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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023102327
(43)【公開日】2023-07-25
(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルスワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/29 20060101AFI20230718BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20230718BHJP
C07K 14/02 20060101ALI20230718BHJP
C12N 15/51 20060101ALI20230718BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20230718BHJP
【ＦＩ】
A61K39/29 ZNA
A61P31/20
C07K14/02
C12N15/51
C12N15/10 200Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022002717
(22)【出願日】2022-01-12
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和元年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、感染症実用化研究事業「効果的な新規Ｂ型肝炎ウイルスワクチンの開発を目指した基礎的研究」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】591222245
【氏名又は名称】国立感染症研究所長
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(71)【出願人】
【識別番号】503100821
【氏名又は名称】株式会社ビークル
(74)【代理人】
【識別番号】110003557
【氏名又は名称】弁理士法人レクシード・テック
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100201732
【弁理士】
【氏名又は名称】松縄 正登
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(74)【代理人】
【識別番号】100194515
【弁理士】
【氏名又は名称】南野 研人
(72)【発明者】
【氏名】加藤 孝宣
(72)【発明者】
【氏名】明里 宏文
(72)【発明者】
【氏名】郷 保正
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA03
4C085BA89
4C085CC21
4C085DD86
4C085EE06
4C085FF12
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA02
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
4H045GA22
4H045GA26
(57)【要約】 （修正有）
【課題】エスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘導可能なＢ型肝炎ウイルスワクチンを提供する。
【解決手段】本開示のワクチンは、対象に投与することにより、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法に用いるためのＢ型肝炎ウイルスワクチンであって、Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質またはその変異体のみと、脂質膜とを含む表面抗原粒子を含む。
【選択図】図７
【解決手段】本開示のワクチンは、対象に投与することにより、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法に用いるためのＢ型肝炎ウイルスワクチンであって、Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質またはその変異体のみと、脂質膜とを含む表面抗原粒子を含む。
【選択図】図７
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象に投与することにより、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法に用いるためのＢ型肝炎ウイルスワクチンであって、
Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質またはその変異体のみと、脂質膜とを含む表面抗原粒子を含む、ワクチン。
Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質またはその変異体のみと、脂質膜とを含む表面抗原粒子を含む、ワクチン。
【請求項2】
前記Ｌタンパク質またはその変異体は、下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質である、請求項１に記載のワクチン：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域内で１３個以下であって、かつ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失または置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域内で１３個以下であって、かつ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失または置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項3】
対象への投与により、前記Ｌタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１領域および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対する抗体が産生される、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項4】
対象への投与により、前記Ｌタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１領域および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対する細胞性免疫が誘導される、請求項１から３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項5】
対象への投与により、投与後２週間までに、前記対象においてＬタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１領域および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対するに対する抗体が産生される、請求項１から４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項6】
免疫賦活化剤を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項7】
前記免疫賦活化剤は、スクワレン含有アジュバントである、請求項６に記載のワクチン。
【請求項8】
前記Ｂ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価が、少なくとも２から１０００である、請求項１から７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項9】
前記Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質を含むＢ型肝炎ワクチンにより誘導される中和抗体に対するエスケープ変異体である、請求項１から８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項10】
前記Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域のＧ１４５Ｒ変異体、Ｇ１４５Ａ変異体、および／またはＩ１２６Ｓ変異体である、請求項１から９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項11】
前記対象は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に感染している対象、および／または、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質を含むワクチンを投与された対象である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
現在、Ｂ型肝炎ワクチン（ＨＢＶ）の有効成分（免疫原）は世界的に酵母で産生されたＳ抗原が主に利用されている。例外的に、ＨＢＶの免疫原として、ＣＨＯ細胞を用いて製造したＭタンパク質を含む抗原（例えば、Genhevac B）が利用されているものもある。また、前記ＨＢＶワクチンの免疫原として、同じくＣＨＯ細胞を用いて製造したＳタンパク質とＭタンパク質とに加えて、Ｌタンパク質も含むと謳われているワクチン（Sci-B-Vac（登録商標））もある。日本では、ＨＢＶワクチンとして、酵母由来のＳ抗原を用いた２種類のＨＢＶワクチン（ヘプタバックス（登録商標）（遺伝子型Ａ株）およびビームゲン（登録商標）（遺伝子型Ｃ株））が承認され、使用されている。これらのワクチンは、ＨＢＶに対する中和抗体の誘導に関して同程度の誘導能を有すると考えられている。しかしながら、非特許文献１に記載のように、Ｓ抗原を有効成分とするＨＢＶワクチンから誘導された中和抗体では、感染阻止が難しいＨＢＶの変異株（エスケープ変異体）が発生して問題となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】William F. Carman et.al., “Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus”, The Lancet, 1990, vol.336, pages 325-329
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
そこで、本開示は、エスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘導可能なＢ型肝炎ウイルスワクチンの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
前記目的を達成するために、本開示のワクチンは、対象に投与することにより、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法に用いるためのＢ型肝炎ウイルスワクチンであって、
Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質またはその変異体のみと、脂質膜とを含む表面抗原粒子を含む。
Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質またはその変異体のみと、脂質膜とを含む表面抗原粒子を含む。
【発明の効果】
【0006】
