記第１及び第２の調節性制御システムによって前記第１及び第２の標的核酸の転写を誘導するステップ；及び
前記第１及び第２の遺伝子産物によって前記第３の標的核酸の転写を調節するステップを含む方法。
［項目１７］
前記第１及び第２の遺伝子産物の両方が前記第３の標的核酸の転写の調節に必要である、項目１６に記載の方法。
［項目１８］
前記第１又は前記第２の遺伝子産物のいずれかが前記第３の標的核酸の転写を調節する、項目１６に記載の方法。
［項目１９］
前記第３の標的核酸の調節が前記第３の標的核酸の転写を誘導することである、項目１６に記載の方法。
［項目２０］
前記第３の標的核酸の調節が前記第３の標的核酸の転写を抑制することである、項目１６に記載の方法。
［項目２１］
前記第１及び第２の調節性制御システムが、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、Ｌａｃスイッチ誘導性、エクジソン誘導性、クマート遺伝子スイッチ又はタモキシフェン誘導性システムから選択される、項目１６に記載の方法。
［項目２２］
項目１６に記載の単離された第２の受容細胞。
［項目２３］
項目１６に記載の単離された第３の受容細胞。
［項目２４］
項目１６に記載の単離された第２の受容細胞からの合成染色体。
［項目２５］
項目１６に記載の単離された第３の受容細胞からの合成染色体。
［項目２６］
前記第１、第２及び第３の標的核酸を含む合成染色体を含む第４の受容細胞を単離するステップを更に含む、項目１６に記載の方法。
［項目２７］
項目２４に記載の単離された第４の受容細胞。
［項目２８］
項目１６に記載の単離された第４の受容細胞からの合成染色体。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
