特開 2023-100653 ＨＥＲ２を標的とするキメラ抗原受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023100653

(43)【公開日】2023-07-19

(54)【発明の名称】ＨＥＲ２を標的とするキメラ抗原受容体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230711BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230711BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230711BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20230711BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20230711BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N5/10

C12N15/13

C12N15/12

C12N5/0783

【審査請求】有

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023065384

(22)【出願日】2023-04-13

(62)【分割の表示】P 2021133074の分割

【原出願日】2016-11-04

(31)【優先権主張番号】62/251,052

(32)【優先日】2015-11-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】518156369

【氏名又は名称】プライスマン，ソール ジェイ．

(71)【出願人】

【識別番号】518156370

【氏名又は名称】フォーマン，スティーブン ジェイ．

(71)【出願人】

【識別番号】518156381

【氏名又は名称】ブラウン，クリスティーン イー．

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100091214

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 進介

(72)【発明者】

【氏名】プライスマン，ソール ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】フォーマン，スティーブン ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン，クリスティーン イー．

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＨＥＲ２を標的とする細胞外ドメイン、膜貫通領域、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ膜貫通免疫受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【解決手段】ＨＥＲ２を標的化するためのキメラ抗原受容体を発現するヒトＴ細胞の集団を調製する方法であって、前記キメラ抗原受容体は、特定の配列に１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、前記変異体はＨＥＲ２を標的化し、かつ、前記アミノ酸修飾はＨＥＲ２を標的化するためのｓｃＦｖ部分には存在しない、方法である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＥＲ２を標的化するためのキメラ抗原受容体を発現するヒトＴ細胞の集団を調製する方法であって、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２６及び２７並びに１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、前記変異体はＨＥＲ２を標的化し、かつ、前記アミノ酸修飾はＨＥＲ２を標的化するためのｓｃＦｖ部分には存在しない、方法。

【請求項2】

１～５個のアミノ酸修飾は、１～５個のアミノ酸置換である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

１～５個のアミノ酸修飾は、１又は２個のアミノ酸修飾である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

１又は２個のアミノ酸修飾は、１又は２個のアミノ酸置換である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記キメラ抗原受容体は、配列番号２６又は２７で表されアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

ＨＥＲ２を標的化するためのキメラ抗原受容体をコードする核酸分子であって、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２６及び２７並びに１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、前記変異体はＨＥＲ２を標的化し、かつ、前記アミノ酸修飾はＨＥＲ２を標的化するためのｓｃＦｖ部分には存在しない、核酸分子。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

腫瘍特異的Ｔ細胞を用いた免疫療法は、遺伝子操作されたＴ細胞を用いた療法も含めて、抗腫瘍治療について研究されている。しかし、このような治療法で用いられるＴ細胞は、生体内で十分な期間、活性を維持できない場合がある。また、固形腫瘍が不均一であることや、自己抗原を標的とした場合に非がん細胞へのオフターゲット効果が生じる可能性があること等のため、Ｔ細胞の腫瘍特異性が比較的低い場合もある。そのため、当技術分野では、抗腫瘍特異性と機能が改善された腫瘍特異的ながん治療法が求められている。

【0002】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）は、細胞外腫瘍認識／標的ドメイン、細胞外リンカー／スペーサー、膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞活性化及び共刺激シグナル伝達ドメインで構成される。有害なオフターゲット作用の回避には、認識／標的ドメインの設計が重要である。ＣＡＲ腫瘍標的ドメインの大部分は、特定の抗原に対する抗体の結合の特異性を利用する抗体配列由来の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖｓ）である。また、ＩＬ－１３受容体であるＩＬ１３Ｒα２を発現する細胞を標的とするＩＬ－１３サイトカインＣＡＲ等、正常な受容体リガンド由来のＣＡＲ腫瘍標的ドメインの例もある。