本開示によれば、エスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘導できる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【発明を実施するための形態】
【0008】
＜定義＞
本明細書において、「タンパク質」は、未修飾アミノ酸（天然のアミノ酸）、修飾アミノ酸、および／または人工アミノ酸から構成されるペプチドのポリマーを意味する。前記ポリマーの形状は、例えば、直鎖、分岐、および環状等があげられる。前記タンパク質は、ペプチドまたはポリペプチドということもできる。
本明細書において、「タンパク質」は、未修飾アミノ酸（天然のアミノ酸）、修飾アミノ酸、および／または人工アミノ酸から構成されるペプチドのポリマーを意味する。前記ポリマーの形状は、例えば、直鎖、分岐、および環状等があげられる。前記タンパク質は、ペプチドまたはポリペプチドということもできる。
【0009】
本明細書において、「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、および／または、改変ヌクレオチドのポリマーを意味する。本明細書において、「核酸」が特定のタンパク質と組合わせて用いられる場合、前記「核酸」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドのポリマーを意味する。前記核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等があげられる。前記核酸は、例えば、一本鎖または二本鎖等であってもよい。前記核酸は、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」と互いに読み替え可能である。
【0010】
本明細書において、「宿主」は、外来の核酸を導入される細胞、および／または、個体を意味する。前記宿主が細胞の場合、前記宿主は、宿主細胞ということもできる。
【0011】
本明細書において、「ベクター」および「発現ベクター」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、宿主または宿主細胞に送達される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを意味する。前記「ベクター」および「発現ベクター」は、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。
【0012】
本明細書において、「Ｌタンパク質」とは、Ｂ型肝炎ウイルスのＬ抗原（ＨＢｓ－Ｌ抗原、Ｌ－ＨＢｓ抗原）を構成するタンパク質を意味する。本明細書において、「Ｍタンパク質」は、Ｂ型肝炎ウイルスのＭ抗原（ＨＢｓ－Ｍ抗原、Ｍ－ＨＢｓ抗原）を構成するタンパク質を意味し、本明細書において、「Ｓタンパク質」は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ抗原（ＨＢｓ－Ｓ抗原、Ｓ－ＨＢｓ抗原）を構成するタンパク質を意味する。
【0013】
前記ＨＢＶのウイルス粒子表面には、ＨＢｓ－Ｌ抗原、ＨＢｓ－Ｍ抗原、およびＨＢｓ－Ｓ抗原の３種類のタンパク質（表面抗原）が存在する（図１、図２）。前記ＨＢｓ－Ｌ抗原は、表面に提示されるタンパク質のＮ末からＰｒｅ－Ｓ１領域、Ｐｒｅ－Ｓ２領域、およびＳ領域の３つの領域から構成される。前記Ｐｒｅ－Ｓ１領域は、ＨＢＶが感染する肝細胞を認識し結合するセンサー領域であり、ＨＢＶ感染機構の最初のステップで重要な役割を持っていることが知られている。前記Ｐｒｅ－Ｓ２領域は、発癌との関与が推定されている他、ＨＢＶが感染細胞へ侵入する際に役割を果たすと推定されている。前記Ｓ領域は、ＨＢＶがウイルス粒子としての構造を保持するために重要な膜貫通ドメインを有している。前記ＨＢｓ－Ｌ抗原は、３つの領域から構成されている。前記ＨＢｓ－Ｍ抗原は、Ｐｒｅ－Ｓ１領域を有しない。前記ＨＢｓ－Ｓ抗原は、Ｐｒｅ－Ｓ１領域およびＰｒｅ－Ｓ２領域を有さず、Ｓ領域のみから構成されている。前記ＨＢｓ－Ｌ抗原を形成するＬタンパク質は、通常、４００個のアミノ酸からなっているが、欠失が多いタイプでは、例えば、３８２個のアミノ酸から構成されるものもある。前記Ｌタンパク質が４００個のアミノ酸からなる場合（配列番号１）、前記Ｐｒｅ－Ｓ１領域は、Ｎ末側からの１番から１１９番目まで、前記Ｐｒｅ－Ｓ２領域は、１２０番から１７４番目まで、前記Ｓ領域は、１７５番から４００番目までのアミノ酸で構成されている。種々の変異体において、各領域の重要なアミノ酸配列は良く保存されており、４００個のアミノ酸から構成されるＬタンパク質のアミノ酸配列とアライメントすることにより、当業者であれば、欠失が多い変異体においても、３つの領域を容易に区別できる。前記配列番号１のアミノ酸配列は、NCBIアクセッション番号：X01587で登録されたポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列である。
【0014】
Ｌタンパク質（４００アミノ酸）（配列番号１）
[MGGWSSKPRQGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSHNPDWDFNPNKDHWPEANQVGAGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGVLTTVPVAPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQA][MQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSISSRTGDPAPN][MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEGASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYI]
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【0015】
本明細書において、「エスケープ変異体」は、Ｓタンパク質を含むＨＢＶワクチンで誘導される中和抗体において感染阻止能が低減しているＨＢＶの変異株を意味する。前記エスケープ変異体は、例えば、下記参考文献１のエスケープ変異体を参照できる。具体例として、前記エスケープ変異体は、例えば、前記Ｓ領域の１２９番目のグルタミン（Ｑ）がヒスチジン（Ｈ）に置換された変異体（Ｑ１２９Ｈ）、１３０番目のグリシン（Ｇ）がアスパラギン（Ｎ）に置換された変異体（Ｇ１３０Ｎ）、１４３番目のセリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に置換された変異体（Ｓ１４３Ｌ）、１４４番目のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に置換された変異体（Ｄ１４４Ａ）、１４５番目のグリシン（Ｇ）がアルギニン（Ｒ）に置換された変異体（Ｇ１４５Ｒ）変異体、１４５番目のグリシン（Ｇ）がアラニン（Ａ）に置換された変異体（Ｇ１４５Ａ）変異体、および／または１２６番目のイソロイシン（Ｉ）がセリン（Ｓ）に置換された変異体（Ｉ１２６Ｓ）等があげられる。前記エスケープ変異体において、前記Ｓ領域のアミノ酸の変異箇所の数は、１つでもよいし、複数でもよい。本開示のワクチンは、特に、エスケープ変異体の主な変異体を占める、Ｇ１４５Ｒ変異体、Ｇ１４５Ａ変異体、および／またはＩ１２６Ｓ変異体に対する中和抗体を好適に誘導できる。
参考文献１：Qiang Ma and Yefu Wang, “Comprehensive Analysis of the Prevalence of Hepatitis B Virus Escape Mutations in the Major Hydrophilic Region of Surface Antigen”, Journal of Medical Virology, 2012, vol. 84, pages 198-206
参考文献１：Qiang Ma and Yefu Wang, “Comprehensive Analysis of the Prevalence of Hepatitis B Virus Escape Mutations in the Major Hydrophilic Region of Surface Antigen”, Journal of Medical Virology, 2012, vol. 84, pages 198-206
【0016】
本明細書において、「液性免疫応答の誘発」は、Ｂ細胞が特異的抗原を認識し、前記抗原に対する抗体を作ることで、生体内に侵入した抗原を排除する免疫反応を誘導（例えば、惹起増強、または増大）することを意味する。前記液性免疫応答の誘発は、抗体の誘導、抗体産生の誘導、中和抗体の誘導、中和抗体産生の誘導、抗体産生の増強、中和抗体の増強、中和抗体産生の増強等ということもできる。
【0017】
本明細書において、「脂質膜」は、脂質から構成される膜状体を意味する。前記脂質膜は、平面状の膜を形成してもよいし、ベシクル（リポソーム）またはミセル等の立体状の膜を形成してもよい。前記脂質膜は、前記ＨＢＶの表面抗原タンパク質と組合わせることにより、前記表面抗原の自己組織化能により、表面抗原粒子（ウイルス様粒子）を形成できる。
【0018】
本明細書において、「アジュバント」または「免疫賦活化剤」は、製剤または組成物において、特定の免疫原（抗原）と組み合わせて使用されるとき、得られる免疫応答を増強、改変、または修飾する化合物を意味する。前記免疫応答の増強、改変、または修飾は、例えば、抗体応答および細胞性免疫応答の少なくとも一方の特異性の強化、増加、または増強を意味する。前記免疫応答の増強、改変、または修飾は、特定の抗原特異的免疫応答の低下、低減、または抑制を意味してもよい。
【0019】
本明細書において、「処置」は、治療的処置および／または予防的処置を意味する。本明細書において、「治療」は、疾患、病態、もしくは障害の治療、治癒、防止、抑止、寛解、改善、または、疾患、病態、もしくは障害の進行の停止、抑止、低減、もしくは遅延を意味する。本明細書において、「予防」は、疾患もしくは病態の発症の可能性の低下、または疾患もしくは病態の発症の遅延を意味する。前記「治療」は、例えば、対象疾患を発病する対象（患者）に対する治療でもよいし、対象疾患のモデル動物の治療でもよい。
【0020】
本明細書において、「対象」は、動物または動物由来の細胞、組織もしくは器官を意味する。特にヒトを含む意味で用いられる。前記動物は、ヒトおよび非ヒト動物を意味する。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類動物があげられる。
【0021】
本明細書において、「単離」または「単離された」は、同定され、かつ分離された状態、および／または自然状態での成分から回収された状態を意味する。前記「単離」または「単離された」は、例えば、少なくとも１つの精製工程を経ることにより実施できる。
【0022】
以下、本開示について例をあげて説明するが、本開示は以下の例等に限定されるものではなく、任意に変更して実施できる。また、本開示における各説明は、特に言及がない限り、互いに援用可能である。なお、本明細書において、「～」という表現を用いた場合、その前後の数値または物理値を含む意味で用いる。また、本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」という表現には、「Ａのみ」、「Ｂのみ」、「ＡおよびＢの双方」が含まれる。
【0023】
＜Ｂ型肝炎ウイルスワクチン＞
