▶ ヂェァジァン アカデミー オブ アグリカルチュラル サイエンシズの特許一覧
特開2023-101368家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性評価方法及びその応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023101368
(43)【公開日】2023-07-20
(54)【発明の名称】家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性評価方法及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/06 20060101AFI20230712BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/06
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022048994
(22)【出願日】2022-03-24
(31)【優先権主張番号】202210024271.5
(32)【優先日】2022-01-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】522118953
【氏名又は名称】ヂェァジァン アカデミー オブ アグリカルチュラル サイエンシズ
【氏名又は名称原語表記】Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
【住所又は居所原語表記】１９８ Ｓｈｉｑｉａｏ Ｒｄ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｃｉｔｙ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ３１００２１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001841
【氏名又は名称】弁理士法人ＡＴＥＮ
(72)【発明者】
【氏名】ワン ウェン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン ファ
(72)【発明者】
【氏名】シァォン シンニン
(72)【発明者】
【氏名】シァォ インピン
(72)【発明者】
【氏名】リュ ウェンタオ
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA05
4B063QQ06
4B063QR68
4B063QR69
4B063QX01
(57)【要約】
【課題】家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性評価方法及びその応用を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、次のステップ１～ステップ３を含む家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法及びその応用を開示し、すなわち、ステップ１：細菌懸濁液の調製、ステップ２：塩素消毒剤の調合、ステップ３：塩素抵抗性の測定と評価である。本発明により提供される家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法及びその応用は、供試菌株の塩素抵抗性の強さを迅速かつ正確に評価し、塩素抵抗性供試菌株に対して交差耐性が生じする抗生物質をスクリーニングでき、禽類の食品の安全性を向上するために保護する。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、次のステップ１～ステップ３を含む家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法及びその応用を開示し、すなわち、ステップ１：細菌懸濁液の調製、ステップ２：塩素消毒剤の調合、ステップ３：塩素抵抗性の測定と評価である。本発明により提供される家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法及びその応用は、供試菌株の塩素抵抗性の強さを迅速かつ正確に評価し、塩素抵抗性供試菌株に対して交差耐性が生じする抗生物質をスクリーニングでき、禽類の食品の安全性を向上するために保護する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法であって、
ステップ１：細菌懸濁液の調製
家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天平板上にストリークし、一定時間培養した後、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、遠心管でよく撹拌し、細菌懸濁液の濁度を０．５のマクファーランド濁度に調整し、次にカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておき；
ステップ２：塩素消毒剤の調合
滅菌済みの無菌水で消毒剤原液を濃度勾配希釈して用意しておき；
ステップ３：塩素抵抗性の測定及び評価
ブロス微量希釈法で供試菌株に対するＮａＣｌＯの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、ＯＤ６００値の大きさに基づき供試菌株の塩素抵抗性の強さを順位付け・評価する、
上記ステップ１～ステップ３を含むことを特徴とする、家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法。
ステップ１：細菌懸濁液の調製
家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天平板上にストリークし、一定時間培養した後、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、遠心管でよく撹拌し、細菌懸濁液の濁度を０．５のマクファーランド濁度に調整し、次にカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておき；
ステップ２：塩素消毒剤の調合
滅菌済みの無菌水で消毒剤原液を濃度勾配希釈して用意しておき；
ステップ３：塩素抵抗性の測定及び評価
ブロス微量希釈法で供試菌株に対するＮａＣｌＯの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、ＯＤ６００値の大きさに基づき供試菌株の塩素抵抗性の強さを順位付け・評価する、
上記ステップ１～ステップ３を含むことを特徴とする、家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法。
【請求項2】
フローサイトメトリーを用いて処理した後の生細胞、死細胞及び損傷細胞を定量化し、濃度がＭＩＣの消毒液で品質管理菌株及び塩素抵抗性の特徴を持つ菌株を各々処理し、染色された菌株の生存率を観察し、供試菌株の塩素抵抗性の強さを判断する塩素抵抗性評価検証ステップ４をさらに含む、
ことを特徴とする、請求項１に記載の家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法。
ことを特徴とする、請求項１に記載の家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法。
【請求項3】
前記ステップ２内の消毒剤の希釈濃度は、１／２ＭＩＣ品質管理菌株、ＭＩＣ品質管理菌株、２ＭＩＣ品質管理菌株、４ＭＩＣ品質管理菌株、８ＭＩＣ品質管理菌株に従い勾配を設定することを特徴とする、請求項１又は２に記載の家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法。
【請求項4】
前記ステップ３の具体的なプロセスとしては、
