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特開2023-102253熱安定性が向上したクロラムフェニコール無毒化酵素、およびその製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023102253
(43)【公開日】2023-07-24
(54)【発明の名称】熱安定性が向上したクロラムフェニコール無毒化酵素、およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20230714BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230714BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230714BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20230714BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12N9/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022167553
(22)【出願日】2022-10-19
(31)【優先権主張番号】P 2022002013
(32)【優先日】2022-01-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000173762
【氏名又は名称】公益財団法人相模中央化学研究所
(72)【発明者】
【氏名】穂谷 恵
(72)【発明者】
【氏名】井上 宗宣
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050LL10
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065BA02
(57)【要約】
【課題】 熱安定性が向上したクロラムフェニコール無毒化酵素およびその製造方法を提供すること。
【解決手段】配列番号１に示されるアミノ酸配列の１７番目のヒスチジン残基をバリン残基、アラニン残基およびプロリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換すること、および／または、配列番号１に示されるアミノ酸配列の３４番目のアスパラギン残基をセリン残基またはアラニン残基に置換すること、および／または、１３４番目のフェニルアラニン残基をアラニン残基またはメチオニン残基に置換すること、および／または、１５７番目のアスパラギン酸残基をシステイン残基、アラニン残基、グリシン残基、アスパラギン残基、ヒスチジン残基およびスレオニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換すること、および／または、１９８番目のグリシン残基をロイシン残基、システイン残基、スレオニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、アラニン残基、イソロイシン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換すること、加えて、大腸菌を用いて当該クロラムフェニコール無毒化酵素を製造することにより、前記課題を解決する。
【選択図】 なし
【解決手段】配列番号１に示されるアミノ酸配列の１７番目のヒスチジン残基をバリン残基、アラニン残基およびプロリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換すること、および／または、配列番号１に示されるアミノ酸配列の３４番目のアスパラギン残基をセリン残基またはアラニン残基に置換すること、および／または、１３４番目のフェニルアラニン残基をアラニン残基またはメチオニン残基に置換すること、および／または、１５７番目のアスパラギン酸残基をシステイン残基、アラニン残基、グリシン残基、アスパラギン残基、ヒスチジン残基およびスレオニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換すること、および／または、１９８番目のグリシン残基をロイシン残基、システイン残基、スレオニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、アラニン残基、イソロイシン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換すること、加えて、大腸菌を用いて当該クロラムフェニコール無毒化酵素を製造することにより、前記課題を解決する。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）～（５）に記載のアミノ酸残基への置換をいずれか１つ以上含む、タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７番目のヒスチジン残基の、バリン残基、アラニン残基およびプロリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３４番目のアスパラギン残基の、セリン残基またはアラニン残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３４番目のフェニルアラニン残基の、アラニン残基またはメチオニン残基への置換
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基の、システイン残基、アラニン残基、グリシン残基、アスパラギン残基、ヒスチジン残基およびスレオニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基の、ロイシン残基、システイン残基、スレオニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、アラニン残基、イソロイシン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（ｂ）前記（ａ）に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素のアミノ酸配列において、配列番号１の１７番目、３４番目、１３４番目、１５７番目および１９８番目のアミノ酸残基のいずれにも該当しないアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置においてのアミノ酸残基の置換、もしくは数個の位置において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のいずれか１つ以上のアミノ酸配列について、アミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を有するタンパク質
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）～（５）に記載のアミノ酸残基への置換をいずれか１つ以上含む、タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７番目のヒスチジン残基の、バリン残基、アラニン残基およびプロリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３４番目のアスパラギン残基の、セリン残基またはアラニン残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３４番目のフェニルアラニン残基の、アラニン残基またはメチオニン残基への置換
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基の、システイン残基、アラニン残基、グリシン残基、アスパラギン残基、ヒスチジン残基およびスレオニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基の、ロイシン残基、システイン残基、スレオニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、アラニン残基、イソロイシン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（ｂ）前記（ａ）に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素のアミノ酸配列において、配列番号１の１７番目、３４番目、１３４番目、１５７番目および１９８番目のアミノ酸残基のいずれにも該当しないアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置においてのアミノ酸残基の置換、もしくは数個の位置において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のいずれか１つ以上のアミノ酸配列について、アミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を有するタンパク質
【請求項2】
配列番号２から配列番号２２のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
【請求項3】
Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
【請求項4】
Ｎ末端の付加的なアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、請求項３に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
【請求項5】
請求項１から４のいずれか１項に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項6】
請求項５に記載の１項に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項7】
請求項６に記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体であって、請求項１に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素を生産可能な形質転換体。
【請求項8】
宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項７に記載の形質転換体。
【請求項9】
請求項７に記載の形質転換体を培養することによりクロラムフェニコール無毒化酵素を生産する工程、得られた培養物から生産されたクロラムフェニコール無毒化酵素を回収する工程、の２つの工程を含む、請求項１に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、熱安定性が向上したクロラムフェニコール無毒化酵素である変異型クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌が産生するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＣＡＴ）は、細菌に対する抗生物質クロラムフェニコールにアセチル基を転移する酵素である。ＣＡＴをコードする遺伝子（ＣＡＴ遺伝子）を発現する細菌は、クロラムフェニコールに対する耐性を示すため、ＣＡＴ遺伝子は遺伝子導入ベクターの選択マーカーや導入遺伝子の活性を測定するためのレポーター遺伝子として、クロラムフェニコール感受性の宿主細菌を用いた組換え生物の作製に広く使用されている。また、ＣＡＴ自体の用途としては、ＣＡＴ遺伝子の発現活性を測定する際の試薬として使用される。
【0003】
ＣＡＴ遺伝子は様々な細菌由来の種々なアミノ酸配列のものが知られている。遺伝子導入ベクターの選択マーカーとして利用されるＣＡＴ遺伝子としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ６２５７７）などが知られている。
【0004】
前述した通り、ＣＡＴは種々の生物内で発現し、クロラムフェニコールを無毒化し、宿主細菌にクロラムフェニコール耐性を付与するため、遺伝子組換え生物の作製や評価に有用である。しかし大腸菌等の常温性の細菌由来のＣＡＴは熱により失活や活性の低下が起きるため、発現させる宿主細菌の生育条件や、試薬としての製造や流通・保管条件に制約があった。熱安定性が向上したＣＡＴとして、黄色ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣＡＴの１３８番目のアラニン残基をスレオニン残基等に置換することにより、ＣＡＴの酵素活性を維持しながら熱安定性が向上することが知られている（非特許文献１）。また、当該変異型ＣＡＴをコードする遺伝子をもつベクターにより形質転換した好熱性細菌が、高温培養下でクロラムフェニコール耐性を示すことから、好熱菌宿主細菌での選択マーカーとして有用であることが知られている（非特許文献２）。しかしながら、大腸菌をはじめとする細菌用のベクターの選択マーカーとして広く使用されている大腸菌由来のＣＡＴで、熱安定性が向上した変異型は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９９巻、５５６３－５５７２頁、２０１５年