ある態様において、本開示は、エスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘導可能なＢ型肝炎ウイルスワクチンを提供する。本開示のワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法に用いるためのＢ型肝炎ウイルスワクチンであって、Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質またはその変異体のみと、脂質膜とを含む表面抗原粒子を含む。本開示のワクチンによれば、Ｇ１４５Ｒ変異体等のエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発できる。
ある態様において、本開示は、エスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘導可能なＢ型肝炎ウイルスワクチンを提供する。本開示のワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法に用いるためのＢ型肝炎ウイルスワクチンであって、Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質またはその変異体のみと、脂質膜とを含む表面抗原粒子を含む。本開示のワクチンによれば、Ｇ１４５Ｒ変異体等のエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発できる。
【0024】
本発明者らは、ＨＢＶのレセプターであるＮＴＣＰ（Na+-taurocholate cotransporting polypeptide）に結合するＨＢＶの領域であるＰｒｅ－Ｓ１領域を含む表面抗原をワクチン成分とすることにより、エスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発できるのではないかとの着想を得た。そして、本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｌタンパク質（Ｌ－ＨＢｓ抗原）をワクチン成分として使用することにより、霊長類モデル（アカゲザル）においてエスケープ変異体の感染を中和できることを見出し、本開示を確立するに至った。このため、本開示によれば、エスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発できる。
【0025】
本開示のワクチンは、免疫原のＨＢＶ表面抗原タンパク質として、Ｌタンパク質またはその変異体のみを含む。このため、本開示のワクチンは、前記Ｌタンパク質を含んでもよいし、その変異体を含んでもよいし、両者を含んでもよい。また、本開示のワクチンは、前記Ｌタンパク質のみを含んでもよいし、その変異体のみを含んでもよいし、両者のみを含んでもよい。前記Ｌタンパク質およびその変異体は、その発現過程および発現後に、前記Ｌタンパク質またはその変異体を発現させた宿主における代謝活性により、その一部が代謝（分解）される。このため、本開示のＬタンパク質またはその変異体は、前記Ｌタンパク質またはその変異体の代謝物を含んでもよい。前記代謝物の含有量は、例えば、前記ＨＢＶ表面抗原タンパク質全量に対して、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下である。前記Ｌタンパク質またはその変異体は、単離されたＬタンパク質またはその変異体でもよいし、脂質膜とともに表面抗原粒子（ウイルス様粒子）を形成したＬタンパク質またはその変異体でもよい。前記脂質膜は、例えば、前記Ｌタンパク質またはその変異体の発現に用いる形質転換体の細胞膜に由来する。本開示のワクチンは、前記ＨＢＶ表面抗原タンパク質として、実質的にＭタンパク質およびＳタンパク質を含まない。前記「実質的にＭタンパク質およびＳタンパク質を含まない」は、前記Ｍタンパク質およびＳタンパク質の含有量が、検出限界以下であることを意味する。
【0026】
前記Ｌタンパク質またはその変異体は、例えば、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のタンパク質があげられる。
【0027】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域において１３個以下であり、かつ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失または置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域において１３個以下であり、かつ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失または置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
【0028】
前記（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のタンパク質は、Ｌ抗原として機能するタンパク質である。「Ｌ抗原として機能するタンパク質」とは、動物にＬ抗原を接種したときに抗体を産生させ、当該抗体が、Ｂ型肝炎ウイルス、特に、エスケープ変異体に対して中和活性を有するようにワクチンとして機能するタンパク質であることを意味する。
【0029】
前記配列番号２のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記配列番号２のアミノ酸配列は、Ｌタンパク質のアミノ酸配列の一例である。
【0030】
Ｌタンパク質（配列番号２）
KVRQGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDQWPEANQVGAGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTTVPAAPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISGDPAPNMENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYI
KVRQGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDQWPEANQVGAGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTTVPAAPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISGDPAPNMENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLWVYI
【0031】
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）が、Ｌ抗原として機能するタンパク質である範囲であればよい。前記（ｃ）の「同一性」は、前記（ａ）のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記「同一性」の算出は、例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出できる（以下、同様）。
【0032】
前記（ｄ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ）が、Ｌ抗原として機能するタンパク質である範囲であればよい。前記（ｄ）の「１もしくは数個」は、前記（ａ）のアミノ酸配列において、例えば、１～７７個、１～５８個、１～３８個、１～１９個、１～１５個、１～１３個、１～１１個、１～１０個、１～６個、１～５個、１～３個、１または２個である。本開示において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。
【0033】
前記（ｃ）および（ｄ）のタンパク質は、例えば、下記（ｉ）～（ｉｖ）のタンパク質があげられる。下記（ｉ）～（ｉｖ）のタンパク質は、Ｌ抗原として機能するタンパク質である。前記（ｉ）のタンパク質は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と言うこともできる。
【0034】
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列の１番目から５番目のＫＶＲＱＧ（配列番号３）に代わってＭＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧ（配列番号４）が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５６番と１５７番との間へＳＩＦＳＲＴ（配列番号５）の６個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列の１６３番目から３８５番目のＳ領域において１３個以下のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域内で１３個以下であり、かつ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失または置換された配列（１５６番と１５７番との間への６個のアミノ酸の挿入を除く）
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５６番と１５７番との間へＳＩＦＳＲＴ（配列番号５）の６個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列の１６３番目から３８５番目のＳ領域において１３個以下のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域内で１３個以下であり、かつ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失または置換された配列（１５６番と１５７番との間への６個のアミノ酸の挿入を除く）
【0035】
本開示のワクチンは、さらに、免疫賦活化剤を含んでもよい。この場合、本開示のワクチンは、ワクチン組成物ということもできる。前記免疫賦活化剤は、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）、リポ多糖（Lipopolysaccharide：ＬＰＳ）、アルミニウム塩、スクワランもしくはスクワレン等のスクワレン含有アジュバント、完全もしくは不完全フロイントアジュバント、またはこれらの混合物があげられる。前記ＬＰＳとしては、例えば、MPL（Monophosphoryl lipid A）があげられる。前記スクワレン含有アジュバントとしては、例えば、スクワレンの水中油滴型エマルションであるAddaVax（商標）、ＭＦ－５９（登録商標）があげられる。本開示のワクチンは、前記Ｌタンパク質と組合わせることにより、前記Ｌタンパク質に対して、より早期に、より高い抗体産生を誘導できることから、スクワレン含有アジュバントを含むことが好ましい。
【0036】
本開示において、前記Ｌタンパク質およびその変異体の作製方法（以下、「作製方法」という）は、特に制限されず、例えば、酵母等の宿主を用いて遺伝子工学的手法による合成してもよいし、無細胞系により合成してもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。
【0037】
前記Ｌタンパク質を遺伝子工学的手法により合成する場合は、まず、前記Ｌタンパク質をコードする核酸を設計して合成する。前記設計および合成は、例えば、前記Ｌタンパク質をコードする核酸を含むベクター等を鋳型とし、所望の核酸領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、得られた核酸を適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクター（発現ベクター）を得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得ることができる（Sambrook J.et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(4th edition)(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)）。