まず、９６ウェルマイクロタイタープレートに異なる濃度の消毒剤を含む５０μＬの作業溶液を加え、次に消毒剤濃度の低いものから高いものの順に希釈した細菌懸濁液を順次接種し、実験と同時に陽性対照及び陰性対照を設け、シールして適切な温度で一定時間培養した後、９６ウェルマイクロタイタープレート内の細菌の目に見える成長を観察し、細菌の目に見える成長が観察されない最小消毒剤濃度を、菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とし；
品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、ＯＤ６００値の大きさに基づき供試菌株の塩素抵抗性の強さを順位付け・評価する、
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載の家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法。
まず、９６ウェルマイクロタイタープレートに異なる濃度の消毒剤を含む５０μＬの作業溶液を加え、次に消毒剤濃度の低いものから高いものの順に希釈した細菌懸濁液を順次接種し、実験と同時に陽性対照及び陰性対照を設け、シールして適切な温度で一定時間培養した後、９６ウェルマイクロタイタープレート内の細菌の目に見える成長を観察し、細菌の目に見える成長が観察されない最小消毒剤濃度を、菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とし；
品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、ＯＤ６００値の大きさに基づき供試菌株の塩素抵抗性の強さを順位付け・評価する、
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載の家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法。
【請求項5】
前記ステップ４の具体的なプロセスとしては、
濃度がＭＩＣ品質管理菌株の消毒液で品質管理菌株及び有塩素抵抗性の特徴を持つ菌株をそれぞれ０、１０、３０分間処理し、生死細胞染色キットで生菌、死菌、損傷菌を区別し、１ｍＬの菌液と１．５μＬＳＹＴＯ９染色色素を１．５μＬヨウ化プロピジウム染色色素と混合し、次に混合物を暗所で室温にて１５分間染色した後、フローサイトメーターでテストし、染色された菌株の生存率の観察を介して、供試菌株の塩素抵抗性の強さを判断する、
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載の家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法。
濃度がＭＩＣ品質管理菌株の消毒液で品質管理菌株及び有塩素抵抗性の特徴を持つ菌株をそれぞれ０、１０、３０分間処理し、生死細胞染色キットで生菌、死菌、損傷菌を区別し、１ｍＬの菌液と１．５μＬＳＹＴＯ９染色色素を１．５μＬヨウ化プロピジウム染色色素と混合し、次に混合物を暗所で室温にて１５分間染色した後、フローサイトメーターでテストし、染色された菌株の生存率の観察を介して、供試菌株の塩素抵抗性の強さを判断する、
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載の家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法。
【請求項6】
前記品質管理菌株は、サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６から選択されることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性評価方法の応用であって、抵抗性の特徴を持つサルモネラ菌のスクリーニング又はサルモネラ菌の塩素抵抗性の強さを評価するために用いられ、好ましくは塩素抵抗性が極めて強いサルモネラ菌は、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３としてスクリーニングされることを特徴とする、応用。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか一項に記載の家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性評価方法の応用であって、塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じる抗生物質をスクリーニングするために用いられることを特徴とする、応用。
【請求項9】
スクリーニングステップとしては、
ステップ１：細菌懸濁液の調製
家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天平板上にストリークし、一定時間培養した後、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、遠心管でよく撹拌し、細菌懸濁液の濁度を０．５のマクファーランド濁度に調整し、次にカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておき；
ステップ２：塩素消毒剤の調合
滅菌済みの無菌水で消毒剤原液を濃度勾配希釈して用意しておき；
ステップ３：塩素抵抗性の測定
ブロス微量希釈法で供試菌株に対するＮａＣｌＯの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし；
ステップ４：抗生物質抵抗性の測定
好気性グラム陰性菌の薬剤感受性パネルを使用し、アンピシリン、アモキシシリン／クラブラン酸塩、セフォタキシム、メロペネム、アミカシン、ゲンタマイシン、コリスチン、セフチオフル、シプロフロキサシン、コトリモキサゾール、テトラサイクリン、チゲサイクリン、フロルフェニコールという１３種類の抗生物質に対する塩素抵抗性の特徴を持つ菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、塩素抵抗性サルモネラ菌の抗生物質抵抗性を判断し；
ステップ５：交差耐性の評価
塩素抵抗性（ＯＤ６００値）と抗生物質抵抗性（ＭＩＣ値）との間の相関関係を比較することにより、一体どの抗生物質が塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じるかを判断し、算出されたＰ値が有意に正の相関関係である場合、交差耐性が生じることを示し、これとは対照的に交差耐性が生じない、
ステップ１～ステップ５を含むことを特徴とする、請求項８に記載の応用。
ステップ１：細菌懸濁液の調製
家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天平板上にストリークし、一定時間培養した後、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、遠心管でよく撹拌し、細菌懸濁液の濁度を０．５のマクファーランド濁度に調整し、次にカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておき；
ステップ２：塩素消毒剤の調合
滅菌済みの無菌水で消毒剤原液を濃度勾配希釈して用意しておき；
ステップ３：塩素抵抗性の測定
ブロス微量希釈法で供試菌株に対するＮａＣｌＯの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし；
ステップ４：抗生物質抵抗性の測定
好気性グラム陰性菌の薬剤感受性パネルを使用し、アンピシリン、アモキシシリン／クラブラン酸塩、セフォタキシム、メロペネム、アミカシン、ゲンタマイシン、コリスチン、セフチオフル、シプロフロキサシン、コトリモキサゾール、テトラサイクリン、チゲサイクリン、フロルフェニコールという１３種類の抗生物質に対する塩素抵抗性の特徴を持つ菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、塩素抵抗性サルモネラ菌の抗生物質抵抗性を判断し；