【非特許文献2】Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、８１巻、７６２５－７６３２頁、２０１５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の課題は、熱に対する安定性が向上したクロラムフェニコール無毒化酵素とその遺伝子、およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは前記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１７番目のヒスチジン残基をバリン残基、アラニン残基およびプロリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換すること、および/または、配列番号１に示されるアミノ酸配列の３４番目のアスパラギン残基をセリン残基またはアラニン残基に置換すること、および/または、１３４番目のフェニルアラニン残基をアラニン残基またはメチオニン残基に置換すること、および/または、１５７番目のアスパラギン酸残基をシステイン残基、アラニン残基、グリシン残基、アスパラギン残基、ヒスチジン残基およびスレオニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換すること、および/または、１９８番目のグリシン残基をロイシン残基、システイン残基、スレオニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、アラニン残基、イソロイシン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換することにより、クロラムフェニコール無毒化酵素活性を維持しつつ、熱に対する安定性が向上したクロラムフェニコール無毒化酵素が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち本発明は、以下の［１］から［９］に記載した発明を包含するものである。
［１］
以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）～（５）に記載のアミノ酸残基への置換をいずれか１つ以上含む、タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７番目のヒスチジン残基の、バリン残基、アラニン残基およびプロリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３４番目のアスパラギン残基の、セリン残基またはアラニン残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３４番目のフェニルアラニン残基の、アラニン残基またはメチオニン残基への置換
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基の、システイン残基、アラニン残基、グリシン残基、アスパラギン残基、ヒスチジン残基およびスレオニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基の、ロイシン残基、システイン残基、スレオニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、アラニン残基、イソロイシン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（ｂ）前記（ａ）に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素のアミノ酸配列において、配列番号１の１７番目、３４番目、１３４番目、１５７番目および１９８番目のアミノ酸残基のいずれにも該当しないアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置においてのアミノ酸残基の置換、もしくは数個の位置において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のいずれか１つ以上のアミノ酸配列について、アミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を有するタンパク質
［２］
配列番号２から配列番号２２のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、前記［１］に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
［３］
Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する、前記［１］または［２］に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
［４］
Ｎ末端の付加的なアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、前記［１］から［３］のいずれか１項に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
［５］
［１］から［４］のいずれか１項に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素をコードするＤＮＡ。
［６］
前記［５］に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
［７］
前記［６］に記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体であって、［１］から［４］のいずれか１項に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素を生産可能な形質転換体。
［８］ 宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、前記［７］に記載の形質転換体。
［９］前記［７］または［８］に記載の形質転換体を培養することによりクロラムフェニコール無毒化酵素を生産する工程、得られた培養物から生産されたクロラムフェニコール無毒化酵素を回収する工程、の２つの工程を含む、［１］から［４］のいずれか１項に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素の製造方法。
［１］
以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）～（５）に記載のアミノ酸残基への置換をいずれか１つ以上含む、タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１７番目のヒスチジン残基の、バリン残基、アラニン残基およびプロリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３４番目のアスパラギン残基の、セリン残基またはアラニン残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１３４番目のフェニルアラニン残基の、アラニン残基またはメチオニン残基への置換
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基の、システイン残基、アラニン残基、グリシン残基、アスパラギン残基、ヒスチジン残基およびスレオニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基の、ロイシン残基、システイン残基、スレオニン残基、バリン残基、アスパラギン残基、アラニン残基、イソロイシン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（ｂ）前記（ａ）に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素のアミノ酸配列において、配列番号１の１７番目、３４番目、１３４番目、１５７番目および１９８番目のアミノ酸残基のいずれにも該当しないアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置においてのアミノ酸残基の置換、もしくは数個の位置において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のいずれか１つ以上のアミノ酸配列について、アミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含み、かつクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を有するタンパク質
［２］
配列番号２から配列番号２２のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、前記［１］に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
［３］
Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する、前記［１］または［２］に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
［４］
Ｎ末端の付加的なアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、前記［１］から［３］のいずれか１項に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素。
［５］
［１］から［４］のいずれか１項に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素をコードするＤＮＡ。
［６］
前記［５］に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
［７］
前記［６］に記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体であって、［１］から［４］のいずれか１項に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素を生産可能な形質転換体。
［８］ 宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、前記［７］に記載の形質転換体。
［９］前記［７］または［８］に記載の形質転換体を培養することによりクロラムフェニコール無毒化酵素を生産する工程、得られた培養物から生産されたクロラムフェニコール無毒化酵素を回収する工程、の２つの工程を含む、［１］から［４］のいずれか１項に記載のクロラムフェニコール無毒化酵素の製造方法。
【0009】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【0010】
本発明のクロラムフェニコール無毒化酵素は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＣＡＴ）のアミノ酸配列である配列番号１で示される２１９アミノ酸残基（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ６２５７７）を少なくとも含み、ＬＢ培地などを用いた遺伝子工学で一般的に用いられる培養条件下で宿主細菌が増殖可能な程度にクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を保持する限り、ＣＡＴのアミノ酸配列の特定の位置にあるアミノ酸残基を置換することにより変異を導入した変異型ＣＡＴも含む。また、ＣＡＴのアミノ酸配列のＮ末端側またはＣ末端側に酵素活性を有しないポリペプチドや分子が付加されていてもよい。