【0003】

ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍の患者において、強固で持続的な臨床効果を示してきた（非特許文献１及び２）。血液疾患における初期の成功により、固形腫瘍に対するこのアプローチのより広範な適用について、現在、熱心に研究されている。

【0004】

米国国立がん研究所のＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｅｎｄ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＳＥＥＲ）のデータによると、２０１４年の乳がんによる死亡者数は推定４万人で、主に転移性疾患が原因とされている。乳がん患者の約２５～３０％ではＨＥＲ２遺伝子が増幅しており、特に予後が悪い。標的治療を含む新しい薬剤が出現しても、ステージＩＶの疾患における全死亡率の改善はわずかである。例えば、ＨＥＲ２陽性の乳がん患者を対象とした無作為化試験では、トラスツズマブとペルツズマブという２つのＨＥＲ２標的抗体とドセタキセルの併用療法が最も有望とされているものの、トラスツズマブとドセタキセルの単独療法に比べて、全生存期間の中央値は５６．５カ月、無増悪生存期間は６．３カ月しか延長されなかった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｐｒｉｃｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｎｃｏｌ

【非特許文献2】Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｂｌｏｏｄ １２３：２６２５－２６３５

【非特許文献3】Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ

【非特許文献4】Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９６９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５

【発明の概要】

【0006】

本明細書には、細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ膜貫通免疫受容体（キメラ抗原受容体または「ＣＡＲ」）が記載される。細胞外ドメインは、ＨＥＲ２を標的としたｓｃＦｖと、場合によっては、例えば、ヒトＦｅドメインの一部を含むスペーサーを含む。膜貫通部分は、例えば、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインには、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖由来のシグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ξ）と、１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ又はＣＤ２８共刺激ドメイン）が含まれる。細胞外ドメインは、Ｔ細胞の表面に発現したＣＡＲに、ＨＥＲ２を発現している細胞にＴ細胞活性を誘導させうる。当該細胞としては、特定の乳がん細胞や特定の脳がん細胞があげられる。また、細胞内領域にＣＤ３ξと直列に並んだ４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン等の共刺激ドメインが含まれているため、Ｔ細胞が共刺激シグナルを受け取ることができる。Ｔ細胞、例えば、患者特異的自己Ｔ細胞を操作して、本明細書に記載されるＣＡＲを発現することができ、当該操作された細胞を増殖させて、ＡＣＴに用いることができる。アルファベータＴ細胞とガンマデルタＴ細胞とともに含む、様々なＴ細胞サブセットを用いることができる。さらに、ＣＡＲは、ＮＫ細胞等の他の免疫細胞で発現させることができる。本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞で患者を治療する場合、その細胞は自己Ｔ細胞または同種Ｔ細胞であることができる。ある場合、用いられる細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ＋及びＣＤ４５ＲＡ－であるＣＤ４＋及びＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）をともに含む細胞集団であるか、又は、用いられる細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ_ＣＭ細胞、ステムセルセントラルメモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含む細胞集団（すなわち、Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団）である。Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞の集団は、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋であり、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋の細胞をともに、並びに、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞をともに含む。このような細胞を用いると、他のタイプの患者特異的Ｔ細胞を用いる場合と比較して、養子移入後の細胞の長期持続性を向上させることができる。

【0007】

本明細書において記載されているのは、ＣＡＲをコードする核酸分子であり、ＣＡＲは：ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ（例えば、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；配列番号１）又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体の両方）；並びに、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体；を含む。

【0008】

様々な実施形態では、共刺激ドメインは：ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される。特定の実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体が存在する。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体等、２つの共刺激ドメインが存在する。様々な実施形態では、１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾は置換である。