【0038】
前記変異体タンパク質は、例えば、前記Ｌタンパク質をコードする遺伝子（核酸）に変異を導入することにより実施できる。前記変異導入は、例えば、変異を持った遺伝子情報を元に発現ベクターを構築してもよいし、前記Ｌタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターに対して、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット等を用いて行うことができる。前記変異導入用キットは、例えば、市販のキットが使用でき、具体例として、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailor TMSite-Directed Mutagenesis SysTEM（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Supe Express KM等：タカラバイオ社製）等があげられる。
【0039】
形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば、特に制限されず、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞、哺乳類細胞等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Escherichia
coli）等のエッシェリヒア属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas
putida）等のシュードモナス属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。
【0040】
前記発現ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記導入方法としてヒートショック法により宿主の形質転換を行う場合、前記発現ベクターは、例えば、バイナリーベクター等があげられる。前記発現ベクターは、例えば、pETDuet-1、pQE-80L、pUCP26Km等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記発現ベクターは、例えば、pETDuet-1ベクター（ノバジェン社）、pQE-80L（QIAGEN社）、pBR322、pB325、pAT153、pUC8等があげられる。前記酵母に形質転換を行なう場合、前記発現ベクターは、例えば、pYepSec1、pMFa、pYES2等があげられる。前記昆虫細胞に形質転換を行なう場合、前記発現ベクターは、例えば、pAc、pVL等があげられる。前記哺乳類細胞に形質転換を行なう場合、前記発現ベクターは、例えば、pCDM8、pMT2PC等があげられる。
【0041】
前記発現ベクターは、例えば、前記Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現および前記Ｌタンパク質のポリヌクレオチドがコードする前記本開示のＬタンパク質の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は、特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現およびこれがコードするＬタンパク質の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記発現ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記発現ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【0042】
前記発現ベクターの宿主への導入方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法、プロトプラスト法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が、微生物の場合、例えば、中でも、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓ．ｐｕｔｉｄａ等を介する方法が好ましい。前記本開示のＬタンパク質のポリヌクレオチドは、例えば、前記本開示の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
【0043】
そして、本開示の作製方法は、例えば、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるＬタンパク質を採取する。前記培養物は、培養上清でもよいし、培養細胞もしくは培養菌体等の形質転換体、またはその処理物もしくは破砕物のいずれでもよい。
【0044】
前記培養後、前記Ｌタンパク質およびその変異体が宿主内に生産される場合、本開示の作製方法は、例えば、前記宿主を破砕することによりＬタンパク質を抽出する。また、前記Ｌタンパク質およびその変異体が前記宿主外に生産または分泌される場合、本開示の作製方法は、例えば、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により宿主を除去する。その後、本開示の作製方法は、例えば、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、具体的には、限外ろ過膜による濃縮；硫酸アンモニウム沈殿等の塩析；ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種カラムを用いたクロマトグラフィー；等を単独で、または適宜組み合わせて用いることにより、前記Ｌタンパク質およびその変異体を単離または精製することができる。本開示の作製方法では、例えば、前記形質転換体を用いることにより、前記Ｌタンパク質およびその変異体は、前記形質転換体の脂質膜上で自己組織化し、表面抗原粒子を形成する。このため、本開示の作製方法は、前記形質転換体を用いることで、前記Ｌタンパク質またはその変異体のみと、前記脂質膜とを含む表面抗原粒子を簡便に調製できる。
【0045】
本開示の作製方法では、無細胞合成系を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳により、前記Ｌタンパク質およびその変異体を得てもよい。この場合は、本開示の作製方法は、前記Ｌタンパク質をコードするＲＮＡを鋳型にする方法で実施してもよいし、前記Ｌタンパク質をコードするＤＮＡを鋳型にする方法（転写および翻訳）により実施してもよい。前記無細胞合成系は、市販のシステムが使用でき、具体例として、Expressway（商標）システム（インビトロジェン社）等を用いることができる。
【0046】
本開示において、前記Ｌタンパク質は、前述のように、自己組織化能を有し、脂質膜上に集合して粒子を形成することにより抗原提示できる。すなわち、前記Ｓクンパク質、前記Ｍタンパク質、および前記Ｌタンパク質は、いずれも脂質親和性の高いＳ領域を持っており、いずれのタンパク質も、生物細胞（例えば、宿主）を利用して製造すると脂質膜に突き刺さって存在する状態となる。これにより、前記各タンパク質は、安定な抗原粒子構造を取り、この粒子構造のため高い免疫原性を持つことになる。このように抗原提示させる方法は、例えば、特許第４０８５２３１号公報（米国特許第７５９７９０５号明細書）または特許第４９３６２７２号公報（米国特許出願公開２０１０／０２９２４４５号明細書）に記載されている方法があげられる。
【0047】
本開示において、前記Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質は、前記表面抗原粒子と混合してもよいし、前記Ｌタンパク質を含む表面抗原粒子の表面または内部に含めてもよい。前記コアタンパク質の作製方法は、例えば、既に報告されている非特許文献（例えば、Rolland et al.J Chromatogr B Biomed Sci Appl.2001 25; 753(1)：51-65）等の方法を利用できる。
【0048】
本開示のワクチンは、例えば、対象への投与によりＬタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対する抗体が産生される。また、本開示のワクチンは、例えば、対象への投与によりＬタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対する細胞性免疫が誘導される。さらに、本開示のワクチンがコアタンパク質を含む場合、本開示のワクチンは、例えば、対象への投与によりコアタンパク質に対する抗体が誘導され、および／または、コアタンパク質に対する細胞性免疫が誘導される。前記細胞性免疫は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージ等の食細胞に作用し、生体内に侵入した前記異物を攻撃し、前記異物を排除する免疫応答である。
【0049】
前記Ｌタンパク質、または前記Ｌタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対する抗体の産生の開始時期は、例えば、対象への投与後、５週間後、４週間後、３週間後、２週間後、または１週間後までである。前記抗体の産生は、後述の実施例１に準じて、前記Ｌタンパク質、Ｐｒｅ－Ｓ１ペプチド、またはＰｒｅ－Ｓ２ペプチドを用いて測定できる。前記対象への投与は、前記対象への初回または２回目以降の投与であり、好ましくは、対象への初回投与である。
【0050】
前記抗体誘導は、例えば、前記Ｌタンパク質およびその変異体を検出対象とし、前記対象から単離した血清、血漿等の生体試料を用いてＥＬＩＳＡ等により行うことができる。本開示のワクチンは、例えば、前記ワクチンが投与された対象におけるＢ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価が、少なくとも２から１０００、または２から１０００である。前記中和抗体価は、後述の実施例１（５）に準じて、ＩＣ５０値として算出できる。また、本開示のワクチンは、例えば、前記ワクチンが投与された対象におけるＢ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価として、Ｂ型肝炎ウイルスのヒト肝細胞への結合に対する阻害効果が、少なくとも５０～１００％である。前記中和抗体価は、例えば、前記対象由来の血清を１００倍、２００倍、５００倍、または１０００倍に希釈した際の中和抗体価である。前記阻害効果は、後述の実施例１（５）に準じて測定できる。
【0051】