本明細書において変異型ＣＡＴとは、配列番号１で示されるＣＡＴのアミノ酸配列の特定のアミノ酸残基に対して、後述する実施例で示すように、変異導入を行ったものである。具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、１７番目のヒスチジン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号２）、１７番目のヒスチジン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号３）、１７番目のヒスチジン残基をプロリン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号４）、３４番目のアスパラギン残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号５）、３４番目のアスパラギン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号６）、１３４番目のフェニルアラニン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号７）、１３４番目のフェニルアラニン残基をメチオニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号８）、１５７番目のアスパラギン酸残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号９）、１５７番目のアスパラギン酸残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１０）、１５７番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１１）、１５７番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１２）、１５７番目のアスパラギン酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１３）、１５７番目のアスパラギン酸残基をスレオニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１４）、１９８番目のグリシン残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１５）、１９８番目のグリシン残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１６）、１９８番目のグリシン残基をスレオニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１７）、１９８番目のグリシン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１８）、１９８番目のグリシン残基をアスパラギン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１９）、１９８番目のグリシン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号２０）、１９８番目のグリシン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号２１）および１９８番目のグリシン残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号２２）のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。これらの変異型ＣＡＴを含むクロラムフェニコール無毒化酵素は、後述する実施例で示すように、クロラムフェニコールを無毒化し宿主細菌にクロラムフェニコール耐性を与える酵素活性を維持しながら、配列番号１で示される変異導入を行っていないＣＡＴのアミノ酸配列を含む野生型のクロラムフェニコール無毒化酵素と比較して熱に対する安定性が向上しており、熱安定性が最も高い点で、配列番号９で示される変異型ＣＡＴを含むクロラムフェニコール無毒化酵素が好ましい。
本明細書において変異型ＣＡＴとは、配列番号１で示されるＣＡＴのアミノ酸配列の特定のアミノ酸残基に対して、後述する実施例で示すように、変異導入を行ったものである。具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、１７番目のヒスチジン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号２）、１７番目のヒスチジン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号３）、１７番目のヒスチジン残基をプロリン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号４）、３４番目のアスパラギン残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号５）、３４番目のアスパラギン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号６）、１３４番目のフェニルアラニン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号７）、１３４番目のフェニルアラニン残基をメチオニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号８）、１５７番目のアスパラギン酸残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号９）、１５７番目のアスパラギン酸残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１０）、１５７番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１１）、１５７番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１２）、１５７番目のアスパラギン酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１３）、１５７番目のアスパラギン酸残基をスレオニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１４）、１９８番目のグリシン残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１５）、１９８番目のグリシン残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１６）、１９８番目のグリシン残基をスレオニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１７）、１９８番目のグリシン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１８）、１９８番目のグリシン残基をアスパラギン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号１９）、１９８番目のグリシン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号２０）、１９８番目のグリシン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号２１）および１９８番目のグリシン残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列（配列番号２２）のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。これらの変異型ＣＡＴを含むクロラムフェニコール無毒化酵素は、後述する実施例で示すように、クロラムフェニコールを無毒化し宿主細菌にクロラムフェニコール耐性を与える酵素活性を維持しながら、配列番号１で示される変異導入を行っていないＣＡＴのアミノ酸配列を含む野生型のクロラムフェニコール無毒化酵素と比較して熱に対する安定性が向上しており、熱安定性が最も高い点で、配列番号９で示される変異型ＣＡＴを含むクロラムフェニコール無毒化酵素が好ましい。
【0011】
本発明のクロラムフェニコール無毒化酵素は、クロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のバリアント配列を有するタンパク質であってもよい。
（ｉ）１７番目のヒスチジン残基、３４番目のアスパラギン残基、１３４番目のフェニルアラニン残基、１５７番目のアスパラギン酸残基および１９８番目のグリシン残基のいずれにも該当しないアミノ酸残基のいずれか１もしくは数個のアミノ酸残基が、任意のアミノ酸残基に置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したタンパク質
（ｉｉ）（ｉ）に記載のタンパク質のうち、アミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質。
（ｉ）１７番目のヒスチジン残基、３４番目のアスパラギン残基、１３４番目のフェニルアラニン残基、１５７番目のアスパラギン酸残基および１９８番目のグリシン残基のいずれにも該当しないアミノ酸残基のいずれか１もしくは数個のアミノ酸残基が、任意のアミノ酸残基に置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したタンパク質
（ｉｉ）（ｉ）に記載のタンパク質のうち、アミノ酸配列全体に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質。
【0012】
前記（ｉ）において「１もしくは数個」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１個以上２０個以下、１個以上１０個以下、１個以上５個以下、１個以上３個以下のいずれかを意味する。また、「置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上」には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いなどに基づく、天然にも生じ得る変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【0013】
前記（ｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上であればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本発明において相同性とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。アミノ酸配列間の同一性とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列間の類似性とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
【0014】
また、本発明のクロラムフェニコール無毒化酵素は、宿主細菌が生育できる程度にクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側および／またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用な付加的なアミノ酸配列を有していてもよい。前記付加的なアミノ酸配列としては、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、ＳＵＭＯ（ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等が挙げられる。中でも、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより組換えタンパク質の精製が容易に行える点で、ポリヒスチジン配列が好ましい。
【0015】
本発明のポリヌクレオチドは、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法や化学合成法など当業者が通常行う方法で得ればよい。本発明のポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号２６のポリヌクレオチドの配列、配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号２８のポリヌクレオチドの配列、配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号３０のポリヌクレオチドの配列、配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号３２のポリヌクレオチド、配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号３４のポリヌクレオチドの配列、配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号３６のポリヌクレオチドの配列、配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号３８のポリヌクレオチドの配列、配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号４０のポリヌクレオチドの配列、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号４２のポリヌクレオチドの配列、配列番号１１のアミノ酸配列をコードする配列番号４４のポリヌクレオチドの配列、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする配列番号４６のポリヌクレオチドの配列、配列番号１３のアミノ酸配列をコードする配列番号４８のポリヌクレオチドの配列、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする配列番号５０のポリヌクレオチドの配列、配列番号１５のアミノ酸配列をコードする配列番号５２のポリヌクレオチドの配列、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする配列番号５４のポリヌクレオチドの配列、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする配列番号５６のポリヌクレオチドの配列、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする配列番号５８のポリヌクレオチドの配列、配列番号１９のアミノ酸配列をコードする配列番号６０のポリヌクレオチドの配列、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする配列番号６２のポリヌクレオチドの配列、配列番号２１のアミノ酸配列をコードする配列番号６４のポリヌクレオチドの配列および配列番号２２のアミノ酸配列をコードする配列番号６６のポリヌクレオチドの配列の配列が挙げられる。