【0009】

ある場合、共刺激ドメインとＣＤ３ξシグナル伝達ドメインとの間、及び／又は、２つの共刺激ドメイン間に１～６のアミノ酸の短い配列（例えばＧＧＧ）が存在する。

【0010】

さらなる実施形態では、ＣＡＲは：ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体の両方）；及び、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体；ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ又はその変異体と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域（例えば、スペーサー領域は、配列番号２～１２及び４２を含む群から選択されるアミノ酸配列（表３）又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む）；を含み、スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含み；スペーサー領域は、１～１５０のアミノ酸を含み；スペーサーはなく；４－１ＢＢシグナル伝達ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含み；ＣＤ３ξシグナル伝達ドメインは、配列番号２１アミノ酸配列を含み；３乃至１５のアミノ酸のリンカーが、共刺激ドメインとＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する。特定の実施形態では、２つの共刺激ドメインがある場合、１つは４－１ＢＢ共刺激ドメインであり、もう一方は、ＣＤ２８及びＣＤ２８ｇｇから選択される共刺激ドメインである。様々な実施形態では、１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾は、例えば保存的置換等の置換である。

【0011】

ある実施形態では、核酸分子は、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し；キメラ抗原受容体は、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0012】

キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団も開示され、キメラ抗原受容体は：ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体の両方）；及び、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；を含む。様々な実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は、配列番号２６～４１のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体を含むキメラ抗原受容体を発現するベクターを含み；ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ細胞）を含み、例えば、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴ_ＣＭ細胞であり、又は、ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞及びステムセルセントラルメモリー細胞の組み合わせ（Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞）を含み、例えば、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞である。いずれの場合においても、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞もＣＤ８＋細胞も含む（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０、８０又は９０％が、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋であり；ＣＤ３＋細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞の少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０％がＣＤ８＋細胞である）。

【0013】

また、自己又は同種のヒトＴ細胞（例えば、中心記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）または中心記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞および幹中心記憶細胞の組み合わせ（すなわち、Ｔ細胞はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞である）を含む自己又は同種Ｔ細胞の集団を投与することを含む、患者のがんを治療する方法が記載され、ここで、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％６０％、７０％、８０％はＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞である。いずれの場合でも、Ｔ細胞の集団は、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたＣＤ４＋細胞もＣＤ８＋細胞も含み（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０、８０又は９０％が、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋であり；ＣＤ３＋細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞の少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０％がＣＤ８＋細胞である）、キメラ抗原受容体は、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体を含む。様々な実施形態では、がんは、脳がん、例えば、乳がんからの転移であるＨＥＲ２発現脳がんであり；形質導入されたヒトＴ細胞は、患者からＴ細胞を取得する工程、Ｔ細胞を処理してセントラルメモリーＴ細胞を単離する工程、及び、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いてセントラルメモリー細胞の少なくとも一部に形質導入を行う工程、を含む方法によって調製され、ここで、キメラ抗原受容体は、配列番号２６又は２７から選択されるアミノ酸配列又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体を含む。ある場合、ＣＡＲ Ｔ細胞は、脳腫瘍に直接は投与されず、代わりに、患者の脳内の脳室内空間に投与される。

【0014】

配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；５以下のアミノ酸の置換、欠失、存在又は挿入の存在を除いて、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；５以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；及び、２以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；も記載される。

【0015】

本開示は、本明細書において記載されるＣＡＲのいずれかをコードする核酸分子（例えば、ＣＡＲのうちの１つをコードする核酸配列を含むベクター）及び本明細書において記載されるＣＡＲのいずれかを発現する単離されたＴリンパ球も含む。

【0016】

本明細書において記載されるＣＡＲは、ＨＥＲ２結合ドメイン（例えばＨＥＲ２ ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含みうる。様々な異なるスペーサーを用いてよい。それらの一部は、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部、例えば、ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、又は、ＣＨ３ドメイン又はその変異体を含む。以下の表１は、本明細書で記載されるＣＡＲで用いることができる様々なスペーサーを提供する。

【0017】

【表1】

いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のヒンジ領域のうち全て又は部分、すなわち、例えばＩｇＧ４ Ｆｅヒンジ又はＣＤ８ヒンジ等、免疫グロブリンのＣＨＩドメインからＣＨ２ドメインの間に入る配列を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインをともに含む。免疫グロブリン由来の配列は、１つ以上のアミノ酸修飾、例えば１、２、３、４又は５の置換、例えばオフターゲット結合を減少させる置換を含むことができる。