ステップ５：交差耐性の評価
塩素抵抗性（ＯＤ６００値）と抗生物質抵抗性（ＭＩＣ値）との間の相関関係を比較することにより、一体どの抗生物質が塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じるかを判断し、算出されたＰ値が有意に正の相関関係である場合、交差耐性が生じることを示し、これとは対照的に交差耐性が生じない、
ステップ１～ステップ５を含むことを特徴とする、請求項８に記載の応用。
【請求項10】
前記品質管理菌株は、サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６から選択され、前記塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じる抗生物質はセフチオフル、シプロフロキサシン、テトラサイクリン又はフロルフェニコールから選択されることを特徴とする、請求項９に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物の薬剤耐性研究の技術分野に関し、特に、家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性評価方法及びその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
サルモネラ菌は、人に胃腸炎を起こす一般的な原因であり、世界中の重要な公衆衛生上の問題でもある。研究によりサルモネラ菌は、中国において毎年９８７万例の胃腸炎症例を起こしていることがわかっている。現在２６００種類以上のサルモネラエンテリティディス血清型が報告され、報告によると、サルモネラエンテリティディス、サルモネラチフィムリウム、サルモネラケンタッキー、及びサルモネラインディアナがサルモネラ症を起こす最も一般的な血清型である。家禽製品は、サルモネラ菌がサルモネラ菌の最も一般的な感染媒介であり、中国の家禽サンプルの３７．５％がサルモネラ菌に汚染されている。家禽の周囲環境の汚染及び同じ屠殺ラインでの多数の動物の屠殺は、家禽を直接汚染または交差汚染する可能性があり、不適切に調理及び／又は処理された汚染製品を食べると食品由来のサルモネラ症を罹患する可能性があった。
【0003】
次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）は、高効率の広域殺菌剤で、殺菌原理が水中で次亜塩素酸を生成し、細胞内のタンパク質と酸化的に反応するか、リン酸デヒドロゲナーゼの構造を破壊することで、糖代謝を障害させて、細胞死を起すことである。中国の肉用鶏屠殺の業界標準（ＮＹ／Ｔ １１７４－２００６）では、予冷された水中のＮａＣｌＯ消毒剤の濃度を５０～１００ｍｇ／Ｌに維持するよう定められている。しかし、大部分の細菌を殺す又は阻害することができる消毒剤の濃度で殺す又は阻害することができない菌株の出現につれ、消毒剤耐性菌が人々に徐々に注目されてきた。屠殺の予冷の水中に大量のＮａＣｌＯを投入したとしてもサルモネラ菌の殺傷効率は低く、細菌がＮａＣｌＯに対してある程度の耐性が存在してきた。消毒剤に対する細菌の抵抗性機序が非常に複雑で、能動排出方式、透過障壁、作用点の変化及び毒剤に抵抗又は分解する酵素の生成が主な機序である。研究によると、消毒剤に対する細菌の耐性と抗生物質に対する薬剤耐性との間には、ある程度の交差耐性が存在している。これまで、家禽サプライチェーンから分離されたＮａＣｌＯに対するサルモネラ菌の耐性は、まだ完全に明確化されていない。
【0004】
現在、家禽由来サルモネラ菌の特許文献の多くは、ＰＣＲ検査方法に焦点を当て、例えば特許文献１においてＰＣＲバッファー、デオキシリボヌクレオチド三リン混合物、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びｂｃｆ遺伝子、ｈｅｌｉ遺伝子、ｒｈｓ遺伝子、ｓｄｆ遺伝子、ｆｌａ遺伝子のプライマーペアを含み、家禽由来サルモネラ菌を同定するためのマルチプレックスＰＣＲ検出キットが開示され、また家禽の生産或いは家禽製品内に蔓延している異なるサルモネラ血清型を同定するため、前記キットを運用して家禽由来サルモネラ菌を同定するマルチプレックスＰＣＲ検査方法も開示されている。また特許文献２では、家禽由来サルモネラ菌のマルチプレックスＰＣＲ検出キット及び非診断的な検出方法が開示され、該キットには１０×ＰＣＲバッファー、２．５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１０Ｍｍ ｄＮＴＰｓ、マルチプレックスＰＣＲ検出プライマーセット、陽性対照及び陰性対照が含まれ、陽性対照物はサルモネラエンテリティディスＡＴＣＣ１３０７６、サルモネラチフィムリウムＡＴＣＣ１４０２８、サルモネラガリナルムＡＴＣＣ９１８４ゲノムＤＮＡを含み、陰性対照は滅菌再蒸留水であり、また前記キットを運用して家禽由来サルモネラ菌を検収するマルチプレックスＰＣＲ方法も開示されている。
【0005】
家禽の食品の安全性を向上するため、家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性を評価する方法に関する特許文献報告がなく、どのような抗生物質が塩素抵抗性のサルモネラ菌に対し交差耐性が生じるかという文献報告もない。
【0006】
上記をまとめると、家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性を正確に評価する方法を提供し、並びに該方法を運用して塩素抵抗性のサルモネラ菌に対して交差耐性が生じる抗生物質をスクリーニングすることは、当業者がまだ解決されない技術的課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】発明の名称が家禽由来サルモネラ菌を同定するためのマルチプレックスＰＣＲ検出キット及びその方法である、中国特許第ＣＮ１０４７７４９６９Ａ号公開公報
【特許文献2】発明の名称が家禽由来サルモネラ菌のマルチプレックスＰＣＲ検出キット及び非診断性検出方法である、中国特許第ＣＮ１０５６４８０５５Ａ号公開公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、サルモネラ分離株と品質管理菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を比較するか、サルモネラ分離株と品質管理菌株の吸光度（ＯＤ６００）を比較して、塩素抵抗性特徴を持つサルモネラ分離株を選別し、ＯＤ６００値の大きさに基づきサルモネラ分離株の塩素抵抗性の強さを順位付け・評価する家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法を提供することを、第１の技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、第１の技術的課題を解決するために、次のような技術的手段を提示する。
【0010】
家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法は、以下の構成を有する。すなわち、
ステップ１：細菌懸濁液の調製
家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天平板上にストリークし、一定時間培養した後、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、遠心管でよく撹拌し、細菌懸濁液の濁度を０．５のマクファーランド濁度に調整し、次にカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておき；
ステップ２：塩素消毒剤の調合
滅菌済みの無菌水で消毒剤原液を濃度勾配希釈して用意しておき；
ステップ３：塩素抵抗性の測定及び評価