【0016】
本発明のクロラムフェニコール無毒化酵素を生産可能な形質転換体を得るには、当業者が通常用いる方法でよく、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド等を基にしたベクター中の適切な位置に前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入して当該タンパク質の発現ベクターを作製後、当該ベクターを用いて宿主を形質転換し、得ればよい。前記宿主は特に制限はないが、遺伝子工学に関する実験が容易な点で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましく、具体的には、大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株が挙げられる。また、前記発現ベクターも特に制限はないが、実験が容易である点で、大腸菌宿主で使用可能な発現ベクターが好ましく、具体的には、ｐＥＴベクター、ｐＴｒｃベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＵＣベクターおよびｐＢＢＲベクター等のプラスミドベクターが挙げられる。
本発明のクロラムフェニコール無毒化酵素の製造は、当業者が通常行う方法でよく、前記形質転換体を用いて発現培養を行い、培養物から目的の組換えタンパク質を回収・精製すればよい。なお、本発明の培養物とは、培養された形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。
本発明のクロラムフェニコール無毒化酵素の熱安定性の評価は、当業者が通常行う方法でよく、Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法や示差走査熱量計により行うことができる。一例として、Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法でタンパク質の構造変化をモニターする色素としてＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを用いた方法を挙げることができる。
本発明のクロラムフェニコール無毒化酵素の酵素活性の評価は、当業者が通常行う方法でよく、クロラムフェニコールを含む培地での組換え細菌の生育を観察することにより行うことができる。一例として、クロラムフェニコールを添加した寒天培地に組換え細菌を塗抹した後に培養し、コロニーの出現の有無により酵素活性の有無を評価する方法を挙げることができる。
本発明のクロラムフェニコール無毒化酵素の製造は、当業者が通常行う方法でよく、前記形質転換体を用いて発現培養を行い、培養物から目的の組換えタンパク質を回収・精製すればよい。なお、本発明の培養物とは、培養された形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。
本発明のクロラムフェニコール無毒化酵素の熱安定性の評価は、当業者が通常行う方法でよく、Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法や示差走査熱量計により行うことができる。一例として、Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法でタンパク質の構造変化をモニターする色素としてＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを用いた方法を挙げることができる。
本発明のクロラムフェニコール無毒化酵素の酵素活性の評価は、当業者が通常行う方法でよく、クロラムフェニコールを含む培地での組換え細菌の生育を観察することにより行うことができる。一例として、クロラムフェニコールを添加した寒天培地に組換え細菌を塗抹した後に培養し、コロニーの出現の有無により酵素活性の有無を評価する方法を挙げることができる。
【発明の効果】
【0017】
本発明のクロラムフェニコール無毒化酵素は、特定の位置にあるアミノ酸残基を置換することにより、クロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を維持しながら熱安定性を向上させたものであり、当該酵素を用いることにより、温度変化による酵素活性の低下や失活を抑え、安定な酵素活性を発揮することができる。
【実施例0018】
以下、作製例、実施例、比較例および実験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
比較例１ 野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴの作製
野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質として６Ｈ－ＣＡＴを設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞大腸菌由来のｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ６２５７７、２１９アミノ酸残基）（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号２３）を含むポリヌクレオチドを、ｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（配列番号２４）を大腸菌で発現可能なベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴを作製した。作製した発現ベクターを表１に記載した。なお、形質転換体の作製は、後述の＜２＞に記載した。また実施例１から２１および比較例２から１０については、後述の作製例１から６に記載した。
比較例１ 野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴの作製
野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質として６Ｈ－ＣＡＴを設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞大腸菌由来のｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ６２５７７、２１９アミノ酸残基）（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号２３）を含むポリヌクレオチドを、ｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）のマルチクローニングサイトに挿入することで、野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（配列番号２４）を大腸菌で発現可能なベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴを作製した。作製した発現ベクターを表１に記載した。なお、形質転換体の作製は、後述の＜２＞に記載した。また実施例１から２１および比較例２から１０については、後述の作製例１から６に記載した。
【0019】
【表1】
【0020】
＜２＞＜１＞で作製した発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、組換え大腸菌（形質転換体）ＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴを得た。なお、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）はＣＡＴ遺伝子を持たないため、クロラムフェニコール感受性である。
【0021】
＜３＞得られた形質転換体を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行なった。
【0022】
＜４＞＜３＞の前培養液を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（ＯＤ６００ｎｍ）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、ＩＰＴＧを０．５ｍＭ添加した後、４時間培養することで、６Ｈ－ＣＡＴを発現させた。
【0023】
＜５＞ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて、メーカープロトコルに従い菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの６Ｈ－ＣＡＴの精製は、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行なった。クロマトグラフィーの溶出は溶出用緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）により行った。
【0024】
作製例１ ＣＡＴのアミノ酸配列の１７番目のヒスチジン残基変異型の作製
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１７番目のヒスチジン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１７番目のヒスチジン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１７番目のヒスチジン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１７番目のヒスチジン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
【0025】
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ｖ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ｖ）（配列番号２５）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ｖ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１７番目のヒスチジン残基をバリン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｈ１７Ｖ）（配列番号２）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｈ１７Ｖ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号２６）を用いた。
【0026】
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ａ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ａ）（配列番号２７）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ａ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１７番目のヒスチジン残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｈ１７Ａ）（配列番号３）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｈ１７Ａ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号２８）を用いた。
【0027】
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ｐ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ｐ）（配列番号２９）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ｐ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１７番目のヒスチジン残基をプロリン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｈ１７Ｐ）（配列番号４）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｈ１７Ｐ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号３０）を用いた。
【0028】