【0018】

「アミノ酸修飾」とは、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を意味する。「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列中の特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することをいう。当該置換は、非保存的様式（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸に変化させることにより）で、又は保存的様式（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から同じグループに属するアミノ酸に変化させることにより）で、得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させるように行いうる。当該保存的変化では、一般に、結果として生じるタンパク質の構造及び機能の変化がより少なくなる。以下に、アミノ酸の様々な群分けを例示する：１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；
２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ ６．０で正に荷電）。他の群はフェニル基をもつアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンである。

【0019】

特定の実施形態では、スペーサーは、未修飾のスペーサーにおいて存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換される１つ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から得られる。１つ以上の置換されるアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はその組み合わせの１つ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。以下により詳細に記載されるこのナンバリングスキームにおいて、表１のＩｇＧヒンジ配列及びＩｇＧ４ヒンジリンカー（ＨＬ）配列における最初のアミノ酸のように、表１のＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）スペーサーにおける最初のアミノ酸は２１９であり、表１のＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）スペーサーにおける最初のアミノ酸は２１９である。

【0020】

ある実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ又はその組み合わせのうち１つ以上の置換を含むがこれらに限定されないＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から得られる。

【0021】

特定の実施形態では、修飾されたスペーサーは、未修飾の領域に存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換される１つ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４領域から得られる。１つ以上の置換されるアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はその組み合わせの１つ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。

【0022】

一部の実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換：２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ又はその組み合わせのうち１つ以上の置換を含むがこれらに限定されないＩｇＧ４領域から得られ、未修飾のスペーサーにおけるアミノ酸は、示された位置にて上記の同定されたアミノ酸で置換される。

【0023】

本明細書において論じられる免疫グロブリンのアミノ酸位置について、番号付けは、ＥＵインデックス又はＥＵナンバリングスキーム（参照により全内容が本願に援用される非特許文献３）による。ＥＵインデックス又は非特許文献３に記載のＥＵインデックス又はＥＵナンバリングスキームは、ＥＵ抗体の番号付けをいう（非特許文献４）。

【0024】

様々な膜貫通ドメインを用いることができる。表２は、適当な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサードメインが存在する場合、膜貫通ドメインは、スペーサードメインのカルボキシ末端に位置する。

【0025】

【表2】

本明細書に記載されるＣＡＲの多くは、１つ以上の（例えば２つの）共刺激ドメインを含む。共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ξシグナル伝達ドメインとの間に位置する。表３は、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメインの配列と共に適当な共刺激ドメインの例を含む。

【0026】

【表3】

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ（配列番号２６）のアミノ酸配列を示す図である。様々なドメインが、配列の下に順番に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟ＣＡＲ配列（配列番号３４）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。また、図３Ａ～８Ｅ及び本明細書中では、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζともいう。

【図2】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ（配列番号２７）のアミノ酸配列を示す図である。様々なドメインが、配列の下に順番に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟ＣＡＲ配列（配列番号３５）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。また、図３Ａ～８Ｅ及び明細書中では、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζともいう。

【図3】ＨＥＲ２特異的ＣＡＲのコンストラクト及びＣＡＲ Ｔ細胞増殖データを示す図である。

【図4】乳がん細胞株に対するＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏを示す図である。

【図5】ＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの腫瘍活性に対する研究の結果を示す図である。

【図6】局所腫瘍内送達されたＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍有効性に対する研究の結果を示す図である。

【図7】ヒト同所性ＢＢＭ異種移植モデルにおけるＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の局所送達に対する研究の結果を示す図である。

【図8】ＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の脳室内送達に対する研究の結果を示す図である。

【図9】 Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ（配列番号２８）のアミノ酸配列を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟ＣＡＲ配列（配列番号３６）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。