ブロス微量希釈法で供試菌株に対するＮａＣｌＯの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、ＯＤ６００値の大きさに基づき供試菌株の塩素抵抗性の強さを順位付け・評価する。
ステップ１：細菌懸濁液の調製
家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天平板上にストリークし、一定時間培養した後、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、遠心管でよく撹拌し、細菌懸濁液の濁度を０．５のマクファーランド濁度に調整し、次にカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておき；
ステップ２：塩素消毒剤の調合
滅菌済みの無菌水で消毒剤原液を濃度勾配希釈して用意しておき；
ステップ３：塩素抵抗性の測定及び評価
ブロス微量希釈法で供試菌株に対するＮａＣｌＯの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、ＯＤ６００値の大きさに基づき供試菌株の塩素抵抗性の強さを順位付け・評価する。
【0011】
好ましくは、前述塩素抵抗性の評価方法は、次のステップ４をさらに含む。すなわち、
ステップ４：塩素抵抗性の評価検証
フローサイトメトリーを用いて処理した後の生細胞、死細胞及び損傷細胞を定量化し、濃度がＭＩＣ品質管理菌株（又は１／２ＭＩＣ品質管理菌株）の消毒液で品質管理菌株及び塩素抵抗性菌株を各々処理し、染色された菌株の生存率を観察し、供試菌株の塩素抵抗性の強さを判断する。
ステップ４：塩素抵抗性の評価検証
フローサイトメトリーを用いて処理した後の生細胞、死細胞及び損傷細胞を定量化し、濃度がＭＩＣ品質管理菌株（又は１／２ＭＩＣ品質管理菌株）の消毒液で品質管理菌株及び塩素抵抗性菌株を各々処理し、染色された菌株の生存率を観察し、供試菌株の塩素抵抗性の強さを判断する。
【0012】
好ましくは、ステップ２内の消毒剤の希釈濃度は、１／２ＭＩＣ品質管理菌株、ＭＩＣ品質管理菌株、２ＭＩＣ品質管理菌株、４ＭＩＣ品質管理菌株、８ＭＩＣ品質管理菌株に従い勾配を設定する。
【0013】
好ましくは、ステップ３の具体的なプロセスとしては、
まず、９６ウェルマイクロタイタープレートに異なる濃度の消毒剤を含む５０μＬの作業溶液を加え、次に消毒剤濃度の低いものから高いものの順に希釈した細菌懸濁液を順次接種し、実験と同時に陽性対照及び陰性対照を設け、シールして適切な温度で一定時間培養した後、９６ウェルマイクロタイタープレート内の細菌の目に見える成長を観察する。細菌の目に見える成長が観察されない最小消毒剤濃度を、菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とし；
品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、ＯＤ６００値の大きさに基づき供試菌株の塩素抵抗性の強さを順位付け・評価する。
まず、９６ウェルマイクロタイタープレートに異なる濃度の消毒剤を含む５０μＬの作業溶液を加え、次に消毒剤濃度の低いものから高いものの順に希釈した細菌懸濁液を順次接種し、実験と同時に陽性対照及び陰性対照を設け、シールして適切な温度で一定時間培養した後、９６ウェルマイクロタイタープレート内の細菌の目に見える成長を観察する。細菌の目に見える成長が観察されない最小消毒剤濃度を、菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とし；
品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、ＯＤ６００値の大きさに基づき供試菌株の塩素抵抗性の強さを順位付け・評価する。
【0014】
好ましくは、ステップ４の具体的なプロセスとしては、
濃度がＭＩＣ品質管理菌株（又は１／２ＭＩＣ品質管理菌株）の消毒液で品質管理菌株及び有塩素抵抗性の特徴を持つ菌株をそれぞれ０、１０、３０分間処理し、生死細胞染色キットで生菌、死菌、損傷菌を区別する。１ｍＬの菌液と１．５μＬＳＹＴＯ９染色色素を１．５μＬヨウ化プロピジウム染色色素と混合し、次に混合物を暗所で室温にて１５分間染色した後、フローサイトメーターでテストし、染色された菌株の生存率の観察を介して、供試菌株の塩素抵抗性の強さを判断する。
濃度がＭＩＣ品質管理菌株（又は１／２ＭＩＣ品質管理菌株）の消毒液で品質管理菌株及び有塩素抵抗性の特徴を持つ菌株をそれぞれ０、１０、３０分間処理し、生死細胞染色キットで生菌、死菌、損傷菌を区別する。１ｍＬの菌液と１．５μＬＳＹＴＯ９染色色素を１．５μＬヨウ化プロピジウム染色色素と混合し、次に混合物を暗所で室温にて１５分間染色した後、フローサイトメーターでテストし、染色された菌株の生存率の観察を介して、供試菌株の塩素抵抗性の強さを判断する。
【0015】
好ましくは、前述の全ての評価方法における品質管理菌株は、サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６から選択される。
【0016】
本発明は、抵抗性の特徴を持つサルモネラ菌のスクリーニング又はサルモネラ菌の塩素抵抗性の強さを評価するための上に述べたような家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性評価方法の応用も提供する。
【0017】
好ましくは、塩素抵抗性が極めて強いサルモネラ菌は、Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３としてスクリーニングされる。
【0018】
本発明は、前記塩素抵抗性評価方法に基づいて、各種抗生物質に対する塩素抵抗性の特徴を持つ菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）をさらに測定することにより、塩素抵抗性サルモネラ菌の抗生物質抵抗性を判断し、また塩素抵抗性（ＯＤ６００値）と抗生物質抵抗性（ＭＩＣ値）との間の相関関係を比較して、塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じる抗生物質をスクリーニングする家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性評価方法の応用を提供することを、第２の技術的課題とするものである。
【0019】
本発明は、第２の技術的課題を解決するために、次のような技術的手段を提示する。
【0020】
前記家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性評価方法の応用は、塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じる抗生物質をスクリーニングするために用いられる。
【0021】
好ましくは、次のスクリーニングステップを含む。すなわち、
ステップ１：細菌懸濁液の調製
家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天平板上にストリークし、一定時間培養した後、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、遠心管でよく撹拌し、細菌懸濁液の濁度を０．５のマクファーランド濁度に調整し、次にカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておき；
ステップ２：塩素消毒剤の調合
滅菌済みの無菌水で消毒剤原液を濃度勾配希釈して用意しておき；
ステップ３：塩素抵抗性の測定
ブロス微量希釈法で供試菌株に対するＮａＣｌＯの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし；
ステップ４：抗生物質抵抗性の測定