＜２＞比較例１＜２＞に記載と同様な方法で、前記＜１＞で作製した発現ベクターにより、変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を発現可能な形質転換体を取得した。発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ｖ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ｖ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ａ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ａ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ｐ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｈ１７Ｐ）を取得した。取得した形質転換体を用いて、比較例１＜３＞から＜５＞に記載と同様な方法で変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質溶液を得た。
【0029】
作製例２ ＣＡＴのアミノ酸配列の３４番目のアスパラギン残基変異型の作製
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の３４番目のアスパラギン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の３４番目のアスパラギン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）（配列番号３１）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の３４番目のアスパラギン残基をセリン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）（配列番号５）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号３２）を用いた。
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の３４番目のアスパラギン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の３４番目のアスパラギン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）（配列番号３１）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の３４番目のアスパラギン残基をセリン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）（配列番号５）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号３２）を用いた。
【0030】
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ａ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ａ）（配列番号３３）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ａ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の３４番目のアスパラギン残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｎ３４Ａ）（配列番号６）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｎ３４Ａ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号３４）を用いた。
【0031】
＜２＞比較例１＜２＞に記載と同様な方法で、前記＜１＞で作製した発現ベクターにより、変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を発現可能な形質転換体を取得した。発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ｓ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ａ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｎ３４Ａ）を取得した。取得した形質転換体を用いて、比較例１＜３＞から＜５＞に記載と同様な方法で変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質溶液を得た。
【0032】
作製例３ ＣＡＴのアミノ酸配列の１３４番目のフェニルアラニン残基変異型の作製
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のフェニルアラニン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のフェニルアラニン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のフェニルアラニン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のフェニルアラニン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
【0033】
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｆ１３４Ａ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｆ１３４Ａ）（配列番号３５）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｆ１３４Ａ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１３４番目のフェニルアラニン残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｆ１３４Ａ）（配列番号７）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｆ１３４Ａ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号３６）を用いた。
【0034】
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｆ１３４Ｍ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｆ１３４Ｍ）（配列番号３７）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｆ１３４Ｍ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１３４番目のフェニルアラニン残基をメチオニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｆ１３４Ｍ）（配列番号８）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｆ１３４Ｍ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号３８）を用いた。
【0035】
＜２＞比較例１＜２＞に記載と同様な方法で、前記＜１＞で作製した発現ベクターにより、変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を発現可能な形質転換体を取得した。発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｆ１３４Ａ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｆ１３４Ａ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｆ１３４Ｍ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｆ１３４Ｍ）を取得した。取得した形質転換体を用いて、比較例１＜３＞から＜５＞に記載と同様な方法で変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質溶液を得た。
【0036】
作製例４ ＣＡＴのアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基変異型の作製
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１５７番目のアスパラギン酸残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１５７番目のアスパラギン酸残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１５７番目のアスパラギン酸残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１５７番目のアスパラギン酸残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
【0037】
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｃ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｃ）（配列番号３９）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｃ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基をシステイン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｄ１５７Ｃ）（配列番号９）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｄ１５７Ｃ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号４０）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）（配列番号４１）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）（配列番号１０）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号４２）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）（配列番号４１）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）（配列番号１０）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号４２）を用いた。
【0038】
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｇ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｇ）（配列番号４３）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｇ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基をグリシン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｄ１５７Ｇ）（配列番号１１）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｄ１５７Ｇ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号４４）を用いた。
【0039】
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｎ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｎ）（配列番号４５）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｎ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｄ１５７Ｎ）（配列番号１２）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｄ１５７Ｎ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号４６）を用いた。
【0040】