本開示のワクチンは、前述のように、エスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発できる。このため、本開示のワクチンは、エスケープ変異体に対する中和抗体の誘導促進作用を示すことが好ましい。前記中和抗体の誘導促進作用は、後述の実施例１（５）に準じて、ＨＢＶレポーターウイルスのヒト肝臓細胞培養株（例えば、ＮＴＣＰ発現ＨｅｐＧ２細胞株）への感染の抑制能（ＩＣ５０値）を指標に評価できる（エスケープ変異体に対する中和活性アッセイ）。前記評価では、例えば、前記被検物を３回投与した群から採取した血清または血漿のエスケープ変異体に対する中和抗体価（ＩＣ５０値）が、前記Ｓタンパク質を含むワクチンを３回投与した群から採取した血清または血漿のエスケープ変異体に対する中和抗体価と比較して、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、５倍以上、１０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、または１００倍以上、１２５倍以上、または２５０倍以上である場合、前記被検物は、エスケープ変異体に対する中和抗体の誘導促進作用があると評価できる。本開示のワクチンは、例えば、前記ワクチンが投与された対象由来の血清または血漿におけるエスケープ変異体（例えば、Ｇ１４５Ｒ変異体）の中和抗体価は、前記Ｓタンパク質を含むワクチンが投与された対象由来の血清または血漿におけるエスケープ変異体の中和抗体価と比較して、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、５倍以上、１０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、または１００倍以上、１２５倍以上、または２５０倍以上であり、その上限が、１００００倍以下または５０００倍以下である。前記血清または血漿の取得時期は、例えば、３回目の接種後、２週間、４週間、６週間、２週間以内、４週間、または６週間以内である。
【0052】
本開示のワクチンの投与対象は、特に制限されず、例えば、治療的処置または予防的処置が必要な対象があげられる。前記対象は、例えば、前記ＨＢＶワクチンを未接種の対象、前記ＨＢＶのＳタンパク質を含むワクチンを接種（投与）された対象、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に感染している対象等があげられる。本開示のワクチンは、このような対象に投与することにより、例えば、前記対象を、前記エスケープ変異体によるＨＢＶ感染症からの予防またはＨＢＶ感染症からの治療ができる。前記エスケープ変異体は、例えば、前記対象に感染しているＨＢＶについて、ゲノムＤＮＡ（例えば、ｃｃｃＤＮＡ）の塩基配列を解読し、前記配列番号１のアミノ酸配列と比較し、変異したアミノ酸を特定することにより同定できる。
【0053】
本開示のワクチンの投与経路は、特に制限されず、公知のワクチンの投与経路が利用でき、例えば、筋肉投与、腹腔内投与、皮内投与または皮下投与等の注射；鼻腔、口腔または肺からの吸入；経口投与；等により生体に導入することができる。さらに、本開示のワクチンには、既存の抗ウイルス薬（例えば、インターフェロン）または既存のワクチンを併用してもよい。本開示のワクチンと抗ウイルス薬と併用の態様は、特に制限されず、本開示のワクチンと、既存のワクチンまたは抗ウイルス薬とを同時に投与してもよいしし、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与してもよい。
【0054】
本開示のワクチンは、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体；緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等；を含んでもよい。この場合、本開示のワクチンは、ワクチン組成物として使用できる。
【0055】
本開示のワクチンの剤型は、特に制限されず、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、噴霧剤、外用剤、坐剤等の非経口投与剤等の投与形態に応じて適宜設定できる。本開示のワクチンは、好ましくは、皮内、皮下、筋肉内、腹腔等への局部注射あるいは経鼻噴霧等に用いられる剤型があげられる。
【0056】
本開示のワクチンまたはワクチン組成物の投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、エスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発できる有効用量を含んでいればよい。本開示のワクチンまたはワクチン組成物の投与量は、例えば、ＨＢｓ－Ｌ抗原の一日投与量が、皮下注射の場合、約５～４００μｇ、好ましくは、約１０～１００μｇである。本開示のワクチンまたはワクチン組成物の投与量は、例えば、ＨＢｓ－Ｌ抗原の一日投与量が、経鼻噴霧の場合、約５～４００μｇ、好ましくは、１０～１００μｇである。本開示のワクチンまたはワクチン組成物は、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
【0057】
＜液性免疫応答の誘発方法＞
別の態様において、本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法を提供する。本開示の方法（以下、「誘発方法」ともいう）は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法であって、対象に、前記本開示のＢ型肝炎ウイルスワクチンを投与する工程を含む。本開示の誘発方法は、前記本開示のワクチンの説明を援用できる。
別の態様において、本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法を提供する。本開示の方法（以下、「誘発方法」ともいう）は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法であって、対象に、前記本開示のＢ型肝炎ウイルスワクチンを投与する工程を含む。本開示の誘発方法は、前記本開示のワクチンの説明を援用できる。
【0058】
本開示の誘発方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与される。本開示の誘発方法は、例えば、対象においてエスケープ変異体に対する中和抗体を誘導化能であることから、本開示のＢ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法は、本開示のＢ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する中和抗体を誘導する方法ということもできる。
【0059】
＜Ｂ型肝炎ウイルス感染症の処置方法＞
別の態様において、本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置方法を提供する。本開示の方法は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置方法であって、対象に、前記本開示のＢ型肝炎ウイルスワクチンを投与する工程を含む。本開示の処置方法は、前記本開示のワクチンの説明を援用できる。
別の態様において、本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置方法を提供する。本開示の方法は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置方法であって、対象に、前記本開示のＢ型肝炎ウイルスワクチンを投与する工程を含む。本開示の処置方法は、前記本開示のワクチンの説明を援用できる。
【0060】
本開示の処置方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与される。本開示の処置方法は、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンの未投与者（未接種者）に対する処置でもよいし、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンの投与者（接種者）に対する処置でもよい。後者の場合、前記接種者は、例えば、Ｓタンパク質を含むＢ型肝炎ウイルスワクチンの接種者でもよいし、本開示のワクチンの接種者でもよい。また、本開示の処置方法は、Ｂ型肝炎ウイルスの未感染者に対する処置でもよいし、Ｂ型肝炎ウイルスの感染者に対する処置でもよい。
【0061】
＜使用＞
本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発するための、前記本開示のＢ型肝炎ウイルスワクチン、またはその使用である。また、本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置するための、前記本開示のＢ型肝炎ウイルスワクチン、またはその使用である。本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発するためのＢ型肝炎ウイルスワクチンの製造のための、前記本開示のワクチンの使用である。また、本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置するためのＢ型肝炎ウイルスワクチンの製造のための、前記本開示のワクチンの使用である。
本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発するための、前記本開示のＢ型肝炎ウイルスワクチン、またはその使用である。また、本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置するための、前記本開示のＢ型肝炎ウイルスワクチン、またはその使用である。本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発するためのＢ型肝炎ウイルスワクチンの製造のための、前記本開示のワクチンの使用である。また、本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置するためのＢ型肝炎ウイルスワクチンの製造のための、前記本開示のワクチンの使用である。
【実施例0062】
以下、実施例を用いて本開示を詳細に説明するが、本開示は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
【0063】
［実施例１］
本開示のワクチンについて、エスケープ変異体に対する中和抗体を誘導できることを確認した。
本開示のワクチンについて、エスケープ変異体に対する中和抗体を誘導できることを確認した。
【0064】
（１）Ｌ抗原の調製
Ｌ抗原として、配列番号２のアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するＬタンパク質が脂質膜上に集合して出来たウイルス様粒子を用いた。前記Ｌ抗原は、特許第４０８５２３１号（米国特許第７５９７９０５号明細書）に記載されている方法で調製した。具体的には、特許第４０８５２３１号に記載の方法により、Ｌ抗原を発現する酵母を調製した。この酵母を培養し、培養後、特許第４９３６２７２号（米国特許出願公開２０１０／０２９２４４５号明細書）に記載の方法により、ガラスビーズを利用して培養菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を７０℃にて２０分間の熱処理に供した。熱処理後に遠心工程に供し、得られた上清を回収した、その後、回収された上清を硫酸セルロファインカラムおよびゲル濾過カラムを用いて精製し、タンパク質濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮して、Ｌ抗原を得た。
Ｌ抗原として、配列番号２のアミノ酸配列からなる自己組織化能を有するＬタンパク質が脂質膜上に集合して出来たウイルス様粒子を用いた。前記Ｌ抗原は、特許第４０８５２３１号（米国特許第７５９７９０５号明細書）に記載されている方法で調製した。具体的には、特許第４０８５２３１号に記載の方法により、Ｌ抗原を発現する酵母を調製した。この酵母を培養し、培養後、特許第４９３６２７２号（米国特許出願公開２０１０／０２９２４４５号明細書）に記載の方法により、ガラスビーズを利用して培養菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を７０℃にて２０分間の熱処理に供した。熱処理後に遠心工程に供し、得られた上清を回収した、その後、回収された上清を硫酸セルロファインカラムおよびゲル濾過カラムを用いて精製し、タンパク質濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ以上となるように濃縮して、Ｌ抗原を得た。