好気性グラム陰性菌の薬剤感受性パネルを使用し、アンピシリン、アモキシシリン／クラブラン酸塩、セフォタキシム、メロペネム、アミカシン、ゲンタマイシン、コリスチン、セフチオフル、シプロフロキサシン、コトリモキサゾール、テトラサイクリン、チゲサイクリン、フロルフェニコールという１３種類の抗生物質に対する塩素抵抗性の特徴を持つ菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、塩素抵抗性サルモネラ菌の抗生物質抵抗性を判断し；
ステップ５：交差耐性の評価
塩素抵抗性（ＯＤ６００値）と抗生物質抵抗性（ＭＩＣ値）との間の相関関係を比較することにより、一体どの抗生物質が塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じるかを判断し、算出されたＰ値が有意に正の相関関係である場合、交差耐性が生じることを示し、これとは対照的に交差耐性が生じない。
ステップ１：細菌懸濁液の調製
家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天平板上にストリークし、一定時間培養した後、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、遠心管でよく撹拌し、細菌懸濁液の濁度を０．５のマクファーランド濁度に調整し、次にカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておき；
ステップ２：塩素消毒剤の調合
滅菌済みの無菌水で消毒剤原液を濃度勾配希釈して用意しておき；
ステップ３：塩素抵抗性の測定
ブロス微量希釈法で供試菌株に対するＮａＣｌＯの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし；
ステップ４：抗生物質抵抗性の測定
好気性グラム陰性菌の薬剤感受性パネルを使用し、アンピシリン、アモキシシリン／クラブラン酸塩、セフォタキシム、メロペネム、アミカシン、ゲンタマイシン、コリスチン、セフチオフル、シプロフロキサシン、コトリモキサゾール、テトラサイクリン、チゲサイクリン、フロルフェニコールという１３種類の抗生物質に対する塩素抵抗性の特徴を持つ菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、塩素抵抗性サルモネラ菌の抗生物質抵抗性を判断し；
ステップ５：交差耐性の評価
塩素抵抗性（ＯＤ６００値）と抗生物質抵抗性（ＭＩＣ値）との間の相関関係を比較することにより、一体どの抗生物質が塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じるかを判断し、算出されたＰ値が有意に正の相関関係である場合、交差耐性が生じることを示し、これとは対照的に交差耐性が生じない。
【0022】
好ましくは、前述のスクリーニング方法における品質管理菌株は、サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６から選択される。
【0023】
好ましくは、塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じる抗生物質は、セフチオフル、シプロフロキサシン、テトラサイクリン又はフロルフェニコールから選択される。
【発明の効果】
【0024】
従来技術と比較すると、本発明の有利な効果は、次の通りである。すなわち、
１、本発明は、家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法を提供し、１７２種のサルモネラ分離株に対し評価方法で試験を実施し、品質管理菌株Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６よりも塩素抵抗性が高い１６０種以上の供試菌株をスクリーニングでき、これにはサルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３も含まれるがこれに限定されない。対照的に、塩素抵抗性が品質管理菌株よりも非常に強い供試菌株は、サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３である。
１、本発明は、家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法を提供し、１７２種のサルモネラ分離株に対し評価方法で試験を実施し、品質管理菌株Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６よりも塩素抵抗性が高い１６０種以上の供試菌株をスクリーニングでき、これにはサルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３も含まれるがこれに限定されない。対照的に、塩素抵抗性が品質管理菌株よりも非常に強い供試菌株は、サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３である。
【0025】
２、スクリーニングされたサルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３について、フローサイトメトリーを通じて塩素抵抗性菌株と品質管理菌株の生存率の差を比較して、サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３の塩素抵抗性が品質管理菌株Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６よりも優れていることを検証し、又はＯＤ６００値がサルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３よりも低い他の塩素抵抗性菌株の塩素抵抗性もサルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３よりも弱いことを検証する。
【0026】
３、本発明はまた、家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性評価方法の応用を提供し、塩素抵抗性が品質管理菌株Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６より優れている１６０種以上の供試菌株に対して、アンピシリン、アモキシシリン／クラブラン酸塩、セフォタキシム、メロペネム、アミカシン、ゲンタマイシン、コリスチン、セフチオフル、シプロフロキサシン、コトリモキサゾール、テトラサイクリン、チゲサイクリン、フロルフェニコールという１３種類の抗生物質に対する塩素抵抗性の特徴を持つ菌株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定することで、塩素抵抗性サルモネラ菌の抗生物質抵抗性を判断する。また塩素抵抗性（ＯＤ６００値）と抗生物質抵抗性（ＭＩＣ値）との間の相関関係を比較することで、一体どの抗生物質が塩素抵抗性サルモネラ菌に対し交差耐性が生じるかどうかを判断する。
【0027】
結果は、１６０以上の塩素抵抗性サルモネラ菌のうち、セフチオフル、シプロフロキサシン、テトラサイクリン、フロルフェニコールという４種類の抗生物質のみに対して交差耐性が生じることを示している。
【0028】
上記をまとめると、本発明により提供される家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法及びその応用は、供試菌株の塩素抵抗性の強さを迅速かつ正確に評価し、塩素抵抗性供試菌株に対して交差耐性が生じする抗生物質をスクリーニングでき、禽類の食品の安全性を向上するために保護する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】９６ウェルプレート設置方法を示す例である（プレートあたり４つの細菌を接種し、３組並列しループ、陽性対照及び陰性対照を各々設置する）。
【図2】家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