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｈ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｈ）（配列番号４７）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｈ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基をヒスチジン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｄ１５７Ｈ）（配列番号１３）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｄ１５７Ｈ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号４８）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）（配列番号４９）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基をスレオニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）（配列番号１４）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号５０）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）（配列番号４９）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１５７番目のアスパラギン酸残基をスレオニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）（配列番号１４）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号５０）を用いた。
【0041】
＜２＞比較例１＜２＞に記載と同様な方法で、前記＜１＞で作製した発現ベクターにより、変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を発現可能な形質転換体を取得した。発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｃ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｃ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ａ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｇ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｇ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｎ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｎ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｈ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｈ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｄ１５７Ｔ）を取得した。取得した形質転換体を用いて、比較例１＜３＞から＜５＞に記載と同様な方法で変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質溶液を得た。
【0042】
作製例５ ＣＡＴのアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基変異型の作製
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１９８番目のグリシン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１９８番目のグリシン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）（配列番号５１）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をロイシン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）（配列番号１５）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号５２）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）（配列番号５３）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をシステイン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）（配列番号１６）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号５４）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）（配列番号５５）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をスレオニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）（配列番号１７）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号５６）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）（配列番号５７）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をバリン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）（配列番号１８）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号５８）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）（配列番号５９）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をアスパラギン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）（配列番号１９）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号６０）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）（配列番号６１）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）（配列番号２０）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号６２）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）（配列番号６３）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をイソロイシン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）（配列番号２１）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号６４）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）（配列番号６５）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をセリン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）（配列番号２２）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号６６）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）（配列番号６７）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をプロリン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）（配列番号６８）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号６９）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）（配列番号７０）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をメチオニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）（配列番号７１）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号７２）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）（配列番号７３）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をフェニルアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）（配列番号７４）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号７５）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）（配列番号７６）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をチロシン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）（配列番号７７）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号７８）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）（配列番号７９）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をグルタミン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）（配列番号８０）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号８１）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）（配列番号８２）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をグルタミン酸残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）（配列番号８３）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号８４）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）（配列番号８５）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をヒスチジン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）（配列番号８６）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号８７）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）（配列番号８８）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をリジン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）（配列番号８９）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号９０）を用いた。