【図10】 Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４ヒンジ（Ｓ２２８Ｐ）－リンカー－ＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列（配列番号２９）を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟ＣＡＲ配列（配列番号３７）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。

【図11】 Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）－リンカーＩｇＧ４ ＣＨ３－ＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟したＣＡＲ配列（配列番号３８）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。

【図12】 Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）－リンカー－ＩｇＧ４ ＣＨ３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ（配列番号３１）のアミノ酸配列を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟したＣＡＲ配列（配列番号３９）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。

【図13】 Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－リンカー－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ（配列番号３２）のアミノ酸配列を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟したＣＡＲ配列（配列番号４０）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。

【図14】 Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－リンカー－ＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列を示す。配列番号３３）を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟したＣＡＲ配列（配列番号４１）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。

【図15】様々なスペーサーを有する特定のさらなるＣＡＲを特徴づける研究の結果を示す図である。ＩｇＧ３（ＥＱ）は図２にあり；ＤｅｌｔａＣｈ２は図１１にあり；ＣＤ８ｈは図９にあり；ＨＬは図１０にあり；Ｌは図１４にある。

【図16】様々なＣＡＡＲを発現するＴＣＭが、ＨＥＲ２が発現しない細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲ）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＬＯ）又はＨＥＲ２の発現が多い細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＨＩ）に曝露される場合に産生されるＣＤ１０７ａ及びＩＮＦガンマを検査する研究の結果を示した図である。

【図17】図２のＣＡＲ（ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζ）又は図１４のＣＡＲ（ＨＥＲ２（Ｌ）ＢＢζ）を用いた様々な細胞株におけるＰＤ－１の生成及び腫瘍細胞の死滅を検査する研究の結果を示した図である。

【図18】様々なＣＡＡＲを発現するＴＣＭが、ＨＥＲ２の発現がない細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲ）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＬＯ）又はＨＥＲ２の発現が多い細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＨＩ）に曝露される場合に産生されるＣＤ１０７ａ及びＩＮＦガンマを検査する研究の結果を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0028】

以下に記載されるのは、ＨＥＲ２を標的とし、ＨＥＲ２発現乳がん並びに乳房から脳への転移に治療に有用な様々なキメラ抗原受容体の構造、構築及び特徴づけである。重要なことは、本明細書で記載されるＣＡＲをＡＣＴで用いると、脳室内又は腫瘍内送達によって脳内のＨＥＲ２発現腫瘍を治療することができることである。

【0029】

キメラ抗原（ＣＡＲ）は、少なくとも、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含有する組換え生体分子である。したがって、用語「抗原」は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができるいかなる分子をいう。例えば、ＣＡＲは、細胞表面受容体に特異的に結合するリガンドを含むことができる。細胞外認識ドメイン（細胞外ドメイン又は単に細胞外認識ドメインが含有する認識要素ともいう）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜内にＣＡＲを固定する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、場合によっては、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、ＭＨＣによる制限を受けず、抗原に結合し、かつ、Ｔ細胞活性化を伝達することができる。したがって、ＣＡＲは、そのＨＬＡ遺伝子型に関係なく、抗原陽性腫瘍患者の集団を治療することができる「普遍的な（ユニバーサルな）」免疫受容体である。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を用いた養子免疫療法は、がんの治療の強力な治療戦略となりうる。

【0030】

ある場合、本明細書に記載されるＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後に、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列及び、細胞質シグナル伝達テールがない（アミノ酸３２３で切断されている）切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）が続く、ベクターを用いて作製することができる。この構成では、ＣＤ１９ｔを共発現させることにより、不活性で非免疫原性の表面マーカーが得られ、遺伝子改変細胞を正確に測定できるようになり、かつ、遺伝子改変細胞のポジティブ選択、並びに、養子縁組後の生体内の治療用Ｔ細胞の効率的な細胞追跡及び／又はイメージングが可能になる。ＣＤ１９ｔの共発現により、臨床的に利用可能な抗体及び／又は免疫毒素試薬を用いて、生体内に導入された細胞を免疫学的に標的化するマーカーがもたらされて、治療用細胞が選択的に除去され、それによって自殺スイッチとして機能する。