以下、図面及び実施例を参照しつつ本発明の技術的手段をさらに説明する。ただし、本発明の保護範囲は、これらの実施例を含むがこれらに限定されず、本発明の技術的思想から逸脱しないすべて変化又は均等な置換は本発明の保護範囲に含まれている。
【0031】
（実施例１ 家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法の構築）
一、供試菌株の用意
１品質管理菌株：サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６は、中国微生物菌種保存センターに由来する。品質管理菌株は、７０℃以下で保存され、継代回数が５回以内までとした。
２供試菌株：家禽由来サルモネラ分離株。
一、供試菌株の用意
１品質管理菌株：サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６は、中国微生物菌種保存センターに由来する。品質管理菌株は、７０℃以下で保存され、継代回数が５回以内までとした。
２供試菌株：家禽由来サルモネラ分離株。
【0032】
二、細菌懸濁液の調製
無菌操作で家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天（ＴＳＡ）平板上にストリークし、３６±１℃で１６～１８時間培養し、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、３ｍＬ生理食塩水を含む遠心管内でよく撹拌し、濁度計と標準比濁チューブを使用して菌液の濃度を０．５のマクファーランド単位（≒１０８ＣＦＵ／ｍＬ）に校正してからカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておく。
無菌操作で家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天（ＴＳＡ）平板上にストリークし、３６±１℃で１６～１８時間培養し、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、３ｍＬ生理食塩水を含む遠心管内でよく撹拌し、濁度計と標準比濁チューブを使用して菌液の濃度を０．５のマクファーランド単位（≒１０８ＣＦＵ／ｍＬ）に校正してからカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておく。
【0033】
調製した濃度の菌液は、１５分以内に試料添加を完了しなければならない。
【0034】
三、塩素消毒剤の調合
塩素消毒剤溶液は、メーカー又は他の商業的に入手することができ、薬剤に薬剤の通称名、ロット番号、濃度及び有効期限を明記したラベルを貼り、指定された温度と湿度で保管される。
塩素消毒剤溶液は、メーカー又は他の商業的に入手することができ、薬剤に薬剤の通称名、ロット番号、濃度及び有効期限を明記したラベルを貼り、指定された温度と湿度で保管される。
【0035】
この実験において、塩素５６．８ｍｇ／ｍＬを含有するＮａＣｌＯ原液は、上海生工生物科技有限会社から購入した。無菌のＭｉｌｌｉ－Ｑ水（Ｐａｌｌ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）でＮａＣｌＯ原液を希釈して溶液を調製し、またＰａｌｉｎｔｅｓｔＣｈｌｏｒＳｅｎｓｅ（ＫＥＭＳ１０ＤＩＳＣＮ，Ｇａｔｅｓｈｅａｄ、ＵＫ）で溶液内の有効塩素濃度を測定した。測定した結果、次亜塩素酸ナトリウムの最小発育阻止濃度の範囲は１２８～７６８ｍｇ／Ｌ、濃度間の均等な間隔が１２８ｍｇ／Ｌであった。
【0036】
滅菌済みの無菌水で消毒剤原液を一連の濃度勾配に希釈して用意しておき、選択推奨範囲には、品質管理菌株の管理値、すなわち、１／２ＭＩＣ品質管理菌株、ＭＩＣ品質管理菌株、２ＭＩＣ品質管理菌株、４ＭＩＣ品質管理菌株、８ＭＩＣ品質管理菌株等を含める。消毒剤試験濃度の数は、５つ以上の濃度を選択するよう推奨する。
【0037】
四、塩素抵抗性の測定
この実験において、ブロス微量希釈法で１７２株のサルモネラ菌株に対する次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、ＯＤ６００値の大きさに基づき供試菌株の塩素抵抗性の強さを順位付け・評価した。
この実験において、ブロス微量希釈法で１７２株のサルモネラ菌株に対する次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、ＯＤ６００値の大きさに基づき供試菌株の塩素抵抗性の強さを順位付け・評価した。
【0038】
この研究では、分光光度計（ドイツＯｒｔｅｎｂｅｒｇ社製のＰＯＬＡＲｓｔａｒＯｍｅｇａ）を用い、マイクロタイタープレート上のＮａＣｌＯ濃度（１２８ｍｇ／Ｌ）が最も低いウェルのＯＤ６００値をスキャンし、これに基づいてＮａＣｌＯに対する異なる菌株の耐性の差を区別した。
【0039】
９６ウェルプレートの設置方法の例を図１に示す。まず、９６ウェルマイクロタイタープレートに異なる濃度の消毒剤を含む５０μＬの作業溶液（例えば濃度は１／２ＭＩＣ品質管理菌株、ＭＩＣ品質管理菌株、２ＭＩＣ品質管理菌株、４ＭＩＣ品質管理菌株、８ＭＩＣ品質管理菌株に設定する）を加え、次に消毒剤濃度の低いものから高いものの順に５０μＬの希釈した細菌懸濁液（数量が約１０５ＦＵ）を順次接種し、実験と同時に陽性対照（５０μＬの細菌懸濁液と５０μＬのブランクＭＨＢに接種）と陰性対照（１００μＬのブランクＭＨＢに直接接種）を設けた。試料ごとに３つ繰り返して設けた。マイクロタイタープレート用の使い捨てシーリングフィルムでシールし、試料ごとに３つ繰り返して設け、３６±１℃で１８時間培養した。９６ウェルマイクロタイタープレート内の細菌の目に見える成長を観察し、９６ウェルマイクロタイタープレート内の細菌の目に見える成長（クリアウェル）が観察されない最小消毒剤濃度を、ＭＩＣ（ＭＩＣ供試菌＞ＭＩＣ品質管理菌、薬剤耐性菌）とした。
【0040】
品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングした。
【0041】
ただし、複数の供試菌株が同じＭＩＣ値にある場合、特に供試菌株と品質管理菌株のＭＩＣ値が同じである場合、供試菌株に塩素抵抗性の有無、又は塩素抵抗性の強さがどれくらいか判断することができなかった。
【0042】
したがって、同じＭＩＣ値における菌株の塩素抵抗性の差を区別するため、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下のウェルを選択してＯＤ６００値（濁度法による測定）を測定した。測定結果を図２に示す。図２内からも分かるように、ＯＤ６００値が大きければ大きいほど抵抗性が強くなる。
【0043】
（実施例２ 家禽由来サルモネラ菌の塩素抵抗性の評価方法の検証と応用）
実施例１に基づいて、１７２株のサルモネラ菌株のＯＤ６００値を測定することにより、１６０種以上の塩素抵抗性が品質管理菌株Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６よりも優れたサルモネラ菌分離株をスクリーニングし、またＯＤ６００値の大きさの順により、塩素抵抗性が極めて強い品質管理菌株のサルモネラ分離株、すなわち、サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３をスクリーニングした。
実施例１に基づいて、１７２株のサルモネラ菌株のＯＤ６００値を測定することにより、１６０種以上の塩素抵抗性が品質管理菌株Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６よりも優れたサルモネラ菌分離株をスクリーニングし、またＯＤ６００値の大きさの順により、塩素抵抗性が極めて強い品質管理菌株のサルモネラ分離株、すなわち、サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３をスクリーニングした。
【0044】