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１９８番目のグリシン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１９８番目のグリシン残基を置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）（配列番号５１）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をロイシン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）（配列番号１５）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号５２）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）（配列番号５３）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をシステイン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）（配列番号１６）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号５４）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）（配列番号５５）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をスレオニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）（配列番号１７）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号５６）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）（配列番号５７）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をバリン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）（配列番号１８）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号５８）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）（配列番号５９）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をアスパラギン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）（配列番号１９）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号６０）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）（配列番号６１）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）（配列番号２０）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号６２）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）（配列番号６３）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をイソロイシン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）（配列番号２１）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号６４）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）（配列番号６５）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をセリン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）（配列番号２２）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号６６）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）（配列番号６７）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をプロリン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）（配列番号６８）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号６９）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）（配列番号７０）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をメチオニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）（配列番号７１）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号７２）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）（配列番号７３）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をフェニルアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）（配列番号７４）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号７５）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）（配列番号７６）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をチロシン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）（配列番号７７）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号７８）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）（配列番号７９）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をグルタミン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）（配列番号８０）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号８１）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）（配列番号８２）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をグルタミン酸残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）（配列番号８３）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号８４）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）（配列番号８５）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をヒスチジン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）（配列番号８６）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号８７）を用いた。
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）（配列番号８８）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１９８番目のグリシン残基をリジン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）（配列番号８９）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号９０）を用いた。
【0043】
＜２＞比較例１＜２＞に記載と同様な方法で、前記＜１＞で作製した発現ベクターにより、変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を発現可能な形質転換体を取得した。発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｌ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｃ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｔ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｖ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｎ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ａ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｉ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｓ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｐ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｍ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｆ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｙ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｑ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｅ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｈ）、発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｇ１９８Ｋ）を取得した。取得した形質転換体を用いて、比較例１＜３＞から＜５＞に記載と同様な方法で変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質溶液を得た。
【0044】
作製例６ ＣＡＴのアミノ酸配列の１５２番目のセリン残基変異型の作製
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１５２番目のセリン残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１５２番目のセリン残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１５２番目のセリン残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を設計し、当該タンパク質を遺伝子組み換え技術を用いて作製した。
＜１＞野生型ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号１）の１５２番目のセリン残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を大腸菌で発現可能なベクターの作製は、比較例１＜１＞に記載と同様の方法で作製した。
【0045】
発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｓ１５２Ａ）は組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｓ１５２Ａ）（配列番号９１）を発現可能なベクターであり、組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴ（Ｓ１５２Ａ）は、ＣＡＴ（配列番号１）のアミノ酸配列の１５２番目のセリン残基をアラニン残基に置換した変異型ＣＡＴであるＣＡＴ（Ｓ１５２Ａ）（配列番号９２）を含む。発現ベクターの作製はＣＡＴ（Ｓ１５２Ａ）をコードするポリヌクレオチドの配列（配列番号９３）を用いた。
【0046】
＜２＞比較例１＜２＞に記載と同様な方法で、前記＜１＞で作製した発現ベクターにより、変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を発現可能な形質転換体を取得した。発現ベクターｐＥＴ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｓ１５２Ａ）の形質転換体としてＥＣ＿６Ｈ－ＣＡＴ（Ｓ１５２Ａ）を取得した。取得した形質転換体を用いて、比較例１＜３＞から＜５＞に記載と同様な方法で変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質溶液を得た。
実験例１ 組換えタンパク質の熱安定性評価