【0031】

本明細書中に記載されるＣＡＲは、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造されるが、当技術分野で公知のいかなる手段により製造されうる。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当技術分野で公知の分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、オーバーラップＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、部位特異的突然変異誘発等）により、簡便に調製し、完全なコード配列に構築することができる。
得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞系、好ましくはＴリンパ球細胞系、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞系の形質転換に用いられる。

【0032】

非選択のＰＢＭＣ若しくは濃縮されたＣＤ３のＴ細胞、又は、濃縮されたＣＤ３若しくはメモリーＴ細胞のサブセット又はＴ_ＣＭ若しくはＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}を含む、患者から単離された様々なＴ細胞サブセットは、ＣＡＲ発現用ベクターを用いて形質導入することができる。セントラルメモリーＴ細胞は、１つの有用なＴ細胞のサブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、例えば、所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気的に選択するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いて、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を濃縮することによって末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離することができる。セントラルメモリーＴ細胞のために濃縮された細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化され、例えばＣＡＲの発現を指示するＳＩＮレンチウイルスベクター及び生体内検出及び潜在的な生体外選択用の非免疫原性の表面マーカーである切断型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）で形質導入することができる。活性化／遺伝子修飾されたセントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５を用いてインビトロで増殖させた後、凍結保存することができる。

【実施例0033】

２つのＨＥＲ２－ＣＡＲの構造
本明細書に記載のＨＥＲ２ ｓｃＦｖを含む１つのＣＡＲは、Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔという。このＣＡＲには、ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；Ｆｅ受容体（ＦｃＲｓ）との結合を阻害するようにＣＨ２領域内の２つの部位（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）が変異しているＩｇＧ４ Ｆｅ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ξ活性化ドメインを含む、様々な重要な特徴が含まれる。図１は、このＣＡＲのアミノ酸配列を示し、ＣＡＲ発現のモニターに用いられる切断型ＣＤＩ９配列の配列、及び、切断型ＣＤＩ９配列を融合せずにＣＡＲを作製することができるＴ２Ａリボソームスキップ配列を含む。図２に示すように、未成熟ＣＡＲは、以下の：ＧＭＣＳＦＲシグナルペプチド、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、スペーサーとして機能するＩｇＧ４、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＬＬからＧＧへの配列変化を含む４－１ＢＢ共刺激ドメイン、３つのＧｌｙ配列、ＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む。また、転写物には、ＣＡＲタンパク質配列には含まれないＴ２Ａリボソーム配列及び切断型ＣＤＩ９配列がコードされる。当該成熟ＣＡＲは、未成熟ＣＡＲと同一であるが、ＧＭＣＳＦシグナルペプチドがない。

【実施例0034】

ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の発現に用いられるｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｅｐＨＩＶ７ベクターは、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲの発現に用いることができるベクターであり、ｐＨＩＶ７ベクターから作製した。重要なことは、このベクターは、ヒトＥＦＩプロモーターを用いてＣＡＲの発現を駆動する。ベクターの５’配列及び３’配列はともに、以前にＨＸＢｃ２プロウイルスから得られたように，ｐｖ６５３ＲＳＮに由来する。ポリプリントラクトＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙのＨＩＶ－Ｉ株ｐＮＬ４－３に由来する。ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）配列は以前に記載された。