さらに、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）で試験した塩素抵抗性菌株と品質管理菌株の生存率の差を比較して、スクリーニングした塩素抵抗性菌株の塩素抵抗性が品質管理菌株よりも本当に優れているかどうかを検証・評価した。つまり、本実施例は、塩素抵抗性菌株Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ Ｓ２００２－１３と品質管理菌株Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６の耐性の差を評価することにより、実施例１で構築された塩素抵抗性の評価方法を検証する。
【0045】
評価・検証の具体的なステップ：濃度がＭＩＣ品質管理菌株（又は１／２ＭＩＣ品質管理菌株）の消毒液で品質管理菌株ＣＶＣＣ １８０６、塩素抵抗性菌株Ｓ２００２－１３（８ＬｏｇＣＦＵ／ｍＬ）をそれぞれ０、１０、３０分間処理し、生死細胞染色キット（ＢａｃＬｉｇｈｔ(R)ＢａｃｔｅｒｉａｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＫｉｔＬ７０１２，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）で生菌、死菌、損傷菌を区別する。１ｍＬの菌液と１．５μＬＳＹＴＯ９染色色素を１．５μＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色色素と混合し、次に混合物を暗所で室温にて１５分間染色した後、装備する４８８ｎｍと６４０ｎｍレーザーのＢＤ－ＡｃｃｕｒｉＣ６のフローサイトメーターでＦＣＭテストを実施した。テスト結果を図３に示す。
【0046】
図３から分かるように、
１）塩素消毒剤で処理されていない細菌は、ＳＹＴＯ９陽性が高かった（図３Ａ及び図３Ｄ）。
２）１０分間処理された後、約１１．６％の品質管理菌株ＣＶＣＣ １８０６と６．９％の塩素抵抗性菌株Ｓ２００２－１３細胞が損傷された（図３Ｂ及び図３Ｅ）。
３）品質管理菌株ＣＶＣＣ １８０６の場合、細菌の６８％が３０分後にＰＩ陽性でしたが、同じ処理時間で塩素耐性菌Ｓ２００２－１の約１９．２％がＰＩ陽性であった（図３Ｃ及び図３Ｆ）。
４）品質管理菌株ＣＶＣＣ １８０６と比較すると、耐塩素性菌株Ｓ２００２－１３は、塩素含有消毒剤ストレス後の生存率が高く、塩素に対する抵抗性がより高いことを示している。
１）塩素消毒剤で処理されていない細菌は、ＳＹＴＯ９陽性が高かった（図３Ａ及び図３Ｄ）。
２）１０分間処理された後、約１１．６％の品質管理菌株ＣＶＣＣ １８０６と６．９％の塩素抵抗性菌株Ｓ２００２－１３細胞が損傷された（図３Ｂ及び図３Ｅ）。
３）品質管理菌株ＣＶＣＣ １８０６の場合、細菌の６８％が３０分後にＰＩ陽性でしたが、同じ処理時間で塩素耐性菌Ｓ２００２－１の約１９．２％がＰＩ陽性であった（図３Ｃ及び図３Ｆ）。
４）品質管理菌株ＣＶＣＣ １８０６と比較すると、耐塩素性菌株Ｓ２００２－１３は、塩素含有消毒剤ストレス後の生存率が高く、塩素に対する抵抗性がより高いことを示している。
【0047】
（実施例３ 塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じる抗生物質をスクリーニングする方法及び応用）
実施例１に基づいて、１７２株のサルモネラ菌株のＯＤ６００値を測定することにより、１６０種以上の塩素抵抗性が品質管理菌株Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６よりも優れたサルモネラ菌分離株をスクリーニングする。さらに多種類の抗生物質に対するこの１６０種類以上のサルモネラ分離株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定することで、塩素抵抗性サルモネラ菌の抗生物質抵抗性を判断する。また塩素抵抗性（ＯＤ６００値）と抗生物質抵抗性（ＭＩＣ値）との間の相関関係を比較することで、一体どの抗生物質が塩素抵抗性サルモネラ菌に対し交差耐性が生じるかどうかをスクリーニングする。
実施例１に基づいて、１７２株のサルモネラ菌株のＯＤ６００値を測定することにより、１６０種以上の塩素抵抗性が品質管理菌株Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６よりも優れたサルモネラ菌分離株をスクリーニングする。さらに多種類の抗生物質に対するこの１６０種類以上のサルモネラ分離株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定することで、塩素抵抗性サルモネラ菌の抗生物質抵抗性を判断する。また塩素抵抗性（ＯＤ６００値）と抗生物質抵抗性（ＭＩＣ値）との間の相関関係を比較することで、一体どの抗生物質が塩素抵抗性サルモネラ菌に対し交差耐性が生じるかどうかをスクリーニングする。
【0048】
スクリーニングステップは、具体的に次の通りである。すなわち、
一、供試菌株の用意
１品質管理菌株：サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６は、中国微生物菌種保存センターに由来する。品質管理菌株は、７０℃以下で保存され、継代回数が５回以内までとした。
２供試菌株：家禽由来サルモネラ分離株。
一、供試菌株の用意
１品質管理菌株：サルモネラＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６は、中国微生物菌種保存センターに由来する。品質管理菌株は、７０℃以下で保存され、継代回数が５回以内までとした。
２供試菌株：家禽由来サルモネラ分離株。
【0049】
二、細菌懸濁液の調製
無菌操作で家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天（ＴＳＡ）平板上にストリークし、３６±１℃で１６～１８時間培養し、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、３ｍＬ生理食塩水を含む遠心管内でよく撹拌し、濁度計と標準比濁チューブを使用して菌液の濃度を０．５のマクファーランド単位（≒１０８ＣＦＵ／ｍＬ）に校正してからカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておく。
無菌操作で家禽から分離して得られたサルモネラ菌及び品質管理菌株を大豆カゼインダイジェスト寒天（ＴＳＡ）平板上にストリークし、３６±１℃で１６～１８時間培養し、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、３ｍＬ生理食塩水を含む遠心管内でよく撹拌し、濁度計と標準比濁チューブを使用して菌液の濃度を０．５のマクファーランド単位（≒１０８ＣＦＵ／ｍＬ）に校正してからカゼイン加水分解物ブロス（ＭＨＢ）で細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておく。
【0050】
調製した濃度の菌液は、１５分以内に試料添加を完了しなければならない。
【0051】
三、塩素消毒剤の調合
塩素消毒剤溶液は、メーカー又は他の商業的に入手することができ、薬剤に薬剤の通称名、ロット番号、濃度及び有効期限を明記したラベルを貼り、指定された温度と湿度で保管される。
塩素消毒剤溶液は、メーカー又は他の商業的に入手することができ、薬剤に薬剤の通称名、ロット番号、濃度及び有効期限を明記したラベルを貼り、指定された温度と湿度で保管される。
【0052】
この実験において、塩素５６．８ｍｇ／ｍＬを含有するＮａＣｌＯ原液は、上海生工生物科技有限会社から購入した。無菌のＭｉｌｌｉ－Ｑ水（Ｐａｌｌ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）でＮａＣｌＯ原液を希釈して溶液を調製し、またＰａｌｉｎｔｅｓｔＣｈｌｏｒＳｅｎｓｅ（ＫＥＭＳ１０ＤＩＳＣＮ，Ｇａｔｅｓｈｅａｄ、ＵＫ）で溶液内の有効塩素濃度を測定した。測定結果、次亜塩素酸ナトリウムの最小発育阻止濃度の範囲は１２８～１０２４ｍｇ／Ｌ、濃度間の均等な間隔が１２８ｍｇ／Ｌであった。