【0065】
（２）Ｌ抗原の生化学的・物理化学的性質
製造したＬ抗原を電気泳動し銀染色すると、４５ｋＤａ付近の位置にＬ抗原のモノマーのバンドが観察され、その２倍の分子量位置にＬ抗原のダイマーのバンドが観察された。一方、Ｌ抗原をウェスタンブロットで検出すると、Ｓ抗体、Ｐｒｅ－Ｓ１抗体、およびＰｒｅ－Ｓ２抗体の何れの抗体を利用しても、４５ｋＤａ付近の位置とその約２倍の分子量の位置にバンドが見られた。前記Ｌ抗原の粒子径は、ゼータサイザー（マルバーン社）を用いて動的光散乱法によって行った。その結果、粒子径は５９．７ｎｍであり、前記Ｌ抗原が粒子を形成していることが分かった。なお、乾燥状態で測定する電子顕微鏡では、粒子径は、おおよそ２０ｎｍ程度になるが、本方式では粒子サイズは水溶液中で測定するため、粒子径より大きくなる。これらの結果は、前記Ｌ抗原が、Ｓタンパク質およびＭタンパク質を含まず、Ｌタンパク質のみからなる抗原であり、さらに粒子を形成していることが確認された。
製造したＬ抗原を電気泳動し銀染色すると、４５ｋＤａ付近の位置にＬ抗原のモノマーのバンドが観察され、その２倍の分子量位置にＬ抗原のダイマーのバンドが観察された。一方、Ｌ抗原をウェスタンブロットで検出すると、Ｓ抗体、Ｐｒｅ－Ｓ１抗体、およびＰｒｅ－Ｓ２抗体の何れの抗体を利用しても、４５ｋＤａ付近の位置とその約２倍の分子量の位置にバンドが見られた。前記Ｌ抗原の粒子径は、ゼータサイザー（マルバーン社）を用いて動的光散乱法によって行った。その結果、粒子径は５９．７ｎｍであり、前記Ｌ抗原が粒子を形成していることが分かった。なお、乾燥状態で測定する電子顕微鏡では、粒子径は、おおよそ２０ｎｍ程度になるが、本方式では粒子サイズは水溶液中で測定するため、粒子径より大きくなる。これらの結果は、前記Ｌ抗原が、Ｓタンパク質およびＭタンパク質を含まず、Ｌタンパク質のみからなる抗原であり、さらに粒子を形成していることが確認された。
【0066】
（３）Ｌ抗原投与時の抗体産生
Ｌ抗原の投与スケジュールおよび投与量を、図３に示す。前記実施例１（１）で調製したＰｒｅ－Ｓ１領域を含むＬ抗原（３．０μｇ／ｓｈｏｔ）をアジュバント（AddaVax、InvivoGen社製）５００μｌとともに、アカゲザル（３～５歳、体重：～約５ｋｇ、各群３頭）に皮下投与した。接種に用いたワクチン液は、抗原溶液を６μｇ／ｍｌにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて希釈後、得られた希釈液５００μｌと、前記アジュバント５００μｌとを混合することにより調製した。得られたワクチン液全量（１ｍｌ）を前記アカゲザルに投与した。前記投与は、初回投与を基準として、４週目および２０週目に実施した。さらに、接種前、接種日、および１回目の接種日を基準として接種後の所定日（４週後、８週後、１２週後、１６週後、２０週後、２２週後、２４週後、または２６週後）に、各アカゲザルから採血し、血漿を回収した。コントロールは、Ｓ抗原を有効成分とするワクチン（ビームゲン、１．６μｇ／ｓｈｏｔ）を用いた以外は同様に投与と採血を実施した。なお、各抗原は、モル数が約等モルとなる量とした。
Ｌ抗原の投与スケジュールおよび投与量を、図３に示す。前記実施例１（１）で調製したＰｒｅ－Ｓ１領域を含むＬ抗原（３．０μｇ／ｓｈｏｔ）をアジュバント（AddaVax、InvivoGen社製）５００μｌとともに、アカゲザル（３～５歳、体重：～約５ｋｇ、各群３頭）に皮下投与した。接種に用いたワクチン液は、抗原溶液を６μｇ／ｍｌにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて希釈後、得られた希釈液５００μｌと、前記アジュバント５００μｌとを混合することにより調製した。得られたワクチン液全量（１ｍｌ）を前記アカゲザルに投与した。前記投与は、初回投与を基準として、４週目および２０週目に実施した。さらに、接種前、接種日、および１回目の接種日を基準として接種後の所定日（４週後、８週後、１２週後、１６週後、２０週後、２２週後、２４週後、または２６週後）に、各アカゲザルから採血し、血漿を回収した。コントロールは、Ｓ抗原を有効成分とするワクチン（ビームゲン、１．６μｇ／ｓｈｏｔ）を用いた以外は同様に投与と採血を実施した。なお、各抗原は、モル数が約等モルとなる量とした。
【0067】
（４）Ｌ抗原に対する抗体価
捕捉抗原として、HBs L-proteinが１μｇ／ｍｌとなるようにTBS（50 mmol/l Tris-HCl, 150 mmol/l NaCl）で希釈した抗原液を、９６穴プレートに各ウェルに５０μｌずつ分注して、４℃で一晩インキュベーションした。前記インキュベート後、各ウェルに、ブロッキングバッファー（Block Ace, KAC, Kyoto）を各ウェルに１００μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベートしてブロッキングした。前記ブロッキング後、２００μｌの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０添加ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファーで２５０倍に希釈した血漿を各ウェルに５０μｌずつ加え、室温で１．５時間インキュベーションした。
捕捉抗原として、HBs L-proteinが１μｇ／ｍｌとなるようにTBS（50 mmol/l Tris-HCl, 150 mmol/l NaCl）で希釈した抗原液を、９６穴プレートに各ウェルに５０μｌずつ分注して、４℃で一晩インキュベーションした。前記インキュベート後、各ウェルに、ブロッキングバッファー（Block Ace, KAC, Kyoto）を各ウェルに１００μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベートしてブロッキングした。前記ブロッキング後、２００μｌの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０添加ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した後、ブロッキングバッファーで２５０倍に希釈した血漿を各ウェルに５０μｌずつ加え、室温で１．５時間インキュベーションした。
【0068】
つぎに、再度２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した後、２次抗体としてブロッキングバッファーで１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗サルＩｇＧ抗体を各ウェルに５０μｌずつ加え、３７℃で２時間インキュベーションした。その後、２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した後、３次抗体としてブロッキングバッファーで１０，０００倍に希釈した抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を各ウェルに５０μｌずつ加え、３７℃で１時間インキュベーションした。２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した後、０．１５ｍｏｌ／ｌクエン酸バッファー１０ｍｌあたりオルトフェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）を４０ｍｇ溶解し、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を４μｌ加えたものを各ウェルに１００μｌずつ加えた。室温で１０分間発色させた後、反応停止液として２ｍｏｌ／ｌ Ｈ２ＳＯ４を各ウェル５０μｌずつ加え、吸光光度計を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。また、Ｓ－ＨＢｓ抗原に対する抗体価の測定は、エンザイグノスト Anti-HBs II（シーメンスヘルスケアダイアグノスティクス株式会社製）を用いて測定した。
【0069】
図４は、両ワクチン液投与後の抗体価の推移を示すグラフである。図４において、（Ａ）は、抗Ｓ抗原に対する抗体の抗体価を示し、（Ｂ）は、抗Ｌ抗原に対する抗体の抗体価を示す。図４（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、ワクチン接種後の日数を示し、縦軸は、抗体価を示す。図４（Ａ）および（Ｂ）に示すように、実施例のＬ抗原ワクチン液投与群は、抗Ｓ抗原に対する抗体の抗体価がビームゲンワクチン液投与群より低いものの、抗Ｌ抗原に対する抗体の抗体価は、ビームゲンワクチン液投与群と比較して、格段に増強していた。
【0070】
つぎに、前記実施例１（３）で得られた血漿について、前記捕捉抗原として、HBs L-proteinに代えて、Ｐｒｅ－Ｓ１ペプチド（ビークル社製）を用いた以外は、同様にしてＰｒｅ－Ｓ１に対する抗体価を測定した。この結果を図５に示す。
【0071】
図５は、ワクチン液投与後の抗体価の推移を示すグラフである。図５において、横軸は、ワクチン接種後の日数を示し、縦軸は、抗体価を示す。図５に示すように、Ｐｒｅ－Ｓ１抗体価は、図４（Ｂ）のＬ抗原に対する抗体価と、時間推移およびシグナル強度が共に良く一致し、Ｌ抗原に対する抗体の多くがＰｒｅ－Ｓ１に対する抗体であることが分かった。以上のことから、Ｌ抗原ワクチン液投与後にはＰｒｅ－Ｓ１抗体が早期に上昇すると判断された。
【0072】
（５）ＨＢＶの感染中和活性
前記ワクチン接種後、２６週目に採血した血液由来の血漿を用いて、ＨＢＶの感染中和活性の評価を行った。具体的には、図６に示すように、ＨＢＶ感染の中和活性の評価には、Nano Luciferaseを持つＨＢＶレポーターウイルスをＮＴＣＰ発現ＨｅｐＧ２細胞（ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞：HepG2/NTCP細胞）に感染させる系を使用した（参考文献２参照）。ＨＢＶレポーターウイルスは、参考文献２と同様にして調製した。ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞の培養にはDulbecco’s Modified Essential Medium/F12-Glutamax（商標）（Thermo Fisher社製）にＨＥＰＥＳを１０ｍｍｏｌ／ｌ、加熱非働化牛胎児血清（Fetal Calf Serum：FCS）を１０％、Insulinを５μｇ／ｍｌ、Puromycinを１μｇ／ｍｌ、Penicillinが１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、Streptomycinが１００μｇ／ｍｌとなるように添加したものを培地として用いた。
参考文献２：Hironori Nishitsuji et.al., “Novel reporter system to monitor early stages of the
hepatitis B virus life cycle”, Cancer Sci., vol. 106, no. 11, pp. 1616-1624