【0035】

ｐＨＩＶ７の構築を以下のように行った。簡潔には、介在性ＳＬ３－ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）を備えるｇａｇ－ｐｏｌ＋５’及び３’の末端反復配列（ＬＴＲｓ）由来の６５３ｂｐを含有するｐｖ６５３ＲＳＮを、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。つまり、工程１では、５’ＬＴＲからＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）までの配列で、ｐ５’ＨＩＶ－Ｉ ５Ｉを作製した後、５’ＬＴＲを、ＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去して修飾し、最初にＣＭＶエンハンサーに連結させた後、ＳＶ４０複製開始点に連結した（ｐ５’ＨＩＶ－２）。工程２では、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３’ＨＩＶ－１を作製した後、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターから４００ｂｐを欠失させて、ＨＩＶ Ｕ３のシス制御要素を除去し、ｐ３’ＨＩＶ－２を形成した。工程３では、ｐ５’ＨＩＶ－３及びｐ３’ＨＩＶ－２から単離したフラグメントを連結させて、ｐＨＩＶ－３を作製した。工程４では、上流の余分なＨＩＶ配列を除去してさらにｐ３’ＨＩＶ－２をさらに修飾してｐ３’ＨＩＶ－３を作製し、ＷＰＲＥを含む６００ｂｐのＢａｍＨＩ－ＳａｌＩ断片をｐ３’ＨＩＶ－３に付加して、ｐ３’ＨＩＶ－４を作製した。工程５では、ｐＨＩＶ－３のＲＲＥをＰＣＲによってサイズダウンし、ｐＨＩＶ－３の５’断片（図示せず）及びｐ３’ＨＩＶ－４に連結させて、ｐＨＩＶ－６を作製した。工程６では、ＨＩＶ－Ｉ ｐＮＬ４－３（５５）由来のｃＰＰＴ ＤＮＡフラップ配列を含有する１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ－ＢａｍＨＩ断片をｐＮＬ４－３から増幅し、ｐＨＩＶ６のＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列の間に配置してｐＨＩＶ－７を作製した。この親プラスミドｐＨＩＶ７－ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）を用いて、４－プラスミド系を用いて親ベクターをパッケージングした。

【0036】

ウイルスゲノムをベクターに効率よくパッケージングするためには、パッケージングシグナルｐｓｉ（ψ）が必要である。。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の運搬と導入遺伝子の発現を促進する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入の効率を高めることが実証されている。

【0037】

ウイルスベクターの作製に必要なヘルパー機能は、組換えによる複製能力のあるレンチウイルスの作製確率を下げるために３つの別々のプラスミド：ｌ）ｐＣｇｐは、ウイルスベクター構築に必要なｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする；２）ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの運搬に寄与するＲＲＥ配列に作用するＲｅｖタンパク質をコードする；かつ、３）ｐＣＭＶ－Ｇは、ウイルスベクターの感染性に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする；に分けられる。

【0038】

ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間には最小限のＤＮＡ配列相同性がある。相同性のある領域としては、ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列に位置する約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；３つのヘルパープラスミドの全てに存在するＣＭＶプロモーター配列；かつ、ヘルパープラスミドｐＣｇｐ内のＲＲＥ配列；があげられる。これらの領域における相同性のために複製可能な組換えウイルスが生成される見込みは極めて低いが、それは、多数の組換え事象が必要であるからである。さらに、得られた組換え体には、レンチウイルスの複製に必要な機能的なＬＴＲもｔａｔ配列もないであろう。

【0039】

ＣＭＶプロモーターをＥＦｌα－ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦＩｐ）に置換し、新しいプラスミドをｅｐＨＩＶ７と命名した。ＥＦｌｐは５６３ｂｐであり、ＣＭＶプロモーターを切除した後、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを用いてｅｐＨＩＶ７内に導入した。

【0040】

野生型ウイルスの病原性に必要で、標的細胞の増殖性感染に必要なｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれてきた。さらに、当該ベクター構築物には、インタクトな３’ＬＴＲプロモーターがないため、結果として、標的細胞で発現かつ逆転写されたDNAプロウイルスゲノムのＬＴＲは不活性である。このような設計の結果、ＨＩＶ－Ｉ由来の配列はプロウイルスから転写されず、治療用の配列のみが各々のプロモーターから発現されることになる。ＳＩＮベクターのＬＴＲプロモーター活性を除去すると、宿主遺伝子の意図せぬ活性化の可能性が著しく軽減されると予想される。