【0053】
滅菌済みの無菌水で消毒剤原液を一連の濃度勾配に希釈して用意しておき、選択推奨範囲には、品質管理菌株の管理値、すなわち、１／２ＭＩＣ品質管理菌株、ＭＩＣ品質管理菌株、２ＭＩＣ品質管理菌株、４ＭＩＣ品質管理菌株、８ＭＩＣ品質管理菌株等を含める。消毒剤試験濃度の数は、５つ以上の濃度を選択するよう推奨する。
【0054】
四、塩素抵抗性の測定
この実験において、ブロス微量希釈法で１７２株のサルモネラ菌株に対する次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングした。
この実験において、ブロス微量希釈法で１７２株のサルモネラ菌株に対する次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングし、又は、
複数の供試菌株が同じのＭＩＣ値にある時、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下の菌株ＯＤ６００値を濁度法で測定し、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＯＤ６００値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングした。
【0055】
この研究では、分光光度計（ドイツＯｒｔｅｎｂｅｒｇ社製のＰＯＬＡＲｓｔａｒＯｍｅｇａ）を用い、マイクロタイタープレート上のＮａＣｌＯ濃度（１２８ｍｇ／Ｌ）が最も低いウェルのＯＤ６００値をスキャンし、これに基づいてＮａＣｌＯに対する異なる菌株の耐性の差を区別した。
【0056】
具体的にはまず、９６ウェルマイクロタイタープレートに異なる濃度の消毒剤を含む５０μＬの作業溶液（例えば濃度は１／２ＭＩＣ品質管理菌株、ＭＩＣ品質管理菌株、２ＭＩＣ品質管理菌株、４ＭＩＣ品質管理菌株、８ＭＩＣ品質管理菌株に設定する）を加え、次に消毒剤濃度の低いものから高いものの順に５０μＬの希釈した細菌懸濁液（数量が約１０５ＦＵ）を順次接種し、実験と同時に陽性対照（５０μＬの細菌懸濁液と５０μＬのブランクＭＨＢに接種）と陰性対照（１００μＬのブランクＭＨＢに直接接種）を設けた。試料ごとに３つ繰り返して設けた。マイクロタイタープレート用の使い捨てシーリングフィルムでシールし、試料ごとに３つ繰り返して設け、３６±１℃で１８時間培養した。９６ウェルマイクロタイタープレート内の細菌の目に見える成長を観察し、９６ウェルマイクロタイタープレート内の細菌の目に見える成長（クリアウェル）が観察されない最小消毒剤濃度を、ＭＩＣ（ＭＩＣ供試菌＞ＭＩＣ品質管理菌、薬剤耐性菌）とした。
【0057】
品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、塩素抵抗性の特徴を持つ菌株としてＭＩＣ値が品質管理菌株よりも高い供試菌株をスクリーニングした。
【0058】
ただし、複数の供試菌株が同じＭＩＣ値にある場合、特に供試菌株と品質管理菌株のＭＩＣ値が同じである場合、供試菌株に塩素抵抗性があるかどうかを判断することができなかった。
【0059】
したがって、同じＭＩＣ値における菌株の塩素抵抗性の差を区別するため、品質管理菌株のＭＩＣ値を基準とし、１／２ＭＩＣ品質管理菌株の消毒剤濃度処理下のウェルを選択してＯＤ６００値（濁度法による測定）を測定した。
【0060】
ＯＤ６００値が大きいほど、抵抗性が強くなり、実験結果は塩素抵抗性が品質管理菌株Ｓ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＣＶＣＣ １８０６よりも優れたサルモネラ分離株が１６０種以上あることを示し、この１６０種以上の塩素抵抗性サルモネラ菌について次のステップの抗生物質耐性の測定を実施した。
【0061】
五、抗生物質耐性の測定
無菌操作で供試菌株及び品質管理菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２）をＴＳＡ平板上にストリークし、３６±１℃で１６～１８時間培養し、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、３ｍＬ生理食塩水を含む遠心管内でよく撹拌し、濁度計と標準比濁チューブを使用して菌液の濃度を０．５のマクファーランド単位（≒１０８ＣＦＵ／ｍＬ）に校正してからＭＨＢで細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておく。
無菌操作で供試菌株及び品質管理菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２）をＴＳＡ平板上にストリークし、３６±１℃で１６～１８時間培養し、３～５個の単一コロニーを滅菌綿棒に浸し、３ｍＬ生理食塩水を含む遠心管内でよく撹拌し、濁度計と標準比濁チューブを使用して菌液の濃度を０．５のマクファーランド単位（≒１０８ＣＦＵ／ｍＬ）に校正してからＭＨＢで細菌懸濁液を１００倍に希釈した後でよく混ぜて用意しておく。
【0062】
Ｂｉｏｆｏｓｕｎ（登録商標）好気性グラム陰性菌感受性パネルを使用してステップ４でスクリーニングされた１６０種以上の塩素抵抗性サルモネラ菌のアンピシリン（ＡＭＰ）、アモキシシリン／クラブラン酸塩（ＡＭＣ）、セフォタキシム（ＣＴＸ）、メロペネム（ＭＥＭ）、アミカシン（ＡＭＫ）、ゲンタマイシン（ＧＥＮ）、コリスチン（ＣＳ）、セフチオフル（ＣＥＦ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、コトリモキサゾール（Ｔ／Ｓ）、テトラサイクリン（ＴＥＴ）、チゲサイクリン（ＴＩＧ）、フロルフェニコール（ＦＦＣ）の計１３種類の抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を検査した。米国臨床検査標準化委員会（ＣＬＳＩ）の基準で結果を判断した。
【0063】
六、交差耐性の評価
この実験において、塩素抵抗性（ＯＤ６００値）と抗生物質抵抗性（ＭＩＣ値）との間の相関関係（Ｐ値の計算）を比較することにより、１３種類の抗生物質のうち、一体どの抗生物質が塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じるかを判断する。つまり、算出されたＰ値が有意に正の相関関係である場合、交差耐性が生じることを示し、これとは対照的に交差耐性が生じない。
この実験において、塩素抵抗性（ＯＤ６００値）と抗生物質抵抗性（ＭＩＣ値）との間の相関関係（Ｐ値の計算）を比較することにより、１３種類の抗生物質のうち、一体どの抗生物質が塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じるかを判断する。つまり、算出されたＰ値が有意に正の相関関係である場合、交差耐性が生じることを示し、これとは対照的に交差耐性が生じない。
【0064】
ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２０ソフトウェア内のＳｐｅａｒｍａｎ関連検定で塩素抵抗性（ＯＤ６００値）と抗生物質抵抗性（ＭＩＣ値）との間の相関関係を測定したところ、 Ｓｐｅａｒｍａｎ係数の取り得る値の範囲は、－１～＋１で、Ｓｐｅａｒｍａｎの相関関係の分析の結果を表１に示す。
【0065】
表１からも分かるように、塩素消毒剤に対する細菌の抵抗性が抗生物質の薬剤耐性と有意に正の相関関係（ｐ＜０．０５）にある場合、塩素含有消毒剤と抗生物質がサルモネラ菌に対して交差耐性が生じることを示している。
【0066】
結果は、１３種類の抗生物質のうち、セフチオフル（ＣＥＦ）、シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、テトラサイクリン（ＴＥＴ）、フロルフェニコール（ＦＦＣ）のみが全ての塩素抵抗性サルモネラ菌に対して交差耐性が生じることを示している。
【0067】
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