前記ワクチン接種後、２６週目に採血した血液由来の血漿を用いて、ＨＢＶの感染中和活性の評価を行った。具体的には、図６に示すように、ＨＢＶ感染の中和活性の評価には、Nano Luciferaseを持つＨＢＶレポーターウイルスをＮＴＣＰ発現ＨｅｐＧ２細胞（ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞：HepG2/NTCP細胞）に感染させる系を使用した（参考文献２参照）。ＨＢＶレポーターウイルスは、参考文献２と同様にして調製した。ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ３０細胞の培養にはDulbecco’s Modified Essential Medium/F12-Glutamax（商標）（Thermo Fisher社製）にＨＥＰＥＳを１０ｍｍｏｌ／ｌ、加熱非働化牛胎児血清（Fetal Calf Serum：FCS）を１０％、Insulinを５μｇ／ｍｌ、Puromycinを１μｇ／ｍｌ、Penicillinが１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、Streptomycinが１００μｇ／ｍｌとなるように添加したものを培地として用いた。
参考文献２：Hironori Nishitsuji et.al., “Novel reporter system to monitor early stages of the
hepatitis B virus life cycle”, Cancer Sci., vol. 106, no. 11, pp. 1616-1624
【0073】
まず、ＨＢＶレポーターウイルスの作製用プラスミド２種類（HBV-NLおよびHBV-dE）をHepG2細胞に導入後、HepG2を３７℃の条件下で１週間培養し、前記培養後に培養上清中のＨＢＶレポーターウイルスを回収した。なお、ＨＢＶレポーターウイルスは、野生型のＨＢＶウイルスと、Ｇ１４５Ｒ変異体のＨＢＶウイルスの２種類を調製した。回収したＨＢＶレポーターウイルスはイオデキサノールを用いた密度勾配超遠心法で精製し感染材料とした。前記実施例１（３）のアカゲザル血漿中の抗体はProtein G（protein G HP SpinTrap, Cytiva, 28903134）を用いて精製した。精製された抗体を１０倍ずつ段階希釈し、５濃度準備した（１、１０、１００、１０００または１００００倍）。準備した抗体液を、ＨＢＶレポーターウイルス（moi=20）と混合した後に３７℃で１時間静置後、得られた混合液をＮＴＣＰ発現ＨｅｐＧ２細胞と接触させ、ＨＢＶレポーターウイルスに感染させた。前記感染８日後に細胞内のNano Luciferase発現量を測定キット（Nano-Glo Luciferase Assay System, Promega, N1130）を用いて測定することでＨＢＶの感染を評価した。また、ＨＢＶ感染を５０％阻害した抗体の希釈倍率（ＩＣ５０値）を中和活性の指標とした。これらの結果を、図７および図８に示す。
【0074】
図７および図８は、血漿中の中和抗体の活性を示すグラフである。図７および図８において、横軸は、抗体の希釈倍率を示し、縦軸は、ＨＢＶレポーターウイルスの感染量を示す。図７に示すように、通常のＨＢＶ株（ＨＢＶ－ＷＴ）の感染では、実施例のＬ抗原およびアジュバントの投与群で誘導された抗体のＩＣ５０値は、１５５．７±１２７．９（fold dilution）であり、コントロールのビームゲン接種（Ｓ抗原のみ）により誘導された抗体のＩＣ５０値（３８３．９±２９１．２（fold dilution））と、ほぼ同程度であった。他方、図８に示すように、ワクチンエスケープ変異として知られているＧ１４５Ｒ変異を持つＨＢＶ株（ＨＢＶ－Ｇ１４５Ｒ）を用いた場合、実施例のＬ抗原およびアジュバントの投与群で誘導された抗体のＩＣ５０値は、４３４．２±３１４．９（fold dilution）であり、ＨＢＶ－ＷＴ株と比較して、ＩＣ５０値に大きな変化を認められなかった。これに対して、ビームゲン接種により誘導された抗体のＩＣ５０値は、１６．９±１０．５（fold dilution）であり著明な低下が認められた。さらに、ワクチン接種を行った各個体群での変化を比較したところ、実施例のＬ抗原およびアジュバントの投与群では、ＨＢＶ－ＷＴとＨＢＶ－Ｇ１４５Ｒとの差は、１．１１±０．２０倍と大きな差を認めなかったが、コントロールのビームゲン接種個体では、０．１２±０．０２倍とＩＣ５０値が、１／１００程度に低下していた。これらの結果から、既存のＨＢＶワクチンでは、エスケープ変異体に対する中和抗体の誘導ができないのに対して、本開示のワクチンによれば、エスケープ変異体に対する中和抗体の誘導ができることがわかった。また、本開示のワクチンでは、Ｐｒｅ－Ｓ１領域に対する中和抗体の誘導能を有することにより、Ｇ１４５Ｒ変異体についても中和活性を示すと推定される。また、Ｇ１４５Ｒ変異体以外のエスケープ変異体もＳ領域に変異を有し、Ｐｒｅ－Ｓ１領域に対する中和抗体は、中和活性を示すといえる。したがって、本開示のワクチンによれば、エスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発できるといえる。
【0075】
（６）ＨＢＶの感染中和活性
前記ワクチン接種後、２６週目に採血した血液由来の血清を用いて、Ｇ１４５Ｒエスケープ変異体以外のエスケープ変異体に関してＨＢＶの感染中和活性の評価を行った。具体的には、野生型のＨＢＶウイルスに加えて、Ｉ１２６Ｓエスケープ変異体、Ｇ１４５Ｒエスケープ変異体、およびＧ１４５Ａエスケープ変異体を調製した以外は、前記実施例１（５）と同様にして、ＨＢＶの感染を評価した。また、ＨＢＶ感染を５０％阻害した抗体の希釈倍率（ＩＣ５０値）を中和活性の指標とした。また、野生型のＨＢＶウイルスに対する中和活性を１００％として、中和活性の相対値を算出した。これらの結果を図９に示す。
前記ワクチン接種後、２６週目に採血した血液由来の血清を用いて、Ｇ１４５Ｒエスケープ変異体以外のエスケープ変異体に関してＨＢＶの感染中和活性の評価を行った。具体的には、野生型のＨＢＶウイルスに加えて、Ｉ１２６Ｓエスケープ変異体、Ｇ１４５Ｒエスケープ変異体、およびＧ１４５Ａエスケープ変異体を調製した以外は、前記実施例１（５）と同様にして、ＨＢＶの感染を評価した。また、ＨＢＶ感染を５０％阻害した抗体の希釈倍率（ＩＣ５０値）を中和活性の指標とした。また、野生型のＨＢＶウイルスに対する中和活性を１００％として、中和活性の相対値を算出した。これらの結果を図９に示す。
【0076】
図９は、血漿中の中和抗体の活性を示すグラフである。図９（Ａ）において、横軸は、抗体の希釈倍率を示し、縦軸は、ＨＢＶレポーターウイルスの感染量を示す。また、図９（Ｂ）において、横軸は、エスケープ変異体の種類およびワクチンの種類を示し、縦軸は、中和活性の相対値（ＩＣ５０値）を示す。図９（Ａ）および（Ｂ）に示すように、いずれのエスケープ変異体においても、コントロールのビームゲン接種（Ｓ抗原のみ）では、野生型のＨＢＶウイルスに対する中和活性と比較して、中和活性が低下した。これに対して、実施例のＬ抗原およびアジュバントの投与群では、いずれのエスケープ変異体に対する中和活性が、野生型のＨＢＶウイルスに対する中和活性と同程度であった。したがって、本開示のワクチンによれば、異なるエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発できることがわかった。
【0077】
（７）ＨＢＶの感染中和活性
前記実施例１（２）で調製したＬ抗原について、水酸化アルミニウムゲル（Alhydrogel Adjuvant, InvivoGen 社）で製剤化し、雄のアカゲザル（３頭）に抗原として３μｇを４週間毎（０、４、または８週目）に３回皮下投与した。さらに、接種日および１回目の接種日を基準として接種後の所定日（２週後、４週後、６週後、８週後、１０週後、または１２週後）に、各アカゲザルから採血し、血漿を回収した。得られた血漿中の抗Ｓ抗体、抗Ｐｒｅ－Ｓ１抗体および抗Ｐｒｅ－Ｓ２抗体の量について、それぞれの抗体測定キット（株式会社ビークル社製）を用いて行いて定量した。これらの結果を図１０に示す。
前記実施例１（２）で調製したＬ抗原について、水酸化アルミニウムゲル（Alhydrogel Adjuvant, InvivoGen 社）で製剤化し、雄のアカゲザル（３頭）に抗原として３μｇを４週間毎（０、４、または８週目）に３回皮下投与した。さらに、接種日および１回目の接種日を基準として接種後の所定日（２週後、４週後、６週後、８週後、１０週後、または１２週後）に、各アカゲザルから採血し、血漿を回収した。得られた血漿中の抗Ｓ抗体、抗Ｐｒｅ－Ｓ１抗体および抗Ｐｒｅ－Ｓ２抗体の量について、それぞれの抗体測定キット（株式会社ビークル社製）を用いて行いて定量した。これらの結果を図１０に示す。
【0078】
図１０は、ワクチン液投与後の抗体価の推移を示すグラフである。図１０において、横軸は、ワクチン接種後の日数を示し、縦軸は、抗体価を示す。図１０に示すように、抗Ｓ抗体、抗Ｐｒｅ－Ｓ１抗体、および抗Ｐｒｅ－Ｓ２抗体のいずれも抗体価の上昇は確認され、２回目の投与後に急激に各抗体の抗体価の上昇（７５～４００倍）が確認された。他方、図５（Ｂ）に示すスクワレン含有アジュバントであるAddaVaxのワクチン液投与群と、初回投与後の抗体価の上昇を比較すると、AddaVaxのワクチン液投与群では、水酸化アルミニウムゲルのワクチン投与群より早期に抗Ｐｒｅ－Ｓ１抗体の急激な上昇が確認された。以上のことから、免疫原としてＬタンパク質を用いる場合、AddaVax、すなわち、スクワラン含有アジュバントをアジュバントとして利用するとアラムアジュバントよりも早期に抗体価の上昇を誘導できることがわかった。
【0079】
以上、実施形態を参照して本開示を説明したが、本開示は、上記実施形態に限定されるものではない。本開示の構成や詳細には、本開示のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【0080】
＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
＜Ｂ型肝炎ウイルスワクチン＞
（付記１）
対象に投与することにより、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法に用いるためのＢ型肝炎ウイルスワクチンであって、
Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質またはその変異体のみと、脂質膜とを含む表面抗原粒子を含む、ワクチン。
（付記２）
前記Ｌタンパク質またはその変異体は、下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質である、付記１に記載のワクチン：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域内で１３個以下であって、かつ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失または置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（付記３）
前記Ｌタンパク質またはその変異体が、酵母により発現されたものである、付記１または２に記載のワクチン。
（付記４）
対象への投与により、前記Ｌタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１領域および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対する抗体が産生される、付記１から３のいずれかに記載のワクチン。
（付記５）
対象への投与により、前記Ｌタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１領域および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対する細胞性免疫が誘導される、付記１から４のいずれかに記載のワクチン。
（付記６）