作製した組換えタンパク質のうち、比較例１の野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質、および作製例１，２，４および６の変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質のうち置換後のアミノ酸残基がアラニン残基である変異型の熱安定性評価は、組換えタンパク質のニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィー溶出液を使用してＴｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法により行った。Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ ＡｓｓａｙはリアルタイムＰＣＲ装置ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を使用し、反応液の組成は、作製例１、２、４および６、比較例１で作製した組換えタンパク質溶液を終濃度１５％（ｖ／ｖ）（タンパク質溶液の２８０ｎｍの紫外線吸光度がおおよそ０．５～２）、２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅとし、昇温温度４０℃から９０℃、昇温速度０．０５℃／ｓで反応させた。得られた蛍光強度のグラフから、ピークの中点にあたる温度を変性中点温度（Ｔｍ）とした。測定は２回以上行い、平均値を記載した。
実験例１ 組換えタンパク質の熱安定性評価
作製した組換えタンパク質のうち、比較例１の野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質、および作製例１，２，４および６の変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質のうち置換後のアミノ酸残基がアラニン残基である変異型の熱安定性評価は、組換えタンパク質のニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィー溶出液を使用してＴｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法により行った。Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ ＡｓｓａｙはリアルタイムＰＣＲ装置ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を使用し、反応液の組成は、作製例１、２、４および６、比較例１で作製した組換えタンパク質溶液を終濃度１５％（ｖ／ｖ）（タンパク質溶液の２８０ｎｍの紫外線吸光度がおおよそ０．５～２）、２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅとし、昇温温度４０℃から９０℃、昇温速度０．０５℃／ｓで反応させた。得られた蛍光強度のグラフから、ピークの中点にあたる温度を変性中点温度（Ｔｍ）とした。測定は２回以上行い、平均値を記載した。
【0047】
表２に、比較例１で作製した野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質および作製例１，２，４および６で作製した変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質のうちアラニン残基に置換した変異型である実施例２，５，９，比較例１０の熱安定性評価の結果を示した。実施例２，５，９，比較例１０の組換えタンパク質はすべて比較例１の野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴより高い変性中点温度を示した。なお、酵素活性の評価は、後述の実験例３に記載した。
【0048】
【表2】
【0049】
実験例２ 組換えタンパク質の濃度を一律にした反応液での熱安定性評価
作製した組換えタンパク質を限外ろ過膜によりバッファー交換を行い、タンパク質濃度を一律にした反応液を用いてＴｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法により熱安定性評価を行った。変性中点温度は解析ソフトを用いて算出した。
作製した組換えタンパク質を限外ろ過膜によりバッファー交換を行い、タンパク質濃度を一律にした反応液を用いてＴｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法により熱安定性評価を行った。変性中点温度は解析ソフトを用いて算出した。
【0050】
作製例１から６および比較例１で作製した組換えタンパク質溶液は限外ろ過膜を用いて精製タンパク質緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール）にバッファー交換を行い、紫外線吸光光度法によりタンパク質濃度を測定し、濃度が１または２ｍｇ／ｍＬになるよう調整した。濃度の補正はＡ２８０＝１を０．６３４ｍｇ／ｍＬとした。補正値の算出は、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／により野生型ＣＡＴを含む６Ｈ－ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号２４）から決定した。Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法の組成液は、０．３ｍｇ／ｍＬ 組換えタンパク質、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍＭ ＤＴＴ、３％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５％（ｖ／ｖ）ＳＹＰＲＯ ｏｒａｎｇｅとし、昇温温度４０℃から９８℃、昇温速度０．０５℃／ｓで反応させた。得られた蛍光強度のグラフを解析ソフトＰｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）で解析し、ピークの中点にあたる温度である変性中点温度（Ｔｍ）を決定した。測定は２回以上行い、平均値を記載した。
表２に、実施例１から２１、比較例１から１０の組換えタンパク質の濃度を０．３ ｍｇ／ｍＬに調製して測定した熱安定性評価の結果を示した。比較例２から９および実施例１から２１はすべて比較例１の野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴより高い変性中点温度を示した。一方、比較例１０の組換えタンパク質６Ｈ―ＣＡＴ（Ｓ１５２Ａ）は、比較例１より低い変性中点温度を示し、熱安定性の向上は確認できなかった。実験例１と実験例２では、変性中点温度に若干の差があるが、実験例２の方がタンパク質濃度を一律にした精度の高い測定法であるため、熱安定性の判断は実験例２の測定値に従った。なお、酵素活性の評価は、後述の実験例３に記載した。
実験例３ 組換えタンパク質の酵素活性の評価
クロラムフェニコール無毒化酵素活性の評価は、野生型または変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を生産可能な組換え細菌（形質転換体）の、クロラムフェニコールを含む寒天培地上での生育の有無により行った。比較例１＜２＞または作製例１＜２＞で得られた組換え大腸菌を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地に塗抹し、３７℃で一昼夜培養してコロニーを形成させた。次に、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールと３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地に、カナマイシンを添加した培地で得られたコロニーを塗抹し、３７℃で一昼夜培養してコロニー形成の有無を観察した。なお、比較例１１として、ＣＡＴ遺伝子を導入していないｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）の形質転換体ＥＣ＿ｖｅｃｔｏｒを比較例１＜２＞に記載と同様な方法で作製し、同様に評価した。
表２に示す通り、比較例１から１０および実施例１から２１で作製した組換えタンパク質を発現可能な組換え細菌のうち、比較例１，１０，実施例１から２１がクロラムフェニコールを含む寒天培地上でコロニーを形成した。一方、ＣＡＴ遺伝子を持たない形質転換体ＥＣ＿ｖｅｃｔｏｒを用いた比較例１１はコロニーを形成しなかった。以上の結果より、実施例１から２１の変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質は、比較例１の野生型ＣＡＴタンパク質を含む組換えタンパク質と同様にクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を維持しており、かつ、実験例２の結果から、比較例１の野生型ＣＡＴタンパク質を含む組換えタンパク質より高い熱安定性を示すことが示唆される。一方、比較例２から１０の変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質は、クロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を失っているか、または、実験例２の結果から、比較例１の野生型ＣＡＴタンパク質を含む組換えタンパク質より低い熱安定性であることが示唆された。
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／により野生型ＣＡＴを含む６Ｈ－ＣＡＴのアミノ酸配列（配列番号２４）から決定した。Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法の組成液は、０．３ｍｇ／ｍＬ 組換えタンパク質、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２ｍＭ ＤＴＴ、３％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５％（ｖ／ｖ）ＳＹＰＲＯ ｏｒａｎｇｅとし、昇温温度４０℃から９８℃、昇温速度０．０５℃／ｓで反応させた。得られた蛍光強度のグラフを解析ソフトＰｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）で解析し、ピークの中点にあたる温度である変性中点温度（Ｔｍ）を決定した。測定は２回以上行い、平均値を記載した。
表２に、実施例１から２１、比較例１から１０の組換えタンパク質の濃度を０．３ ｍｇ／ｍＬに調製して測定した熱安定性評価の結果を示した。比較例２から９および実施例１から２１はすべて比較例１の野生型ＣＡＴを含む組換えタンパク質６Ｈ－ＣＡＴより高い変性中点温度を示した。一方、比較例１０の組換えタンパク質６Ｈ―ＣＡＴ（Ｓ１５２Ａ）は、比較例１より低い変性中点温度を示し、熱安定性の向上は確認できなかった。実験例１と実験例２では、変性中点温度に若干の差があるが、実験例２の方がタンパク質濃度を一律にした精度の高い測定法であるため、熱安定性の判断は実験例２の測定値に従った。なお、酵素活性の評価は、後述の実験例３に記載した。
実験例３ 組換えタンパク質の酵素活性の評価
クロラムフェニコール無毒化酵素活性の評価は、野生型または変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質を生産可能な組換え細菌（形質転換体）の、クロラムフェニコールを含む寒天培地上での生育の有無により行った。比較例１＜２＞または作製例１＜２＞で得られた組換え大腸菌を３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地に塗抹し、３７℃で一昼夜培養してコロニーを形成させた。次に、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールと３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地に、カナマイシンを添加した培地で得られたコロニーを塗抹し、３７℃で一昼夜培養してコロニー形成の有無を観察した。なお、比較例１１として、ＣＡＴ遺伝子を導入していないｐＥＴ２８ａ（＋）（メルク製）の形質転換体ＥＣ＿ｖｅｃｔｏｒを比較例１＜２＞に記載と同様な方法で作製し、同様に評価した。
表２に示す通り、比較例１から１０および実施例１から２１で作製した組換えタンパク質を発現可能な組換え細菌のうち、比較例１，１０，実施例１から２１がクロラムフェニコールを含む寒天培地上でコロニーを形成した。一方、ＣＡＴ遺伝子を持たない形質転換体ＥＣ＿ｖｅｃｔｏｒを用いた比較例１１はコロニーを形成しなかった。以上の結果より、実施例１から２１の変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質は、比較例１の野生型ＣＡＴタンパク質を含む組換えタンパク質と同様にクロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を維持しており、かつ、実験例２の結果から、比較例１の野生型ＣＡＴタンパク質を含む組換えタンパク質より高い熱安定性を示すことが示唆される。一方、比較例２から１０の変異型ＣＡＴを含む組換えタンパク質は、クロラムフェニコールを無毒化する酵素活性を失っているか、または、実験例２の結果から、比較例１の野生型ＣＡＴタンパク質を含む組換えタンパク質より低い熱安定性であることが示唆された。
【配列表】