対象への投与により、投与後２週間までに、前記対象においてＬタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１領域および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対するに対する抗体が産生される、付記１から５のいずれかに記載のワクチン。
（付記７）
免疫賦活化剤を含む、付記１から６のいずれかに記載のワクチン。
（付記８）
前記免疫賦活化剤は、スクワレン含有アジュバントである、付記７に記載のワクチン。
（付記９）
Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質を含む、付記１から８のいずれかに記載のワクチン。
（付記１０）
対象への投与により、コアタンパク質に対する抗体が誘導される、付記９に記載のワクチン。
（付記１１）
対象への投与により、コアタンパク質に対する細胞性免疫が誘導される、付記９または１０に記載のワクチン。
（付記１２）
前記Ｂ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価が、少なくとも２から１０００である、付記１から１１のいずれかに記載のワクチン。
（付記１３）
前記Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質を含むＢ型肝炎ワクチンにより誘導される中和抗体に対するエスケープ変異体である、付記１から１２のいずれかに記載のワクチン。
（付記１４）
前記Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域のＧ１４５Ｒ変異体、Ｇ１４５Ａ変異体、および／またはＩ１２６Ｓ変異体である、付記１から１３のいずれかに記載のワクチン。
（付記１５）
前記対象は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に感染している対象、および／または、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質を含むワクチンを投与された対象である、付記１から１４のいずれかに記載のワクチン。
＜液性免疫応答の誘発方法＞
（付記１６）
Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法であって、
対象に、付記１から１５のいずれかに記載のＢ型肝炎ウイルスワクチンを投与する工程を含む、方法。
（付記１７）
前記Ｂ型肝炎ウイルスワクチンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与される付記１６に記載の方法。
（付記１８）
前記Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域のＧ１４５Ｒ変異体、Ｇ１４５Ａ変異体、および／またはＩ１２６Ｓ変異体である、付記１６または１７に記載の方法。
（付記１９）
前記対象は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に感染している対象、および／または、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質を含むワクチンを投与された対象である、付記１６から１８のいずれかに記載の方法。
＜Ｂ型肝炎ウイルス感染症の処置方法＞
（付記２０）
Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置方法であって、対象に、付記１から１５のいずれかに記載のＢ型肝炎ウイルスワクチンを投与する工程を含む、方法。
（付記２１）
前記Ｂ型肝炎ウイルスワクチンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与される付記２０に記載の方法。
（付記２２）
前記Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域のＧ１４５Ｒ変異体、Ｇ１４５Ａ変異体、および／またはＩ１２６Ｓ変異体である、付記２０または２１に記載の方法。
（付記２３）
前記対象は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に感染している対象、および／または、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質を含むワクチンを投与された対象である、付記２０から２２のいずれかに記載の方法。
＜使用＞
（付記２４）
Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発するための、付記１から１５のいずれかに記載のＢ型肝炎ウイルスワクチン。
（付記２５）
Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置するための、付記１から１５のいずれかに記載のＢ型肝炎ウイルスワクチン。
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
＜Ｂ型肝炎ウイルスワクチン＞
（付記１）
対象に投与することにより、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法に用いるためのＢ型肝炎ウイルスワクチンであって、
Ｂ型肝炎ウイルスのＬタンパク質またはその変異体のみと、脂質膜とを含む表面抗原粒子を含む、ワクチン。
（付記２）
前記Ｌタンパク質またはその変異体は、下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質である、付記１に記載のワクチン：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、６番目から１１３番目のＰｒｅ－Ｓ１領域内で６個以下、１１４番目から１６２番目のＰｒｅ－Ｓ２領域内で６個以下、１６３番目から３８５番目のＳ領域内で１３個以下であって、かつ合計で１６個以下のアミノ酸が欠失または置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（付記３）
前記Ｌタンパク質またはその変異体が、酵母により発現されたものである、付記１または２に記載のワクチン。
（付記４）
対象への投与により、前記Ｌタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１領域および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対する抗体が産生される、付記１から３のいずれかに記載のワクチン。
（付記５）
対象への投与により、前記Ｌタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１領域および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対する細胞性免疫が誘導される、付記１から４のいずれかに記載のワクチン。
（付記６）
対象への投与により、投与後２週間までに、前記対象においてＬタンパク質のＰｒｅ－Ｓ１領域および／またはＰｒｅ－Ｓ２領域に対するに対する抗体が産生される、付記１から５のいずれかに記載のワクチン。
（付記７）
免疫賦活化剤を含む、付記１から６のいずれかに記載のワクチン。
（付記８）
前記免疫賦活化剤は、スクワレン含有アジュバントである、付記７に記載のワクチン。
（付記９）
Ｂ型肝炎ウイルスのコアタンパク質を含む、付記１から８のいずれかに記載のワクチン。
（付記１０）
対象への投与により、コアタンパク質に対する抗体が誘導される、付記９に記載のワクチン。
（付記１１）
対象への投与により、コアタンパク質に対する細胞性免疫が誘導される、付記９または１０に記載のワクチン。
（付記１２）
前記Ｂ型肝炎ウイルスに対する中和抗体価が、少なくとも２から１０００である、付記１から１１のいずれかに記載のワクチン。
（付記１３）
前記Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質を含むＢ型肝炎ワクチンにより誘導される中和抗体に対するエスケープ変異体である、付記１から１２のいずれかに記載のワクチン。
（付記１４）
前記Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域のＧ１４５Ｒ変異体、Ｇ１４５Ａ変異体、および／またはＩ１２６Ｓ変異体である、付記１から１３のいずれかに記載のワクチン。
（付記１５）
前記対象は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に感染している対象、および／または、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質を含むワクチンを投与された対象である、付記１から１４のいずれかに記載のワクチン。
＜液性免疫応答の誘発方法＞
（付記１６）
Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発する方法であって、
対象に、付記１から１５のいずれかに記載のＢ型肝炎ウイルスワクチンを投与する工程を含む、方法。
（付記１７）
前記Ｂ型肝炎ウイルスワクチンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与される付記１６に記載の方法。
（付記１８）
前記Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域のＧ１４５Ｒ変異体、Ｇ１４５Ａ変異体、および／またはＩ１２６Ｓ変異体である、付記１６または１７に記載の方法。
（付記１９）
前記対象は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に感染している対象、および／または、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質を含むワクチンを投与された対象である、付記１６から１８のいずれかに記載の方法。
＜Ｂ型肝炎ウイルス感染症の処置方法＞
（付記２０）
Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置方法であって、対象に、付記１から１５のいずれかに記載のＢ型肝炎ウイルスワクチンを投与する工程を含む、方法。
（付記２１）
前記Ｂ型肝炎ウイルスワクチンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ ｖｉｖｏで投与される付記２０に記載の方法。
（付記２２）
前記Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ領域のＧ１４５Ｒ変異体、Ｇ１４５Ａ変異体、および／またはＩ１２６Ｓ変異体である、付記２０または２１に記載の方法。
（付記２３）
前記対象は、Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に感染している対象、および／または、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質を含むワクチンを投与された対象である、付記２０から２２のいずれかに記載の方法。
＜使用＞
（付記２４）
Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘発するための、付記１から１５のいずれかに記載のＢ型肝炎ウイルスワクチン。
（付記２５）
Ｂ型肝炎ウイルスのエスケープ変異体の感染症の処置するための、付記１から１５のいずれかに記載のＢ型肝炎ウイルスワクチン。
【産業上の利用可能性】
【0081】
以上のように、本開示によれば、エスケープ変異体に対する液性免疫応答を誘導可能なＢ型肝炎ウイルスワクチンを提供できる。このため、本開示は、例えば、医薬分野等において極めて有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】